Embed Size (px)
Citation preview
CENTRO UNIVERSITÁRIO CESMAC
HINGRID ESTÉFANE LINS DE MENDONÇA
MONITORAMENTO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CLÍNICA DE CÃES ESTIMULADOS POR ANTÍGENO
VACINAL RECOMBINANTE A2 E SAPONINA
MACEIÓ-AL 2018/01
HINGRID ESTÉFANE LINS DE MENDONÇA
MONITORAMENTO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CLÍNICA DE CÃES ESTIMULADOS POR ANTÍGENO
VACINAL RECOMBINANTE A2 E SAPONINA
Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito final do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário Cesmac, sob orientação da professora Ma. Gilsan Aparecida de Oliveira
MACEIÓ-AL 2018/01
REDE DE BIBLIOTECAS CESMAC
M539m
Mendonça, Hingrid Estéfane Lins de
Monitoramento da resposta imune humoral e clínica
de cães estimulados por antígeno vacinal recombinante
A2 e saponina / Hingrid Estéfane Lins de Mendonça.--
Maceió , 2018.
23 f.: il.
TCC (Graduação em Medicina Veterinária) - Centro Universitário
CESMAC, Maceió, AL, 2018.
Orientador: Gilsan Aparecida de Oliveira.
1. Leishmania spp. 2. Leishmaniose. 3. Cães. 4.
Vacina. I. Oliveira, Gilsan Aparecida de. II. Título.
CDU: 619:636.7
Evandro Santos Cavalcante
Bibliotecário CRB-4 1700
HINGRID ESTÉFANE LINS DE MENDONÇA
MONITORAMENTO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CLÍNICA DE CÃES ESTIMULADOS POR ANTÍGENO
VACINAL RECOMBINANTE A2 E SAPONINA
Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito final do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário Cesmac, sob orientação da professora Ma. Gilsan Aparecida de Oliveira
APROVADO EM: 28/05/2018
Orientadora – Ma. Gilsan Aparecida de Oliveira
BANCA EXAMINADORA
DRA. ISABELLE VANDERLEI MARTINS BASTOS
DR. SILVIO ROMERO OLIVEIRA ABREU
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, por ter permitido que eu chegasse até aqui.
Agradeço aos meus pais e minha família, por toda ajuda, dedicação e
incentivo. Devo todas minhas conquistas a vocês.
Agradeço à minha professora, orientadora e amiga, Gilsan Aparecida de
Oliveira, por toda confiança depositada em mim, dedicação e auxílio em qualquer
momento ou assunto, sua enorme ajuda foi e sempre será fundamental em toda
minha caminhada na medicina veterinária.
Agradeço ao Dr. Rinaldo Ferri, por sempre ter me ajudado e por tudo que me
ensina e ensinou.
Agradeço a todos que me acompanham desde muito tempo nessa jornada,
que sempre me apoiaram, tiveram paciência comigo, vibraram todas as minhas
conquistas junto comigo, me ensinaram muito e me ajudaram a crescer pessoal e
profissionalmente...
Obrigada aqueles que de alguma forma fizeram parte da minha/nossa
conquista.
Muito obrigada a todos vocês!
MONITORAMENTO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CLÍNICA DE CÃES ESTIMULADOS POR ANTÍGENO VACINAL RECOMBINANTE A2 E SAPONINA
MONITORING THE HUMORAL IMMUNE RESPONSE AND CLINIC OF DOGS STIMULATED BY RECOMBINANT A2 AND SAPONINE VACCINE ANTIGEN
Hingrid Estéfane Lins de Mendonça Graduanda do Curso de Medicina Veterinária
Gilsan Aparecida de Oliveira
Mestra em Ciência Veterinária e professora do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário Cesmac
RESUMO A LVC é uma zoonose de grande impacto na saúde pública devido à alta patogenicidade e mortalidade em humanos e cães, por isso as vacinas têm sido uma alternativa para controlar a doença. Contudo, os anticorpos vacinais não devem reagir aos testes aplicados no Brasil. Objetivou-se monitorar sorologicamente os animais vacinados com antígeno vacinal recombinante A2, a fim de evitar a eutanásia de cães falso-positivos, por meio de fornecimento de dados que garantam a não reação dos testes aos anticorpos vacinais. Foram coletados cerca de 5mL de sangue dos 5 cães atendidos em processo vacinal com um total de 11 amostras. O sangue foi encaminhado ao laboratório de doenças parasitárias do Cesmac – Marechal Deodoro e ao Centrovet – Maceió para realização dos testes. Observou-se que 9,09% (1/11) das amostras foram positivas ao DPP, 18,1% (2/11) indeterminado ao teste de ELISA e 100% de negatividade ao RIFI. Desta forma, sugere-se que o antígeno utilizado na vacina pode gerar anticorpos que reagem aos testes disponíveis no país, visto que durante o monitoramento o animal pode ter sido desafiado por L. infantum.
PALAVRAS CHAVE: Leishmania spp. Leishmaniose. Cães. Vacina. ABSTRACT CanL is a zoonosis with a major impact on public health due to the high pathogenicity and mortality in humans and dogs, so vaccines have been an alternative to control the disease. However, the vaccine antibodies should not react to the tests applied in Brazil. The objective was to serologically monitor animals vaccinated with A2 recombinant vaccine antigen in order to avoid the euthanasia of false-positive dogs by providing data that guarantee the unlikely reaction of the tests to the vaccine antibodies. About 5 mL of blood were collected from the 5 dogs treated in the vaccine process with a total of 11 samples. Blood was sent to the laboratory of parasitic diseases of Cesmac - Marechal Deodoro and Centrovet - Maceió for the tests. It was observed that 9,09% (1/11) of the samples were positive for DPP, 18,1% (2/11) indeterminate ELISA test and 100% negativity for IFA . Thus, it is suggested that the antigen used in the vaccine can generate antibodies that respond to the available tests in the country, since during the management the animal may have been challenged by L. infantum.
KEYWORDS: Leishmania spp. Leishmaniasis. Dogs. Vaccine
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 7
2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 8
3 RESULTADOS .................................................................................................... 12
4 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 13
5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 16
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 17
ANEXO 1– TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ................. 20
ANEXO 2 – PROTOCOLO DO COMITÊ DE ÉTICA ................................................ 22
7
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença zoonótica causada por
Leishmania infantum, transmitida por flebotomíneos (GRADONI, 2015) e
considerada fatal em cães e homens (SCHAUT et al., 2016). Contudo, apenas os
cães domésticos e errantes são considerados importantes reservatórios, onde as
amastigotas vivem no fagolisossoma de fagócitos hospedeiros que exibem o
mecanismo de defesa do óxido nítrico após ter ocorrido a infecção pelas
promastigotas presentes nos flebotomíneos (ALCOLEA et al., 2016).
O sistema imune então pode gerar uma resposta humoral do tipo Th2, pelo
cão, com apresentação de sinais clínicos viscerocutâneos, graves que podem
evoluir para morte, como também pode desenvolver uma resposta celular do tipo
Th1 e o cão tornar-se resistente (GRADONI, 2015). Ressalta-se que,
independentemente do tipo de resposta, apenas a exposição do hospedeiro ao
agente já é passível de gerar a produção de Imunoglobulinas G e M em pequenas
titulações, sendo possível sua detecção sorológica. Contudo, não é detectado o
DNA do parasito na PCR, sendo classificados como cães expostos como sugerido
pela Canine Leishmaniasis Working Group (CLWG) (PALTRINIERI et al., 2010).
O diagnóstico no Brasil é feito utilizando as pesquisas de anticorpos anti-
Leishmania da classe G, e a soropositividade do cão implica na maioria das vezes
na sua eutanásia, que é um dos principais métodos de controle recomendado pelo
Ministério da Saúde no Brasil (BRASIL, 2014). Para verificação desses anticorpos
presentes nos cães é recomendado pelo Ministério da Saúde o uso, como método
de triagem, do ensaio imunocromatográfico Dual Plate Platform (DPP), o qual usa a
tecnologia Dipstick e as proteínas recombinantes rK26 e rK39 (BRASIL, 2014), que
reagem com os anticorpos presentes no sangue, plasma ou soro do cão.
A confirmação da infecção se dá por meio de um teste de ELISA no qual se
usa a rK39, proteína recombinante e imunodominante relacionada a Kinesina,
conferindo, desta forma, uma alta especificidade e sensibilidade, visto que esse
epítopo está bem conservado em algumas espécies de Leishmania spp, (BRASIL,
2014). Desta forma, o ELISA torna-se um bom método de diagnóstico para avaliar o
estado de infecção dos cães (SCALONE et al., 2002).
Contudo, o controle realizado através da detecção de cães soropositivos
seguidos da eutanásia não tem demonstrado associação com significância
8
estatística entre esse método de controle e a leishmaniose humana, ao contrário, o
risco parece ser maior em casos com prévia infecção humana e não animal (JULIÃO
et al., 2007). Tal fato chama atenção para outros possíveis reservatórios e a
necessidade de novas medidas de controle que visem o bem-estar humano e
animal. Entendendo isso, cada vez mais pesquisadores têm trabalhado em estudos
vacinais usando fração glicoproteica purificada o antígeno de FML (Fucose mannose
ligand) associada a saponinas, com bons resultados citados no estudo de Lima et al.
(2010a) e em seguida ressaltadas reações falso-positivas por Barichello (2010).
Diante dos resultados vacinais obtidos pela FML em cães, foram necessárias
novas pesquisas a fim de introduzir um novo antígeno vacinal com resultados
melhores. Assim deu-se início a novas pesquisas com o antígeno A2, uma proteína
específica presente no estágio de amastigota nas espécies L. donovani, L. infantum,
L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana capaz de estimular anti-corpos anti-A2 em
pacientes infectados com Leishmania spp., possibilitando a proteção cruzada entre
essas espécies (HERMONT, 2008).
Contudo, a natureza crônica lenta da doença exige que os estudos de eficácia
durem anos, além dos altos custos e o conflito com as regras de bem-estar animal
(GRADONI, 2015). Acredita-se desta forma que pode ocorrer reações falso-positivas
devido a produção dos anticorpos vacinais reagirem com os antígenos presentes
nos testes sorológicos preconizados pelo Ministério da Saúde.
As reações falso-positivas, em animais vacinados, deve ser algo remoto
quando o animal é submetido aos testes sorológicos de acordo com o manual da
vigilância epidemiológica (BARICHELLO, 2010). Desta forma, este estudo tem por
objetivo monitorar sorologicamente os animais vacinados com o antígeno vacinal
recombinante A2 disponível atualmente no mercado, a fim de evitar a eutanásia de
cães falso-positivos, por meio de fornecimento de dados que garantam e ratifiquem
a improvável reação dos testes sorológicos aos anticorpos vacinais.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Foi realizado um estudo analítico observacional transversal, a fim de analisar
a reação dos anticorpos vacinais de cães estimulados ao A2 e saponina com os
antígenos presentes nos testes sorológicos. A amostragem foi definida por
conveniência (REIS, 2003; COSTA NETO, 1977) de acordo com a rotina vacinal das
9
clínicas parceiras. Os tutores dos animais que decidiram participar do estudo
receberam as informações contida no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) em anexo 1 e uma cópia do mesmo e foi-lhes garantido que poderiam
desistir quando lhe aprouvesse.
O estudo foi desenvolvido, somente, após a obtenção da aprovação da CEUA
de número 18A/2017. Mediante a liberação foi dado início a pesquisa nas clínicas
parceiras localizadas na capital Maceió (Clínicas Sanchez e Ferri e Clínica Pedigree)
e em Marechal Deodoro (Clínica Escola do Centro Universitário Cesmac) no Estado
de Alagoas (Figura 1), onde foram atendidos cinco cães com idades que variaram
entre 9 meses e 10 anos, de ambos os sexos e de raças variadas. Contudo, o
protocolo vacinal só teve início após os testes negativos de ELISA e RIFI conforme
manual da Leish-tec.
Fig. 1: Clínicas parceiras localizadas em Maceió e Marechal Deodoro, AL. Fonte: Google maps
Exame clínico e Coleta de material
Os cinco animais foram submetidos ao exame clínico e logo após, feita
contenção para a coleta. O sangue foi obtido mediante prévia antissepsia com álcool
70% e em seguida feito venopunção da jugular, cefálica ou safena lateral, com
agulhas de vermelho) e com etilenodiaminotetracético (EDTA) - tampa roxa (Figura
2-B), acondicionados em caixas isotérmicas conforme figura 2-C. As amostras foram
encaminhadas ao Laboratório de Doenças Parasitárias da Clínica Escola do Centro
Universitário Cesmac para processamento.
10
Fig. 2: Venopunção da cefálica (A); Tubos estéreis (B) Caixa isotérmica (C) Fonte: Dados da pesquisa
Processamento das amostras sanguíneas
As amostras sanguíneas nos tubos sem anticoagulante foram centrifugadas
por 15 minutos na rotação de 3 400 rpm (Figura 3-A) e o soro obtido estocado em
eppendorf esterilizado (Figura 3-B), armazenado a temperatura de -20°C para
posterior encaminhamento ao Laboratório Centrovet – Maceió, que realizou o
encaminhamento das amostras ao Laboratório Tecsa – Belo Horizonte.
Fig. 3: Centrífugação (A); Coleta do soro (B) Freezer a -20°C (C) Fonte: Dados da pesquisa
Teste DPP (Dual Plath Platform)
As amostras de sangue total com EDTA foram submetidas ao teste rápido
imunocromatográfico com tecnologia dipstick desenvolvido por Bio-manguinhos, o
A B C
A B C
11
Dual plate platform (DPP) logo após a coleta sanguínea em qualquer uma das fases
de vacinação.
O Kit DPP é composto por: alças coletoras, pincetas, plataforma teste,
solução tampão e o manual de utilização (Figura 4-A). Para aplicação do teste foi
seguida à risca a recomendação do fabricante a qual consiste: Retirar do tubo com a
alça coletora cerca de 5 µL de sangue/soro ou plasma (Figura 4-B); colocar a
amostra na vertical sob a área de aplicação da amostra no poço 1, adiciona-se duas
gotas de tampão sob a mesma e aguarda 5 minutos (Figura 4-C); após os 5 minutos
adicionar 4 gotas de tampão no poço e aguardar 10 minutos para realização da
leitura (Figura 4-D).
Fig. 4: Kit DPP (A); uso da alça coletora (B); Tampão poço 1 (C); Tampão poço 2 (D) Fonte: Arquivo pessoal
A interpretação do resultado é realizada visualmente. É dito como resultado
não reagente quando há uma linha roxa/rosa na área de controle (C) e nenhuma
linha na área teste (T). Este resultado sugere ausência de anticorpos para
Leishmania na amostra, mas isso não exclui a possibilidade de infecção pelo
tripanosomatídeo (Figura 5-A).
É dito como resultado reagente quando há duas linhas roxa/rosa, uma na
área controle (C) e outra na área teste (T), podendo haver uma variação de claro
(Figura 5-B) a escuro (Figura 5-C) na área teste de acordo com a concentração de
anticorpos específicos, essa variação de cor não invalida o teste, ratifica que existe
anticorpos para Leishmania e estes foram detectados (Figura 5-B).
Poderão existir, ainda, resultados inválidos quando nenhuma linha é visível na
área controle e na área teste, sendo, portanto, recomendado repetir o teste (Figura
5-C).
A B C D
12
Fig. 5: Não reagente (A); reagente claro (B); reagente muito escuro (C); teste inválido (D) Fonte: Arquivo pessoal
RIFI (Reação de Imunofluorescência Indireta) e ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)
As amostras congeladas foram encaminhadas ao Laboratório Centrovet em
Maceió, o qual terceiriza os métodos de RIFI e ELISA para diagnóstico da
Leishmania infantum ao Laboratório Tecsa – Belo Horizonte. Foi solicitado a
titulação das amostras positivas ao ponto de corte do RIFI de 40.
O teste de ELISA é feito utilizando antígeno S7 e imunoglobulinas do tipo G e
a leitura feita no processador automatizado de ELISA – Evolis™, Bio Rad. Para
aplicação do RIFI é utilizado a extrato solúvel de promastigota de Leishmania
infantum para pesquisa de IgG para antígeno de membrana.
3 RESULTADOS
Das 11 amostras sanguíneas obtidas dos cinco animais em protocolo vacinal
usando rA2 mais saponina (Leishtec), 9,09% (1/11) foram positivas ao DPP, 18,1%
(2/11) indeterminada ao ELISA e 100% (11/11) negativas ao RIFI.
Os animais em primovacinação, na primeira dose vacinal houve 100% de
negatividade em todos os testes DPP, ELISA e RIFI. Dos três animais submetidos à
segunda dose da vacina, 33,3% (1/3) foram positivos ao DPP, 33,3% (1/3)
indeterminado ao ELISA e 100% negativos ao RIFI. Enquanto que na terceira dose
vacinal, todos os animais voltaram à 100% de negatividade nos testes acima
citados. Dos dois animais em reforço anual 50% (1/2) foi indeterminado ao ELISA e
todos negativos ao DPP e RIFI (Tabela 1).
Ao exame clínico realizado durante todo o processo de vacinação,
independente da fase vacinal, primovacinação ou reforço anual, não se verificou
nenhuma alteração físico-clínica nos animais relacionadas à temperatura, hipertrofia
A B C D
13
dos linfonodos palpáveis, onicogrifose, anorexia, ou outros sinais menos sugestivos.
Desta forma, todos os animais foram considerados clinicamente saudáveis e aptos à
vacinação.
Tabela 1 - Valores absolutos obtidos dos animais nas diferentes etapas de vacinação frente aos testes sorológicos.
Testes
Vacina
DPP ELISA RIFI
Posit. Neg. Posit. Neg. Posit. Neg.
1° dose 0 3 0 3 0 3
2° dose 1 2 1* 2 0 3
3° dose 0 3 0 3 0 3
Reforço anual 0 2 1* 1 0 2
*ELISA indeterminado
Os animais foram agrupados e as fases da vacinação comparadas com a
reposta humoral observada nos diferentes testes aplicados. Foi observado apenas 1
animal positivo na segunda vacinação. Em todas as amostras analisadas não foi
observado nenhum animal reagente na primeira ou terceira dose, conforme gráfico
1.
0
1
2
3
4
5
ANIMAL 1 ANIMAL 2 ANIMAL 3 ANIMAL 4 ANIMAL 5
DPP +
ELISA indeterminado
RIFI -
Gráfico 1: Resposta humoral através de testes sorológicos dos animais em diferentes fases de
vacinação
Fonte: Arquivo pessoal
4 DISCUSSÃO
14
Apesar de ocorrer reação entre os anticorpos vacinais e o teste DPP, tal
resultado não é considerado pelo fabricante da vacina usada neste estudo, visto que
não está incluído entre os testes vacinais feitos pela Leish-tec e disponíveis em seu
manual técnico (HERMONT, 2008). Contudo, deve ser levado em consideração que
se trata de um teste preconizado pelo Ministério da Saúde do Brasil, logo deve-se
reavaliar estes dados, visto que resultados positivos podem significar a eutanásia
desses animais que se limitam apenas aos testes de triagem gratuitos fornecidos
pelo governo (DPP).
Segundo Silva et. al (2013) os cães vacinados apresentam elevada produção
de IFN-γ e maior de IgG2 específico ao antígeno vacinal, o que permite a
diferenciação sorológica entre animais vacinados e animais infectados, mantendo
sorologia negativa frente aos testes de rotina pelo ELISA ou RIFI, o que não
corrobora o presente estudo, visto que houve sorologia indeterminada ao ELISA.
Segundo a Bula do ELISA/S7, o kit tem como base um peptídeo recombinante
fazendo com que o teste não reaja cruzadamente com os anticorpos vacinais
gerados pelas vacinas atualmente disponíveis no mercado nacional. Afirmando que
o soro de cães vacinados tem resultado negativo, sendo ele o Ag HSP70, que é uma
proteína recombinante (S7), mais especifico para L chagasi, negativo em cães
vacinados. Enquanto que o teste Bio-manguinhos utiliza o Ag para L. major e possui
94,5% de sensibilidade e 91,8% de especificidade (RISTOW; PEREZ JUNIOR,
2011).
Os resultados indeterminados ao ELISA, por sua vez, devem ser
considerados pelo fabricante, que inclui esse teste como forma de garantir a
qualidade da vacina e a não reação da produção dos anticorpos vacinais aos
antígenos do ELISA ou do RIFI. Visto que, os anticorpos vacinais são específicos ao
antígeno rA2 (HERMONT, 2008). Contudo, os resultados utilizando o ELISA/S7, são
desconsiderados pelo Ministério da Saúde, apesar de ser reconhecido e aprovado
pela Fundação Ezequiel Dias (FUNED) e o kit ser registrado pelo Ministério da
Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) (NÓBREGA, 2014).
Para o resultado em questão ter a aprovação do Ministério da Saúde a
amostra positiva ao DPP deveria ser submetida ao EIE-LVC (Bio-Manguinhos) como
teste confirmatório (LIMA; MELO, 2016) que é o que o MS preconiza para
diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina no Brasil.
15
Contudo, existem controvérsias quanto a sensibilidade e especificidade dos
testes de ELISA disponíveis no mercado e o disponibilizado pelo MS (QUEIROZ
JÚNIOR, 2011). Estudos demonstraram que o ELISA utilizando antígeno bruto de L.
infantum obteve sensibilidade de 95,65% em animais assintomáticos e 87,8% em
animais sintomáticos, 68% para os oligossintomáticos e especificidade de 100%
para todos os grupos de animais (MOREIRA et al., 2007).
Porém, o kit ELISA (EIE - Bio-Manguinhos) preconizado pelos órgãos da
Saúde Pública, que utiliza o antígeno solúvel e lisado de Leishmania major possui
sensibilidade de 72% e especificidade de 87,5% (LIRA et al., 2006), essa diminuição
pode ser devido ao uso de antígeno não específico para Leishmania viscerotropica,
parâmetros esses que dependem do tipo de antígeno empregado, tempo de
incubação ou tipo de microplacas utilizadas (REITHINGER et al., 2002).
Buscando testes de ELISA mais específicos, deu-se início ao uso de novos
antígenos como rK39, rK9 e rK26 ou purificados como as glicoproteínas de
membrana gp63, gp72 e gp70, específicas do gênero Leishmania e que conferem
grande sensibilidade ao teste sorológico (SCALONE et al., 2002; ROSATI et al.,
2003). O teste de ELISA utilizando a rK39 para diagnóstico da leishmaniose visceral
apresenta valores de sensibilidade maior que 93% e especificidade entre 84 a 100%
(PEDRAS et al., 2008).
Contudo, visando um diagnóstico sensível e rápido para triagem, nos últimos
anos foram desenvolvidos os testes rápidos imunocromatográficos (TRIs) que
utilizam anticorpos monoclonais de diferentes fontes adsorvidos em membranas de
nitrocelulose (GRANDONI, 2002) junto com antígenos rK26 ou rK39 que formam a
linha teste. A presença de anticorpos anti-rK39 ou rK26 é indicativo de infecção, e
ainda não foi relatada a reatividade com outros tripanosomatídeos (BISUGO et al.,
2007), fato não observado no presente estudo.
16
5 CONCLUSÃO
Os resultados apontam que a vacina disponível no mercado precisa ser mais
bem avaliada através do monitoramento dos cães em processo de vacinação, visto
que apesar da divergência entre autores com relação aos testes empregados é fato
que ocorreu reação entre a resposta humoral do animal produzido pelo protocolo
vacinal e os testes disponíveis no mercado e pelo Ministério da Saúde do Brasil.
Desta forma fica claro, também, a necessidade de se estabelecer uma consonância
entre os métodos aplicados ao diagnóstico da leishmaniose visceral canina.
17
REFERÊNCIAS
ALCOLEA, P. J. et al. Differential protein abundance in promastigotes of nitric oxide-sensitive and resistant Leishmaniachagasi strains. Proteomics ClinAppl, v. 10, n. 11, 2016, p. 1132–1146.
BARICHELLO, F. F. G. Avaliação da resposta imunológica de cães vacinados com a vacina FML (Leishmune®) e cães naturalmente infectados com leishmaniose visceral canina por meio de dois métodos sorológicos: ELISA e RIFI. 2010.
BISUGO, M. C et al. Assessment of canine visceral leishmaniasis diagnosis by means of a rapid test using recombinant antigen K39 in endemic regions of São Paulo state, Brazil. Revista do Instituto Adolfo Lutz. 2007; 66, 185-193.
BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Nota técnica nº 038/2014/DFIP/SDA.2014a. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/assuntos/politica-agricola/arquivos/nota-tecnica-dfip-38-14-leishmune.pdf/view>. Acesso em: 5 jun. 2017.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde, 2014b.
COSTA NETO, P. L. O. Estatística. São Paulo: Edgard Blucher, 1977, p. 264.
GRADONI, L. Evaluation of the Leishmania recombinant K39 antigen as a diagnostic marker for canine leishmaniasis and validation of a standardized enzymelinked immunosorbent assay. Veterinary Parasitology. 2002; v. 104, n. 4, p. 275–285, GRADONI, L. Canine leishmania vaccines: still a long way to go. VetParasitol, v. 208, n. 1–2, 2015, p. 94–100.
HERMONT, V. J. Manual Técnico Leishtec: Vacina recombinante contra leishmaniose canina. 1° ed. Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, 2008.
JULIAO, F. S. et al .Investigação de áreas de risco como metodologia complementar ao controle da leishmaniose visceral canina. Pesq. Vet. Bras., Rio de Janeiro , v. 27, n. 8, p. 319-324, Aug. 2007.
LIMA V. M. F. et al. Diminished CD4+/CD25+ T cell and increased IFN-γ levels occur in dogs vaccinated with Leishmune® in an endemic area for visceral leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. 2010a; v.135: p.296-302.
18
LIMA, D; A. MELO, M. A. Levantamento epidemiológico da leishmaniose visceral canina no município de Santa Luzia/PB. XIII Congresso de iniciação científica da Universidade Federal de Campina Grande. 2016.
LIRA, R. A et al. Canine visceral leishmaniosis: A comparative analysis of the EIE-leishmaniose-visceral-canina-Bio-Manguinhos and the IFI-leishmaniose-visceral-canina-Bio-Manguinhos kits. Vet. Parasitol. 2006; 137, 11–16.
MOREIRA, M. et al. Comparison of parasitological, immunological and molecular methods for the diagnosis of leishmaniasis in dogs with different clinical signs. Veterinary Parasitology, v. 145, n. 3-4, p. 245–252, 2007.
NÓBREGA, G. D. Comparação entre métodos recombinantes e PCR em tempo real no diagnóstico da Leishmaniose visceral canina. 2014.
PALTRINIERI, S. et al. Guidelines for diagnosis and clinical classification of leishmaniasis in dogs. JAmVetMed Assoc.; v. 236, 2010. p.1184–1191.
PEDRAS, M. J et al. Comparative evaluation of direct agglutination test, rk39 and soluble antigen-ELISA and RIFI for the diagnosis of visceral leishmaniasis in Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 102, n. 2, p. 172-178, 2008.
QUEIROZ JÚNIOR, E. M. Validação do teste imunocromatográfico rápido Dual Path Platform para o diagnóstico da leishmaníase visceral canina. 2011.
REITHINGER, R. et al. Leishmania (Viannia) spp. Dissemination and tissue tropism in naturally infected dogs (Canis familiaris). Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 96, n. 1, p.76–78, 2002.
REIS, J.C. Estatística aplicada à pesquisa em ciência veterinária. 1ª Ed. Olinda: J. C. R., 2003, p. 651.
RISTOW,L. E; PEREZ JÚNIOR, A. A. Desvendando o diagnóstico da LVC. Tecsa: Teconologia em sanidade animal. 2011. Disponível em <http://www.tecsa.com.br/assets/pdfs/desvendando-o-diag-da-lvc%202011-goiania.pdf>.
ROSATI, S. et al. Prokaryotic expression and antigenic characterization of three recombinant Leishmania antigens for serological diagnosis of canine leishmaniasis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 10, n. 6, p. 1153– 1156, 2003.
SCALONE, A. et al. Evaluation of the Leishmania recombinant K39 antigen as a diagnostic marker for canine leishmaniasis and validation of a standardized enzyme-linked immunosorbent assay. Vet Parasitol., v.104, n.4, 2002, p. 275-85.
19
SCHAUT, R. G et al. Recovery of antigen-specific T cell responses from dogs infected with Leishmania (L.) infantum by use of vaccine associated TLR-agonist adjuvant. Vaccine. v. 34, n. 44, 2016, p.5225–5234.
SILVA, K. L. O et al. Vacinas Contra Leishmaniose: Uma Revisão. Arch Health Invest, 2013.
20
ANEXO 1– TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
21
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Projeto: MONITORAMENTO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CLÍNICA DE
CÃES ESTIMULADOS POR ANTÍGENO VACINAL RECOMBINANTE A2 E
SAPONINA
Eu,_______________________________________,RG ______________________,
proprietário do animal ______________________, espécie ______________ aceito
participar desse estudo, cujo objetivo é Monitorar a resposta imune humoral e clínica
de cães estimulados por antígeno vacinal recombinante A2 e saponina. Fui
informado que meu animal será examinado e submetido aos exames sorológicos
para diagnóstico da leishmaniose visceral canina a cada dose da vacina. Para isso
será coletado amostras sanguíneas. Durante a assinatura deste termo fui
esclarecido acerca dos benefícios desse estudo, que contribuirá para desenvolver
uma nova medida de controle da doença e que os materiais coletados serão
incorporados ao Laboratório de Doenças Parasitárias do Centro Universitário
Cesmac, podendo ser utilizados em pesquisas posteriores; e que tenho plena
liberdade de recusar ou retirar o consentimento sem sofrer nenhum tipo de
penalização ou pressão por tal. Estou ciente que não haverá nenhum incentivo
financeiro para participação nesta pesquisa. Contatos: Profa. Gilsan Aparecida de
Oliveira– Tel. (82) 99113-0551
_______________________________________
Assinatura Participante
_______________________________________
Assinatura Coordenadora
Maceió, ____/____/____
22
ANEXO 2 – PROTOCOLO DO COMITÊ DE ÉTICA
23
