Microorganismos eEngenharia Genética

Andrea PellinJean Paulo LemosLaryssa de LizJenniffer Carolina Silva

Universidade Federal de Santa CatarinaDisciplina de Microbiologia Geral – MIP7013

Conjunto de processos que permitem a manipulação do genoma de organismos vivos, com a conseqüente alteração das capacidades de cada espécie.

Engenharia Genéticaou

Tecnologia do DNA recombinante

Só se tornou possível com a aquisição de novos conhecimentos sobre o código genético.

Técnicas de DNA recombinante tiveram início em 1970

Utilização de vetores de clonagem e enzimas de restrição

Clonagem Molecular

Primeira experiência de clonagem realizada em 1972, por um grupo de pesquisadores chefiados por Paul Berg.

Em 1987 surgiu uma nova contribuição, a reação de polimerização em cadeia (PCR)

1- Obtenção do gene que se pretende transferir;

2- Introdução do gene em um vetor;

3- Transferência e clonagem do gene;

4- Triagem das células modificadas geneticamente;

5- Expressão do gene pelas células modificadas.

A manipulação genética envolve 5 passos:

1 – Isolamento do geneExtração do ácido nucléico é a primeira etapa.

Para realizar esse isolamento pode-se:

- Obter um fragmento de RNA e este transcrever-se em uma cadeia de DNA complementar = ação da transcriptase reversa.

- Extrair o DNA, que é então fragmentado pelas enzimas de restrição.

Participação das enzimas de restrição é muito importante. Possuem um padrão específico de corte da molécula de DNA.

Resulta em fragmentos genômicos que podem ser isolados, clonados e seqüenciados.

Tão importante quanto as enzimas de restrição são as ligases, enzimas que possuem a capacidade de ligar covalentemente as extremidades livres dos fragmentos de DNA.

2 – Introdução do gene em um vetorVetores de clonagem são veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada.

A tecnologia do DNAr também recorre a segmentos de DNA que possuem capacidade de se inserir, casualmente, em outros segmentos de ácido nucléico.

Sequências de inserção e Transposons

3 – Transferência e clonagem do geneConsiste na introdução do DNA recombinante (vetor + gene transferido) para uma célula hospedeira adequada.

Hospedeiros utilizados podem ser bactérias e leveduras

As leveduras apresentam vantagem em relação as bactérias por poderem suportar grandes fragmentos de DNA.

A célula hospedeira vai ser escolhida de acordo com o objetivo.

Célula hospedeira elevada capacidade de multiplicação o que permite a clonagem do DNA recombinante.

Hospedeiros Procarióticos- Vantagem de utilização por serem mais simples;- Escherichia coli;- Desvantagem: pela falta de membrana nuclear alguns genes eucarióticos não funcionam.

Uma célula hospedeira ideal deve ser fácil de manipular e propagar, deve estar disponível , com uma grande quantidade de cadeias geneticamente definidas.

Hospedeiros Eucarióticos

- Usados quando hospedeiros procarióticos não funcionam;- Suporta grandes fragmentos de DNA.- Saccharomyces cerevisae.

Fonte: http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Hospedeiros/Hospedeiros.html

4- Triagem das células

Nem todas as células hospedeiras captam o vetor recombinado, assim torna-se necessário selecionar as células hospedeiras.

Depende da utilização de bancos de DNA.

Pode-se também recorrer a bancos de cDNA que contém somente as sequências codificadoras de determinada proteína expressa no tipo de célula que está sendo usada.

5 – Expressão do gene

Técnicas de Engenharia Genética

Técnicas dna recombinante a partir de 1970

Vetores da engenharia genética

PLASMÍDEOSSão células bacterianas que contém pequenas moléculas de DNA circular Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas.

VÍRUS

Os vírus, principalmente o bacteriófago são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante.

A região mediana do cromossomo pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado.

Essa técnica é utilizada pelos cientistas para multiplicar um gene.

Enzimas de Restrição- A base da técnica do DNA recombinante é a utilização de enzimas de

restrição. - Essas enzimas são capazes de cortar uma molécula de DNA em locais bem

específicos

DNA recombinanteO DNA recombinante é uma molécula híbrida obtida pela união

de DNSs de fontes biologicamente diferente.

Clonagem Molecular• Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é

inseri-los em células bacterianas. Plasmídeos e células bacterianas são postos um em contato com o outro

• Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico.

• Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo.

• Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.

PCR – Reação de Polimerização em CadeiaSurgiu em 1987

Esta técnica permite amplificar determinado locus, quando se tem pouca quantidade de DNA genômico.

Polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus

Aplicações da Engenharia Genética

Biorremediação;

Produção de substâncias úteis aos seres humanos;

Vacinas;

Terapia gênica;

Bactérias que produzem toxinas contra parasitas;

Organismos geneticamente modificados.

BiorremediaçãoInserção de genes que codificam enzimas catabólicas específicas para a molécula-alvo;

Incorporação por plasmídios ou transposons;

Genes instáveis

Pseudomonas

Produção de Substâncias Úteis

Fonte: http://www.iisc.ernet.in/currsci/aug252005/614.pdf

Produção de Substâncias Úteis

Fonte: Recombinant DNA, 2d ed. Scientific American Books

Vacinas

Fonte: http://scielo.iec.pa.gov.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2176-62232011000200008&lng=pt

Terapia Gênica

Fonte: http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=2010_Lecture_22

Bactérias que produzem toxinas contra parasitas

Organismos Geneticamente Modificados

Biobalística

Agrobactérias

RegulamentaçãoEm 05 de janeiro de 1995 foi criada no Brasil a lei 8974, Normas para o Uso das Técnicas de Engenharia Genética e Liberação no Meio Ambiente de Organismos Geneticamente Modificados.

Em 1998 pela primeira vez que a MONSANTO conseguiu a aprovação para sua soja Roundup Ready a qual foi autorizada pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). Após essa aprovação, o Greenpeace e o Instituto de Defesa do Consumidor (IDEC) entraram com um processo na 6ª Vara de Justiça Federal contra a Monsanto e o governo. Esse processo marcou o inicio da moratória judicial para liberações comerciais de transgênicos no Brasil e fez com que as variedades transgênicas permanecessem fora do mercado entre 1998 e 2003.

Em 28 de janeiro de 2000 foi assinado o Tratado de Cartagena, é o único tratado internacional que trata do movimento transfonteiriço de transgênicos.

LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005

Regulamenta os incisos II, IV e V do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, cria o Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, reestrutura a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio, dispõe sobre a Política Nacional de Biossegurança – PNB, revoga a Lei no 8.974, de 5 de janeiro de 1995, e a Medida Provisória no 2.191-9, de 23 de agosto de 2001, e os arts. 5o, 6o, 7o, 8o, 9o, 10 e 16 da Lei no10.814, de 15 de dezembro de 2003, e dá outras providências.

Conselho Nacional de Biossegurança - CNBS

Composição Membro Efetivo do Colegiado - Ministro de Estado - Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior - Gabinete do Ministro

Finalidade Fixar princípios e diretrizes para a ação administrativa dos órgãos e entidades federais com competências sobre a matéria; Analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da conveniência e oportunidade socioeconômicas e do interesse nacional, os pedidos de liberação para uso comercial de OGM e seus derivados; Avocar e decidir, em última e definitiva instância, com base em manifestação da CTNBio e, quando julgar necessário, dos órgãos e entidades referidos no art. 16 desta Lei, no âmbito de suas competências, sobre os processos relativos a atividades que envolvam o uso comercial de OGM e seus derivados.

Comissão Técnica Nacional de Biossegurança - CTNBio

A CTNBio, integrante do Ministério da Ciência e Tecnologia, é instância colegiada multidisciplinar de caráter consultivo e deliberativo, para prestar apoio técnico e de assessoramento ao Governo Federal na formulação, atualização e implementação da PNB de OGM e seus derivados, bem como no estabelecimento de normas técnicas de segurança e de pareceres técnicos referentes à autorização para atividades que envolvam pesquisa e uso comercial de OGM e seus derivados, com base na avaliação de seu risco zoofitossanitário, à saúde humana e ao meio ambiente.

http://www.ctnbio.gov.br/

Referências Bibliográficas:

CANDEIAS, J.A.N. A engenharia genética. Saúde Pública, São Paulo, 25: 3-10,1991.

PENIDO, G.C.E. O início da genética de microrganismos no Brasil. In: REUNIÃO ANUAL DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS, 18., São Paulo, 1992. Programa e Resumos. São Paulo, USP; SBG, p. 25, set. 1992.

http://www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.html

http://www.songazetehaberleri.com/thermus-aquaticus-bakterisi-ozellikleri.html/thermus-aquaticus-bakterisi-ozellikleri-onemi-nedir

http://www.notapositiva.com/pt/trbestbs/biologia/12_o_rastreio_dos_transg_e_o_codigo_de_vida_d.htm