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Nanocristais semicondutores: aplicações em biosensores e
imagem médica
Pedro A. S. Jorge
FCUP / INESC Porto
07 / 09/ 2006
Resumo• Introdução
• Nanoparticulas– Nanopartículas de material semicondutor (Quantum dots)– Semicondutores e luminescência– Confinamento quântico– Propriedades ópticas dos quantum dots
• Aplicações de QD como sensores e marcadores– Imagem médica– Sensores químicos– Biosensores
• Sensores luminescentes em fibra óptica– Principais vantagens problemas – Exemplos de aplicações
• Aplicação de QD em sensores de oxigénio– Principio de funcionamento– QD como referência temperatura/intensidade– Multiplexagem de sensores O2 usando QD
O que é uma nanopartícula?
Partículas de um determinado material (metal, vidro, semicondutor) com
dimensões de apenas alguns nanometros A sua composição e reduzido
tamanho (centenas a milhares de átomos) conferem-lhe propriedades
ópticas/eléctricas/mecânicas únicas.
~20-30 nm
1 nanometro = 10-9 m
Quantum dots
Nanocristais de material semicondutor.
Com emissão de fluorescência
Luminescência
• Desactivação de um estado excitado por emissão de radiação
Espectro electromagnético
Propriedades ópticas de um semicondutor
En+1
En
En-1
Ek
Eg
Exciton levels
Conduction band(effective mass me*)
Valence band(effective mass mh*)
0 5 10 15 20hω-Eg (arbitrary units)
α (a
rbitr
ary
units
)
n=1 exciton peak
Bandedge
including exciton effectsneglecting exciton effects
Absorção
•Átomo: níveis de energia discretos
•Sólidos: bandas de energia
•Periodicidade da rede cristalina - bandas de energias proibidas
•Fotões com energia hν>Eg absorvidos
( )
( )
2 2
*
2 2
*
2
2
c ge
vh
kE k Em
kE km
= +
= −
3.40 3.45 3.50 3.55 3.60
GaN
Energy (eV)
Lum
ines
cenc
e In
tens
ity
T=4 k
PL
absorption
Opt
ical
Den
sity
Propriedades ópticas de um semicondutor
Emissão (Luminescência)
E E
Eg
hωL
k = 0
(a) (b)
hω
electrons
holes
Density of states
conduction band
valence band
k0
2 2 2 2
* *2 2ge h
k kEm m
ω = + +
•Relaxamento muito rápido (~100 fs)
•Emissão do limiar da banda
•Alargamento espectral ∆λ (distribuição de Boltzman)
Composition Eg (eV) λg (nm)
Si 1.11 1100
GaAs 1.43 870
AlAs 2.15 580
CdTe 1.44 860
CdS 2.42 510
PbTe 0.29 4300
Quantum dot (QD) = poço de potencial 3D– Alteração dos níveis de energia
– Níveis de energia discretos
– Propriedades ópticas dependentes do tamanho
– Fluorescência e absorção mais intensas
– Deslocamento para o azul (maior energia)
12 B
E k T∆ >
2 2
2( )2 2 ( )xpEm m x
∆∆ =
∆∼
Confinamento Quântico
– Confinamento aumenta energia cinética da partícula (Heisenberg).
– Confinamento significativos se ∆E exceder energia térmica da partícula
– Em semicondutores confinamento é significativo qdtamanho da estrutura menor ou igual a λ electrão
Range (nm) La 0.1–0.6 ,e hλ 1-100 Xa 1 – 30
22
22nl g nlE Ea
χµ
= +
Métodos de Fabricação
• Objectivo: fabricar estruturas semicondutoras em que os electrões sejam confinados em 3D.
• 3 métodos principais– Litografia
– Epitaxy: crescimento de padrões ou crescimento auto organizado
– Suspensões Coloidais: baixa temperatura, mais barato, compatível com bioaplicações
Suspensão coloidal• Reacções químicas controladas. Nanoparticulas formam-se por precipitação
numa solução ou em meio sólido (ex. polímero)
• Variação nos tamanhos ( “dispersão”)
Evident Technologies: http://www.evidenttech.com/products/core_shell_evidots/overview.php
Núcleo de CdSe com revestimento de ZnS
Espectros de absorção e emissão dos QDs
• Comportamento semelhante a semicondutores macroscópicos mas absorção e emissão são mais intensos devido aos efeitos de confinamento.
REF: www.evidenttech.com
Composição λ (nm)
CdS 350 - 470
CdSe 450 - 655
CdTe 600 - 725
PbSe 800 - 2000
REF: Evident Technologies . www.evidenttech.com
REF: Quantum Dot Corporation. www.qdots.com
2 2
2g 0 2E (QD)
e h
e h
g a
m m
m m
E πµ
µ =+
≈ +
Emissão no vermelho: particulas maiores
Emissão no azul: particulas mais pequenas
O tamanho importa!
Tamanho de um QD
Suficientemente grande para ser combinado com diferentes moléculasSuficientemente pequeno para ser introduzido dentro de células
Vantagens dos QDs• Espectro de emissão: estreito (25 nm) e simétrico.
• Excitação: espectro de excitação muito alargado. Desvio de Stokeselevado.
• Intensidade: rendimentos quânticos elevados, comparáveis aos dos corantes orgânicos tradicionais.
• Foto-estabilidade: muito resistente à foto-degradação.
• Diferentes λ: diferentes λ de emissão mas propriedades químicas e rendimentos quânticos semelhantes. Potencial para multiplexagem.
Potenciais problemas
• Reactivos: QD sem revestimento são muito reactivos levando àdegradação das propriedades luminescentes.
• Tamanho: QD maiores que marcadores orgânicos, dificulta difusão celular e pode interferir com processo biológico.
• QDs revestidos com anticorpos (azul) permitem grande especificidade.
• Proteínas (purpura e verde) são usadas como auxiliares de ligação.
• QDs revestidos com anticorpos (azul) permitem grande especificidade.
• Proteínas (purpura e verde) são usadas como auxiliares de ligação.
Jyoti K. Jaiswal and S.M. Simon, "Potentials and pitfalls of fluorescent quantum dots for biological imaging". TRENDS in Cell Biology, p. ARTICLE IN PRESS. 2004
Bio aplicações :QD Bio-conjugados
Maior fotoestabilidadeMarcação específica de células com conjugados QD-streptavidin.Marcação específica de células com conjugados QD-streptavidin.
QD com emissão mais forte que corantes molecularesQD com emissão mais forte que corantes moleculares
Xingyong Wu, et al., "Immonofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots". Nature Biotechnology. 21, p. 41-46. 2002.
QD permitem marcação específica e permanecem luminescentes por períodos mais longos.
QD permitem marcação específica e permanecem luminescentes por períodos mais longos.
Marcação especifica de células vivas ‘in-vitro’ com QDs
Marcação especifica de células vivas ‘in-vitro’ com QDs
Jaiswal, J. K.; Mattoussi, H.; Mauro, J. M.; Simon, S. M. Long-term Multiple Color Imaging of Live Cells Using Quantum Dot Bioconjugates. Nature Biotech. 2003, 21, 47–51.
Jyoti K. Jaiswal and S.M. Simon, "Potentials and pitfalls of fluorescent quantum dots for biological imaging". TRENDS in Cell Biology, p. ARTICLE IN PRESS. 2004
Apenas células ‘infectadas’ com Pgp-GFP (proteina luminescente – verde) foram marcadas com QDs. Cor amarela resulta da sobreposição de fluorescência verde (GFP) com fluorescência dos QD (vermelho)
Apenas células ‘infectadas’ com Pgp-GFP (proteina luminescente – verde) foram marcadas com QDs. Cor amarela resulta da sobreposição de fluorescência verde (GFP) com fluorescência dos QD (vermelho)
Heróis silenciosos
• QD deve ser tornado biocompatível e capaz de identificar células cancerosas.
Marcação específica de tumores ‘in vivo’
Camada 1 protecção hidrofóbica(polímero + TOPO) protege QD de degradação enzimática tornando-o altamente biocompatível.
Camada 2 marcadores de afinidade como anticorpos PSMA tornam QD marcador específico do tumor da próstata.
Marcação específica de tumores ‘in vivo’
Tamanho vários marcadores diferentes podem simultaneamente ser colocados na superfície do QD (maior especificidade).
Superior acumulação no tumor.
Gao, X., Y. Cui, R.M. Levenson, L.W. Chung, and S. Nie, In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots.Nat Biotechnol, 2004. 22(8): p. 969-76. Epub 2004 Jul 18.
Diferentes cores. QD com emissão distinta excitados pela mesma fonte, claramente distinguíveis.
QD vs corante molecular. Maior contraste e longevidade dos nanocristais.
Marcação específica de tumores ‘in vivo’
Sensores ópticos baseados em Luminescência
Medição da concentração de espécies químicas como iões, pH e CO2, O2.
Sensores químicos
Reconhecimento de padrões moleculares: Complexos; enzimas; imunoreacções anticorpo – antigénio; genética (DNA); células
Biosensores
Sensores luminescentes: a detecção baseia-se na influência de um elemento bioquímico sobre a luminescência (intensidade, tempo de vida, espectro) de um marcador.
Propriedades de luminescência dos QD atractivas para aplicações sensoras.
Sensores Físicos
Medição de grandezas ’físicas’ como temperatura, pressão, corrente electrica.
Hedi Mattoussi, et al., "Luminescent Quantum Dot-Bioconjugates in Immunoassays, FRET, Biosensing, and Imaging Applications". JALA. 9, p. 28–32. 2004.
IMUNO-ENSAIO formato competição: detecção do explosivo RDX [hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine].IMUNO-ENSAIO formato competição: detecção do explosivo RDX [hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine].
QD como Biosensor
Sensores luminescentes em fibra óptica
θa
θc
θc
Guided rayLeaky ray
Acceptance cone
Fibra óptica: condutor de luz
Sensores luminescentes em fibra óptica
QDnRu
ProcessingStation
sensor λ1 (Ru+QD1)
sensor λ3 (Ru+QD3)
sensor λ2 (Ru+QD2)
sensor λn (Ru+QDn)
optical Fiber cable
Sensing head
Data Transmission
O2 permeable menbrane
Tapered fiber
Remote monitorization of marine and coastal environments
Exemplo de aplicação
A fibra óptica como sensor! Corante Luminescente + fibra óptica
Sensores luminescentes em fibra óptica
Principais vantagens• Sensibilidade elevada, tempo de resposta rápido• Detecção remota e em tempo real• Imunidade a interferências electromagnéticas• Capacidade de miniaturização• Interrogação de vários sensores através do mesmo sistema
Principais desafios• Imobilização do marcador fluorescente na superfície da fibra. • Volume da amostra muito reduzido ->sinal luminescente muito fraco.• Fotodegradação do marcador• Dependência com a temperatura
Corante Luminescente + fibra óptica
Sistemas comercias
Sensor de Oxigénio FOXY™ da Ocean Optics baseado na inibição de fluorescência de um complexo de Ru.Varios formatos de cabeça sensora optimizados para diferentes aplicações.
PreSens™ Needle-Type Housing (NTH) -pH Micro-Sensor. Microsensor (140 µm) para aquisição de perfis de pH em sedimentos e biofilmes.
Geometrias sensorasIntrinseca Extrinseca
Micro sensor
Evanescente
Sensores ópticos de Oxigénio
Sensor óptico – vantagens
• Não consomem oxigénio.
• Mais sensíveis e rápidos.
• Imune a interferências electromagnéticas
Aplicações• Médicas: análise ao O2 no sangue, ciclo respiratório
• Ambientais: poluição e qualidade da água, tratamento de resíduos.
• Industriais: Fermentação, embalagens de comida
• Segurança: explosivos, minas e túneis
Principal mecanismo sensor:inibição da fluorescência
Inibição de Fluorescência ‘Quenching’
Indicador luminescente: Complexo molecular de Ruténio
0 0 1 [ ]SVI K QI
ττ
= = +
Ru(bpy) Tris(2,2’-bipyridine) ruthenium (II)
I 0/I
and
τ 0/τ
0
1
HigherTemperature
kq T/η
slope=KSV=kqτ0
[Q]
(a)
Detecção óptica de Oxigénio
Na presença de O2 a intensidade de fluorescência e o tempo de vida diminuem!
Fabricação de sensor de O2 em fibra óptica• Fibra óptica deve ser revestida com composto
fluorescente.
• Polímero ou vidro poroso corado com Ru(bpy) e depositado na extremidade da fibra óptica.
Solução corada com Ru(bpy)
Todo processo efectuado em ‘sala limpa’ livre de poeiras.
(a) (b) (c) (d)
Revestimento de lamelas de vidro
Revestimento de fibras ópticas
Sistema sensor em fibra óptica
Output
Lock-in
connector
O2 in
N2 in
Sealed Chamber
Coupler
sensing probe
Fiber600/550 µm
SineModulation
Phot
odio
de
50:50
O2
met
er
High pass filter 550 nm
470 nmLED
Phase φ
amplitude
Laser Detector CCD
Fibra sensora
60 120 180 240 300 360 420
60
80
100
120
140
160
100% N2100% N2
100% N2
100% O2100% O2
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
(mV
)
time (s)
100% Oxigénio100% Azoto
Como melhorar o desempenho do sensor?
• Temperatura : Determinação simultânea da temperatura e do oxigénio.
• Referência em intensidade: medição de O2 independentemente da potência óptica.
• Multiplexagem: como interrogar simultaneamente vários sensores de O2 espacialmente distribuídos.
• Propriedades dos Quantum dots podem ser utilizadas para resolver alguns destes problemas!
Espectros de emissão da fonte de excitação (LED), sensor (Ru) e QD
0
0.25
0.5
0.75
1
400 500 600 700
λ (nm)
Ru(bpy)Blue LEDQD 545
0
0.25
0.5
0.75
1
400 500 600 700
λ (nm)
Ru(bpy)Blue LEDQD 545
QD não se sobrepõe significativamente aos espectros da fonte ou do sensor.
QD como sensor de temperatura
480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 5800
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
T= 43ºC
T= 14ºC
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
(a.u
.)
λ (nm)
(a)
580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 6800
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500 T= 11ºC
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
(a.u
.)
λ (nm)
T= 48ºC
(b)
Resposta da emissão fluorescente de nanocristais de CdSe/ZnS para uma gama de temperaturas entre 11 ºC e 48 ºC.Resposta da emissão fluorescente de nanocristais de CdSe/ZnS para uma gama de temperaturas entre 11 ºC e 48 ºC.
QD CdSe/ZnS 520 nm• Variação da intensidade com a
temperatura: –1.6% / ºC
QD CdSe/ZnS 520 nm• Variação da intensidade com a
temperatura: –1.6% / ºC
QD CdSe/ZnS 610 nm
• Variação da intensidade com a temperatura: –0.7% / ºC
QD CdSe/ZnS 610 nm
• Variação da intensidade com a temperatura: –0.7% / ºC
•Em ambas as amostras o pico espectral de emissão varia de +0.2nm/ºCcom o aumento da temperatura.•Em ambas as amostras o pico espectral de emissão varia de +0.2nm/ºCcom o aumento da temperatura.
QD como sensor de temperatura
590 600 610 620 630 640 6500
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
λ (nm)
A B
A=[595;600] nm; B=[620; 625]A=[595;600] nm; B=[620; 625]Normalização:Normalização:
A-BS=A+B
• Intensidade da Fluorescência e λmudam linearmente e reversivelmente com a temperatura.
• Processamento de sinal para obter imunidade a flutuações de potência óptica.
• Intensidade da Fluorescência e λmudam linearmente e reversivelmente com a temperatura.
• Processamento de sinal para obter imunidade a flutuações de potência óptica.
0
2( )
( )g gTE T ET
αβ
= −+
QD como sensor de temperatura
10 15 20 25 30 35 40 45 50600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
(a.u
.)
Temperature ( ºC)
100% PLED
90% PLED
80% PLED
Linear Fits
(a)
10 15 20 25 30 35 40 45 50
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
(S1-S
2)/(S
1+S 2)
Temperature ( ºC)
100% PLED
90% PLED
80% PLED
Linear Fit
(b)
Calibrações obtidas para 100%, 90% e 80% de potência de excitação, PLED, paragama de temperaturas entre 11 ºC e 48 ºC.Calibrações obtidas para 100%, 90% e 80% de potência de excitação, PLED, paragama de temperaturas entre 11 ºC e 48 ºC.
a) Resposta da intensidade de fluorescênciaa) Resposta da intensidade de fluorescência b) Resposta dos sinais processadosb) Resposta dos sinais processados
QD como referência de intensidade
Comportamento da fonte de excitação, LED, da referência, QD, e sensor de O2 (Ru):Comportamento da fonte de excitação, LED, da referência, QD, e sensor de O2 (Ru):
Variação da potência de excitação de 100% para 82% e 63% em atmosfera de 20% O2.Variação da potência de excitação de 100% para 82% e 63% em atmosfera de 20% O2.
Variação da concentração de O2 de 0% para20% e 100%, potência de excitação constante.Variação da concentração de O2 de 0% para20% e 100%, potência de excitação constante.
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 8500
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
Inte
nsity
(a.u
)
λ (nm)
100% PLED
82% PLED
63% PLED
LEDQD
Ru
400 450 500 550 600 650 700 750 800 8500
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
Ru
QD
Inte
nsity
(a.u
.)λ (nm)
0% O2
20% O2
100% O2
LED
QD como referência de intensidade
Resposta do sensor (PRu e PRu/PQD) a ciclosde saturação O2/N2 enquanto a potência do LED, PLED,, muda lentamente entre 100% e 70%.
Resposta do sensor (PRu e PRu/PQD) a ciclosde saturação O2/N2 enquanto a potência do LED, PLED,, muda lentamente entre 100% e 70%.
0:01:17 0:02:38 0:04:00 0:05:22 0:06:44 0:08:06 0:09:28 0:10:500.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
100% O2
100% N2
Nor
mal
ized
Inte
nsity
Time (h:min:s)
PLED
PRu
PRu/PQD
10 15 20 25 30 35 40 45
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
Nor
mal
ized
Inte
nsity
LED current
Ru Ru-Qd/Ru +Qd
Após processamento, variação máxima do sinal compensado não excede 1.5%, mesmopara variações de potência óptica de 80%.
Após processamento, variação máxima do sinal compensado não excede 1.5%, mesmopara variações de potência óptica de 80%.
(b) Ru(bpy) + QD CdTe/ZnS QD (680 nm) em sol-gel não-hidrolitico (filmesseparados) .
(b) Ru(bpy) + QD CdTe/ZnS QD (680 nm) em sol-gel não-hidrolitico (filmesseparados) .
Espectros de emissão em 100% N2 e 100% O2:
(a) Ru(bpy) em sol-gel não-hidrolitico.
Sensor de O2 com espectro de emissãodiferenciado.
575 600 625 650 675 700 725 750 775 800 8250
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
Ru bpy
excitation detection
sensing element
Lum
ines
cenc
e In
tens
ity (a
.u)
λ (nm)
100% N2
100% O2
(a)
575 600 625 650 675 700 725 750 775 800 8250
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
QD
excitation detection
sensing element
long pass filter (600 nm)
Ru bpy
Lum
ines
cenc
e In
tens
ity (a
.u.)
λ (nm)
100% N2
100% O2
(b)
Interrogação de múltiplos sensores
QDnBRu + QDnB
Sensing head
O2 permeable menbrane
Tapered fiber
OXYGEN SENSOR N
TEMPERATURESENSOR N
SENSOR 1 SENSOR 2 SENSOR 3
SENSOR N
Detection and processing
unitOPT
ICA
LSO
UR
CE
OPTICAL FIBER CABLE
0
0.25
0.5
0.75
1
400 500 600 700 800 900λ (nm)
Norma
lized O
ptical P
ower
Rubpy [O2,T]Blue LEDQD550 [T]QD700 [O2,T]
Spectral Distribution of Sensor 1
CONCLUSÃO• As propriedades ópticas dos QD tornam-os extremamente atractivos para
substituir marcadores orgânicos em aplicações biomédicas.
• Melhoram o desempenho de técnicas existentes e permitem implementar novas técnicas.
• O comportamento espectral dos QD permite implementar sensores detemperatura auto referenciáveis.
• A sua elevada fotoestabilidade torna-os excelentes para usar como referências de intensidade em sensores luminescentes.
• A combinação de QD com corantes orgânicos torna possível a multiplexagem de sensores bioquímicos.
• Um grande potencial ainda por explorar!
Algumas Questões• Quais as principais consequências do confinamento quântico nas
propriedades de luminescência?
• Qual o efeito da temperatura na fluorescência de marcadores moleculares?
• Qual o efeito da temperatura na fluorescência dos QD?
• Quais os problemas associados à medição directa da intensidade de luminescência? Alternativas?
• Que comprimentos de onda são mais adequados para aplicações biológicas? Visível, infravermelho?
• E comprimentos de onda de excitação?
