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Micologia Clinica
Prova II
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DAS MICOSES
Microscopia do material
O exame direto é a primeira etapa do diagnóstico laboratorial micológico, indicando, na
maioria das vezes, se o material examinado contém ou não estruturas fúngicas. A
escolha da técnica depende do espécime que se quer analisar.
Escamas de pele, pêlos, cabelos e unhas: sobre uma lamina de microscopia,
limpa, coloca-se de 1 a 2 gotas de uma solução clarificante (KOH) e, sobre esta,
a amostra a ser analisada. Cobre-se o material com uma lamínula e aguarda-se
um intervalo de 5 a 10 minutos, ou até que a substancia clarificante desempenhe
sua função. Para amostras de pêlos e cabelos é importante dar preferência aos
pêlos tonsurados. Em amostras de unha, quanto mais fino for o fragmento,
melhor será a visualização dos elementos fúngicos (diâmetro aproximado de um
fio de cabelo);
Mucosas, orifícios naturais e secreções diversas: um dos swabs usados na coleta
é usado para a confecção de um esfregaço, que será corado pela prata-
metenamina e, com o material restante do mesmo swab, será feita uma
preparação do tipo lâmina-lamínula, com KOH. Dessa forma, a presença de
fungos demáceos na lesão poderá ser facilmente evidenciada;
Biópsias de tecidos ou órgãos: não macerar; deve ser cortada em pequenos
fragmentos, tanto para observação microscópica direta como para semeadura.
Para a observação microscópica direta, os fragmentos devem apresentar
espessura razoável, a fim de que esta não prejudique a transiluminação e,
consequentemente, a observação microscópica;
Sangue periférico e medula óssea: quando a amostra já vem semeada m meio
líquido, uma pequena alíquota dessa cultura é retirada e centrifugada. O
sobrenadante é desprezado e, com o sedimento, são preparados dois esfregaços,
sendo um corado pela prata-metenamina e o outro pelo Giemsa. Nas amostras
que vierem em seringas heparinizadas ou com outro anticoagulante, as laminas
serão confeccionadas diretamente do material, sem a necessidade de
centrifugação;
Líquor: deve ser imediatamente centrifugado por 10 minutos; o sobrenadante
deve ser armazenado. Com o auxilio de uma alça de platina ou de uma pipeta de
Pasteur, coloca-se uma pequena quantidade do sedimento sobre uma lâmina. São
adicionadas 2 gotas de tinta da China (nanquim), seguindo-se homogeneização
da preparação e cobertura com uma lamínula. Essa técnica permite a perfeita
visualização de cápsulas de Cryptococcus sp., um dos fungos mais
frequentemente encontrados nesse tipo de material. Além dessa lâmina, deve ser
feita outra, com o sedimento apenas coberto por uma lamínula que se presta para
a visualização de fungos demáceos; também deve ser feita outra corada pela
prata-metenamina;
Urina: também deve ser centrifugada durante 10 minutos. O sobrenadante é
desprezado e uma lamina é preparada com o sedimento do material, sem
necessidade de utilizar qualquer substancia diluente ou clarificante;
Fezes: normalmente leveduras. Uma pequena alíquota de fezes é homogeneizada
em 1-2 gotas de KOH e coberta com uma lamínula, ou realiza-se um esfregaço
corado pelo método de Gram;
Escarro: são preparadas três lâminas, sendo uma com KOH e dois esfregaços,
sendo um corado pela prata-metenamina e outro pelo Giemsa;
Pus e líquidos patológicos: as lâminas devem ser preparadas misturando-se uma
gota do material com 1-2 gotas de KOH e cobrindo-se com uma lamínula.
Também deve ser feito um esfregaço pela coloração prata-metenamina.
Semeadura e tempo de observação dos isolamentos primários
A cultura é absolutamente necessária para o isolamento e identificação dos fungos.
Entende-se por isolamento primário a capacidade que os microrganismos apresentam de
crescer, a partir do material clínico, em um meio de cultura basal.
Hoje se utiliza, na grande maioria dos isolamentos de fungos, o meio basal de Saboraud;
este pode ser acrescido de antibiótico, com a finalidade de inibir o crescimento de
bactérias que, porventura, estejam contaminando o material clinico.
Escamas de pele, pêlos, cabelos e unhas: é utilizado o ágar Saboraud; quando
houver suspeita de ptiríase versicolor, as escamas serão semeadas em ágar
Saboraud acrescido de óleo de oliva ou no meio de Dixon. Com o auxilio do
garfo, inoculam-se, na profundidade do meio, pequenas quantidades do material,
em três locais equidistantes do tubo contendo o ágar. Na suspeita de crescimento
de dermatófitos, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente por um prazo
máximo de 15 dias, com observação diária começando no terceiro dia da
semeadura. Já na suspeita clinica de ptiríase ou candidíase, os meios devem ser
incubados por até 5 dias, com observação diária começando no segundo dia de
incubação. As amostras semeadas em ágar Saboraud acrescido de óleo de oliva
ou em meio de Dixon, devem ser incubadas à temperatura de 32º C, pois esta é a
temperatura considerada mais adequada para o crescimento das diferentes
espécies de Malassezia spp.
Mucosas, orifícios naturais e secreções diversas: meio ágar Saboraud ou, quando
a pesquisa direta indicar a possível existência de leveduras, o material deve ser
semeado contendo CHROMagar Candida, o qual vai facilitar a evidenciação de
infecções mistas por leveduras. Com o swab serão feitos pequenos movimentos
rotacionais na superfície dos meios Saboraud e em uma extremidade da
superfície do CHROMagar Candida; em seguida, o material é semeado em toda
a superfície do meio, com o auxilio de uma alça de platina. Na suspeita de
crescimento de leveduras, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente, por
um prazo máximo de 72h e com observações diárias. Já na suspeita clinica de
fungos filamentosos ou dimórficos, os meios devem ser incubados até 30 dias,
com observação diária começando no quinto dia de incubação.
Biopsia de tecidos ou órgãos: meio ágar Saboraud; o meio ágar Saboraud com
brain heart infusion (SABHI) só deve ser utilizado na suspeita clinica de
histoplasmose e/ou paracoccidioidomicose. Com o auxilio de um garfo,
semeiam-se pequenos fragmentos da biopsia na profundidade do meio, em três
pontos distintos e equidistantes. 24 a 72h para leveduras e até 30 dias para
fungos filamentosos ou dimórficos.
Sangue periférico e medula óssea: em ágar Saboraud simples ou com SABHI,
semeia-se na superfície, com o auxilio de uma alça de platina ou uma pipeta e
Pasteur, uma alíquota equivalente a aproximadamente 0,1mL em cada tubo.
Líquor: não utilizar ágar Saboraud com cicloeximida, pois este não permite o
crescimento de Cryptococcus spp. Após centrifugação do material para
confecção das laminas, toma-se uma alíquota do sedimento com alça de platina
o pipeta de Pasteur e inocula-se, na superfície do meio, o equivalente a cerca de
0,1mL em cada tubo. Na suspeita de crescimento de Cryptococcus spp. ou outra
levedura, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente por um prazo
máximo de 10 dias, com observação diária após o segundo dia da semeadura. Na
suspeita clinica de fungos filamentosos ou dimórficos, os meios devem ser
incubados também a temperatura ambiente por até 30 dias, com observação
diária começando no quinto dia de inoculação.
Urina: em suspeita de leveduras utilizar CHROMagar Candida em placa; com o
auxilio de uma alça, faz-se uma estria ao longo do diâmetro da placa e, em
seguida, com movimentos em zigue-zague, cruza-se essa primeira estria,
distribuindo a urina de forma homogênea sobre a placa. Dessa forma, é possível
quantificar o numero de colônias de leveduras. Em suspeita de fungos
filamentosos ou dimórficos utilizar ágar Saboraud simples ou SABHI; a técnica
preconizada é a mesma do líquor.
Fezes: ágar Saboraud com cloranfenicol ou gentamicina ou CHROMagar
Candida em placa. O material deverá ser semeado com o auxilio de uma alça de
platina, espalhando apenas uma pequena alíquota da amostra na superfície do
meio. Não se utiliza meio isento de antibacteriano, visto que a população desses
microrganismos é exuberante nesse tipo de espécime clinico e, fatalmente, a
competição pelos substratos orgânicos entre as leveduras e as bactérias levaria
ao não crescimento fúngico. O material deve ser incubado a temperatura
ambiente por um prazo máximo de 72h, com observações diárias.
Escarro: meios idem líquor. Antes da semeadura, podem passar por técnicas que
visam ao enriquecimento do material, facilitando o isolamento de fungos
patogênicos. Toma-se uma alíquota do material com alça de platina e, após
escolha de regiões do material que se apresentam mucopurulentas, inocula-se, na
superfície do meio, o equivalente a 0,1mL em cada tubo. Para leveduras incuba-
se por até 72h, exceto Cryptococcus spp., que se deve esperar por até 10 dias,
enquanto para fungo filamentosos e dimórficos, por até 30 dias.
Pus e líquidos patológicos: forma padrão com alça de platina.
Blastoconídio = levedura.
ASPECTOS GERAIS DE FUNGOS FILAMENTOSOS E DIMÓRFICOS NA
APRESENTAÇÃO FILAMENTOSA
Na observação das características culturais de determinado microrganismo, devemos
ressaltar o tamanho da colônia, características das bordas, textura, relevo e pigmentação.
O estudo micromorfológico é feito, na maioria das vezes, a partir do isolamento
primário, utilizando-se uma pequena alíquota da colônia retirada da cultura e montada
entre lamina e lamínula com uma gota de tinta Parker. Essa montagem é observada em
objetiva de 40x. Nessas preparações podem ser visualizadas estruturas de reprodução,
bem como estruturas de ornamentação.
Entretanto, nem sempre essas estruturas se fazem presentes no meio Saboraud, que é
convencionalmente utilizado. Outro método utilizado com a finalidade de evidenciar,
com o mínimo de deterioração, o arranjo das estruturas de frutificação e ornamentação é
denominado de microcultivo.
Na primeira etapa, devem ser preparadas placas de Petri contendo uma lamina apoiada
sobre um suporte. Essa lamina deve ficar ajustada à placa de modo que o suporte não
deslize com movimentos.
Com uma lamina de bisturi, retiram-se de uma placa contendo ágar-batata, blocos
retangulares de meio de cultivo. Esses blocos devem ser dispostos de forma asséptica
sobre a lamina que se encontra acondicionada na placa de Petri. Após, toma-se a colônia
em estudo e fazem-se 4 repiques desta, nas quatro faces do retângulo de ágar-batata, que
será posteriormente coberto com uma lamina estéril.
Montada a cultura, coloca-se 1mL de água destilada estéril dentro da placa, tendo
cuidado para a água não molhar a lamina que contém o bloco de meio de cultura. A
função básica da água é evitar a dessecação do meio antes de se evidenciar o
crescimento fúngico, com seu arranjo característico.
Essa placa é incubada à temperatura ambiente até o aparecimento visual evidente do
crescimento fúngico sobre a lamínula.
Para a observação final, coloca-se uma gota de corante sobre uma lamina e retira-se a
lamínula que está cobrindo o microcultivo, utilizando-a para cobrir a lamina que está
com o corante.
LEVEDURAS: IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL
As leveduras geralmente crescem bem dentro de 48h, sob temperatura entre 25 e 37º C,
em meios micológicos e bacteriológicos comuns, incluindo ágar-sangue, ágar Saboraud
dextrose (ASD), BHI, além de outros. A maioria das leveduras produz colônias glabras,
de coloração branca ou bege, textura cremosa e superfície lisa.
Os métodos de identificação das leveduras são diferentes daqueles utilizados para
fungos filamentosos. Em relação às características morfológicas, consideram-se
aspectos macroscópicos da colônia e microscópicos da levedura. Presença de cápsula,
ascos, blastoconídeos, clamidoconídeos, artroconídeos, hifas, pseudo-hifas e formação
de tubo germinativo deve ser pesquisada através de metodologia específica, e não pela
simples observação do isolamento primário.
Prova do tubo germinativo
O tubo germinativo é uma projeção alongada, que emerge da levedura, quando esta
entra em contato com soro humano ou de outros animais, à temperatura de 37º C,
durante 2 a 3h.
1. Com o auxilio de uma alça de platina esterilizada, retira-se pequena alíquota de
uma colônia de levedura, submetida a crescimento prévio de 24 a 48h;
2. Inocula-se a levedura em um tubo contendo 0,5 a 1,0mL de soro estéril humano,
de coelho, cavalo, carneiro ou albumina sérica;
3. Incuba-se a suspensão a 37º C durante 2 a 3h;
4. Remove-se, com auxilio de uma pipeta de Pasteur, uma gota da suspensão e
monta-se uma preparação do tipo lamina-lamínula;
5. Examina-se a preparação ao microscópio óptico, com objetivas de 10 e 40x.
NÃO CONFUDIR COM PSEUDO-HIFA: o tubo germinativo é asseptado, com lados
paralelos, e não há constrição no ponto de inserção entre a estrutura da parede celular da
projeção crescente e o blastoconídio. A pseudo-hifa pode ser septada ou não, tem lados
não necessariamente paralelos e apresenta constrição no ponto de inserção entre a
estrutura da parede celular da projeção crescente e o blastoconídio.
Assimilação de carboidratos
A assimilação de carboidratos é a habilidade que uma levedura tem de crescer
aerobiamente na presença de determinado carboidrato fornecido como única fonte de
energia. Pode-se utilizar como fontes de carbono dextrose, maltose, sacarose, e outro se
necessário.
Emprega-se meio ágar destituído de qualquer fonte de carboidrato, adicionado da
suspensão da levedura e distribuído em placa. Após a solidificação, são aliquotados os
carboidratos sobre o ágar. Alternativamente, podem-se utilizar discos de papel filtro
impregnados com os diferentes carboidratos. A positividade é avaliada através da
observação de halo de crescimento da levedura em presença do carboidrato fornecido.
Assimilação de nitrogênio
A assimilação de nitrogênio é a habilidade que uma levedura tem de crescer
aerobiamente na presença de um composto nitrogenado fornecido como única fonte de
energia. Geralmente empregam-se a peptona e o nitrato de potássio como fontes de
nitrogênio, mas outros compostos podem ser utilizados.
Emprega meio ágar destituído de qualquer fonte de nitrogênio, adicionado da suspensão
de levedura e distribuído em placa. Após a solidificação, são aliquotados compostos
nitrogenados sobre o ágar. A positividade é avaliada através do crescimento da levedura
em presença do composto nitrogenado fornecido.
Fermentação de carboidratos
Fermentação de carboidratos é a habilidade que uma levedura tem de crescer
anaerobiamente na presença de determinado açúcar fornecido como única fonte de
energia, observada através da produção de gás carbônico e alteração de pH.
A prova é realizada inoculando-se suspensão da levedura em tubo de ensaio contendo
meio de cultura, solução do açúcar desejado a 2% e um tubo de Durham invertido. A
positividade é observada através da produção de gás no interior do tubo de Durham e da
mudança da coloração do meio, quando se utiliza um indicador de pH.
CHROMagar: seu principio é a produção de cor nas colônias por reações enzimáticas
espécie-especificas, com um substrato cromogênico do meio.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS
Ptiríase versicolor
Malassezia furfur. É realizado pelo exame micológico direto com KOH/tinta Parker.
O parasito apresenta-se sob a forma de elemento arredondado, ou mais ou menos
quadrangular, caracteristicamente aglomerado em número variável de 5 a mais de 30
elementos. Esses agrupamentos apresentam-se em vários pontos de campo
microscópico. Ao lado dessas formas agrupadas, podemos ver uma quantidade variável
de hifas curtas, retas ou curvas, podendo chegar a mais de 10μm de comprimento.
Algumas vezes, há predominância absoluta destas hifas em relação às formas
arredondadas.
A cultura não é feita para fins diagnósticos, mesmo porque o cultivo do agente
etiológico é difícil. Sabe-se que o parasito exige substâncias oleosas nos meios de
cultivo.
Piedra negra
Piedraia hortae. É realizado o exame micológico direto e a cultura.
Micológico direto: pega-se o nódulo do fio de cabelo, macera-o e coloca-o entre
lamina e lamínula. Possuem ascos (espaços claros) com esporos em seu interior.
Cultura: cresce como uma colônia escura, preto- esverdeada, podendo ser elevada ou
achatada na parte central (colônia cerebriforme). Fungo filamentoso com crescimento
lento.
Microscopicamente, mostra hifas escuras, de paredes espessas, muito septadas, vários
elementos arredondados, lembrando clamidoconídios.
Piedra branca
Trichosporon beigelii. Esses nódulos são mais moles que os da piedra negra.
Micológico direto: hifas e artroconídeos (pedaços de hifas) ovais e
blastoconídeos. Não possuem ascos.
Cultura: ao primeiro isolamento, aparece bem no terceiro dia, como colônias de
aspecto cerebriformes, cobrindo-se com uma camada de hifas esbranquiçadas.
Com o tempo, dois meses depois, a superfície toma uma coloração amarelo-
acastanhada, perdendo, naturalmente, o brilho inicial. Microscopicamente,
apresenta o aspecto geral característico do gênero Trichosporon, isto é, presença
de hifas septadas, que se transformam em artroconídios, estes apresentando
capacidade de gemulação.
Tinea nigra
Phaecannelomyces werneki.
Micológico direto: revela imediatamente hifas mais ou menos escuras, septadas,
sinuosas. Pode-se observar, também, elementos arredondados, gemulantes,
tendo até 5μm no maior diâmetro.
Cultura: as colônias aparecem, principalmente, como pontos negros, brilhantes,
como se fossem leveduras negras. Em poucos dias, recobrem-se de hifas verdes-
oliváceas.
Fazendo-se preparado microscópico, podemos observar as hifas septadas
escuras, tendo até 5μm de diâmetro. Os conídios uni ou bicelulares nascem
diretamente das hifas por gemulação, ou então, por meio de espículo. Observam-
se, também, pequenos conidióforos com anéis na extremidade onde se
implantam os conídios (aneloconídios). As culturas velhas quase não produzem
conídios.
Candidoses ou leveduroses
As colônias de Candida são leveduriformes, de crescimento rápido, consistência
mole e lisa (semelhante à um pingo de vela) de cor branca ou creme. O que irá
diferenciar as várias espécies de Candida é a microscopia. O microcultivo é
obrigatório.
Candida albicans
Apresentam hifas ou pseudo-hifas. Clamidoconídios (estruturas de resistência do
fungo) sempre na extremidade da hifa.
Candida glabrata
Não possuem hifas ou clamidoconídios. Aparece como uma massa de células
leveduriformes.
Candida parapsiloris
Apresentam hifas ou pseudo-hifas curvas ou largas. Os blastoconídeos são
pequenos e localizados ao longo das hifas.
Candida guilliermondii
As hifas e pseudo-hifas são escassas. Os blastoconídeos são pequenos e podem
estar próximos ou não das hifas.
Candida tropicallis
Apresentam hifas e pseudo-hifas. Os blastoconídeos são grandes e solitários.
Ágar cromogênico:
Infecções oportunistas
Aspergillus
Micológico direto: possui hifas hialinas septadas formando um ângulo de 45º.
Cultura: colônia filamentosa, pulverulenta. A cor varia de acordo com a espécie. Na
microscopia é importante verificar um conidióforo longo com vesículas globosas na
extremidade. A vesícula globosa também varia com a espécie.
1. A. niger: Preto.
2. A. flavus: Amarelada.
3. A. fumigatos: cinza-esverdeado.
Penicillium
Micológico direto: apresenta hifas hialinas septadas.
Cultura: é essencial. A colônia do Penicillium é muito característica e de
crescimento rápido. É aveludada, branca e torna-se esverdeada com o passar do
tempo. No exame microscópico, verificam-se conidióforos perpendiculares
subdivididos em ramos (parecendo um pincel).
Alternaria:
Micológico direto: apresenta hifas septadas demáceas.
Cultura: é um fungo filamentoso de crescimento rápido. Apresenta coloração de
cinza-claro a marrom. Apresenta uma consistência aveludada mais grosseira. Ao
exame microscópico apresenta macroconídios com septos transversais e horizontais.
Scopulariopses
Micológico direto: apresenta hifas hialinas septadas.
Cultura: é um fungo filamentoso de crescimento lento. A colônia possui uma
coloração branca que evolui para avelã. Possui uma consistência aveludada. No
exame microscópico, pode-se observar conídios.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – DERMATÓFITOS
TODOS os dermatófitos possuem hifas hialinas septadas ao exame microscópico
direto. O que diferencia é a produção ou não de microconídios e macroconídios,
bem como a estruturas destes. Trichophyton
T. rubrum:
O crescimento varia de rápido a lento. Apresenta uma colônia algodonosa, elevada e
de coloração, produzindo um pigmento vermelho (no reverso da colônia). Durante o
exame microscópico, podem-se observar hifas hialinas septadas com muitos
microconídios em forma de lágrima, ao longo das hifas. Eventualmente, aparecem
macroconídios de parede lisa em forma de lápis (muito raro).
T. mentagropytes
Apresenta uma colônia pulverulenta com uma elevação central e radiada. Possui
coloração de branca a bege, com o reverso de marrom-claro a amarelo. Ao
exame microscópico podem se observar numerosos microconídios arredondados
de paredes finas, isolados ou em cachos. Os macroconídios são raros, septados e
em forma de charuto. O que caracteriza esta espécie é a presença de hifas
espiraladas (ou gavinhas).
T. tonsurans
A colônia pode ser aveludada ou pulverulenta. Possui um aspecto de cera de vela,
com coloração de branca a amarelo claro. No exame microscópico podem ser
observados numeroso microconídios em forma de balão, dispostos lateralmente nas
hifas. Os macroconídio possuem uma parede grossa, porém são raros. Podem-se
obsevar clamidoconídios intercelulares ou terminais (são raros).
T. shoenleinii
A colônia apresenta uma superfície elevada com aspecto de cera. Ao exame
microscópico não se observa nenhuma estrutura, apenas um candelabro fávico
formado por hifas bifurcadas.
T. violaceum
Colônia aveludada de coloração branca a avermelhada com o reverso branco. No
exame microscópico, apresenta ausência de macro ou microconídios; culturas velhas
podem apresentar clamidoconídios. Possuem hifas largas e tortuosas.
Microsporum
M. canis
A colônia possui uma franja amarela e tipicamente estrelada, de coloração branca
com o reverso amarelo gema de ovo. No exame microscópico, apresenta números
macroconídios multisseptados, de parede grossa e rugosa, com 6 a 15 células
internas e possuem uma ponta afilada. Apresentam microconídios piriformes em
pequena quantidade.
M. gypseum
Apresentam uma colônia plana e pulverulenta de coloração marrom-canela. Ao
exame microscópico, podemos observar inúmeros macroconídios de forma elipsoide
e de parede delgada e rugosa, com 4 a 6 células internas. Os microconídios possuem
forma de clava e aparecem em pequena quantidade.
Epidermophytom
E. floccosum
Possui colônia granulosa ou algodonosa, com centro elevado de cor branca a verde-
amarelada. No exame microscópico, apresentam numerosos macroconídios de
parede lisa, depositados em cachos que crescem diretamente das hifas e possuem de
2 a 4 células internas. Os microconídios são ausentes.