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MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO TRABAJO DE GRADO Presentado para optar por el título de: MICROBIOLOGO INDUSTRIAL DIRECTOR: DIANA CAROLINA CLAVIJO BURITICA, MSc., Ph.D. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL 2019

MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

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Page 1: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA

LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO

JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO

TRABAJO DE GRADO

Presentado para optar por el título de:

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR:

DIANA CAROLINA CLAVIJO BURITICA, MSc., Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

2019

Page 2: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA

LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO

JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO

___________________________ _________________________

Concepción J. Puerta Bula, Ph.D Marcela Franco Correa, Ph.D

Decana facultad de Ciencias Directora de Carrera

Microbiología Industrial

Page 3: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA

LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO

JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO

___________________________ __________________________

Diana C. Clavijo Buritica, MSc., Ph.D. Jose S. Montaña Lara, Ph.D

Directora Jurado

Page 4: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

RESUMEN

La Fenazina-1-carboxilato es una molécula producida por cepas de Pseudomonas

aeruginosa que tiene alta relevancia para el sector agrícola debido a su capacidad

de inhibir el crecimiento de diversos hongos fitopatogenos. En el presente trabajo

se modeló la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de análisis de balance de flujo en estado estacionario (FBA) y en

estado dinámico (DFBA), con en fin de simular la producción de fenazina-1-

carboxilato en este este organismo.

Los resultados obtenidos simulan el metabolismo para la producción de biomasa

en Pseudomonas aeruginosa PAO1, así como la biosíntesis de PCA en estado

estacionario, ya que se observó que las reacciones de síntesis de pared celular,

síntesis de aminoácidos, síntesis de cofactores, síntesis de grupos prostéticos,

síntesis de transportadores de electrones, las reacciones del metabolismo central

y las reacciones de biosíntesis de PCA estaban activas. También se simuló la

producción de biomasa y la biosíntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa

PAO1 en estado dinámico, con lo cual se obtuvo el perfil de concentración de

biomasa y los perfiles de concentración de nutrientes tales como glucosa y sulfato,

evidenciándose que la reacción de síntesis de PCA estaba activa pero no había

presencia de un perfil de concentración de PCA extracelular. Lo que concuerda

con los resultados obtenidos en estado estacionario donde no se observaron

eventos en los que PCA fuera exportado al espacio extracelular.

De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, se hace necesario

realizar estudios posteriores a nivel in vitro e in silico, que permitan determinar el

mecanismo biológico en el que la fenazina-1-carboxilato es exportada al medio

extracelular, para así bajo la aproximación del Análisis de Balance de Flujo

proponer alternativas que permitan mejorar la producción de este metabolito a

escala industrial.

Palabras claves: Fenazina-1-carboxilato, Pseudomonas aeruginosa PAO1, FBA, DFBA.

Page 5: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios, por permitirme llegar hasta esta etapa de mi proceso de formación académica.

A mis padres, por su apoyo y fortaleza en los momentos difíciles.

A mi directora Carolina Clavijo, por darme la oportunidad de trabajar con ella y de conocer el

campo de acción en el que ella se desempeña, por su paciencia y por todo el tiempo dedicado a lo

largo del desarrollo del trabajo de grado.

Al profesor German Combariza, por su apoyo y asesoría en la parte matemática y computacional

del trabajo de grado.

Page 6: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN. ........................................................................................................................ 9

2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................. 11

3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 13

4. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 20

4.1. OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 20

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................. 20

5. METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 21

5.1. Revisión de la biosíntesis de PCA ................................................................................... 22

5.2. Curación del modelo CCBM1737 ..................................................................................... 22

5.2.1. Precursores de biomasa ............................................................................................ 22

5.2.2. Adición de PCA a la reacción de biomasa .............................................................. 23

5.2.3. Patologías de la red .................................................................................................... 23

5.2.4. Detección y solución de ciclos termodinámicamente infactibles ......................... 23

5.3. Análisis de Balance de Flujo (FBA) ................................................................................. 25

5.4. Análisis de Balance de Flujo Dinámico (DFBA) ............................................................. 25

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................ 27

6.1. Descripción del Modelo de la Red Metabólica de Pseudomonas aeruginosa que

involucra la síntesis de PCA ..................................................................................................... 27

6.2. Modelamiento bajo la aproximación de FBA de la Red Metabólica de Pseudomonas

aeruginosa que involucra la síntesis de PCA. ....................................................................... 30

6.3. Modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la Red Metabólica de

Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA .............................................. 36

7. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 44

REFERENCIAS .............................................................................................................................. 45

ANEXOS .......................................................................................................................................... 49

Page 7: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Biosíntesis de Fenazina-1-carboxilato en Pseudomonas aeruginosa a partir de

Ácido Corísmico. .............................................................................................................. 14

Figura 2. Metodología para la simulación de la producción de PCA a partir del modelo

CCBM1737. ..................................................................................................................... 21

Figura 3. Número de reacciones activas en cada uno de los sistemas metabólicos activos

durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de FBA. ...................................................................................................... 30

Figura 4 Subsistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica

de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA. ................................. 32

Figura 5. Perfil de concentración in silico de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1,

empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 38

Figura 6. Perfil de consumo de glucosa in silico por Pseudomonas aeruginosa PAO1,

empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 39

Figura 7. Perfil de consumo in silico de sulfato por Pseudomonas aeruginosa PAO1,

empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 40

Figura 8. Perfil de concentración de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1,

empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ..................... 41

Figura 9. Perfil de concentración de Glucosa en Pseudomonas aeruginosa, empleando las

condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ............................................. 41

Figura 10. Perfil de concentración de sulfato en Pseudomonas aeruginosa PAO1,

empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ..................... 42

Figura 11. Flujo in silico de la reacción de síntesis de PCA bajo las condiciones de

simulación del escenario 3. .............................................................................................. 43

Page 8: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Genes, reacciones, enzimas y proteínas transportadoras involucradas en la

biosíntesis de fenazina-1-carboxilato. .............................................................................. 28

Tabla 2. Metabolitos involucrados en la síntesis de PCA que fueron incorporados al

modelo CCBM1737 ......................................................................................................... 29

Tabla 3. Flujo de las reacciones de biosíntesis, transporte e intercambio de PCA

obtenidas del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa bajo la

aproximación de FBA empleando el software GAMS y el programa en R. ....................... 33

Tabla 4. Simulación en GAMS de flujos en estado estacionario restringiendo las

reacciones de transporte e intercambio de PCA. ............................................................. 34

Tabla 5. Reacciones inactivas para la maximización de la producción de PCA ............... 36

Tabla 6. Condiciones de simulación DFBA. ..................................................................... 37

Page 9: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

9

1.INTRODUCCIÓN.

Los patógenos de plantas son responsables de hasta un 20% de la reducción del

rendimiento de los cultivos. Razón por lo cual actualmente se han implementado

estrategias tales como el uso de variedades resistentes, la rotación de cultivos, la

sanitización y el uso de fungicidas con el fin de disminuir la presencia de dichos

organismos [1]. Los fungicidas son agentes de origen natural o sintético los cuales actúan

para proteger las plantas de la invasión de hongos o erradicar una infección fúngica ya

establecida. El termino fungicida convencionalmente se aplica para compuestos que

controlan hongos verdaderos, principalmente del género Plasmodiophora y Oomycota [2].

El uso de fungicidas para el control de hongos patógenos inicio en la mitad del siglo XIX

con la incorporación de fungicidas no sistémicos, lo cuales correspondían generalmente a

complejos químicos metal-colorante y posteriormente a finales de los años 60 surgieron

fungicidas sistémicos que a diferencia de los no sistémicos podían penetrar las

estructuras vegetales lo que permitió el control de enfermedades que ya estaban

establecidas en los cultivos, generando un aumento en el uso de este tipo de fungicidas y

promoviendo el desarrollo de nuevos fungicidas sintéticos de este tipo [2].

Aunque los fungicidas sintéticos han sido útiles para reducir las pérdidas económicas

debido a hongos fitopatógenos, su uso ha mostrado tener consecuencias negativas para

la protección de cultivos como el desarrollo de resistencia [1] y sobre el medio ambiente,

como desarrollo de toxicidad sobre organismos vivos. Por tal razón, se ha optado por la

búsqueda de alternativas biológicas que permitan el control de hongos fitopatógenos y el

mejoramiento de los cultivos. Una alternativa es el uso de rizobacterias promotoras del

crecimiento vegetal; en este grupo resaltan las bacterias productoras de fenazinas, en

particular las productoras de fenazina-1-carboxilato(PCA, por sus siglas en inglés:

Phenazine-1-Carboxylic Acid). Pseudomonas aeruginosa es reconocida entre otras cosas

Page 10: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

10

por su capacidad de generar antagonismo sobre otros microorganismos [3]. Por lo

anterior, el estudio de la síntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa y la búsqueda de

alternativas que permitan mejorar la producción de este metabolito son necesarias para

llevar a cabo el bioproceso de producción de PCA a escala industrial.

Los estudios en el campo de los bioprocesos pueden desarrollarse in vitro; sin embargo,

estos generan altos costos a nivel de experimentación y costos en tiempo de obtención de

resultados, por lo cual el uso de herramientas como los modelos matemáticos y

algoritmos computacionales provistos por la biología de sistemas, constituyen una

alternativa para los estudios en este campo. Entre las herramientas más empleadas en

biología de sistemas para el estudio de procesos biológicos se encuentra la

reconstrucción y modelamiento de redes metabólicas, las cuales reúnen todas reacciones

bioquímicas presentes en una célula y reflejan la interacción entre todos los metabolitos

involucrados en la misma.

Las redes metabólicas son obtenidas a partir de datos de secuenciación, genes y

reacciones enzimáticas presentes en bases de datos biológicos u obtenidas

experimentalmente. Estas redes permiten el estudio de los procesos metabólicos llevados

a cabo en un organismo de forma cualitativa y cuantitativa. El modelamiento bajo la

aproximación del análisis de balance de flujo (FBA, por sus siglas en inglés: Flux Balance

Analysis) hace posible simular el crecimiento de un organismo y la expresión de

fenotipos(conjunto de rutas metabólicas activas en la célula) por medio de modelos

matemáticos basados en el balance estequiométrico de las reacciones bioquímicas del

organismo y el análisis de flujos metabólicos en estado estacionario o no estacionario. De

modo que si se asume un estado estacionario se debe resolver un problema de

optimización por programación lineal, mientras que si se asume un estado no estacionario

se debe resolver un problema de optimización por programación no lineal cuyas

restricciones son ecuaciones diferenciales [4,5].

Debido a que los protocolos de cuantificación de PCA son costosos y no se han realizado

estudios in silico de la producción de este compuesto en Pseudomonas aeruginosa, el

modelamiento matemático de la red metabólica que involucra la síntesis de este

metabolito en esta bacteria es un método alternativo que permitirá estudiar y entender las

Page 11: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

11

condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la biosíntesis de PCA, en busca de mejorar la

producción de este metabolito.

2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Hoy en día la reconstrucción y modelamiento de redes metabólicas de microorganismos

ha tomado gran fuerza en el campo de la investigación en ciencias básicas, debido a su

capacidad para predecir el crecimiento y la producción de metabolitos de un organismo

sin la necesidad de recurrir a extensos protocolos in vitro. Las actuales metodologías in

vitro e in vivo para el estudio de bioprocesos resultan ser costosas y dispendiosas. Es así,

como la biología computacional, la bioinformática y la biología de sistemas proporcionan

metodologías que permiten el entendimiento y la comprensión del comportamiento

biológico, haciendo posible, generar posibles alternativas para la solución de problemas

como el que se aborda en este trabajo [6,7].

Uno de los métodos que se emplea con mayor frecuencia para el estudio de redes

metabólicas es el modelamiento in silico bajo la aproximación del análisis de balance de

flujo (FBA, por sus siglas en inglés: Flux Balance Analysis), que permite obtener los flujos

metabólicos de todas las reacciones bioquímicas presentes en la red durante el

crecimiento celular, de modo que es posible proponer modificaciones genéticas y

condiciones de crecimiento específicas con el fin de mejorar la producción de un

metabolito específico [8].

Actualmente existen una gran variedad de redes metabólicas reportadas en bases de

datos (como BioCyc y KEGG), entre las cuales se encuentra la red de Pseudomonas

aeruginosa PAO1 [9,10], la cual puede ser utilizada para predecir la producción de

metabolitos como PCA. Esta molécula es un metabolito secundario producido por cepas

Page 12: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

12

Pseudomonas aeruginosa; en estudios como los realizados por Upadhyay y Srivastava en

2011 [11] y Lee y colaboradores en 2003 [12] se ha observado que esta molécula tiene un

efecto inhibitorio sobre hongos fitopatógenos de alta relevancia en el contexto agrícola

como Fusarium oxysporum y Coletotrichum spp. Esta característica de PCA hace que sea

posible su uso como potencial fungicida de origen biológico que permita la reducción del

uso de fungicidas sintéticos y así mismo los efectos negativos que estos pueden generar

al medio ambiente [13].

Para estudiar la producción de PCA in vitro se utilizan medios como PPM(por sus siglas

en inglés: Pigment Producing Medium), GA(por sus siglas en inglés: Glycerol-Alanine) y

LB(Luria Bertani) en los cuales se han estudiado condiciones de crecimiento que

favorecen la producción de PCA, y los mecanismos de regulación para la producción de

este compuesto, como lo es la regulación por Quorum sensing[14,15]. Sin embargo, no se

han llevado a cabo estudios in silico en los cuales se evalúen condiciones de crecimiento

para la producción de PCA.

Por consiguiente, el modelamiento in silico de la red metabólica que involucra la

biosíntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA,

permitirá entender las condiciones de crecimiento bajo las cuales se lleva a cabo dicho

proceso, y de ser posible proponer una alternativa para mejorar la producción de PCA a

escala industrial en busca de utilizar este compuesto como un fungicida de origen natural

para el control biológico de diferentes cultivos, lo cual permitirá reducir gradualmente el

uso de fungicidas sintéticos.

Page 13: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

13

3. MARCO TEÓRICO

Un tema de gran importancia en el sector agrícola es el control de hongos fitopatógenos.

Estos hongos generan un deterioro de los cultivos y por consiguiente generan pérdidas

económicas a los agricultores. Existe una amplia variedad de fungicidas que previenen el

crecimiento de hongos fitopatógenos; sin embargo, los fungicidas han mostrado tener

efectos negativos sobre los ecosistemas, ya que genera toxicidad sobre insectos

polinizadores [16], bacterias en cuerpos de agua y particularmente se ha observado que

reducen las poblaciones de bacterias desnitrificantes [17], lo cual podría generar

eutrofización en cuerpos de agua debido a que estos compuestos terminan en cuerpos de

agua por el proceso de escorrentía, generando un aumento de la concentración de nitrato

en los mismos [18].

De la misma manera, estos compuestos también pueden generar toxicidad sobre

invertebrados acuáticos y algas unicelulares [19,20]. En animales se ha observado que el

uso de benzimidazoles (usados para el control de Fusarium oxysporum y Colletotrichum

spp.) [21,22] se han asociado con toxicidad del desarrollo, oncogénesis, fallas en el

sistema reproductor y desarrollo anormal del feto [23]. Por otra parte, algunos fungicidas

son compuestos orgánicos persistentes por lo cual permanecen en el suelo durante años,

lo que genera que hongos fitopatógenos desarrollen resistencia a estos compuestos

dificultando el control fitosanitario de los mismos [24].

Para enfrentar los efectos negativos producidos por los fungicidas sintéticos se ha optado

por el uso de métodos de control biológico, tales como el uso de fungicidas de origen

natural. Un microorganismo que ha sido utilizado para el estudio de compuestos

biológicos con actividad fungicida es Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser

una bacteria que tiene un efecto antagonista sobre hongos fitopatógenos. La interacción

amensalista entre Pseudomonas aeruginosa y estos hongos se ha asociado a la

producción de compuestos conocidos como las fenazinas, que pertenecen a un grupo de

metabolitos secundarios producidos por la ruta del ácido Shikimico usando como

Page 14: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

14

intermediario principal el ácido corísmico. Como se puede observar en la Figura 1, ésta

ruta metabólica para Pseudomonas aeruginosa está bien establecida, ha sido estudiada y

se encuentra disponible en bases de datos biológicos, como KEGG y MetaCyc (Figura1).

Figura 1. Biosíntesis de Fenazina-1-carboxilato en Pseudomonas aeruginosa a partir de Ácido

Corísmico. Tomado de : http://www.pseudomonas.com:1555/PSEUDO/NEW-

IMAGE?type=PATHWAY&object=PWYB-5652

Page 15: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

15

Las fenazinas han mostrado tener un amplio rango de aplicaciones, entre las que se

encuentra el control de hongos fitopatógenos [25], y debido a que son compuestos de

origen biológico, que no generan toxicidad al medio ambiente [26, 27] hace que su

utilización como biofungicidas sea factible.

Entre las fenazinas que son producidas por Pseudomonas aeruginosa se encuentra la

fenazina-1-Carboxilato (PCA), con la cual se han desarrollado estudios como los

realizados en 2013 por Puopolo y colaboradores, en los que se observó que a

concentraciones de PCA iguales o inferiores a 50 es posible inhibir en más de un

60% el crecimiento de hongos como Fusarium oxysporum, Botrytis cinérea, Alternaria

alternata, Sclerotinia sclerotorum, Colletotrichum gloesporoides y algunos oomycetes y a

concentraciones muy bajas de PCA se consigue inhibir totalmente el crecimiento de

Gaumannomyces graminis var triticii y Phytopthora nicotianae [28].

Aunque la capacidad de PCA para inhibir hongos fitopatógenos, lo hace un compuesto de

interés para el sector agrícola, su producción in vitro e in vivo es baja [29]. Por lo cual, si

se quiere producir este compuesto a nivel industrial es necesario encontrar y proponer

estrategias que ayuden a aumentar su producción. De este modo, es necesario estudiar

los factores involucrados en el proceso metabólico de biosíntesis, incluyendo los sustratos

que son usados como fuente de carbono por el microorganismo y los fenotipos que éste

expresa durante la síntesis de PCA con el fin de mejorar su producción.

Las fuentes de carbono que influencian la biosíntesis de PCA en Pseudomonas

aeruginosa han sido objeto de estudios in vitro [29]; sin embargo, estos estudios suelen

ser dispendiosos debido a que requieren un número elevado de ensayos, y una gran

cantidad de reactivos y tecnologías de alto costo, como HPLC, para la separación o

purificación de compuestos. Por lo anterior, el uso de métodos alternativos que permitan

estudiar los bioprocesos como lo son los estudios in silico deben ser considerados.

Uno de los métodos in silico mas empleado actualmente para acercarse al entendimiento

de la fisiología de un organismo es a través de la reconstrucción, y modelamiento de

redes metabólicas (conjunto de reacciones bioquímicas presentes en un organismo), ya

que con este método se pueden realizar simulaciones y modelar bajo diferentes

condiciones el crecimiento celular y producción de metabolitos en un organismo.

Page 16: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

16

El proceso de reconstrucción consiste en obtener un listado preliminar de las reacciones

bioquímicas, las enzimas presentes en la célula, la reacción de biomasa y las reacciones

de transporte e intercambio a partir de datos de anotación genómica [30]. En el caso de la

red metabólica de Pseudomonas aeruginosa (PAO1), la reconstrucción de la misma, fue

realizada entre otros, por Oberhardt y colaboradores en 2008 [31] y actualizada, curada y

modelada para la producción de pioverdina por Clavijo en 2018 [32] quien reportó el

modelo CCBM1737 el cual puede ser curado y modelado para la biosíntesis de PCA.

El proceso de curación de la red metabólica consiste en corregir las inconsistencias que

pudiera presentar la red preliminar y que conllevan a un crecimiento nulo en el

modelamiento de la red. Estas inconsistencias se relacionan principalmente con la

ausencia de reacciones en una ruta metabólica, la ausencia de precursores involucrados

en la formación de biomasa, la presencia de ciclos termodinámicamente infactibles y con

la presencia de metabolitos que se producen y no se consumen o metabolitos que no se

producen y si se consumen en alguna reacción de la red, entre otros. Los detalles del

proceso de curación son explicados en la metodología.

Por otra parte, el modelamiento de la red metabólica reconstruida se puede realizar, entre

otros, bajo la aproximación del Análisis de Balance de Flujo. El FBA es una aproximación

matemática, que se centra en solucionar un problema de optimización basado en

restricciones, para el análisis del flujo de las reacciones a través de una red metabólica.

En este método se representan las reacciones metabólicas por medio de una matriz

estequiométrica (S) de tamaño n*m (n metabolitos y m reacciones), que contiene los

coeficientes estequiométricos de las reacciones. La estequiometria de las reacciones

restringe el flujo de los metabolitos a través de la red, lo que constituye la base del

método FBA [33]. Si se modela la red metabólica como un sistema estacionario se debe

resolver un problema de optimización basado en restricciones por programación lineal

(LP, por sus siglas en inglés: Linear Programming) con el fin de maximizar o minimizar

una función objetivo.

Generalmente la función objetivo en el modelamiento de redes metabólicas, consiste en la

maximización de la biomasa. La ecuación 1 representa el modelo algebráico del problema

de optimización de FBA.

Page 17: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

17

Donde, es el número total de metabolitos, el número total de reacciones, es la

función objetivo determinada, la cual comúnmente suele ser la maximización de biomasa;

corresponde al flujo de la reacción , el cual es expresado en . y

corresponde a los límites o valores inferiores y superiores posibles que puede adquirir

y que dependen directamente de la termodinámica de cada reacción; es decir,

comúnmente para reacciones reversibles el y el

y para reacciones irreversibles el y el

. Finalmente, es la matriz estequiométrica, que

representa el coeficiente estequiométrico del metabolito en la reacción [32].

El vector es un vector cuyos componentes representan el flujo de cada una de las

reacciones en la red y corresponde a la solución al espacio nulo de la matriz S (Ecuación

1) que maximiza la función objetivo, es decir, el flujo de la reacción de biomasa en el

problema considerado, de modo que se establece un fenotipo metabólico en el cual se

máxima el crecimiento del organismo en cuestión [34].

El FBA se emplea típicamente para estudiar el flujo metabólico en un estado particular

constante del sistema; sin embargo, este método no permite predecir el comportamiento

de una red metabólica a través del tiempo y asume que las concentraciones de los

metabolitos no varían con el tiempo [35]. No obstante, se debe tener en cuenta que los

sistemas biológicos son dinámicos, por lo cual se puede emplear la resolución del

problema de optimización por programación no lineal (NLP, por sus siglas en inglés: Non

Linear Programing) de un problema de optimización basado en restricciones (Ecuación 2),

propuesto por Mahadevan y colaboradores en 2002 [36], conocido como Análisis de

balance de flujo dinámico (DFBA, por sus siglas en inglés: Dynamic Flux Balance

Analysis).

Page 18: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

18

(Ecuación 2)

:

( )

[ ]

Donde es la concentración de los metabolitos extracelulares, y son las

condiciones iniciales para cada metabolito y para la concentración de biomasa

respectivamente, es la concentración de biomasas, es la tasa de crecimiento

específica, es la reacción de peso, es el vector de las restricciones no lineales

(tales como la cinética de consumo de los sustratos), y corresponden al tiempo inicial

y al tiempo final respectivamente, finalmente, indica el número de intervalos en donde

el tiempo es discretizado.

El modelamiento dinámico de una red metabólica genera información acerca de las

concentraciones de los metabolitos y la biomasa a través del tiempo, por lo cual con esta

herramienta es posible simular el crecimiento, producción y consumo de metabolitos por

Page 19: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

19

parte de un microorganismo en un cultivo discontinuo, así como modificar las condiciones

iniciales con el fin de mejorar el rendimiento de un metabolito específico [36].

El modelamiento dinámico de redes metabólicas a través del método DFBA se ha

utilizado para simular el crecimiento celular y la producción de compuestos de interés

industrial. Por ejemplo, Serrano y colaboradores en 2016 [37] utilizó este método para

simular el crecimiento y producción de 1,3-propanediol y ácidos orgánicos en Clostridium

sp., usando como sustrato glicerol. Por otra parte, Flassing y colaboradores en 2016 [38]

modelaron bajo la aproximación de DFBA la red metabólica de la microalga Dualinella

salina con el fin de estudiar la producción de biomasa (la cual puede ser usada como

biocombustible) y pigmentos como el -caroteno prediciendo el perfil de producción de

este metabolito, condiciones de luz y fuente de nitrógeno necesaria para llevar a cabo el

bioproceso. Al igual que se ha realizado el modelamiento para estos organismos, se

puede utilizar el método DFBA para obtener los perfiles de PCA y concentraciones

apropiadas de fuente de carbono, nitrógeno y oxígeno que maximizan el crecimiento de

Pseudomonas aeruginosa PAO1 y mejoran la producción de PCA.

Page 20: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

20

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL:

Modelar y simular bajo la aproximación de FBA y DFBA la producción de fenazina-1-

carboxilato(PCA) en Pseudomonas aeruginosa PAO1.

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1. Complementar y curar el modelo CCBM1737 de la red metabólica de

Pseudomonas aeruginosa con las reacciones involucradas en la síntesis de

fenazina-1-carboxilato.

2. Modelar y simular la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de FBA para la producción de fenazina-1-carboxilato.

3. Modelar y simular la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de DFBA para la producción de fenazina-1-carboxilato.

Page 21: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

21

5. METODOLOGÍA

La simulación de la síntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa se realizó tomando

como base el modelo CCBM1737 propuesto por Clavijo y colaboradores en 2018 [32],

conformado por 1123 reacciones y 879 metabolitos. La metodología propuesta para el

desarrollo de éste trabajo se describe a continuación y se puede observar el esquema

general en la Figura 2:

Figura 2. Metodología para la simulación de la producción de PCA a partir del modelo

CCBM1737.

Modelo

CCBM1737

Curación

Integración de las

reacciones propias

de PCA

Simulación bajo

la aproximación

FBA

Simulación bajo

la aproximación

DFBA

Flujos metabólicos

en un instante de

tiempo t arbitrario

[metabolitos] en

función del tiempo

[PCA] en función

del tiempo

Precursores

de biomasa

Patologías

de la red

Ciclos termodinámicos

infactibles

Page 22: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

22

5.1. Revisión de la biosíntesis de PCA Tomando como base la ruta metabólica para la síntesis de PCA (Figura 1), la revisión de

literatura y de bases de datos biológicos que contuvieran información metabólica del

microorganismo de interés, "Pseudomonas aeruginosa PAO1", tales como Pseudocyc [39]

y Kegg [40] entre otras, al modelo CCBM1737 se integraron los genes, las enzimas

correspondientes a las reacciones metabólicas propias de la síntesis de PCA que no se

encontraban en el modelo base, asi mismo se integró el sistema y subsistema metabólico

al que pertenecían las reacciones añadidas. Se revisó la estequiometria de estas

reacciones, su localización celular, la direccionalidad y valor de . En adición, se

incluyeron las reacciones de transporte e intercambio requeridas para la adecuada

biosíntesis de este metabolito. Vale mencionar aquí que las reconstrucciones de redes

metabólicas se caracterizan por presentar reacciones metabólicas, reacciones de

transporte y reacciones de intercambio.

5.2. Curación del modelo CCBM1737 La curación de la red metabólica se realizó con el fin de refinar el modelo y obtener un

modelo funcional para la biosíntesis de PCA. En adición a la inserción de las reacciones

faltantes en el modelo pertenecientes a la síntesis y transporte de PCA, dentro del

proceso de curación se revisaron y corrigieron las patologías de los metabolitos presentes

en la red (metabolitos que se consumen en la red pero no son producidos en ninguna

reacción o no son importados desde el medio extracelular y metabolitos que son

producidos en la red y no son consumidos por ninguna reacción o no son exportados al

medio extracelular); también fueron revisados los metabolitos precursores de biomasa con

el fin de asegurar que fueran producidos al interior de la red, finalmente se buscaron y

solucionaron los ciclos termodinámicamente infactibles que puedan llevar a un

crecimiento nulo en el modelamiento de la red. La forma de en la que se llevó a cabo cada

uno de estos procesos de curación de la red es explicada a continuación:

5.2.1. Precursores de biomasa

En el proceso de curación se hace necesario determinar la presencia de algún metabolito

que sea precursor de biomasa o alguno de sus intermediarios que no esté reportado en la

red; es decir, verificar la ruta metabólica puntual que asegure la síntesis de cada uno de

los precursores de biomasa que requiere el microorganismo para crecer. Este proceso se

lleva a cabo por medio de ingeniería reversa, siguiendo la metodología propuesta por

Senger y Papoutsakis en 2008 [41].

Page 23: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

23

5.2.2. Adición de PCA a la reacción de biomasa

Debido a que PCA es un metabolito secundario que no pertenece al ―core‖ del

metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1, es necesario adicionar este metabolito

a la reacción de biomasa (Reacción que se utiliza en el modelamiento como función

objetivo y que por ende será maximizada al solucionar el problema de optimización) para

que se activen las reacciones metabólicas involucradas en la síntesis y transporte de este

metabolito. El coeficiente estequiométrico de PCA para la reacción de biomasa no se

encuentra reportado en la literatura, por lo cual fue necesario realizar un análisis de

sensibilidad a través de varias simulaciones bajo la aproximación de FBA, en las que el

valor del coeficiente estequiométrico para PCA fue modificado en cada simulación

tomando valores entre 0.001 y 1. La selección del coeficiente estequiométrico se llevó a

cabo con base en el criterio utilizado Clavijo y colaboradores en 2018, es decir, se eligió

aquel valor de coeficiente para PCA que activara el mayor número reacciones de la red en

la simulación.

5.2.3. Patologías de la red

En las reconstrucciones in silico de redes metabólicas pueden surgir dos tipos de

patologías en los metabolitos: (i) metabolitos que no son producidos o no son importados

a la célula desde el medio extracelular (RNP, por sus siglas en inglés: root-non-

production) y (ii) metabolitos que no son consumidos o no son exportados al espacio

extracelular y por ende se acumulan dentro de la célula (RNC, por siglas en inglés: Root-

non-consuption). Este tipo de patologías se identifican y solucionan a través de algoritmos

como los empleados en GapFind y GapFill, el primero permite identificar los metabolitos

que no se producen o no se consumen en la red metabólica y el segundo, a partir de la

lista de metabolitos encontrada con el primer algoritmo, realiza un mínimo de

modificaciones a la red adicionando las reacciones de biosíntesis (anabólicas), de

degradación (catabólicas) o de transporte faltantes en la reconstrucción preliminar de la

red [42].

5.2.4. Detección y solución de ciclos termodinámicamente infactibles

Los ciclos termodinámicamente infactibles conllevan a ciclos no nulos sin alguna

comunicación con el sistema y el ambiente externo, generando errores en la solución del

problema de optimización implicado en el FBA [43,44]. Para detectar y solucionar estos

ciclos se seguir tres pasos:

Page 24: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

24

5.2.4.1. Análisis de Variabilidad de Flujo

El método de análisis variabilidad de flujo (FVA, por sus siglas en inglés: Flux Variability

Analysis) permite encontrar los flujos que se encuentran en los máximos o mínimos

establecidos utilizando programación entero mixta (MIP, por sus siglas en inglés Mixed

Integer Programming) [44]. Este método maximiza y minimiza el valor de los flujos

metabólicos de todas las reacciones en la red como se muestra en la Ecuación 3.

(Ecuación 3)

Donde es el número total de reacciones, es la función objetivo determinada, la

cual comúnmente suele ser la maximización de biomasa; corresponde al flujo

de la reacción , el cual es expresado en . y corresponde

a los límites o valores inferiores y superiores posibles que puede adquirir y que

dependen directamente de la termodinámica de cada reacción; es decir,

comúnmente para reacciones reversibles ( el y

el y para reacciones irreversibles ( el

y el . Finalmente, es la matriz

estequiométrica, que representa el coeficiente estequiométrico del metabolito en

la reacción [32].

5.2.4.2. Determinación del espacio nulo

Las reacciones cuyo flujo toma valor en los máximos o mínimos (1000

−1 −1 y -1000 −1 −1 , respectivamente) se utilizan para formar

una matriz ( ), a la cual se le debe hallar espacio nulo (solucionar ). El

conjunto de vectores columna que hacen parte del espacio nulo de esta matriz

Page 25: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

25

corresponde a las reacciones que presentan ciclos termodinámicamente

infactibles.

5.2.4.3. Solución de ciclos termodinámicamente infactibles

Para solucionar estos ciclos se pueden aplicar estrategias como cambiar la

direccionalidad de las reacciones según su valor de , eliminación de

reacciones duplicadas y bloqueo de reacciones no relevantes metabólicamente

que puedan ayudar a eliminar el ciclo [32].

Estos tres pasos deben realizar hasta llegar a que la dimensión del espacio nulo

de la matriz sea igual a cero.

5.3. Análisis de Balance de Flujo (FBA) El problema de optimización basado en restricciones para el FBA en estado estacionario

(Ecuación 1), se solucionó programación lineal mediante la implementación del algoritmo

simplex en el software GAMS empleando el solver CPLEX.

En adición, para este trabajo se desarrolló un código en el software libre R que soluciona

el problema de optimización de FBA. Para la construcción del código se utilizó la librería

Rsymphony, la cual permite resolver problemas de programación lineal con un gran

número de restricciones y problemas en los que el vector solución está acotado por un

vector de Lower Bounds y Upper Bounds. La matriz estequiométrica fue importada desde

Excel usando la librería readxl. Los detalles del código son explicados en los anexos.

5.4. Análisis de Balance de Flujo Dinámico (DFBA) Se solucionó el problema de programación no lineal de DFBA en el software GAMS

mediante la aplicación del algoritmo basado en colocación ortogonal en elementos finitos.

Este algoritmo usa puntos de colocación ortogonal, los cuales corresponden a las

soluciones al polinomio de Legendre de grado 4 (Matriz de Legendre) cuyos valores

corresponden a subintervalos de tiempo en los cuales se calcula la concentración de los

metabolitos y el grado del polinomio corresponde al número de puntos de colocación

escogidos para la simulación. Por otra parte, las ecuaciones diferenciales que representan

las restricciones del problema de DFBA son parametrizadas utilizando polinomios de

Lagrange (Matriz de Lagrange), de modo que el sistema de ecuaciones diferenciales se

Page 26: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

26

transforma en un sistema de ecuaciones algebraicas. El código en GAMS utiliza el

algoritmo el algoritmo del gradiente reducido (GRG, por sus siglas en inglés: Generalized

Reduced Gradient) modificado[45].

Actualmente del código en software libre para la solución del problema de NLP de DFBA

se encuentra en proceso de construcción. Este estará basado en la implementación del

algoritmo GRG modificado en Python usando las librerías Scipy, las cuales permiten la

solución de problemas de optimización por programación no lineal.

Page 27: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

27

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Descripción del Modelo de la Red Metabólica de Pseudomonas

aeruginosa que involucra la síntesis de PCA

A partir de una revisión del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y de la ruta

de biosíntesis de fenazinas, específicamente de PCA, en la base de datos PseudoCyc

(MetaCyc [9]) y una revisión del modelo CCBM1707, fueron identificadas un total de trece

reacciones involucradas en la síntesis de PCA a partir de ácido corísmico. De estas trece

reacciones, diez fueron adicionadas al modelo CCBM1737 y las tres restantes ya se

encontraban involucradas en el modelo original.

Cada reacción adicionada al modelo involucra en su descripción los genes y las enzimas

asociadas, su estequiometría, valor de , direccionalidad y localización celular. En la

tabla 1 se presenta la relación gen-proteína-reacción de las reacciones involucradas en la

ruta metabólica de biosíntesis de PCA, donde las reacciones 1124 hasta la 1133

corresponden a la reacciones que fueron adicionadas al modelo CCBM1737.

Igualmente, se realizó una revisión de los metabolitos involucrados en el modelo

CCBM1737 y fueron adicionados los requeridos propiamente para la síntesis de PCA que

no se encontraban en el modelo general. En la tabla 2 se relacionan los siete metabolitos

que fueron incorporados para complementar la información, con el objetivo de tener el

total de metabolitos involucrados en la síntesis de PCA. Estos metabolitos se representan

en el modelo por medio de abreviaturas que han sido establecidas previamente por la

comunidad científica.

Page 28: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

28

Tabla 1. Genes, reacciones, enzimas y proteínas transportadoras involucradas en la biosíntesis de fenazina-1-carboxilato. Las reacciones 1124 a 1133 fueron incorporadas al modelo CCBM1737

ID de

Reacción Reacción Descripción Enzima/

Proteína transportadora

Genes

59 [c] : chor + gln-L --> a4dic + glu-L

Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate

2-amino-4-deoxychorismate synthase

PA1903, PA4214

228 [c] : a4dic + h2o --> dhha + pyr + h

Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato

2-amino-4-deoxychorismate hydrolase

PA4213, PA1902

894 pca[e] + adp + pi <==> pca[c] + atp + h2o

Transporte de PCA xenobiotic-transporting ATPase

PA5159

1124 [c] : dhha --> aochc Isomerización de trans-2,3-dihydro-3-hydroxy-anthranilato

trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilate isomerase

-

1125 [c] : (2) aochc --> ohpdc + h2o + (2) h

Síntesis de (1R,5a,6R)-4a-hidroxi-1,4,4a,5,5a,6,9,10a-octahidrophenazina-1,6-dicarboxylato

protein PhzB PA1900

1126 [c] : ohpdc --> hhpdc + h2o

Síntesis de 1R,6R)-1,4,5,5a,6,9-hexahidrophenazina-1,6-dicarboxilato

protein PhzB PA1900

1127 [c] : hhpdc + o2 + h --> thpca + h2o2 + co2

Síntesis de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidro-phenazina-1-carboxilato

- -

1128 [c] : thpca + o2 --> dhpca + h2o2

Oxidación de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidrophenazine-1-carboxilato

pyridoxamine 5'-phosphate oxidase

PA4216

1129 [c] : dhpca --> d5hpca

Síntesis de 5,10dihidrophenazine-1-carboxilate

- -

1130 [c] : d5hpca + o2 --> pca + h2o2

Síntesis de PCA - -

1131 [c] : thpca <==> t1rhpca

Isomerización de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidrophenazine-1-carboxilato

- -

1132 [c] : t1rhpca + o2 --> dhpca + h2o2

Oxidación de (1R)-1,4,5,10- tetrahidro-phenazina-1-carboxilato

pyridoxamine 5'-phosphate oxidase

PA4216

1133 [e] : pca_e <=>

Intercambio de PCA - -

Posterior a realizar la incorporación de las reacciones y metabolitos anteriormente

mencionados, el modelo metabólico de Pseudomonas aeruginosa propuesto para este

trabajo está constituido por un total 886 metabolitos y 1133 reacciones, en las que se

incluyen reacciones netamente metabólicas, reacciones de transporte, reacciones de

Page 29: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

29

intercambio de metabolitos y una reacción de biomasa. Cabe resaltar que esta reacción

de biomasa hace referencia a la reacción que contiene todos los metabolitos necesarios

para la formación de biomasa(carbohidratos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos y ATP) y la

cual se tomará como función objetivo al momento de realizar el modelamiento bajo la

aproximación de FBA y al solucionar el problema de optimización.

Tabla 2. Metabolitos involucrados en la síntesis de PCA que fueron incorporados al modelo CCBM1737

Metabolito Abreviatura

(1R,6S)-6-amino-5-oxociclohex-2-ene-1-carboxilato aochc

(1R,5a,6R)-4a-hidroxi-1,4,4a,5,5a,6,9,10a-octahidrophenazina-1,6-dicarboxilato

ohpdc

(1R,6R)-1,4,5,5a,6,9-hexahidrophenazina-1,6-dicarboxilato hhpdc

(1R,10aS)-1 ,4,10, 10a-tetrahidrophenazina-1-carboxilato thpca

(10aS)-10,10a-dihidrophenazina-1- carboxilato dhpca

5,10dihidrophenazina-1-carboxilato d5hpca

(1R)-1,4,5,10- tetrahidro-phenazina-1-carboxilato t1rhpca

A partir de la red metabólica completa, que incluye las reacciones propias de la biosíntesis

de PCA, se realizó el proceso de curación de la red metabólica siguiendo la metodología

propuesta en la sección 5.2. Como resultado de este proceso de curación se determinó

que no había presencia de precursores de biomasa faltantes, ni patologías tipo RNC y

RNP y tampoco se evidenció la presencia de ciclos termodinámicamente infactibles.

En adición al proceso de curación, se determinó el coeficiente estequiométrico para incluir

a PCA como precursor de biomasa (reacción 914) con un valor de 0.8. Este coeficiente

estequiométrico, se escogió posterior a realizar un análisis de sensibilidad, teniendo en

cuenta el mayor número de reacciones para las cuales se obtuvo un flujo de reacción

distinto a cero (flujo activo) después de realizar el modelamiento de la red bajo la

aproximación de FBA. Empleando el coeficiente estequiométrico de 0.8 para PCA en la

reacción de biomasa se obtuvieron flujos activos para 352 reacciones, entre las cuales se

encuentran las correspondientes a la síntesis y transporte de PCA.

Tanto la inclusión de PCA como precursor de biomasa y la determinación de su

coeficiente estequiométrico, son dos procesos importantes a tener en cuenta en el

modelamiento de la red ya que esto permite la activación de las reacciones de síntesis,

transporte e intercambio de este metabólito. Hay que tener en cuenta que estas

reacciones no pertenecen al ―core‖ del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1

Page 30: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

30

puesto que PCA es a un metabolito secundario y por ende no es indispensable para el

crecimiento y supervivencia celular de este microorganismo.

6.2. Modelamiento bajo la aproximación de FBA de la Red Metabólica de

Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA.

Posterior al proceso de curación, la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 se

modeló bajo la aproximación de FBA en el software GAMS y con el programa en R

desarrollado específicamente para este trabajo (ver metodología, sección 5.3) .

En general los resultados obtenidos del modelamiento muestran que de las 1133

reacciones que conforman la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 en este

trabajo, 352 estaban activas durante la simulación. Para determinar si realmente las

reacciones activas correspondían a reacciones involucradas en el proceso biológico de

crecimiento bacteriano se realizó un análisis de los sistemas y subsistemas metabólicos a

los que pertenece cada reacción.

Figura 3. Número de reacciones activas en cada uno de los sistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA.

Page 31: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

31

En la Figura 3 se presenta un gráfico de barras en el cual se relacionan los principales

sistemas metabólicos que se encuentran involucrados en las reacciones activas durante

el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de FBA. En esta figura se evidencia que la mayoría de reacciones activas

corresponden a la síntesis de pared celular, seguida del metabolismo de aminoácidos,

síntesis de cofactores, grupos prostéticos, transportadores de electrones y metabolismo

central. Estos sistemas metabólicos son los que presentan el mayor número de

reacciones activas ya que son los que se relacionan principalmente con los procesos de

crecimiento y supervivencia celular. Así, las reacciones de biosíntesis de lipopolisacáridos

(LPS), estan relacionadas con la síntesis de pared celular; las reacciones de biosíntesis

de aminoácidos se relacionan con la síntesis de proteínas tales como proteínas con

actividad enzimática, de transporte o proteínas de pared y membrana, entre otras. Las

reacciones que involucran cofactores y transportadores de electrones están relacionadas

con respiración celular y en general con procesos metabólicos pertenecientes al

metabolismo central

En la figura 3 también se observa que el sistema metabólico correpondiente a la

metabolismo de ácidos grasos y en general de lípidos contiene un número significativo de

reacciones activas, esto puede deberse a que la biosíntesis de ácidos grasos se relaciona

con síntesis de glicerofosfolípidos y en general con lípidos estructurales de pared y de

membrana; asi como , los procesos de degradación de lípidos se relaciona con

producción de energía necesaria para el crecimiento celular. También se puede observar

que otro sistema metabólico importante hace referencia a la síntesis de nucleótidos por

rutas de novo y de salvamento que implican la disponibilidad de estos para síntesis de

ácidos nucléicos, proceso que es indispensable en la proliferación y supervivencia celular.

Así mismo, las reacciones de intercambio y de transporte que permiten el transporte de

metabolitos hacia el medio intra y extracelular se encuentran activas, lo que implica que

se mantenga la homeostasis celular a través del ingreso de nutrientes y exportación de

metabolitos cuya acumulación podría generar toxicidad en la célula. Por otra parte, el

metabolismo de compuestos sulfurados puede estar relacionado con la biosíntesis de

aminoácidos (metionina y cisteína) y la síntesis de grupos prostéticos tales como la

coenzima A.

Page 32: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

32

Figura 4 Subsistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA.

En la figura 4 se hace una descripción cualitativa de los resultados teniendo en cuenta las

rutas metabólicas que se encuentran activas durante el modelamiento de Pseudomonas

aeruginosa PAO1. Se observa al igual que en los sistemas metabólicos que las

principales rutas activas son las relacionadas con la síntesis de pared celular (síntesis de

antígeno O y lipopolisacáridos), con la síntesis de membrana celular (síntesis de ácidos

grasos y de aminoácidos como treonina, lisina, isoleucina y aminoácidos aromáticos),

con la síntesis de nucleótidos (metabolismo del folato, rutas de salvamento, síntesis de

purinas y pirimidinas) y con el metabolismo central (glicolisis/gluconeogénesis, vía de las

Page 33: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

33

pentosas fosfato, fosforilación oxidativa y rutas de degradación de fuentes de carbono

alternas) principalmente.

Los resultados de los valores de los flujos metabólicos de las reacciones de interés para

la síntesis de PCA obtenidos del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas

aeruginosa bajo la aproximación de FBA y que fue solucionado tanto con el software

GAMS como con el programa en R desarrollado para este trabajo se muestran en la Tabla

3. En ambos casos se obtuvo un valor para los flujos metabólicos de las reacciones

relativamente igual, lo que indica que el programa construido en R (software libre) fue

diseñado en forma adecuada, logra reproducir los resultados del FBA obtenidos en el

software comercial (GAMS) y se constituye como un aporte para la comunidad científica

en el modelamiento de redes metabólicas bajo la aproximación de FBA.

Tabla 3. Flujo de las reacciones de biosíntesis, transporte e intercambio de PCA obtenidas del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa bajo la aproximación de FBA empleando el software GAMS y el programa en R.

ID de

Reacción Descripción Flujo en GAMS

(mmol/gDW*h) Flujo en R

(mmol/gDW*h) 914 Biosíntesis de biomasa 0.61587184 0.6158718

59 Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate 0.00 0.00

228 Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato 0.00 0.00

894 Transporte de PCA 0.49269747 0.4926975

1124-1132 Biosíntesis de PCA 0.00 0.00

1133 Intercambio de PCA -0.49269747 -0.4926975

Estos valores de flujo fueron obtenidos de la simulación del FBA en estado estacionario,

donde se observa un flujo para la reacción de biomasa cercano al reportado en la

literatura para Pseudomonas aeruginosa [46]. Sin embargo, los resultados muestran que

las reacciones involucradas en la síntesis de acido corismico (precursor de PCA) y de

PCA no se encuentran activas, esto puede ser debido a que la reacción de transporte

(que involucra un transporte activo) de PCA se encuentra activa siendo la fuente principal

de PCA, que de acuerdo con las condiciones de simulación se requiere como precursor

de biomasa. Esto se puede confirmar también con la inactividad de las reacciones en las

que PCA se consume como precursor de piocianina y que se muestran más adelante en

la tabla 5. Estos resultados obtenidos simulan un evento en el que la célula asimila PCA

del medio extracelular, lo cual tiene sentido desde un punto de vista biológico ya que si la

célula puede adquirir los nutrientes que necesita para su crecimiento, esta lo hará con el

Page 34: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

34

fin de gastar la menor cantidad de ATP sintetizando compuestos que requiere para

generar biomasa.

Sin embargo, un escenario en el que PCA es asimilado, pero no es sintetizado por la

célula, no sería de interés en el contexto de este trabajo para la producción de PCA, ya

que no aporta información sobre la distribución de los flujos metabólicos de las reacciones

implicadas en la ruta biosintética de este metabolito. Por lo cual, se planteó otro escenario

de simulación en el que se bloqueo la reacción de transporte de PCA (Reacción 894), con

estas restricciones se esperaría obtener un escenario en el que la célula deba sintetizar y

exportar PCA. Los resultados del modelamiento de la red de Pseudomonas aeruginosa

PAO1 bajo la aproximación de FBA teniendo en cuenta la modificación mencionada

anteriormente para la reacción de transporte de PCA (Tabla 4), muestran que al llevar a la

célula a sintetizar PCA, el flujo de la reacción de biomasa disminuye en un 18% en

comparación con la primera simulación (ver Tabla 3), esto puede darse posiblemente por

el costo energético que implica la síntesis de un metabolito requerido como precursor de

biomasa.

Tabla 4. Simulación en GAMS de flujos en estado estacionario restringiendo las reacciones de transporte e intercambio de PCA.

ID de Reacción

Descripción Flujo (mmol/gDW*h)

914 Biosíntesis de biomasa 0.50588105

59 Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate 0.80940969

228 Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato 0.80940969

894 Transporte de PCA Reacción Bloqueada

1124 Isomerización de trans-2,3-dihydro-3-hydroxy-anthranilato 0.80940969

1125-1132 Biosíntesis de PCA 0.40470484

1133 Intercambio de PCA 0.00

Los resultados también muestran que, aunque las reacciones de síntesis de PCA se

activaron, la reacción de intercambio no se activo (Tabla 4). La inactividad de esta

reacción intercambio posiblemente puede presentarse debido a que para modelar la

biosíntesis de PCA fue necesario añadir este metabolito en la reacción de biomasa, de

modo que en la simulación, PCA es indispensable para la producción de biomasa de

Pseudomonas aeruginosa PAO1 y si este metabolito fuera exportado disminuiría la

disponibilidad del mismo lo que conllevaría a la no producción de biomasa. Sin embargo,

en ensayos in vitro, se ha observado que en Pseudomonas aeruginosa este compuesto

podría ser exportado a través de un sistema conocido como MexGHI-OpmD [23, 47] el

Page 35: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

35

cual no fue contemplado en el modelo de la red metabólica de este trabajo, con lo que se

propone para dar continuidad a esta investigación en trabajos futuros se contemple la

participación de los mecanismos de regulación génica y metabólica que implican la

actividad de MexGHI-OpmD.

En adición, trabajos como los reportados por El-Sayed y colaboradores en 2008 [48]

indican que la producción de PCA in vitro después de 48 horas de cultivo no supera los

12.6 . Esta producción natural de PCA en Pseudomonas aeruginosa es baja y no

contempla modificaciones como las que se tuvieron en cuenta para el modelamiento

realizado, lo cual puede abrir puertas a investigaciones futuras.

Debido a que PCA es un metabolito secundario asociado a Quorum-Sensing su máxima

producción se da al final de la fase exponencial donde la densidad poblacional es alta

[49]. De modo que la discrepancia en el proceso de biosíntesis evidenciada en los

resultados de las simulaciones mencionadas anteriormente para el modelo propuesto en

este trabajo, se puede deber a que naturalmente la producción de PCA depende del

crecimiento y de la densidad poblacional de Pseudomonas aeruginosa PAO1, mientras

que el modelo matemático propuesto en este trabajo para la producción de este

metabolito en particular, asume que el crecimiento depende de la presencia o síntesis de

PCA. Con lo anterior, se propone para dar continuidad a este trabajo que se contemplen

el modelo de la red metabólica la regulación de los sistemas de Quorum-sensing para la

expresión de PCA.

Sin embargo, esto no implica que el modelamiento de la producción de PCA no se pueda

llevar a cabo bajo la aproximación de FBA, ya que existen otras rutas metabólicas (de las

cuales se conoce muy poco), en las que podría intervenir esta fenazina. Por ejemplo,

Wang y colaboradores en 2011 [50], mostraron que PCA promovía la adquisición de

hierro durante la formación de biofilm en ausencia de sideróforos, mostrando un

mecanismo por el cual las fenazinas podrán contribuir en la adquisición de hierro, lo cual

involucra el transporte de la fenazina en estado reducido hacia el medio extracelular, una

reacción redox en la cual la fenazina se oxida y el hierro III se reduce y posteriormente se

importan los compuestos.

Page 36: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

36

Por otra parte, se ha observado que en Pseudomonas aeruginosa PCA podría sustituir al

NAD+ en reacciones de óxido reducción bajo condiciones anaerobias y de esta manera

producir PCA en estado reducido [51]. De este modo se podría adicionar a la red

metabólica las reacciones involucradas en la adquisición de hierro y reducción de PCA,

realizar la curación de la red y manipular las condiciones redox en la célula a través del

método FBA con el fin de determinar si estas condiciones activan las reacciones de

biosíntesis, transporte e intercambio simultáneamente.

Aunque en la simulación bajo la aproximación de FBA mostrada en la Tabla 4 no se activó

la reacción de intercambio de PCA durante su biosíntesis, se observó durante la

simulación que algunas reacciones, como las involucradas en síntesis de otras fenazinas

como lo son 5-metil-PCA, piocianina y 1-hidroxi-fenazina tienen un flujo nulo (Tabla 5).

Tabla 5. Reacciones inactivas para la maximización de la producción de PCA

ID de Reacción

Subsistema metabólico Precursor

3 Biosíntesis de1-hidroxi-Fenazina PCA

28 Biosíntesis de 5-metil-PCA PCA

174 Biosíntesis de Aminoácidos Aromáticos Ácido Corísmico

420 Biosíntesis de Quinonas Ácido Corísmico

712 Biosíntesis de Piocianina PCA

912 Biosíntesis de Pioverdina Ácido Corísmico

Lo anterior puede estar dado debido a que PCA es el precursor de las fenazinas

anteriormente mencionadas y se constituye como un precursor de biomasa en el modelo

matemático, por ende, estas reacciones adquieren un valor de cero con el fin maximizar la

producción de biomasa e impedir el consumo de PCA. Ocurre de la misma forma para las

reacciones mostradas en la Tabla 5 en las que el ácido corísmico es precursor, estas

reacciones se encuentran inactivas debido a que el ácido corísmico es el precursor

principal de PCA y el modelo matemático distribuye los flujos para la producción de PCA

evitado el consumo de ácido corísmico en las otras reacciones en las que está implicado.

Lo anterior indica el adecuado funcionamiento del modelo de la red metabólica de

Pseudomonas aeruginosa propuesto en este trabajo.

6.3. Modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la Red Metabólica de

Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA.

Page 37: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

37

En cuanto al modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la red metabólica de

Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA, se consideraron varios

escenarios de simulación (Tabla 6), teniendo en cuenta las siguientes condiciones :

(i) La presencia de PCA en la reacción de biomasa. Como se mencionó

anteriormente, PCA es un metabolito secundario que no pertenece al ―Core‖

del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1, por lo cual para activar

las reacciones relacionadas con la biosíntesis de este metabolito, PCA fue

adicionado como precursor a la reacción de biomasa con un coeficiente

estequiométrico de 0.8.

(ii) Los intervalos fueron definidos de un tamaño de 0.0095 horas, lo cual es el

resultado de dividir el tiempo estándar de crecimiento de Pseudomonas

aeruginosa PAO1 (19 horas) en 2000 intervalos [32].

(iii) La reacción que involucra el mecanismo de transporte de PCA (reacción 894)

fue bloqueada. Dado que en el modelamiento bajo la aproximación de FBA se

observó que las reacciones de biosíntesis de PCA estaban activas cuando el

flujo de esta reacción era cero, lo que conllevaba a que la red metabólica

distribuyera los flujos de las reacciones para la activación de la síntesis de

PCA (Activación de los flujos de las reacciones 1124 a 1132)

(iv) La concentración inicial in silico de los componentes del medio de cultivo (LB,

medio Luria Bertani): La concentración inicial de las fuentes de carbono,

nitrógeno, fosforo, azufre, oxigeno y del inoculo (concentración de biomasa

inicial) para una simulación del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en

medio LB fueron las reportadas por Clavijo y colaboradores en 2018 (55.5 mM

de glucosa, 104.1279mM de amoniaco, 3.8801mM de Pi, 0.2863mM de SO4,

1mM de oxigeno y 0.1g/L de inoculo).

Tabla 6. Condiciones de simulación DFBA. Las casillas marcadas con ―X‖ corresponden a las condiciones utilizadas en la simulación. El escenario 1 considera

Escenario de

simulación

PCA presente en la reacción de biomasa

Transporte de PCA

bloqueado 1

2 X

3 X X

Page 38: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

38

En la tabla 6 se muestran los escenarios de simulación con las condiciones empleadas en

cada simulación que se plantearon para este trabajo con el fin de estudiar la producción

de PCA en Pseudomonas aeruginosa PAO1 en estado dinámico. El escenario 1 no

considera ninguna condición y se tomó como escenario control para verificar la

funcionalidad del modelo, el escenario 2 considera la inserción de PCA como precursor en

la reacción de biomasa con un coeficiente estequiométrico de 0.8 y finalmente el

escenario 3 considera tanto la inserción de PCA como precursor en la reacción de

biomasa con un coeficiente estequiométrico de 0.8 como el bloqueo de la reacción de

transporte de PCA (reacción 894).

En la simulación bajo las condiciones planteadas para el escenario 1 (Tabla 6), se

observa que hubo producción de biomasa hasta las 9 horas de simulación

aproximadamente (Figura 5), mostrando un aumento exponencial en el tiempo de la

concentración de biomasa hasta un máximo de 1.33g/L.

Figura 5. Perfil de concentración in silico de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.

Acorde con este resultado, el modelo indica un consumo del 80% de la glucosa disponible

(Figura 6) y un consumo del 100% del sulfato (Figura 7) que coinciden con la hora 9 de

simulación, hora en la que el perfil de biomasa indica haber alcanzado un estado

estacionario. El cambio abrupto entre la fase exponencial y la fase estacionaria es

observado debido a que el modelo matemático permite simular la producción de biomasa

Page 39: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

39

siempre que haya disponibilidad de nutrientes, por lo tanto es posible observar un

aumento de la concentración de biomasa en el tiempo hasta que el consumo de sulfato

es del 100%, sin embargo en un perfil de concentración in vitro de biomasa se esperaría

que la fase estacionaria iniciara gradualmente y antes de que el sulfato fuera consumido

por completo.

Como era de esperarse, de acuerdo con las condiciones de simulación de este primer

escenario, no se observó actividad (presencia de flujos metabólicos) para las reacciones

implicadas en la ruta de biosíntesis de PCA y por ende no se obtuvo un perfil de

concentración de PCA; lo anterior, debido a que no se contempló ninguna condición que

permitiera la activación de dicha ruta metabólica.

Figura 6. Perfil de consumo de glucosa in silico por Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.

Cabe resaltar, que este primer escenario se planteó como un escenario control, con el fin

de evaluar el funcionamiento del modelo de la red metabólica de Pseudomonas

aeruginosa que involucra la síntesis de PCA propuesto en este trabajo y tener un punto de

partida para las siguientes simulaciones, de modo que como resultado se esperaba

Page 40: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

40

obtener el perfil de producción in silico de biomasa y el perfil de consumo in silico de

nutrientes.

Figura 7. Perfil de consumo in silico de sulfato por Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.

Al tomar en cuenta las condiciones de simulación propuestas en el escenario 2, los

resultados obtenidos con respecto al perfil de biomasa indican, como se muestra en la

figura 8, que se presenta una producción exponencial de biomasa a lo largo de las

primeras 11 horas simuladas, tiempo en el cual la concentración de biomasa alcanza un

máximo de 1.33 g/L (Figura 8).

Page 41: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

41

Figura 8. Perfil de concentración de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.

Esta producción de biomasa está asociada con un consumo del 100% de la glucosa

(Figura 9) y del sulfato disponibles (Figura 10). Esto se asemeja con lo observado

naturalmente en Pseudomonas aeruginosa, ya que hay producción de biomasa hasta

cuando se agotan algunos de los nutrientes escenciales para el crecimiento disponibles

en el medio y luego la producción de biomasa se mantiene constante, lo que corresponde

biológicamente con la finalización de la fase exponencial y el comienzo de la fase

estacionaria. Schleheck y colaboradores en 2009 [52], entre otros, reportaron que

Pseudomonas aeruginosa, puede crecer exponencialmente hasta cuando el consumo de

glucosa es del 100%, lo que concuerda con los resultados mencionados anteriormente.

Los perfiles de concentración in silico de glucosa, sulfato y biomasa obtenidos en la

simulación bajo las condiciones propuestas para el escenario 3 (presencia de PCA en la

reacción de biomasa y bloqueo de la reacción de transporte de PCA) fueron iguales a los

obtenidos aplicando las condiciones propuestas para el escenario 2 (los datos no se

muestran).

Figura 9. Perfil de concentración de Glucosa en Pseudomonas aeruginosa, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.

Page 42: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

42

El tiempo de producción de biomasa y la concentración de biomasa obtenidas en la

simulación dos son similares a los reportados por Clavijo y colaboradores en 2018 [32], ya

que en este estudio se obtuvo que para Pseudomonas aeruginosa PAO1, el tiempo

durante el cual hubo producción in vitro e in silico de biomasa fue de 14 horas, y la

concentración obtenida al cabo de este tiempo fue de aproximadamente 1.3 g/L, por lo

cual se puede afirmar que el escenario 2 simula de mejor manera la producción de

biomasa en Pseudomonas aeruginosa. Así mismo, Clavijo y colaboradores reportan que

al final de la fase exponencial se observó un consumo in silico de glucosa del 100%, lo

cual también ocurre en el escenario de simulación 2 (figura 9).

Con respecto al consumo de sulfato para este trabajo (Figura 10), bajo las condiciones de

simulación del escenario 2 y 3, la disponibilidad de sulfato al igual que que la

disponibilidad de glucosa mostró ser limitante para la producción in silico de biomasa en

Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Figura 10. Perfil de concentración de sulfato en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.

Por otra parte, en los resultados de las simulaciones bajo las condiciones propuestas para

el escenario 2 y el escenario 3 no se observa producción de PCA a nivel extracelular; sin

embargo, a nivel intracelular el modelo muestra un flujo activo para la reacción de síntesis

de de PCA, el cual es constante (Figura 11), con lo que se puede inferir que el PCA

Page 43: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

43

producido está siendo consumido en el modelo para la producción de biomasa, debido a

que se ha tomado este metabolito como precursor de biomasa en el modelo propuesto

para este trabajo (Ver sección 5.2.2).

Figura 11. Flujo in silico de la reacción de síntesis de PCA bajo las condiciones de simulación del escenario 3.

En adición, al igual que en la simulación bajo la aproximación de FBA (estado

estacionario, tabla 4), este resultado puede estar relacionado con la inactividad de las

reacciones de transporte e intercambio de PCA y la actividad de las reacciones de la ruta

de biosíntesis de PCA. Como se mencionó en la discusión de esos resultados (en estado

estacionario), no se conoce el mecanismo exacto por el cual se lleva a cabo la

exportación de PCA, por tal razón no es posible en este trabajo obtener un perfil de

producción de PCA extracelular. Esto abre las puertas para investigaciones futuras, en las

que se estudie el mecanismo de transporte de PCA a nivel in vitro e in silico, tambien se

puede proponer evaluar a futuro otras condiciones celulares de simulación que permitan

aumentar la producción de PCA para que no sea consumido por completo en la reacción

de biomasa y el exceso pueda ser exportado.

Como se había mencionado anteriormente, la producción de PCA está regulada por

Quorum sensing; es así cómo los resultados de estudios in vitro, tales como el realizado

por Cui y colaboradores en 2016 [15], en el que se estudian los genes y las proteinas

involucradas en este mecanismo de regulación y su influencia en la producción de PCA

en Pseudomonas aeruginosa PAO1, pueden ser utilizados para construir la red de

Page 44: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

44

Quorum sensing [32] que regula la expresión de los genes implicados en la síntesis de

PCA y pueda ser utilizada para simular y modelar la síntesis metabólica de PCA bajo la

aproximación de FBA y DFBA.

7. CONCLUSIONES

El modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de FBA permite simular el metabolismo para la producción de

biomasa de este microorganismo, ya que las reacciones activas observadas en la

simulación en estado estacionario, estaban relacionadas con el crecimiento y

supervivencia celular.

Se diseño un código en el software libre R que permite simular el metabolismo

para la producción de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1 en estado

estacionario, con resultados iguales a los obtenidos en el software comercial

(GAMS)

El modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de DFBA permite obtener perfiles de producción de biomasa,

consumo de glucosa y consumo de sulfato que han sido reportados en la literatura.

La red metabólica utilizada en este trabajo permite la simulación de la biosíntesis

de fenazina-1-carboxilato (PCA) en Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la

aproximación de FBA y DFBA, pero se deben realizar más estudios con relación al

mecanismo de exportación de PCA para obtener un perfil de producción

extracelular de este metabolito.

Page 45: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

45

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Page 49: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

49

ANEXOS

1. Solucion al problema de optimización lineal de FBA en el software libre R

library(Rsymphony)

library(readxl)

#CONTRUCCION DE LA FUNCION OBJETIVO

obj=c(rep(0,913),rep(1,1),rep(0,219))

#IMPORTACION DE LA MATRIZ ESTEQUIOMETRICA

mat=read_excel("C:/Users/USER/Downloads/Estacionario/Matriz_PCA.xlsx",

sheet=1,col_names=F)

mat=data.matrix(mat, rownames.force = NA)

#CONSTRUCCION DE dir(Restricción tipo Ax=b)

dir=c('==')

i1=1

while (i1<886){

dir=c(dir,'==')

i1=i1+1

}

#CONSTRUCCIÓN DE rhs ―vector nulo‖

rhs=numeric(886)

#CONSTRUCCIÓN DE BOUNDS

##LOWER BOUNDS ―LBj‖

l1=c(LB1,LB2,…,LB100)

l2=c(LB101,LB102,…,LB200)

l3=c(LB201,LB202,…,LB300)

l4= c(LB301,LB302,…,LB400)

l5= c(LB401,LB402,…,LB500)

l6= c(LB501,LB502,…,LB600)

l7= c(LB601,LB602,…,LB700)

l8= c(LB701,LB702,…,LB800)

l9= c(LB801,LB802,…,LB900)

l10=c(LB901,LB902,…,LB1000)

l11= c(LB1001,LB1002,…,LB1100)

l12=c(LB1101,LB1102,…,LB1133)

#CONSTRUCCIÓN DE val1

val1=c(l1,l2,l3,l4,l5,l6,l7,l8,l9,l10,l11,l12)

Page 50: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

50

#CONSTRUCCIÓN DE ind

k1=c(1L , 2L , …, 100L)

k2=c(101L,102L,… ,200L)

k3=c(201L,202L,…,300L)

k4=c(301L,302L,…,400L)

k5=c(401L,402L,…,500L)

k6=c(501L,502L,…,600L)

k7=c(601L,602L,…,700L)

k8=c(701L,702L, …,800L)

k9=c(801L,802L,…,900L)

k10=c(901L, 902L,…,1000L)

k11=c(1001L,1002L,…,1050L)

k12=c(1051L,1052L,…,1123L)

k13=c(1124L, 1125L,…,1132L)

ind=c(k1,k2,k3,k4,k5,k6,k7,k8,k9,k10,k11,k12,k13)

#CONSTRUCCIÓN DE val2

##UPPER BOUNDS‖UBj‖

u1=c(UB1,UB2,…,UB100)

u2=c(UB101,UB102,…,UB200)

u3=c(UB201,UB202,…,UB300)

u4=c(UB301,UB302,…,UB400)

u5=c(UB401,UB402,…,UB500)

u6=c(UB501,UB502,…,UB600)

u7=c(UB601,UB602,…,UB700)

u8=c(UB701,UB702,…,UB800)

u9=c(UB801,UB602,…,UB900)

u10=c(UB901,UB902,…,UB1000)

u11=c(UB1001,UB1002,…,UB1100)

u12=c(UB1101,UB1102,…,UB1133)

val2=c(u1,u2,u3,u4,u5,u6,u7,u8,u9,u10,u11,u12)

bounds=list(lower=list(ind=ind,val=val1),upper=list(ind=ind,val=val2))

#CONSTRUCCION DE types

types=c("C")

i2=1

while (i2<1133){

types=c(types,"C")

i2=i2+1

Page 51: MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas

51

}

#MAXIMIZACIÓN

max=TRUE

#SOLUCIÓN

Rsymphony_solve_LP(obj, mat, dir, rhs, bounds , types ,max , verbosity = -2, time_limit = -

1,node_limit = -1, gap_limit = -1, first_feasible = FALSE,write_lp = FALSE, write_mps = FALSE)

2. Red Metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1

Se entrega la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 utilizada en este trabajo en

formato digital. La red incluye la información (reacciones, genes, metabolitos, enzimas y valores de

), reportada previamente en el modelo CCBM1737, junto con la información referente a la

biosíntesis de fenazina-1-carboxilato, la cual fue adicionada en este trabajo.