Mini Curso Biotecnologia

7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia

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Faculdade de Cincias Sociais e Agrrias de Itapeva - FAIT

Mini curso

Biotecnologia na Agricultura

MsC. Mrian SberESALQ/EMBRAPA Meio Ambiente

[email protected]


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Agricultura antiga

Culturas sustentveis;

Rotaes de culturas resistncia pragas einsetos, no utilizao de defensivos qumicos;

Mnimo impacto ambiental

Agricultura moderna

Modernizao agrcola;

Objetivo: LUCRO

Monocultura;

Mecanizao;

Pragas, defensivos qumicos.


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BIOTECNOLOGIA

Impacto na comunidade global :Crise global de alimentos7-10x maior produo

Impacto positivo na sade humana :Menos gordura saturadaMais cidos graxos e mega 3

Impacto ambiental:Menor uso de pesticidasReduo de emisso de carbono


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Correo de solos

Enriquecimento do solo com micro-organismosbenficos que estabelecem relaes simbiticas com asrazes das plantas resultando em:

Proteo contra doenas

Promoo do crescimento de razes

Quebra de cadeias qumicas disponibilizando

nutrientes para as plantas


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Nutrio de plantas

Fixao de nitrognio em leguminosas e gramneas(inoculantes)

Aumento de nutrientes em fertilizantes de origemvegetal

Acelerao da decomposiode resduos vegetais


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Preveno e Controle de Pragas e Doenas

Os defensivos biolgicos baseados em micro-organismospossibilitam o controle das seguintes pragas e doenas:

Lagartas

Colepteros Percevejos Mosca-branca Nematides

Rhizoctonia solanii Phytium spp. Fusarium spp. Odio


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Bioremediao

Eliminao de sais

Reduo de metais pesados

Reduo de contaminaes por hidrocarbonetos

Revegetao


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OGM

O melhoramento gentico de plantas constitui-se amaior aplicao da biotecnologia na agricultura. Em 2007as culturas de milho, soja, canola, algodo e arrozgeneticamente modificados ocuparam 114 milhes dehectares e envolveram 10 milhes de agricultores em 22

pases. Em 12 anos de existncia a biotecnologia OGMmovimentou US$ 6 bilhes, com crescimento de 10 a 20%ao ano.


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+ Glyphosate

X

Plantas Sensveis ao Roundup

X

X

Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate

3-Enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate(EPSP)

PlantaEPSP synthase

Aminoacidosaromticos

Sem aminocidos,

Plantas morrem

X


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BacteriaEPSP synthase

Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate

3-enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate(EPSP)

Aminocidosaromticos

Plantas Resistntes ao Roundup

+ Glyphosate

Com aminocidos,

planta vive

RoundUp no tem efeito;enzima resistente ao herbicida


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Flavr Savr (Calgene)

Tomate transgnico Tomate tradicional

SUPERMERCADO

O tomate tradicionaltem de ser colhido

verde, para no seresmagado durante otransporte.

O tomate tradicional vaporizado com

etileno para induzir amaturao.

O tomate transgnicoamadurece na planta,

ficando com mais sabor.Mantm-se firme aps acolheita.


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Etapas no laboratrio


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O prximo teste no campo

No-transgenicos

Transgenicos

Resistencia ao herbicida


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Teste final dos transgnicosAceitao do consumidor

RoundUp Ready

Antes Depois


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CLONAGEM CELULAR


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Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA Recombinante

um conjunto de tcnicas que permite aos cientistas identificar,

isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos.

Clonagem de genes de

interesse para expresso eproduo de protenasrecombinantes: insulina,hormnio de crescimento genes de humanosclonados em bactrias;

Plantas transgnicas;

Animais transgnicos.

Clonagem molecular;

Vetores; PCR;

Bibliotecas genmicas;

Sequenciamento de DNA;

Hibridizao;

Eletroforese.


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Tecnologia do DNA recombinante: construo de umamolcula de DNA recombinante

DNA quimera

(DNA recombinante)Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem


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ENZIMAS DE RESTRIO

Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos

especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases -

palndromas


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Vetores de clonagem

Plasmdeos podem ser modificados para carregar novos genes

devem apresentar origem de replicao;

devem apresentar um gene para seleo (gene para resistncia a antibitico);

devem apresentar mltiplos stios de clonagem (poli-linker)


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PLASMDIOS E VETOR DE CLONAGEM

cromossomo plasmdeos

cromossomo plasmdeos

Diviso celular

ocorrem naturalmente em algumas bactrias; so molculas de DNA dupla fita e circular;muitas vezes carregam genes para resistncia a antibiticos; replicao independente da replicao cromossmica

(apresentam uma origem de replicao independente).


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Origem de replicao

Genes para resistnciaa antibiticos

Permite que a clula

hospedeira cresa em meio

seletivo

Mltiplos stios de

clonagem

Permite a insero de DNA

exgeno


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Transformao qumica

Eletroporao

Insero do DNA dentro da clula bacteriana


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Cassetes de transformao so produzidos nos laboratrios

Eles so introduzidos dentro das plantas

Dois mtodos principais:

Introduzir o gene na Planta

Agrobacterium

Gene GunCultura de tecido, deveRegenerar a plantatrangnica

Cl


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Clonagem

1 plasmdeo1 clulaTransformaoplasmdeo

recombinante

Recombinao

com o gene alvo

Enzima de

restrio

Enzima de

restrio

DN

Acromossm

ico

Gene alvo

DNA Recombinante

Transformao

Clula hospedeira

Juang RH (2004) BCbasics

A lifi S l


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Amplificao e Seleo

1

1 clula, 1 colnia

X100

X1,000

Duplicaoplasmdeo

Duplicaobactria

Plaquear

Isolar a colnia

com o gene de interesse

=100,000 Juang RH (2004) BCbasics


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1.Estrutura primria estrutura de nucleotdeos.

-Nucleotdeo = Acar + Fosfato + Base nitrogenada.

A ESTRUTURA DO DNA


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1 componente - Acar

A ESTRUTURA DO DNA


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A ESTRUTURA DO DNA

2 componente Base nitrogenada


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A ESTRUTURA DO DNA

3 componente Grupamento Fosfato.


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A ESTRUTURA DO DNA

Estrutura secundriaconfigurao tridimensional.

-Estrutura em dupla hlice.

-Ligaes fosfodister.

-Pontes de Hidrognio.

-Complementariedade de bases:

A -TG -C


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Dogma Central da Biologia Molecular


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DNA

RNA

Protena

Duplicao

Transcrio

Traduo

Transcriptase

Reversa

Transcriptoma

Proteoma

Genoma


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Extrao de DNA

No geral, toda extrao de DNA se baseia em 4 etapasbsicas:

1. Lise das membranas lipdicas;2. Purificao do DNA ;3. Precipitao do DNA;4. Reidratao do DNA.


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PCR: Polymerase Chain Reaction

(Reao em cadeia da polimerase)

O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no incio dadcada de 80 atribudo o Premio Nobel da Qumica pelo seu

trabalho.

um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias)de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo,

Escherichia coli(bactria) ou leveduras.


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1. Desnaturao (94-96C, 30-600 segundos).

Durante a desnaturao, a cadeia dupla do DNA separada em duas cadeias simples. A DNA polimerase estvel a altas temperaturas pois obtida de organismos que vivem

em ambientes extremos (extremfilos). A DNA polimerase mais usada a Taqpolimerase (obtida de Thermus aquaticus).

2. Annealing (emparelhamento, pareamento, hibridizao) (45-80 C, 30-120segundos).

Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simplese a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.

3. Alongamento (polimerizao) (65-80 C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar

medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucletideos

presentes na reao.

Aps cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, aps mltiplas ciclos, o aumentoda quantidade de DNA exponencial de base 2.

PCR: Polymerase Chain Reaction


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Reao em cadeia da polimerase (PCR)


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1 ciclo

2 ciclo

3 ciclo

4

ciclo

5 ciclo

6 ciclo

PCR amplifica DNA


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Que regentes so necessrios para uma reao de

PCR?

REAGENTES:1. DNA polimerase;2. Buffers (Soluo-Tampo)3. MgCl2

4. Primers5. DNA Molde6. dNTPs


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Como eu visualizo o material amplificado?

Eletroforese


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Eletroforese

l f d A


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Eletroforese de DNA


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5ul


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Anlise da Sequncia de DNA

nucleotdeo

base

acar

fosfato


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G C A T


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ABI 3700 Applied Biosystems


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Detecoa laser


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Aula prtica: Extrao de DNA

1. Utilizar 400 L de TEM soluo de homogeinizao, 40 L de 10% SDS e 8

L de proteinase-K2. Incubar 55C por 1h3. Adicionar 300 L de NaCl (soluo saturada)4. Vortex por 30 segundos5. Centrifugar por 30 min 14.000 g6. Transferir o sobrenadante para um tubo novo7. Precipitar o DNA utilizando um volume de isopropanol e manter a -20C

por 2h8. Centrifugar por 15 min 14.000 g (4C)9. Lavar o pellet de DNA com etanol 100% (1 mL) e centrifugar por 5 min

(14.000 g)

10.Lavar o pellet de DNA com etanol 70% (1 mL) e centrifugar por 5 min(14.000 g)

11.Secar a temperatura ambiente12.Ressuspender o DNA em 20 L de H2O milli-Q autoclavada13.Armazenar a -20C


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