Métodos de Referencia y Técnicas de Laboratorio en uso para … · 2014-07-28 · Métodos de Referencia y Técnicas de Laboratorio en uso para Diagnóstico en Parasitología María

MMéétodos de Referencia todos de Referencia y Ty Téécnicas de Laboratorio encnicas de Laboratorio en

uso para Diagnuso para Diagnóóstico en stico en ParasitologParasitologííaa

MarMaríía Isabel Jercic L. a Isabel Jercic L. MsMs. EPT. [email protected]@ispch.cl

20072007

Red de LaboratoriosRed de Laboratorios

Red de Coproparasitología

350 Laboratorios Clínicos Red de Infección por T. cruzi

36 Laboratorios Clínicos

56 Bancos de Sangre

Red de Hidatidosis


Red de Toxoplasmosis


Red de Pneumocystis jiroveci


Laboratorio Nacional y de Referencia de Parasitología

LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR

VIGILANCIA REFERENCIA

PEEC SUPERVISIONES

CONTROL DE CALIDAD INVESTIGACIÓN

CURSOS ADIESTRAMIENTOS

CAPACITACIÓN

LAB. REF. PARASITOLOGÍA LABORATORIO ENTOMOLOGIA

FUNCIONESFUNCIONESSECCISECCIÓÓN PARASITOLOGN PARASITOLOGÍÍA A

DIAGNDIAGNÓÓSTICO EN STICO EN PARASITOLOGPARASITOLOGÍÍA A

DiagnDiagnóóstico Directostico Directo–– VisualizaciVisualizacióón del parn del paráásito en muestras de:sito en muestras de:

SangreSangreFluidosFluidos Deposiciones, orina, secreciones, etc.Deposiciones, orina, secreciones, etc.BiopsiasBiopsias

DiagnDiagnóóstico Indirectostico Indirecto–– BBúúsqueda de anticuerpos especsqueda de anticuerpos especííficos por ficos por

diferentes mdiferentes méétodos. todos.

DetecciDeteccióón del material genn del material genéético o tico o proteproteíínas constitucionales especnas constitucionales especííficasficas

PCRPCRCromatografCromatografííaa

VIGILANCIAVIGILANCIA

Reglamento sobre NotificaciReglamento sobre Notificacióón de Enfermedades n de Enfermedades Transmisibles de DeclaraciTransmisibles de Declaracióón Obligatoria N n Obligatoria N °°158158

–– NotificaciNotificacióón inmediatan inmediataMalariaMalariaTriquinosisTriquinosis

–– De NotificaciDe Notificacióón Diarian DiariaEnfermedad de ChagasEnfermedad de ChagasHidatidosisHidatidosis

–– Vigilancia de LaboratorioVigilancia de LaboratorioTrypanosoma cruziTrypanosoma cruzi Laboratorios ClLaboratorios Clíínicos y Bancos de nicos y Bancos de Sangre pSangre púúblicos y privados deben notificar semanalmente blicos y privados deben notificar semanalmente al ISP la identificacial ISP la identificacióón de n de T. cruzi, enviando muestras para T. cruzi, enviando muestras para su confirmacisu confirmacióón.n.

Se deben enviar a confirmar todas las Se deben enviar a confirmar todas las

muestras que resulten positivas en los muestras que resulten positivas en los

establecimiento pestablecimiento púúblicos o privadosblicos o privados

–– Existe un formulario especial para el envExiste un formulario especial para el envíío de o de

las muestras. las muestras. www.ispch.clwww.ispch.cl

–– No tiene costo la realizaciNo tiene costo la realizacióón de estos n de estos

exexáámenesmenes

–– Existe un algoritmo diagnExiste un algoritmo diagnóóstico que se aplica stico que se aplica

para cada parasitosis.para cada parasitosis.

REFERENCIAREFERENCIA

ExExáámenes dmenes disponibles para los isponibles para los laboratorios y pacientes plaboratorios y pacientes púúblicos blicos

de acuerdo a la previside acuerdo a la previsióón de n de paciente y privados con arancel.paciente y privados con arancel.

Listado en pagina Listado en pagina webwebwww.ispch.clwww.ispch.cl

Enfermedad de Enfermedad de ChagasChagas

Red de DiagnRed de Diagnóósticostico

Grupo Tamizaje 92Grupo Tamizaje 92–– ELISA y AglutinaciELISA y Aglutinacióón de Partn de Partíículasculas–– Deben enviar a confirmar las muestras POSITIVAS Deben enviar a confirmar las muestras POSITIVAS

e INDETERMINADASe INDETERMINADASGrupo ConfirmaciGrupo Confirmacióón 14n 14–– IFI Ig GIFI Ig G–– MicroscopMicroscopíía Directa a Directa

ISPISP–– ExExáámenes Directos menes Directos –– ExExáámenes Indirectosmenes Indirectos–– ExExáámenes Molecularesmenes Moleculares

Laboratorio Nacional y Laboratorio Nacional y de Referenciade Referenciade Parasitologde ParasitologííaaISPISP

Programa de Control VectorialPrograma de Control VectorialConfirmaciConfirmacióón de Muestrasn de MuestrasPrograma de control de la TransmisiPrograma de control de la Transmisióón n transplacentariatransplacentariaExExáámenes pacientesmenes pacientesNorma de AtenciNorma de Atencióón al paciente n al paciente chagchagáásicosico

ÚÚtil en la etapa agua de la enfermedad.til en la etapa agua de la enfermedad.En la etapa indeterminada o crEn la etapa indeterminada o cróónica snica sóólo el lo el 50 % de los pacientes es positivo.50 % de los pacientes es positivo.–– MicroscMicroscóópicos picos

FrotisFrotisExamen al frescoExamen al frescoGota gruesaGota gruesaMicroStroutMicroStrout

Concentración

ExExáámenes Directos menes Directos

DiagnDiagnóóstico Indirectostico Indirecto

Serología

Se han empleado:Se han empleado:

–– HemaglutinaciHemaglutinacióónn IndirectaIndirecta

–– EnzimoinmunoEnzimoinmuno ensayo Ig Gensayo Ig G

Inmunofluorescencia Indirecta Ig GInmunofluorescencia Indirecta Ig G

>o igual a 1: 20>o igual a 1: 20

–– Western Blot polivalente Western Blot polivalente IgGIgG Ig A e Ig MIg A e Ig M

Reacciones cruzadas con Reacciones cruzadas con LeishmaniaLeishmania, ,

mononucleosismononucleosis infecciosa, lepra.infecciosa, lepra.

Ig M para infecciones agudas y congIg M para infecciones agudas y congéénitasnitas

Enzimoinmuno ensayo ELISA Ig GEnzimoinmuno ensayo ELISA Ig G

Western blotWestern blotELECTROTRANSFERENCIA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

CORRIENTE ELECTRICA

GEL SDS NITROCELULOSA INCUBACIÓN CON CONJUGADO

DESARROLLO

Western blot Infección por Trypanosoma cruzisueros positivos

Western blot Infección por Trypanosoma cruzisueros con otras parasitosis

Leishmaniosis Criptosporidiosis

BiologBiologíía Moleculara Molecular

Se puede emplear tSe puede emplear téécnicas para buscar cnicas para buscar DNA del parDNA del paráásito en pacientes sito en pacientes –– Agudos Agudos –– CrCróónicosnicos–– VectoresVectoresPuede ser cualitativo o CuantitativoPuede ser cualitativo o Cuantitativo–– PCR convencional PCR convencional ISPISP–– PCR tiempo real PCR tiempo real en proyectoen proyecto

Algoritmo de trabajoAlgoritmo de trabajo

Programa VectorialPrograma VectorialConfirmaciConfirmacióón de laboratorion de laboratorioTransmisiTransmisióón n TransfusionalTransfusionalTransmisiTransmisióón n TransplacentariaTransplacentaria

Hidatidosis HumanaHidatidosis Humana


20 instituciones20 instituciones–– Hospitales pHospitales púúblicos y privados. Clblicos y privados. Clíínicas y nicas y

Laboratorios privadosLaboratorios privadosExExáámenes Directosmenes Directos100 % ELISA Ig G 10% adem100 % ELISA Ig G 10% ademáás DD5s DD5Deben enviar a confirmar las muestras POSITIVAS e Deben enviar a confirmar las muestras POSITIVAS e INDETERMINADASINDETERMINADAS

ISPISP–– ExExáámenes Directos menes Directos –– ExExáámenes Indirectosmenes Indirectos–– ExExáámenes Molecularesmenes Moleculares

DiagnDiagnóóstico Directostico Directo

Se aplica a la observaciSe aplica a la observacióón n microscmicroscóópica del lpica del lííquido obtenido por quido obtenido por puncipuncióón de quiste hidatn de quiste hidatíídico.dico.

Quiste HidatQuiste Hidatíídicodico

PROTOESCOLEXPROTOESCOLEX

DiagnDiagnóóstico Indirectostico Indirecto

Serología

Se dispone de:Se dispone de:

Doble DifusiDoble Difusióón en n en gelgel con deteccicon deteccióón del Arco 5n del Arco 5ºº

EnzimoinmunoEnzimoinmuno ensayo Ig Gensayo Ig G

EnzimoinmunoEnzimoinmuno ensayo Ig Eensayo Ig E

Western blot polivalente Ig G, Ig A e Ig MWestern blot polivalente Ig G, Ig A e Ig M

AntAntíígeno Liquido Hidatgeno Liquido Hidatíídico extradico extraíído de quistes fdo de quistes féértilesrtiles

Reacciones cruzadas con cisticercosisReacciones cruzadas con cisticercosis

Western blot Hidatidosis sueros +

ToxoplasmosisToxoplasmosis

Toxoplasma gondiiToxoplasma gondii


21 instituciones21 instituciones–– Hospitales pHospitales púúblicos y privados. Clblicos y privados. Clíínicas y nicas y

Laboratorios privadosLaboratorios privadosELISA Ig G e ELISA Ig G e IgMIgMELFA Ig G e Ig M ELFA Ig G e Ig M

ISPISP–– ExExáámenes Indirectosmenes Indirectos


Importante en la transmisiImportante en la transmisióón n transplacentaria de la enfermedad, en transplacentaria de la enfermedad, en inmunocomprometidos y transplante de inmunocomprometidos y transplante de óórganos.rganos.

Inmunofluorescencia IndirectaInmunofluorescencia Indirecta Ig GIg G

ELFA Ig G, Ig M e Ig G ELFA Ig G, Ig M e Ig G avidityavidity

Inmunofluorescencia

MiniVidasMiniVidas bioMerieuxbioMerieux

ELFA para Toxoplasmosis detecciELFA para Toxoplasmosis deteccióón de n de IgGIgG e e IgMIgM

ToxocariasisToxocariasis

ToxocaraToxocara caniscanis

ToxocaraToxocara catiscatis

AntAntíígeno extracto somgeno extracto somáático de larvastico de larvasTTéécnica de eleccicnica de eleccióón:n:–– EnzimoinmunoEnzimoinmuno Ig G Mayor Ig G Mayor o igual a o igual a

1:641:64

El ISP dispone de:– 2 técnica de ELISA comercial y 1 propia– Técnica de Western blot comercial y

propia en desarrollo

ELISA Ig GELISA Ig G

De la LDe la Líínea LD nea LD BioBio DiagnosticDiagnosticLyonLyon, Francia., Francia.

SerSeríían positivos an positivos aquellas muestras aquellas muestras con las bandas de con las bandas de 24 y 35 24 y 35 KdKd. .

TriquinosisTriquinosis

Trichinella sppTrichinella spp

Se dispone de:Se dispone de:

–– 2 t2 téécnicas de ELISA Ig G una cnicas de ELISA Ig G una

comercial y otra propiacomercial y otra propia

–– 2 Western blot uno comercial Ig G y 2 Western blot uno comercial Ig G y

otro polivalenteotro polivalente Ig G, Ig A e Ig M.Ig G, Ig A e Ig M.

PatrPatróónn Debe estar presente 47 Debe estar presente 47 kDakDa junto con a lo menos una de las junto con a lo menos una de las bandas de 63, 52, 32 y 28 bandas de 63, 52, 32 y 28 kDakDa..

Western blot ISP sueros Positivos

De la LDe la Líínea LD nea LD BioBio DiagnosticDiagnosticLyonLyon, Francia., Francia.

SerSeríían positivos an positivos aquellas aquellas muestras con las muestras con las bandas de bandas de P 43P 43--44 y P 6444 y P 64

CoproparasitologCoproparasitologííaa


350 instituciones350 instituciones–– Hospitales pHospitales púúblicos y privados. Clblicos y privados. Clíínicas nicas

Consultorios y Laboratorios privadosConsultorios y Laboratorios privados–– Examen Seriado de deposiciones Examen Seriado de deposiciones

TelemannTelemann y y BurrowsBurrows ModificadosModificados

–– BBúúsqueda de squeda de Enterobius vermicularisEnterobius vermicularisTest de GrahamTest de GrahamBBúúsqueda desqueda de Cryptosporidium sppCryptosporidium spp

ISPISP


Generales Generales –– Se puedes derivan muestras de deposiciones para Se puedes derivan muestras de deposiciones para

confirmaciconfirmacióón de elementos microscn de elementos microscóópicos picos encontrados.encontrados.

Estudio en pacientes inmunocomprometidosEstudio en pacientes inmunocomprometidos–– BBúúsqueda de squeda de

Cryptosporidium Cryptosporidium parvumparvumIsosporaIsospora bellibelliCiclosporaCiclospora cayetanensiscayetanensisMicrosporidiumMicrosporidium spsp CromotropoCromotropo 2 R2 R

IdentificaciIdentificacióón de elementos macroscn de elementos macroscóópicos picos derivados derivados –– Se pueden enviar elementos o ejemplares Se pueden enviar elementos o ejemplares

eliminados por boca, nariz o ano.eliminados por boca, nariz o ano.–– Existe formulario especialExiste formulario especial

ZielhZielh NeelsenNeelsenBurrowsBurrowsAutofluorescenciaAutofluorescencia

Algunos Emergentes y Algunos Emergentes y rere--emergentesemergentes

Infecciones por especies Infecciones por especies del gdel géénero nero PlasmodiumPlasmodium

MalariaMalaria

FormaciFormacióón de Redn de Red

Se han realizado 3 talleresSe han realizado 3 talleres–– 45 Profesionales capacitados45 Profesionales capacitados

Protocolo de trabajo comProtocolo de trabajo comúúnnCapacidad de enfrentar diagnCapacidad de enfrentar diagnóóstico stico inicialinicialMMéétodos todos inmunocromatogrinmunocromatográáficosficos

El diagnEl diagnóóstico clstico cláásico es por sico es por microscopmicroscopíía y por lo tanto es operador a y por lo tanto es operador dependiente.dependiente.Existen Existen kitskits comerciales para realizar comerciales para realizar –– MMéétodos todos InmunocromatogrInmunocromatográáficosficos–– MMéétodos de biologtodos de biologíía molecular que a molecular que

permiten diferenciar las especies de permiten diferenciar las especies de Plasmodium.Plasmodium.

P falciparumP falciparumP vivaxP vivaxP malariaeP malariaeP ovaleP ovale

P ovale

P falciparum P vivax

P malariae

ComparaciComparacióón por mn por méétodotodo

MicroscopMicroscopííaa–– MMéétodo tradicionaltodo tradicional–– Requiere experienciaRequiere experiencia–– Bastante tiempo por muestrasBastante tiempo por muestras–– Falsos NegativosFalsos Negativos–– LLíímite sensibilidad 1mite sensibilidad 1--5 par5 paráásitos sitos ulul

P falciparum

P vivax

InmunocromatogrInmunocromatográáficosficos–– Detectan antDetectan antíígenos circulantegenos circulante–– Muy rMuy ráápidospidos–– No diferencian todas las especiesNo diferencian todas las especies–– LLíímite de sensibilidad 100 parmite de sensibilidad 100 paráásitos/sitos/ululPCRPCR–– Detecta las cuatro especiesDetecta las cuatro especies–– Detecta infecciones mixtasDetecta infecciones mixtas–– Posibilidad de automatizaciPosibilidad de automatizacióónn–– RRáápidospidos–– Limite de sensibilidad 0.01 a 0.05 parLimite de sensibilidad 0.01 a 0.05 paráásitos/sitos/ulul

ICT MalariaICT Malaria

AntAntíígeno geno

ProteProteíína 2 rica en histidina na 2 rica en histidina HRP2HRP2

OptimalOptimal

AntAntíígeno Lactato geno Lactato deshidrogenasadeshidrogenasa especespecííficafica

Las bandas esperadas para Las bandas esperadas para muestras positivas son muestras positivas son visibles tras la segunda visibles tras la segunda reaccireaccióón de amplificacin de amplificacióón: n:

P. falciparumP. falciparum: 395 : 395 bpbp •• •• •• ••

P. malariaeP. malariae: 269 : 269 bpbp

P. vivaxP. vivax: 499 : 499 bpbp

P. ovaleP. ovale: 436 : 436 bpbp

499499

436436

395395

269269

PCR ISP BIOMALARPCR ISP BIOMALAR

StrongyloidiasisStrongyloidiasis

Strongyloides stercoralis

Parasitosis cuyo diagnParasitosis cuyo diagnóóstico directo es stico directo es de baja sensibilidad, ya que se utilizan de baja sensibilidad, ya que se utilizan muestras fijadas.muestras fijadas.

Se sospecha en pacientes con Se sospecha en pacientes con eosinofiliaeosinofiliaalta.alta.

Se registran prevalencias mSe registran prevalencias máás altas en s altas en instituciones cerradas como hospitales instituciones cerradas como hospitales siquisiquiáátricostricos..

Larvas en deposiciones

Filariforme

Rabditiforme

ELISA ELISA IgGIgG ISPISPMERCADO P, Rubén, JERCIC L, María Isabel, TORRES H, Patricio et al. Inmunodiagnóstico de las infecciones por Strongyloides stercoralis en Chile utilizando la prueba de ELISA. Rev. méd. Chile, dic. 2002, vol.130, no.12, p.1358-1364. ISSN 0034-9887.

LeishmaniaLeishmaniaSchistosomiasisSchistosomiasisFilariasisFilariasis

De la LDe la Líínea LD nea LD BioBioDiagnosticDiagnostic LyonLyon, , Francia.Francia.

SerSeríían positivos aquellas an positivos aquellas muestras con las bandas muestras con las bandas de de P 14 y/o P 16.P 14 y/o P 16.


SerSeríían positivos aquellas an positivos aquellas muestras con 3 de las muestras con 3 de las bandas de bandas de P 65, P 70, P P 65, P 70, P 80, P 95, P 110 y P 120.80, P 95, P 110 y P 120.

Amebas de vida Amebas de vida LibreLibre

GGéénero nero AcanthamoebaAcanthamoebaEn el ISPEn el ISP–– Cultivo AxCultivo Axééniconico

Demora 7 dDemora 7 dííasasRaspado cornealRaspado cornealBiopsiaBiopsiaLentesLentes

EpidemiologEpidemiologíía Moleculara Molecular

CultivoCultivo in vitro, a in vitro, a travtravééss del del mediomedio ANNE, ANNE, siguiendosiguiendo lo lo descritodescrito porporPage. (LCR; Page. (LCR; EpitelioEpitelio corneal; corneal; BiopsiasBiopsias; ; lenteslentes de de contactocontacto., etc.., etc.

• Sobre agar no nutriente, se depositauna pelicula de Sol. de Escherichia coli.

• Luego se procede a la siembra

• Estufa a 37° c., durante 7 días, revisandoperiodicamente.-

ImportadasImportadasLeishmaniasisLeishmaniasisSchistosomiasisSchistosomiasisFilariasisFilariasis


SerSeríían positivos aquellas an positivos aquellas muestras con las bandas muestras con las bandas de de P 14 y/o P 16.P 14 y/o P 16.


SerSeríían positivos aquellas an positivos aquellas muestras con 3 de las muestras con 3 de las bandas de bandas de P 65, P 70, P P 65, P 70, P 80, P 95, P 110 y P 120.80, P 95, P 110 y P 120.

FilariasisFilariasis

DetecciDeteccióón de n de –– BrugiaBrugia malayimalayi BrugiaBrugia timoritimori–– Loa Loa loaloa–– MansonellaMansonella ozzardiozzardi, , MansonellaMansonella

perstans,Mansonellaperstans,Mansonella streptocercastreptocerca–– OnchocercaOnchocerca volvulusvolvulus–– WuchereriaWuchereria bancroftibancroftiELISA Ig GELISA Ig G

Aseguramiento de la Aseguramiento de la calidadcalidad

Control de Calidad Interno Control de Calidad Interno Control de Calidad ExternoControl de Calidad Externo

Control de Calidad Control de Calidad InternoInterno

Debe estar presente en todos los Debe estar presente en todos los laboratorios y bancos de sangrelaboratorios y bancos de sangreExiste literatura de apoyoExiste literatura de apoyo–– Manual de control de calida Interno ISPManual de control de calida Interno ISP

Se capacita en todos los cursos Se capacita en todos los cursos

El ISP tiene un programa especial para El ISP tiene un programa especial para

todas las todas las ááreas del laboratorio clreas del laboratorio clíínico y nico y

bancos de sangre como tambibancos de sangre como tambiéén para n para

Laboratorios del Ambiente y de Salud Laboratorios del Ambiente y de Salud

OcupacionalOcupacional

Control de Calidad Control de Calidad Externo Externo

ÁÁrea Parasitologrea Parasitologííaa

SUBSUB--PROGRAMASPROGRAMAS–– DiagnDiagnóóstico stico CoproparasitolCoproparasitolóógicogico

Cryptosporidium Cryptosporidium parvumparvum..

–– DiagnDiagnóóstico de Serologstico de Serologíía para la a para la Enfermedad de Chagas:Enfermedad de Chagas:

Grupo Tamizaje Grupo Tamizaje

Grupo confirmaciGrupo confirmacióónn

–– SerologSerologíía para Hidatidosis Humana.a para Hidatidosis Humana.–– DiagnDiagnóóstico de stico de Pneumocystis jiroveciPneumocystis jiroveci–– SerologSerologíía para Toxoplasmosis humanaa para Toxoplasmosis humana

I

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