MICROBIOLOGÍA DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS.LOS ALIMENTOS.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MÉTODOS DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE E INTERPRETACIÓN DE

RESULTADOSRESULTADOS

Blga. Patricia A. Núñez RamosBlga. Patricia A. Núñez Ramos

LA CONTAMINACIÓN DE LOS LA CONTAMINACIÓN DE LOS ALIMENTOSALIMENTOS

¿Qué es un alimento contaminado?¿Qué es un alimento contaminado?

Es todos aquel producto que contiene Es todos aquel producto que contiene sustancias o elementos ajenos a su sustancias o elementos ajenos a su

composición natural, en concentración composición natural, en concentración o cantidad tal que pueden causar daño o cantidad tal que pueden causar daño

a la salud del consumidor.a la salud del consumidor.

¿Cuántos tipos de¿Cuántos tipos de contaminación contaminación existe?existe?

Se reconocen tres tipos de contaminación: Se reconocen tres tipos de contaminación:

a)a) Contaminación biológicaContaminación biológica, cuando es , cuando es causada por bacteria y/o sus toxinas, causada por bacteria y/o sus toxinas, parásitos en su forma adulta o forma larvaria; parásitos en su forma adulta o forma larvaria; virus, hongos y sus toxinas naturales (hongos virus, hongos y sus toxinas naturales (hongos venenosos) y biotoxinas marinas.venenosos) y biotoxinas marinas.

b)b) Contaminación químicaContaminación química,, cuando es cuando es causada por sustancias químicas que llegan causada por sustancias químicas que llegan a los alimentos de forma accidental o por a los alimentos de forma accidental o por malas prácticas de los productores, malas prácticas de los productores, comercializadores o manipuladores en comercializadores o manipuladores en generalgeneral..

Ejemplos, de contaminación química:

Contaminación por metales pesados: plomo, cadmio, mercurio, cobre, etc; al usar recipientes que contienen estos metales.

Contaminación por plaguicidas aplicados en los productos agrícolas, cuando se aplican en exceso o a destiempo (no se respeta el número de días previos a la cosecha) venenos, insecticidas, sustancias químicas que se transportan o almacenan junto con alimentos.

También se considera como contaminación química la aplicación de aditivos alimentarios no autorizados o el uso en exceso de los autorizados.

c)c) Contaminación físicaContaminación física, cuando es , cuando es ocasionada por cuerpos extraños al ocasionada por cuerpos extraños al producto, por lo general visibles; producto, por lo general visibles; ejemplos: astillas de madera, ejemplos: astillas de madera, excremento de roedores, larvas de excremento de roedores, larvas de insectos, trozos de metal o vidrio, insectos, trozos de metal o vidrio, tierra, arena, piedras pequeñas, etc.tierra, arena, piedras pequeñas, etc.

INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE AL INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE AL ESTUDIAR LA MICROFLORA ESTUDIAR LA MICROFLORA

ALIMENTARIA:ALIMENTARIA:

- Permite conocer las fuentes de contaminación del Permite conocer las fuentes de contaminación del

alimento que se analiza.alimento que se analiza.- Valorar las normas de higiene utilizadas en la Valorar las normas de higiene utilizadas en la

elaboración y manipulación de los alimentos.elaboración y manipulación de los alimentos.- Detectar la posible presencia de flora patógenaDetectar la posible presencia de flora patógena

que suponga un riesgo para la salud delque suponga un riesgo para la salud del

consumidor, siendo este uno de los objetivos másconsumidor, siendo este uno de los objetivos más

importantes en Microbiología Alimentaria.importantes en Microbiología Alimentaria.

- Establecer en qué momento se Establecer en qué momento se producen producen fenómenos de alteración en los fenómenos de alteración en los distintosdistintos alimentos, con el fín de delimitar su alimentos, con el fín de delimitar su períodoperíodo de conservación. de conservación.

EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LOS PRODUCTOS ALIMENTARIOS DE LOS PRODUCTOS ALIMENTARIOS SE CONSIDERAN, PRINCIPALMENTE:SE CONSIDERAN, PRINCIPALMENTE:

- Calidad higiénico-sanitaria.- Calidad higiénico-sanitaria.- Calidad comercial.- Calidad comercial.

EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS ESTA BASADO, ALIMENTOS ESTA BASADO, ESENCIALMENTE:ESENCIALMENTE:

- Muestreo- Muestreo- Criterio microbiológico- Criterio microbiológico- Elección de técnica analítica- Elección de técnica analítica- Interpretación de los resultados - Interpretación de los resultados analíticos analíticos

PUNTOS DE MUESTREO DE PUNTOS DE MUESTREO DE ALIMENTOSALIMENTOS

* MERCADOS

* KIOSCOS ESCOLARES

• COMEDORES POPULARES

• RESTAURANTES

• SERVICIOS DE ALIMENTACIÓN EN

TRANSPORTE TERRESTRE

* ETC.

MATERIAL PARA LA TOMA DE MATERIAL PARA LA TOMA DE MUESTRA:MUESTRA:

CoolerCooler Plumón indeleblePlumón indeleble Gel refrigeranteGel refrigerante Bolsas de polietileno Bolsas de polietileno

de primer usode primer uso Frascos de vidrio Frascos de vidrio

con tapa rosca con tapa rosca estéril.estéril.

Pinzas estérilPinzas estéril

Ficha de muestreoFicha de muestreo Guantes Guantes

descartable.descartable. Protector de cabelloProtector de cabello GuardapolvoGuardapolvo AlcoholAlcohol AlgodónAlgodón Cucharas estérilesCucharas estériles Termómetro Termómetro

ambientalambiental

¿QUE ALIMENTOS SE MUESTREA?¿QUE ALIMENTOS SE MUESTREA?

• ALIMENTOS DE ALTO RIESGO

(PREPARADOS)

(200 gramos aprox.)

* ALIMENTOS ENVASADOS

¿CUÁLES SON LOS ALIMENTOS DE ¿CUÁLES SON LOS ALIMENTOS DE ALTO RIESGO?ALTO RIESGO?

* JUGOS * ENSALADA DE VERDURAS

* REFRESCOS * ENSALADA DE FRUTAS

* CEVICHE * AJI AMARILLO MOLIDO

* MAYONESA * SANDWICHS

* AJOS MOLIDOS * EMPANADAS

* CAUSA RELLENA * ETC.

* CREMA DE PAPA A LA HUANCAINA

* ROCOTO MOLIDO C/S CEBOLLA CHINA

CRITERIO MICROBIOLÓGICOCRITERIO MICROBIOLÓGICO Es la aceptabilidad de un alimento basado enEs la aceptabilidad de un alimento basado en

la presencia o ausencia de un determinado la presencia o ausencia de un determinado

número de microorganismos, parásitos por número de microorganismos, parásitos por

unidad de masa, volumen, área o lote. unidad de masa, volumen, área o lote.

Utilizado para la inocuidad alimentária.Utilizado para la inocuidad alimentária.

NORMA MICROBIOLÓGICANORMA MICROBIOLÓGICA

-“Criterios Microbiológicos de Calidad Higiénico

Sanitaria e Inocuidad para los Alimentos y

Bebidas de Consumo Humano”

Resolución Ministerial Nº 615- 2003-SA/DM

-“Norma Sanitaria para el Funcionamiento de

Restaurantes y Servicios Afines”

Resolución Ministerial

Nº 363-2005/MINSA

““Norma Sanitaria para la Fabricación de Norma Sanitaria para la Fabricación de Alimentos a Base de Granos y Otros, destinados Alimentos a Base de Granos y Otros, destinados a Programas Sociales de Alimentación”. a Programas Sociales de Alimentación”. Resolución Ministerial Nº 451-2006-MINSA.Resolución Ministerial Nº 451-2006-MINSA.

GRUPOS DE GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDASALIMENTOS Y BEBIDAS SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIASUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA

1. Leche y Productos Lácteos.2. Helados y Mezclas para Helados.3. Productos Grasos.4. Productos deshidratados.5. Cereales, leguminosas y derivados6. Azúcares y mieles7. Productos de confitería.8. Productos de panadería, pastelería y galletería9. Alimentos formulados (regímenes especiales)

GRUPOS DE GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDASALIMENTOS Y BEBIDAS SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIASUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA

10.Carnes y productos cárnicos

11.Productos Hidrobiológicos

12.Huevo y oviproductos.

13.Especias,condimentos y salsas.

14.Frutas y Verduras.

15.Comidas y Platos Preparados.

16.Bebidas.

17.Estimulantes y Fruitivos.

18.Conservas

19.Semiconservas

CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA ALIMENTOS DE ALTO PARA ALIMENTOS DE ALTO

RIESGORIESGO

Comidas preparadas sin tratamiento térmico (ensaladas crudas, mayonesas, salsa de papa huancaína, ocopa, postres, jugos, otros).Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin tratamiento térmico (Ej. Ensaladas mixtas, palta rellena, sandwichs, ceviche, postres, refrescos, otros).

Agente microbianoAgente microbiano

Límite por Límite por g/mLg/mL

mm

Aerobios mesófilosAerobios mesófilos 101055

ColiformesColiformes 101022

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus 1010

Escherichia coliEscherichia coli 1010

Salmonella sp. Salmonella sp. en 25 g/ mLen 25 g/ mL 00

Comidas preparadas con tratamiento térmico (ensaladas cocidas, guisos, arroces, asados, postres cocidos, arroz con leche, mazamorra, otros)

Agente microbiano

Límite por Límite por g/mLg/mL

mm

Aerobios mesófilos 101044

Coliformes 1010

Staphylococcus aureus 1010

Escherichia coli <3<3

Salmonella sp. en 25 g/ mL 00

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISISPARA SU ANÁLISIS::

Toma de muestras, aprox. 200 g o mLToma de muestras, aprox. 200 g o mL Cuando se trata de alimentos sólidos, Cuando se trata de alimentos sólidos,

es necesario someterlos previamente es necesario someterlos previamente a una suspensión, utilizando un a una suspensión, utilizando un diluyente estéril.diluyente estéril.

Diluyente:Diluyente: Agua peptonada salina Agua peptonada salina

Trituración de la muestra y obtener Trituración de la muestra y obtener una mezcla homogénea para lograr una mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los la distribución equilibrada de los gérmenes y sus toxinas.gérmenes y sus toxinas.

Ejm: Homogenizador -- StomacherEjm: Homogenizador -- Stomacher

(a base de (a base de paletas)paletas)

TÉCNICATÉCNICA PARA LA PREPARACIÓN DE PARA LA PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES:LAS DILUCIONES:

90 mLAPS

9 mL APS

10-1

10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL10 g de muestra

....

MÉTODO: CUALITATIVOMÉTODO: CUALITATIVO

PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g ó PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g ó mL de muestra.mL de muestra.

MÉTODO: CUANTITATIVOMÉTODO: CUANTITATIVO1.1. Tubos múltiples: NMP/g ó mL de Tubos múltiples: NMP/g ó mL de

muestramuestra

2.2. Recuento en placa: Recuento en placa: ufc/g ó mLufc/g ó mL

a. Por incorporacióna. Por incorporación

b. Por superficieb. Por superficie

MÉTODO CUALITATIVOMÉTODO CUALITATIVOMÉTODO CUALITATIVOMÉTODO CUALITATIVO

ENSAYOS:ENSAYOS:

1.1. Salmonella sp.Salmonella sp.

2.2. Vibrio choleraeVibrio cholerae

3.3. Listeria monocytogenesListeria monocytogenes

MÉTODO CUANTITATIVOMÉTODO CUANTITATIVO

1. Tubos múltiples1. Tubos múltiples Coliformes totalesColiformes totales Coliformes fecalesColiformes fecales Escherichia coliEscherichia coli

2. Recuento en placa2. Recuento en placa

a. Mesófilos aerobiosa. Mesófilos aerobios

a. Mohosa. Mohos

a. Levadurasa. Levaduras

a. Enterobacteriasa. Enterobacterias

a.a. Clostrid. perfringens Clostrid. perfringens

b.b. Staphylococccus Staphylococccus aureusaureus

b.b. Bacillus cereus Bacillus cereus

AISLAMIENTO E AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE IDENTIFICACIÓN DE

Salmonella sp.Salmonella sp.- Preenriquecimiento en medio líquido no Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo.selectivo.- Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.- Aislamiento diferencial sobre medios sólidos Aislamiento diferencial sobre medios sólidos

selectivos.selectivos.- Confirmación bioquímica de las colonias Confirmación bioquímica de las colonias

sospechosas.sospechosas.- Confirmación serológica de las colonias Confirmación serológica de las colonias sospechosas.sospechosas.

 

DETECCIÓN DETECCIÓN DEDE Salmonella sp.Salmonella sp.

 

     

 

 

25g o mL de muestra

225 mLmedio de pre-

enriquecimiento (A.P.T.)

Caldo Rappaport-Vassiliadis

(10 mL)

Caldo Selenito/Cistina

Incubar a 35°C por 20 horas

Incubar a 42°C por 24 h junto con los controles (+) y (-)

Incubar a 35°C por 20 h junto con los controles (+) y (-)

Estriado en medios selectivos

10 mL0.1 mL 1 mL

(100 mL) (10 mL)

ó

Agar Verde Brillante/

Rojo Fenol

Agar XLD óAgar SS

Incubar a 35°C por 24 hSi no aparecen colonias típicas, reincubar 18-24 h más a

35°C

Seleccionar colonias típicas o sospechosas

Estriar en Agar Nutritivo e Incubar a

35°C por 18-24 h

CONFIRMACIÓNBIOQUÍMICA

Agar TSI

Agar Úrea

Rx. Voges Proskauer

Rx.Indol

Agar

LIA

(+): Forma ácido, c/s

gas y H2S (+)K/A

(+): Color púrpura

K/K

(-): No vira a amarillo

(-): No vira a rosado o

rojo brillante

(-): No forma

anillo rojo

CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA

Rx (+): Aglutinación

Salmonella sp.

Detección deβ-Descarboxilasa

(-): Mantiene color del

medio

• ISO 6579, 1993

Salmonella enteritidis

Salmonella O antiserum poly A-I & Vi

Incubar a 35°C por 24 h

SalmonellaSalmonella sp.sp. en el medio de cultivo Agar en el medio de cultivo Agar

XLDXLD

Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar XLD y en Agar XLD y Agar Bismuto SulfitoAgar Bismuto Sulfito

Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar Verde en Agar Verde BrillanteBrillante

Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar Salmonella y Shigellaen Agar Salmonella y Shigella

NUMERACIÓN DE NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus

90 mLAPS 9 mL

APS 10-1

Inocular 1 mL de cada dilución por duplicado en placas Petri (14 mm) con Agar Baird Parker y esparcir con la espátula drigalsky.

10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL10 g de muestra

Incubar a 35ºC por 18-24 h

Si no hay crecimiento, reincubar a 35ºC por 24 h.

Seleccionar para la numeración, placas con un máximo de 200 colonias (típicas y/o atípicas ))

....

1 mL 1 mL

+ 0,3 mL de inóculo del Caldo BHI

0,3 mL plasma de conejo con

EDTA

PRUEBA DE COAGULASA

Staphylococcus aureus

Incubar a 35°C

Examinar luego de 4-6 h y hasta un máx. de 24 h y verificar la formación de coágulo

No hay formación de coágulo

Formación de coágulo

Prueba de coagulasa (+)

Prueba de coagulasa (-)

Aislar 5 colonias típicas y atípicas y colocar cada una de ellas en caldo BHI

Incubar a 35°C por 24 h

ISO 6888-1, 1999

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus en Agar Baird Parker en Agar Baird Parker

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus Prueba de coagulasa Prueba de coagulasa

NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS VIABLESVIABLES

90 mLAPS 9 mL

APS 10-1

Inocular 1 mL de cada dilución en placas Petri por duplicado

10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL10 g de muestra

Incorporar el medio Agar Plate Count*, homogenizar y que se solidifique.

Incubar a 35ºC por 48 h

Seleccionar para la numeración placas con un máximo de 250 colonias

ICMSF Vol. 1, 2da. Ed. 2000

....

•Agregar a 100 mL de medio PCA, 2 mL de TTC al 0.5% .

(TTC= 2.3.5 triphenil tetrazolium chloride)

1 mL 1 mL

MESÓFILOS AEROBIOS MESÓFILOS AEROBIOS EN AGAR PLATE COUNTEN AGAR PLATE COUNT

MESÓFILOS AEROBIOS MESÓFILOS AEROBIOS EN AGAR PLATE COUNTEN AGAR PLATE COUNT

COLIFORMES TOTALESCOLIFORMES TOTALES

90 mLAPS 9 mL

APS

10-1

10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL10 g de muestra

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Caldo lauryl sulfato

10 mL por tubo

Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:

Prueba Presuntiva

....

1 mL 1 mL

2 X X

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Caldo verde brillante bilis lactosa

10 mL por tubo

Leer los tubos

COLIFORMES TOTALES

Positivos: gas y turbidez

Negativos a gas y turbidez

ISO 4831:2006

Prueba confirmativa

Escherichia coliEscherichia coli

90 mLAPS 9 mL

APS

10-1

10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL10 g de muestra

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Caldo lauryl sulfato

10 mL por tubo

Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:

Prueba Presuntiva

....

1 mL 1 mL

PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO

Incubar a 44.5ºC por 24 - 48 horas

Caldo EC

10 mL por tubo

Leer los tubos

Sembrar en Agar EMB (Eosina azul de metileno)

Positivos: gas y turbidez

Colonias individuales, Bioquímica

Negativos a gas y turbidez

ICSMF - 2000

Prueba Confirmativa

Escherichia coli

INTERPRETACIÓN DE INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSRESULTADOS

Salmonella sp.Salmonella sp.

REPORTE:REPORTE:

AUSENCIA o PRESENCIA DE AUSENCIA o PRESENCIA DE

Salmonella sp.Salmonella sp. en 25 g de en 25 g de muestra.muestra.

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus

CÁLCULO:CÁLCULO:

Placa

Tipo de colonia

Nº de colonias/

dilución Selección de colonias

Bioquímica PRE

CÁLCULOufc

-1 -2 Prueba de Coagulasa

1 T 42 3 3 (+)

42 51,3

A 28 3 1(+) 9,3

2 T 52 3 2 (+) 34,7 56,0A 32 3 2 (+) 21,3

Promedio

53,7

Nº de colonias x inversa del volumen usado x factor de la dilución= 53,7 x 10 x 10 = 5370

REPORTE:

54 x 102 u.f.c. de Stap. aureus / g de muestra

MESÓFILOS AEROBIOSMESÓFILOS AEROBIOS

PlacaPlaca

Nº de Nº de colonias / colonias / dilucióndilución

RESULTADORESULTADO

(obtener la (obtener la media aritmética media aritmética

x factor de la x factor de la dilución)dilución)

REPORTEREPORTE-1-1 -2-2 -3-3

11 188188

190 x 10190 x 10

19x 1019x 1022 ufc ufc de mesófilos de mesófilos aerobios / g aerobios / g de muestrade muestra

22 192192

COLIFORMESCOLIFORMES TOTALES TOTALES

Tipo de Prueba

Nº de tubos

positivos/

diluciónSERIE TABLA

(NMP)REPORTE

-1 -2 -3

P.P. 3 3 2 15 x 10 NMP de

coliformes totales/ g de

muestra

P.C. 3 2 1 3-2-1 150

Escherichia coliEscherichia coli

Tipo de Tipo de pruebaprueba

Nº de tubos Nº de tubos positivos/positivos/

dilucióndilución SERIESERIE TABLATABLA

(NMP)(NMP)

REPORTEREPORTE

-1-1 -2-2 -3-3

P.P.P.P. 33 33 22 20 NMP de 20 NMP de Escherichia Escherichia coli coli / g de / g de muestramuestra

P.C.P.C. 22 22 11Bioquí-Bioquí-

micamica22 11 11 2-1-12-1-1 2020

CUADRO RESUMEN DE RESULTADOSCUADRO RESUMEN DE RESULTADOS

Agente Agente microbianomicrobiano

Límite Límite por g/mLpor g/mL Resultado Resultado

mm

Aerobios Aerobios mesófilosmesófilos

101055 19 x 1019 x 1022

ColiformesColiformes 101022 15 x 1015 x 10

Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus

1010 54 x 1054 x 1022

Escherichia coliEscherichia coli 1010 2020

Salmonella sp. Salmonella sp. en 25 gen 25 g

00 AusenciaAusencia

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

La muestra Nº 224, sobrepasa los La muestra Nº 224, sobrepasa los limites permisibles de limites permisibles de Staphylococcus Staphylococcus aureus, aureus, Coliformes y de Coliformes y de Escherichia Escherichia colicoli, según la Norma Sanitaria para el , según la Norma Sanitaria para el funcionamiento de restaurantes y funcionamiento de restaurantes y servicios afines. Comidas preparadas servicios afines. Comidas preparadas sin tratamiento térmico.sin tratamiento térmico.

R. M. Nº 363-005/MINSA.R. M. Nº 363-005/MINSA.

MUESTRAS DE ALIMENTOS

LAVADO DE MATERIALES

PREPARACIÓN DE MATERIALES

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

ANÁLISIS DE BEBIDAS GASIFICADAS

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO(DILUCIÓN DE LA

MUESTRA)

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO(DILUCIÓN DE LA MUESTRA)

COLOCANDO LA MUESTRA DILUIDAEN LA PLACA PETRI

MÉTODO RAPIDO-PLACA PETRIFILMANÁLISIS DE COLIFORMES- E. COLI

INCUBACIÓN

COLIFORMES TOTALES y COLIFORMES TOTALES y Escherichia coliEscherichia coli

ANÁLISIS DE SALMONELLA

Bacillus cereus Bacillus cereus en Agar MYPen Agar MYP

Mohos y Levaduras en Agar Mohos y Levaduras en Agar OGYOGY

MUCHAS GRACIAS …