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1 Métodos moleculares Métodos moleculares aplicados à aplicados à microbiologia de microbiologia de alimentos alimentos Hans Fröder XII Workshop em Alimentos Lajeado/RS, 5 a 6 de outubro 2011

Métodos moleculares aplicados à microbiologia de alimentos · 1 Métodos moleculares aplicados à microbiologia de alimentos Hans Fröder XII Workshop em Alimentos Lajeado/RS, 5

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  • 1

    Mtodos moleculares Mtodos moleculares aplicados aplicados

    microbiologia de microbiologia de alimentosalimentos

    Hans FrderXII Workshop em AlimentosLajeado/RS, 5 a 6 de outubro 2011

  • Tendncia Mundial

    Qualidade e Inocuidade dos Alimentos:

    Monitoramento dos Riscos

    Anlise FQ Anlise Microscpica Anlise Microbiolgica

    2

  • Qualidade dos Alimentos

    Verificada pelos MO Indicadores:

    Bactrias aerbias mesfilas, psicrotrficas e termfilas S. aureus homem veiculador Fungos limpeza do local Contaminao fecal (coliformes T,TT, E. coli) Enterobacteriaceae (preferncia)

    3

  • Inocuidade

    Verificada pelos patgenos:

    Gram-positivos (intoxicao)

    Gram-negativos (infeco)

    Fungos produtores de micotoxinas

    Vrus

    4

  • 5

    B. cereus S. aureus L. monocytogenes

    E. coli Salmonella Campylobacter

  • 6

    Aspergillus Penicillium Fusarium

    Rotavrus Norwalk Poliomielite

  • 7

    Excretas de rato (6,5x) Plo de rato (400x)Brbula de pombo (200x)

    caro (25x) caro (30x) caro (200x)

  • 8

    75% novas doenas = patgenos oriundos de animais / produtos

  • 9

    Produo industrial dealimentos de origem animal

    Intercmbio internacional de animais/ produtos

    http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.setor1.com.br/textos/carnes/FD00997_.gif&imgrefurl=http://www.setor1.com.br/carnes/index.htm&h=364&w=420&sz=12&hl=pt-BR&start=2&tbnid=sRHUZnpV_M3i7M:&tbnh=108&tbnw=125&prev=/images%3Fq%3Dprodutos%2Bde%2Borigem%2Banimal%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DG
  • 10

    Introduo e disseminao de patgenos

  • 11

    Mtodos de anlise eficientes

    Preocupao por parte das autoridades

    de sade pblicaImplementao de programas

    de controle microbiolgico

    Empresas e consumidores

    Mt. tradicional ISO: incentivo mtodos sensveisescolha mt. rpido: custo, aceito

  • Mtodos de Verificao

    Mtodos tradicionais / cultivo / clssicos

    Mtodos alternativos / rpidos Por que a procura? Para que servem? Usado em que situaes?

    12

  • Mtodos Tradicionais

    Meios de cultura no seletivos, seletivos, complementados por provas bioqumicas

    Utilizam testes morfolgicos

    Testes sorolgicos

    13

  • Mtodos Tradicionais

    Problemas

    Trabalhosos / requerem muito material Demorados Requerem laboratorista treinado Sujeito a falhas na interpretao dos resultados Sensibilidade insuficiente (capacidade de detectar) Especificidade insuficiente (detectar apenas o alvo) Repetitividade baixa (resultado no ser o mesmo) Reprodutividade baixa (resultado estatisticamente diferente)

    14

    Que demora!

  • Mtodos Tradicionais

    Farber et al. (2001)

    Resultados de testes bioqumicos podem apresentar variabilidade pela ao de fatores ambientais sobre a expresso gnica

    Baixo poder discriminatrio Risco de interpretaes errneas Utilizao de um nmero grande de determinaes

    microbiolgicas (custo de anlise muito elevado)

    15

  • Mtodos Tradicionais

    Martin et al. (2006)

    Mtodos tradicionais, embora confiveis e eficientes, requerem vrios dias a semanas

    Propriedade fenotpicas pelas quais as bactrias so identificadas podem no ser expressas e quando so, podem ser difcies de ser interpretadas e classificadas

    Possibilidade de clulas VPNC

    16

  • Mtodos

    1993 at 2000 = surgimento de inmeros mtodos comerciais em pases desenvolvidos (bioluminescncia, imunolgicos, bioqumicos, moleculares, impedncia/condutncia, etc)

    Atualmente: maior controle do mercado

    17

  • Objetivo dos Mtodos Alternativos

    Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica

    Aumentar a confiabilidade dos resultados (kit)

    Aumentar a preciso dos resultados

    Tcnico treinado18

  • Mtodos Alternativos

    Nas ltimas dcadas, verificou-se aumento significativo no desenvolvimento de tcnicas moleculares para deteco, identificao e caracterizao de bactrias patognicas

    Destro (1995) Avanos, nos estudos de biologia molecular, propiciam o

    desenvolvimento e emprego de vrios mtodos de tipagem molecular

    19

  • 20

    Tcnica Aplicao Metodologia

    Perfil plasmidial Tipificao Extrao de DNA plasmidial, corte com enzimas e

    eletroforese

    REA Ferramenta epidemiolgicaExtrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e

    eletroforese

    Ribotipagem Tipificao (cpia de genes ribossomais)Extrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e

    eletroforese

    PFGE Ferramenta epidemiolgica Mudana repetida da orientao do campo eltrico

    RAPDAmplifica DNA em condies de baixa

    estringncianico primer, no sendo necessrio saber a regio de

    ligao

    RT-PCRExpresso de genes (virulncia, toxinas),

    RNA viralRNA extrado convertido para cDNA que amplificado

    por PCR

    Nested PCR Tipificao Grupo de primers (amplificao); outro grupo de primers

    (re-amplificao)

    Multiplex PCR Tipificao Uso de mais de um par de primers na mesma reaoREP-, ERIC-, BOX-(PCR)

    Identificao e tipificao (gnero, espcie, subespcie)

    Uso de primers de consenso; amplifica regies entre estes elementos repetitivos

    RFLP-PCRAnlise do polimorfismo do tamanho de

    fragmento de restrioFragmentos amplificados por PCR; digesto por uma ou

    mais endonucleases

    PCR ribotipagem Identificao e tipificao Amplificao de sequncias conservadas 5S, 16S e 23S

    do operon do RNAr

    PCR tempo real Deteco e quantificaoPCR convencional ; sondas fluorescentes; interpretao do

    espectro gerado

  • 21

    Tcnica Vantagens Desvantagens Referncias

    Perfil plasmidial Informaes epidemiolgicas

    Perda ou ganho de plasmdio; pouco valor para bactrias com

    baixa incidncia Kolstad et al. (1992)

    REA Uso de endonuclease

    Dificuldade de interpretao visual dos perfis (centenas de

    bandas) Wojciech et al. (2004)Ribotipagem Bandas mais visveis e comparveis custo elevado Aarestrup (2006)

    PFGE Agarose mantm DNA intacto

    DNA de alto peso molecular pode ser submetido digesto

    pela endonuclease Arbeit et al. (1990)

    RAPD Detectar polimorfismos do DNA

    Escolha de iniciadores que originem resultados

    reproduzveis Welsh & McClelland (1990)

    RT-PCR Amplifica DNA obtido por meio de TR de RNA Tang & Persing (1999)

    Nested PCR Diversos ciclos de amplificao Konemann et al. (2001)

    Multiplex PCRAmplifica diferentes alvos de microrganismos,

    uso na rotina, baixo R$

    Reduo na sensibilidade de deteco; necessidade de

    ensaios preliminares Tang & Persing (1999)

    REP-, ERIC-, BOX-(PCR) Uso em diferentes regies do genoma

    Amplificao de sequncias inespecficas (ERIC) Gillings & Holley (1997)

    RFLP-PCR Associao da tcnica PFGE Farber et al. (2001)PCR ribotipagem Uso para diferenciar espcies Shangkuan et al. (2000)

    PCR tempo realEstudos quantitativos, tubo fechado, no h

    necessidade de eletroforese custo elevado Heid et al. (1996)

  • Mtodos Alternativos

    Tcnicas genotpicas referem-se caracterizao do DNA cromossmico, plasmidial ou total de um micro-organismo, caractersticas relativamente estveis

    Tcnicas moleculares: Aplicao direta na deteco e caracterizao de bactrias

    patognicas em alimentos Destaca-se a PCR (Boer e Beumer, 1999; Farber, 1996;

    Malorny et al. (2003)

    22

  • 23

    Reviso

  • 24

    Informao para produzir determinada protena

  • 25

    Primer Polimerase

    Thermus aquaticus (Taq)

  • Exemplo de mistura para reao qPCR

    26

    400 nM primers (de cada 1 do par)250 nM sonda200 M de cada dGTP, dATP, dCTP400 M dUTP*Tampo PCR (Tris-HCl, pH 8,4)50 mM KCl4,5 mM MgCl21 U Platinum Taq polimeraseDNA ou RNA alvoH2O Ultra-pura

    *dUTP suscetvel hidrlise pela enzima bacteriana uracil-N-glicosilase. Adio da enzima na mistura PCR permite hidrlise seletiva e remoo dos produtos de amplificao contaminante da mistura de PCR

  • 27

  • 28

  • Mtodos Rpidos (PCR)

    It is difficult to find a journal that does not describe

    some use of these techniques (APHA, 2001)

    difcil encontrar uma revista cientfica que no descreva algum uso destas tcnicas

    29

  • Reao da Polimerase em Cadeia(PCR)

    Kary B. Mullis (1983): inveno da PCR

    Tcnica altamente sensvel

    Pequenas quantidade de sequncias de DNA ou RNA especficas podem ser enzimaticamente amplificadas, at que sejam obtidas milhes de cpias da sequncia alvo

    30

  • 31

  • PCR

    32

  • 33

    Nao! Quantificar

    Detectar ?

  • 34

    PCR Sistema Aberto

    (deteco)

  • 35

    PCR- Sistema Fechado(BAX System)

    Sim

    No

    3. Deteco

    Amostra

    2. Amplificao

    pr-enriquec. MO: est ou no est ?

    resposta

  • 36

    Resultados do rack reportdo BAXSystem para deteco de Listeria monocytogenes

  • 37

    Perfil da curva de fuso (melting curve) do controle interno

    Perfil da curva de fuso (melting curve) de Listeria monocytogenes da amostra positiva

  • Aprovao MAPA - Salmonella

    INSTRUO NORMATIVA N 41, DE 7 DE JUNHO DE 2004 VALIDAO DA METODOLOGIA UTILIZADA PELO SISTEMA DE DETECO PATOGNICA PARA ALIMENTOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS - A-BAX PARA DETECO DE SALMONELLA SPP EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS, GUA E AMOSTRAS AMBIENTAIS-SWAB, COMO MTODO ALTERNATIVO EQUIVALENTE AO MTODO DE REFERNCIA DO MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO MAPA

    38

  • Aprovao MAPA - Listeria

    INSTRUO NORMATIVA N 40, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2005. ISOLAMENTO E IDENTIFICACAO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM CARNE VERMELHA, CARNE DE AVE, OVOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS, MLG 8.04 METODOLOGIA ALTERNATIVA DE LISTERIA A-BAX MLG-8 A .01

    39

  • 40

    Segunda gerao de mtodos que empregam a PCR (qPCR)

    Amplificao e deteco em uma nica reao em tubo fechado

    Baixo risco de contaminao

    Deteco do aumento do nmero de cpias do DNA alvo medida que a reao realizada

    Reduo do tempo de anlise

    Ciclo

    Cpia inicial

    PCRCiclo 1

    PCRCiclo 2

    2XCpias

    30-45 Ciclos

    4XCpias

    monitora o progresso da PCR em TR

    PCR-tempo real (qPCR)

  • Exemplos de qPCR

    41

  • 42

    FRET

    Corantes fluorognicos ligados

    Sntese de DNA e clivagem da Sonda - 5exonuclease

    Deteco / PCR-RT marcadores fluorognicossonda: hibrid.reg. internas

    Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003

  • Curva de amplificao da qPCR

    43

    Ct Threshold cycle

  • 44

    Amostras so inseridas no termociclador que controla a temperatura de cada ciclo da PCR

    Amostras so excitadas e a fluorescncia mensurada por um fotodetector em cada ciclo da PCR

    LED (light-emitting diode)

    Fonte: Valasek & Repa, 2005

  • Comparao entre tcnicas fenotpicas e genotpicas

    Gandra et al. (2008)

    Tempo de anlise menor para as tcnicas baseadas em PCR

    Resultados em 6 a 8 h Resutados falso-positivos (amplificao de DNA proveniente

    de clulas mortas) Viabilidade de micro-organismos presentes (RNA) Preparo da amostra, incluso de um IAC, purificao do

    DNA/RNA

    45

  • PCRVantagens qPCR

    Maior alcance dinmico na deteco

    Nenhum processamento ps-PCR Alta sensibilidade Coleta de dados na fase

    exponencial da PCR Um aumento no sinal reprter

    fluorescente diretamente proporcional ao nmero de amplicons gerados

    A sonda clivada fornece um registro permanente de amplificao de um amplicon

    Desvantagens PCR convencional Baixa preciso Baixa sensibilidade Baixa resoluo No automatizado Discriminao baseada apenas no

    tamanho do amplicon Resultados no so expressos

    como nmeros Brometo de etdio para a colorao

    no quantitativa Ps-processamento da PCR

    46

  • Preparo de amostras

    Rodrguez-Lzaro et al. (2007)

    Garantir boa homogeneizao Aumentar a concentrao do organismo alvo Reduzir ou excluir substncias inibitrias (etapa de enriquecimento) Procedimentos de pr-amplificao devem ser adaptados para cada

    matriz alimentcia variao na homogeneidade; consistncia; composio e microbiota

    47

  • Outras metodologias para o preparo de amostras

    Glynn et al. (2006)

    Filtrao Centrifugao Uso de detergentes e solventes orgnicos Tratamento com enzimas Incluso de aditivos na PCR (BSA) Diluio da amostra

    48

  • Limitaes da PCR

    Farber et al. (2001); Glynn et al. (2006); Martin et al. (2006)

    Alto custo inicial

    Falta de legislao que padronize e valide estas tcnicas

    Desenvolvimento de sistemas automotivos (extrao, purificao)

    49

  • Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos

    Postollec et al. (2011)

    qPCR: detectar, identificar, quantificar micro-organismos

    ISO: deteco de patgenos por PCR (ISO 22174:2005; ISO/TS 20836:2005; ISO 20837:2006; ISO 20838:2006)

    Fase inicial: expresso gnica; multiplicao e atividade microbiana em matrizes complexas para controles industriais

    50

  • Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos

    PCR: > rapidez, sensibilidade e especificidade detecta populaes dominantes, sub-dominantes, clulas

    mortas ,VPNC, quantifica genes e expresso gnica

    Automao: Isolamento do cido nucleico e preparo qPCR (barato e adequado para rotina)

    51

  • Implementao do qPCR no Laboratrio

    52

  • Viso do administrador

    53

    Terror!

  • Viso do tcnico

    54

    astro da magia!

  • Viso do cliente

    55

    soluo dos problemas!

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Extrao do cido nucleico Componente mais importante para assegurar

    reprodutibilidade

    Uso de kits comerciais ou com adaptaes dependendo da matriz

    RNA: extrao laborosa, especialmente em matrizes complexas ou gordurosas

    fcil degradao, rapidamente analisado

    56

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Deteco qumica Disponibilidade de vrios sistemas

    Modo de ao, vantagens e limitaes

    Mais usados na Micrbiologia de Alimentos: DNA binding dye (SYBR Green) Hydrolisis Probe (5 nuclease assay)

    57

  • Sistema SYBR Green

    58

  • Sistema TaqMan

    59

  • 60

  • 61

    Tipos de sistemas qumicos usados para a deteco na qPCR

    Fonte: Wong & Medrano, 2005

  • Custo dos sistemas qumicos de deteco

    62

  • Consideracoes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Mtodos de quantificao

    Escolha de uma curva padro (Absoluta ou Relativa)

    Eficincia de amplificao:[10-1/slope] 1 = 1

    PCR no apresenta eficincia ideal presena de inibidores; variabilidade nos nucleotdeos

    63

  • 64

    Curvas de amplificao: - relao do sinal fluorescente

    versus o nmero de ciclos da PCR

    Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003

    Curva padro: - R2 =coeficiente de regresso

    linear dos dados gerada- clculo da EA

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    RT-qPCR

    nica ou duas etapas nica etapa nica tubo

    menor risco de contaminao do DNA minimiza o risco de variao experimental maior degradao do RNA

    65

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    RT-qPCR

    Duas etapas RT independente da qPCR Melhor quando a mesma amostra de RNA utilizada

    66

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Variaes experimentais da RT-qPCR

    Tcnica de alta sensibilidade Variabilidade nos resultados Triplicatas (RNA; cDNA ou DNA)

    67

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Controles Devem ser includos para avaliar a contaminao do alvo

    (DNA, eficincia da RT, variaes no M Mix Controle negativo (contaminado com no-alvo) Controle positivo (contaminado com o alvo) Branco (gua) 96 amostras (vrios Brancos) IAC: possibilita identificar substncias inibidoras da PCR

    68

  • Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

    Modo de expresso

    Quantificao absoluta UFC/mL ou GEq/mL (GEq ou cpias DNA/mL) GE/mL = nr. de cpias do gene alvo Diferenas entre UFC/GEq (clulas mortas, lise incompleta)

    Quantificao relativa Nvel de expresso (gene, RNAr) da amostra para amostra

    controle cDNA alvo/DNA espcie alvo

    69

  • Aplicaes da qPCR

    70

  • Desenvolvimento de um ensaio para quantificao de Salmonella empregando a qPCR

    Frder et al. 2008

    13 sunos (4 semanas de idade) oramente contaminados com S.Typhimurium DT 104

    Dose Infectiva: ~ 6 x 109 UFC/mL/animal Material fecal colhido geralmente nos dias 1, 2, 3, 4, 6, 8, 13, 15, 20, 22 e 28 aps

    infeco

    71

  • 72

    Quantificao por qPCR Quantificao por mtodo

    clssicoTratamento Pr-PCR (200-220 mg de

    fezes )

    Fezes coletadas via retal

    Diluio 1:10 em 1% BPW

    Semeadura superficial 100 L sobre XLDNal50 com SPEnsaio qPCR

    Incubao (48 h /37C)

    Contagem bacteriana automtica (ProtoCOL)

    Confirmao sorolgica

    Protocolo para quantificao de Salmonella em material fecal

  • Protocolo para quantificao de Salmonella em fezes sunas por qPCR

    QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) Material: 200-220 mg

    Ensaio qPCR:Malorny et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. AEM, 2004 Fragmento de 94 pb do locus ttr especfico para SalmonellaSonda TaqMan FAM-DQ

    Curva Padro: 1 107 clulas direto na qPCR6,5 x 105 6,5 cpias de DNA (aps Qiagen Kit) Anlise dos dados baseado no valor Ct

    73

  • 74

    Quantificao de Salmonella em fezes sunas naturalmente contaminadas empregando mtodo

    clssico e qPCRSmbolos fechados: qPCR

    Smbolos vazados: Spiral Plater

  • Valores mdios de UFC eq de Salmonella e Ct mdios obtidos para as curvas padro de fezes naturalmente contaminadas e submetidas

    ao qPCR, aps tratamento com QIAamp DNA Stool Kit

    75

    Salmonella (UFC/mL DP)

    Salmonella qPCR

    (UFC eq)

    Salmonella (UFC eq)

    Ct DP*

    1,3 x 108 1,5 x 107 6,5 x 105 9,3 x 105 6,1 x 104 18,8 0,33 1,3 x 107 1,5 x 106 6,5 x 104 1,1 x 105 2,6 x 104 22,1 0,16 1,3 x 106 1,5 x 105 6,5 x 103 8,0 x 103 1,7 x 103 25,3 0,18 1,3 x 105 1,5 x 104 6,5 x 102 9,9 x 102 1,0 x 102 28,8 0,40 1,3 x 104 1,5 x 103 6,5 x 101 1,1 x 102 2,9 x 101 31,9 0,38 1,3 x 103 1,5 x 102 6,5 x 100 9,6 x 100 1,4 x 100 35,4 0,59 1,3 x 102 1,5 x 101 0,65 0,65 > 45

    populao de Salmonella obtida no gar XLDNal50

    desvio padro (DP)

    populao de Salmonella em UFC eq definida na janela de deteco da PCR-RT

    populao de Salmonella em UFC eq obtida por PCR-RT

    *Ct - ciclos da PCR cujo sinal fluorescente atingiu o limiar de deteco desvio padro (DP)

  • 76

    Combinao de qPCR; qPCR-PMA; tradicional PMA: corante que intercala na dupla fita de clulas mortas

    n= 50 carcaas naturalmente contaminadasMtodo PMA-PCR: 100% de especificidade

    Mtodo ISO 10272-1: trabalhoso, requer muito tempo, no detecta VPNC

  • 77

    Resultados de qPCR (preto), qPCR com tratamento PMA (cinza) e o mtodo tradicional (branco)

    Correlao entre ISO e qPCR foi maior do que a correlao com qPCR-PMAConsideraes do qPCR-PMA: estado celular (viva ou morta), permeabilidade da parede celular

    ou se PMA entrou em pequenas fraes em clulas cultivveis

  • 78

    Limite de quantificao qPCR e qPCR-PMA

    102 UFC/mL

  • 79

    Primers para deteco de genes de virulncia e sorotipo de E. coli O157:H7

    RNA bacteriano em concentraes de 102 e 103 UFCInoculao artificial em suco, alface e carne

    Concentrao do inculo empregando 2 filtraes (0,45 m e 0,2 m)Tempo analtico: 4 h

  • 80

    Protena intimina

    Antgeno flagelar H7

    Hemolisina

    Antgeno somtico O157 Controle interno

  • 81

  • 82

    Validao in-house para deteco especfica de Salmonella em alimentosValidao requer: desenho de primers e sonda especficos

    Teste de inclusividade e exclusividade110 alimentos artificialmente contaminados

  • 83

    IAC: fragmento de DNA artificial e inserido em cada mistura de reao

  • 84

  • 85

  • 86

    Sensibilidade: nmero total de culturas ou colnias positivas corretamente obtidasEspecificidade: nmero total de culturas ou colnias negativas obtidas

  • 87

    Estudo de validao qPCR multiplex (12 hospitais de SP) e identificao de fatores associados com cultura negativas* e PCR positivas

    Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae Tipo b causam meningite em recm nascidos

    Brasil: 28.000 casos/ano

    *devido uso de antibiticos

  • 88

    Caractersticas dos 499 pacientes envolvidos no estudo

    Caractersticas Nr. (%)

    Sexo masculino 301 (60.9%)Faixa etria mdia 9 anos (082)Mortos 40 (9.6%)Culture-positiveN. meningitidis 107 (21.4%)S. pneumoniae 50 (10.0%)H. influenzae 5 (1.0%)CSF 100 WBCs e 60% PMNs 460 (93.7%)Cultura positiva, 1 dos 3 alvos 123Cultura negativa 337Ensaio antibitico CSF positivo 142 (34.6%)

    CSF Fluido crebro-espinhal; WBC clulas sanguneas brancas; PMNs clulas polimorfonucleares

  • 89

    Mtodo 1** cultura positiva para um patgeno e os outros dois negativos na qPCRMtodo 2*** cuturas negativas, com critrio CSF de 100 leuccitos/mm3 e 60 neutrfilosMetodo 3**** culturas positivas para o segundo alvo, porm removidas no clculo da sensibilidade

    Risco de cultura + qPCR = presena de antibiticos no fluido crebro-espinhal

  • 90

    nica etapa nica tuboDuas etapas RT independente da qPCR

    Emprego de duas enzimas (RT e DNA polimerase)Quantificao absoluta ou relativa

  • 91

    Extrao do mRNA alvo

    Purificao do mRNA

    mRNA

    Transcriptase reversa (RNA polimerase)

    RT-PCR Sntese de DNA complementar (cDNA)

    Reao de PCR

    DNA dupla-fita (mltiplas cpias)

  • Viabilidade obtida para S. Typhimurium 51K61 no modelo ave durante o perodo de 165 h aps a

    inoculao

    92

    Viabilidade: relao cp. RNA (UFCeq do tuf-RNA ) e cp. DNA (UFCeq tuf )Viabilidade: capacidade de metabolizar componentes

    Expresso do gene tuf

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    qPCR = deteco e quantificao (bactrias*, fungos e vrus)*Salmonella, Lm, Sa, Ec O157:H7

    Vantagens: Tempo analtico menor

    Lm (2 dias) Salmonella (26 h ou algumas horas) Clostrdios (1 dia) Bc (2 h)

    93

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    Ct similar s contagens em placa

    Limites de quantificao sem enriquecimento da amostra: 102 103 UFC/g ou mL

    Ideal: qPCR + enriquecimento de poucas horas Salmonella e Lm (

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    Reduzir os nveis de deteco Combinar :

    PCR ou Filtrao ou Centrifugao 10-100 UFC/g (Salmonella e C. jejuni) em 3 h Mtodo: centrifugao por densidade + qPCR

    qPCR: correlao com plaqueamento (5 logs)

    Discrepncias: contagens maiores no plaqueamento

    95

  • Discrepncia de logs

    96

    Populaes mdias de S. Typhimurium obtidas em alimento-modelo (suno) incubado a 20 C e determinada por RT-qPCR (tuf-RNA), qPCR- (tuf) e semeadura em gar XLD

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    Motivos das discrepncias:

    Volumes diferentes (1 mL ou 0,1 mL versus 5 L) Presena de DNA intacto de clulas mortas Presena de formas VPNC 1 UFC pode ser gerada por mais uma clula Uso de primers para o alvo variando nmeros de

    multicpias dos genes

    97

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    Quantificao de patgenos: Considerar

  • Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

    Tendncia atual: multiplex no mesmo tubo de reao Diferencia rapidamente de gnero ou espcie

    Exemplos: E.coli O157:H7, Salmonella spp., Lm presente em leite e carne Campylobcter, Salmonella spp. em frango

    99

  • qPCR: deteco de no-patognicos

    Deteco e quantificao de bactrias processos fermentativos (LAB) Propriedades organolpticas

    Queijo Enterococcus gilvus (LD:104 UFC/g) Queijo Corynebacterium casei (LQ: 105 UFC/g) Probiticos Bifidobacterium (LD: 102 UFC/g) (16 rRNA)

    qPCR: monitoramento de alteraes causadas por fungos (maturao de queijos)

    Penicillium roqueforti Penicillium camemberti

    100

  • qPCR: deteco de no-patognicos

    Limitaes do qPCR: substitudas pelo RT-qPCR

    RT-qPCR: pouco usado Dificuldade na extrao de RNA Disponibilidade de kits Instrumentos (ready-to-use) checagem de RNA integral

    101

  • RT-qPCR e avaliao de risco

    Problemas recorrentes Mtodos moleculares: deteco de micro-organismos mortos

    Estratgias de diferenciao de cl.vivel/mortas EMA/PMA (aplicado antes da extrao de DNA)

    inativao da clula vivel e inibio da PCR Incluso da etapa de enriquecimento Sistemas de filtrao Tratamento com DNAse I (vivel e esporos)

    102

  • Concluso e Recomendaes

    Deteco e quantificao de patgenos esto sendo amplamente estudados na MA

    Resulado positivo pelo mtodo rpido ser considerado presuntivo e dever ser confirmado pelo tradicional

    A confirmao extende a anlise por vrios dias, isso no pode ser visto como fator limitante (devido a ter negativos)

    103

  • Concluso e Recomendaes

    Mtodos rpidos carecem de sensibilidade e especificiadade para anlise direto do alimento

    Enriquecimento considerado um fator limitante (Temp), porm dilui os efeitos dos inibidores, diferencia viveis de VPNC, reparo do stress ou injria celular

    Tendncia de uso do qPCR multiplex Mltipla deteco / anlise de rotina

    104

  • Concluso e Recomendaes

    Falta consenso de como conduzir os experimentos e interpretar dados

    Exemplo: h muitos mtodos qPCR para E. coli O157:H7 e Salmonella que podero:

    Confundir e ser massacrante para o usurio Qual validar?

    105

  • Concluso e Recomendaes

    Devido a alta sensibilidade do (RT-)qPCR pequenas diferenas no preparo de amostra, amplificao e expresso dos dados tem impacto nos resultados

    Incluso de vrios controles em cada etapa

    SYBR Green o corante mais barato, apresenta um resultado robusto e sensvel

    106

  • Concluso Final

    Estudos futuros:

    Estudos envolvendo diferentes etapas de processos industriais

    Expresso dos genes do alvo de interesse

    Buscar a melhoria no limite de deteco, a fim de se obter maior sensibilidade do mtodo

    107

  • Opinio Pessoal

    Devido a complexidade do mtodo (RT-)qPCR, deve se levar sempre em considerao:

    Custo dos reagentes/kits Necessidade de haver pessoal tcnico especializado para a

    realizao do trabalho Resultado em curto perodo de tempo Mtodo simples Sensvel para detectar baixos nveis de micro-organismos e

    preciso

    108

  • Referncias BAM online: Rapid methods for detecting foodborne, 2001 Castelani, L. & Duarte, K. M. R. Mtodos moleculares em microbiologia de alimentos, PUBVET, 5

    (2), 2011 Destro, M.T. Listeria em camaro (Penaeus brasiliensis): marcadores sorolgicos e genticos no

    monitoramento de sua disseminacao em uma unidade processadora de pescado, 1995. (Tese de Doutorado)

    Di, R & Tumer, N.E. Real-time reverse transcriptase for detection of shiga toxin-producing Eschrichia coli O157:H7 in food, J. Food Safety, 30, 51-66, 2010

    Farber, J.M. et al. Rapid methods for detection, identification, and enumeration. Chapter 10, 11.6 Rapid PCR-Based Methods. APHA, 2001

    Frder, H. Desenvolvimento de mtodos para a quantificao direta de Salmonella sp. por PCR-tempo real e por transcriptase reversa-PCR-tempo real, 2008. (Tese de doutorado)

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    Mocellin et al. TRENS in Molecular Biology,2003 Novais, C.M.& Pires-Alves, M. PCR em tempo real, Rev. Biotec. Cin & Desenvol., 33, 2004 Postollec, F. et al. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology.

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    "Ora a f o firme fundamento das coisas que se operam e uma demonstrao das que no se veem"

    Hebreus 11,1

  • Muito Obrigado!Hans Frder

    [email protected](011) 5097 7888

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