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vacuum
pump
boiling water
spark
discharge
liquid water in trap
water containing
organic compounds
water droplets
water in
condenser
electrodes
water out
CH4
NH3 H2O
H2
gases
H2O, CO, CO2, N2, H2S e H2
- 20 aminoácidos
- Açúcares
- Bases nitrogenadas
- ATP, etc
Componentes Orgânicos
Formação de polímeros de carbono
(macromoléculas)
Mundo do RNA
Eventos
químicos
RNA
armazenamento
catálise reprodução
CÉLULAS
PRIMITIVAS
MICROAMBIENTE
Molecular Biology of the Cell, 3º Edição
DNA -> RNA -> PROTEÍNA
C A T T C A C C T C G A T G C A C C T G
G T A A G T G G A G C T A C G T G G A C
3’ 5’
3’ 5’
C A U U C A C C U C G A U G C A C C U G
3’ 5’
Val Ser Gly Ala
Thr Trp
transcrição
tradução
DNA -> RNA -> PROTEÍNA
C A T T C A C C T C G A T G C A C C T G
G T A A G T G G A G C T A C G T G G A C
3’ 5’
3’ 5’
am
plific
açã
o
ENCODE CONSORTIUM
(2007)
Seqüenciamento do genoma = 21.000 genes codificantes de proteína
Caracterização de 1%
do genoma humano
High-throughput
bioinformática
Maior parte do DNA é transcrita
Regiões não-codificantes ou
silenciosas
Sobrepostas com ORF
Sítios múltiplos
de iniciação
ncRNAs
centenas a milhares por genoma
estrutural enzimática
Braço de ligação Braço de ligação
Região
catalítica
transporte
molde
(complexo
enzimático)
ncRNAs
centenas a milhares por genoma
ncRNAs Longos Regulação da tradução
modificações
epigenéticas
Xa Xi
regular a expressão de gene codificante de
proteína (cis)
2000: Nemátoda (Ruvkun lab)
2000: (Pasquinelli e col)
Conservado
entre várias
espécies
Fases do
desenvolvimento
embrionário
Let-7
2001: microRNAs
Grande classe de
pequenos RNAs
Publicação tripla na Science:
- C. elegans (Bartel D; Ambros V)
- invertebrados e vertebrados (Tuschl T)
2002: Plantas
(Bartel D)
microRNAs (miRNAs)
• pequenos RNAs de ~ 22 nt
• gene endógeno
• presente na maioria dos organismos multicelulares
• bastante conservados
• bloqueia a tradução
• modulam a expressão de genes envolvidos com
desenvolvimento em C. elegans, Drosófila e
mamíferos
• outras funções: defesa contra vírus; regulação de
genes envolvidos com proliferação celular
RNAi
fenômeno que promove o
silenciamento pós-transcricional
através de pequenos RNAs
evolutivamente conservado
RISC: RNA-Induced Silencing Complex
• endonuclease direcionada pelos siRNAs/miRNAs
• pode clivar o RNA alvo complementar aos siRNAs/miRNAs
• RECICLÁVEL
Algumas proteínas do complexo em mamíferos
• helicase: desenrola a dupla fita (Gemin-3)
• Proteína da família ARGONAUTA (RNase H)
- endoribonuclease: cliva o RNA-alvo (Ago2) ou não Ago1;3; 4
- 2 Domínios PAZ ligam-se ao siRNA (3´overhang 2nt)
- Domínio PIWI
exógeno
defesa
degradação
Complementaridade
Inibem a expressão gênica
Utilizam a Dicer e o RISC
siRNA miRNA
endógeno
desenvolvimento/
processos fisiológicos
impede a tradução
complementaridade
total
complementaridade
total ou parcial
X
siRNA miRNA =
Estrutura Gênica microRNAs
Kim V, 2005
isolado
cluster
Exon em
ncRNA
Intron em
ncRNA
Intron em
RNA
codificante
70
% i
ntr
ag
ên
ico
40%
Difícil estudar !
- Região alvo pode variar
para um mesmo miRNA
- Combinação de miRNA para
ocorrer o silenciamento
- Tecido específica
- Expressão temporal
miRNAs humanos
• 1527 microRNAs
• 1-3% dos transcritos são miRNAs
• 30-60% dos genes são regulados por
miRNAs
miRNAs
• Trabalhos:
clonagem
- novos miRNA
Clonagem
(concatâmeros)
extração de RNAs
pequenos
Ligação de
Adaptadores 3´ e 5´
Transcrição Reversa
PCR
sequenciamento
predição
- Validação
- Organização
/ Função
miRNAs
• Trabalhos:
regiões conservadas
3’ UTR (seed)
Localização no
genoma (seed)
Comparação com
outros organismos
precursor
predição
clonagem
- novos miRNA
predição
- Validação
- Organização
/ Função
miRNAs
• Trabalhos:
predição
clonagem
- novos miRNA
- Organização sinergia
gene hospedeiro
isolado
cluster
predição
- Validação
- Organização
/ Função
miRNAs
• Trabalhos:
predição
clonagem
- novos miRNA
- Validação
- Organização
/ Função RNAs-alvo
precursor
Painel de expressão: microarray
- 175 miRNAs em 24 órgãos humanos
- Presença e abundância
- Maioria amplamente expressa
- Co-expressão com outros miRNAs
- Paralelo com expressão de
hospedeiros
microarray Identificação de alvos
miR-124
miR -1
HeLa transfecção
- 12/24h Diminuiu a expressão de 100 genes
-88% da região 3’UTR tinha o motivo (5’- 2-7)
(mutação na semente)
miR-124 miR-1
-miRNAs específicos para cada
tipo celular
-depende da origem do tecido /
subgrupos
- Tumores têm baixo nível de
expressão de miRNAs (geral)
- marcador (Grau de
malignidade/ origem)
miR-127 cluster – ilha CpG – metilada em tumores
miR-127
BCL6 (proto-oncogene)
células tumorais + 5-AZA + PBA
proto-oncogene miRNA supressor tumoral
miR-17-92 cluster – superexpresso em tumores
supressor tumoral oncomiR
C-MYC
E2F1 apoptose
tumores expressão de miRNAs
- >50% dos miRs sítios frágeis – amplificações, deleções,
quebras e rearranjos
- Desregulação transcricional
- Problemas na biogênese
- Mutações e polimorfismos (SNPs)
- Modificações Epigenéticas
Identificação de alvos
- miR-16
miR-122
miR-192
miR-194
- específico e
prolongado (2 semanas)
(fígado)