Rev. Saúde Pública, 30 (3): 267-72, 1996 267

Miotoxicidade por organofosforados

Organophosphate myotoxicity

Maria J. Cavaliere, Edenilson E. Calore, Nilda M. Perez e Flávio Rodrigues PugaDivisão de Patologia do Insituto Adolfo Lutz. São Paulo, SP - Brasil (M.J.C.); Seção de AnatomiaPatológica do Instituto Emílio Ribas. São Paulo, SP - Brasil (E.E.C., N.M.P.); Seção deToxicologia eHigiene Comparada do Instituto Bilógico. São Paulo, SP - Brasil (F.R.P.)

Correspondência para / Correspondence to: Maria José Cavaliere - Divisão do Patologia do Instituto Adolfo Lutz. Av. Dr. Arnaldo, 355 - 01246-902São Paulo, SP - Brasil.Edição subvencionada pela FAPESP. Processo 95/2290-6.Recebido em 30.6.1995. Aprovado em 8.2.1996.

Resumo

Os organofosforados são um grupo de compostos químicos amplamente utili-zados em agropecuária como inseticidas, ocasionando intoxicações acidentaisem animais e humanos, e mesmo sendo utilizados em tentativas de suicídio. Atoxicidade desses produtos decorre sobretudo de insuficiência cárdio-respirató-ria por compromentimento do sistema nervoso autônomo. Sabe-se que algunsdestes compostos induzem em animais de experimentação e em humanos, umamiopatia caracterizada por degeneração de células musculares, comprometen-do sobretudo a musculatura respiratória. Baseado no fato de que este compro-metimento contribui para a piora da função respiratória, propõe-se um protoco-lo de avaliação rotineira de miotoxicidade por compostos organofosforados,através de uma bateria mínima e suficiente de colorações e reações histoquími-cas para quantificação da necrose muscular. Utilizaram-se como modelo expe-rimental, grupos de ratos albinos (Wistar) intoxicados com o organofosforadoparaoxon, com e sem antídotos (atropina ou pralidoxima). Verificou-se nosgrupos tratados com paraoxon e paraoxon mais atropina, necrose de fibrasmusculares no diafragma, que atingia em determinadas áreas até 15% das fi-bras. No grupo tratado com paraoxon mais pralidoxima, a necrose foi mínima,evidenciando o papel mioprotetor deste último antídoto.

Inseticidas organofosforados, toxicidade. Fibras musculares, patologia.

Abstracts

Organophosphates comprise a group of chemical compounds extensively usedin farming as insecticides, which cause accidental poisoning in animals andmen and are also used in suicide attempts. The toxicity of these compounds isdue especially to the cardiac and respiratory impairment in consequence ofautonomic nervous system disorders. However, it is known that some of theseproducts induce a myopathy in experimental animals and humans. Thismyopathy is characterized by muscle cell degeneration, involving above all therespiratory muscles. Based on the fact that this involvement certainly enhancesthe respiratory impairment, this study offers an experimental method forroutine evaluation of organophosphate myotoxicity, using a minimal andsufficient battery of stains and histochemical reactions, for muscle necrosisquantification. For this purpose, albino rats (Wistar) treated with the

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Os objetivos do presente trabalho foram:1 - padronizar técnicas histoquímicas para ava-

liar lesões musculares causadas por organo-fosforados;

2 - comparar a eficácia dos antídotos atropina epralidoxima na prevenção de tais lesões.

MATERIAL E MÉTODO

Animais

Ratos albinos machos e fêmeas da linhagem Wistar(225 g + 25 g) foram divididos em 4 grupos. Cada grupofoi constituído por 8 animais (4 machos e 4 fêmeas), man-tidos separados durante todo o experimento em gaiolas deplástico, recebendo água e ração ad libitum.

Produtos

O organofosforado utilizado foi o Paraoxon® (dietil-paranitrofenil fosfato) com 98,2% de pureza, fornecidopela Bayer do Brasil, São Paulo. O Sulfato de Atropina®

foi proveniente da Sigma e o mesilato de pralidoxima(Contrathion)®, da Rhodia. O paraoxon foi dissolvido empropilenoglicol (0,3 mg/ml); a atropina (0,3 mg/ml) e apralidoxima (10,0 mg/ml) foram preparadas em soluçãofisiológica.

Administração de Paraoxon, Atropina e Pralidoxima

Os produtos foram injetados via intraperitoneal por 4dias com intervalos de 24 h. O grupo 1 foi tratado apenascom paraoxon (0,3 mg/kg); o grupo 2 com paraoxon (0,3mg/kg) seguido imediatamente de atropina (0,3 mg/kg); ogrupo 3 com paraoxon (0,3 mg/kg) seguido imediatamen-te de pralidoxima (10,0 mg/kg) e o grupo 4 (Controle)recebeu apenas propilenoglicol (0,25 ml).

Observação dos Sinais de Intoxicação

Os sinais de intoxicação e sua intensidade foram ob-servados diariamente após a aplicação dos produtos eregistrados durante a primeira hora e a cada 30 min dasseis horas subseqüentes. Para o registro da intensidade dossinais de intoxicação estabeleceu-se o seguinte critério:(+) leve, (++) moderado e (+++) intenso.

Determinação da Atividade da ColinesterasePlasmática

Amostras de 1 ml de sangue foram colhidas por pun-ção do plexo retro-orbitário, 24 h após o último trata-

organophosphate paraoxon, were used both with and without antidotes(atropine or pralidoxime). Muscle fiber necrosis in the diaphragm of the ratstreated with paraoxon or paraoxon and atropine, that affected about 15% of thefibers in some areas, was detected. In the group treated with paraoxon andpralidoxime, a minimal necrosis was seen, revealing a protective role of thislater antidote during the development of myopathy.

Insecticides, organophosphate, toxicology. Muscle fibers, pathology.

INTRODUÇÃO

Os pesticidas organofosforados atuam inibindoas colinesterases, principalmente a acetilcolinesterase(AchE; EC3.1.1.7), aumentando o nível de acetilco-lina nas sinapses. Em mamíferos, estes efeitos ca-racterizam-se principalmente por lacrimejamento,salivação, sudorese, diarréia, tremores e distúrbioscardiorrespiratórios. Estes últimos são decorrentesde broncoconstricção, aumento das secreções brôn-quicas e bradicardia, bem como de depressão do sis-tema nervoso central, sendo as principais causas demorbidade e mortalidade por tais produtos11.

Alterações estruturais e funcionais observadasnos músculos esqueléticos estão relacionadas comas estruturas químicas dos produtos e com o tipo demúsculo, sendo o diafragma o mais afetado em estu-dos experimentais3, 4, 5, 8, 9, 13, 14, 15. Necrose muscular,semelhante à observada em animais de laboratório,foi encontrada em músculos diafragma e intercos-tais de indivíduos intoxicados pelo parathion6, dia-zinon1, triclornato7 e combinação de malathion e di-azinon18. Uma vez que a insuficiência respiratória éuma das conseqüências mais graves das intoxicaçõespor organofosforados, é possível que o envolvimen-to dos músculos da respiração constitua agravantedo distúrbio respiratório, o qual é devido à disfunçãodo sistema nervoso autônomo.

O tratamento das intoxicações por organofosfo-rados baseia-se principalmente no uso da atropina,antídoto sintomático e, com menor freqüência, dasoximas, antídotos específicos que reativam as coli-nesterases.

No Brasil, a ocorrência de intoxicações por pes-ticidas do grupo dos organofosforados continua sen-do alta, apesar de seu uso ter diminuído em relação àdécada dos anos oitenta. Os dados estatísticos dosCentros de Toxicologia de Belo Horizonte, Campi-nas, Florianópolis, Ribeirão Preto, Londrina e Ma-ringá mostram que de 495 casos de intoxicaçõesocupacionais, cerca de 34,9% foram devidos a orga-nofosforados; de 622 casos de tentativas de suicídio,38,1% resultaram do uso de compostos deste grupo;de 38 casos de óbitos, 44,7% foram devidos a orga-nofosforados16.

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mento. O plasma foi separado por centrifugação a 2000r.p.m. por 15 min, e a atividade da colinesterase foi de-terminada pelo método espectrofotométrico de Ellman12,1961 modificado por Wilheim19, 1967. O substrato utili-zado foi a acetiltiocolina e a atividade enzimática foideterminada pela variação de absorbância/ml/minuto(∆E/ml/min), sendo feitas leituras no comprimento deonda de 430 nm.

Técnicas Histológicas e Histoquímicas

Os animas foram anestesiados com éter e decapitados24 h após o último tratamento e os hemidiafragmas es-querdos foram colhidos e congelados em n-hexano previa-mente resfriado em nitrogênio líquido, em posição paraobter cortes transversais em micrótomo-criostato. Cortesseriados (8 µm de espessura), colhidos em diferentes lâ-minas para microscopia, foram corados pela hematoxili-na-eosina (HE) bem como submetidos às reações histo-químicas para fosfatase ácida e nicotinamida-adenina-dinucleotídio-tetrazolium-redutase (NADH-TR) segundoDubowitz10,1985.

Avaliação das Alterações Histológicas

Foi observada ao microscópio óptico toda a área docorte histológico e feita semiquantificação das alteraçõesencontradas, seguindo os seguintes critérios: 1) observa-ção pelo HE, no aumento de 100 X, com delimitação dos5 campos mais alterados; 2) semi-quantificação de fibrasalteradas nos 5 campos, no aumento de 400 X, nos cortesseriados submetidos às reações histoquímicas de NADH-TR e fosfatase ácida, sendo (+) até 5% de fibras alteradas;(++) de 5 a l5% de fibras alteradas e (+++) acima de 15%de fibras alteradas.

Análise Estatística

Os resultados da atividade da colinesterase plasmáticaforam analisados pelo teste de Mann-Whitney-Wilcoxonpara amostras não-paramétricas, tomando-se como índicede significância p < 0,01.

RESULTADOS

Sinais de Intoxicação

A Tabela 1 mostra os sinais de intoxicação obser-vados. O grupo que recebeu apenas paraoxon (grupo1) apresentou os sinais mais intensos. A aplicação deatropina diminuiu a intensidade dos sinais, com exce-ção da fasciculação e flacidez musculares, e preveniua ocorrência de diarréia (grupo 2). O tratamento compralidoxima (grupo 3) mostrou-se altamente eficaz,impedindo a manifestação de todos os sinais.

Determinação da Atividade da ColinesterasePlasmática

Os animais tratados com paraoxon (grupo 1) eparaoxon mais atropina (grupo 2) apresentaram re-sultados de atividade da colinesterase de 32,2% e43,8%, respectivamente, revelando diferenças esta-tisticamente significativas (p < 0,01) em relação aogrupo-controle. Já os animais tratados com paraoxonmais pralidoxima (grupo 3) apresentaram atividadeda colinesterase de 94,1%, não havendo diferençaestatisticamente significativa em relação ao grupo-controle (Tabela 2).

Histopatologia

A análise histopatológica mostrou nos animaisdos grupos tratados com paraoxon (grupo 1) eparaoxon mais atropina (grupo 2) a presença de fi-bras musculares necróticas, freqüentemente comfagocitose, que se encontravam próximas umas àsoutras nas áreas mais afetadas. Essas fibras foramevidenciadas com maior nitidez na reação histoquí-mica para fosfatase ácida (Fig. 1). A reação deNADH-TR mostrou fibras com diferentes graus dealteração da trama intermiofibrilar, correspondendoa alterações da estrutura normal das fibras muscula-

Tabela 1 - Sinais observados durante o experimento, em ordem de aparecimento, sendo (+) leve,(++) moderado e (+++) intenso.

Sinal Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4Paraoxon Paraoxon + Paraoxon + Controle

atropina pralidoxima

Salivação aumentada +++ + - -Lacrimejamento +++ + - -Exoftalmia +++ ++ - -Tremores +++ ++ - -Dispnéia +++ + - -Fasciculação muscular +++ +++ - -Ataxia +++ ++ - -Prostração +++ + - -Diarréia +++ - - -

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res (Fig. 2). Com menor freqüência foram observa-das fibras atróficas angulares. No grupo tratado comparaoxon mais pralidoxima (grupo 3), fibrasnecróticas e com alteração da trama intermiofibrilarforam encontradas em pequeno número. Os resulta-dos da análise histopatológica dos músculos diafrag-ma dos animais estudados (analisados em conjuntoem cada grupo), expressos semiquantitativamente,encontram-se na Tabela 3.

DISCUSSÃO

Embora o comprometimento do sistema muscu-lar esquelético em intoxicações por alguns organo-

fosforados seja conhecido de longa data, pouca im-portância se dá a este fato, haja vista que a avaliaçãorotineira por estes compostos não inclui protocolosde miotoxicidade. Sabe-se que a principal causa demorbidade e mortalidade nas intoxicações pelos or-ganofosforados é o comprometimento cardiorrespi-ratório. No entanto, é provável que o comprometi-mento da musculatura esquelética, sobretudo damusculatura respiratória, contribua tal morbidade, oque reforça a importância da avaliação das lesõesmusculares nessas intoxicações.

Experimentalmente, além dos sinais de intoxica-ção típicos dos organofosforados, o parâmetro maisutilizado na avaliação do nível de toxicidade desses

Tabela 2 - Atividade da colinesterase plasmática (∆E/ml/min) e desvios-padrão.Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4Paraoxon Paraoxon Paraoxon Controle

+ atropina + pralidoxima

Atividade 0,48 + 0,092 0,65 + 0,124 1,38 + 0,241 1,46 + 0,133% 32,2 43,8 94,1 100,0

Figura 1 - Corte transversal de fibras musculares exibindonecrose e fagocitose de algumas delas (setas). Músculodiafragma de rato intoxicado pelo paraoxon. Reaçãohistoquímica pela fosfatase ácida. A barra corresponde a 100µm.

Figura 2 - Corte transversal de fibras musculares exibindoalteração da estrutura interna das mesmas (a seta indica umadestas fibras). Músculo diafragma de rato intoxicado peloparaoxon. Reação histoquímica pela Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-tetrazolium-redutase (NADH-TR). A barracorresponde a 50 µm.

Tabela 3 - Alterações encontradas no músculo diafragma em áreas selecionadas, expressas de forma semiquantitativa: (+) até5% de fibras alteradas; (++) de 5 a 15% de fibras alteradas; (+++) acima de 15 % de fibras alteradas.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4Alterações Paraoxon Paraoxon Paraoxon Controle

+ atropina + pralidoxima

Necrose/fagocitose +++ +++ + -Desorganização da trama intermiofibrilar +++ +++ + -Fibras atróficas angulares + + - -

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compostos é a medida da atividade da colinesteraseplasmática. As doses utilizadas em nosso experimen-to foram suficientes para desencadear sinais de into-xicação, bem como diminuição da atividade dacolinesterase plasmática, o que permitiu avaliar cla-ramente as diferenças entre os grupos tratados.

Com relação aos antídotos, a atropina age comoinibidor competitivo da acetilcolina em nível dosreceptores muscarínicos, porém não tem ação nosreceptores nicotínicos, que são os existentes na pla-ca motora. Isto explica o fato de que a atropina nãoimpediu o desenvolvimento da miopatia no diafrag-ma. Dekleva e col.8, 1989, descreveram resultadossemelhantes em experimentos com ratos intoxicadospelo organofosforado soman, nos quais verificaramque a atropina não prevenia o desenvolvimento damiopatia mesmo com doses altas (20 mg/kg).

No presente estudo, o uso da pralidoxima imedia-tamente após a administração do paraoxon impediua inibição da colinesterase plasmática e preveniu odesenvolvimento da miopatia. Ariens e col.2, 1969,em trabalho pioneiro sobre miopatia por organofos-forados em ratos, já haviam relatado o papel prote-tor da pralidoxima com relação a este efeito sobre omúsculo esquelético. Em humanos, tem sido relata-do que as oximas são capazes de reativar acolinesterase por um período que varia de 24 a 36horas após a intoxicação11. No entanto, não há rela-tos quanto ao seu papel preventivo da miopatia nohomem.

No que se refere à padronização das técnicashistoquímicas para avaliação das lesões muscula-

res, os presentes resultados indicaram que a utili-zação da reação histoquímica para fosfatase ácidamostra, com bastante nitidez, as fibras alteradasnesta miopatia, já que evidencia atividade lisosso-mal e, portanto, processo necrótico. A reação paraa enzima oxidativa NADH-TR também mostrou-seútil por demonstrar claramente fibras com altera-ção da trama intermiofibrilar. Os vários autores ci-tados na literatura, que estudaram experimentalmen-te a miopatia por organofosforados, utilizaram ou-tras técnicas histológicas e histoquímicas, especi-almente a coloração pelo tricrômico modificado deGomori4, 13, 14, 15, 17. Brigth e col.3, 1991, estudaram aexpressão da fosfatase ácida em músculos de ani-mais intoxicados, porém sem finalidade de quanti-ficar as lesões.

Em conclusão, a proposta foi avaliar o grau demiotoxicidade de organofosforados através de testesem ratos albinos, utilizando doses subletais capazesde produzir sinais de intoxicação e diminuição daatividade da colinesterase, com ou sem uso de antí-dotos. A análise do músculo diafragma, através decongelação ultra-rápida e avaliação semiquantitativadas lesões musculares em cortes transversais seria-dos, corados por uma bateria mínima e suficiente detécnicas histológicas e histoquímicas (hematoxilina-eosina, fosfatase ácida e NADH-TR), mostrou-sesatisfatória. Baseados nestas observações, conside-rou-se esta metodologia adequada para avaliação demiotoxicidade por diferentes produtos organofosfo-rados, que pode ser realizada rotineiramente em tes-tes toxicológicos.

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