Monografia - Extracção de DNA em Genética Forense

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UTAD Licenciatura em Gentica e Biotecnologia 1 ano - 2 Semestre Unidade Curricular: Gentica Molecular

Extraco de DNA em Gentica Forense

Elaborado por: Ana Rita Costa N 30926 Joana Filipa Silva N 30940

Extraco de DNA em Gentica Forense

A Gentica Forense a rea do conhecimento que trata da utilizao dos conhecimentos e das tcnicas de gentica e de biologia molecular no auxlio justia. O Teste de ADN para a justia como telescpio para as estrelas. No uma lio de bioqumica, no uma exibio das maravilhas reveladas por uma lente, mas um modo de ver as coisas como elas realmente so. (Barry Scheck e Peter Neufeld, Actual Innocence)

Palavras-chave: Gentica Forense, DNA, material biolgico, extraco de DNA, anlise de DNA.

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ndice

Introduo___________________________________________ Pg. 4

Desenvolvimento_______________________________________ Pg. 5

o o o o o o o

Primeiro caso de aplicao da gentica forense___________ Pg. 6 Material biolgico de interesse biolgico________________ Pg. 7 Tcnicas de extraco de DNA_______________________ Pg. 9 Tcnicas de anlise da amostra de DNA________________ Pg. 10 Dificuldades encontradas e sua resoluo_______________ Pg. 12 Obteno do perfil de DNA_________________________ Pg. 12 Banco de dados criminais___________________________ Pg. 12

Concluso___________________________________________ Pg. 13

Bibliografia__________________________________________ Pg.14

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Anexos_____________________________________________ Pg. 16

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IntroduoAs cincias forenses e criminais desempenham uma funo essencial no sistema de justia, ao fornecer informao cientfica fundamental para a investigao criminal e para os tribunais. O trabalho laboratorial em cincias forenses e criminais direcciona-se para o reconhecimento, identificao, individualizao e avaliao de vestgios fsicos em procedimentos legais, aplicando as cincias naturais. Na gentica forense os marcadores moleculares mais utilizados so os microssatlites autossmicos (tambm conhecidos pela sua sigla em ingls STRs - Short Tandem Repeats). Trata-se de uma rea de investigao cientfica que se dedica a trs tipos de exames criminalstica biolgica (anlise de manchas de sangue encontradas nos locais dos crimes, de smen deixado nas vtimas de crimes de natureza sexual, de plos ou cabelos suspeitos de pertencerem a criminosos); identificao biolgica de parentesco (identificaes de paternidade ou maternidade, entre outros); identificao gentica individual (identificao de um corpo ou de fragmentos de um corpo). A principal e nica responsabilidade dos tcnicos da gentica forense "limita-se a analisar factos, com base nos conhecimentos e rigor cientfico, e a elaborar relatrios para apreciao dos tribunais, que decidiro depois de confrontados outros meios de prova" (Francisco Moita Flores, vice-presidente do IMNL, in Jornal Pblico). Quanto s amostras biolgicas, nas cenas de crimes, as fontes escassas mais encontradas so fios de cabelo, amostras de saliva - no corpo da vtima ou em objectos e smen, restos de clulas de pele sob unhas, gotas de sangue e, em alguns casos, fragmentos de dentes. Dependendo do tipo de catstrofe ocorrida e dos danos causados ao material biolgico a ser colhido para a identificao, as fontes de DNA podem variar, desde sangue, ossos, dentes e tecidos moles, a fios de cabelo. Alm disso, os substratos para anlise podem ser materiais biolgicos decompostos, ou que exijam cuidados especiais nos mtodos de colecta e extraco (Hoff PO, 1999). Visto isto, a Gentica Forense uma rea do conhecimento das cincias forenses que utiliza o DNA para apoiar e auxiliar a Justia a deslindar casos sob investigao policial e/ou do Ministrio Pblico, utilizando conhecimentos e tcnicas de gentica e de biologia molecular, sendo essencial a extraco correcta e adequada de DNA para que a investigao criminal ocorra da melhor forma; estes mtodos sero posteriormente analisados neste trabalho de forma detalhada e individualizada.

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Aspectos histricos da gentica forenseH bem pouco tempo a investigao em cincias forenses limitava-se a anlises de soros dos polimorfismos de protenas e grupos sanguneos e em alguns marcadores genticos. O exame forense de amostras biolgicas teve o seu incio por volta do princpio do sculo XX com a aplicao dos grupos sanguneos ABO em evidncias relacionadas com crimes ou identificao de pessoas, sendo actualmente pouco utilizado. Marcando uma segunda fase na evoluo desta cincia, em 1954, foi demonstrada a ocorrncia de um sistema de histocompatibilidade mediado por antignios na superfcie dos leuccitos, conhecido por complexo HLA (CALABREZ, 1999). A terceira fase do desenvolvimento das cincias forenses voltadas identificao humana veio com a publicao de um artigo na Revista Nature, por Alec Jeffrey, sobre certas regies do genoma humano que produziam uma espcie de impresses digitais de DNA. O primeiro caso de identificao criminal atravs de exames de DNA foi em 1985, na Inglaterra. Ocorreu um caso de uma mulher violada e assassinada, sendo que o geneticista Alec Jeffreys colheu o esperma encontrado na vtima e fez o exame de DNA. Mais tarde ocorreu outro caso idntico e novamente Jeffreys analisou o smen encontrado na vtima, concluindo que se tratava do homem que cometera o primeiro crime. As autoridades locais forjaram uma campanha de doao de sangue cuja finalidade era identificar o agressor. Como todos os habitantes doaram sangue mas nenhuma possua DNA idntico ao do agressor, a polcia prossegui com as investigaes e descobriu que havia um viajante na cidade. Quando o sujeito voltou, doou sangue e feito o teste de DNA no sangue colhido, Jeffreys concluiu que o cdigo gentico do viajante era o mesmo do que o do violador (AMABIS & MARTHO, 1995).

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Material biolgico de interesse forenseQualquer tipo de tecido ou fluido biolgico pode ser utilizado como fonte de DNA, uma vez que so formados por clulas. Nas clulas, o DNA de interesse forense encontra-se tanto no ncleo como nas mitocndrias (BEZERRA, 2004). Os tipos de amostras mais comuns so: sangue, smen, cabelo, saliva, urina, pele, unhas, ossos, lquidos amniticos, vilosidades corinicas, fgado, msculo, suor e fezes. Nos casos em que no possvel a anlise utilizando-se DNA nuclear, pode ser usado DNA mitocondrial. Por exemplo, fios de cabelo que no possuam mais bulbos e ossos antigos podem ser utilizados para extraco de DNA mitocondrial. Qualquer tecido ou fluido biolgico pode ser utilizado como fonte de DNA, desde que possua clulas prprias ou clulas de outros tecidos. Por exemplo, na urina podemos encontrar clulas oriundas da bexiga e mucosa do pnis que podem ser utilizadas em estudos de identificao. Da mesma forma podem ser encontradas clulas na saliva, lgrimas, suor e em outras substncias orgnicas (SILVA & PASSOS, 2006). Nos seres humanos, o DNA que carrega o cdigo gentico ocorre em todas as clulas que possuem ncleo, inclusive os glbulos brancos, os espermatozides, as clulas que envolvem as razes capilares e as clulas encontradas na saliva. Estas so as clulas que oferecem maior interesse para os estudos forenses (DUARTE, 2001). O DNA mitocondrial um marcador gentico de grande interesse na rea forense, pois uma nica clula possui mais de 5000 cpias de mtDNA, associados sua resistncia com estruturas circular, digesto enzimtica. Assim, em grandes desastres (incndios, exploses, queda de avies, etc.), quando mais difcil identificar os corpos, analisa-se o mtDNA e compara-se com sequncias obtidas de possveis irmos ou ascendentes maternos (LIMA, 2006). Este tambm pode ser utilizado quando se quer fazer um exame de maternidade e no se tem o pai. O mtDNA de herana materna, sendo que recebemos esse marcador das nossas mes e temos identidade com os nossos irmos e parentes prximos pela linhagem materna (JOBIM, et.al., 2006). O cromossoma Y transmitido pelo pai somente para os filhos homens, e a anlise destas regies pode fornecer importante informao quanto origem parental dos indivduos, embora no fornea informao indivduo-especfico. As amostras biolgicas merecem especial ateno devido sua susceptibilidade, degradao e contaminao.

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Tcnicas de extraco de DNAOs mtodos de extraco variam de acordo com o tipo de evidncia recolhida. Relembrando que, em princpio, qualquer tipo de tecido ou fluido biolgico pode ser utilizado como fonte de ADN, uma vez que so formados ou possuem clulas. Na tabela 1 temos a relao da quantidade de DNA que pode ser extrado em funo do tipo de amostra.Amostra (tecidos e fluidos corporais) 1 mL de sangue Manchas de sangue seco em 1 cm2 1mL de smen 1 fio de cabelo com bulbo capilar 1 mL de saliva Quantidade Recuperada 10- 40 g 200 ng 150-300 g 1-750 ng 1-10 g

Tabela 1 Quantidade aproximada de ADN recolhido de amostras. [adaptado de RUMJANEK e RINZLER,2001].

De maneira geral, as tcnicas de extraco consistem em desnaturar as protenas que envolvem o ADN. Para isto, utiliza-se uma gama de espcies qumicas. Por exemplo, a mistura de clorofrmio, lcool isoamlico e fenol. Outra forma utilizando uma soluo de cloreto de sdio, que separa os sistemas em uma fase slida e uma fase lquida, onde nesta ltima se encontra o ADN. Existem diferentes mtodos de extraco de DNA, entre os quais: 1. Extraco com Chelex 100 Chelex-100 uma resina que utilizada nas cincias forenses para extrair, de um modo eficaz, DNA de amostras difceis, como por exemplo: de sangue, manchas, ossos, esfregao bucal, plos e cabelos com bulbos, entre outras. O protocolo para extraco de DNA com Chelex 100 foi baseado no mtodo descrito por Coombs: - Em cada tubo adicionado 1 l de proteinase K (20 mg/ml), sendo as amostras incubadas em banho-maria a 55C, durante trs horas, e agitadas gentilmente a cada hora. - Aps esse perodo, a cada tubo adiciona-se 100 l de Chelex 100 a 5% (diludo em soluo de Tris 10 mM e EDTA 1 mM), sendo os mesmos aquecidos a 99C durante 10 minutos sendo, posteriormente, suavemente agitados. - De seguida procede-se centrifugao a 10.600 rpm durante 15 minutos. - Os tubos so novamente aquecidos a 45C por cinco minutos e, posteriormente, foram adicionados 100 l de clorofrmio. - Para finalizar, coloca-se a centrifugar a 10.600 rpm durante 15 minutos.Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 8

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- Aps a centrifugao, retiramos o DNA e colocamo-lo em tubos limpos, que iro ser armazenados a 20C negativos.2. Extrao com QIAamp DNA minikit

Este mtodo essencialmente utilizado na extraco de DNA a partir de tecidos biolgicos envoltos em parafina. O protocolo para extraco de DNA a partir de material parafinado com o sistema comercial QIAamp DNA minikit o seguinte: - Em cada tubo so adicionados 180 l de Buffer ATL (Tissue Lysis Buffer), juntamente com 20 l de proteinase K. - Aps homogeneizao, as amostras so incubadas em banho-maria a 55C, durante trs horas, e agitadas suavemente a cada hora. - Aps esse perodo, adiciona-se a cada tubo 200 l de Buffer AL, sendo posteriormente aquecidos a 70C durante 10 minutos para a inactivao da proteinase residual. - Em seguida, so adicionados 200 l de etanol, agitando durante 15 segundos e centrifugando durante um perodo reduzido de tempo. - A soluo resultante transferida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. - O dispositivo com a coluna removido do tubo e recolocado em um tubo limpo. - Posteriormente adiciona-se 500 l de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao novo tubo (com a coluna). - O procedimento de lavagem repetido com 500 l de Buffer AW2 (Wash Buffer 2), seguido de uma centrifugao a 14.000 rpm durante trs minutos. - O DNA extrado da coluna adiciona-se 100 l de Buffer AE: numa primeira fase so adicionados 50 l, aguardando-se um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto; em seguida, adiciona-se os restantes 50 l de Buffer AE, aguarda-se cinco minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por um minuto, aps as amostras terem sido transferidas do dispositivo para tubo de recuperao, sendo posteriormente armazenadas a uma temperatura de -20C.

3. Chelex-100, Chelex-100 combinado organicamente (do ingls: Chelex100 Organic Combined) e Chelex-100 combinado com pequenos fragmentos magnticos (do ingls: Chelex-100 magnetism pearl combined) So mtodos utilizados para a extraco de epitlio humano de acordo com cada caso.

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Tcnicas de anlise da amostra de DNAAps a extraco do DNA presente no material em questo, segue-se a anlise dos polimorfismos genticos. Nos ltimos anos foram desenvolvidas diversas tcnicas para o estudo de diferentes tipos de polimorfismo de DNA, no qual os cientistas e laboratrios podem escolher o mtodo mais adequado para solucionar o problema (LIMA, 2006). As principais tcnicas posteriores para a anlise de DNA, so: O RFLPs (do ingls, Restriction Fragment Length Polymorfism), que uma tcnica em que os organismos podem ser diferenciados pela analise de padres derivados da clivagem do seu DNA (CARRAPA e tal.,2005); Metodologia de Southern Blothing, que permite a identificao de fragmentos com sequncias idnticas ou similares sonda utilizada, e pode tambm auxiliar no posicionamento relativo de diferentes fragmentos (ZAHA, 2003); Electroforese em gel uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho. A electroforese normalmente utilizada para separar protenas e molculas de DNA e RNA. Fingerprinting, padro fragmentos de DNA. altamente individual de

Fig. 1 Resultado da Electroforese, apresentado em gel de agarose.

PCR, reaco em cadeia polimerase (do ingls, Polymerase Chain Reaction) um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias) de DNA (cido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactria) ou leveduras. Existem sondas unilocais (SLP), que estudam cada locus individualmente, e sondas multilocais, que avaliam muitos loci ao mesmo tempo, conhecidos como impresso digital do DNA (JOBIM et al., 2006 a pud BALAZS, 1993).

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Dificuldades encontradas e sua resoluoToda a actividade humana est associada a algum tipo de erro. Existem fontes potenciais de erro desde a recolha em campo, passando pela anlise no laboratrio, at a interpretao dos resultados dessa anlise. Nem todos os erros tm consequncias prejudiciais; muitos nem tem consequncias sendo prontamente identificados e podem ser corrigidos. Para conseguir resultados precisos devem ser utilizados em todos os passos do processo de identificao pelo DNA cuidados especficos e ter uma redobrada ateno aos detalhes (DUARTE et al., 2001). Uma das principais dificuldades encontradas a degradao/contaminao do material biolgico, que pode ser provocada pela aco da luz, elevadas temperaturas, compostos qumicos, substncias corrosivas, actividade enzimtica, contaminao/degradao por microrganismos, com consequentes quebras e outras alteraes da cadeia de polinucleotdeos; que modificam a composio e a estrutura normal de seu DNA. Para diminuir a aco destes factores na degradao do DNA, devem ser adoptadas uma serie de normas preventivas como um cuidado especifico na recolha do material biolgico/elas devem ser imediatamente entregues ao laboratrio forense e, para minimizar a deteriorao da amostra e os itens, devem ser guardados em ambiente frio e seco at que sejam submetidos testagem (BENECKE, 2005). O mtodo de recolha especfico depender do estado e das condies da prova biolgica. Em geral, uma quantidade significativa de material deve ser recolhida para garantir a extraco de DNA suficiente para os testes. No entanto, importante preservar a recolha de material adicional (gorduras, fluidos e outros materiais) que podem afectar o processo de anlise de DNA (LEE e LAAD, 2001). Quando a amostra biolgica est muito degradada ou em pequenas quantidades, uma soluo possvel a PCR, que pode permitir a amplificao de sequncias especficas a partir de material no qual o DNA est gravemente degradado ou embebido num meio onde difcil o isolamento de DNA. Assim, atravs da PCR, possvel a anlise do DNA em amostras que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio, por exemplo (DUARTE et al., 2001). No entanto, esta tcnica de ampliao possui limitaes como a questo da contaminao. Se o DNA contaminante estiver presente em nveis comparveis aos do DNA alvo, a sua amplificao pode confundir a interpretao dos resultados da anlise, possivelmente levando a uma concluso errada (DUARTE et cols, 2002). Com o objectivo de minimizar esta possibilidade, algumas providncias devem ser tomadas, como utilizao de um controlo negativo, no qual feita a mesma reaco de PCR, mas nenhuma amostra colocada, e a separao fsica das reas do laboratrio destinadas para o trabalho com PCR e com produto j amplificado (BOROVIK et al., 2006).Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 11

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Outro ponto importante a ser abordado sobre as limitaes do DNA, principalmente na rea criminal, diz respeito a peculiaridades da anlise. Muitas vezes, qualquer vestgio de roupas coloridas, que possa ser encontrado nas evidncias biolgicas, acaba por inibir a reaco de PCR (BONACCORSO, 2004). Quando a amostra levada a tribunal como prova jurdica, se a evidncia no for documentada, recolhida, embalada e preservada com muito cuidado, ela pode no preencher os requisitos legais e cientficos para ser admitida num tribunal, pois, se ela no for correctamente documentada antes da recolha, a sua origem pode ser questionada e se tiver sido mal recolhida ou embalada, a possibilidade de contaminao aumentar, levando a uma maior possibilidade de discordncia nos resultados da anlise do DNA (LEE e LAAD, 2001). Apesar de certas limitaes da anlise de DNA, deve-se acima de tudo enfatizar a sua importncia como prova extremamente poderosa, se esta for realizada segundo as recomendaes tcnicas exigidas (BONACCORSO, 2004).

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Obteno do perfil de DNAO perfil do DNA uma maneira simples de se comparar sequncias de DNA de dois ou mais indivduos. O exame do perfil de DNA tambm pode ser usado para casos de paternidade e identificao de cadveres, entre outros (BORM et al., 2001). O padro de fragmentos do DNA ou perfil de DNA de uma pessoa pode ser obtido pela analise do seu material gentico. O procedimento inclui sete etapas: recolha da amostra, isolamento do DNA, corte do DNA, separao dos fragmentos, transferncia do DNA, hibridao de sondas e perfil do DNA. O perfil final do DNA constitudo, aps hibridao de diferentes sondas membrana. O resultado um padro de bandeamento de diferentes tamanhos (BORM et al., 2001).

Banco de dados criminaisA anlise de DNA tem como objectivo diferenciar um individuo de outro, atravs de um grande nmero de caracterstica, dando-lhe uma identidade absoluta como pessoa, podendo assim ser diferenciado entre bilhes de outras pessoas (BONACCORSO, 2004). Assim existe o banco de dados criminal, com a funo de diferenciar e identificar indivduos atravs da comparao dos perfis genticos obtidos de suspeitos com os cadastros no banco e identificao de criminosos a partir de outros crimes. A tecnologia em questo pode ser usada para provar a inocncia ou culpa de suspeitos, identificar restos mortais e amostras biolgicas, atravs de relatrios cientficos.

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ConclusoOs avanos nas tecnologias de DNA surtiram um enorme impacto no campo da cincia forense. Com uma incrvel sensibilidade e um alto poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido uma poderosa ferramenta para a identificao humana e investigaes criminais sendo um dos maiores progressos tcnicos da investigao criminal desde a descoberta das impresses digitais. Existem diferentes tipos de amostras biolgicas para extraco e posterior anlise de DNA sendo as mais utilizadas o sangue (liquido ou sob a forma de mancha seca), smen (colhido na vagina, peas ntimas ou manchas), plos (no qual o DNA est contido na raiz) e os objectos com saliva (a saliva no contm clulas mas nelas podem ser encontradas clulas epiteliais da cavidade bucal, as quais possuem DNA); restos de cadveres, amostras de msculos, ossos e polpa dentria. Devido a esta grande diversidade de amostras forenses existem tcnicas especficas de extraco de DNA dependendo da sua natureza. Assim, a tcnica Chelex-100 utilizada para amostras difceis, como o sangue, manchas, ossos, esfregao bucal, plos e cabelos com bulbos. A extrao com QIAamp DNA minikit essencialmente utilizada a partir de tecidos biolgicos envoltos em parafina; o mtodo Chelex-100 quando combinado com diferentes substncias serve para extrair DNA de outro tipo de amostras biolgicas. As amostras biolgicas merecem especial ateno devido sua susceptibilidade, degradao e contaminao merecendo cuidados especficos e tcnicas adequadas, como exemplo a PCR, sendo mtodos imediatos que requerem apenas uma pequena quantidade de material e podem fornecer identificao no-ambgua de alelos individuais. (DUARTE et al., 2001; GOES et al., 2002). A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise de DNA progrediram a ponto de no colocar em dvida a admissibilidade dos dados sobre o DNA quando adequadamente recolhidos e analisados (DUARTE et al., 2001). No futuro, espera-se que as tcnicas de biologia molecular existentes sejam aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam desenvolvidos, a fim de que a grande maioria dos casos de investigaes forenses cveis e criminais tenham um desfecho que no possa ser questionado nos tribunais.

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AnexosProcedimento de uma investigao forense

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Fig. 2 Esquema geral para o teste de ADN para fins forenses. [adaptado de ENGER et al, 2005].

Na fig. 2 est representada os procedimentos adoptados para um caso de violao: Em (a) temos a recolha de smen na vtima e posterior exame. Tambm feita a anlise do ADN a partir de uma amostra de sangue do suspeito. Em (b) so representadas as enzimas de restrio que tm a capacidade de cortar o ADN em lugares especficos onde uma determinada sequncia de nucleotdeos ocorre (nota: tesoura simboliza as enzimas necessrias para a seleco de sequncias especficas). Em (c) esto ilustrados os pedaos de ADN separados pela electroforese. Em (d) mostra-se um padro conhecido como DNA fingerprint.Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 18

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Observao: os padres oriundos do smen recolhido e do sangue do suspeito coincidem, indicando que o smen do suspeito e que este est ligado ao crime.

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