1

Mtodos moleculares Mtodos moleculares aplicados aplicados

microbiologia de microbiologia de alimentosalimentos

Hans FrderXII Workshop em AlimentosLajeado/RS, 5 a 6 de outubro 2011

Tendncia Mundial

Qualidade e Inocuidade dos Alimentos:

Monitoramento dos Riscos

Anlise FQ Anlise Microscpica Anlise Microbiolgica

2

Qualidade dos Alimentos

Verificada pelos MO Indicadores:

Bactrias aerbias mesfilas, psicrotrficas e termfilas S. aureus homem veiculador Fungos limpeza do local Contaminao fecal (coliformes T,TT, E. coli) Enterobacteriaceae (preferncia)

3

Inocuidade

Verificada pelos patgenos:

Gram-positivos (intoxicao)

Gram-negativos (infeco)

Fungos produtores de micotoxinas

Vrus

4

5

B. cereus S. aureus L. monocytogenes

E. coli Salmonella Campylobacter

6

Aspergillus Penicillium Fusarium

Rotavrus Norwalk Poliomielite

7

Excretas de rato (6,5x) Plo de rato (400x)Brbula de pombo (200x)

caro (25x) caro (30x) caro (200x)

8

75% novas doenas = patgenos oriundos de animais / produtos

9

Produo industrial dealimentos de origem animal

Intercmbio internacional de animais/ produtos

http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.setor1.com.br/textos/carnes/FD00997_.gif&imgrefurl=http://www.setor1.com.br/carnes/index.htm&h=364&w=420&sz=12&hl=pt-BR&start=2&tbnid=sRHUZnpV_M3i7M:&tbnh=108&tbnw=125&prev=/images%3Fq%3Dprodutos%2Bde%2Borigem%2Banimal%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DG

10

Introduo e disseminao de patgenos

11

Mtodos de anlise eficientes

Preocupao por parte das autoridades

de sade pblicaImplementao de programas

de controle microbiolgico

Empresas e consumidores

Mt. tradicional ISO: incentivo mtodos sensveisescolha mt. rpido: custo, aceito

Mtodos de Verificao

Mtodos tradicionais / cultivo / clssicos

Mtodos alternativos / rpidos Por que a procura? Para que servem? Usado em que situaes?

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Mtodos Tradicionais

Meios de cultura no seletivos, seletivos, complementados por provas bioqumicas

Utilizam testes morfolgicos

Testes sorolgicos

13

Mtodos Tradicionais

Problemas

Trabalhosos / requerem muito material Demorados Requerem laboratorista treinado Sujeito a falhas na interpretao dos resultados Sensibilidade insuficiente (capacidade de detectar) Especificidade insuficiente (detectar apenas o alvo) Repetitividade baixa (resultado no ser o mesmo) Reprodutividade baixa (resultado estatisticamente diferente)

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Que demora!

Mtodos Tradicionais

Farber et al. (2001)

Resultados de testes bioqumicos podem apresentar variabilidade pela ao de fatores ambientais sobre a expresso gnica

Baixo poder discriminatrio Risco de interpretaes errneas Utilizao de um nmero grande de determinaes

microbiolgicas (custo de anlise muito elevado)

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Mtodos Tradicionais

Martin et al. (2006)

Mtodos tradicionais, embora confiveis e eficientes, requerem vrios dias a semanas

Propriedade fenotpicas pelas quais as bactrias so identificadas podem no ser expressas e quando so, podem ser difcies de ser interpretadas e classificadas

Possibilidade de clulas VPNC

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Mtodos

1993 at 2000 = surgimento de inmeros mtodos comerciais em pases desenvolvidos (bioluminescncia, imunolgicos, bioqumicos, moleculares, impedncia/condutncia, etc)

Atualmente: maior controle do mercado

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Objetivo dos Mtodos Alternativos

Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica

Aumentar a confiabilidade dos resultados (kit)

Aumentar a preciso dos resultados

Tcnico treinado18

Mtodos Alternativos

Nas ltimas dcadas, verificou-se aumento significativo no desenvolvimento de tcnicas moleculares para deteco, identificao e caracterizao de bactrias patognicas

Destro (1995) Avanos, nos estudos de biologia molecular, propiciam o

desenvolvimento e emprego de vrios mtodos de tipagem molecular

19

20

Tcnica Aplicao Metodologia

Perfil plasmidial Tipificao Extrao de DNA plasmidial, corte com enzimas e

eletroforese

REA Ferramenta epidemiolgicaExtrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e

eletroforese

Ribotipagem Tipificao (cpia de genes ribossomais)Extrao de DNA, corte com enzimas (restrita) e

eletroforese

PFGE Ferramenta epidemiolgica Mudana repetida da orientao do campo eltrico

RAPDAmplifica DNA em condies de baixa

estringncianico primer, no sendo necessrio saber a regio de

ligao

RT-PCRExpresso de genes (virulncia, toxinas),

RNA viralRNA extrado convertido para cDNA que amplificado

por PCR

Nested PCR Tipificao Grupo de primers (amplificao); outro grupo de primers

(re-amplificao)

Multiplex PCR Tipificao Uso de mais de um par de primers na mesma reaoREP-, ERIC-, BOX-(PCR)

Identificao e tipificao (gnero, espcie, subespcie)

Uso de primers de consenso; amplifica regies entre estes elementos repetitivos

RFLP-PCRAnlise do polimorfismo do tamanho de

fragmento de restrioFragmentos amplificados por PCR; digesto por uma ou

mais endonucleases

PCR ribotipagem Identificao e tipificao Amplificao de sequncias conservadas 5S, 16S e 23S

do operon do RNAr

PCR tempo real Deteco e quantificaoPCR convencional ; sondas fluorescentes; interpretao do

espectro gerado

21

Tcnica Vantagens Desvantagens Referncias

Perfil plasmidial Informaes epidemiolgicas

Perda ou ganho de plasmdio; pouco valor para bactrias com

baixa incidncia Kolstad et al. (1992)

REA Uso de endonuclease

Dificuldade de interpretao visual dos perfis (centenas de

bandas) Wojciech et al. (2004)Ribotipagem Bandas mais visveis e comparveis custo elevado Aarestrup (2006)

PFGE Agarose mantm DNA intacto

DNA de alto peso molecular pode ser submetido digesto

pela endonuclease Arbeit et al. (1990)

RAPD Detectar polimorfismos do DNA

Escolha de iniciadores que originem resultados

reproduzveis Welsh & McClelland (1990)

RT-PCR Amplifica DNA obtido por meio de TR de RNA Tang & Persing (1999)

Nested PCR Diversos ciclos de amplificao Konemann et al. (2001)

Multiplex PCRAmplifica diferentes alvos de microrganismos,

uso na rotina, baixo R$

Reduo na sensibilidade de deteco; necessidade de

ensaios preliminares Tang & Persing (1999)

REP-, ERIC-, BOX-(PCR) Uso em diferentes regies do genoma

Amplificao de sequncias inespecficas (ERIC) Gillings & Holley (1997)

RFLP-PCR Associao da tcnica PFGE Farber et al. (2001)PCR ribotipagem Uso para diferenciar espcies Shangkuan et al. (2000)

PCR tempo realEstudos quantitativos, tubo fechado, no h

necessidade de eletroforese custo elevado Heid et al. (1996)

Mtodos Alternativos

Tcnicas genotpicas referem-se caracterizao do DNA cromossmico, plasmidial ou total de um micro-organismo, caractersticas relativamente estveis

Tcnicas moleculares: Aplicao direta na deteco e caracterizao de bactrias

patognicas em alimentos Destaca-se a PCR (Boer e Beumer, 1999; Farber, 1996;

Malorny et al. (2003)

22

23

Reviso

24

Informao para produzir determinada protena

25

Primer Polimerase

Thermus aquaticus (Taq)

Exemplo de mistura para reao qPCR

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400 nM primers (de cada 1 do par)250 nM sonda200 M de cada dGTP, dATP, dCTP400 M dUTP*Tampo PCR (Tris-HCl, pH 8,4)50 mM KCl4,5 mM MgCl21 U Platinum Taq polimeraseDNA ou RNA alvoH2O Ultra-pura

*dUTP suscetvel hidrlise pela enzima bacteriana uracil-N-glicosilase. Adio da enzima na mistura PCR permite hidrlise seletiva e remoo dos produtos de amplificao contaminante da mistura de PCR

27

28

Mtodos Rpidos (PCR)

It is difficult to find a journal that does not describe

some use of these techniques (APHA, 2001)

difcil encontrar uma revista cientfica que no descreva algum uso destas tcnicas

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Reao da Polimerase em Cadeia(PCR)

Kary B. Mullis (1983): inveno da PCR

Tcnica altamente sensvel

Pequenas quantidade de sequncias de DNA ou RNA especficas podem ser enzimaticamente amplificadas, at que sejam obtidas milhes de cpias da sequncia alvo

30

31

PCR

32

33

Nao! Quantificar

Detectar ?

34

PCR Sistema Aberto

(deteco)

35

PCR- Sistema Fechado(BAX System)

Sim

No

3. Deteco

Amostra

2. Amplificao

pr-enriquec. MO: est ou no est ?

resposta

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Resultados do rack reportdo BAXSystem para deteco de Listeria monocytogenes

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Perfil da curva de fuso (melting curve) do controle interno

Perfil da curva de fuso (melting curve) de Listeria monocytogenes da amostra positiva

Aprovao MAPA - Salmonella

INSTRUO NORMATIVA N 41, DE 7 DE JUNHO DE 2004 VALIDAO DA METODOLOGIA UTILIZADA PELO SISTEMA DE DETECO PATOGNICA PARA ALIMENTOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS - A-BAX PARA DETECO DE SALMONELLA SPP EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS, GUA E AMOSTRAS AMBIENTAIS-SWAB, COMO MTODO ALTERNATIVO EQUIVALENTE AO MTODO DE REFERNCIA DO MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO MAPA

38

Aprovao MAPA - Listeria

INSTRUO NORMATIVA N 40, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2005. ISOLAMENTO E IDENTIFICACAO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM CARNE VERMELHA, CARNE DE AVE, OVOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS, MLG 8.04 METODOLOGIA ALTERNATIVA DE LISTERIA A-BAX MLG-8 A .01

39

40

Segunda gerao de mtodos que empregam a PCR (qPCR)

Amplificao e deteco em uma nica reao em tubo fechado

Baixo risco de contaminao

Deteco do aumento do nmero de cpias do DNA alvo medida que a reao realizada

Reduo do tempo de anlise

Ciclo

Cpia inicial

PCRCiclo 1

PCRCiclo 2

2XCpias

30-45 Ciclos

4XCpias

monitora o progresso da PCR em TR

PCR-tempo real (qPCR)

Exemplos de qPCR

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42

FRET

Corantes fluorognicos ligados

Sntese de DNA e clivagem da Sonda - 5exonuclease

Deteco / PCR-RT marcadores fluorognicossonda: hibrid.reg. internas

Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003

Curva de amplificao da qPCR

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Ct Threshold cycle

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Amostras so inseridas no termociclador que controla a temperatura de cada ciclo da PCR

Amostras so excitadas e a fluorescncia mensurada por um fotodetector em cada ciclo da PCR

LED (light-emitting diode)

Fonte: Valasek & Repa, 2005

Comparao entre tcnicas fenotpicas e genotpicas

Gandra et al. (2008)

Tempo de anlise menor para as tcnicas baseadas em PCR

Resultados em 6 a 8 h Resutados falso-positivos (amplificao de DNA proveniente

de clulas mortas) Viabilidade de micro-organismos presentes (RNA) Preparo da amostra, incluso de um IAC, purificao do

DNA/RNA

45

PCRVantagens qPCR

Maior alcance dinmico na deteco

Nenhum processamento ps-PCR Alta sensibilidade Coleta de dados na fase

exponencial da PCR Um aumento no sinal reprter

fluorescente diretamente proporcional ao nmero de amplicons gerados

A sonda clivada fornece um registro permanente de amplificao de um amplicon

Desvantagens PCR convencional Baixa preciso Baixa sensibilidade Baixa resoluo No automatizado Discriminao baseada apenas no

tamanho do amplicon Resultados no so expressos

como nmeros Brometo de etdio para a colorao

no quantitativa Ps-processamento da PCR

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Preparo de amostras

Rodrguez-Lzaro et al. (2007)

Garantir boa homogeneizao Aumentar a concentrao do organismo alvo Reduzir ou excluir substncias inibitrias (etapa de enriquecimento) Procedimentos de pr-amplificao devem ser adaptados para cada

matriz alimentcia variao na homogeneidade; consistncia; composio e microbiota

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Outras metodologias para o preparo de amostras

Glynn et al. (2006)

Filtrao Centrifugao Uso de detergentes e solventes orgnicos Tratamento com enzimas Incluso de aditivos na PCR (BSA) Diluio da amostra

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Limitaes da PCR

Farber et al. (2001); Glynn et al. (2006); Martin et al. (2006)

Alto custo inicial

Falta de legislao que padronize e valide estas tcnicas

Desenvolvimento de sistemas automotivos (extrao, purificao)

49

Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos

Postollec et al. (2011)

qPCR: detectar, identificar, quantificar micro-organismos

ISO: deteco de patgenos por PCR (ISO 22174:2005; ISO/TS 20836:2005; ISO 20837:2006; ISO 20838:2006)

Fase inicial: expresso gnica; multiplicao e atividade microbiana em matrizes complexas para controles industriais

50

Avanos da qPCR na microbiologia de alimentos

PCR: > rapidez, sensibilidade e especificidade detecta populaes dominantes, sub-dominantes, clulas

mortas ,VPNC, quantifica genes e expresso gnica

Automao: Isolamento do cido nucleico e preparo qPCR (barato e adequado para rotina)

51

Implementao do qPCR no Laboratrio

52

Viso do administrador

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Terror!

Viso do tcnico

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astro da magia!

Viso do cliente

55

soluo dos problemas!

Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Extrao do cido nucleico Componente mais importante para assegurar

reprodutibilidade

Uso de kits comerciais ou com adaptaes dependendo da matriz

RNA: extrao laborosa, especialmente em matrizes complexas ou gordurosas

fcil degradao, rapidamente analisado

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Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Deteco qumica Disponibilidade de vrios sistemas

Modo de ao, vantagens e limitaes

Mais usados na Micrbiologia de Alimentos: DNA binding dye (SYBR Green) Hydrolisis Probe (5 nuclease assay)

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Sistema SYBR Green

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Sistema TaqMan

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60

61

Tipos de sistemas qumicos usados para a deteco na qPCR

Fonte: Wong & Medrano, 2005

Custo dos sistemas qumicos de deteco

62

Consideracoes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Mtodos de quantificao

Escolha de uma curva padro (Absoluta ou Relativa)

Eficincia de amplificao:[10-1/slope] 1 = 1

PCR no apresenta eficincia ideal presena de inibidores; variabilidade nos nucleotdeos

63

64

Curvas de amplificao: - relao do sinal fluorescente

versus o nmero de ciclos da PCR

Fonte: Mocellin et al., TRENS in Molecular Biology.,2003

Curva padro: - R2 =coeficiente de regresso

linear dos dados gerada- clculo da EA

Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

RT-qPCR

nica ou duas etapas nica etapa nica tubo

menor risco de contaminao do DNA minimiza o risco de variao experimental maior degradao do RNA

65

Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

RT-qPCR

Duas etapas RT independente da qPCR Melhor quando a mesma amostra de RNA utilizada

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Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Variaes experimentais da RT-qPCR

Tcnica de alta sensibilidade Variabilidade nos resultados Triplicatas (RNA; cDNA ou DNA)

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Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Controles Devem ser includos para avaliar a contaminao do alvo

(DNA, eficincia da RT, variaes no M Mix Controle negativo (contaminado com no-alvo) Controle positivo (contaminado com o alvo) Branco (gua) 96 amostras (vrios Brancos) IAC: possibilita identificar substncias inibidoras da PCR

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Consideraes tcnicas para implementao da (RT-)qPCR

Modo de expresso

Quantificao absoluta UFC/mL ou GEq/mL (GEq ou cpias DNA/mL) GE/mL = nr. de cpias do gene alvo Diferenas entre UFC/GEq (clulas mortas, lise incompleta)

Quantificao relativa Nvel de expresso (gene, RNAr) da amostra para amostra

controle cDNA alvo/DNA espcie alvo

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Aplicaes da qPCR

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Desenvolvimento de um ensaio para quantificao de Salmonella empregando a qPCR

Frder et al. 2008

13 sunos (4 semanas de idade) oramente contaminados com S.Typhimurium DT 104

Dose Infectiva: ~ 6 x 109 UFC/mL/animal Material fecal colhido geralmente nos dias 1, 2, 3, 4, 6, 8, 13, 15, 20, 22 e 28 aps

infeco

71

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Quantificao por qPCR Quantificao por mtodo

clssicoTratamento Pr-PCR (200-220 mg de

fezes )

Fezes coletadas via retal

Diluio 1:10 em 1% BPW

Semeadura superficial 100 L sobre XLDNal50 com SPEnsaio qPCR

Incubao (48 h /37C)

Contagem bacteriana automtica (ProtoCOL)

Confirmao sorolgica

Protocolo para quantificao de Salmonella em material fecal

Protocolo para quantificao de Salmonella em fezes sunas por qPCR

QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) Material: 200-220 mg

Ensaio qPCR:Malorny et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. AEM, 2004 Fragmento de 94 pb do locus ttr especfico para SalmonellaSonda TaqMan FAM-DQ

Curva Padro: 1 107 clulas direto na qPCR6,5 x 105 6,5 cpias de DNA (aps Qiagen Kit) Anlise dos dados baseado no valor Ct

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Quantificao de Salmonella em fezes sunas naturalmente contaminadas empregando mtodo

clssico e qPCRSmbolos fechados: qPCR

Smbolos vazados: Spiral Plater

Valores mdios de UFC eq de Salmonella e Ct mdios obtidos para as curvas padro de fezes naturalmente contaminadas e submetidas

ao qPCR, aps tratamento com QIAamp DNA Stool Kit

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Salmonella (UFC/mL DP)

Salmonella qPCR

(UFC eq)

Salmonella (UFC eq)

Ct DP*

1,3 x 108 1,5 x 107 6,5 x 105 9,3 x 105 6,1 x 104 18,8 0,33 1,3 x 107 1,5 x 106 6,5 x 104 1,1 x 105 2,6 x 104 22,1 0,16 1,3 x 106 1,5 x 105 6,5 x 103 8,0 x 103 1,7 x 103 25,3 0,18 1,3 x 105 1,5 x 104 6,5 x 102 9,9 x 102 1,0 x 102 28,8 0,40 1,3 x 104 1,5 x 103 6,5 x 101 1,1 x 102 2,9 x 101 31,9 0,38 1,3 x 103 1,5 x 102 6,5 x 100 9,6 x 100 1,4 x 100 35,4 0,59 1,3 x 102 1,5 x 101 0,65 0,65 > 45

populao de Salmonella obtida no gar XLDNal50

desvio padro (DP)

populao de Salmonella em UFC eq definida na janela de deteco da PCR-RT

populao de Salmonella em UFC eq obtida por PCR-RT

*Ct - ciclos da PCR cujo sinal fluorescente atingiu o limiar de deteco desvio padro (DP)

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Combinao de qPCR; qPCR-PMA; tradicional PMA: corante que intercala na dupla fita de clulas mortas

n= 50 carcaas naturalmente contaminadasMtodo PMA-PCR: 100% de especificidade

Mtodo ISO 10272-1: trabalhoso, requer muito tempo, no detecta VPNC

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Resultados de qPCR (preto), qPCR com tratamento PMA (cinza) e o mtodo tradicional (branco)

Correlao entre ISO e qPCR foi maior do que a correlao com qPCR-PMAConsideraes do qPCR-PMA: estado celular (viva ou morta), permeabilidade da parede celular

ou se PMA entrou em pequenas fraes em clulas cultivveis

78

Limite de quantificao qPCR e qPCR-PMA

102 UFC/mL

79

Primers para deteco de genes de virulncia e sorotipo de E. coli O157:H7

RNA bacteriano em concentraes de 102 e 103 UFCInoculao artificial em suco, alface e carne

Concentrao do inculo empregando 2 filtraes (0,45 m e 0,2 m)Tempo analtico: 4 h

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Protena intimina

Antgeno flagelar H7

Hemolisina

Antgeno somtico O157 Controle interno

81

82

Validao in-house para deteco especfica de Salmonella em alimentosValidao requer: desenho de primers e sonda especficos

Teste de inclusividade e exclusividade110 alimentos artificialmente contaminados

83

IAC: fragmento de DNA artificial e inserido em cada mistura de reao

84

85

86

Sensibilidade: nmero total de culturas ou colnias positivas corretamente obtidasEspecificidade: nmero total de culturas ou colnias negativas obtidas

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Estudo de validao qPCR multiplex (12 hospitais de SP) e identificao de fatores associados com cultura negativas* e PCR positivas

Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae Tipo b causam meningite em recm nascidos

Brasil: 28.000 casos/ano

*devido uso de antibiticos

88

Caractersticas dos 499 pacientes envolvidos no estudo

Caractersticas Nr. (%)

Sexo masculino 301 (60.9%)Faixa etria mdia 9 anos (082)Mortos 40 (9.6%)Culture-positiveN. meningitidis 107 (21.4%)S. pneumoniae 50 (10.0%)H. influenzae 5 (1.0%)CSF 100 WBCs e 60% PMNs 460 (93.7%)Cultura positiva, 1 dos 3 alvos 123Cultura negativa 337Ensaio antibitico CSF positivo 142 (34.6%)

CSF Fluido crebro-espinhal; WBC clulas sanguneas brancas; PMNs clulas polimorfonucleares

89

Mtodo 1** cultura positiva para um patgeno e os outros dois negativos na qPCRMtodo 2*** cuturas negativas, com critrio CSF de 100 leuccitos/mm3 e 60 neutrfilosMetodo 3**** culturas positivas para o segundo alvo, porm removidas no clculo da sensibilidade

Risco de cultura + qPCR = presena de antibiticos no fluido crebro-espinhal

90

nica etapa nica tuboDuas etapas RT independente da qPCR

Emprego de duas enzimas (RT e DNA polimerase)Quantificao absoluta ou relativa

91

Extrao do mRNA alvo

Purificao do mRNA

mRNA

Transcriptase reversa (RNA polimerase)

RT-PCR Sntese de DNA complementar (cDNA)

Reao de PCR

DNA dupla-fita (mltiplas cpias)

Viabilidade obtida para S. Typhimurium 51K61 no modelo ave durante o perodo de 165 h aps a

inoculao

92

Viabilidade: relao cp. RNA (UFCeq do tuf-RNA ) e cp. DNA (UFCeq tuf )Viabilidade: capacidade de metabolizar componentes

Expresso do gene tuf

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

qPCR = deteco e quantificao (bactrias*, fungos e vrus)*Salmonella, Lm, Sa, Ec O157:H7

Vantagens: Tempo analtico menor

Lm (2 dias) Salmonella (26 h ou algumas horas) Clostrdios (1 dia) Bc (2 h)

93

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

Ct similar s contagens em placa

Limites de quantificao sem enriquecimento da amostra: 102 103 UFC/g ou mL

Ideal: qPCR + enriquecimento de poucas horas Salmonella e Lm (

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

Reduzir os nveis de deteco Combinar :

PCR ou Filtrao ou Centrifugao 10-100 UFC/g (Salmonella e C. jejuni) em 3 h Mtodo: centrifugao por densidade + qPCR

qPCR: correlao com plaqueamento (5 logs)

Discrepncias: contagens maiores no plaqueamento

95

Discrepncia de logs

96

Populaes mdias de S. Typhimurium obtidas em alimento-modelo (suno) incubado a 20 C e determinada por RT-qPCR (tuf-RNA), qPCR- (tuf) e semeadura em gar XLD

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

Motivos das discrepncias:

Volumes diferentes (1 mL ou 0,1 mL versus 5 L) Presena de DNA intacto de clulas mortas Presena de formas VPNC 1 UFC pode ser gerada por mais uma clula Uso de primers para o alvo variando nmeros de

multicpias dos genes

97

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

Quantificao de patgenos: Considerar

Aplicaes da (RT-)qPCR na MA

Tendncia atual: multiplex no mesmo tubo de reao Diferencia rapidamente de gnero ou espcie

Exemplos: E.coli O157:H7, Salmonella spp., Lm presente em leite e carne Campylobcter, Salmonella spp. em frango

99

qPCR: deteco de no-patognicos

Deteco e quantificao de bactrias processos fermentativos (LAB) Propriedades organolpticas

Queijo Enterococcus gilvus (LD:104 UFC/g) Queijo Corynebacterium casei (LQ: 105 UFC/g) Probiticos Bifidobacterium (LD: 102 UFC/g) (16 rRNA)

qPCR: monitoramento de alteraes causadas por fungos (maturao de queijos)

Penicillium roqueforti Penicillium camemberti

100

qPCR: deteco de no-patognicos

Limitaes do qPCR: substitudas pelo RT-qPCR

RT-qPCR: pouco usado Dificuldade na extrao de RNA Disponibilidade de kits Instrumentos (ready-to-use) checagem de RNA integral

101

RT-qPCR e avaliao de risco

Problemas recorrentes Mtodos moleculares: deteco de micro-organismos mortos

Estratgias de diferenciao de cl.vivel/mortas EMA/PMA (aplicado antes da extrao de DNA)

inativao da clula vivel e inibio da PCR Incluso da etapa de enriquecimento Sistemas de filtrao Tratamento com DNAse I (vivel e esporos)

102

Concluso e Recomendaes

Deteco e quantificao de patgenos esto sendo amplamente estudados na MA

Resulado positivo pelo mtodo rpido ser considerado presuntivo e dever ser confirmado pelo tradicional

A confirmao extende a anlise por vrios dias, isso no pode ser visto como fator limitante (devido a ter negativos)

103

Concluso e Recomendaes

Mtodos rpidos carecem de sensibilidade e especificiadade para anlise direto do alimento

Enriquecimento considerado um fator limitante (Temp), porm dilui os efeitos dos inibidores, diferencia viveis de VPNC, reparo do stress ou injria celular

Tendncia de uso do qPCR multiplex Mltipla deteco / anlise de rotina

104

Concluso e Recomendaes

Falta consenso de como conduzir os experimentos e interpretar dados

Exemplo: h muitos mtodos qPCR para E. coli O157:H7 e Salmonella que podero:

Confundir e ser massacrante para o usurio Qual validar?

105

Concluso e Recomendaes

Devido a alta sensibilidade do (RT-)qPCR pequenas diferenas no preparo de amostra, amplificao e expresso dos dados tem impacto nos resultados

Incluso de vrios controles em cada etapa

SYBR Green o corante mais barato, apresenta um resultado robusto e sensvel

106

Concluso Final

Estudos futuros:

Estudos envolvendo diferentes etapas de processos industriais

Expresso dos genes do alvo de interesse

Buscar a melhoria no limite de deteco, a fim de se obter maior sensibilidade do mtodo

107

Opinio Pessoal

Devido a complexidade do mtodo (RT-)qPCR, deve se levar sempre em considerao:

Custo dos reagentes/kits Necessidade de haver pessoal tcnico especializado para a

realizao do trabalho Resultado em curto perodo de tempo Mtodo simples Sensvel para detectar baixos nveis de micro-organismos e

preciso

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"Ora a f o firme fundamento das coisas que se operam e uma demonstrao das que no se veem"

Hebreus 11,1

Muito Obrigado!Hans Frder

hfroder@hotmail.com(011) 5097 7888

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