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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

WILZA KÍMILLY VITAL DE PAIVA

PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE IN VITRO DO ÁCIDO HIALURÔNICO PRODUZIDO POR

Streptococcus zooepidemicus CCT 7546

NATAL – RN

2019


PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE IN VITRO DO ÁCIDO HIALURÔNICO PRODUZIDO POR

Streptococcus zooepidemicus CCT 7546

Trabalho de conclusão de curso como

requisito parcial para o título de Bacharel

em Engenharia Química pelo Departamento

de Engenharia Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, campus

Natal. Sob a orientação do professor Dr.

Francisco Caninde de Sousa Júnior.

TERMO DE APROVAÇÃO


PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

IN VITRO DO ÁCIDO HIALURÔNICO PRODUZIDO POR Streptococcus zooepidemicus

CCT 7546

O presente trabalho de conclusão de curso para a obtenção do título de bacharel em

Engenharia Química do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte foi aprovado pela seguinte banca examinadora em ___/___/____ com nota

_____.

Prof. Dr. Francisco Caninde de Sousa Junior

Orientador – Departamento de Farmácia

Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Departamento de Engenharia Química

_______________________________________

Profa. Dra. Cristiane Fernandes de Assis

Departamento de Farmácia

AGRADECIMENTOS

Um motivo pelo qual devo dar graças todos os dias: ser abençoada de encontrar suporte,

apoio e morada em pessoas maravilhosas em todas as fases da minha vida. A elas irei agradecer

aqui.

Em primeiro lugar, aos meus pais. Essa conquista, assim como todas as outras só foi

possível porque acreditaram em mim, principalmente quando nem eu mesma acreditava, e

porque me deram todo amor e apoio que nem o melhor ser do mundo seria capaz de merecer.

Espero um dia poder retribuir tudo isso.

À minha família por todo amor e apoio incondicionais, em especial à minha irmã

Wanne, minha bisavó Maria Miranda, meus avós: Salete e Chico, Graça e Wilton; minhas tias

Adriana e Linda; minhas madrinhas Nalva e Ana; meus primos Erika, Luana, Patrícia, Fernanda

e Flávia, Erick e Wlademir e ao meu afilhado Elias.

Ao professor Francisco, por toda dedicação e orientação. Eu não poderia ter escolhido

orientador melhor. Ao professor Everaldo e a todos que compõem o LEB, em especial Waleska,

Juliene e Sérgio, por todo suporte, ensinamento e por proporcionarem o melhor ambiente de

cooperação científica que eu poderia sonhar dentro dessa universidade.

À toda família EQ - UFRN 2015.1, em especial aos amigos Ceci, Murilo, Joemil, Beatriz,

Bruna, Mário, Júlia e Lorena e a todos os mestres que contribuíram com minha formação, em

especial aos professores Gilson, Kate, Magna e Eduardo por serem espelho do profissional que

quero ser.

Ao IFRN, que não foi o início da minha vida acadêmica, mas que de tão significativo a

dividiu em dois períodos. Se pude sonhar em ingressar na universidade federal foi por me abrir

oportunidades para isso. Serei eternamente grata por todo desenvolvimento pessoal, científico,

tecnológico e acima de tudo, cidadão.

Ao CNPq pelo incentivo à pesquisa e apoio financeiro.

Por fim, à Claire e os Crosbys e aos meus amores Duck e Pérola por serem luz e calmaria

nos dias mais difíceis.

RESUMO

O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo de alta massa molar com inúmeras aplicações em produtos médicos, farmacêuticos, estéticos e cosméticos. Tradicionalmente, este polímero é extraído de tecidos conjuntivos animais como cordões umbilicais e cristas de galo. Assim, a produção biotecnológica do AH, em particular por Streptococcus zooepidemicus, surge como alternativa promissora. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo produzir, caracterizar e avaliar a atividade antioxidante in vitro do ácido hialurônico produzido por S. zooepidemicus CCT 7546. Inicialmente, cepa de S. zooepidemicus foi cultivada por fermentação submersa em incubador rotativo a 150 rpm e 37 °C por 22 horas. Em seguida, o AH foi extraído utilizando dodecil sulfato de sódio (SDS) e purificado por precipitação com etanol 95%. As amostras de AH produzido por S. zooepidemicus e um padrão comercial de hialuronato de sódio (HS) foram submetidas à caracterização por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise termogravimétrica (TGA) e avaliação da atividade antioxidante in vitro. A análise de MEV mostrou que o HS se apresenta como sólidos amorfos de granulometria uniforme em um meio também uniforme o que corrobora com o fato de advir de uma fonte animal enquanto o MEV do AH produzido por S. zooepidemicus o identificou como um sólido cristalino de granulometria variável. Já a análise de FTIR identificou perfis característicos e comuns às duas amostras neles funções orgânicas foram identificadas como prováveis responsáveis por sua atividade antioxidante. Além disso, foram detectadas atividades nos ensaios in vitro de sequestro do radical DPPH, sequestro do radical hidroxila, poder redutor e capacidade antioxidante total. Por fim, os resultados de TGA mostraram que o AH de origem microbiana é mais estável termicamente que seu equivalente comercial de fonte animal. Os resultados obtidos demonstram o potencial do AH obtido por via biotecnológica e contribuem para o entendimento de suas características e atividade antioxidante.

Palavras-chave: Ácido hialurônico. Hialuronato de sódio. Radicais livres. Antioxidantes. DPPH.

ABSTRACT

Hyaluronic acid (HA) is a high molar mass polysaccharide with countless applications in medical, pharmaceutical, esthetics and cosmetic products. Traditionally, this polymer is extracted from animal connective tissues such as umbilical cords and chicken combs. Therefore, the biotechnological production of HA, in particular Streptococcus zooepidemicus, appears as a promising alternative. In this context, the present study aims to produce, characterize and evaluate the in vitro antioxidant activity of hyaluronic acid produced by S. zooepidemicus CCT 7546. First, S. zooepidemicus strain was cultured by submerged fermentation in a rotary incubator at 150 rpm and 37 ° C for 22 hours. Then, the HA was extracted using sodium dodecyl sulfate (SDS) and purified by precipitation with 95% ethanol. Samples of HA produced by S. zooepidemicus and a commercial standard of sodium hyaluronate (SH) were subjected to Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), thermogravimetric analysis (TGA) and evaluation of antioxidant activity in vitro. The SEM analysis showed that SH presents itself as amorphous solids of uniform granulometry in a uniform medium, which corroborates the fact that it comes from an animal source, and the MEV of HA produced by S. zooepidemicus identified as a crystalline solid of granulometry non-uniform. In the FTIR curves characteristic bands were identified and typical to the two samples. Some organic functions have been identified as likely responsible for their antioxidant activity. In addition, activities were detected in the in vitro assays of DPPH radical sequestration, hydroxyl radical sequestration, reducing power and total antioxidant capacity. Finally, TGA results showed that AH of microbial origin is more thermally stable than its commercial equivalent of animal source. The results obtained also demonstrated the potential of AH obtained by biotechnology and contribute to the understanding of its characteristics and antioxidant activity.

Keywords: Hyaluronic acid. Sodium hyaluronate. Free radicals. Antioxidants. DPPH.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química do ácido hialurônico. ……..………....……………..………… 16

Figura 2 - Representação estrutural de ligações secundárias e terciárias entre moléculas de

ácido hialurônico. …………………………………………...……………............……….…. 17

Figura 3 - Perfil do crescimento do número de patentes com o ácido hialurônico no período de

1975 a 2015. ………...………….....…………………………………………………...….…. 19

Figura 4 - Perfil do crescimento do número de publicações sobre ácido hialurônico no período

de 1996 a 2006. ………………………....………………………………………................… 19

Figura 5 - Vias de produção de ácido hialurônico. ………….....………...……………….… 20

Figura 6 - Simulação de um tratamento com aplicações na pálpebra a base de ácido hialurônico.

……………………………………………………………………….…......................…...… 23

Figura 7 - Esquema do processo de reidratação da pele. ……………...…………………..... 24

Figura 8 - Perfil de patentes sobre ácido hialurônico criadas por área até 2016...…..…....… 25

Figura 9 - Esquema da reação de um ensaio de DPPH. …....…………..……………..…….. 27

Figura 10 - Esquema da reação de um ensaio de quelação de Ferro………...……….……… 28

Figura 11 - Reação de redução do NBT a Formazan. ……..……………...………….….….. 28

Figura 12 - Fluxograma das etapas de produção de ácido hialurônico por Streptococcus

zooepidemicus CCT 7546. …..…………........…………………....……………….………… 31

Figura 13 - Fluxograma do processo utilizado para a purificação do ácido hialurônico

produzido. ………………………………………...………………………………...……….. 33

Figura 14 - Diagrama de blocos da metodologia de determinação de ácidos urônicos proposta

por Bitter e Muir (1962). …………………...………………......………………….………… 34

Figura 15 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) do padrão comercial de

hialuronato de sódio comercial ampliados (a) 500x, (b) 1000x, (c) 3000 x e (d) 5000 x. ........ 38

Figura 16 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de AH produzido por S. zooepidemicus CCT 7546 ampliados (a) 500 x, (b) 500 x, (c) 1000 x e (d) 3000 x. ....…...…. 39

Figura 17 - Análise térmica de ácido hialurônico produzido por S. zooepidemicus CCT 7546. Curva da análise térmica diferencial (ciano) e curva termogravimétrica (violeta). …….…..... 41

Figura 18 - Análise térmica do padrão comercial de hialuronato de sódio. Curva da análise térmica diferencial (ciano) e curva termogravimétrica (violeta). ………………..…..….…… 41

Figura 19 - Bandas identificadas das curvas de transmitância da análise de FTIR entre 4000 cm-1 a 560 cm-1 do AH por S. zooepidemicus CCT 7546 (azul) e para o padrão de hialuronato de sódio (violeta). ……………………....……………………….…..........................……….. 44

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Concentração de ácido hialurônico encontrada em cada fonte ………..……...…. 21

Tabela 2 - Composição do meio de cultivo de baixo custo para a Streptococcus zooepidemicus

CCT 7546 ………………………………………………………………………….……..….. 32

Tabela 3 - Degradação térmica das amostras de ácido hialurônico por S. zooepidemicus CCT

7546 e de Hialuronato de Sódio comercial. …………………………………….......……….. 40

Tabela 4 - Comprimentos de onda encontrados por análise de transmitância em FTIR para o

AH produzido por S. zooepidemicus CCT 7546 e para o padrão de hialuronato de sódio........ 43

Tabela 5 - Resultados das atividades antioxidantes encontradas para o AH produzido por S.

zooepidemicus CCT 7546 e do padrão de hialuronato de sódio. …………………….....….… 45

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AH: Ácido Hialurônico.

HS: Hialuronato de Sódio.

GAGs: Glicosaminoglicanos.

ERO: Espécies Reativas de Oxigênio.

FDA: Food and Drug Administration.

SDS: Dodecil Sulfato de Sódio.

HAS: Enzimas Hialurano Sintetases.

DVS: Divinilsulfona.

MEV: Microscopia Eletrônica de varredura.

FTIR: Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier.

TGA: Análise Termogravimétrica.

DTA: Análise Térmica Diferencial.

CAT: Capacidade antioxidante total

DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila.

FRAP: Poder de Redução do Íon Férrico.

NBT: Nitroblue Tetrazolium.

BHI: Brain Heart Infusion.

AA: Ácido Ascórbico.

TE: Trolóx.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO …………………………………...…………….……..………......... 13

2. OBJETIVOS …………………………………………………………...….……….... 15

2.1 OBJETIVO GERAL ……………………………………………………….…..…….. 15

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS …………………..………………………………...….. 15

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA …………………………..….………….……..... 16

3.1 O ÁCIDO HIALURÔNICO ……………………………………...….……….…….... 16

3.1.1 Propriedades …………………………………………….…..……………..…….…. 17

3.1.2 Breve histórico …………………………………………....……………………...….. 18

3.1.3 Produção do ácido hialurônico ……………….……………….………………....... 20

3.1.3.1 Biossíntese ………………………………………………………………….……..… 21

3.1.3.2 Síntese bacteriana ……………………………………………………………....…… 21

3.1.4 Finalidade comercial ………………….…………..………….…………...…..…….. 22

3.1.4.1 Indústria médica ………………………………………………………...………….... 23

3.1.4.2 Indústria farmacêutica …………………………………...………………...………… 24

3.1.4.3 Indústria estética e cosmética ………...………….………………………..…………. 24

3.1.5 Mercado econômico ……………………………………………....……..………….. 25

3.2 MECANISMOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE …....…... 26

4. METODOLOGIA ...................................................................................................... 30

4.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DO MICRO-ORGANISMO………...........…..… 30

4.2 REATIVAÇÃO …………………………………………………………….………... 30

4.3 INÓCULO E PRODUÇÃO DO AH ……………………………………..………...... 31

4.4 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO AH ………………....………….....…….…….. 32

4.5 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS URÔNICOS …..………………….....…….….….. 33

4.6 MECANISMOS DE ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ..………...…. 34

4.6.1 Teste da Capacidade Antioxidante Total ………………………...……….....…….. 34

4.6.2 Poder Redutor ………………………………………………….……......…..….…... 35

4.6.3 Quelação de Íons metais ………………………..……………………….........…….. 35

4.6.4 Sequestro do Radical hidroxila …………………………..………………..…....….. 35

4.6.5 Sequestro do Radical Peróxido ………………...………………………....….…….. 35

4.6.6 Sequestro do Radical DPPH ……...…………………….……………….….....…... 36

4.7 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO AH PRODUZIDO .…..…..…….....….... 36

4.7.1 MEV …………..……................................................................................................... 36

4.7.2 FTIR …………..…….............................................................................................….. 36

4.7.3 Termogravimetria (TGA)…………………………...………….....……….…………. 36

5. RESULTADOS ........................................................................................................... 37

5.1 ANÁLISE FÍSICA E ESTRUTURAL ……………………….……..…………......… 37

5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) do ácido hialurônico e do hialuronato

de sódio …………………………………………………………………………..….….….... 37

5.1.2 Análise termogravimétrica ……………………………….…...……….……....…... 39

5.1.3 FTIR do ácido hialurônico e do hialuronato de sódio …………..…...…….....….. 41

5.2 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE …………...…………………..….. 42

6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 47

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 48

APÊNDICE 54

13

WILZA KÍMILLY VITAL DE PAIVA ENGENHARIA QUÍMICA - UFRN

1 INTRODUÇÃO

A busca por longevidade acompanha a humanidade desde os primórdios da civilização.

Dados do The World Bank revelam que a expectativa de vida do homem moderno é de 72,04

anos, essa realidade, porém não é a mesma de poucas décadas atrás (THE WORLD BANK,

2006). É importante destacar também que, estando ligadas à fatores ambientais, genéticos ou

metabólicos, muitas são as teorias sobre as causas do envelhecimento celular, porém até os dias

atuais nenhuma delas foi consagrada como teoria absoluta. Esta problemática é justificada pelo

não comportamento uniforme de células, tecidos, órgãos e sistemas durante o processo de

envelhecimento natural. (GAVA & ZANONI, 2005).

Uma das teorias mais estudadas foi apontada por Harman em 1956. Ele propôs que tal

envelhecimento seria decorrente do estresse oxidativo das células levando à oxidação das

formas proteicas, lipídicas e do próprio DNA que iriam progredir lentamente por todos os

tecidos, denominada teoria dos radicais de oxigênio, ou teoria dos radicais livres. (FERREIRA

& MATSUBARA, 1997).

Esse estresse oxidativo seria causado não só por radiações ionizantes, como os raios

ultravioleta (UV), como também por reações enzimáticas ou não-enzimáticas, e até mesmo pelo

processo de respiração celular devido a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). Além

disso, hábitos cada vez mais comuns ao homem moderno podem contribuir com a exposição a

esses elementos reativos, como consumo de bebidas alcoólicas, tabaco, alimentação

desbalanceada, e fatores ambientais, como a poluição do ar e da água potável (GAVA &

ZANONI, 2005).

Segundo Kogon 2007, a pele, maior órgão do corpo humano, possui o ácido hialurônico

como agente sequestrador dos radicais livres gerados pelos raios UV apresentando assim função

antioxidante. Porém, ao desempenhar essa função ele pode ser quebrado resultando em cadeias

mais curtas que são ingeridas por fibroblastos, macrófagos e queratinócitos, reduzindo assim

sua concentração na derme, que perde um considerável agente hidratante (apud PEREIRA,

2017).

Sendo o ressecamento cutâneo um indicador de idade, cosméticos a base de ácido

hialurônico vêm tomando lugar no mercado de produtos anti-idade por atuar na síntese de

colágeno e elastina, na renovação celular e na promoção da hidratação (SCOOTTI, 2003 apud

PEREIRA, 2017). Ademais, o ácido hialurônico possui inúmeras aplicações médicas,

14


oftalmológicas, alimentícias e farmacêuticas sendo assim um produto versátil e de alto valor

agregado.

Este trabalho teve como objetivo, produzir ácido hialurônico por via bacteriana em

fermentação submersa a partir da bactéria Streptococcus zooepidemicus; caracterizar

estruturalmente e quimicamente o ácido produzido e avaliar seu comportamento como

antioxidante frente a mecanismos que inibem a formação, propagação e finalização da reação

de formação de radicais livres, comparando os resultados dessas análises com o seu padrão

comercial disponível no mercado.

15


2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho tem como objetivo geral produzir, caracterizar e avaliar a atividade

antioxidante in vitro do ácido hialurônico produzido por Streptococcus zooepidemicus CCT

7546.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Produzir o AH por fermentação submersa de Streptococcus zooepidemicus CCT 7546;

● Extrair o AH utilizando dodecil sulfato de sódio (SDS) e purificar por precipitação com

etanol 95%;

● Realizar a análise estrutural do AH produzido e do padrão comercial de hialuronato de

sódio advindo de fonte animal, através dos ensaios de espectroscopia no infravermelho

com transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e

análise termogravimétrica (TGA);

● Analisar a capacidade antioxidante in vitro do AH produzido e do padrão comercial de

hialuronato de sódio, utilizando os testes de poder redutor, quelação do íon ferro,

sequestro do radical DPPH, sequestro do radical hidroxila, sequestro do radical peróxido

e capacidade antioxidante total.

16


3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 ÁCIDO HIALURÔNICO

O ácido hialurônico (AH) é um mucopolissacarídeo ácido pertencente ao grupo dos

glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas compostas de cadeias polissacarídicas complexas,

cuja função é promover a movimentação celular, transporte de nutrientes e produção de

colágeno. Diferente dos demais GAGs, o AH possui uma estrutura primária mais simples, livre

de peptídeos, caracterizando-se como a única estrutura não sulfatada do seu grupo. Sua estrutura

é formada através de ligações ꞵ-1,3 e ꞵ-1,4 de unidades dissacarídicas polianiônicas de ácido

D-glucurônico e N-acetil-glicosamina (BICUDO, 2011), como ilustrado na Figura 1.

Figura 1 - Estrutura química do ácido Hialurônico.

Fonte: Adaptado de Gomes, (2016).

Em sua molécula, distinguem-se quatro grupos funcionais, regiões de ataque para

modificações químicas, sendo estes grupos carboxílicos: Onde ocorrem reações de esterificação

e reações por ataque de carbodiimidas; hidroxílicos: com reações de sulfonação, esterificação,

oxidação com periodato e ativação com brometo de cianogênio. Outras reações também podem

ocorrer nos terminais acetamidas e terminais reduzidos do polímero (PRESTWICH, 2010 apud

BICUDO, 2011).

As próprias ligações glicosídicas podem sofrer hidrólise em cadeias menores ou

oligossacarídeos formando assim cadeias menores e de menor massa molecular. Em soluções

17


aquosas, pontes de hidrogênio são formadas entre o solvente e os sítios acetamida, caboxilato e

hidroxílico formando assim ligações secundárias e terciárias (SHIMOJO, 2011), como

exemplificado na figura 2.

Figura 2 - Representação estrutural de ligações secundárias e terciárias entre moléculas de ácido hialurônico.

Fonte: SHIMOJO, (2011).

3.1.1 Propriedades

Sendo um fluído não newtoniano, suas propriedades elásticas e viscosas não são

constantes, variando assim com a taxa de cisalhamento aplicada ou seu movimento oscilatório

(BICUDO, 2011). Sendo a viscoelasticidade a propriedade reológica mais característica,

promove através dela várias funções biológicas naturais e sua classificação como produto de

alto valor agregado com aplicações na área médica, estética e farmacêutica.

Segundo Soltes et. al., 2006 apud Kogan et. al., 2007, Como líquido sinovial, o AH

reduz o impacto e descarte nas articulações, estando a sua degradação aliada a enfermidades

como a artrite reumatóide e a osteoartrite. Na pele, liga-se à água promovendo tonicidade e

elasticidade dos tecidos e permite a proliferação celular, reparando os tecidos além de sequestrar

radicais livres gerados pela exposição à radiação ultravioleta (apud BICUDO, 2011).

Segundo Kogan et al (2007), o AH está presente naturalmente no corpo humano, como

no cordão umbilical, fluido das articulações, pele, tendões e humor vítreo. Além disso, também

18


é encontrado nas cristas de galo, cápsulas de alguns estreptococos e em todos os vertebrados,

não estando presente em insetos, plantas e fungos (apud BICUDO, 2011).

É importante destacar ainda que o AH empregado para finalidades médicas e

farmacêuticas têm sido extraído de fonte animal com aprovação da FDA, segundo Kogan et al.,

sendo o preferido para aplicações estéticas. Porém sua associação a antígenos limita as

aplicações médicas (Pires 2009 apud Shimojo, 2011), ocasionando no crescente mercado a

utilização de AH de fonte microbiana.

Nessas circunstâncias, os autores apontam também que o fator alergênico pode ser

decisivo para a não utilização de tecidos animais como fonte de AH para fins médicos a

pacientes alérgicos aos derivados de aves. Por essa razão o estudo de derivados químicos do

ácido hialurônico melhorados para suprir as necessidades do mercado, é incentivado

atualmente, assim como sua obtenção por via não-animal. (SHIMOJO, 2011).

3.1.2 Breve histórico

Meyer e Palmer foram os primeiros a isolar o ácido hialurônico, nominando-o assim.

Este feito foi realizado em 1934 onde os pesquisadores o coletaram em amostras do humor

vítreo de olhos bovinos. Nesta pesquisa encontraram uma estrutura com duas moléculas de

carboidrato, na qual uma delas foi identificada como esse ácido urônico (SHIMOJO, 2011).

Três anos depois, foram observadas semelhanças entre o componente recém descoberto e o

polissacarídeo presente em cápsulas de bactérias de gênero Streptococcus por Kendall,

Heidelberger e Dawson, que impulsionaram o estudo do AH de origem microbiana. (MORAES,

2017).

Os 20 anos seguintes à descoberta inicial contaram com o isolamento da substância em

cristas de galos, em fluidos sinoviais, cordão umbilical e em demais tecidos e articulações,

porém, nessas pesquisas a estrutura química ainda não tinha sido determinada com precisão,

sendo concluída somente após 1954 por Weissman e Meyer, utilizando estratégias químicas e

enzimáticas (SHIMOJO, 2011).

No fim da década de 1950, a primeira aplicação médica do AH foi registrada em uma

cirurgia oftalmológica como substituto do vítreo humano. Já em 1960, na Itália, ocorreu a

comercialização do primeiro produto a base de AH, o Hyalgan, sendo este um creme para

queimaduras e úlceras (CHONG et al., 2005 apud MORAES, 2017). No decorrer da década de

1960 a sua extração nos mais diversos tecidos estava condicionada à problemas como a retenção

19


de proteínas, encontrando-se uma solução com a determinação dos mecanismos para a

clonagem da enzima AH sintase e da biossíntese do ácido hialurônico. (BOERIU et al., 2013).

A década de 1980 marcou o início da produção microbiana deste ativo em escala

industrial, tendo essa produção crescido ainda mais a partir de 2003 quando os produtos

Hylaform e o Restylane receberam a aprovação da FDA, aumentando consecutivamente o

número de patentes (Figura 3). (KOGAN et al., 2007 apud MORAES, 2017).

Figura 3 - Perfil do crescimento do número de patentes com o ácido hialurônico no período de 1975 a 2015.

Fonte: Adaptado de GOMES (2016).

Figura 4 - Perfil do crescimento do número de publicações sobre ácido hialurônico no período de 1996 a 2006.

Fonte: Adaptado de GOMES (2016).

A partir da década de 1980, observa-se, também, um crescimento significativo no

número de publicações tendo o ácido hialurônico em seu título (Figura 4) mas só em 1997, as

20


condições ótimas para a sua produção por Streptococcus foram determinadas por Johns &

Armstrong, sendo elas a faixa de temperatura entre 30 a 37 ºC e um faixa de pH entre 6,5 e 7,5.

No ano seguinte, Chong e Blank concluíram o esquema para a rota metabólica desta síntese por

meio de Streptococcus, já em 2002, Chong e Nilsen apresentaram a proposta de um modelo do

fluxo metabólico de carbono em Streptococcus zooepidemicus (MACEDO, 2007).

3.1.3 Produção do ácido hialurônico

As rotas utilizadas para a obtenção do ácido hialurônico, como apontado por Boeriu et

al. (2013), são três: a extração em tecidos animais, produção in vitro e a produção por via

bacteriana (Figura 5).

Figura 5: Vias de produção de ácido hialurônico.

Fonte: Adaptado de BOERIU et al (2013).

Mesmo que o comércio de ácido hialurônico proveniente de fonte animal seja aprovado

pelas agências reguladoras de produtos farmacêuticos, como a Food and Drug Administration

(FDA) nos Estados Unidos e esta ainda seja a maior fonte de matéria prima, (Tabela 1) o AH

de origem microbiana vem tomando seu espaço a cada ano devido à sua elevada produtividade

(SHIMOJO, 2011).

21


Além disso, Chong (1998) aponta que a produção bacteriana contorna algumas

dificuldades enfrentadas pela extração animal, como a redução da massa molar após a

purificação e a formação de complexos com proteoglicanos que dificultam a separação de

moléculas de alta massa molecular. (CHONG, 1998 apud MACEDO, 2007).

Tabela 1 - Concentração de Ácido hialurônico encontrada em cada fonte.

Fonte de ácido Hialurônico Concentração encontrada mg/L

Crista de galo 7500

Cordão umbilical humano 4100

Fluido sinovial humano 1400-3600

Cartilagem nasal bovina 1200

Humor vítreo humano 140-340

Derme humana 200-500

Produção Bacteriana por S. Zooepidemicus 40 – 6940*

*É variável dependendo principalmente do meio de cultivo, do microrganismo e das condições de operação. PAN et al (2015).

Fonte: Adaptado de PIRES (2009).

3.1.3.1 Biossíntese

A biossíntese do AH está condicionada às enzimas hialurano sintetases (HAS) presentes

na membrana plasmática de células que compõem o tecido conjuntivo. Essas

glicosiltransferases produzem o ácido hialurônico, usando os açúcares UDP-ácido glucurônico

e UDP-N-acetilglucosamina como substratos, e o secreta para a matriz extracelular. Por outro

lado, a degradação do AH é realizada pelas enzimas hialuronidases, β-D-glucuronidases e β-N-

acetil-hexosaminidases. Neste processo de degradação, as hialuronidases atuam inicialmente

sobre os polímeros de alta massa molecular, clivando-os em estruturas menores, e, por fim as

β-D-glucuronidases e β-N-acetil-hexosaminidases degradam esse produto com a finalidade de

remover os açúcares redutores finais. (ESTEVES, 2017).

3.1.3.2 Síntese bacteriana

22


Uma alternativa para a obtenção de um melhor rendimento e qualidade do ácido

produzido é através do cultivo microbiano. Segundo Chong & Nielsen (2003-b), no caso da

Streptococcus zooepidemicus, o ácido hialurônico é sintetizado a partir da glicose-6-fosfato e

da frutose-6-fosfato pela ação da enzima hialuronato sintase, que polimeriza os precursores

ácidos UDP-glicurônico e UDP-N-acetil-glicosamina no interior da membrana plasmática

(OGRODOWSKI, 2006). Tendo como objetivo a proteção celular, o ácido produzido atravessa

a membrana celular e forma uma cápsula externa de S. zooepidemicus (BENEDINI, 2012).

Esse processo ocorre sob as condições ideais de temperatura e pH, determinados por

Chong et al., (2005) nas quais alcança o rendimento de 5 a 10 g/L entre 6 a 16 horas de cultivo

tendo como alternativa a fermentação contínua para redução de custos. Devendo-se atentar a

baixa taxa de produtividade nesses casos devido à instabilidade do fenótipo da cepa produtora.

Por essas condições, sua condução em batelada ainda é preferível em escala industrial

(MORAES, 2017).

Com o intuito de aprimorar as propriedades químicas, reológicas e o tempo de residência

nos tecidos do ácido hialurônico produzido, modificações químicas são realizadas em escala

industrial visando não comprometer sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e para a

indústria médica e farmacêutica, as suas propriedades farmacológicas. Segundo Shimojo

(2011), Tais modificações ocorrem por dois métodos distintos, são eles os métodos de adição

de compostos ou moléculas na cadeia principal e o método da reticulação.

A reticulação deste polímero consiste na formação de ligações cruzadas entre moléculas

antes lineares ou pouco ramificadas criando estruturas maiores e tridimensionais de alta massa

molecular, um exemplo disso é o Hylan B um derivado em forma de gel em que o ácido

hialurônico foi reticulado com divinilsulfona (DVS) para sua utilização na estética facial

(SHIMOJO, 2011).

Conforme apontado por Liu et al, (2011) outra complicação deste método de produção

é a provenientes dos estreptococos que podem permanecer no ácido final impedindo sua

utilização para fins medicinais, restringindo assim o seu campo de aplicação. Surge assim o

DNA recombinante como alternativa, utilizando de bactérias gram-positivas e gram-negativas

como a Bacillus sp., Lactococcus lactis, Agrobacterium sp. e Escherichia coli.

3.1.4 Finalidade comercial

23


De posse de todas as propriedades aqui já citadas, são inúmeras as finalidades

comerciais do ácido hialurônico tanto na indústria médica e farmacêutica, estética e cosmética

como exemplificado a seguir:

3.1.4.1 Indústria médica

As aplicações médicas do ácido hialurônico são classificadas em quatro categorias:

viscocirurgia, viscoaumento, viscossuplementação e viscosseparação. Na viscocirurgia, é

comumente utilizado em plásticas oculares com sucesso, como na extração de cataratas. Outros

estudos buscam sua utilização para a substituição do humor vítreo natural. Segundo Zamani et

al., (2008), aplicações de AH nas pálpebras evitam sua retração natural, melhorando o

fechamento ocular (Figura 6), evitando o uso de múltiplos colírios para lubrificação e,

consequentemente, minimizando a realização de intervenções cirúrgicas (FIGUEIREDO et al.,

2009).

Figura 6 - Simulação de um tratamento com aplicações na pálpebra a base de ácido hialurônico.

Fonte: GARCIA (2017).

O viscoaumento consiste na reparação e aumento de tecidos danificados, ocorrendo

normalmente em conjunto com a viscosseparação, envolvendo órgãos e tecidos expostos a

procedimentos cirúrgicos, e, evitando assim, sua adesão. Por fim, sua ação na

viscossuplementação, é repor os fluidos sinoviais degradados por enfermidades degenerativas

24


como a artrite reumatóide, com a finalidade de alívio de dores e minimização dos sintomas

(PAN, 2013).

3.1.4.2 Indústria farmacêutica

Facilmente metabolizado pelo corpo humano, ligações cruzadas do AH são realizadas

para a formação de hidrogéis no preparo de microcápsulas na indústria farmacêutica para

liberação controlada de fármacos. Assim, constituem um método bastante eficiente, pois através

delas conforme as cápsulas vão sendo degradadas ocorre a liberação progressiva e controlada

de fármacos, que são agora direcionados a alvos específicos (BICUDO, 2011).

3.1.4.3 Indústria estética e cosmética

No ramo estético, seu comportamento visco-elástico e sua capacidade de retenção de

água atuam tendo o rejuvenescimento como objetivo principal, sendo empregadas em

aplicações no interior da derme de forma a amenizar os efeitos de rugas e marcas de expressão.

A solução de ácido hialurônico também pode ser injetada nos lábios para preenchimento e

modelagem dos mesmos. Além das aplicações, ele pode ser usado como componente base de

cremes faciais de uso contínuo atuando como hidratante, retendo o colágeno e revitalizando a

derme desidratada pelo envelhecimento natural. (MORAES, 2017).

Sua capacidade antioxidante é explorada em cremes e maquiagens fotoprotetores pelo

objetivo em comum de prevenir o envelhecimento cutâneo. Além disso, a renovação celular é

estimulada (Figura 7) assim como a síntese de elastina e colágeno.

Figura 7 - Esquema do processo de reidratação da pele.

Fonte: Adaptado de Clínica Wulkan® (2018).

25


Por ser processado naturalmente no corpo humano, mesmo uma fina camada de produto

pode criar uma película de proteção contra a radiação ultravioleta enquanto preenche sulcos na

pele criados pelo tempo e a desidratação natural, não impede a passagem de oxigênio nem de

nutrientes entre as células (PEREIRA, 2017).

3.1.5 Mercado econômico

As patentes criadas com esse tema impulsionam pesquisas de aprimoramento de

produtos e métodos. Conforme apresentado por Selyanin et al. (2015), até 2016, das 4884

patentes registradas mundialmente (Figura 8), 3881 foram para aplicação médica, 819

bioquímica, 127 alimentícia, 48 processos para o desenvolvimento de novas cadeias de ácido

hialurônico e 9 com outras bases (GOMES, 2016).

Figura 8 - Perfil de patentes sobre ácido hialurônico criadas por área até 2016.

Fonte: GOMES (2016).

O continente europeu somado aos Estados Unidos e Japão detém boa parte do mercado

mundial de derivados do ácido hialurônico, movendo em 2005 cerca de 1 bilhão de dólares.

Devido a purificação extra, o custo por quilo para aplicação médica é superior aos destinados

para fins cosméticos. Tais valores variam de US$ 40.000,00 à US$ 60.000,00 por Kg para fins

medicinais e farmacêuticos, enquanto que a variação para fins cosméticos girava em torno de

US$ 1.000,00 a US$2.000,00 por Kg (BICUDO, 2011). Em 2006, seus derivados cosméticos

26


movimentaram cerca de US$ 850.000.000,00 pela comercialização de 1,6 milhões de produtos

estéticos (MORAES, 2017).

Dados da Transparency Market Research apontam que em 2012 o mercado de ácido

hialurônico movimentou cerca de 5,32 bilhões de dólares com expectativa de aumento para

9,85 bilhões em 2019 (GOMES, 2016). Atualmente, o cenário comercial brasileiro conta com

a importação legal de inúmeras empresas, das quais se destacam os produtos da Surgiderm,

Juvederm, Hylaform, Restylane, Perlane, Esthelis e Forthelis (FERREIRA, 2016). Uma

segunda estimativa foi realizada pela Grand View Research (2016), ano em que o mercado

mundial de AH foi avaliado em US$ 7,2 bilhões, sua pesquisa estipulou um rendimento desse

mercado de US$ 15,4 bilhões até 2025.

3.2 MECANISMOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Segundo Alves et al. (2010), vários são os mecanismos para a avaliação da atividade

antioxidante in vitro em produtos naturais, como exemplos têm-se os métodos: eletroquímicos,

biológicos e espectrofotométricos.

Têm-se como técnicas espectrofotométricas o conjunto de métodos relativamente

simples baseadas no princípio de mudança de coloração das amostras lidas por variação de

absorbância por comprimento de onda, (BORGES et al., 2011) o que como apontado por

Halliwell (1995) mostra-se eficiente já que seu rápido resultado permite rejeitar um possível

antioxidante para testes in vivo se este apresentar baixa atividade antioxidante in vitro. (ALVES

et al., 2010). Existem diversas metodologias de avaliação da atividade antioxidante in vitro,

entre elas: Sequestro do radical DPPH, Sequestro do radical peroxila; Poder Redutor; Quelação

de íons metais; Sequestro do radical hidroxila e Capacidade antioxidante total.

Sequestro do radical DPPH

Seu mecanismo de ação ocorre através do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-

hidrazila (DPPH), de coloração inicial violeta, vista a existência de um par de elétrons

desemparelhados se deslocando em ressonância por toda a molécula, em uma reação redox para

o elemento antioxidante, sendo reduzido assim para hidrazina pelo ganho de um próton de

hidrogênio por esse agente redutor. Tal reação é visualizada pela mudança de coloração para a

cor amarelada (Figura 9), sendo quantificada pelo decaimento da absorbância no comprimento

de onda de 517 nm (ALVES et al., 2010).

27


Figura 9 - Esquema da reação de um ensaio de DPPH.

Fonte: Adaptado de Pires et al (2017)

Poder Redutor

O ensaio de poder de redução do íon férrico ou simplesmente poder redutor, tem sua

atividade antioxidante avaliada através do poder de agente redutor da amostra teste em reduzir

o ferricianeto de potássio (Fe+3) à ferricianeto de potássio (Fe+2), sendo identificado pela

variação de cor, visto apresentar, inicialmente, a coloração amarelada e, ao fim da reação, a

coloração azul-esverdeada na presença de cloreto de Ferro. Essa variação causa aumento da

absorbância que é lida então à 700 nm. (CHUNG et al., 2002 apud GARCIA, 2016).

Teste da Capacidade Antioxidante Total

O método do fosfomolibdênio, descrito por Pietro et al. (1999) é utilizado para avaliar

a capacidade antioxidante total das amostras através da redução do Mo+4 a Mo+5 seguido da

formação do complexo fosfato-molibdato, determinada por espectrofotometria pela mudança

de cor de amarelo para roxo-azulado com um pico de absorção em 695 nm.

Quelação de Íons metais

Estudada através da atividade quelante de íons Fe II proposta por Dinis et al, (1994), a

quelação de íons metais ocorre através da quelação da Ferrozina que oxida o cloreto de ferro se

quelando ao íon Fe+2 disponível promovendo assim uma coloração avermelhada à mistura.

(Figura 10). A amostra teste no meio deve então competir com a Ferrozina nesse processo.

Assim, quanto maior a quelação de íons metais pela amostra, menos avermelhada se dará a

28


solução, logo uma menor absorbância será lida na faixa de 562 nm (MORESCO et al., 2011)

indicando que a atividade antioxidante da amostra atua também conforme esse mecanismo.

Figura 10 - Esquema da reação de um ensaio de quelação de Ferro.

Fonte: MORESCO et al (2011).

Sequestro do Radical Peróxido

O mecanismo espectrofotométrico para essa análise opera através da inibição de íons

superóxidos na redução fotoquímica do NBT através do sistema Riboflavina-luz-NBT como o

ensaio realizado por Beauchamp & Fridovich (1971). Nele o antioxidante atua inibindo o

radical O2- liberado no meio cuja função seria reduzir o NBT, de cor amarela, a formazan de

cor púrpura, (Figura 11) que pode ser lido à 560 nm (ALVES et al, 2010).

Figura 11- Reação de redução do NBT a Formazan.

Fonte: Adaptado de Bakr, Ahmed & Rahaman, Md. (2016).

29


Sequestro do Radical hidroxila

Uma espécie altamente reativa in vivo pode ser sequestrada ao se utilizar um

antioxidante em altas concentrações que atuem conforme o mecanismo de sequestro do radical

hidroxila (QUADROS, 2018) Para tanto, ensaios in vitro são realizados para testar sua atuação

reduzindo a quantidade de antioxidante necessária para isso. Um dos métodos para análise in

vitro é o do sistema FeCl2/H202 proposto por o Smirnoff & Cumbes (1989).

Nesse ensaio, íons OH- se formam pela reação entre peróxido de hidrogênio e íons Fe2+,

denominada reação de Haber-Weiss. Esses radicais hidroxilas reagem então com o salicilato de

sódio formando como intermediário o ácido diidroxibenzóico que possui resposta visual em

510 nm. Assim quanto maior o potencial de sequestrar íons hidroxila tiver a amostra, menor

será a absorbância lida nesse comprimento de onda (JIN et al., 2016 apud QUADROS, 2018).

30


4. METODOLOGIA

4.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DO MICRO-ORGANISMO

A linhagem de Streptococcus equi subsp. zooepidemicus CCT 7546 utilizada no

presente trabalho foi obtida na coleção de culturas da Fundação André Tosello Pesquisa e

Tecnologia, São Paulo - Brasil sendo esta originária da cepa Streptococcus equi subsp.

zooepidemicus Farrow and Collins ATCC 39920, Strain Designation: HA-116 obtida da

American Type Culture Colletion, Manassas, VA.

Para manutenção, a linhagem foi cultivada em caldo BHI (Brain Heart Infusion) e

mantida em incubador rotativo a 37 ºC e 150 rpm por 24 h. A biomassa foi então separada por

centrifugação a 9956 g, a 4 ºC por 15 minutos; ressuspendida em solução salina (0,9 %) com

glicerol 50% (v/v) estéril e armazenada a -80 ºC (Solução estoque).

4.2 REATIVAÇÃO

Para reativação da cepa de Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, 1 mL da solução

estoque mantida a -80 ºC em NaCl 0,9% com glicerol 50%, foi distribuída em 50 mL de caldo

BHI em dois repiques conforme metodologia descrita por Ogrodowski (2006). (Figura 12).

Os Erlenmeyers foram levados ao incubador rotativo onde permaneceram sob agitação

de 150 rpm a 37 ºC por 18 h. Após esse período, o conteúdo dos Erlenmeyers, em câmara

asséptica, foi distribuído em dois tubos de centrífuga tipo Falcon de 50 mL, dos quais foram

retiradas alíquotas para serem observadas em microscópio.

Como não foram observados sinais de contaminação pelo microscópio óptico, os tubos

foram submetidos a centrifugação à 4500 rpm por 20 min sob refrigeração (4 ºC).

No fim desta etapa, houve a identificação visual da formação de duas fases distintas das

quais a fase 1, o sobrenadante, foi descartado e ao precipitado restante, fase 2, foram

adicionados 1,5 mL de NaCl 0,9% para sua solubilização. Em seguida, o conteúdo dos dois

tubos foi transferido para Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de BHI estéril. O novo

sistema foi então mantido em incubador rotativo por 21 h a 37 ºC e 150 rpm (Figura 12).

31


Figura 12 - Fluxograma das etapas de produção de ácido hialurônico por Streptococcus zooepidemicus CCT

7546 .

Fonte: O autor.

4.3 INÓCULO E PRODUÇÃO DO AH

Passadas as 21 horas a 150 rpm e 37 ºC, o conteúdo de cada Erlenmeyer foi dividido

igualmente em dois tubos Falcons de 50 mL cada e submetido à centrifugação à 4500 rpm

durante 20 min sob refrigeração (4 ºC). Após descarte do sobrenadante, cada precipitado foi

ressuspendido em 2,5 mL de NaCl 0,9%, e o conteúdo de dois tubos, que foram chamados de

inóculo, foram transferidos a um Erlenmeyer de 250 mL contendo 45 mL do meio de cultivo

32


cuja composição é mostrada na Tabela 2 (AMADO et al., 2015), e retornados à incubadora

rotativa a 37 ºC e 150 rpm por 22 h.

Tabela 2 - Composição do meio de cultivo de baixo custo para a Streptococcus zooepidemicus CCT 7546.

Componente Concentração (g/L)

Glicose (Dextrose) 50

Triptona 15

Extrato de levedura 5

Fosfato monobásico de potássio 2

Fosfato dibásico de potássio 0,5

Sulfato de Magnésio 0,5

Sulfato de amônio 0,5

Fonte: AMADO et al (2015)

4.4 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO AH

Seguindo o método de Nimrod et al. (1988) modificado, ao final da etapa de produção

do AH, foram adicionados aos Erlenmeyers 5 mL de solução de SDS (Dodecil sulfato de sódio)

à 5%, e deixados reagir por 10 min para que o SDS rompesse a membrana celular, liberando o

ácido hialurônico presente no interior da bactéria. Em seguida, o conteúdo de cada Erlenmeyer

foi dividido em 2 tubos centrífuga tipo Falcon e submetidos à centrifugação a 4500 rpm por 40

min a 4 ºC (Figura 13).

Retirados da centrífuga, os precipitados foram descartados e os sobrenadantes foram

reunidos em um becker onde foi adicionado Etanol 95% na proporção 1,5/1

(sobrenadante/etanol) e foram homogeneizados em agitação por 3 minutos. A mistura foi então

armazenada em tubos tipo Falcon e deixadas em repouso por 1 hora a 4 ºC, para o favorecimento

da precipitação, após essa etapa houve a centrifugação à 4500 rpm e 4ºC durante 10 min, de

onde o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi solubilizado em 5 mL de salina por

erlenmeyer de meio de cultivo. Ao fim, esses microlitros foram transferidos para eppendorfs

que foram etiquetados e separados para as análises seguintes.

Uma parte da amostra foi submetida à liofilização durante 24 horas, à velocidade

constante de 1mm/h, a -40 °C sob vácuo de 0,5 mmHg e pressão final de 0,05 mmHg. O

33


processo ocorreu no (liofilizador modelo L101, Liobras, Brasil) do Laboratório de Engenharia

de Alimentos LEA - UFRN. As amostras liofilizadas, agora no estado sólido, foram utilizadas

para as análises de MEV, TG e FTIR, enquanto as amostras não liofilizadas foram utilizadas na

determinação de ácidos urônicos e nas metodologias de avaliação da atividade antioxidante.

Figura 13 - Fluxograma do processo utilizado para a purificação do ácido hialurônico produzido.

Fonte: O autor.

4.5 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS URÔNICOS

Seguindo a metodologia de Bitter e Muir (1962), a concentração do ácido obtido após a

etapa de purificação sendo determinada em triplicata através da utilização de solução de

tetraborato de sódio decahidratado em ácido sulfúrico 0,025 M e reagente de carbazol. 1,5 mL

da solução de tetraborato foram pipetados em tubos de ensaio e resfriados por 30 min em banho

termostático à 4 ºC quando 0,25 mL da amostra purificada foram adicionados em cada tubo

(Figura 14). Os mesmos foram fechados e agitados ainda em resfriamento constante; após a

agitação os tubos foram levados em banho com ebulição vigorosa por 10 minutos.

Quando retirados foram esperados retornar à temperatura ambiente para serem agitados

em vórtex e então receberem 0,05 mL do reagente colorimétrico de Carbazol (0,125 g em 100

ml de etanol absoluto) após isso retornaram ao banho com ebulição vigorosa por mais 15

minutos. Quando os tubos, após retirados, voltaram a temperatura ambiente, a densidade ótica

foi lida em 530 nm no espectrofotômetro Genesys 10 uv da Thermo Spectronic, EUA. O branco

foi realizado com água destilada. Feita a leitura, os resultados foram aplicados na equação da

34


reta da curva de calibração construída anteriormente na faixa de 0,05 à 0,4 g/L com o padrão

comercial de hialuronato de sódio e a concentração obtida de AH solubilizada em salina foi

determinada.

Figura 14 - Diagrama de blocos da metodologia de determinação de ácidos urônicos proposta por Bitter e Muir

(1962).

Fonte: O autor.

4.6 MECANISMOS DE ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO

4.6.1 Capacidade Antioxidante Total

A atividade antioxidante total foi determinada pelo método do fosfomolibdênio com

modificações (Kumaran & Karunakaran, 2005). Para isso, 100 µL de cada amostra foram

adicionados em tubos de ensaio contendo 100 µL de molibdato de amônio (40 mM), 100 µL de

fosfato de sódio (280 mM) e 700 µL de água destilada. Em seguida, as amostras foram

incubadas a 100 ºC por 90 minutos e, após resfriadas, a absorbância lida em espectrofotômetro

35


a 695 nm. Para expressar o resultado em g de ácido ascórbico equivalente por grama de amostra

(g AAE/g), elaborou-se uma curva padrão com concentrações de ácido ascórbico na faixa de

0,025-0,250 g/mL.

4.6.2 Poder redutor

O poder redutor do ácido hialurônico produzido foi avaliado conforme Wang et. al.

(2008). Para isso, 200 μL de amostra foram incubados com 100 μL de ferricianeto de potássio

(1%) a 50 ˚C por 20 minutos. Na sequência adicionou-se aos tubos 180 μL de ácido

tricloroacético 10%, 20 μL de cloreto férrico (0,1%) e 1,5 mL de tampão fosfato 200 mM (pH

6,6). A absorbância foi avaliada a 700 nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos

em percentual de atividade do poder redutor (%) em relação a um padrão de ácido ascórbico na

concentração de 0,1 g/L.

4.6.3 Quelação do íon ferro

A capacidade das amostras quelarem o íon ferro foi realizada conforme Galinari et al.

(2018). A mistura reacional contendo 910 µL da amostra, 30 µL de FeCl2 (2 mM) e 60 µL de

ferrozina (5 mM) foi agitada e incubada a 37 ºC por 10 minutos. A absorbância foi medida a

562 nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos em percentual de atividade

quelante (%).

4.6.4 Sequestro do radical hidroxila

O potencial sequestrador de radical hidroxila foi investigado conforme previamente

descrito por Smirnoff & Cumbes (1989). Inicialmente os radicais foram gerados pela adição de

750 µL de tampão fosfato 150 mM (pH 7,40 contendo FeSO4.7H2O 10 mM, EDTA 10 Mm e

salicilato de sódio 2 mM) e 200 µL de H2O2 (30%). Em seguida, as amostras foram incubadas

a 37 ºC por 60 minutos e a presença do radical hidroxila avaliada em espectrofotômetro a 510

nm. Os resultados foram expressos em percentual de inibição (%).

4.6.5 Sequestro do radical superóxido

O sequestro dos radicais superóxidos foi avaliado pela redução fotoquímica do azul de

nitrotetrazólio (NBT) através do sistema riboflavina-luz-NBT (Dasgupta & De, 2004). Para

isso, 200 μL de amostra foram adicionadas a 200 μL de tampão fosfato 50 mM (pH 7,4), 200

μL de metionina (65 mM), 200 μL de EDTA (0,5 mM), 200 μL de NBT (0,375 mM) e 200 μL

de riboflavina (0,5 mM). O controle foi preparado substituindo-se 200 μL da amostra por 200

36


μL de tampão fosfato. Os tubos contendo as amostras e os controles foram mantidos sob luz

fluorescente por 15 minutos e a verificação da absorbância foi realizada em espectrofotômetro

a 560 nm. Os resultados foram expressos em percentual de inibição (%).

4.6.6 Sequestro do Radical DPPH

A capacidade de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) foi avaliada

conforme Nóbrega et al. (2015) utilizando microplaca com 96 poços. Em resumo, 40 µL de

amostra foram adicionados a 200 µL de uma solução de DPPH (0,1 mM) em etanol. A mistura

foi então incubada por 25 minutos em câmara escura e a leitura realizada a 517 nm em leitor de

microplacas Epoch-Biotek (Winooski, VT, USA). A curva padrão foi construída com

concentrações de trolox (ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano) variando de

30 a 200 µM e os resultados expressos em mol de trolox equivalente por grama de amostra

(kmol TE/g).

4.7 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO AH PRODUZIDO

4.7.1 MEV

Realizado no Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN (DEMAT), a

microscopia eletrônica de varredura (MEV) consistiu na emissão de feixes de elétrons de 15

KV nas amostras fixadas em fita de carbono e por meio da utilização do equipamento Phillips

XL-30 ESEM, USA.

4.7.2 FTIR

A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourrier (FTIR) contou com a

emissão de espectros na faixa de 400 à 4000 cm -1 nas amostras em fase sólida através do

Shimadzu, IR Tracer 100 (Perkin Elmer, EUA), realizada no Departamento de Engenharia de

Materiais (DEMAT) da UFRN. Os dados foram tratados na plataforma Google Sheets na versão

de 2019.

4.7.3 Termogravimetria (TGA)

O ensaio termogravimétrico foi realizado nas amostras sólidas pelo equipamento DTG-

60 da Shimadzu com controlador de fluxo Shimadzu modelo FC-60A e interface TA-60WS

(Shimadzu) do Núcleo de Pesquisa em Petróleo e Gás (NUPEG – UFRN). A faixa de

37


temperatura utilizada foi de 30 a 800 ºC a uma taxa de aquecimento de 5 ºC/minuto em

atmosfera de gás nitrogênio. Os dados foram adquiridos pelo software TA Acquisition Status

versão 2.21, tratados nos softwares TA60 versão 2.21 e plotados no Microsoft Excel 2016.

38


5. RESULTADOS

Com a concentração de ácidos urônicos produzidos sendo determinada por

espectroscopia, constatou-se que a concentração de AH produzido por S. Zooepidemicus foi de

0,0698 g/L tendo um rendimento médio de 1,396 mg de AH em cada erlenmeyer de meio de

cultivo utilizado.

5.1 ANÁLISE FÍSICA E ESTRUTURAL

5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) do ácido hialurônico e padrão

comercial de hialuronato de sódio.

As imagens obtidas na microscopia eletrônica de varredura (MEV) para o padrão

comercial de hialuronato de sódio e do ácido hialurônico produzido por Streptococcus

zooepidemicus CCT 7546 são apresentadas nas figuras 15 e 16, respectivamente.

Figura 15 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) do padrão comercial de hialuronato de sódio

comercial ampliados (a) 500x, (b) 1000x, (c) 3000 x e (d) 5000 x.

Fonte: O autor.

Na imagem de MEV do padrão comercial de hialuronato de sódio ampliada 500 x, pode-

se observar grupamentos poliméricos maciços, com granulometrias e formas pouco uniformes,

39


que, embora semelhantes entre si, se destacam visualmente no meio (Figura 15-A). Nos

aumentos de 3000 x e 6000 x, Figuras 15-C e 15-D respectivamente, percebe-se que essas

partículas isoladas possuem estrutura não-cristalinas, sendo classificadas como sólidos

amorfos. Tal observação corrobora com o fato deste padrão comercial obtido por intermédio da

Sigma - Aldrich (BRP, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard), ser de origem

animal, mais precisamente, extraído de cristas de galo.

Após liofilização, o ácido hialurônico extraído de Streptococcus zooepidemicus

apresentou estrutura macroscópica branca e granular. Esta amostra, visualmente foi dividida

em três formas distintas. A primeira em forma de pó branco, a segunda em forma polimérica

branca e lisa, que se encontrava em maior quantidade na amostra, e a terceira, também

polimérica, possuía coloração ocre, opaca e de formas e tamanhos variados. A micrografia desta

amostra (Figura 16) ampliada 500 x, permitiu a identificação das três formas.

Figura 16 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de AH produzido por S. zooepidemicus

CCT 7546 ampliados (a) 500 x, (b) 500 x, (c) 1000 x e (d) 3000 x.

Fonte: O autor.

40


Os cristais de menor granulometria e em maior quantidade na Figura 16-A foram

atribuídos aos cristais de NaCl que compunham a solução em que a amostra foi diluída e

purificada. Enquanto que os cristais maiores em meio aos cristais de NaCl, cuja estrutura é

melhor visualizada na figura 16-C, foram atribuídos aos cristais de ácido hialurônico extraídos.

Por fim, o polímero mais escuro, que se encontrava em menor quantidade na amostra e que

pode ser visualizado na Figura 16-A, foi atribuído, em hipótese, a resquícios de componentes

celulares da S. zooepidemicus CCT 7546 que se mantiveram no meio mesmo após a etapa de

purificação. A mesma pode ser vista ampliada 3000 x na Figura 16-D.

5.1.2 Análise Termogravimétrica (TGA)

As figuras 17 e 18 mostram as curvas de análise termogravimétrica (TGA) e análise

térmica diferencial (DTA) do ácido hialurônico produzido por S. zooepidemicus CCT 7546 e

do padrão de hialuronato de sódio, respectivamente. Assim como os ensaios realizados por Vasi

et al. (2014), a degradação térmica do ácido hialurônico e do hialuronato de sódio ocorreu,

ambas, em quatro etapas distintas. Com o auxílio das curvas de TG e DTA, as temperaturas de

início e fim, assim como a porcentagem de perda de massa dessas etapas, foram quantificadas

e apresentadas na tabela 3.

Tabela 3 - Degradação térmica das amostras de ácido hialurônico produzido por S. zooepidemicus CCT 7546 e

do Hialuronato de Sódio comercial.

Fonte: O autor.

41


Apenas comparando o comportamento das curvas apresentadas nas figuras 17 e 18

pode-se notar a indicação de que o ácido hialurônico por S. zooepidemicus CCT 7546 é

termicamente mais estável que o hialuronato de sódio, fato esse que é suportado por apresentar

menores perdas de massa nas quatro etapas de degradação (Tabela 3).

Figura 17 - Análise térmica de ácido hialurônico produzido por S. zooepidemicus CCT 7546. Curva da análise

térmica diferencial (ciano) e curva termogravimétrica (violeta).

Fonte: O autor.

Figura 18 - Análise térmica do padrão comercial de hialuronato de sódio. Curva da análise térmica diferencial

(ciano) e curva termogravimétrica (violeta).

Fonte: O autor.

De acordo com Vasi et al. (2014), o primeiro passo de degradação (I) da molécula

corresponde à perda de água (umidade). Em ambas as amostras tal perda ocorreu na temperatura

42


média de 53,2 °C, entretanto, para o AH, a variação de temperatura foi um pouco maior (Tabela

3). Ainda na primeira etapa, o AH sofreu menor perda de massa em relação ao HS, sendo esta

de 5,43% enquanto que a perda do HS foi de 21,07%. Para Vasi et al., (2014) esse

comportamento pode indicar uma diferença de hidrofilicidade, devido ao fato de em sua forma

de sal de sódio, o hialuronato possui uma maior polaridade por estar carregado negativamente.

Na segunda etapa (II) das figuras 17 e 18, começa a degradação da amostra (Réef et al,

2012). A temperatura inicial desta etapa entre as duas análises distanciou-se em cerca de 50 °C,

acontecendo para o AH apenas em 279,44 °C. A diferença do percentual de perda de massa

também foi significativa, sendo aproximadamente um terço da sofrida pelo sal.

Nas etapas finais esse comportamento se manteve, porém, ainda mais discrepante. Para

o HS 24,63 % foram perdidos entre 540 e 591 ºC, enquanto que a massa de ácido hialurônico

de S. zooepidemicus CCT 7546 se manteve praticamente constante nesse período, só havendo

redução mássica significativa a partir de 779,78 °C, temperatura essa aproximadamente 200 ºC

acima da temperatura média da quarta etapa de degradação do padrão comercial do hialuronato

de sódio (Tabela 3).

Vasi et al (2014) argumentam que essa diferença de comportamento térmico entre as

amostras pode ser devido às características físico-químicas dos compostos e sua capacidade de

formar pontes de hidrogênio, assim como o fato das ligações covalentes presentes no polímero

de ácido hialurônico conferirem maior estabilidade estrutural ao composto do que a interação

eletrostática da estrutura salina do hialuronato de sódio. (Figuras 17 e 18) promovendo a ele

uma menor perda de massa durante a análise térmica.

5.1.3 FTIR do ácido hialurônico e do hialuronato de sódio

Com o objetivo principal de caracterizar o polímero obtido, a espectroscopia no

infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), mostrou que estruturalmente a amostra

produzida e o padrão de hialuronato de sódio comercial são bem similares. Ambos apresentam

picos e vales em comprimentos de onda semelhantes entre si e semelhantes aos relatados na

literatura. Com base em tais similaridades, pôde-se identificar os principais grupos funcionais

existentes nos polímeros analisados. Todas as bandas e seus respectivos comprimentos de onda

estão apresentados na figura 19 e tabela 4.

43


Tabela 4 - Comprimentos de onda encontrados por análise de transmitância em FTIR para o AH produzido por

S. zooepidemicus CCT 7546 e para o padrão de hialuronato de sódio.

Banda

Comprimento de onda (cm-1)

Padrão de HS AH de S. zooepidemicus

a 3371,57 3410,14

b 2974,23 2924,08

c 2850,08 2846,93

d 2368,58 2341,58

e 1647,21 1651,07

f 1604,77 1608,63

g 1411,89 1458,18

h 1350,17 1350,17

i 1323,17 1323,17

j 1207,43 1234,44

k 1153,43 1118,71

l 1033,84 1041,56

m 891,11 891,11

n 667,37 667,37

o 613,36 617,22

Fonte: O autor.

A primeira banda a ser reconhecida em ambos os espectros foi a banda a (Figura 19)

cujos valores se encontram na faixa dos 3371 e 3410 cm-1 para o padrão e a amostra

respectivamente, próximos aos encontrados por Reddy & Karunakaran (2013) em ácido

hialurônico produzido por S. zooepidemicus 3523-7, a classificando como correspondente ao

alongamento de grupamentos OH-.

Nos pontos b e c os comprimentos de onda obtidos na amostra mais se aproximam dos

pontos obtidos por Sadhasivam et al. (2012) que do padrão analisado, visto que esse se

encontrou um pouco mais deslocados para a esquerda, porém ainda caracterizando

alongamentos simétricos e assimétricos de CH2 em ambas as bandas.

44


Figura 19 - Bandas identificadas das curvas de transmitância da análise de FTIR entre 4000 cm-1 à 560 cm-1 do

AH por S. zooepidemicus CCT 7546 (azul) e para o padrão de hialuronato de sódio (violeta).

Fonte: O autor.

A quarta banda, ponto d, corresponde ao alongamento da ligação de grupos tiol com os

grupos SH (Carneiro et al., 2016), enquanto os pontos e e f indicam a presença de amidas

primárias e grupamentos ácido, respectivamente, como apontados por Kim et al. (2008). Em

g, as bandas indicam a presença de CH2, CH3; da deformação das ligações C-O-H e da

combinação C-O com C-O, enquanto que um alongamento de ligações entre uma amina

aromática primária e um grupo CN é indicado pelo ponto h. (SADHASIVAM et al., 2012).

O ponto i, em ambas as curvas, demarca a presença de grupos diaquil-aril sulfonas

simétricas e assimétricas. Já em j tem-se caracterizado a presença de fosfatos aromáticos além

do alongamento P-O-C, enquanto que em k ocorre o alongamento de C-O-C além da

deformação das ligações O-H e C-O (SADHASIVAM et al., 2012).

Alkrad et al.(2002) apud Reddy & Karunakaran (2013) apontam que as bandas cujos

comprimentos de onda se assemelham aos indicados em l são devidos alongamento C-O-C. Em

m, segundo Sadhasivam et al., (2012) ocorrem também o alongamento C-O-C, além das

deformações O-H e C=O, para os autores, em n há o alongamento da ligação C-S dissulfídicas,

assim como por fim, a última banda identificada entre 560 e 4000 cm-1 (ponto o) caracteriza o

alongamento da ligação S-S dissulfídica.

45


5.2 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Antioxidantes são compostos que retardam ou inibem a formação de espécies reativas

de oxigênio (ERO), que por sua vez são responsáveis pela oxidação química de outras

moléculas. A formação destas espécies reativas ocorre em três estágios: iniciação, propagação

e terminação (Galinari et al., 2018). Dessa forma, as propriedades antioxidantes do AH

produzido por S. zooepidemicus e do padrão comercial de HS foram analisadas por diversos

métodos, como aqueles que bloqueiam a inicialização (capacidade antioxidante total e poder

redutor), propagação (quelação de ferro) e terminação (Sequestro dos radicais DPPH, hidroxila

e superóxido). Os resultados obtidos para as atividades antioxidantes avaliadas são apresentados

na tabela 5.

Tabela 5 - Resultado das atividades antioxidantes encontradas para o AH produzido por S. zooepidemicus CCT

7546 e do padrão de hialuronato de sódio.

Atividade antioxidante AH de S. zooepidemicus Padrão de Hialuronato de sódio

Capacidade Antioxidante Total (g AAE/g)

14,02 ± 0,38 7,02 ± 2,36

Poder Redutor (%) 18,18 ± 6,43 6,82 ± 3,21

Quelação do íon ferro (%) ND* ND*

Sequestro do Radical DPPH (kmol TE/g)

5,57 ± 0,23 7,90 ± 2,94

Sequestro do Radical hidroxila (%)

28,39 ± 2,40 6,35 ± 2,40

Sequestro do Radical Superóxido (%)

ND* ND*

*ND: Não detectada.

Fonte: O autor.

Pode-se constatar que a capacidade antioxidante total (CAT) do AH produzido por S.

zooepidemicus é aproximadamente duas vezes maior que a apresentada pelo padrão comercial

de HS. Assim, a capacidade antioxidante de 1 g de AH aqui produzido equivale a capacidade

de 14,02 g de ácido ascórbico, um antioxidante comercial. Como a CAT avalia a capacidade

de uma amostra doar elétrons em um ambiente levemente ácido e, assim, neutralizar espécies

reativas de oxigênio (ERO), os resultados obtidos apontam que a fonte bacteriana, nesse caso,

foi mais eficiente que o padrão de HS, obtido de fonte animal.

46


Eles também indicaram que o poder redutor do padrão comercial de HS corresponde à

apenas 60% do poder redutor do AH microbiano (Tabela 5). Ambas as amostras mostraram

resultados abaixo dos obtidos para o padrão de ácido ascórbico 0,1 g/L. Resultados semelhantes

foram encontrados por Sadhasivam et al. (2012). Segundo Gordon (1996), a capacidade de um

composto como agente redutor, e consequente potencial antioxidante, está relacionada a sua

capacidade de romper a cadeia de formação de radicais livres por meio da doação de um átomo

de hidrogênio. Assim, pode-se confirmar tal característica está presente no AH produzido por

S. zooepidemicus.

Os íons Cu+2 e o Fe+2 são importantes agentes pró-oxidantes, assim a quelação destes

metais por uma molécula antioxidante evitaria a formação de ERO e, consequentemente, o dano

oxidativo. Segundo Rosa (2008), polímeros que possuem ligações cruzadas com grupos

carboxílicos podem se quelar à íons metálicos, ligações essas que não foram identificadas na

análise de FTIR.

Como ilustrado na tabela 5, a amostra de AH e padrão de HS não apresentaram

capacidade de quelação de íons ferro. Porém, como apontado por Silva et al. (2016), a quitosana

possui um alto potencial quelante. Dessa forma, ao ser utilizada associada ao AH proporciona

ao produto a atuação antioxidante também por esse mecanismo. Como exemplo têm-se os

trabalhos de Nascimento & Bertachini (2015) na formulação de Hidrogéis a base de AH e

quitosana para engenharia de tecido cartilaginoso, e Batista et al. (2017), em arcabouços de

quitosana e AH visando a regeneração medular.

Em relação capacidade de sequestro do radical DPPH, os resultados obtidos para a

amostra de AH e do padrão comercial de HS apresentaram valores similares (Tabela 5). O

radical DPPH é um radical livre estável, que tem sido empregado amplamente como uma

estratégia para estimar o potencial antioxidante de componentes bioativos (Hu, Lu, Huang, &

Ming, 2004). A capacidade de sequestro do radical DPPH por parte do AH produzido por S.

zooepidemicus já foi descrita em trabalhos anteriores (Ke et al., 2009 e Pan et al., 2016). Ke et

al., (2009) obtiveram sequestro do radical DPPH nas concentrações de 200 a 1600 µg/mL,

diretamente proporcional a concentração, mas inferior à do padrão ácido ascórbico.

Trabalhos anteriores relatam também que a atividade antioxidante do AH pode estar

relacionada a sua massa molecular (Kim et al., 2008 e Pan et al., 2016) mostraram um aumento

gradual da capacidade de sequestro do radical DPPH pela redução da massa molecular do

polímero.

47


El-Safory e Lee (2010) também observaram uma atividade de eliminação de radicais

mais intensa para oligômeros de AH do que com o polímero nativo. Uma explicação para essa

diferença de atividade foi discutida por Prior, Wu e Schaich (2005), que relacionaram com o

impedimento estérico. Dessa forma, moléculas de cadeias menores seriam menos impedidas, e

assim apresentariam maior atividade (ALVES, 2010).

O radical hidroxila e seus radicais subsequentes são as ERO mais nocivas, constituindo-

se nos principais responsáveis pela lesão oxidativa de biomoléculas (Ke et al., 2009). Os

resultados do teste de sequestro do radical hidroxila mostraram que a amostra de AH atingiu

uma inibição de 28,39%, enquanto que o padrão comercial de HS apresentou inibição de 6,35%.

Segundo Telles et al., (2010), essa atividade pode ocorrer por duas vias distintas: pelo

sequestro direto do radical hidroxila ou pela quelação do íon ferro impedindo assim a liberação

desse radical. Como visto anteriormente, a atividade antioxidante das amostras analisadas por

quelação de ferro não foi detectada, indicando assim que tal inibição ocorreu pelo sequestro do

radical.

Assim como o ensaio de quelação de íons metais, não foi detectada atividade nas

amostras teste e padrão para sequestro do radical superóxido. Indicando que as amostras não

conseguiram competir com NBT, sendo este, então, reduzido.

48


6. CONCLUSÕES

● A análise de MEV mostrou que o polímero de hialuronato de sódio se apresenta como

sólidos amorfos de granulometria uniforme em um meio também uniforme o que

corrobora com o fato de advir de uma fonte animal (cristas de galo), passando por um

processo de purificação eficaz. Quanto a microscopia eletrônica de varredura do ácido

hialurônico produzido por S. zooepidemicus, este o identificou como um sólido

cristalino de granulometria variável. Nela pôde-se identificar também a presença das

partículas de cloreto de sódio no qual a amostra foi diluída, além de impurezas residuais

após o processo de purificação.

● A termogravimetria revelou que o AH de origem microbiana é mais estável

termicamente que seu equivalente comercial de fonte animal. Essa estabilidade pode

estar relacionada com sua estrutura. As ligações covalentes presentes no polímero de

AH de S. zooepidemicus conferem maior estabilidade estrutural em meio aquoso que as

ligações iônicas da estrutura salina do hialuronato de sódio.

● Nas curvas de FTIR foram identificados 15 pontos em comum entre as amostras.

Algumas funções orgânicas identificadas foram amidas primárias, grupamentos

hidroxila e carbonilas responsáveis por sua atividade antioxidante.

● Não foi detectada atividade nos ensaios antioxidantes in vitro de quelação de íon ferro

e sequestro do radical peróxido, indicando que a ação antioxidante do ácido hialurônico

não ocorre por esses mecanismos. Em contrapartida, foram detectadas atividades nos

ensaios in vitro de sequestro do radical DPPH, sequestro do radical hidroxila, poder

redutor e capacidade antioxidante total. Nessas três últimas a atividade antioxidante do

AH produzido foi superior ao do padrão comercial de HS.

● Uma hipótese para o resultado inferior ao Hialuronato de Sódio no ensaio in vitro de

sequestro do radical DPPH é de que o comprimento da cadeia molecular do AH possa

ser superior ao do HS, o que ocasionaria em um maior impedimento estérico. O ensaio

de HPLC por gel de filtração pode revelar isso, sendo assim uma sugestão a ser

desenvolvida em trabalhos futuros.

● Os resultados obtidos demonstram o potencial do AH produzido por S. zooepidemicus

e contribuem para o entendimento de suas características e atividade antioxidante.

49


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FIGUEIREDO, Eugênio Santana

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