Author
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
1
Mtodos moleculares Mtodos moleculares aplicados aplicados
microbiologia de microbiologia de alimentosalimentos
Hans FrderXII Workshop em AlimentosLajeado/RS, 5 a 6 de outubro 2011
Tendncia Mundial
Qualidade e Inocuidade dos Alimentos:
Monitoramento dos Riscos
Anlise FQ Anlise Microscpica Anlise Microbiolgica
2
Qualidade dos Alimentos
Verificada pelos MO Indicadores:
Bactrias aerbias mesfilas, psicrotrficas e termfilas S. aureus homem veiculador Fungos limpeza do local Contaminao fecal (coliformes T,TT, E. coli) Enterobacteriaceae (preferncia)
3
Inocuidade
Verificada pelos patgenos:
Gram-positivos (intoxicao)
Gram-negativos (infeco)
Fungos produtores de micotoxinas
Vrus
4
5
B. cereus S. aureus L. monocytogenes
E. coli Salmonella Campylobacter
6
Aspergillus Penicillium Fusarium
Rotavrus Norwalk Poliomielite
7
Excretas de rato (6,5x) Plo de rato (400x)Brbula de pombo (200x)
caro (25x) caro (30x) caro (200x)
8
75% novas doenas = patgenos oriundos de animais / produtos
9
Produo industrial dealimentos de origem animal
Intercmbio internacional de animais/ produtos
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.setor1.com.br/textos/carnes/FD00997_.gif&imgrefurl=http://www.setor1.com.br/carnes/index.htm&h=364&w=420&sz=12&hl=pt-BR&start=2&tbnid=sRHUZnpV_M3i7M:&tbnh=108&tbnw=125&prev=/images%3Fq%3Dprodutos%2Bde%2Borigem%2Banimal%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DG10
Introduo e disseminao de patgenos
11
Mtodos de anlise eficientes
Preocupao por parte das autoridades
de sade pblicaImplementao de programas
de controle microbiolgico
Empresas e consumidores
Mt. tradicional ISO: incentivo mtodos sensveisescolha mt. rpido: custo, aceito
Mtodos de Verificao
Mtodos tradicionais / cultivo / clssicos
Mtodos alternativos / rpidos Por que a procura? Para que servem? Usado em que situaes?
12
Mtodos Tradicionais
Meios de cultura no seletivos, seletivos, complementados por provas bioqumicas
Utilizam testes morfolgicos
Testes sorolgicos
13
Mtodos Tradicionais
Problemas
Trabalhosos / requerem muito material Demorados Requerem laboratorista treinado Sujeito a falhas na interpretao dos resultados Sensibilidade insuficiente (capacidade de detectar) Especificidade insuficiente (detectar apenas o alvo) Repetitividade baixa (resultado no ser o mesmo) Reprodutividade baixa (resultado estatisticamente diferente)
14
Que demora!
Mtodos Tradicionais
Farber et al. (2001)
Resultados de testes bioqumicos podem apresentar variabilidade pela ao de fatores ambientais sobre a expresso gnica
Baixo poder discriminatrio Risco de interpretaes errneas Utilizao de um nmero grande de determinaes
microbiolgicas (custo de anlise muito elevado)
15
Mtodos Tradicionais
Martin et al. (2006)
Mtodos tradicionais, embora confiveis e eficientes, requerem vrios dias a semanas
Propriedade fenotpicas pelas quais as bactrias so identificadas podem no ser expressas e quando so, podem ser difcies de ser interpretadas e classificadas
Possibilidade de clulas VPNC
16
Mtodos
1993 at 2000 = surgimento de inmeros mtodos comerciais em pases desenvolvidos (bioluminescncia, imunolgicos, bioqumicos, moleculares, impedncia/condutncia, etc)
Atualmente: maior controle do mercado
17
Objetivo dos Mtodos Alternativos
Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica
Aumentar a confiabilidade dos resultados (kit)
Aumentar a preciso dos resultados
Tcnico treinado18
Mtodos Alternativos
Nas ltimas dcadas, verificou-se aumento significativo no desenvolvimento de tcnicas moleculares para deteco, identificao e caracterizao de bactrias patognicas
Destro (1995) Avanos, nos estudos de biologia molecular, propiciam o
desenvolvimento e emprego de vrios mtodos de tipagem molecular
19
20
Tcnica Aplicao Metodologia
Perfil plasmidial Tipificao Extrao de DNA plasmidial, corte com enzimas e
eletroforese
REA Ferramenta epidemiolgicaExtrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e
eletroforese
Ribotipagem Tipificao (cpia de genes ribossomais)Extrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e
eletroforese
PFGE Ferramenta epidemiolgica Mudana repetida da orientao do campo eltrico
RAPDAmplifica DNA em condies de baixa
estringncianico primer, no sendo necessrio saber a regio de
ligao
RT-PCRExpresso de genes (virulncia, toxinas),
RNA viralRNA extrado convertido para cDNA que amplificado
por PCR
Nested PCR Tipificao Grupo de primers (amplificao); outro grupo de primers
(re-amplificao)
Multiplex PCR Tipificao Uso de mais de um par de primers na mesma reaoREP-, ERIC-, BOX-(PCR)
Identificao e tipificao (gnero, espcie, subespcie)
Uso de primers de consenso; amplifica regies entre estes elementos repetitivos
RFLP-PCRAnlise do polimorfismo do tamanho de
fragmento de restrioFragmentos amplificados por PCR; digesto por uma ou
mais endonucleases
PCR ribotipagem Identificao e tipificao Amplificao de sequncias conservadas 5S, 16S e 23S
do operon do RNAr
PCR tempo real Deteco e quantificaoPCR convencional ; sondas fluorescentes; interpretao do
espectro gerado
21
Tcnica Vantagens Desvantagens Referncias
Perfil plasmidial Informaes epidemiolgicas
Perda ou ganho de plasmdio; pouco valor para bactrias com
baixa incidncia Kolstad et al. (1992)
REA Uso de endonuclease
Dificuldade de interpretao visual dos perfis (centenas de
bandas) Wojciech et al. (2004)Ribotipagem Bandas mais visveis e comparveis custo elevado Aarestrup (2006)
PFGE Agarose mantm DNA intacto
DNA de alto peso molecular pode ser submetido digesto
pela endonuclease Arbeit et al. (1990)
RAPD Detectar polimorfismos do DNA
Escolha de iniciadores que originem resultados
reproduzveis Welsh & McClelland (1990)
RT-PCR Amplifica DNA obtido por meio de TR de RNA Tang & Persing (1999)
Nested PCR Diversos ciclos de amplificao Konemann et al. (2001)
Multiplex PCRAmplifica diferentes alvos de microrganismos,
uso na rotina, baixo R$
Reduo na sensibilidade de deteco; necessidade de
ensaios preliminares Tang & Persing (1999)
REP-, ERIC-, BOX-(PCR) Uso em diferentes regies do genoma
Amplificao de sequncias inespecficas (ERIC) Gillings & Holley (1997)
RFLP-PCR Associao da tcnica PFGE Farber et al. (2001)PCR ribotipagem Uso para diferenciar espcies Shangkuan et al. (2000)
PCR tempo realEstudos quantitativos, tubo fechado, no h
necessidade de eletroforese custo elevado Heid et al. (1996)
Mtodos Alternativos
Tcnicas genotpicas referem-se caracterizao do DNA cromossmico, plasmidial ou total de um micro-organismo, caractersticas relativamente estveis
Tcnicas moleculares: Aplicao direta na deteco e caracterizao de bactrias
patognicas em alimentos Destaca-se a PCR (Boer e Beumer, 1999; Farber, 1996;
Malorny et al. (2003)
22
23
Reviso
24
Informao para produzir determinada protena
25
Primer Polimerase
Thermus aquaticus (Taq)
Exemplo de mistura para reao qPCR
26
400 nM primers (de cada 1 do par)250 nM sonda200 M de cada dGTP, dATP, dCTP400 M dUTP*Tampo PCR (Tris-HCl, pH 8,4)50 mM KCl4,5 mM MgCl21 U Platinum Taq polimeraseDNA ou RNA alvoH2O Ultra-pura
*dUTP suscetvel hidrlise pela enzima bacteriana uracil-N-glicosilase. Adio da enzima na mistura PCR permite hidrlise seletiva e remoo dos produtos de amplificao contaminante da mistura de PCR
27
28
Mtodos Rpidos (PCR)
It is difficult to find a journal that does not describe
some use of these techniques (APHA, 2001)
difcil encontrar uma revista cientfica que no descreva algum uso destas tcnicas
29
Reao da Polimerase em Cadeia(PCR)
Kary B. Mullis (1983): inveno da PCR
Tcnica altamente sensvel
Pequenas quantidade de sequncias de DNA ou RNA especficas podem ser enzimaticamente amplificadas, at que sejam obtidas milhes de cpias da sequncia alvo
30
31
PCR
32
33
Nao! Quantificar
Detectar ?
34
PCR Sistema Aberto
(deteco)
35
PCR- Sistema Fechado(BAX System)
Sim
No
3. Deteco
Amostra
2. Amplificao
pr-enriquec. MO: est ou no est ?
resposta
36
Resultados do rack reportdo BAXSystem para deteco de Listeria monocytogenes
37
Perfil da curva de fuso (melting curve) do controle interno
Perfil da curva de fuso (melting curve) de Listeria monocytogenes da amostra positiva
Aprovao MAPA - Salmonella
INSTRUO NORMATIVA N 41, DE 7 DE JUNHO DE 2004 VALIDAO DA METODOLOGIA UTILIZADA PELO SISTEMA DE DETECO PATOGNICA PARA ALIMENTOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS - A-BAX PARA DETECO DE SALMONELLA SPP EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS, GUA E AMOSTRAS AMBIENTAIS-SWAB, COMO MTODO ALTERNATIVO EQUIVALENTE AO MTODO DE REFERNCIA DO MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO MAPA
38
Aprovao MAPA - Listeria
INSTRUO NORMATIVA N 40, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2005. ISOLAMENTO E IDENTIFICACAO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM CARNE VERMELHA, CARNE DE AVE, OVOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS, MLG 8.04 METODOLOGIA ALTERNATIVA DE LISTERIA A-BAX MLG-8 A .01
39
40
Segunda gerao de mtodos que empregam a PCR (qPCR)
Amplificao e deteco em uma nica reao em tubo fechado
Baixo risco de contaminao
Deteco do aumento do nmero de cpias do DNA alvo medida que a reao realizada
Reduo do tempo de anlise
Ciclo
Cpia inicial
PCRCiclo 1
PCRCiclo 2
2XCpias
30-45 Ciclos
4XCpias
monitora o progresso da PCR em TR
PCR-tempo real (qPCR)
Exemplos de qPCR
41
42
FRET
Corantes fluorognicos ligados
Sntese de DNA e clivagem da Sonda - 5exonuclease
Deteco / PCR-RT marcadores fluorognicossonda: hibrid.reg. internas
Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003
Curva de amplificao da qPCR
43
Ct Threshold cycle
44
Amostras so inseridas no termociclador que controla a temperatura de cada ciclo da PCR
Amostras so excitadas e a fluorescncia mensurada por um fotodetector em cada ciclo da PCR
LED (light-emitting diode)
Fonte: Valasek & Repa, 2005
Comparao entre tcnicas fenotpicas e genotpicas
Gandra et al. (2008)
Tempo de anlise menor para as tcnicas baseadas em PCR
Resultados em 6 a 8 h Resutados falso-positivos (amplificao de DNA proveniente
de clulas mortas) Viabilidade de micro-organismos presentes (RNA) Preparo da amostra, incluso de um IAC, purificao do
DNA/RNA
45
PCRVantagens qPCR
Maior alcance dinmico na deteco
Nenhum processamento ps-PCR Alta sensibilidade Coleta de dados na fase
exponencial da PCR Um aumento no sinal reprter
fluorescente diretamente proporcional ao nmero de amplicons gerados
A sonda clivada fornece um registro permanente de amplificao de um amplicon
Desvantagens PCR convencional Baixa preciso Baixa sensibilidade Baixa resoluo No automatizado Discriminao baseada apenas no
tamanho do amplicon Resultados no so expressos
como nmeros Brometo de etdio para a colorao
no quantitativa Ps-processamento da PCR
46
Preparo de amostras
Rodrguez-Lzaro et al. (2007)
Garantir boa homogeneizao Aumentar a concentrao do organismo alvo Reduzir ou excluir substncias inibitrias (etapa de enriquecimento) Procedimentos de pr-amplificao devem ser adaptados para cada
matriz alimentcia variao na homogeneidade; consistncia; composio e microbiota
47
Outras metodologias para o preparo de amostras
Glynn et al. (2006)
Filtrao Centrifugao Uso de detergentes e solventes orgnicos Tratamento com enzimas Incluso de aditivos na PCR (BSA) Diluio da amostra
48
Limitaes da PCR
Farber et al. (2001); Glynn et al. (2006); Martin et al. (2006)
Alto custo inicial
Falta de legislao que padronize e valide estas tcnicas
Desenvolvimento de sistemas automotivos (extrao, purificao)
49
Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos
Postollec et al. (2011)
qPCR: detectar, identificar, quantificar micro-organismos
ISO: deteco de patgenos por PCR (ISO 22174:2005; ISO/TS 20836:2005; ISO 20837:2006; ISO 20838:2006)
Fase inicial: expresso gnica; multiplicao e atividade microbiana em matrizes complexas para controles industriais
50
Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos
PCR: > rapidez, sensibilidade e especificidade detecta populaes dominantes, sub-dominantes, clulas
mortas ,VPNC, quantifica genes e expresso gnica
Automao: Isolamento do cido nucleico e preparo qPCR (barato e adequado para rotina)
51
Implementao do qPCR no Laboratrio
52
Viso do administrador
53
Terror!
Viso do tcnico
54
astro da magia!
Viso do cliente
55
soluo dos problemas!
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Extrao do cido nucleico Componente mais importante para assegurar
reprodutibilidade
Uso de kits comerciais ou com adaptaes dependendo da matriz
RNA: extrao laborosa, especialmente em matrizes complexas ou gordurosas
fcil degradao, rapidamente analisado
56
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Deteco qumica Disponibilidade de vrios sistemas
Modo de ao, vantagens e limitaes
Mais usados na Micrbiologia de Alimentos: DNA binding dye (SYBR Green) Hydrolisis Probe (5 nuclease assay)
57
Sistema SYBR Green
58
Sistema TaqMan
59
60
61
Tipos de sistemas qumicos usados para a deteco na qPCR
Fonte: Wong & Medrano, 2005
Custo dos sistemas qumicos de deteco
62
Consideracoes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Mtodos de quantificao
Escolha de uma curva padro (Absoluta ou Relativa)
Eficincia de amplificao:[10-1/slope] 1 = 1
PCR no apresenta eficincia ideal presena de inibidores; variabilidade nos nucleotdeos
63
64
Curvas de amplificao: - relao do sinal fluorescente
versus o nmero de ciclos da PCR
Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003
Curva padro: - R2 =coeficiente de regresso
linear dos dados gerada- clculo da EA
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
RT-qPCR
nica ou duas etapas nica etapa nica tubo
menor risco de contaminao do DNA minimiza o risco de variao experimental maior degradao do RNA
65
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
RT-qPCR
Duas etapas RT independente da qPCR Melhor quando a mesma amostra de RNA utilizada
66
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Variaes experimentais da RT-qPCR
Tcnica de alta sensibilidade Variabilidade nos resultados Triplicatas (RNA; cDNA ou DNA)
67
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Controles Devem ser includos para avaliar a contaminao do alvo
(DNA, eficincia da RT, variaes no M Mix Controle negativo (contaminado com no-alvo) Controle positivo (contaminado com o alvo) Branco (gua) 96 amostras (vrios Brancos) IAC: possibilita identificar substncias inibidoras da PCR
68
Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR
Modo de expresso
Quantificao absoluta UFC/mL ou GEq/mL (GEq ou cpias DNA/mL) GE/mL = nr. de cpias do gene alvo Diferenas entre UFC/GEq (clulas mortas, lise incompleta)
Quantificao relativa Nvel de expresso (gene, RNAr) da amostra para amostra
controle cDNA alvo/DNA espcie alvo
69
Aplicaes da qPCR
70
Desenvolvimento de um ensaio para quantificao de Salmonella empregando a qPCR
Frder et al. 2008
13 sunos (4 semanas de idade) oramente contaminados com S.Typhimurium DT 104
Dose Infectiva: ~ 6 x 109 UFC/mL/animal Material fecal colhido geralmente nos dias 1, 2, 3, 4, 6, 8, 13, 15, 20, 22 e 28 aps
infeco
71
72
Quantificao por qPCR Quantificao por mtodo
clssicoTratamento Pr-PCR (200-220 mg de
fezes )
Fezes coletadas via retal
Diluio 1:10 em 1% BPW
Semeadura superficial 100 L sobre XLDNal50 com SPEnsaio qPCR
Incubao (48 h /37C)
Contagem bacteriana automtica (ProtoCOL)
Confirmao sorolgica
Protocolo para quantificao de Salmonella em material fecal
Protocolo para quantificao de Salmonella em fezes sunas por qPCR
QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) Material: 200-220 mg
Ensaio qPCR:Malorny et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. AEM, 2004 Fragmento de 94 pb do locus ttr especfico para SalmonellaSonda TaqMan FAM-DQ
Curva Padro: 1 107 clulas direto na qPCR6,5 x 105 6,5 cpias de DNA (aps Qiagen Kit) Anlise dos dados baseado no valor Ct
73
74
Quantificao de Salmonella em fezes sunas naturalmente contaminadas empregando mtodo
clssico e qPCRSmbolos fechados: qPCR
Smbolos vazados: Spiral Plater
Valores mdios de UFC eq de Salmonella e Ct mdios obtidos para as curvas padro de fezes naturalmente contaminadas e submetidas
ao qPCR, aps tratamento com QIAamp DNA Stool Kit
75
Salmonella (UFC/mL DP)
Salmonella qPCR
(UFC eq)
Salmonella (UFC eq)
Ct DP*
1,3 x 108 1,5 x 107 6,5 x 105 9,3 x 105 6,1 x 104 18,8 0,33 1,3 x 107 1,5 x 106 6,5 x 104 1,1 x 105 2,6 x 104 22,1 0,16 1,3 x 106 1,5 x 105 6,5 x 103 8,0 x 103 1,7 x 103 25,3 0,18 1,3 x 105 1,5 x 104 6,5 x 102 9,9 x 102 1,0 x 102 28,8 0,40 1,3 x 104 1,5 x 103 6,5 x 101 1,1 x 102 2,9 x 101 31,9 0,38 1,3 x 103 1,5 x 102 6,5 x 100 9,6 x 100 1,4 x 100 35,4 0,59 1,3 x 102 1,5 x 101 0,65 0,65 > 45
populao de Salmonella obtida no gar XLDNal50
desvio padro (DP)
populao de Salmonella em UFC eq definida na janela de deteco da PCR-RT
populao de Salmonella em UFC eq obtida por PCR-RT
*Ct - ciclos da PCR cujo sinal fluorescente atingiu o limiar de deteco desvio padro (DP)
76
Combinao de qPCR; qPCR-PMA; tradicional PMA: corante que intercala na dupla fita de clulas mortas
n= 50 carcaas naturalmente contaminadasMtodo PMA-PCR: 100% de especificidade
Mtodo ISO 10272-1: trabalhoso, requer muito tempo, no detecta VPNC
77
Resultados de qPCR (preto), qPCR com tratamento PMA (cinza) e o mtodo tradicional (branco)
Correlao entre ISO e qPCR foi maior do que a correlao com qPCR-PMAConsideraes do qPCR-PMA: estado celular (viva ou morta), permeabilidade da parede celular
ou se PMA entrou em pequenas fraes em clulas cultivveis
78
Limite de quantificao qPCR e qPCR-PMA
102 UFC/mL
79
Primers para deteco de genes de virulncia e sorotipo de E. coli O157:H7
RNA bacteriano em concentraes de 102 e 103 UFCInoculao artificial em suco, alface e carne
Concentrao do inculo empregando 2 filtraes (0,45 m e 0,2 m)Tempo analtico: 4 h
80
Protena intimina
Antgeno flagelar H7
Hemolisina
Antgeno somtico O157 Controle interno
81
82
Validao in-house para deteco especfica de Salmonella em alimentosValidao requer: desenho de primers e sonda especficos
Teste de inclusividade e exclusividade110 alimentos artificialmente contaminados
83
IAC: fragmento de DNA artificial e inserido em cada mistura de reao
84
85
86
Sensibilidade: nmero total de culturas ou colnias positivas corretamente obtidasEspecificidade: nmero total de culturas ou colnias negativas obtidas
87
Estudo de validao qPCR multiplex (12 hospitais de SP) e identificao de fatores associados com cultura negativas* e PCR positivas
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae Tipo b causam meningite em recm nascidos
Brasil: 28.000 casos/ano
*devido uso de antibiticos
88
Caractersticas dos 499 pacientes envolvidos no estudo
Caractersticas Nr. (%)
Sexo masculino 301 (60.9%)Faixa etria mdia 9 anos (082)Mortos 40 (9.6%)Culture-positiveN. meningitidis 107 (21.4%)S. pneumoniae 50 (10.0%)H. influenzae 5 (1.0%)CSF 100 WBCs e 60% PMNs 460 (93.7%)Cultura positiva, 1 dos 3 alvos 123Cultura negativa 337Ensaio antibitico CSF positivo 142 (34.6%)
CSF Fluido crebro-espinhal; WBC clulas sanguneas brancas; PMNs clulas polimorfonucleares
89
Mtodo 1** cultura positiva para um patgeno e os outros dois negativos na qPCRMtodo 2*** cuturas negativas, com critrio CSF de 100 leuccitos/mm3 e 60 neutrfilosMetodo 3**** culturas positivas para o segundo alvo, porm removidas no clculo da sensibilidade
Risco de cultura + qPCR = presena de antibiticos no fluido crebro-espinhal
90
nica etapa nica tuboDuas etapas RT independente da qPCR
Emprego de duas enzimas (RT e DNA polimerase)Quantificao absoluta ou relativa
91
Extrao do mRNA alvo
Purificao do mRNA
mRNA
Transcriptase reversa (RNA polimerase)
RT-PCR Sntese de DNA complementar (cDNA)
Reao de PCR
DNA dupla-fita (mltiplas cpias)
Viabilidade obtida para S. Typhimurium 51K61 no modelo ave durante o perodo de 165 h aps a
inoculao
92
Viabilidade: relao cp. RNA (UFCeq do tuf-RNA ) e cp. DNA (UFCeq tuf )Viabilidade: capacidade de metabolizar componentes
Expresso do gene tuf
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
qPCR = deteco e quantificao (bactrias*, fungos e vrus)*Salmonella, Lm, Sa, Ec O157:H7
Vantagens: Tempo analtico menor
Lm (2 dias) Salmonella (26 h ou algumas horas) Clostrdios (1 dia) Bc (2 h)
93
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
Ct similar s contagens em placa
Limites de quantificao sem enriquecimento da amostra: 102 103 UFC/g ou mL
Ideal: qPCR + enriquecimento de poucas horas Salmonella e Lm (
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
Reduzir os nveis de deteco Combinar :
PCR ou Filtrao ou Centrifugao 10-100 UFC/g (Salmonella e C. jejuni) em 3 h Mtodo: centrifugao por densidade + qPCR
qPCR: correlao com plaqueamento (5 logs)
Discrepncias: contagens maiores no plaqueamento
95
Discrepncia de logs
96
Populaes mdias de S. Typhimurium obtidas em alimento-modelo (suno) incubado a 20 C e determinada por RT-qPCR (tuf-RNA), qPCR- (tuf) e semeadura em gar XLD
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
Motivos das discrepncias:
Volumes diferentes (1 mL ou 0,1 mL versus 5 L) Presena de DNA intacto de clulas mortas Presena de formas VPNC 1 UFC pode ser gerada por mais uma clula Uso de primers para o alvo variando nmeros de
multicpias dos genes
97
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
Quantificao de patgenos: Considerar
Aplicaes da (RT-)qPCR na MA
Tendncia atual: multiplex no mesmo tubo de reao Diferencia rapidamente de gnero ou espcie
Exemplos: E.coli O157:H7, Salmonella spp., Lm presente em leite e carne Campylobcter, Salmonella spp. em frango
99
qPCR: deteco de no-patognicos
Deteco e quantificao de bactrias processos fermentativos (LAB) Propriedades organolpticas
Queijo Enterococcus gilvus (LD:104 UFC/g) Queijo Corynebacterium casei (LQ: 105 UFC/g) Probiticos Bifidobacterium (LD: 102 UFC/g) (16 rRNA)
qPCR: monitoramento de alteraes causadas por fungos (maturao de queijos)
Penicillium roqueforti Penicillium camemberti
100
qPCR: deteco de no-patognicos
Limitaes do qPCR: substitudas pelo RT-qPCR
RT-qPCR: pouco usado Dificuldade na extrao de RNA Disponibilidade de kits Instrumentos (ready-to-use) checagem de RNA integral
101
RT-qPCR e avaliao de risco
Problemas recorrentes Mtodos moleculares: deteco de micro-organismos mortos
Estratgias de diferenciao de cl.vivel/mortas EMA/PMA (aplicado antes da extrao de DNA)
inativao da clula vivel e inibio da PCR Incluso da etapa de enriquecimento Sistemas de filtrao Tratamento com DNAse I (vivel e esporos)
102
Concluso e Recomendaes
Deteco e quantificao de patgenos esto sendo amplamente estudados na MA
Resulado positivo pelo mtodo rpido ser considerado presuntivo e dever ser confirmado pelo tradicional
A confirmao extende a anlise por vrios dias, isso no pode ser visto como fator limitante (devido a ter negativos)
103
Concluso e Recomendaes
Mtodos rpidos carecem de sensibilidade e especificiadade para anlise direto do alimento
Enriquecimento considerado um fator limitante (Temp), porm dilui os efeitos dos inibidores, diferencia viveis de VPNC, reparo do stress ou injria celular
Tendncia de uso do qPCR multiplex Mltipla deteco / anlise de rotina
104
Concluso e Recomendaes
Falta consenso de como conduzir os experimentos e interpretar dados
Exemplo: h muitos mtodos qPCR para E. coli O157:H7 e Salmonella que podero:
Confundir e ser massacrante para o usurio Qual validar?
105
Concluso e Recomendaes
Devido a alta sensibilidade do (RT-)qPCR pequenas diferenas no preparo de amostra, amplificao e expresso dos dados tem impacto nos resultados
Incluso de vrios controles em cada etapa
SYBR Green o corante mais barato, apresenta um resultado robusto e sensvel
106
Concluso Final
Estudos futuros:
Estudos envolvendo diferentes etapas de processos industriais
Expresso dos genes do alvo de interesse
Buscar a melhoria no limite de deteco, a fim de se obter maior sensibilidade do mtodo
107
Opinio Pessoal
Devido a complexidade do mtodo (RT-)qPCR, deve se levar sempre em considerao:
Custo dos reagentes/kits Necessidade de haver pessoal tcnico especializado para a
realizao do trabalho Resultado em curto perodo de tempo Mtodo simples Sensvel para detectar baixos nveis de micro-organismos e
preciso
108
Referncias BAM online: Rapid methods for detecting foodborne, 2001 Castelani, L. & Duarte, K. M. R. Mtodos moleculares em microbiologia de alimentos, PUBVET, 5
(2), 2011 Destro, M.T. Listeria em camaro (Penaeus brasiliensis): marcadores sorolgicos e genticos no
monitoramento de sua disseminacao em uma unidade processadora de pescado, 1995. (Tese de Doutorado)
Di, R & Tumer, N.E. Real-time reverse transcriptase for detection of shiga toxin-producing Eschrichia coli O157:H7 in food, J. Food Safety, 30, 51-66, 2010
Farber, J.M. et al. Rapid methods for detection, identification, and enumeration. Chapter 10, 11.6 Rapid PCR-Based Methods. APHA, 2001
Frder, H. Desenvolvimento de mtodos para a quantificao direta de Salmonella sp. por PCR-tempo real e por transcriptase reversa-PCR-tempo real, 2008. (Tese de doutorado)
Gandra, E.A. et al. Tcnicas moleculares aplicadas microbiologia de alimentos, Acta Sci. Technol., 30 (1), 109-118, 2008
109
Referncias Josefsen, M. H. et al. Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses,
using real-time PCR and propidium monoazide treatment, as a tool for quantitative risk assessment. AEM, 76 (15), 5097-5104, 2010
Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food, AEM, 70(12), 7046-7052, 2004
Mocellin et al. TRENS in Molecular Biology,2003 Novais, C.M.& Pires-Alves, M. PCR em tempo real, Rev. Biotec. Cin & Desenvol., 33, 2004 Postollec, F. et al. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology.
Food Microbiology, 28, 848-861, 2011 Sacchi,C. et al. Incorporation of Real-time PCR into routine public health surveillance of culture
negative bacterial meningitidis in Sao Paulo, Brazil, Plos ONE, 6 (6), 2011 Valasek, M. & Repa, J. J. The power of real-time PCR. Adv. Physiol. Edu, 2005 Wong, M. L. & Medrano. J. Real-time PCR for mRNA quantification, BioTechniques, 39:75-85, 2005
110
111
"Ora a f o firme fundamento das coisas que se operam e uma demonstrao das que no se veem"
Hebreus 11,1
Muito Obrigado!Hans Frder
[email protected](011) 5097 7888
112
113
Slide 1Slide 2Slide 3Slide 4Slide 5Slide 6Slide 7Slide 8Slide 9Slide 10Slide 11Slide 12Slide 13Slide 14Slide 15Slide 16Slide 17Slide 18Slide 19Slide 20Slide 21Slide 22Slide 23Slide 24Slide 25Slide 26Slide 27Slide 28Slide 29Slide 30Slide 31Slide 32Slide 33Slide 34Slide 35Slide 36Slide 37Slide 38Slide 39Slide 40Slide 41Slide 42Slide 43Slide 44Slide 45Slide 46Slide 47Slide 48Slide 49Slide 50Slide 51Slide 52Slide 53Slide 54Slide 55Slide 56Slide 57Slide 58Slide 59Slide 60Slide 61Slide 62Slide 63Slide 64Slide 65Slide 66Slide 67Slide 68Slide 69Slide 70Slide 71Slide 72Slide 73Slide 74Slide 75Slide 76Slide 77Slide 78Slide 79Slide 80Slide 81Slide 82Slide 83Slide 84Slide 85Slide 86Slide 87Slide 88Slide 89Slide 90Slide 91Slide 92Slide 93Slide 94Slide 95Slide 96Slide 97Slide 98Slide 99Slide 100Slide 101Slide 102Slide 103Slide 104Slide 105Slide 106Slide 107Slide 108Slide 109Slide 110Slide 111Slide 112Slide 113