Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA ...3,23 6,33 7,33 50 µg/L 3,92 2,54 2,49 4,90 5,01 150 µg/L 1,90 7,90 7,52 Precisão Repetitividade Valores médios n=6

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPALaboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MGDivisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BHMétodo de Ensaio – MET

Código: MET/LACQSA/BH/012 - V.1Fase: VigenteAprovado em: 01/09/14

Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas

Aprovado por: Eugênia Azevedo VargasNilson César Castanheira Guimarães

Verificado por: Roseane Brandão de Brito

Elaborado/Revisado por: Anelise Lapertosa Drummond

1.0 Objetivos e alcanceO MET “Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a

espectrômetro de massa” objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de

carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar por cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massa / massa (CG-MS-MS) e no registro de dados relacionados às análises, para que estes

sejam corretamente seguidos.

1.1 Abreviações

CE - carbamato de etila

CED - carbamato de etila deuterado

CID – dissociação por colisão induzida

CG – Cromatografia gasosa

CG-MS-MS - cromatografia gasosa/espectrômetro de massa/massa

LD50 – é a dose necessária de uma dada substância ou tipo de radiação para matar 50% de uma população em teste

LQ - limite de quantificação

MC – material critico

MRM – monitoramento de reação múltipla

PTFE – Politetrafluoretileno (teflon)

SE – Solução estoque

SI – Solução intermediária

2.0 FundamentosA determinação de CE na amostra de destilado de cana-de-açúcar é efetuada por injeção direta em um sistema

de cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa, que baseia na dissociação induzida por

colisão (CID), na segunda célula de colisão (quadrupolo 2), do triplo quadrupolo.

Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Página 1/23Cópia não controlada







Neste método o padrão de CE é injetado no CG-MS-MS no modo MRM e identificado pelo tempo de retenção de

10,7 minutos, pelo perfil de fragmentação que deverá apresentar as transições para o íon quantificador 62 →44

e qualificador 74 → 44 e a intensidade relativa dos íons diagnóstico (% pico quanlificador em relação ao

quantificador) do CE de 49% com faixa aceitável de 37 a 61% para o padrão e a amostra.

A confirmação é feita pela comparação dos espectros de massa do padrão e da amostra. Na amostra é

adicionado um padrão interno. É preparada curva de calibração do analito que será utilizado para quantificar as

amostras. A quantificação é feita pela interpolação em curva analítica e corrigida pelo percentual (%) de

recuperação do padrão dos analitos.

2.1 Características do métodoEste método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, com base no trabalho desenvolvido por

LACHENMEIER et al (2005, 2006) e BRUNO(2006). Na validação foram determinadas as seguintes figuras de

mérito: veracidade (em termos de recuperação, R%), obtidas por ensaios com amostras artificialmente

contaminadas, linearidade, exatidão e precisão (em termos de desvio padrão relativo, DPr% e DPR%), limite de

quantificação do método A validação do método foi orientada pelo POP/LACQSA/BH/011 “Validação de

métodos analíticos”, pelo Manual de Garantia Analitica da CGAL/2011 e pelo plano de estudo 073

“Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a

espectrômetro de massa”

O perfil de fragmentação foi feito pela análise em fullscan de cada analito, seguido do estudo dos íons produtos

e a definição das transições dos íons de quantificação e qualificação utilizados na elaboração do método em

modo de monitoramento de reação múltipa (MRM) no triplo quadrupolo apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Transições dos íons de quantificação, qualificação e tempo de retenção dos analitos.

Analitos Quantificador Qualificador Tempo de retenção (min)

Carbamato de etila 62 → 44 74→ 44 10,7

Carbamato de etila deuterado 64 → 44 - 10,5

A intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) foi calculada para








o analito CE que permiti determinar a faixa aceitável para o CE, a qual está dentro dos critérios da CEE

657/2002, que está de acordo com a tolerância máxima permitida para a intensidade relativa dos íons utilizando

várias técnicas de análises de espectrometria de massa (Tabela 2).

Tabela 2: Características obtidas dos íons quantificadores e qualificadores.

Analitos Quantificador Qualificador Intensidade relativa dos íons % Faixa aceitável (%)

Carbamato de etila 62 → 44 74→ 44 41 31 a 51

Carbamato de etila deuterado 64 → 44 - - -

De acordo com CEE 657/ 2002 a razão sinal/ruído dos íons dos analitos devem ser ≥ 3:1 o que pode ser

evidenciado quando se analisa o cromatograma de cada analito. No Plano de estudo 073 quando foram

analisados os cromatogramas de carbamato de etila e carbamato de etila deuterado em sua menor

concentração foi possível verificar que a razão sinal/ruído ≥ 3:1 dos picos eram atendidos.

Os parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação encontram-se descritos na Tabela

3 e Tabela 4.

Tabela 3: Parâmetros de desempenho do método utilizando padrão interno carbamato de etila deuterado

Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação

Veracidade na concentração do LQ (20 µg/L) Recuperação média: n= 6

recuperação 80 a 110% CEE 657/2002

92% (18,4 µg/L) Sim

Solução CE RSDr %

5,814,089,5720 µg/L

2,443,236,337,3350 µg/L

3,922,542,494,905,01

150 µg/L

1,907,907,52

PrecisãoRepetitividadeValores médios n=6

RSDr 10%

400 µg/L8,48

RSDr %








1,47Solução CE RSDR%

20 µg/L 8,8350 µg/L 6,70

150 µg/L 5,69

Precisão(precisão intermediária)Valores médio n=6

RSDR 15%

400 µg/L 7,52

Sim


20 µg/L 0,00350 µg/L 0,003

150 µg/L 0,003Horrat Precisão adequada por Horrat <1

400 µg/L 0,004

Sim

Seletividade/especificidade Teste t de Student com nível de probabilidade de 95%

Não há efeito matriz Sim

Faixa ótima de trabalho 20 a 400 µg/LFaixa da curva de calibração 20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/L


Aplicabilidade(matriz e faixa de concentração)

IN/SDA número 13 de 2005 -Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar Sim

Limite de detecção* (g/L)Cálculo matemático a partir da menor concentração da curva - uma previsão do limite superior

12,9 µg/L Sim

Limite de quantificação* (g/L) 20,0 µg/L SimIncerteza de medição no LQ* ± 8,0 µg/L (40%) Sim

Fonte: * de acordo com análise critica 067/2013 – Reportagem de resultado.

Para análise sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado observou-se na validação o desempenho

geral do método apresentado na tabela 4.

Tabela 4: Parâmetros de desempenho do método sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado


Veracidade na concentração do LQ = 20 µg/L Recuperação média: n= 6

Recuperação 80 a 110% CEE 657/2002

93% (18,5 µg/L) Sim

Solução CE RSDr %5,814,089,6720 µg/L

9,943,236,647,03

PrecisãoRepetitividadeValores médios n=6

RSDr 10%

50 µg/L

4,11

Sim








2,542,494,635,01

150 µg/L

1,887,9

7,528,47400 µg/L

1,47Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação

Solução CE RSDR %20 µg/L 8,7350 µg/L 6,94

150 µg/L 5,62

Precisão(precisão intermediária)Valores médio n=6

RSDR 15%

400 µg/L 7,52

Sim

20 µg/L 0,00350 µg/L 0,003

150 µg/L 0,003Horrat Precisão adequada por

Horrat <1400 µg/L 0,004

Sim

Seletividade/especificidade Teste t de Student com nível de significância de 95%

Não há efeito matriz Sim

Faixa ótima de trabalho 20 a 400 µg/L

Faixa da curva de calibração 20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/L

Aplicabilidade(matriz e faixa de concentração)

IN/SDA número 13 de 2005 - Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar Sim

Limite de detecção (g/L)

Cálculo matemático a partir da menor concentração da curva – uma previsão do limite superior

13,0 µg/L Sim

Limite de quantificação(g/L) 20,0 µg/L Sim

Incerteza de medição no LQ* ± 8,0 µg/L (40%) SimFonte: * de acordo com análise critica 067/2013 – Reportagem de resultado.

2.2 AplicabilidadeO método validado é aplicável à determinação do contaminante CE em cachaça e aguardente conforme os

resultados obtidos na validação do método. Atende o limite máximo de CE de 150µg / L definido na normativa

SDA Nº 13 (BRASIL, 2005) para o CE cachaça e aguardente de cana-de-açúcar.

3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos








A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários para realização dos procedimentos

descritos neste MET em particular os Materiais críticos (MC - cuja qualidade afeta o resultado analítico)

encontram-se na planilha PLN/DLAB/PL/007 - V.4 – “Lista de Materiais de Consumo por Procedimento” e a

planilha com as peças de reposição do cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo

Agilent 7000A.

Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do

formulário FOR/LACQSA/BH/021 “Solicitação de material de consumo”. As quantidades das soluções

necessárias para as análises deverão ser verificadas.

Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo

de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025 “Solicitação de material ao preparo”.

Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque devem-se observar

os procedimentos descritos no documento de suporte DS/LACQSA/BH/011 “Aquisição de materiais de consumo”

para solicitação dos mesmos.

Nota 1: As vidrarias descritas na PLN/DLAB/PL/007 acima referenciada apresentam especificações completas compatível com a vidraria desejável e em processo de aquisição. Por uma questão de disponibilidade e adequação, enquanto não se adquire o material desejado, as análises serão realizadas com as vidrarias disponíveis.

3.1 Vidrarias em geral

- balão volumétrico calibrado nos volumes de 10, 50, 100 e 1000 mL (MC);

- becker de 25, 50, 100, 600 e 1000 mL;

- frascos reagente de vidro borossilicato, âmbar, capacidade de 250, 500 e 1000 mililitros;

- frasco tipo vial de 15 e 100 mL com tampa de rosca e teflon para guardar amostras e padrões;

- pipetas Pasteur

- proveta de 100, 500 e 1000 mL de preferência calibrada.

3.2 Materiais de suporte








- barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 L;

- bastão em vidro borossilicato;

- bulbo de amostragem de borracha natural;

- cuba para recolher materiais limpos e utilizados;

- espátula em aço inoxidável;

- gás Hélio Analítico (MC);

- gás nitrogênio (MC);

- papel alumínio;

- papel toalha;

- pissetas de 500 mL;

- ponteiras descartáveis para pipetas automáticas com volumes de 20 a 100 µL, 200 a 1000 µL e 1 a 10 mL.

3.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS

- coluna capilar HP-INNOWAX (60 m x 0,25 mm x 0,25 um) (MC);

- septo azul, PTFE/ silicone/PTFE vermelho silicone, com tampa de rosca;

- frasco tipo vial de 2 mL.

3.4 Padrões

Para assegurar que as medições feitas sejam rastreáveis ao Sistema Internacional de Unidades (SI), o

laboratório deve utilizar material de referência certificado acompanhado de uma documentação emitida por um

organismo com autoridade, a qual fornece um ou mais valores de propriedades especificadas com as incertezas

e rastreabilidade associada, utilizando procedimentos válidos. Caso este produto não esteja disponível no

mercado, o laboratório utilizará o de melhor qualidade disponível (padrão de trabalho, segundo o

POP/DLAB/PL/001).

- Carbamato de etila – Padrão Analítico de Uretane, pureza:≥ 99,0%(CG)

- Carbamato de etila deuterado - Padrão Analítico de Uretane-D5, pureza: 99% (CP)








3.5 Reagentes e solventes

Os reagentes utilizados neste procedimento seguirão a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e controle de lotes de

insumos (reagentes, solventes e soluções)” que descreve os procedimentos a serem adotados no preparo e

controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de

reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.

- Água tipo 1 conforme a ISO 3696:1987

- Etanol pa., pureza mínina de ≥ 99,9 %

4.0 EquipamentosUtilizar os equipamentos observando: os procedimentos descritos em suas respectivas instruções de trabalho , o

Plano de Equipamentos e o POP/LAQCSA/BH/002 “Controle de Equipamentos” considerando a adequação dos

instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a adequada execução deste procedimento.

Verificar o desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para micropipetas

e balanças proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas.

Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados nesse MET, sendo que outros podem ser

utilizados desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nas fichas

de análise ou formulário. Utilizar, preferencialmente, vidrarias volumétricas, balanças e micropipetas calibradas.

O desempenho do cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa deve ser verificado utilizando o

formulário FOR/LACQSA/BH/053 “Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector

de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)” antes da análise ou uma vez por semana ou se o equipamento foi

desligado. Também se deve verificar o número de injeções realizadas com o liner e o septo do auto - injetor que

devem ser trocados após ± 250 injeções e se necessário a limpeza ou troca da seringa do auto – injetor

consultando a FOR/LACQSA/BH/118 “Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de

massas Agilent (CG-QQQ)”.

4.1 Equipamentos críticos

- balança analítica de precisão com ± 4 casas decimais calibrada e tolerância ± 0,00005;

- cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo Agilent 7000A qualificado;








- geladeira – temperaturas de 2 a 8 °C;

- micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µL;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µL;

- micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 1 a 10mL com menor divisão de escala de 20 µL.

4.1.2 Equipamentos de suporte

- capela de exaustão;

- purificador de água purelab option Q. – marca Elga.

5.0 Precauções analíticas

O CE é classificado pela Internation Agency for Research on Câncer (IARC) como possivelmente carcinogênico

para o homem, da classe 2B. Sua toxicidade aguda é relativamente baixa, sendo a LD50 na ordem 2,5 g/kg de

peso corporal. O CE não é diretamente carcinogênico nem mutagênico, mas sua atuação pelo citocromo P-450,

origina metabólitos tóxicos considerados como genotóxicos, mutagênicos e clastogênicos, especialmente na

presença de ativação metabólica (IARC- 2007-03-01).

Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança consultar o POP/LACQSA/BH/003

“Ambiente e segurança”. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções

particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó e sapatos fechados),

evitando qualquer contato de solventes e reagentes com a pele e/ou os olhos.

Utilizar vidraria limpa, livres de detergente e resíduos. Ao final da análise, o material utilizado deverá ser lavado

conforme o IP/LACQSA/BH/OO1 “Descontaminação e preparo de material”.








A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado,

considerando a natureza de cada um e as informações contidas na FISPQ - ficha de segurança de produtos

químicos. Consultar o POP/LACQSA/BH/004 “Gerenciamento de resíduos e documentação associada”.

6.0 ProcedimentosO analista deve selecionar as amostras que serão analisadas, inclusive aquelas para fins de controle

intralaboratorial em acordo com o responsável.

Os procedimentos referentes ao controle intralaboratorial estabelecidos no POP/LACQSA/BH/009 “Garantia da

qualidade analítica” devem ser realizados com amostras controles (AC) em ensaios cegos e não cegos.

As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento da ficha FOR/LACQSA/BH 024 “Comunicado e

solicitação de amostras”. Estas serão entregues acompanhadas das respectivas fichas de acompanhamento de

amostras FOR/LACQSA/BH/061 “Registro de amostra para análise físico-química de bebidas” e

FOR/LACQSA/BH/062 “Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidas”.

O formulário FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análise de bebidas (Carbamato de etila e

congêneres)” deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de

detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada

folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha.

Organizar as soluções e materiais utilizados na análise.

Ao final da análise:

Os resíduos de analise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente

identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004 -

“Gerenciamento de Resíduos”.

Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e ou

frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as soluções e

materiais utilizados na análise.








Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH 003 -

“Ambiente e Segurança”.

6.1 Preparo de soluções

Os reagentes e soluções utilizadas neste procedimento seguiram a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e controle de

lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)” que descreve os procedimentos a serem adotados no

preparo e controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de

reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.

Rotular as soluções preparadas utilizando etiqueta própria, preenchendo adequadamente o lote de origem dos

insumos registrados no FOR/LACQSA/BH/006 “Controle de lotes e insumos para análise”, descrição da solução,

lote e insumos utilizados, data de preparo, data de validade, responsável/preparo, utilização, temperatura de

armazenamento.

O preparo e as quantidades das soluções necessárias para a análise devem ser preparadas seguindo os

procedimentos descritos neste MET, sendo que as soluções padrões de carbamato de etila devem ser feitas no

dia da análise.

Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as

necessidades das análises respeitando as devidas proporções.

6.1.1 Preparo da solução de etanol a 40% (v/v)

Medir em uma proveta 400 mL de etanol e em outra proveta 600 mL de água tipo 1. Transferir para um para um

frasco com tampa de 1000 mL e homogeneizar a solução. Rotular a solução e armazenar em temperatura

ambiente. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para

análises de bebidas”.

6.1.2 Preparo das soluções estoque (SE) de carbamato de etila (2000 mg/L)








Em um balão volumétrico de 10 mL calibrado colocar ± 1 mL de solução de etanol a 40 %. Pesar 20 mg ± 0,05

mg do padrão CE. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e transferir para um

frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o formulário

FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.

6.1.3 Preparo das soluções estoque de Carbamato de etila deuterado(1000 mg/L)

Em um balão volumétrico calibrado de 100 mL colocar ± 10 mL de solução de etanol a 40%. Pesar 100 mg ±

0,05mg do padrão CED. Completar o volume com solução de etanol a 40%. Homogeneizar e transferir para um

frasco âmbar, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o formulário

FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.

6.1.4 Preparo das soluções intermediária (SI) de carbamato de etila (10 mg/L)

Em um balão volumétrico de 10 mL calibrado colocar ± 1 mL de solução de etanol a 40 % e adicionar 50 µL da

solução estoque de carbamato de etila. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e

transferir para um frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o

formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.

6.1.5 Preparo da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L)

Em um balão volumétrico de 50 mL colocar ± 5 mL de solução de etanol a 40 % e adicionar 500 µL da solução

estoque de carbamato de etila deuterado. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e

transferir para um vial de 50 mL, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C.

Preencher o FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas” e o

FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”

6.1.6 Preparo da curva de calibração








Os procedimentos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração de CE devem ser registrados

no formulário o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de

bebidas” e no FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e

congêneres)”, que deverá ser arquivada juntamente com as planilhas de resultado na pasta de

acompanhamento de análise.

A curva de calibração é preparada em 6 níveis de concentração de CE, sendo cada uma preparada em um

balão volumétrico de 10 mL calibrado, numerado de 1 a 6 e registrada no FOR/LACQSA/BH/039

“Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”. Em cada balão volumétrico de

10 mL calibrado adicionar ± 1 mL da solução de etanol a 40 %. Colocar 50 µL da solução intermediária do

padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L) em cada balão volumétricos de 10 mL com auxílio de

uma micropipeta calibrada, que corresponderá a concentração de 50 µg/L do padrão interno. Adicionar a

solução intermediária do padrão de carbamato de etila (10 mg/L) em cada balão seguindo a Tabela 5, com

auxílio de uma micropipeta calibrada.

Tabela 5: Preparo da curva de calibração de carbamato de etila.

Carbamato de etilaNíveis da Curva de Calibração

Concentração (µg/L) Volume SI (µL)

1 20 20

2 50 50

3 150 150

4 300 300

5 400 400

6 600 600

Completar o volume de cada balão volumétrico com solução de etanol 40 %. Homogeneizar as soluções dos

balões volumétricos e colocar cada solução da curva de calibração em 3 vials de 2 mL identificados. Os








restantes das soluções da curva de calibração serão descartados no final da análise, seguindo o

POP/LACQSA/BH/003 “Ambiente e Segurança” em recipientes adequados, devidamente identificados para

coleta posterior.

6.2 Preparo dos controles analíticos

Em cada batelada de análise será injetado 1 branco reagente, 1 branco de amostra e 3 brancos de amostra

fortificadas em três níveis de concentração do analito carbamato de etila que serão utilizados para avaliar o

processo de análise.

- Preparar o branco reagente em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da

solução de etanol a 40 % e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do

padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L.

Completar o volume do balão volumétrico de 10 mL com solução de etanol 40% e homogeneizar. Em um vial

identificado colocar ± 500 µL desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser

reutilizados os septos).

- Preparar a amostra branco em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da

amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do padrão

interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L. Completar o

volume do balão volumétrico de 10 mL com a amostra branco e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ±

500 µL desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos).

- Preparo das amostras fortificadas será realizado em 3 balões volumétrico de 10 mL calibrado identificados

R1, R2 e R3. Colocar ± 1 mL da amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibradas adicionar 50 µL da

solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L

do padrão interno, e as quantidades da solução intermediária de carbamato de etila (10 mg/L) em cada balão

seguindo a Tabela 6.

Tabela 6 - Concentração do padrão de carbamato de etila utilizados para preparo das amostras fortificadas.

Carbamato de etilaAmostras fortificadas Concentração (µg / L) Volume SI (µL)








R1 20 20

R2 50 50

R3 150 150

Completar o volume de cada balão volumétrico com amostra branco. Homogeneizar os balões volumétricos e

colocar cada amostra fortificada em vials de 2 mL identificados com uma tampa com septo novo (não devem ser

reutilizados os septos).

Nota 02: caso não tenha amostra branco para realizar a análise, o controle (amostra branco) será uma solução de etanol 40 % adicionada de 50 µL da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a amostra fortificada.

Nota 03: podem ser usadas outras concentrações para o preparo das amostras fortificadas, desde que estejam contemplados na faixa de trabalho.

6.3 Preparo das amostras

As amostras são injetadas sem nenhum processo de extração, somente será adicionado o padrão interno

carbamato de etila deuterado (10 mg/L).

Em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da amostra e com auxílio de uma

micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado

(10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L. Completar o volume do balão volumétrico de 10 mL

com a amostra e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ± 500 µL desta solução e fechá-lo com uma

tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos).

6.4 Injeção das amostras

Antes de injetar a curva padrão de CE deve-se injetar o padrão CE de maior concentração da curva de

calibração (600µg/L) por duas vezes. Avaliar o tempo de retenção, as características dos íons quantificador e

qualificador de acordo com a Tabela 1 e a intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em








relação ao quantificador) se atende a faixa de aceitável de acordo com os critérios da CEE 657/2002

apresentado na Tabela 2 e registrar no formulário FOR/LACQSA/BH/044 “Controle de injeção do padrão

carbamato de etila”.

Injetar os padrões da curva de calibração, o branco reagente, o branco da amostra, as amostras fortificadas e as

amostras no cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa utilizando o método CE1.M com as

seguintes condições:

Injetor:Capacidade da seringa: 10 µL

Volume de injeção: 2 µL Modo: split Razão:5:1 Temperatura do injetor: 230 oC

Tabela 7: Lavagem e ambiente da seringa de injeção do auto injetor do CG-MS-MS

Lavagem Pré injeção Pós injeção Volume (µL)

Solvente (Etanol 40%) 6 8 Máximo

Amostra 6 - 2

Ambiente da amostra 6 - -

Forno:Tempo de equilíbrio: 0,5 minutos

Coluna: HP-INNOWAX (60 m x 250 µm x 0,25 µm)

Gás de arraste: hélio 1,5 mL/min

Tabela 8: Programação do forno do CG-MS-MS

Taxa 0 oC / min Valor oC Tempo de espera min Tempo de corrida min

Inicial 90 1

10 185 0

30 230 2 14,00

Célula de colisão: Gás da célula de colisão: Nitrogênio 1,5 mL/min

Hélio 2,25mL/min








Linha de transferência (Transfer Line):Temperatura: 230 oC

- Montar a sequência de injeção no CG de modo aleatório colocando os padrões da curva de calibração, o

branco reagente, a amostra branca, as amostras fortificadas e as amostras a serem analisadas.

7.0 Resultados

7.1 Cálculos

Calcular a concentração do CE nas amostras pela interpolação em curva analítica que será realizado utilizando

a planilha PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de

cana-de-açúcar’’, que permite a obtenção do resultado final corrigido pela recuperação e expressa o valor da

incerteza expandida (U) (K=2) para esta medida, expressos em µg/L representada pela equação abaixo.

Equação 1 RIRCE CFCb

aAPCALµgC

)(/

ACPA = área cromatográfica do pico da amostra

a = intercepto da curva de calibração (µg/L);

b = inclinação da curva de calibração (µg/L);

FCR = fator de correção devido ao erro sistemático da recuperação FCR=1 e

CRI = correção devido à reprodutibilidade interna do laboratório CRI=0;

Utilizar a planilha PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas

destiladas de cana-de-açúcar’’ para obter o resultado final de cada amostra e das amostras branco

contaminadas.

7.2 Reportagem do resultado

- Declarar se o resultado é corrigido ou não pela recuperação do controle.








- Declarar os valores em porcentagem da recuperação obtida pelos controles.

- Declarar a Incerteza expandida estimada com probabilidade de abrangência 95%.

- Reportar o fator de abrangência K.

A expressão do resultado e da incerteza de medição deve ser (y±U: Resultado ± Incerteza). Quando expressa em

tabela ou Quadro a incerteza deve ser reportada sem o sinal ±.

Sendo: y = resultado= mensurando e U= incerteza expandida com 95% de probabilidade de abrangência.

Importante:

y= corrigido pela recuperação quando aplicável

y= corrigido pelo erro sistemático a princípio somente para procedimentos analíticos quando o erro sistemático

impactar significativamente os resultados.

A incerteza expandida de medição declarada é baseada em uma incerteza padrão multiplicada pelo fator de

abrangência K, com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. Podendo reportar também o K

calculado pelas planilhas que sempre é calculado com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente

95%.

A incerteza é estimada pontualmente por amostra, respeitando a faixa de trabalho de cada método. Quando a

concentração do analito exceder a faixa de trabalho a amostra deve ser diluída de forma que sua concentração

fique dentro da faixa de trabalho validada pelo laboratório para cada um dos seus métodos.

A incerteza é reportada na mesma unidade do mensurando (do analito) de acordo com a unidade da legislação

vigente ou limite crítico estabelecido pelo Laboratório.

A incerteza será reportada com dois (2) algarismos significativos, conforme o proposto pelo GUM, 2012.

O número de algarismos significativos da incerteza poderá ser maior que dois para atender o valor e a unidade

da legislação quando justificável.








A unidade da reportagem de resultado poderá ser modificada, quando necessário ou quando o cliente assim

exigir. Logo a unidade poderá ser modificada para continuar atendendo a premissa de a incerteza ser

representada por dois (2) algarismos significativos.

Os cálculos dos resultados analíticos e da incerteza de medição analítica, realizados na planilha

PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-

açúcar’’ serão efetuados considerando todos os algarismos significativos e não serão arredondados até a

emissão do resultado final. Ao final, quando o resultado for reportado, será utilizada a mesma regra de

arredondamento realizado pelo EXCEL.

Os limites de detecção e quantificação serão representados nas mesmas condições descritas acima.

Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme

apresentado na Tabela 1 – “Parâmetros de desempenho do método”. Os limites de quantificação e de detecção

do método são respectivamente 20,0 g/kg e 13,0 g/kg.

A amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação deve ser reanalisada para confirmação.

Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a análise.

Nota 04: os resultados da recuperação servirão para alimentar a planilha PLN/LACQSA/BH/038 “Carta controle

para monitoramentoi físico-quimica de bebidas”.

Nota 05: também serão monitorados em carta controle os resultados das áreas do padrão interno carbamato de

etila deuterado utilizados nas análises de rotina na planilha PLN/LACQSA/BH/038 “Carta controle para

monitoramentoi físico-quimica de bebidas”.

Reportar o resultado da análise caso os resultados obtidos dos controles analíticos estiverem dentro dos

critérios de aceitabilidade do método estabelecidos durante a validação e da CEE 657/2002 Tabelas 3, 4, como

as transições dos íons de quantificação e qualificação determinados, o tempo de retenção (Tabela 1) e a

intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) Tabela 2.








Se os resultados estiverem dentro dos critérios de aceitabilidade do método os resultados deverão ser

registrados no FOR/LACQSA/BH/062 “Reportagem de resultado analítico de físico-química de bebidas” que

deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhados à URPA.

7.3 Eventualidades

Desvios dos procedimentos estabelecidos neste MET somente devem ocorrer se esses desvios estiverem

documentados, tecnicamente justificados e autorizados pelo Responsável e aceitos pelo cliente (conforme

descrito na norma ABNT NBR ISO/IEC 17025: 2005, página 13, item 5.4.2).

Em caso de trabalho de ensaio não conforme, registrar no FOR/LACQSA/BH/071 “Controle de trabalho de

ensaio não conforme (TNC)”, arquivar cópia em pasta específica na GTA e junto aos registros da análise em

questão. Referenciar o registro do TNC no campo de observações do formulário de acompanhamento de análise

FOR/LACQSA/BH 039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”.

8.0 ResponsabilidadesAs atribuições e responsabilidades estão definidas na DS/LACQSA/BH/001 “Atribuições e Responsabilidades” e na DS/LACQSA/BH/005 “Descrição de Função”. 9.0 ReferênciasBRASIL. Instrução Normativa no 31, de 29 de junho de 2005. Diário Oficial da União. Brasília, 30 de junho de 2005.

BRUNO, S. N. F. Adequação dos processos de destilação e de troca iônica na redução dos teores de carbamato de etila em cachaças produzidas no estado do Rio de Janeiro. Tese de doutorado – UFRJ. 2006.

CEE 657/2002 (CCα e CCβ). Decisão da Comissão de 12 de agosto de 2002. Jornal Oficial da União Européia, L221, pp 8-36, 17.08.2002.

Etanol: http://www.qca.ibilce.unesp.br/prevencao/produtos/etanol.html. Acesso outubro 2012.

IARC (2007-03-01 http://www.apolnet.ca/resources/pubs/respapers/IARC-Vol96-AlcoholicBeverage Consumption-Feb2007.pd

LACHENMEIER, D.W.; FRANK, W.; KUBALLA, T. Application of tandem mass spectrometry combined with gas chromatography to the routine analysis of ethyl carbamate in stone-fruit spirits. Rapid Communicantions in Mass Spectrometry.19, 108-112,.2005.

LACHENMEIER, D.W.; NERLICH, U.; KUBALLA, T. Automated determination of ethyl carbamate in stone-fruit spirits using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J. Crhomatography A. 1108, 116 -120, 2006.


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NIT-DICLA-030. Rastreabilidade metrológica ao sistema internacional de unidades na acreditação \de laboratórios e no reconhecimanto da conformidade aos princípios das BPL. revisão 04; página 1-5, jul 2011.

Relatório do plano de estudo 073- Análise e carbamato de etila em cachaça. MAPA- LACQSA. 06/07/2012.

10.0 Documentos referenciadosIP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de materialIS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)POP/DLAB/PL/001-Inventário e Especificação de Materiais de ConsumoPOP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratórioPOP/LACQSA/BH/009-Garantia da qualidade analíticaPOP/LACQSA/BH/011-Validação de métodos analíticos

11.0 Anexos referenciadosDS/LACQSA/BH/001-Atribuições e responsabilidadesDS/LACQSA/BH/005-Descrição de FunçãoDS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumoFOR/LACQSA/BH/006-Controle de lotes de insumos para análiseFOR/LACQSA/BH/021-Solicitação de material de consumoFOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostrasFOR/LACQSA/BH/025-Soliciação de material ao preparoFOR/LACQSA/BH/039-Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)FOR/LACQSA/BH/044-Controle de injeção do padrão carbamato de etilaFOR/LACQSA/BH/053-Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)FOR/LACQSA/BH/061-Registro de amostras para análises fisico-químicas de bebidasFOR/LACQSA/BH/062-Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidasFOR/LACQSA/BH/071-Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC)FOR/LACQSA/BH/118-Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ)FOR/LACQSA/BH/137-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises físico-químicas de bebidasPLN/DLAB/PL/007-Lista de Materiais de Consumo por ProcedimentoPLN/LACQSA/BH/038-Carta controle para monitoramento físico-químico de bebidasPLN/LACQSA/BH/057-Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açucar

12.0 Informações de registro Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ) - FOR/LACQSA/BH/118 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamatode etila + congêneres) - FOR/LACQSA/BH/039








Carta controle para monitoramento físico-química de bebidas - PLN/LACQSA/BH/038Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)Controle de injeção do padrão de carbamato de etila - FOR/LACQSA/BH/044 Controle de lotes de insumos para análise (FOR/LACQSA/BH/006)Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas - FOR/LACQSA/BH/137Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC) (FOR/LACQSA/BH/071)Lista de Materiais de Consumo por Método de Ensaio/Procedimento Operacional Padrão/Instrução de Serviço/Instrução de Preparo/Instrumento de Medição/Plano de Estudo (PLN/DLAB/PL/007)Registro de amostra para análises físico-químicas de bebidas (FOR/LACQSA/BH/061)Reportagem de resultado analíticos de físico-química de bebidas - FOR/LACQSA/BH/062Resultado da determinação de Carbamato de Etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar _ PLN/LACQSA/BH/057Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)Solicitação de material de consumo (FOR/LACQSA/BH/021)Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)-FOR/LACQSA/BH/053

13.0 Arquivos anexados

14.0 Controle de alterações

Este MET foi elaborado a partir do POP 110, conforme o sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH

vigente na época, com o seguinte histórico de revisão:

Revisão Data Responsável Descrição

00 10.10.2012 Anelise L. D.Eugênia A. V.

Elaboração do POP.

01 25.09.2013 Anelise L. D.Eugênia A. V.

- Alteração dos títulos dos itens 1, 2.1 e 2.2;- O item 3.1 Equipamentos foi dividido em 3.1.1 Equipamentos críticos e 3.1.2 Equipamentos de suporte;- O item 3.1 foi colocado a definição de material critico e atualizados equipamentos- O item 3.2 Materiais foi dividido em 3.2.1 Vidrarias em geral, 3.2.2 Materiais de suporte e 3.2.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS;- No item 3.2 foi colocado a definição de material critico e atualizados os matérias dos sub-itens 3.2.1 Vidrarias em geral, 3.2.2 Materiais de suporte e 3.2.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS;- No item 3.5.1 alteração na redação do preparo da solução de etanol 40 %;- O item 4.4 Reagentes foi alterado o titulo para Reagentes e solventes;- Alteração do item 3.10 Reportagem de resultado incluindo decisões tomadas na análise critica 067/2013.








Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/012Versão Data Responsável Descrição

00 13/02/2014 Anelise L. Drummond - Inserido no software Docnix módulo MaxDoc.


Documents

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA ...3,23 6,33 7,33 50 µg/L 3,92 2,54 2,49 4,90 5,01 150 µg/L 1,90 7,90 7,52 Precisão Repetitividade Valores médios n=6