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NATHÉRCIA PERCEGONI
“PERFIL HORMONAL E DE CITOCINAS DURANTE A GÊNESE DO
SOBREPESO EM RATAS OVARIECTOMIZADAS”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 6
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i
Percegoni, Nathércia. Perfil Hormonal e de Citocinas Durante a Gênese do Sobrepeso em Ratas Ovariectomizadas / Nathércia Percegoni – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2006. xiv, 104f.: il. Dissertação (Doutorado em Ciências Biológicas – Fisiologia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2006. Orientadora: Denise Pires de Carvalho 1. ovariectomia. 2. menopausa. 3. Sobrepeso. 4. obesidade. 5. citocinas. 6. Hormônios tireóideos. 7. Leptina. 8. Corticosterona – Teses. I. Percegoni, Nathércia. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título
ii
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de
amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pelo Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico (CNPq).
iii
Essa vitória eu dedico a você tio Gecel, esteja onde estiver, saiba que a saudade
é grande. O tempo com você foi curto, mas suficiente para nos deixar um legado
de alegria e alto astral! Um grande homem, uma grande mente e um coração
maior ainda. Sei que a gente ainda vai se encontrar...
iv
AAAgggrrraaadddeeeccciiimmmeeennntttooosss
Em primeiro lugar à Masaco Oya Masuda, que me deu oportunidade de
ingressar no programa de doutorado, abrindo suas portas e tornando possível
minha vinda para o Rio de Janeiro. Serei sempre grata!
À Regina Goldemberg, por quem tenho grande admiração, que inicialmente
me orientou e me guiou para que eu pudesse trabalhar com a linha de pesquisa
que desejava. Obrigada pelo carinho e compreensão.
À minha orientadora Denise Pires de Carvalho, exemplo de determinação.
Pelo profissionalismo com que conduz os trabalhos e pelas oportunidades que me
proporcionou.
À Doris Rosenthal, exemplo de dedicação, que com seu jeito me incentiva a
superar cada vez mais os meus limites!
À Vivian Rumjanek, exemplo de profissionalismo, sensibilidade, carisma e
capacidade. Pela ajuda e pela parceria estabelecida. Você me faz lembrar uma
frase: “Hay que endurecer, pero sin perder la ternura jamás”
À Morgana Teixeira Lima Castelo Branco, pela ajuda tão valiosa, e pela
amizade e carinho a mim dispensados.
Às professoras Vânia Costa e Tamar Frankenfield, pela amizade e
inúmeros auxílios durante esta jornada.
A amiga Andréa Ferreira pelas orientações, pela amizade e sobretudo pelo
exemplo de retidão de caráter, senso de justiça e equilíbrio. Na vida sempre
devemos seguir um modelo, saiba que me espelho em você!!!
v
Ao amigo Rodrigo Fortunato, pela amizade fiel, pelas ajudas com as
dosagens e pelo exemplo de sagacidade.
Aos amigos do laboratório de Fisiologia Endócrina: Flávia Nóbrega, Lívia de
Lima, Alba Cenélia, Michelle Marassi, Mônica Mulbauer, Valmara Pereira, Tiago
Pantaleão, Sabrina Coelho, Danielle Ignácio, Glória Ginabreda, Elaine. Obrigada
pela amizade sincera! É muito bom saber que em um ambiente de trabalho ainda
existem solidariedade e companheirismo entre as pessoas.
Ao Advaldo e à Norma, sempre tornando o nosso ambiente de trabalho
menos pesado e mais alegre. Obrigada pela ajuda nos experimentos!
Ao Wagner, pela amizade e pela capacidade de reconhecer nas pessoas o
que elas tem de melhor.
À Caroline Ferreti, pela oportunidade de orientá-la e pela grande ajuda nos
experimentos. Principalmente pela confiança que depositou em mim. Pela
amizade sincera e por me fazer acreditar em orientação, apesar dos pesares.
À Luciene Paschoal, amiga de longa data, pelo carinho e por todo o auxílio
e sinceridade sempre.
Ao Dr. Paulo Barragat e toda a sua família, por terem me acolhido em sua
casa e me apresentado ao Rio de Janeiro, e pela ajuda durante todo esse tempo
fora de casa. Minha gratidão será eterna.
A amiga Cristina Monteiro, agora professora da UFRJ, você me enche de
orgulho! Obrigada pela amizade, pela companhia nos finais de semana na UFRJ
para cuidar dos ratinhos. Você é uma amiga como poucas, daquelas que a gente
pode contar em todas as ocasiões. Que bom que você existe!
vi
As amigas Danielle Lopes e Flávia Hosken pela alegria com que vocês
conduzem a vida! Pelas escapulidas sempre divertidas desse mundo tão sério!
Pelos conselhos e pelos passeios!
A minha cunhadinha Viviane Pessoa, pelos livros cheios de mensagens de
luz, que muitas vezes me deram forças e recarregaram minhas baterias frente às
adversidades. Obrigada pela amizade e carinho!
À minha família, pela força e compreensão das minhas ausências! E por
sempre acreditarem em mim, me dando confiança para seguir em frente!
Ao Antônio, que me ensinou que o amor não pode ser escolhido, medido ou
calculado. Ele vem de onde menos se espera e, sendo verdadeiro, nos ampara
sempre. Obrigada por estar sempre aqui. Te amo.
vii
RRReeesssuuummmooo
PERCEGONI, Nathércia. PERFIL HORMONAL E DE CITOCINAS DURANTE A GÊNESE DO SOBREPESO EM RATAS OVARIECTOMIZADAS. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas – Fisiologia) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2006. O presente trabalho pretendeu verificar a gênese do sobrepeso em ratas ovariectomizadas e suas relações com consumo alimentar e/ou gasto energético orgânico. Para utilizou-se ratas Wistar fêmeas, de 200g de peso corporal mantidas em gaiolas individuais. O trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa, as ratas foram divididas em: ovariectomizadas (OVX) e controle estressadas cirurgicamente (SHAM). Mensurou-se a cada dois dias o peso corporal e a ingestão hídrica e alimentar destes animais. O sacrifício foi realizado aos 44 dias após a castração. Na segunda etapa, as ratas com ciclo estral regular, foram divididas em: ovariectomizadas (OVX); ovariectomizadas com administração de estrogênio (0.7µg/100g p.c.) (OVX + EB) a partir do primeiro dia de castração, controle estressadas cirurgicamente (SHAM) e controle intactas (C). Mensurou-se diariamente o peso corporal e as ingestões alimentar e hídrica destes animais. O sacrifício foi feito após 3, 6, 9 e 13 dias de castração, quando se mensurou a porcentagem das gorduras retroperitoneal e periinguinal. Mediu-se T3, T4, TSH, leptina e corticosterona por RIE e IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α por ELISA no soro destes animais. Nossos resultados mostraram um aumento de peso corporal significativo nos grupo OVX, a partir do 13° dia de castração, e redução do peso corporal no grupo OVX + EB, que foi significativa nos dias 6 e 9 após a ovariectomia. Em relação aos consumos hídrico e alimentar não foram observadas diferenças importantes entre os grupos. A gordura retroperitoneal encontra-se reduzida no grupo OVX + EB em relação ao grupo OVX a partir do 6° dia; entretanto esta diferença não é significativa. A gordura periinguinal está reduzida nos grupos OVX e OVX + EB, o que é significativo a partir do 3° dia após a ovariectomia. A leptina está reduzida no grupo OVX + EB no 6° dia, e a corticosterona não apresenta variação significativa entre os grupos, apesar dos grupos OVX e OVX + EB apresentarem comportamentos semelhantes para este hormônio ao longo do experimento; sendo que o grupo OVX + EB apresenta valores reduzidos em relação ao grupo OVX, em todos os momentos. O hormônio T3 não apresenta variação importante entre os grupos OVX e OVX + EB; T4 está significativamente elevado no grupo OVX no 13° dia, e TSH está significativamente elevado no grupo OVX + EB no dia 9. Em relação às citocinas inflamatórias, IL-1β está significativamente aumentada nos grupos OVX e OVX + EB durante todo o experimento. IL-6 difere no 3° dia entre os grupos, estando elevada no grupo OVX e IL-10 encontra-se elevada nos grupos OVX e OVX + EB a partir do 9° dia após a castração. TNF-α não apresenta modificações importantes entre os grupos. Concluímos que a ovariectomia eleva o peso
viii
corporal das ratas após o 13° dia de ovariectomia, e que este ganho de peso não está relacionado a hiperfagia. Relaciona-se às modificações no gasto energético, acompanhadas por uma modificação no perfil de citocinas inflamatórias no soro destes animais. A administração de estrogênio previne o ganho de peso nos primeiros dias após o procedimento cirúrgico. O aumento nas concentrações de IL-1 parece estar relacionado às modificações no peso corporal, e a elevação tardia nas concentrações de IL-10 sugere a existência de um mecanismo intrínseco de defesa contra as modificações sofridas no peso corporal total. Palavras Chave: ovariectomia, menopausa, obesidade, sobrepeso, citocinas, corticosteróides, hormônios tireóideos, leptina.
ix
AAAbbbssstttrrraaacccttt
PERCEGONI, Nathércia. Hormones and cytokines profiles overweight genesis in ovariectomizated rats. Tese (Doctor in Biology Science - Fisiology), IBCCF°, UFRJ, Rio de Janeiro, 2006. This study intended to verify the genesis of increase in body weight in ovariectomy rats, and this relationship with food intake and metabolic rate. Female wistar rats weighting 200g here held in individual cages. The study was divided in two steps. At firt, they were divided in ovariectomizated (OVX) and sham operated (SHAM) groups. Body weight, food and water intake were measured every two days. The rats were killed 44 days after ovariectomy. Later, rats were divided in 4 groups: ovariectomizated (OVX), ovariectomizated with estrogen (OVX + EB), sham operated (SHAM) and control intact (C) groups. Body weight, food and water intake were measured every day. The rats were killed 3, 6, 9 and 13 days after ovariectomy. On the sacrifice day, retroperitoneal and periinguinal fats were weighted. Leptin, corticosterone, TSH, T3, T4, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α serum concentrations were measured. The results show increased on body weight in OVX group, 13 days after ovariectomy. The OVX + EB group show decrease on body weight 6 and 9 days after ovariectomy. The water and food intake did not show differences betwen groups. The retroperitoneal fat decreased in OVX + EB group when compared with OVX group after day 6, but this difference was not significant. Periinguinal fat decreased in OVX and OVX + EB group after day 3. Leptin was decreased in OVX + EB group in the day 6; and corticosterone did not betwen groups. Serum T3 levels do not differ betwen OVX and OVX + EB groups; serum T4 increased in OVX groups, on the 13 day, and serum TSH levels increased in OVX + EB group, on the 9 day. About cytokines, IL-1β increased in OVX and OVX + EB groups in all times studied. Serum IL-6 were elevated in OVX group in day 3. IL-10 levels were elevated in OVX an OVX + EB after day 9. TNF-α did not alter in any group. We concluded that in rats, ovariectomy increase body weight after 13 days, and the increase in body weight is not associated with increase in food intake. The estrogen avoids body weight gain in the first days after ovariectomy. Increase in serum IL-1β may be related to body weight modifications and the increase in IL-10 levels appears to be an intrinsic mechanism against changes in body weight. key words: ovariectomy, menopause, obesity, overweight, cytokines
x
LLLiiissstttaaa dddeee aaabbbrrreeevvviiiaaatttuuurrraaasss
ACTH: hormônio adenocorticotrófico
AGRP: proteína relacionada a agouti
AMPc: adenosina monofosfato cíclica
ASP: proteína estimuladora de acilação
ATP: adenosina trifosfato
BAT: tecido adiposo marrom
C: grupo controle intacto
CART: transcrito regulado por cocaína e anfetamina
CRH: hormônio liberador de corticotrofina
DIO II: desiodase tipo II
EB: benzoato de estradiol
ELISA: “Enzime linked Immuno Sorbent Assay”
eNOS: sintase de óxido nítrico endotelial
ERα: receptor de estrogênio alfa
GLUT4: transportador de glicose tipo 4
HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência
HT: hormônio tireoideano 125I: iodo radioativo 125
IKKβ: 1 Kappa beta quinase
IL-1β: interleucina 1 beta
IL-2: interleucina 2
IL-6: interleucina 6
IL-10: interleucina 10
iNOS: sintase de óxido nítrico indutível
IRS-1: substrato do receptor de insulina 1
IRS-1pSer: substrato do receptor de insulina fosforilado nos seus resíduos de serina
JNK: janus quinase
MCP-1: proteína quimioatrativa de monócito
xi
NF-Kappa B ou NFκB: fator nuclear kappa B
NO: óxido nítrico
NPY: neuropeptídeo Y
OVX: ovariectomia / ovariectomizado
OVX + EB: ovariectomizado com reposição estrogênica (benzoato de estradiol)
PAI-1: inibidor do ativador de plasminogênio
p.c.: peso corporal
POMC: proopiomelanocortina
RIE: radimunoensaio
RI: resto ingestão
rT3: T3 reverso
Ser: serina
SHAM: grupo controle falso-operado
SOCS-3: supressor de sinalização de citocinas 3
TAB: tecido adiposo branco
TBG: globulina ligadora de tiroxina
TMB: taxa metabólica basal
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
TRH: hormônio liberador de tireotrofina
TRα: receptor de hormônio tireoideano alfa
TRβ: receptor de hormônio tireoideano beta
TSH: hormônio tireotrófico
TTR: transtiretina
Tyr: tirosina
T3: triiodotironina
T4: tetraiodotironina
UCP1: proteína desacopladora mitocondrial 1
UCP2: proteína desacopladora mitocondrial 2
UCP3: proteína desacopladora mitocondrial 3
UCPs: proteína desacopladoras mitocondriais
VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade
xii
LLLiiissstttaaa dddeee fffiiiggguuurrraaasss
Figura 1 ............................................................................................................. 5
Figura 2 ............................................................................................................. 6
Figura 3 ............................................................................................................. 8
Figura 4 ............................................................................................................ 15
Figura 5 ............................................................................................................. 16
Figura 6 ............................................................................................................. 19
Figura 7 ............................................................................................................. 22
Figura 8 ............................................................................................................. 25
Figura 9 ............................................................................................................. 26
Figura 10 ........................................................................................................... 28
Figura 11 ........................................................................................................... 33
Figura 12 ........................................................................................................... 37
Figura 13 ........................................................................................................... 38
Figura 14 ........................................................................................................... 88
Gráfico 1 ............................................................................................................ 43
Gráfico 2 ............................................................................................................ 45
Gráfico 3 ............................................................................................................ 47
Gráfico 4 ........................................................................................................... 49
Gráfico 5 ............................................................................................................ 51
Gráfico 6 ............................................................................................................ 53
Gráfico 7 ............................................................................................................ 55
Gráfico 8 ............................................................................................................ 57
Gráfico 9 ............................................................................................................ 59
Gráfico 10 .......................................................................................................... 61
Gráfico 11 .......................................................................................................... 63
xiii
Gráfico 12 .......................................................................................................... 65
Gráfico 13 .......................................................................................................... 67
Gráfico 14 .......................................................................................................... 69
Gráfico 15 ..........................................................................................................
71
xiv
LLLiiissstttaaa dddeee TTTaaabbbeeelllaaasss
Tabela 1 ............................................................................................................. 44
Tabela 2 ............................................................................................................ 46
Tabela 3 ............................................................................................................ 48
Tabela 4 ........................................................................................................... 50
Tabela 5 ............................................................................................................ 52
Tabela 6 ............................................................................................................ 54
Tabela 7 ............................................................................................................ 56
Tabela 8 ............................................................................................................ 58
Tabela 9 ............................................................................................................ 60
Tabela 10 .......................................................................................................... 62
Tabela 11 .......................................................................................................... 64
Tabela 12 .......................................................................................................... 66
Tabela 13 .......................................................................................................... 68
Tabela 14 .......................................................................................................... 70
Tabela 15 .......................................................................................................... 72
xv
SSSuuummmááárrriiiooo
FICHA CATALOGRÁFICA..............................................................................
APOIO.............................................................................................................
DEDICATÓRIA................................................................................................
AGRADECIMENTOS......................................................................................
RESUMO.........................................................................................................
ABSTRACT.....................................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................
LISTA DE TABELAS.......................................................................................
INTRODUÇÃO ...............................................................................................
i
ii
iii
iv
vii
ix
x
xii
xiv
1
1. Estrogênio e regulação do peso corporal ................................................ 1
2. Adipocinas ............................................................................................... 4
2.1. Leptina- um hormônio produzido pelo tecido adiposo .................... 8
2.2. Fator de necrose tumoral (TNF-α) .................................................. 13
2.3. Interleucina 6 (IL-6) ......................................................................... 17
3. Outras citocinas possivelmente envolvidas na regulação do
metabolismo energético ..............................................................................
20
3.1. Interleucina 1 (IL-1) ......................................................................... 20
3.2. Interleucina 10 (IL-10) ..................................................................... 22
4. Hormônios tireóideos ............................................................................... 25
5. Glicocorticóides .......................................................................................
6. Justificativas ............................................................................................
29
33
OBJETIVOS ...................................................................................................
35
xvi
1. Objetivo geral .......................................................................................... 35
2. Objetivos específicos ............................................................................... 35
MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................
36
1. Tratamento e sacrifício dos animais ........................................................ 36
2. Primeira fase de experimentos ................................................................ 36
3. Segunda fase de experimentos ............................................................... 37
4. Dosagens de citocinas ............................................................................ 39
5. Dosagens hormonais ............................................................................... 39
5.1. Radioimunoensaio de TSH ............................................................. 39
5.2. Radioimunoensaio de T3 e T4 .......................................................... 40
5.3. Radioimunoensaio de leptina .......................................................... 40
5.4 Radioimunoensaio de corticosterona ............................................... 41
6. Análise estatística .................................................................................... 41
RESULTADOS ...............................................................................................
43
1. Primeira etapa – detecção do momento no qual se inicia o ganho de
peso corporal após a ovariectomia ..............................................................
43
2. Segunda etapa ........................................................................................ 44
2.1. Peso corporal .................................................................................. 44
2.2. Gorduras ......................................................................................... 47
2.2.1. Gordura retroperitoneal ................................................................ 47
2.2.2. Gordura periinguinal ..................................................................... 49
3. Consumo alimentar ................................................................................. 51
4. Consumo hídrico ..................................................................................... 53
5. Verificação dos parâmetros séricos na ovariectomia e na reposição
hormonal – perfil hormonal ..........................................................................
55
5.1. Leptina ............................................................................................ 55
xvii
5.2. Corticosterona ................................................................................. 57
5.3. Triiodotironina (T3) .......................................................................... 59
5.4. Tetraiodotironina (T4) ...................................................................... 61
5.5. TSH ................................................................................................. 62
6. Verificação dos parâmetros séricos na ovariectomia e na reposição
hormonal – Citocinas ...................................................................................
65
6.1. IL-1β ................................................................................................ 65
6.2. IL-6 .................................................................................................. 67
6.3. IL-10 ................................................................................................ 69
6.4. TNF-α .............................................................................................. 71
DISCUSSÃO ..................................................................................................
74
CONCLUSÕES ..............................................................................................
87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................
89
1
IIInnntttrrroooddduuuçççãããooo
1. Estrogênio e regulação do peso corporal
Os principais hormônios ovarianos são os estrógenos, a progesterona e em
menor proporção, os andrógenos, a relaxina e a inibina, entre outros. Os
estrógenos normalmente encontrados na espécie humana são: estradiol, estrona e
estriol que são produzidos principalmente pelo ovário, mas também podem ser
produzidos por conversão periférica a partir de andrógenos em outros tecidos,
como, por exemplo, no tecido adiposo.
A concentração plasmática dos estrógenos é baixa na infância (menor que
10pg/ml), eleva-se gradativamente durante a puberdade, atingindo concentrações
cíclicas após a menarca. Após a menopausa, a concentração plasmática de
estrogênios decresce bastante devido à falência hormonal ovariana (menos de 10
pg/ml). Na idade adulta, o principal estrógeno circulante é o 17β-estradiol;
entretanto, no período pós-menopausa, a estrona passa a ser o principal
estrógeno plasmático resultante da conversão de androstenediona produzida
pelos ovários e adrenais. As pequenas concentrações de progesterona e 17-α-
OH-progesterona secretadas nesta fase da vida são de origem adrenal (Bulun e
Adashi, 2002).
Os hormônios ovarianos exercem seus efeitos em uma gama de tecidos e
sistemas, como: sistema reprodutor, sistema nervoso central, sistema
cardiovascular, hematopoético e outros (Bulun e Adashi, 2002).
Atualmente, vários trabalhos têm demonstrado um papel importante do
estradiol na regulação do peso corporal.
Na espécie humana a última menstruação ocorre normalmente entre os 45
e 55 anos de idade devido à falência ovariana, e se caracteriza pelo aparecimento
de uma série de sintomas e sinais relativos à privação hormonal (Bulun e Adashi,
2002).
2
Esse é um período de grandes transformações no organismo feminino e as
principais alterações observadas relacionam-se ao aumento na taxa de
reabsorção óssea, redução de glicocorticóides plasmáticos totais,
desenvolvimento de obesidade andróide, modificação do perfil lipídico,
hipertensão arterial e ganho de peso corporal (Sakai e cols, 2000).
O ganho de peso corporal, causado pela redução dos níveis de estrogênio
após a menopausa aumenta o risco de doenças cardiovasculares, diabetes e
hipertensão, podendo levar a um quadro conhecido atualmente como síndrome
metabólica. Ainda, aumenta a incidência e a severidade de infecções. Algumas
evidências sugerem que a terapia de reposição hormonal pode apresentar
benefício para redução de doenças osteo-articulares e cardiovasculares,
entretanto, outros efeitos adversos podem ocorrer, como aumento do risco de
câncer no endométrio e eventos trombo-embólicos (Stallone, 1994).
Animais ovariectomizados são um modelo experimental bastante aceito
para o estudo das modificações fisiológicas decorrentes da menopausa, pois
apresentam alterações metabólicas semelhantes àquelas encontradas em
mulheres após a falência ovariana. A ovariectomia corresponde à remoção
bilateral dos ovários, com conseqüente redução do estrogênio e progesterona
plasmáticos em fêmeas de várias espécies animais. Vários estudos demonstram
aumento de peso corporal progressivo em ratas ovariectomizadas, embora apenas
um estudo tenha avaliado o ganho de peso progressivo, com o tempo decorrido
após ovariectomia. Nesse estudo, as ratas ovariectomizadas obtiveram ganho de
peso corporal ponderal maior que as ratas controle, sendo, este aumento,
significativo a partir da 11° semana em ratas de 21 dias pesando 60 ± 5g ; e a
partir da 9° semana em ratas de 60 dias pesando 200 ± 15g. Para esses autores,
a privação dos hormônios ovarianos em ratas, seja em idade jovem ou mais
avançada, está relacionada com ganho de peso ponderal (Vasconcelos e cols,
2004). Observam-se nas primeiras semanas após a ovariectomia, elevação nos
níveis de algumas citocinas inflamatórias e redução dos níveis de leptina
circulantes; fatores que podem estar contribuindo para a gênese do ganho de
peso corporal. A administração de estrogênio é capaz de reverter o aumento nas
3
concentrações destas citocinas inflamatórias, principalmente em ratas jovens
(Johnson e Sohrabji, 2005).
Sabe-se há muitas décadas que o estrogênio tem um papel regulador da
quantidade e distribuição de gordura corporal total. Esse papel foi confirmado em
estudos recentes feitos em camundongos “knockout” para o receptor de
estrogênio α (ER α), ou “knockout” para aromatase, a enzima responsável pela
biossíntese do estrogênio. Esses animais apresentam aumento significativo de
tecido adiposo e dislipidemia (Heine e cols, 2000; Jones e cols, 2000). Além
desses achados, ratas ovariectomizadas apresentam ganho de peso corporal
superior aquelas falso operadas e o tratamento com estrogênio promove um
menor ganho de peso em relação aos animais ovariectomizados não repostos
com estrogênio (Yoneda e cols, 1998; Thomas e cols, 1986; Pedersen e cols,
2001). Os estudos recentes sugerem que o receptor de estrogênio α (ERα) seja
aquele responsável por mediar o efeito deste hormônio sobre a regulação do peso
corporal (Roesch, 2006), mas os mecanismos pelo qual o estrogênio seria capaz
de modular o peso corporal ainda não foram completamente elucidados. Muitos
autores correlacionam o ganho de peso corporal em ratas ovariectomizadas, e em
mulheres na menopausa, ao aumento da ingestão alimentar (Jeusette e cols,
2004; Liang e cols, 2002; Ainslie e cols, 2001; Shimizu e cols, 1996). No entanto,
alguns trabalhos relatam que esse ganho de peso seria secundário a alterações
no gasto energético diário (Roesch, 2006).
Com relação aos efeitos do estrogênio sobre o gasto energético, acredita-
se que esse esteróide seja capaz de regular a expressão de proteínas
desacopladoras mitocondriais (UCPs) nos tecidos adiposos branco e marrom.
Ratas ovariectomizadas apresentam redução na expressão de UCP1 no tecido
adiposo marrom, entretanto, a expressão de UCP2 e UCP3 não se altera com a
diminuição do estrogênio. Contudo, observa-se redução na expressão de UCP2
no tecido adiposo branco em ratas ovariectomizadas. A redução na expressão das
UCPs nos diferentes tipos de tecidos poderia ser um dos fatores responsáveis por
causar decréscimo no gasto energético, e conseqüente aumento de peso corporal
em ratas ovariectomizadas (Pedersen e cols, 2001). Um outro efeito do estrogênio
4
de similar relevância é o seu papel na modulação dos níveis plasmáticos de
citocinas, o que pode se correlacionar com o aumento de peso corporal (Johnson
& Sohrabji, 2005).
No tecido adiposo são produzidas várias substâncias, dentre as quais
leptina, resistina, adiponectina, e outros mediadores químicos (Nedvídková e cols,
2005). Algumas destas substâncias têm sido relacionadas ao desenvolvimento de
obesidade e resistência à insulina. Estudos recentes sugerem que a obesidade é
caracterizada por um acúmulo de macrófagos no tecido adiposo. Esta infiltração
de macrófagos parece contribuir substancialmente para a liberação de citocinas
inflamatórias no tecido adiposo e para o desenvolvimento da obesidade em
roedores e humanos. (Hauner, 2004). Entretanto, a maior parte dos estudos avalia
o perfil de citocinas plasmáticas após a instalação da obesidade, impedindo a
correta avaliação dos mecanismos relacionados à gênese do sobrepeso.
2. Adipocinas
Os mediadores químicos secretados no tecido adiposo são denominados
conjuntamente de adipocinas, tais como leptina, adiponectina, adipsina, inibidor do
ativador de plasminogênio (PAI-1), proteína estimuladora de acilação (ASP),
angiotensinogênio e fator de necrose tumoral (TNF-α), embora esta lista esteja
sendo constantemente ampliada com a descoberta de substâncias biologicamente
ativas provenientes do tecido adiposo branco (Figura 1) (Fonseca-Alanis e cols,
2006).
Algumas dessas substâncias são citocinas inflamatórias e resultam da
migração macrofágica para o tecido adiposo, quando este se encontra em
excesso; ou são hormônios capazes de regular o balanço energético do
organismo. Estas substâncias por estarem envolvidas no controle do balanço
energético, podem modular o peso corporal total. Tais substâncias, como TNF-α,
leptina e principalmente IL-6 (interleucina 6), têm seus efeitos biológicos
sistêmicos relacionados à lipólise ou a lipogênese de tecido adiposo branco. O
estímulo ou a inibição de sua secreção no tecido adiposo está diretamente
5
relacionado ao desenvolvimento de sobrepeso e obesidade (Fonseca-Alanis e
cols, 2006).
Figura 1. Principais fatores protéicos e não protéicos produzidos pelo tecido
adiposo branco (TAB)
Animais ovariectomizados, e mulheres na menopausa, apresentam
variações importantes nas concentrações séricas de algumas dessas substâncias
produzidas no tecido adiposo, e, na maioria das vezes, estas variações
correlacionam-se ao incremento de peso corporal total observado após
ovariectomia ou durante a menopausa. As citocinas, como TNF-α e outras,
desempenham papéis importantes no controle dos estoques energéticos e da
ingestão calórica. Pouco se conhece a respeito do mecanismo de ação destas
citocinas no hipotálamo, mas aparentemente, de forma aguda, podem induzir a
expressão de peptídeos orexígenos, como NPY (neuropeptídeo Y) e CRH
(hormônio liberador de corticotrofina) e de forma crônica, diminuir os anorexígenos
como POMC (proopiomelanocortina) (Amaral e cols, 2006).
O consumo de alimentos ricos em gorduras saturadas induz a expressão de
citocinas no tecido adiposo. A sinalização pró-inflamatória regional
(particularmente a ação de citocinas como TNF-α induzindo a expressão de IL-1β,
IL-6 e IL-10) promove aumento na expressão neuronal de SOCS-3 (supressor da
sinalização de citocinas tipo 3), a qual participa de mecanismos intracelulares de
LeptinaLeptina
CitocinasCitocinas Adiponectina
prostaglandinas
GlicocorticóidesGlicocorticóides
ResistinaNÚCLEOEstrógenos
6
inibição de sinais anorexigênicos no hipotálamo. Contudo, as conseqüências
hipotalâmicas do consumo de dieta rica em lipídeos não se restringem à indução
de SOCS-3. Na verdade, o fenômeno pró-inflamatório ativa as vias de sinalização
inflamatórias da JNK (janus quinase) e NF-Kappa B (fator nuclear Kappa B) em
neurônios do núcleo arqueado e do hipotálamo lateral. Essa via de sinalização
leva à resistência à insulina no hipotálamo de animais alimentados com dieta
hiperlipídica. Esse mecanismo pode ser um dos responsáveis pela gênese da
obesidade, por induzir resistência hipotalâmica à ação da insulina e da leptina, que
têm efeito anorexígeno, concomitantemente ao aumento no consumo alimentar via
efeito orexígeno mediado pela expressão de SOCS (Velloso, 2006). (Figura 2)
Figura 2. Resumo das possíveis vias de sinalização propostas para a ação das
citocinas no hipotálamo.
O tecido adiposo sofre influência de vários fatores hormonais para o seu
desenvolvimento e funcionamento: alguns desses hormônios têm atividade
predominantemente catabólica (catecolaminas), outros têm atividade
predominantemente anabólica (insulina); outros ainda possuem papel permissivo à
Citocinas (inicialmente TNF-αααα)
↑↑↑↑ NPY e CRH↓↓↓↓ POMC
↓↓↓↓ anorexigênicos
↑↑↑↑ SOCS-3
↑↑↑↑ Vias de sinalização JNK e NF-Kappa B
resistência à insulinainsulina
Síndrome metabólicaSíndrome metabólica
Efeito orexígeno
Hipotálamo
7
ação de outros hormônios (glicocorticóides) e alguns são importantes para o seu
desenvolvimento embriológico além de seus efeitos metabólicos (hormônios da
tireóide) (Fonseca-Alanis e cols, 2006).
O adipócito, de acordo com a sua localização, apresenta características
metabólicas diferentes, sendo a adiposidade intra-abdominal aquela que
apresenta maior impacto sobre a diminuição da sensibilidade à insulina.
Entretanto, o mecanismo fisiopatogênico pelo qual o acúmulo desta gordura
poderia induzir a obesidade ainda é desconhecido (Ribeiro Filho e cols, 2006).
Atualmente, a produção de citocinas inflamatórias tem sido relacionada à
resistência insulínica comumente associada à adiposidade intra-abdominal. A
capacidade do adipócito em produzir citocinas e quimiocinas tem sido estudada
como uma possível causa de obesidade. As citocinas infiltram o estroma do tecido
adiposo abdominal em ratos, contribuindo para a perpetuação e exacerbação do
processo inflamatório crônico. A expressão de marcadores inflamatórios é mais
acentuada na gordura visceral que na subcutânea, fator que parece interferir no
impacto metabólico da adiposidade intra-abdominal (Wellen e cols, 2003; Ribeiro
Filho e cols, 2006).
Os mecanismos pelos quais a obesidade leva à resistência insulínica ainda
não estão totalmente esclarecidos. Estudos recentes têm demonstrado um papel
decisivo das citocinas inflamatórias produzidas no tecido adiposo, na ligação entre
obesidade e diabetes tipo II. Sabe-se, até o momento, que as citocinas ativam a
via de sinalização da Janus quinase, que por sua vez inibe a cascata de
sinalização insulínica, via inativação do substrato para o receptor de insulina (IRS-
1). Em contrapartida, a produção de citocinas no tecido adiposo predispõe à maior
formação de tecido adiposo, completando o ciclo obesidade – citocinas – diabetes
(Tilg & Moschen, 2006) (Figura 3).
8
Figura 3. Relação entre citocinas e obesidade associada à resistência à insulina.
JNK: Janus quinase; IRS-1: substrato do receptor de insulina 1; IKK: 1 Kappa β
quinase). Adaptado do site: http://www.hsph.harvard.edu/GSH-LAB/
2.1. Leptina – um hormônio produzido pelo tecido adiposo
A leptina é um produto do gene ob (Houseknecht e cols, 1988) em vários
tecidos, incluindo placenta, glândulas mamárias e endométrio, mas a sua
produção ocorre principalmente no tecido adiposo (Meli e cols, 2004). Esse
hormônio está diretamente envolvido na homeostase energética do organismo
em roedores e humanos (Isidori e cols, 2000). Seu principal efeito é
anorexígeno, pois atua nos neurônios de primeira ordem do núcleo arqueado do
hipotálamo, promovendo sensação de saciedade. Promove estimulação dos
neurônios anorexígenos produtores de POMC (proopiomelanocortina) / CART
(transcrito regulado pela cocaína e anfetamina) e inibição dos neurônios
orexígenos produtores de AGRP (proteína relacionada a agouti) / NPY
(neuropeptídeo Y), que por sua vez atuam nos neurônios de segunda ordem do
núcleo arqueado. Isso resulta em redução do consumo alimentar e aumento do
gasto energético simultaneamente (Otero e cols, 2005, Meli e cols, 2004).
A leptina circulante no plasma está relacionada, e é diretamente
proporcional, à quantidade de tecido adiposo do organismo. Sua liberação no
OBESIDADE
TNF-αααα, IL-6, IL-1
JNK
DiabetesIKK
IRS-1 pSer
Receptor de insulina
OBESIDADE
TNF-αααα, IL-6, IL-1
JNK
DiabetesIKK
IRS-1 pSer
Receptor de insulina
9
sangue reflete o conteúdo de triglicerídeos estocados e o metabolismo
energético (Houseknecht e cols, 1988). Portanto, nos indivíduos obesos ela
existe em grande quantidade. No entanto, nestes indivíduos a leptina não exerce
seus efeitos anorexígenos de forma satisfatória. Postula-se nestes casos a
existência de um mecanismo de resistência à ação da leptina (Isidori e cols,
2000).
Há mais leptina circulante nas mulheres do que nos homens. Tal fato pode
ser devido a maior porcentagem de gordura encontrada nas mulheres,
fisiologicamente relacionada à reprodução (Shimizu e cols, 1997; Isidori e cols,
2000). Segundo Tomaseli (2001) as fêmeas, em todas as espécies, possuem
maior expressão do gene ob, o que explicaria as maiores concentrações de
leptina circulantes.
A secreção de leptina também é influenciada por muitos fatores metabólicos
e hormonais. Em humanos, glicocorticóides, insulina, hormônios tireóideos e
estradiol estimulam; enquanto testosterona e estimulação adrenérgica inibem
sua secreção (Isidori e cols, 2000; Kulcsár e cols, 2005). Em contrapartida, a
leptina é capaz de reduzir as secreções e as concentrações plasmáticas de
glicocorticóides e insulina, e de aumentar de catecolaminas. A insulina exerce
um efeito importante não só na regulação da secreção, como também na ação
da leptina, sendo um hormônio co-participativo nos efeitos estimulatórios da
leptina nos neurônios POMC / CART e inibitórios nos neurônios AGRP / NPY
(Otero e cols, 2005).
Na menopausa, época que coincide com idade mais avançada, também há
níveis de leptina alterados. Há, freqüentemente, aumento de peso corporal total
após ovariectomia em ratas e também durante a menopausa em mulheres
(Isidori e cols, 2000, Baranowska e cols, 2000; Martin e cols, 2001). Portanto,
pensa-se em aumento nas concentrações séricas de leptina nestas situações,
como resultado do aumento de gordura corporal total. Os estudos são
contraditórios nestes casos. Segundo Martin e cols (2001), após a ovariectomia
(OVX) há uma redução do gasto energético total que é simultânea ao aumento
de peso corporal. Acompanhando essas alterações, observa-se um aumento nas
10
concentrações séricas de leptina o que, para o autor, reflete a maior
porcentagem de gordura corporal. De fato, no estudo de Meli e cols (2004) a
leptina sérica está elevada em ratas após 7 e 22 semanas de castração.
Contudo, esta elevação é mais pronunciada após 22 semanas de castração,
momento que coincide com um peso corporal total mais elevado. Quatro
semanas após a ovariectomia, o autor observou menor elevação de peso
corporal, que não foi acompanhada de elevações nos níveis de leptina
circulantes.
Em mulheres ovariectomizadas há um decréscimo significativo nas
concentrações de leptina plasmáticas 4 dias após a cirurgia, entretanto, o efeito
dos anestésicos e o consumo alimentar reduzido, comuns ao período pós-
operatório, não podem ser excluídos. A administração subcutânea de
progesterona em conjunto com estrogênio pode prevenir esta redução nos níveis
de leptina. Mulheres com ciclo menstrual normal, não apresentam modificações
no conteúdo de leptina plasmático. No período de menopausa fisiológica (sem a
remoção cirúrgica dos ovários), os valores de leptina encontram-se ligeiramente
elevados. Entretanto, os resultados de muitos estudos são contraditórios neste
sentido, provavelmente porque a maioria dos estudos não estabelece uma
correção em função da composição corporal destas mulheres (Shimizu e cols,
1997; Kulcsár e cols, 2005).
De acordo com Baranowska e cols (2000) há elevação nas concentrações
séricas de leptina em mulheres na menopausa com sobrepeso. Contudo, as
concentrações de leptina são maiores nas menopausadas obesas. Essa
variação pode estar mais relacionada com o aumento de peso do que com as
modificações hormonais da menopausa.
Sabendo-se que a leptina tem efeito anorexígeno, podendo modular
ingestão alimentar e gasto energético, como explicar a manutenção do peso
corporal mais elevado após a ovariectomia e a menopausa, com a elevação nos
níveis de leptina sérica? Postula-se a existência de um mecanismo de
resistência a leptina. (Chen e cols, 2001).
11
De acordo com Ainslie e cols (2001), a obesidade observada em ratas
ovariectomizadas não está associada a hipoleptinemia ou a redução na
expressão do gene ob, mas correlaciona-se a uma insensibilidade central à
leptina. O autor verifica ainda, um aumento na produção de NPY, um orexígeno
produzido no hipotálamo, o que poderia estar contribuindo para o excesso de
acúmulo lipídico na ausência de estrogênio. Alguns trabalhos relatam redução
na expressão do receptor de leptina em animais ovariectomizados. Segundo
Kimura e cols (2002) há redução na expressão do receptor de forma curta de
leptina no cérebro, e do de forma longa no hipotálamo de ratas
ovariectomizadas. Existe uma regulação diferenciada para a expressão de
receptores de forma curta e de forma longa. O receptor de forma longa é mais
ativo e determina a ação da leptina sobre o controle da ingestão alimentar. Para
Bennett e cols (1998), a ovariectomia não tem efeito na expressão do receptor
de forma longa, mas promove aumento na expressão do receptor de forma curta.
Ratas ovariectomizadas por 7 ou 22 semanas têm diferença na expressão dos
receptores de forma longa para leptina. Observa-se redução na expressão de
receptores de leptina no hipotálamo, apenas após 22 semanas de ovariectomia,
que estaria associado à hiperleptinemia. No tecido adiposo, observa-se elevação
na expressão deste receptor após 7 semanas de ovariectomia, e diminuição
após 22 semanas (Meli e cols, 2004). Essas alterações desaparecem com a
suplementação de estrogênio (Meli e cols, 2004; Ainslie e cols, 2001; Kimura e
cols, 2002; Bennett e cols, 1998).
Todavia, não é somente por redução na expressão de seus receptores que
a leptina tem sua ação reduzida ou interrompida. Se o transporte de leptina para
o sistema nervoso central, tecido alvo da leptina, estiver interrompido, o
mecanismo de ação deste hormônio é igualmente prejudicado, mesmo que
esteja em altas concentrações no sangue. Segundo Abba e cols (2001),
camundongos ovariectomizados apresentam redução no transporte de leptina
para o cérebro após 5 semanas de ovariectomia.
Alguns estudos relatam redução e outros não relatam alteração nas
concentrações de leptina sérica em ratos e humanos após ovariectomia ou
12
durante a menopausa, respectivamente. Sabe-se que, em humanos, o
estrogênio é um fator estimulante para a secreção de leptina (Tommaselli e cols,
2001). Na menopausa, ou após ovariectomia em ratas, a ausência de estrogênio
estaria possivelmente modulando negativamente as concentrações de leptina
séricas ou a expressão do gene ob. Verifica-se, em alguns casos, redução na
expressão do gene ob em tecido adiposo subcutâneo e retroperitoneal, e
elevação desta expressão em tecido adiposo mesentérico, após 8 semanas de
ovariectomia em ratas (Shimizu e cols, 1997; Bennet e cols, 1998; Yoneda e
cols, 1998).
No estudo de Chu e cols (1999), as concentrações séricas de leptina estão
reduzidas nas primeiras semanas após a ovariectomia em ratos. Logo após a
cirurgia, verifica-se uma redução progressiva nos níveis de leptina séricos até a
sétima semana após castração. Nesta semana, os níveis de leptina encontram-
se indetectáveis. Após este período, as concentrações séricas de leptina tendem
a aumentar, e por volta da décima terceira semana, verificam-se níveis bastante
elevados deste hormônio no soro dos animais ovariectomizados. A reposição
com estrogênio (25µg/Kg p.c.) via endovenosa elimina tais flutuações na
concentração de leptina sanguínea.
De acordo com Pelleymounter (1999) não há alteração nos níveis de leptina
antes do desenvolvimento da obesidade, e a administração de estrogênio (0,05
– 17µg/dia, durante 14 dias) não altera estes níveis. Haveria variações dos
níveis de leptina somente após o estabelecimento da obesidade.
Outro parâmetro que tem despertado a atenção nas últimas décadas é a
interação entre citocinas inflamatórias e leptina. Em infecções agudas, como na
sepse, situação nas quais ocorre processo inflamatório, também se observa
alteração nos níveis de leptina. Quando níveis séricos de citocinas como IL-1, IL-
10 e TNF-∝ estão elevados no soro, observa-se concentrações de leptina em
quantidades igualmente elevadas. Estas citocinas ainda aumentam a expressão
de RNAm para leptina (Hulver e cols, 2003). Em contrapartida, a leptina também
é capaz de elevar a produção de citocinas (Ryan e cols, 2004). A leptina e seus
receptores estão, estruturalmente e funcionalmente, relacionados com a família
13
da citocina pró-inflamatória IL-6 (Tartaglia e cols, 1995). A forma longa do
receptor de leptina é expressa por tecidos e células do sistema imune, incluindo
medula óssea, baço, monócitos, macrófagos e linfócitos T (Fantuzzi e cols, 2000;
Gainsford e cols, 1996). Isso sugere um envolvimento da leptina, atuando
sozinha ou em sinergismo com as citocinas na patogênese de doenças
inflamatórias e auto-imunes (Bik e cols, 2001; Otero e cols, 2005). Essa inter-
relação é dependente da espécie estudada. Em primatas e roedores a resposta
fisiológica é semelhante; os fatores que elevam a liberação de leptina são os
mesmos em ambos; a única diferença é o tempo de liberação na corrente
sanguínea. Em roedores, a leptina é liberada mais rapidamente, logo nas
primeiras horas de estímulo, por administração de endotoxinas, por exemplo,
(Landman e cols, 2003; Finck e cols, 1998; Turnbull e cols, 1999). Não se sabe
ao certo o mecanismo de ação pelo qual citocinas atuam estimulando a
liberação de leptina pelo tecido adiposo.
Além do efeito das citocinas, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal pode sofrer
modulação por leptina. A leptina atua diminuindo a liberação de ACTH, (Kulcsár
e cols, 2005) e os glicocorticóides por sua vez, assim como as catecolaminas,
estimulam a secreção de leptina (Mastronaldi e cols, 2000).
Em resumo, a leptina pode estar relacionada ao ganho de peso corporal
observado em ratas ovariectomizadas; e sua elevação sérica, pode resultar na
produção de citocinas inflamatórias no processo de ganho de peso corporal.
Entretanto, não se sabe se o aumento na produção sérica destas citocinas eleva
a liberação de leptina pelo tecido adiposo, ou se é a leptina que estimula a maior
produção de citocinas. De qualquer forma, parece existir uma sinergia entre
estes fatores nos animais ovariectomizados, promovendo o incremento do peso
corporal ou a manutenção do peso elevado.
2.2. Fator de Necrose Tumoral-αααα (TNF-αααα)
O TNF-α é um citocina pró-inflamatória produzida por vários tipos celulares,
principalmente por macrófagos e linfócitos. Pode também ser produzida no tecido
14
adiposo, entretanto em humanos esta produção é pequena (Hotamisligil e cols,
1993). Sua concentração plasmática está freqüentemente aumentada na
obesidade, assim como a quantidade de seus receptores solúveis (Hauner, 2004;
Merial e cols, 2000).
O TNF-α pode ter efeitos anorexígenos e orexígenos. Seus efeitos
anorexígenos são observados na caquexia que acompanha as doenças
infecciosas e o câncer. Seus efeitos orexígenos podem ser visualizados durante o
período de desenvolvimento da obesidade, quando se observa um aumento na
expressão desta citocina e de outras citocinas pró-inflamatórias (Hauner, 2004).
Esta citocina exerce papel fundamental na indução da resistência à insulina,
promovendo a fosforilação do IRS-1 (substrato do receptor de insulina) nos seus
resíduos de serina. Essa fosforilação não permite a interação do IRS-1 com a
subunidade β do receptor de insulina, o que promove inibição da sinalização
insulínica (Bastard e cols, 2006). (Figura 4). A expressão de TNF-α está
aumentada em indivíduos com resistência insulínica no tecido adiposo e no
músculo (Bahia e cols, 2006). Sendo a insulina um hormônio adipostático que
exerce efeito anorexígeno no hipotálamo, a redução do seu efeito afeta o balanço
energético, promovendo aumento da ingestão calórica (Amaral e cols, 2006).
Estudos demonstram que TNF-α pode elevar a expressão da forma
indutível da óxido nítrico sintase (iNOS) em vários tecidos e tipos celulares,
principalmente no músculo e no adipócito. Esta iNOS, por sua vez, parece estar
envolvida na regulação negativa de UCP-2 por TNF-α e na redução da captação
de glicose pelos tecidos adiposo e muscular. Este efeito ocorre via papel redutor
do óxido nítrico na expressão de UCP-2 e de GLUT4 (transportador de glicose tipo
4) (Merial e cols, 2000; Bahia e cols, 2006).
15
Figura 4. Interação das vias inflamatórias com a via da insulina
Nos vasos, TNF-α reduz a biodisponibilidade de NO (óxido nítrico) e impede
a vasodilatação endotélio-dependente. Os possíveis mecanismos sugeridos
incluem a redução na meia vida do RNAm da NOS endotelial (eNOS) e aumento
na produção de superóxido pelo NADPH oxidase vascular. TNF-α também pode
contribuir para a apoptose da célula endotelial (Bahia e cols, 2006). Segundo
Merial-Kieny e cols (2003), a indução de iNOS em músculo e adipócito, e a
redução na NO em vasos por TNF-α, têm papel fundamental no estabelecimento
da síndrome metabólica, que se caracteriza pela ocorrência de obesidade,
Diabetes Mellitus tipo 2 e hipertensão. A obesidade central ou abdominal leva à
resistência à insulina e à disfunção endotelial; a resistência à insulina, por sua vez,
leva à disfunção endotelial (Carvalho e cols, 2006).
O TNF-α também pode exercer efeitos na fração ligada dos hormônios
tireóideos. A infusão intravenosa de TNF-α (8µg/dia) durante 7 dias, em ratos,
provoca redução no hormônio tireóideo T4 ligado no plasma, pois é capaz de
reduzir a proteína ligadora de tiroxina, responsável por carrear T4 no sangue, mas
não altera a concentração de T4 livre. Entretanto, essa citocina não altera a razão
entre T3/T4, nem a atividade da enzima desiodase tipo I, uma das enzimas
responsáveis pela conversão de T4 em T3. Como não altera os níveis de T4 livre e
membrana
plasmática
TNFTNF
MKKK
MKK
JNK Serina kinase
AP1NFκB
NFκB
IKKβSerina kinase
IκBα
p
p
NÚCLEO TNF-αααα, IL-6, IL-1
IκBα
p
p
p
extracelular
citosol
ppTyr Tyr
IRS
IRS
PDK
AKT/PKB
GLUT 4
p
p
PI3K
Ser
Insulina
membrana
plasmática
TNFTNF
MKKK
MKK
JNK Serina kinase
AP1NFκB
NFκB
IKKβSerina kinase
IκBα
p
p
NÚCLEO TNF-αααα, IL-6, IL-1
IκBα
p
p
p
extracelular
citosol
ppTyr Tyr
IRS
IRS
PDK
AKT/PKB
GLUT 4
p
p
PI3K
Ser
membrana
plasmática
TNFTNF
MKKK
MKK
JNK Serina kinase
AP1NFκB
NFκB
IKKβSerina kinase
IκBα
p
p
NÚCLEO TNF-αααα, IL-6, IL-1
IκBα
p
p
p
extracelular
citosol
ppTyr Tyr
IRS
IRS
PDK
AKT/PKB
GLUT 4
p
p
PI3K
Ser
Insulina
16
tampouco a conversão deste hormônio em sua forma mais ativa, T3,
provavelmente o mecanismo pelo qual TNF-α promove redução em gasto
energético não seria através destes hormônios (Sweep e cols, 1992). (Figura 5).
Dietas hipercalóricas utilizadas na indução da obesidade promovem
elevação nos níveis de TNF-α e outras citocinas no plasma. Estudos recentes
sugerem que a redução dos níveis de TNF-α promove redução no consumo
alimentar, perda de peso e é capaz de reverter o quadro de resistência à insulina
no hipotálamo (Bastard e cols, 2006).
Figura 5. Resumo dos possíveis efeitos do TNF-α no desencadeamento da
síndrome metabólica.
Em relação à expressão e a produção de TNF-α no tecido adiposo de
indivíduos obesos, os estudos são controversos. Segundo Hotamisligil e cols
(1995), os obesos expressam 2,5 vezes mais RNAm para TNF-α no tecido
adiposo, do que indivíduos magros. No estudo de Mohamed e cols (1997), a
expressão de RNAm para TNF-α em humanos é similar em tecido adiposo visceral
e subcutâneo; e a obesidade não altera esta expressão. A produção de TNF-α em
TNFTNF--αααααααα
Fosforilação de IRS-1
Inibição da sinalizaçãoinsulínica
↑ iNOSTecidos adiposo
e muscular
↓ UCP-2
↑ NF-kappaB↓ [NO] nos vasos↓ eNOS RNAm
↑ Adesão de monócitos nos vasos e conversão
em macrófagos
Síndrome metabólicaSíndrome metabólica
17
tecido subcutâneo de indivíduos magros e obesos é similar. De acordo com esse
autor, o estímulo para a produção de TNF-α seria provocado pela presença de
leptina ou de outras adipocinas no plasma, que poderiam induzir a secreção de
TNF-α por diferentes tipos celulares, como macrófagos (Bastard e cols, 2006).
Ratas fêmeas ovariectomizadas apresentam concentrações elevadas de
TNF-α séricas, em comparação aos animais ovariectomizados tratados com
estrogênio. Camundongos ovariectomizados também apresentam níveis elevados
desta citocina no plasma e a administração de estrogênio reverte este efeito
(Speyer e cols, 2005). Entretanto, esses estudos foram realizados quando os
animais já apresentavam sobrepeso, ou seja, as alterações de TNF-α sérico após
a ovariectomia podem ser secundárias à instalação da obesidade.
2.3. Interleucina-6 (IL-6)
A interleucina do tipo 6 (IL-6) é uma citocina pró-inflamatória que pode ser
produzida por vários tipos celulares, como fibroblastos, células endoteliais e
monócitos; podendo ser produzida em diferentes tecidos, entre eles o tecido
adiposo (Fried e cols, 1998; Bastard e cols, 2002). Dados recentes sugerem que,
enquanto TNF-α age de forma parácrina no adipócito, a IL-6 circula no plasma em
concentrações relativamente altas, sendo mais importante sistemicamente
(Carvalho e cols, 2006).
As concentrações de IL-6 circulantes estão diretamente relacionadas ao
peso corporal (Hauner, 2004). Na obesidade mórbida, os níveis plasmáticos desta
citocina estão elevados. Normalmente, 15-30% da IL-6 circulante presente no
organismo é proveniente do tecido adiposo, na ausência de inflamação aguda.
Esta secreção é maior no tecido adiposo visceral, em relação aos outros
compartimentos corporais de gordura; sendo a expressão de RNAm para IL-6
maior neste tecido. Contudo, no tecido adiposo, a maior proporção de IL-6 não é
produzida por adipócitos maduros, mas por células do estroma vascular, incluindo
pré-adipócitos, células endoteliais, monócitos e macrófagos (Bastard e cols, 2002;
Mohamed-Ali e cols, 1997; Fain e cols, 2004). Sabe-se que há maior quantidade
18
de macrófagos e monócitos sendo recrutados para o tecido adiposo visceral em
comparação com o tecido adiposo subcutâneo, o que poderia explicar as maiores
concentrações de IL-6 no tecido adiposo visceral (Hauner, 2004).
A IL-6 é uma citocina multifuncional que age em várias células e tecidos.
Estudos recentes demonstraram que a IL-6 e seu receptor são expressos e
funcionais no tecido adiposo, podendo esta citocina exercer efeito
autócrino/parácrino neste tecido (Hauner, 2004).
Um dos principais efeitos da IL-6 é a indução da produção da proteína
hepática C reativa. Essa proteína é um dos maiores marcadores do risco de
complicações cardiovasculares. Há relação entre conteúdo de IL-6 em tecido
adiposo, IL-6 plasmática e proteína C reativa (Bastard e cols, 2002; Ridker e cols,
2003).
Atualmente, tem sido proposto, para a IL-6, um papel importante na ligação
entre obesidade, inflamação e doenças cardiovasculares. Sabe-se que o tecido
adiposo visceral, reserva adiposa ligada diretamente aos acidentes vasculares,
pode produzir maiores quantidades de IL-6 que o tecido adiposo subcutâneo.
Além disso, a produção de IL-6 pelo tecido adiposo pode afetar diretamente o
metabolismo lipídico por induzir a secreção de VLDL pelo fígado e a
hipertrigliceridemia (Bastard e cols, 2002; Yudkin e cols, 2000).
A IL-6 também pode estar envolvida na resistência insulínica e suas
complicações. Pacientes com diabetes melitus tipo II apresentam concentrações
plasmáticas elevadas de IL-6 (Bruan e cols, 2003).
O receptor de IL-6 pertence à classe I de receptores de citocinas, cuja ação
envolve a via JAK/STAT de sinalização intracelular. O mecanismo exato pelo qual
IL-6 atua na via de sinalização da insulina não está totalmente esclarecido;
provavelmente envolve a ativação da tirosina fosfatase, com conseqüente
diminuição da fosforilação do substrato para o receptor de insulina (IRS-1), e a
interação entre proteínas supressoras da sinalização de citocinas (SOCS) e o
receptor de insulina. Além disto, tanto IL-6 quanto TNF-α podem promover a
redução na expressão de RNAm para adiponectina, uma citocina, produzida pelo
19
tecido adiposo, que aumenta a sensibilidade à insulina (Bruan e cols, 2003;
Mooney e cols, 2001; Carvalho e cols, 2006). (Figura 6)
Figura 6. Resumo dos possíveis mecanismos de inibição da sinalização insulínica
por IL-6.
A IL-6 é provavelmente uma citocina lipolítica. A infusão de IL-6,
diretamente no coração de indivíduos normais, promove aumento na liberação de
ácidos graxos livres e glicerol para o plasma, elevação nas concentrações de
cortisol plasmático e aumento da taxa metabólica basal em humanos (Van Hall e
cols, 2003). A administração de IL-6 subcutânea, em homens, promove a elevação
aguda nas secreções de prolactina, hormônio do crescimento e ACTH, e redução
na liberação de TSH (Tsigos e cols, 1997). Tais resultados sugerem uma função
lipolítica importante de IL-6; entretanto, em ambos os estudos, tal efeito somente é
observado quando altas doses de IL-6 são administradas.
Exercício físico intenso, infecções agudas e obesidade mórbida são
situações nas quais se observa elevação dessas citocina no plasma. Nos dois
primeiros casos observa-se redução de peso corporal, o que está de acordo com o
ILIL--66
↑ Tirosina fosfatase
↓ FosforilaçãoIRS-1
Inibição da sinalizaçãoinsulínica
AdiponectinaAdiponectina
↑ Sensibilidade à insulina
-ILIL--66
↑ Tirosina fosfatase
↓ FosforilaçãoIRS-1
Inibição da sinalizaçãoinsulínica
AdiponectinaAdiponectina
↑ Sensibilidade à insulina
-
20
efeito lipolítico; entretanto, qual seria a possível correlação entre IL-6 e
obesidade? Provavelmente, o aumento nos níveis de IL-6, no indivíduo obeso,
seria um mecanismo de defesa orgânico, na tentativa de elevar a taxa metabólica
basal na obesidade. Contudo, este efeito não é eficaz na redução de peso
corporal. Postula-se uma possível resistência à ação lipolítica desta citocina no
obeso.
A ovariectomia é um procedimento capaz de modificar as concentrações
plasmáticas de IL-6, o que acompanha o ganho de peso corporal nos animais
ovariectomizados. Ratas fêmeas ovariectomizadas apresentam elevação nos
níveis de IL-6 plasmáticos e aumento na expressão de IL-6 em mielócitos (Zeng e
cols, 2005). A ovariectomia eleva significativamente a expressão gênica de IL-6
no tecido adiposo após 5 meses da ovariectomia, e a administração de estrogênio
reverte este efeito (Bruun e cols, 2003).
Estas observações sugerem uma tentativa de prevenção do ganho de peso
corporal nos animais ovariectomizados, via aumento na secreção de IL-6; e pode
justificar a ausência de ganho de peso nos animais ovariectomizados que
recebem reposição estrogênica. Entretanto, este mecanismo não é eficaz em
barrar o ganho de peso corporal, visto que os animais ovariectomizados ganham
peso progressivamente após a ovariectomia.
3. Outras citocinas possivelmente envolvidas na regulação do
metabolismo energético
3.1. Interleucina-1 (IL-1)
A IL-1, assim como TNF-α e IL-6, é uma citocina multi funcional produzida
principalmente por macrófagos ativados por antígenos. Esta citocina também pode
ser produzida por outros tipos celulares, como queratinócitos, fibroblastos e
células dos sistemas nervoso e endócrino, em resposta à inflamação, infecção e
injúria (Ait-Ali e cols, 2003).
21
A IL-1 e o TNF-α têm um campo de atuação vasto e semelhante, podendo
exercer seus efeitos a nível local ou sistêmico. Ambos parecem estar envolvidos
na regulação da medula adrenal e do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. A medula
adrenal de ratos exibe imunorreatividade para IL-1, e os níveis de IL-1 e de RNAm
para IL-1 estão aumentados nas células cromafins em resposta à injeção de
lipopolissacarídeos (Ait-Ali e cols, 2003). Essa citocina promove elevação no
conteúdo de ACTH plasmático, elevando conseqüentemente os níveis de
glicocorticóides, hormônios que estão relacionados à obesidade, quando elevados
cronicamente. Um efeito sinérgico foi descrito entre as citocinas IL-6, IL-1 e TNF-α
na progressão da aterosclerose. Essas citocinas são capazes de atuar em
conjunto promovendo maior dano vascular, na maioria das vezes associado à
obesidade e à resistência à insulina (Yudkin e cols, 2000).
A IL-1 também exerce efeito no metabolismo da glândula tireóide. A
administração de IL-1 (0,015µg/dia) durante 3 dias a camundongos promove
redução nos níveis séricos de T4, T3 e rT3, elevação na razão T3/T4 e na atividade
da enzima desiodase tipo I no fígado, e redução no efeito do TSH sobre a tireóide.
Paralelamente, essa administração é capaz de promover redução de até 65% no
consumo alimentar desses animais. Sabe-se que TNF-α tem efeito semelhante
(Sato e cols, 1989). A administração de IL-1 a ratos (15mcg/dia), durante 7 dias,
também promove redução nas concentrações séricas de T4, redução na
responsividade tireóidea ao estímulo de TSH e elevação no conteúdo de TSH
hipofisário (Sugawa e cols, 1990).
Os efeitos sobre a economia tireóidea promovidos por IL-1 e TNF-α
poderiam explicar, em parte, o papel dessas citocinas no metabolismo energético.
A redução nas concentrações dos hormônios tireóideos poderia promover
concomitante redução no gasto energético. (Figura 7)
Na síndrome metabólica, foram encontrados níveis mais elevados de IL-1
em mulheres do que em homens. (Corwin e cols, 2006).
A IL-1 está aumentada no tecido ósseo de animais ovariectomizados após 3
semanas de ovariectomia. Esta elevação coincide com a osteoporose que ocorre
22
devido à ausência de estrogênio e a administração de estrogênio reverte este
aumento (Dinarello e cols, 1990).
Até o momento, não há estudos mostrando as concentrações plasmáticas
de IL-1 em animais ovariectomizados. Acredita-se que estas concentrações
estejam elevadas nestes animais, já que se encontram aumentadas em diversas
situações onde se verifica aumento na quantidade de tecido adiposo. Sendo IL-1
mais uma citocina relacionada ao ganho de peso corporal, é de se esperar que
sua secreção pelos macrófagos no tecido adiposo, esteja elevada, em
comparação aos animais não ovariectomizados.
Figura 7. Resumo dos possíveis efeitos da IL-1β no estabelecimento da síndrome
metabólica
.
3.2. Interleucina 10 (IL-10)
A interleucina 10 (IL-10) é a principal citocina antiinflamatória presente no
sistema imune, e desempenha um papel crucial na regulação imunológica. Essa
citocina atua desativando as respostas inflamatórias mediadas por macrófagos e
ILIL--11ββββββββ
↑ ACTH
↑ Glicocorticóides
+ IL-6 e TNF-α
aterosclerose
Tireóide
↓ T3 e T4
Síndrome MetabólicaSíndrome Metabólica
23
linfócitos, inibindo a formação de citocinas pró-inflamatórias (Scarpelli e cols,
2006).
As citocinas inflamatórias podem causar resistência à insulina, como
descrito anteriormente, e as citocinas antiinflamatórias podem se opor a esses
efeitos, o que sugere a existência de um balanço entre as citocinas pró- e
antiinflamatórias relacionado ao desenvolvimento da diabetes tipo II (Scarpelli e
cols, 2006). Segundo Corwin e cols (2006), a síndrome metabólica está associada
a elevados níveis de proteína C reativa, IL-1β, leptina e níveis reduzidos de IL-10;
e esta condição associa-se a redução na sensibilidade à insulina.
Um estudo com crianças obesas, obesas hipertensas, e obesas diabéticas
encontrou níveis elevados das citocinas IL-6 e TNF-α nestes grupos. A citocina IL-
10 estava inalterada em todos os grupos (Glowinska e urban, 2003). Em
contrapartida, foram encontrados níveis reduzidos de IL-10 em pacientes com
diabetes tipo II. A redução nas concentrações sanguíneas dessa citocina
relacionou-se à redução concomitante na sensibilidade à insulina (Bluher e cols,
2005).
Entretanto, em indivíduos obesos, os dados são controversos. Alguns
autores referem elevação, enquanto outros referem redução na concentração
sanguínea de IL-10 na obesidade. No estudo de Oberbach (2006), os indivíduos
obesos apresentaram concentrações reduzidas de IL-10 no sangue e esta
concentração foi associada ao padrão de distribuição de gordura corporal total. Na
obesidade andróide houve maior redução nas concentrações de IL-10,
comparada à redução observada na obesidade ginóide. Um programa de perda de
peso de curta duração não foi eficaz para elevar as concentrações de IL-10
reduzidas no obeso. Ainda assim, esse programa foi eficaz em reduzir os níveis da
citocina IL-6 e da proteína C reativa, ambos elevados no sangue de obesos.
Segundo o autor, a atividade física também não é eficaz na elevação das
concentrações de IL-10 no sangue de indivíduos submetidos a um programa de
treinamento, durante 4 semanas, com o objetivo de perda de peso corporal.
De acordo com Esposito e cols (2003) os níveis circulantes de IL-10
diminuídos relacionam-se à síndrome metabólica, tanto em mulheres obesas
24
quanto não obesas. Mulheres obesas sem síndrome metabólica apresentam
elevados níveis circulantes de IL-10. Modificações no estilo de vida com redução
de peso corporal e a prática de atividade física regular por um período de um ano
resultam em redução nas concentrações de IL-10 em mulheres obesas sem
síndrome metabólica. Segundo o autor, os níveis elevados desta citocina em
mulheres obesas podem representar uma tentativa de inibir constantemente a
produção das citocinas inflamatórias. Entretanto, este mecanismo por algum
motivo estaria falhando, pois se verifica a produção das citocinas inflamatórias em
grande quantidade nos obesos.
Não se conhecem os mecanismos pelos qual essa citocina atua. Sabe-se
até o momento que a IL-10 é capaz de inibir a ativação de NF-κB por TNF-α,
inibindo a atividade da IKK (IκB-kinase) em linhagens celulares monocíticas
humanas (Kim e cols, 2003). A IL-10 pode, ainda, prevenir a resistência à insulina
induzida por IL-6 em músculo esquelético e fígado “in vivo”. Com a administração
de IL-10 o “turnover” de glicose está aumentado no músculo e no restante do
corpo; a atividade de PI-3 kinase associada ao IRS-I está elevada no músculo; há
redução das concentrações de ácidos graxos livres intramusculares e, a taxa de
glicólise muscular está elevada, assim como o conteúdo de glicogênio muscular.
Todos esses efeitos são revertidos por administração de IL-6. Esse estudo sugere
que a administração de IL-10 poderia ser um potente recurso terapêutico para a
reversão da resistência à insulina (Kim e cols, 2003). (Figura 8)
Estudos recentes têm demonstrado um papel protetor de IL-10 tanto em
relação à instalação da lesão aterosclerótica quanto na sua progressão. Há
liberação de IL-10 no plasma durante a isquemia miocárdica, o que limita a
ativação de macrófagos no miocárdio (Espósito e cols, 2003). De acordo com
Manigrasso e cols (2005) a redução nos níveis sanguíneos de IL-10 é um fator
importante de progressão para a lesão ateromatosa.
Apesar de alguns estudos descreverem aumento das concentrações
séricas de IL-10 na menopausa (Kamada e cols, 2001) não há estudos avaliando
as concentrações sangüíneas de IL-10 em animais ovariectomizados
relacionando-as ao desenvolvimento do sobrepeso neste modelo.
25
Figura 8. Possíveis efeitos de IL-10 na prevenção da resistência insulínica
4. Hormônios Tireóideos
A tireóide é a primeira glândula endócrina a surgir no embrião, sendo
responsável pela produção dos hormônios triiodotironina (T3) e tetraiodotironina
(T4), de grande importância fisiológica para o organismo (Koop, 2005)
Os hormônios da tireóide desempenham funções críticas na diferenciação
celular, no crescimento e no metabolismo energético, aumentando o consumo de
oxigênio e, portanto, a taxa metabólica basal (Yen, 2001).
A glândula localiza-se na região anterior e lateral da laringe e traquéia,
sendo composta por 2 lobos localizados um de cada lado da traquéia, unidos por
um istmo situado imediatamente abaixo da cartilagem cricóide. Normalmente, o
lobo direito é maior que o esquerdo (Larsen e cols., 1998). O peso da glândula
tireóide no homem adulto se situa em torno de 15 a 25g, e este peso é mantido
por um “turnover” celular discreto, havendo renovação celular aproximadamente 5
vezes durante a vida do indivíduo. O tecido tireoideano é composto de folículos de
estrutura esferoidal; as células que constituem os folículos são as células
foliculares tireoideanas ou tireócitos, células cubóides, responsáveis pela
ILIL--1010
↓ TNF-α ↓ IL-6
↑ “turnover” glicose ↓ Ác. graxos intramusculares↑Glicólise intramuscular↑ Glicogênio muscular
Prevenção da resistência à insulina
ILIL--1010
↓ TNF-α ↓ IL-6
↑ “turnover” glicose ↓ Ác. graxos intramusculares↑Glicólise intramuscular↑ Glicogênio muscular
Prevenção da resistência à insulina
26
produção dos hormônios tireóideos, que se organizam formando uma camada
única de células que delimitam um espaço interno chamado lúmem folicular. O
lúmen folicular é preenchido por colóide, constituído principalmente de
tireoglobulina, que vai ser iodada, originando os hormônios tireóideos T3 e T4.
Cada folículo é circundado por tecido conjuntivo e por capilares, formando o
espaço interfolicular. A estrutura folicular é mantida pela presença de junções
intercelulares, que asseguram a manutenção do colóide dentro do folículo (Al-
Gahtany e cols, 2005)
A atividade da glândula tireóide é basicamente controlada pelo hormônio
tireotrófico (TSH), produzido pela adeno-hipófise. Os hormônios tireoideanos
exercem “feedback” negativo sobre a produção do TSH, de acordo com a
quantidade de T3 e T4 circulantes, mantendo desta forma o equilíbrio da atividade
secretória da tireóide. Os hormônios T3 e T4 podem exercer um efeito inibitório
sobre a secreção do hormônio liberador de tireotrofina (TRH), que é um fator de
estimulação à produção de tireotrofina (TSH), produzido pelo hipotálamo (Yen,
2001) (Figura 9)
Figura 9. Regulação do eixo hipotálamo – hipófise - tireóide
TRHTRH
HipotálamoHipotálamo
HipófiseHipófise
T4T4
T3T3
++
++
TSHTSH
Tireóide
TRHTRH
HipotálamoHipotálamo
HipófiseHipófise
T4T4
T3T3
T4T4
T3T3
++
++
TSHTSHTSHTSH
Tireóide
27
O T4 é o maior produto de secreção tireóideo, sendo o total sérico de T4 40
vezes maior que o de T3. Apenas 0,03% do T4 liberado estão livres no plasma,
sendo a grande maioria encontrada ligada a proteínas carreadoras, como a
globulina ligadora de tiroxina (TBG), albumina e transtiretina (TTR).
Aproximadamente 0,3% de T3 estão livres no plasma. São os hormônios da
tireóide na sua forma livre que podem se ligar às células alvo gerando a resposta
biológica (Yen, 2001).
Os hormônios da tireóide (HT) são reguladores importantes do metabolismo
energético, sendo importantes na regulação da taxa metabólica basal (TMB). Os
mecanismos envolvidos nessa regulação não estão totalmente explicados,
contudo evidências sugerem que os HT estimulam a TMB por aumentar o gasto
de ATP através da regulação da expressão de proteínas desacopladoras (UCPs)
na mitocôndria de tecido adiposo e músculo, dentre outros efeitos. A ação desses
hormônios é um determinante extremamente importante da manutenção da
homeostase energética, pois influenciam, entre outras coisas, o metabolismo de
carboidratos em músculo esquelético e tecido adiposo via regulação positiva da
transcrição de GLUT4 no músculo esquelético e tecido adiposo (Mentuccia e cols.,
2002). (Figura 10)
O hormônio da tireóide ativo, T3, exerce funções importantes na regulação
do consumo basal de oxigênio, nos estoques de gorduras, no consumo alimentar,
na lipogênese e na lipólise, desempenhando desta forma papel importante na
função do tecido adiposo branco e marrom e também no desenvolvimento (Yen,
2001).
Esses hormônios podem induzir o acúmulo intracelular de lipídeos e ainda
estimular a proliferação celular dos adipócitos. Adicionalmente, enzimas
lipogênicas, ATP citrato liase, enzima málica e ácido graxo sintase são induzidos
por T3 durante a diferenciação dos adipócitos (Yen, 2001).
Estudos recentes têm, também, demonstrado que os principais receptores
dos HT: TRα e TRβ, são diferencialmente expressos durante o desenvolvimento
do tecido adiposo marrom (BAT), o tecido mais importante para a termogênese
facultativa em roedores. A termogênese facultativa ocorre em resposta a
28
temperaturas baixas, ao exercício físico ou à super alimentação e depende da
síntese de UCPs por estimulação adrenérgica e T3. Existem três isoformas
conhecidas de UCPs: UCP1, UCP2 e UCP3. A UCP3 é estimulada por T3 em
músculo esquelético. O estímulo à síntese de UCP resulta em aumento na
termogênese, promovendo produção de calor. Interessantemente, o BAT também
contém a enzima desiodase tipo II que converte T4 a T3, cuja atividade aumenta na
exposição ao frio. Em experimentos utilizando-se ratos com quantidades reduzidas
de BAT observou-se decréscimo na tolerância ao frio e obesidade, sugerindo uma
atuação crítica de BAT na termogênese e no controle de peso corporal.
Recentemente, animais knockout para UCP3 foram gerados e apresentaram peso,
assim como termogênese e resposta ao T3 normais, sugerindo que a UCP3 não é
o principal mediador para a termogênese induzida por T3 (Argyropoulos & Harper,
2002). A UCP1, parece ser a maior responsável pela termogênese sem tremor em
roedores, o maior componente da termogênese facultativa em humanos e em
pequenos mamíferos. A UCP1 foi descoberta na membrana mitocondrial interna
de BAT e camundongos que não expressam UCP1 são mais sensíveis ao frio
(Argyropoulos & Harper, 2002). (Figura 10).
Hormônios TireóideosHormônios Tireóideos
↑ UCPs↑Transcrição de GLUT4em músculo esquelético
e tecido adiposo
Regulação da TMB, consumo de O2, estoques de gorduras, consumo alimentar, lipólise e
Lipogênese
Homeostase energHomeostase energééticatica
Modulação de receptoresadrenérgicos
Hormônios TireóideosHormônios Tireóideos
↑ UCPs↑Transcrição de GLUT4em músculo esquelético
e tecido adiposo
Regulação da TMB, consumo de O2, estoques de gorduras, consumo alimentar, lipólise e
Lipogênese
Homeostase energHomeostase energééticatica
Modulação de receptoresadrenérgicos
29
Figura 10. Resumo dos principais efeitos dos hormônios tireóideos no
metabolismo energético.
Vários estudos sugerem que a alteração no peso corporal produz
modificações no gasto energético a favor do retorno ao peso original. Por
exemplo, animais em restrição calórica apresentam menor consumo de oxigênio, o
que causaria resistência à perda de peso. Essas modificações podem estar
associadas a modificações nos níveis de HT circulantes (Leibel e cols., 1995).
Segundo Kokkoris & Pi-Suyer (2003), o hormônio tireóideo T3 encontra-se elevado
no plasma na obesidade.
Animais ovariectomizados apresentam modificações nas concentrações
séricas dos hormônios tireóideos. Observa-se freqüentemente redução nas
concentrações séricas de T3 em ratas ovariectomizadas (Thomas e cols, 1986;
Marassi e cols, 2006). De acordo com Thomas e cols (1986), concomitante à
redução de T3, observa-se redução nas concentrações de insulina nesses animais.
A reposição de estrogênio é capaz de elevar as concentrações tanto de T3 quanto
de insulina, entretanto não promove elevação nas concentrações séricas de T4. Já
a reposição de progesterona é eficiente em elevar as concentrações de T3 e T4,
tornando esses valores próximos aos valores encontrados nos animais controle.
De acordo com Jeusette e cols (2006), cadelas castradas, apresentam
flutuações nos hormônios tireóideos em função do tempo pós ovariectomia. Os
autores observaram redução nas concentrações séricas de T4 total, T3 total, T3
reverso (rT3) e TSH nos primeiros 6 meses após a ovariectomia. Após os 6
primeiros meses, observou-se elevação progressiva em todos esses valores, o
que se manteve até o final do experimento, que durou 13 meses. Esta redução
nos hormônios tireóideos nos primeiros meses após a ovariectomia pode estar
relacionada a redução no gasto energético, o que justificaria o ganho de peso
corporal total depois de decorrido um certo tempo da ovariectomia.
30
5. Glicocorticóides
A corticosterona é o glicocorticóide produzido em ratos e o cortisol é o
principal corticosteróide produzido em humanos. Esse hormônio possui ações
antagônicas podendo atuar em todas as células do corpo. Possui ação permissiva
às ações de outros hormônios e esta é a sua atuação mais marcante (Stewart,
2005).
Em relação ao metabolismo energético, o glicocorticóide é capaz de
promover mobilização de proteínas musculares, estimular a neoglicogênese, e
estimular a lipólise, principalmente no jejum. Quando em excesso, e em algumas
condições ou tecidos, pode promover lipogênese. Observa-se esse último efeito
quando o cortisol permanece em longo prazo na corrente sanguínea. Na síndrome
de Cushing, quadro clínico no qual se observam concentrações elevadas de
cortisol, em humanos, o efeito lipogênico é bem demonstrado, pois estes
pacientes são obesos. Além da lipogênese aumentada, esses pacientes
apresentam mobilização de gordura corporal para a região do tronco, o que gera a
obesidade centrípeta. A redistribuição de gordura para os estoques
intraabdominais ocorre quando há elevação simultânea nas concentrações de
insulina plasmática. Os glicocorticóides promovem elevação nas concentrações de
insulina “in vivo”. De fato, a obesidade induzida por glicocorticóides associa-se a
hiperinsulinemia e à resistência à insulina (Freedman e cols, 1986).
Roedores geneticamente obesos (fa/fa, ob/ob, db/db e Ay/a) apresentam
níveis de glicocorticóides cronicamente elevados. O tratamento com corticosterona
promove elevação de NPY, um peptídeo orexígeno e aumento no consumo
alimentar com preferência por lipídeos. Em roedores normais a adrenalectomia
reduz o consumo alimentar diário, o tecido adiposo e o ganho de peso corporal.
Estes efeitos são revertidos pela administração de corticosterona a esses animais.
Os glicocorticóides aparentemente contribuem para o fenótipo de resistência à
leptina em camundongos, fenótipo freqüentemente observado em indivíduos
obesos. Eles possuem também um efeito inibitório sobre as ações da leptina, pois
31
a leptina tem efeito aumentado quando administrada às ratos adrenalectomizados
(Marchington e cols, 1983; Lenzen & Bailey, 1984; La Fleur e cols, 2004).
No estresse agudo há o estímulo à secreção do hormônio liberador de
corticotrofina (CRH). Esse hormônio tem ação anorexígena, o que poderia explicar
em parte a redução do consumo alimentar e a caquexia, observados em infecções
agudas. De fato, infusão de CRH no cérebro de ratos reduz o consumo alimentar
destes animais e o CRH medeia os efeitos anoréticos do estresse (Koob &
Heinrichs, 1999).
Contudo, alguns estudos com humanos associam o estresse ao
desenvolvimento da obesidade. Dallman e cols (2004) verificaram, em seu estudo,
que a secreção aguda de cortisol está relacionada ao aumento na ingestão de
açúcar e gordura após o estímulo estressor. O autor considera que a ação rápida
dos glicocorticóides em elevar o consumo calórico pode ser exercida através de
seus efeitos na secreção de endocarabinóides nos neurônios. Michael e cols
(2005) demonstraram que o estresse pode promover ganho ou perda de peso
corporal, dependendo da dieta que é aplicada no momento do estresse e da carga
genética do animal. Em seu estudo, camundongos geneticamente obesos que
receberam dieta hiperlipídica ganharam peso significativamente, em relação aos
animais obesos que receberam dieta normolipídica. Esse ganho de peso iniciou-se
no 5° dia após o início do estresse. Entretanto, o efeito do estresse foi
suficientemente grande para promover posteriormente a redução do peso corporal
nesses camundongos. Em um estudo anterior, o mesmo autor verificou ganho de
peso corporal em animais submetidos ao estresse, com redução de termogênese
e elevação na quantidade de gordura visceral. Esse autor considera que
provavelmente, o estresse pode ter efeitos anabólicos ou catabólicos, dependendo
do tipo de estresse a que o animal é submetido e da sua carga genética. Períodos
pequenos de estresse, não freqüentes, provavelmente tem efeitos catabólicos
menores que períodos mais longos de estresse, pois neste último caso há
ativação do sistema CRH. Para esse autor o estresse promove ações anabólicas
especialmente na presença de genes que predispõem ao desenvolvimento da
obesidade.
32
Há importante diferença entre os efeitos exercidos pelos glicocorticóides de
forma aguda e aqueles de forma crônica. A maioria dos estudos tem demonstrado
que o estresse agudo, ao contrário do estresse crônico, inibe o consumo
alimentar. Nas sociedades modernas a biodisponibilidade alimentar aumentada,
em conjunto com a presença constante de estressores crônicos, promove
aumento nos níveis de glicocorticóides, o que eleva os depósitos lipídicos
abdominais e os níveis de insulina plasmáticos, levando ao quadro de obesidade
(Dallman e cols, 2004). De fato, o excesso de glicocorticóides produz obesidade
central e diabetes. (Figura 11). Entretanto, na obesidade mórbida não há
evidências de uma elevação importante nos níveis de glicocorticóides (Adhabi e
cols, 2004). Existem evidências de que um polimorfismo na proteína ligadora de
corticosteróides, em roedores, poderia influenciar a gênese da obesidade nestes
animais e a modulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, promovendo aumento
na deposição de gordura nos estoques corporais. Entretanto, o mecanismo pelo
qual esse polimorfismo estaria gerando tal fenótipo, ainda não está esclarecido
(Barat e cols, 2005).
Estudos atuais têm sugerido que os efeitos anabólicos dos glicocorticóides
são mediados pelo sistema nervoso central. Pequenas doses de glicocorticóides
são mais eficazes quando administradas diretamente no cérebro de ratos do que
quando administradas perifericamente. A inativação seletiva de receptores de
glicocorticóides no sistema nervoso central afeta o acúmulo energético por reduzir
o consumo alimentar e o crescimento (Sainsbury e cols, 2001).
No estresse, o cortisol é capaz de inibir ou reduzir a síntese dos
mediadores de resposta inflamatória, promovendo neste caso um efeito
antiinflamatório. Promove redução da migração e da aderência de leucócitos ao
endotélio e reduz a resposta imune mediada por células, pois inibe a produção de
IL-1 por macrófagos e de IL-2 por células auxiliares. Ainda, se opõe à elevação da
temperatura normalmente induzida por infecções. Contudo, os efeitos desse
hormônio são antagônicos, pois ao mesmo tempo em que promove aumento de
resistência do organismo ao estresse, quando presente em níveis basais, pode
33
promover redução na resposta imune quando presente em elevadas
concentrações no sangue (Stewart, 2005).
O cortisol está elevado no período de 7 – 12 meses antes e de 7 – 12
meses depois do início da menopausa. As mulheres que apresentam elevação
nos níveis de cortisol sanguíneo apresentam sintomas vasomotores mais severos.
Essa elevação nos níveis de cortisol varia de acordo com a idade na qual a mulher
entra na menopausa. O aumento nas concentrações de cortisol durante o estágio
de transição para menopausa, quando há irregularidades menstruais significativas,
pode ser concomitante à elevação na produção dos andrógenos adrenais neste
momento e o aumento na gordura intraabdominal freqüentemente observada na
menopausa (Woods e cols, 2006).
Figura 11. Resumo dos principais efeitos do estresse agudo e crônico na
regulação do peso corporal.
5. Justificativas
Há vários estudos na literatura avaliando as concentrações circulantes de
hormônios relacionados à regulação da ingestão alimentar e do gasto energético
GlicocorticóidesGlicocorticóides
↑ CRH (Efeito anorexígeno)Proteólise muscular↑ Neoglicogênese
↑ lipólise
Crônico(excesso de glicocorticóides)
↑↑↑↑↑↑↑↑ Gordura abdominalGordura abdominal
Resistência à insulinaResistência à insulinaResistência à leptinaResistência à leptina
↑↑NPYNPY
ObesidadeObesidade
Agudo
Estresse
34
em roedores, em vários modelos de sobrepeso e obesidade. Dentre esses
hormônios estão os hormônios da tireóide, os glicocorticóides e a leptina. Os
receptores específicos e as vias intracelulares ativadas por esses hormônios
também têm sido muito avaliados. No entanto, poucos estudos analisam as
variações nesses parâmetros durante a gênese do sobrepeso.
Além das alterações hormonais, estudos mais recentes têm demonstrado
que, nos obesos, as células mononucleares circulantes têm a secreção de
citocinas aumentada, devido a modificações no conteúdo de gordura corporal,
mais especificamente visceral, estarem associadas à alteração nos níveis de
citocinas pró e pré-inflamatórias. Contudo, tais estudos também apresentam um
panorama do perfil destes mediadores inflamatórios quando a obesidade ou o
sobrepeso, já estão instalados.
Vários modelos vêm sendo usados para o estudo do aumento ou perda de
peso corporal em animais. Em roedores, assim como em seres humanos, a
deficiência de estrogênio causa aumento do peso corporal, por mecanismos ainda
pouco definidos. Nosso estudo procurou investigar o momento exato, após a
ovariectomia, no qual iniciam-se as modificações nos níveis plasmáticos de alguns
hormônios e citocinas, antes da instalação do sobrepeso e/ou obesidade. Desta
forma, pretendemos esboçar uma relação de causa-efeito entre esses fatores
séricos e o ganho de peso corporal.
35
OOObbbjjjeeetttiiivvvooosss
1. Objetivo geral
- Avaliar o perfil hormonal e de citocinas durante a gênese do aumento de
peso corporal pós-ovariectomia em ratas.
2. Objetivos específicos
- Traçar o curso temporal de ganho de peso corporal em ratas, nos
primeiros dias após a ovariectomia, avaliando:
Ingestões alimentar e hídrica dos animais;
Variações séricas de TNF-α, IL-6, IL-10, IL-1β, leptina e corticosterona;
Conteúdo de gordura retroperitoneal e inguinal;
Função tireóidea através das variações séricas de T3, T4 e TSH.
- Correlacionar os parâmetros hormonais e de citocinas alterados antes da
instalação do sobrepeso com a etiologia do ganho de peso em ratas
ovariectomizadas
36
MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss eee mmmééétttooodddooosss
1. Tratamento e sacrifício dos animais
Utilizou-se ratas Wistar fêmeas, pesando em média 200g no início dos
experimentos, mantidos em gaiolas individuais, sob condições de temperatura (23
± 1°C) e ciclo claro/escuro (12h) controlados, ingerindo ração e água ad libitum
durante todo o experimento.
Mensurou-se o peso corporal, e as ingestões hídrica e alimentar
diariamente no mesmo horário. Cada animal teve acesso a 50 gramas de ração e
200ml de água por 24 horas. No mesmo horário em que a ração e a água foram
oferecidas, pesou-se o que restou de ração em cada gaiola, o que é conhecido
como Resto-Ingestão (RI); e aferiu-se o que restou de água utilizando-se para tal
medida uma proveta calibrada. Ao final do experimento foi realizado o cálculo da
ingestão diária média. Durante todo o experimento o peso corporal dos animais foi
aferido utilizando-se balança digital (Precision).
Antes de iniciarmos os experimentos, foi avaliada a citologia vaginal dos
animais durante 15 dias, com a finalidade de verificar o ciclo estral. Foram
utilizados os animais que apresentavam ciclo estral regular, de 4 a 5 dias.
2. Primeira fase de experimentos
Em um primeiro momento, foi realizado um experimento com duração de 45
dias, a contar da data da ovariectomia. Neste experimento, os animais foram
divididos em 2 grupos: controle “sham” operado (SHAM) (n=16) e
ovariectomizados (OVX) (n=16). Neste experimento, aferimos o peso corporal e
os consumos hídrico e alimentar a cada 2 dias.
Realizou-se a ovariectomia, através da retirada dos dois ovários
bilateralmente, no dia que se convencionou chamar de dia zero (0).
37
O sacrifício foi realizado aos 48 dias após a ovariectomia, por decapitação
dos animais. (Figura 12)
Figura 12. Representação esquemática do 1° experimento
3. Segunda fase de experimentos
Definido o momento exato no qual se inicia o ganho de peso corporal
nestes animais após a ovariectomia, passamos à segunda fase de experimentos.
Realizou-se 4 experimentos, cada um com um n=2 por grupo amostral (tratamento
x tempo de sacrifício), totalizando n=8 ao final dos experimentos por grupo.
Nestes, os animais foram divididos em 4 grupos de tratamento: Controle intacto
(C); Controle falso-operado (SHAM); Ovariectomizados (OVX) e Ovariectomizados
com reposição de estrogênio (OVX + EB). Estes foram subdividido em 4 grupos,
em função do tempo de sacrifício (3, 6, 9 e 13 dias). O estrogênio foi administrado
pela via subcutânea, diariamente, na concentração de 0,7µg/100g de peso
corporal. A reposição se iniciou no dia seguinte a ovariectomia. Essa dose de
estrogênio é suficiente para manter os níveis séricos deste hormônio na faixa da
normalidade (Lima e cols., 2006).
Dia 0Dia 0
Ovariectomia
Dia 44Dia 44sacrifício
OVX (n=8)
SHAM (n=8)
Peso corporalIngestão alimentarConsumo hídrico
A cada dois dias
38
O peso corporal e os consumos hídrico e alimentar foram aferidos
diariamente.
Os experimentos tiveram duração de 13 dias, a contar da data da
ovariectomia. De acordo com os dados obtidos na primeira fase de experimentos,
observou-se que o ganho de peso ocorre a partir do décimo terceiro dia após a
ovariectomia. Portanto, os primeiros 13 dias são importantes para a verificação
dos parâmetros séricos alterados, antes do estabelecimento do sobrepeso nos
animais. Os animais foram sacrificados em diferentes momentos: 3 (n=8), 6 (n=8),
9 (n=8) e 13 (n=8) dias após a ovariectomia (Figura 13). Nos momentos de
sacrifício (12:00 – 15:00h), foram retirados o sangue, sem anticoagulante, e as
gorduras retroperitoneal e periinguinal. Definimos como gordura periinguinal
aquela que se localiza em torno do útero; e gordura retroperitoneal a gordura
restante, localizada na região abdominal, após a retirada da gordura periinguinal.
O soro foi obtido por centrifugação do sangue (3000c/G 15 minutos 4ºC) em tubos
individualizados com a retirada do sobrenadante. As amostras de soro foram
aliquotadas e armazenadas a - 80ºC até o momento das análises. As gorduras
foram pesadas em balança analítica devidamente calibrada.
39
Figura 13. Representação esquemática dos experimentos subseqüentes.
4. Dosagens de citocinas
As concentrações das citocinas séricas foram determinadas por ELISA,
empregando-se kits comerciais específicos para cada citocina (IL-1, IL-6, IL-10 e
TNF-α). Os Kits utilizados foram da marca Biosouce/Sellex/Europe S.A. que são
constituídos por reagentes prontos para o uso: tampão de amostra, solução de
lavagem, as diferentes citocinas recombinantes purificadas em concentrações
crescentes para a curva padrão, estreptavidina, diluente de estreptavidina, biotina
conjugada, cromógeno para revelar e solução de parada da reação. Para a
realização do ELISA utilizamos o protocolo fornecido pelo fabricante. A
sensibilidade de detecção do kit varia, sendo < 3pg/mL para IL-1β; <8 pg/mL para
IL-6; <5 pg/mL para IL-10 e < 4pg/ml para TNF-α. Em cada kit, o anticorpo
apresenta especificidade de 100% para a citocina analisada, já que não foi
encontrada reação cruzada em quaisquer dos kits. A variabilidade intra e inter
ensaio em todos os kits é pequena, sendo o coeficiente de variabilidade em todos
DDiiaa 1133 4°°°° sacrifício
OVX (n=8)
OVX + EB (n=8)
C (n=8)
SHAM (n=8)
DDiiaa 00 Ovariectomia
DDiiaa 33 1°°°° sacrifício
OVX (n=8)
OVX + EB (n=8)
C (n=8)
SHAM (n=8)
DDiiaa 66 2°°°° sacrifício
OVX (n=8)
OVX + EB (n=8)
C (n=8)
SHAM (n=8)
DDiiaa 99 3°°°° sacrifício
OVX (n=8)
OVX + EB (n=8)
C (n=8)
SHAM (n=8)
Peso corporal Ingestão alimentar Consumo hídrico
DDiiaa 11 Início da reposição hormonal no grupo
OVX + EB
(0.7µµµµg/100g p.c.)
diariamente
40
os kits menor que 15%. A leitura dos dados foi realizada em um leitor de ELISA
com filtro para 450λ. Os resultados foram expressos em pg/mL para todas as
citocinas analisadas.
5. Dosagens hormonais
5.1. Radioimunoensaio de TSH
A determinação dos níveis séricos de TSH foi realizada através de
radioimunoensaio específico, utilizando-se TSH murino purificado para a
preparação da curva padrão (0,625 a 25 ng/mL) em soro zero (soro de rato sem
TSH), TSH murino purificado para ser iodado e anticorpos de coelho anti-TSH
murino (1° Ac) que foram fornecidos pelo “National Institute of Diabetes, Digestive
and Kidney Diseases” (NIDDK - Bethesda, USA).
A iodação da molécula do TSH com 125I foi realizada em nosso laboratório,
pelo método da cloramina T e a molécula marcada foi purificada em uma coluna
(Biogel – P60 fino da Bio-rad, EUA). O RIE foi realizado pelo método do 2°
anticorpo, com adição de 6% de polietilenoglicol (Ortiga, 1992).
A contagem da radioatividade dos RIE de TSH foi realizada em um
cintilador de fase sólida (1470 Wallac WizardTM automatic gamma counter).
5.2 – Radioimunoensaio de T3 e T4.
As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de Kit
comercial para RIE de T3 (DLS – 3100 Active, TX, EUA) e T4 (DLS – 3200,
Active, TX EUA) totais, contendo anticorpos específicos aderidos à parede dos
tubos de polipropileno e contendo T3 e T4 ligados ao radiotraçador (125I). As curvas
padrão foram construídas com T3 e T4 diluídos em soro de rato livre de
iodotironinas (soro zero) nas concentrações de 25 a 1000 ng/dl e 1 a 50 µg/dl,
respectivamente. Todo o procedimento foi realizado seguindo-se as
recomendações do fornecedor.
41
Para dosagem de T3, a sensibilidade do método é 4,3 ng/dL. Os
coeficientes de variação intra e interensaio são sempre inferiores a 10%.
Para dosagem de T4, a sensibilidade do método é 0,4µg/dL. O coeficiente
de variação intra-ensaio e interensaio são aproximadamente 5% e 7%
respectivamente.
A contagem da radioatividade dos RIEs de T3 e T4 foi realizada em um
cintilador de fase sólida (1470 Wallac WizardTM automatic gamma counter). Os
resultados foram expressos em ng/dL para o T3 e em µl/dL para o T4.
5.3. Radioimunoensaio de leptina
As dosagens de leptina sérica foram feitas por RIE específico, empregando-
se kit fornecido pela Linco Research, Inc. (Rat Leptin RIA Kit – RL-83K) que é
constituído por reagentes prontos para o uso: leptina murina purificada em
concentrações de 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 e 50 ng/mL para a curva padrão, anticorpo
anti-leptina murina (1º anticorpo), leptina marcada com 125I , atividade específica
de 135 µCi/µg e anticorpo anti-IgG (2º anticorpo). Para a realização do RIE
utilizamos o protocolo fornecido pelo fabricante. O limite de sensibilidade para o
teste é 0,5ng/ml, quando se utiliza 100µl de amostra por tubo. A especificidade
para leptina é 100% e os coeficientes de variação intra e interensaio são sempre
inferiores a 10%.
A contagem da radioatividade dos RIE de leptina foi realizada em um
cintilador de fase sólida (1470 Wallac WizardTM automatic gamma counter). Os
resultados foram expressos em ng/mL.
5.4. Radioimunoensaio de corticosterona
As dosagens de corticosterona sérica foram feitas por RIE específico,
empregando-se kit fornecido pela MP Biomedicals, LLC. (Corticosterone 125RIA Kit
for rats and mice) que é constituído por reagentes prontos para o uso: diluente do
42
esteróide, anticorpo anti-corticosterona, calibradores de corticosterona, solução
precipitante, corticosterona marcada com 125I, controles para corticosterona. Para
a realização do RIE utilizamos o protocolo fornecido pelo fabricante.
As concentrações de corticosterona em ratos e camundongos observadas
por RIA são similares àquelas observadas por cromatografia de alta eficiência
(HPLC). A dose mínima detectável pelo teste é de aproximadamente 7,7ng/ml. A
especificidade para corticosterona é 100%.
A contagem da radioatividade dos RIE de corticosterona foi realizada em
um cintilador de fase sólida (1470 Wallac WizardTM automatic gamma counter).
Os resultados foram expressos em ng/mL.
6. Análise estatística
Os experimentos foram realizados 4 vezes, sendo todos os dados
expressos como média ± erro padrão da média. Em cada grupo experimental
havia, no mínimo, 2 animais correspondentes a cada tratamento realizado. A
análise estatística empregada na comparação dos resultados apresentados foi
realizada com a utilização dos programas de análises estatísticas Graphpad Prism
(versão 4, Graphpad Software, Inc., San Diego, USA) e SUPERANOVA.
Empregou-se o “one-way” anova seguido do teste de múltipla comparação
Newman-Keuls para a análise univariada, e o “Two-way” anova para a análise
bivariada. Para o hormônio corticosterona, fez-se uma análise não paramétrica,
pois a secreção deste hormônio não obedece à curva Gaussiana. Utilizou-se para
tanto o teste Kruskal-Wallis, seguido do teste de múltipla comparação de Dunn.
Em todos os testes considerou-se significativo p<0,05.
Para a construção dos gráficos dos dados obtidos por RIA e ELISA utilizou-
se os valores de média e variância obtidos para o grupo experimental C (controle)
para delimitar os valores de normalidade de cada ensaio. Nas tabelas, os valores
obtidos para o grupo C foram mostrados e estes foram incluídos na comparação
estatística realizada com os demais grupos experimentais.
43
RRReeesssuuullltttaaadddooosss
1. Primeira etapa – detecção do momento no qual se inicia o ganho de
peso corporal após a ovariectomia
Nesta primeira etapa, observa-se diferença significativa a partir do décimo
terceiro dia após a ovariectomia (Tabela 1 e Gráfico 1). Neste momento, o grupo
OVX apresenta ganho de peso superior ao grupo SHAM; e esta diferença é
significativa. A partir deste momento evidencia-se o estabelecimento do sobrepeso
neste grupo.
Gráfico 1. Ganho de peso corporal (média ± SEM) relativo ao peso corporal
inicial, em função do tempo de tratamento em dias.(▲= OVX ; ♦= SHAM).O dia
zero corresponde ao dia da ovariectomia (n = 16).
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
0
0.96
1.06
1.16
1.26
1.36
1.46
tempo de tratamento (dias)
Gan
ho
de
pe
so
co
rpo
ral
rela
tivo
ao
peso
in
icia
l
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
0
0.96
1.06
1.16
1.26
1.36
1.46
tempo de tratamento (dias)
Gan
ho
de
pe
so
co
rpo
ral
rela
tivo
ao
peso
in
icia
l
44
Tabela 1. Ganho de peso em ratas controle falso operadas (SHAM) e
ovariectomizadas (OVX).
Os valores representam média ± erro padrão de ganho de peso corporal relativo
ao peso inicial dos grupos experimentais nos tempos iniciais de tratamento. A
tabela mostra as diferenças entre os grupos experimentais nos tempos de
tratamento (3, 5, 7, 9, 11 e 13 dias após a ovariectomia) (n = 16). Os valores
representados pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste estatístico
utilizado (p> 0,05).
2. Segunda Etapa
2.1. Peso corporal.
O gráfico 2 representa o ganho de peso corporal dos animais dos diferentes
grupos experimentais, em função do tempo. A análise bivariada foi realizada para
comparar as curvas dos grupos experimentais nos diversos tempos de tratamento.
As curvas dos grupos experimentais diferiram significativamente.
13
11
9
7
5
3
Tratamento
Dias
1,09 ± 0,007a
1,08 ± 0,008a
1,09 ± 0,08a
1,07 ± 0,003a
1,03 ± 0,006a
1,06 ± 0,01a
SHAM
1,14 ± 0,009b
1,07 ± 0,01a
1,09 ± 0,01a
1,08 ± 0,01a
1,05 ± 0,01a
1,04 ± 0,01a
OVX
13
11
9
7
5
3
Tratamento
Dias
1,09 ± 0,007a
1,08 ± 0,008a
1,09 ± 0,08a
1,07 ± 0,003a
1,03 ± 0,006a
1,06 ± 0,01a
SHAM
1,14 ± 0,009b
1,07 ± 0,01a
1,09 ± 0,01a
1,08 ± 0,01a
1,05 ± 0,01a
1,04 ± 0,01a
OVX
45
O grupo OVX apresenta maior ganho de peso corporal total em relação aos
outros grupos, até final do experimento. Neste grupo, a curva de ganho de peso
difere significativamente das demais. Em contrapartida, o grupo OVX + EB
apresenta ganho de peso inferior aos demais durante todo o experimento. Esta
curva difere significativamente daquela relativa ao grupo OVX, mas não difere dos
grupos C e SHAM. Os grupos C e SHAM não apresentam diferença significativa
durante todo o experimento, apresentando ambos uma curva de ganho de peso
semelhante. Através deste gráfico pode-se confirmar que o ganho de peso dos
animais ovariectomizados é maior quando comparado ao ganho de peso dos
animais C, SHAM e OVX + EB.
Gráfico 2. Ganho de peso corporal relativo (média ± SEM) ao peso corporal inicial
em função do tempo de tratamento em dias (■ = C; ▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia. Iniciou-se o tratamento
com benzoato de estradiol (EB) na dose 0,7µg/100g p.c. no dia 1 (n=8).
Analisando-se separadamente cada tempo de tratamento, verifica-se de
acordo com a tabela 2, que no terceiro dia após a ovariectomia já se observa um
comportamento diferenciado entre os grupos com relação ao peso corporal. Os
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
0.96
0.99
1.02
1.05
1.08
1.11
1.14
1.17
1.20
Tempo de tratamento (dias)
Gan
ho
de
pe
so
rela
tivo
ao
peso
in
icia
l
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
0.96
0.99
1.02
1.05
1.08
1.11
1.14
1.17
1.20
Tempo de tratamento (dias)
Gan
ho
de
pe
so
rela
tivo
ao
peso
in
icia
l
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
0.96
0.99
1.02
1.05
1.08
1.11
1.14
1.17
1.20
Tempo de tratamento (dias)
Gan
ho
de
pe
so
rela
tivo
ao
peso
in
icia
l
46
grupos OVX e OVX + EB não apresentam diferença significativa entre si.
Entretanto, ambos os grupos diferem significativamente dos grupos C e SHAM,
sendo que estes últimos também não diferem significativamente entre si. Observa-
se neste momento uma redução significativa de peso corporal nos grupos OVX e
OVX+EB.
Tabela 2. Ganho de peso corporal relativo em ratas controle (C), controle falso-
operadas (SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com
administração de estrogênio (OVX + EB)
Os valores representam média ± erro padrão de ganho de peso corporal relativo
ao peso inicial dos grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela
mostra as diferenças entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento
(3, 6, 9 e 13 dias após a ovariectomia) (n = 8). Os valores representados pela
mesma letra, não diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
No sexto dia após ovariectomia os grupos C e SHAM não diferem entre si
significativamente. Contudo, os grupos OVX e OVX + EB já demonstram neste
1,104 ± 0,029a1,177 ± 0,017b1,091 ± 0,02a1,081 ± 0,017a13
1,024 ± 0,014b1,112 ± 0,009a1,089 ± 0,012a1,083 ± 0,012a9
1,005 ± 0,008b1,056 ± 0,006a1,042 ± 0,011a1,062 ± 0,009a6
0,974 ± 0,005b0,983 ± 0,004b0,999 ± 0,004a1,018 ± 0,004a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
1,104 ± 0,029a1,177 ± 0,017b1,091 ± 0,02a1,081 ± 0,017a13
1,024 ± 0,014b1,112 ± 0,009a1,089 ± 0,012a1,083 ± 0,012a9
1,005 ± 0,008b1,056 ± 0,006a1,042 ± 0,011a1,062 ± 0,009a6
0,974 ± 0,005b0,983 ± 0,004b0,999 ± 0,004a1,018 ± 0,004a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
47
momento diferença significativa entre si. O grupo OVX + EB apresenta ganho de
peso corporal significativamente reduzido em relação aos demais.
No nono dia após a ovariectomia ainda se verifica um menor ganho de peso
pelo grupo OVX + EB em relação aos demais, e esta diferença é significativa.
Ainda neste momento, o grupo OVX não difere significativamente dos grupos C e
SHAM.
No final do experimento observa-se um ganho de peso semelhante entre os
grupos C, SHAM e OVX + EB. O grupo OVX + EB já não difere dos grupos
controle significativamente. O grupo OVX demonstra maior ganho de peso em
relação aos demais grupos, neste dia 13° após a ovariectomia, sendo esta
diferença significativa.
2.2. Gorduras
2.2.1. Gordura Retroperitoneal
Com a ovariectomia observa-se uma modificação na distribuição de gordura
corporal entre os grupos experimentais, como se pode observar pelo gráfico 3.
Gráfico 3. Gordura retroperitoneal (média ± SEM), em função do tempo de
tratamento em dias (■ = C; ▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦= SHAM). O dia zero
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
0.008
0.009
0.010
0.011
0.012
0.013
0.014
0.015
0.016
0.017
0.018
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra r
etr
op
eri
ton
ea
l
g/1
00
g p
.c.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
0.008
0.009
0.010
0.011
0.012
0.013
0.014
0.015
0.016
0.017
0.018
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra r
etr
op
eri
ton
ea
l
g/1
00
g p
.c.
48
corresponde ao dia da ovariectomia. Iniciou-se o tratamento com benzoato de
estradiol (EB) na dose 0,7µg/100g p.c. no dia 1 (n=8).
Observa-se aumento progressivo na gordura retroperitoneal no grupo OVX
em relação aos demais. No grupo OVX + EB a gordura tende a diminuir em função
do tempo, o que se observa a partir do sexto dia pós-ovariectomia. Neste dia a
divergência entre OVX e OVX + EB se acentua Os grupos SHAM e C, apesar das
variações iniciais apresentam valores semelhantes no final do experimento.
Contudo as curvas para os diferentes grupos não diferem significativamente. Tal
fato pode ser devido a grande variabilidade observada entre os dados.
Analisando-se cada tempo de tratamento separadamente, ainda assim não são
verificadas diferenças significativas entre os grupos, em qualquer tempo de
tratamento realizado, como se pode observar de acordo com a tabela 3.
Tabela 3. Variação relativa de gordura retroperitoneal em ratas controle (C),
controle falso-operadas (SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas
com administração de estrogênio (OVX + EB)
0,012± 0,001a0,015 ± 0,001a0,013 ± 0,0008a0,013 ± 0,0007a13
0,010 ± 0,0006a0,014 ± 0,001a0,014 ± 0,002a0,013 ± 0,0008a9
0,012± 0,001a0,012 ± 0,001a0,013 ± 0,001a0,014 ± 0,01a6
0,011 ± 0,001a0,013 ± 0,001a0,012 ± 0,002a0,014 ± 0,001a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
0,012± 0,001a0,015 ± 0,001a0,013 ± 0,0008a0,013 ± 0,0007a13
0,010 ± 0,0006a0,014 ± 0,001a0,014 ± 0,002a0,013 ± 0,0008a9
0,012± 0,001a0,012 ± 0,001a0,013 ± 0,001a0,014 ± 0,01a6
0,011 ± 0,001a0,013 ± 0,001a0,012 ± 0,002a0,014 ± 0,001a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
49
Os valores representam média ± erro padrão da média de gordura retroperitoneal
relativa à gordura inicial (g/100g p.c.) dos grupos experimentais nos tempos de
tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os grupos experimentais em cada
tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a ovariectomia) (n = 8). Os valores
representados pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste estatístico
utilizado (p> 0,05).
2.2.2. Gordura periinguinal
Observando-se o gráfico 4, verifica-se uma nítida diferença entre as curvas
de porcentagem de gordura periinguinal entre os grupos. As curvas dos grupos
OVX e OVX + EB diferem daquelas para os grupos C e SHAM significativamente
durante todo o experimento. Evidencia-se uma redução na porcentagem de
gordura nos primeiros.
Gráfico 4. Gordura periinguinal (média ± SEM) em função do tempo de tratamento
em dias. O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (■ = C; ▲= OVX ; ▼=
OVX + EB; ♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na
dose 0,7µg/100g p.c.no dia 1 (n=8).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.00
0.01
0.02
0.03
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra p
eri
ing
uin
al
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.00
0.01
0.02
0.03
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra p
eri
ing
uin
al
g/1
00
gp
.c.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.00
0.01
0.02
0.03
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra p
eri
ing
uin
al
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.00
0.01
0.02
0.03
Tempo de tratamento (dias)
Go
rdu
ra p
eri
ing
uin
al
g/1
00
gp
.c.
50
Analisando-se os grupos em cada tempo de tratamento separadamente,
observam-se diferenças importantes entre os grupos experimentais, como pode
ser verificado através da tabela 4. As diferenças são significativas a partir do sexto
dia após a ovariectomia. Os grupos OVX e OVX + EB não diferem, mas ambos
diferem significativamente dos grupos controle C e SHAM, e estes não diferem
entre si. No décimo terceiro dia após a ovariectomia, os grupos OVX e OVX + EB
mantém uma quantidade de gordura periinguinal menor em relação aos grupos C
e SHAM. Os dois últimos diferem significativamente dos dois primeiros, e ainda
diferem entre si, apresentando o grupo SHAM redução na quantidade de gordura
em relação ao grupo C.
Tabela 4. Variação relativa de gordura periinguinal em ratas controle (C), controle
falso-operadas (SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com
administração de estrogênio (OVX + EB)
Os valores representam média ± erro padrão da média de gordura periinguinal
relativa à gordura inicial (g/100g p.c.) dos grupos experimentais nos tempos de
tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os grupos experimentais em cada
0,012± 0,02c0,014 ± 0,0008c0,019 ± 0,001b0,025 ± 0,002a13
0,009 ± 0,0009b0,012 ± 0,001b0,021 ± 0,002a0,023 ± 0,002a9
0,014± 0,001b0,014 ± 0,002b0,022 ± 0,002a0,026 ± 0,001a6
0,015 ± 0,003a0,017 ± 0,0008a0,021 ± 0,002aO,023 ± 0,003a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
0,012± 0,02c0,014 ± 0,0008c0,019 ± 0,001b0,025 ± 0,002a13
0,009 ± 0,0009b0,012 ± 0,001b0,021 ± 0,002a0,023 ± 0,002a9
0,014± 0,001b0,014 ± 0,002b0,022 ± 0,002a0,026 ± 0,001a6
0,015 ± 0,003a0,017 ± 0,0008a0,021 ± 0,002aO,023 ± 0,003a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
51
tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a ovariectomia) (n = 8). Os valores
representados pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste estatístico
utilizado (p> 0,05).
3. Consumo alimentar
De uma maneira geral, o consumo alimentar é um parâmetro que não
demonstra diferença entre os grupos durante o experimento, como pode ser
observado no gráfico 5. As curvas temporais relativas aos grupos experimentais
não diferem significativamente.
Gráfico 5. Consumo alimentar (média ± SEM) relativo ao consumo alimentar
inicial em função do tempo de tratamento em dias. O dia zero corresponde ao dia
da ovariectomia (■ = C; ▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦= SHAM). Iniciou-se o
tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose 0,7µg/100g p.c. no dia 1
(n=8).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tempo de tratamento (dias)
Co
ns
um
o a
lim
en
tar
rela
tivo
ao
co
nsu
mo
in
icia
l
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tempo de tratamento (dias)
Co
ns
um
o a
lim
en
tar
rela
tivo
ao
co
nsu
mo
in
icia
l
52
Tabela 5. Consumo alimentar em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB)
Os valores representam média ± erro padrão da variação média de consumo
alimentar dos grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as
diferenças entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e
13 dias após a ovariectomia) (n = 8). Os valores representados pela mesma letra,
não diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
1,222± 0,054a1,074 ± 0,175a1,087 ± 0,197a1,246 ± 0,181a13
1,121 ± 0,036a1,145 ± 0,081a1,070 ± 0,070a1,117 ± 0,096a9
1,008± 0,641a1,104 ± 0,067a1,043 ± 0,067a1,128 ± 0,059a6
0,875 ± 0,611b0,964 ± 0,551ab1,011 ± 0,043ab1,115 ± 0,046a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
1,222± 0,054a1,074 ± 0,175a1,087 ± 0,197a1,246 ± 0,181a13
1,121 ± 0,036a1,145 ± 0,081a1,070 ± 0,070a1,117 ± 0,096a9
1,008± 0,641a1,104 ± 0,067a1,043 ± 0,067a1,128 ± 0,059a6
0,875 ± 0,611b0,964 ± 0,551ab1,011 ± 0,043ab1,115 ± 0,046a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
53
4. Consumo hídrico
O consumo hídrico não apresenta variações importantes entre os diferentes
grupos experimentais durante todo o experimento, o que pode ser observado pela
análise do gráfico 6 e da tabela 6. Este parâmetro não sofre alteração com a
intervenção cirúrgica, no terceiro dia e apresenta comportamento semelhante
entre os grupos no 6°, 9° e 13° dia após a ovariectomia.
Gráfico 6. Consumo hídrico (média ± SEM) relativo ao consumo hídrico inicial (ml)
em função do tempo de tratamento em dias. O dia zero corresponde ao dia da
ovariectomia (■ = C; ▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento
com benzoato de estradiol (EB) na dose 0,7µg/100g p.c. no dia 1 (n=8).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tempo de tratamento (dias)
Co
ns
um
o h
ídri
co
rela
tivo
ao
co
nsu
mo
in
icia
l
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tempo de tratamento (dias)
Co
ns
um
o h
ídri
co
rela
tivo
ao
co
nsu
mo
in
icia
l
54
Tabela 6. Consumo hídrico em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB)
Os valores representam média ± erro padrão da média de consumo hídrico
relativo ao consumo inicial (ml) dos grupos experimentais nos tempos de
tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os grupos experimentais em cada
tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a ovariectomia) (n = 8). Os valores
representados pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste estatístico
utilizado (p> 0,05).
1,244± 0,174a1,189 ± 0,133a1,037 ± 0,091a0,932 ± 0,061a13
0,978± 0,064a1,131 ± 0,096a1,125 ± 0,084a0,980 ± 0,084a9
1,053± 0,076a1,094 ± 0,050a1,103 ± 0,057a1,099 ± 0,057a6
1,117± 0,079a1,119± 0,565a1,152 ± 0,060a1,103 ± 0,061a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
1,244± 0,174a1,189 ± 0,133a1,037 ± 0,091a0,932 ± 0,061a13
0,978± 0,064a1,131 ± 0,096a1,125 ± 0,084a0,980 ± 0,084a9
1,053± 0,076a1,094 ± 0,050a1,103 ± 0,057a1,099 ± 0,057a6
1,117± 0,079a1,119± 0,565a1,152 ± 0,060a1,103 ± 0,061a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
55
5. Verificação dos parâmetros séricos na ovariectomia e na reposição
hormonal – perfil hormonal
5.1. Leptina
A leptina apresenta grande variabilidade entre os grupos, como pode ser
visto através da análise do gráfico 7. A curva do grupo OVX + EB difere
significativamente da curva do grupo OVX, apresentando concentrações séricas
de leptina mais baixas que este grupo durante todo o experimento. O grupo OVX
além de diferir do grupo OVX + EB significativamente, também difere do grupo
SHAM. Observa-se durante todo o experimento valores mais elevados de leptina
no primeiro. Contudo, apenas o grupo OVX + EB situa-se fora da região
pontilhada delimitada no gráfico pelos valores obtidos através do grupo C para
faixa de normalidade.
Gráfico 7. Leptina sérica (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias.O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
Tempo de tratamento (dias)
Lep
tin
a (
ng
/ml)
95% das médiaspopulacionais
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
Tempo de tratamento (dias)
Lep
tin
a (
ng
/ml)
95% das médiaspopulacionais
0
56
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites do intervalo = 5,7 – 7,26) (n=6).
Pela análise da tabela 7, pode-se observar no sexto dia após a
ovariectomia, uma redução nas concentrações séricas de leptina nos grupos
SHAM, OVX e OVX + EB. Contudo, neste dia, apenas o grupo OVX + EB difere
significativamente do grupo C. No dia 9, o grupo OVX apresenta valores mais
elevados para leptina em relação aos outros, mas apenas os grupos OVX e SHAM
diferem significativamente.
Tabela 7. Leptina sérica (ng/ml) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de leptina (ng/ml) dos
grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças
entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias
5,913 ± 0,377a7,405 ± 0,561ac4,753 ± 0,453ab6, 167 ± 0, 703a13
4,606 ± 0,379a7,238 ± 0,709a6,302 ± 0,819a5,905 ± 0,651a9
4,880 ± 0,149b6,028 ± 0,460ab5,646 ± 1,075ab7,662 ± 0,509a6
5,502 ± 0,190a7,070 ± 0,566a6,418 ± 0,581a6,088 ± 0,971a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
5,913 ± 0,377a7,405 ± 0,561ac4,753 ± 0,453ab6, 167 ± 0, 703a13
4,606 ± 0,379a7,238 ± 0,709a6,302 ± 0,819a5,905 ± 0,651a9
4,880 ± 0,149b6,028 ± 0,460ab5,646 ± 1,075ab7,662 ± 0,509a6
5,502 ± 0,190a7,070 ± 0,566a6,418 ± 0,581a6,088 ± 0,971a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
57
após a ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não
diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
5.2. Corticosterona
A corticosterona sérica é outro parâmetro de grande variabilidade entre os
grupos. Quando se compara as curvas dos grupos verifica-se diferença
significativa apenas entre os grupos OVX + EB e os grupos SHAM e OVX. Estes
dois últimos não diferem significativamente entre si. O grupo OVX + EB situa-se
abaixo da faixa de normalidade estabelecida pelos valores de C durante todo o
experimento, retornando à faixa de normalidade apenas no décimo terceiro dia
após a ovariectomia (Gráfico 8).
Gráfico 8. Corticosterona sérica (média ± SEM) em função do tempo de
tratamento em dias. O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ;
▼= OVX + EB; ♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol
(EB) na dose 0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas
corresponde a 95% das medidas populacionais, obtido através dos valores de
variância encontrados para o grupo C (limites do intervalo = 267,56 – 459,3) (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
100
200
300
400
500
600
700
Tempo de tratamento (dias)
Co
rtic
os
tero
na
(n
g/m
l)
95% das médias populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
100
200
300
400
500
600
700
Tempo de tratamento (dias)
Co
rtic
os
tero
na
(n
g/m
l)
95% das médias populacionais
58
Comparando-se cada tempo de tratamento separadamente, os grupos OVX
e OVX + EB já diferem no sexto dia após a ovariectomia. Neste momento, o grupo
OVX + EB já apresenta valores reduzidos. No nono dia, este mesmo grupo agora
difere significativamente de SHAM, contudo apresenta valores mais baixos que
todos os demais; e no décimo terceiro dia após a ovariectomia o que se observa é
que os grupos não diferem significativamente entre si pelo teste estatístico
utilizado.
Tabela 8. Corticosterona sérica (ng/ml) em ratas controle (C), controle falso-
operadas (SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com
administração de estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de corticosterona (ng/ml)
dos grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as
diferenças entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e
13 dias após a ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra,
não diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
290,4 ± 26,7a466,8 ± 54,4a265,5 ± 125,0a425,8 ± 46,5a13
61,74 ± 17,5c339,7 ± 101,1abc370,2 ± 83,9b300,6 ± 83,1abc9
156,2 ± 113,9c597,4 ± 67,6b520,0 ± 43,4abc265,1 ± 88,9abc6
146,7 ± 60,8a441,7 ± 21,3a526,7 ± 93,7a502,4 ±81,2a3
OVX + EBOVXSHAMIntacta
Tratamento
Dias
290,4 ± 26,7a466,8 ± 54,4a265,5 ± 125,0a425,8 ± 46,5a13
61,74 ± 17,5c339,7 ± 101,1abc370,2 ± 83,9b300,6 ± 83,1abc9
156,2 ± 113,9c597,4 ± 67,6b520,0 ± 43,4abc265,1 ± 88,9abc6
146,7 ± 60,8a441,7 ± 21,3a526,7 ± 93,7a502,4 ±81,2a3
OVX + EBOVXSHAMIntacta
Tratamento
Dias
59
5.3. Triiodotironina (T3)
Observando as curvas de concentração de T3 dos grupos em função do
tempo (Gráfico 9), verificam-se comportamentos diversificados entre os grupos. A
curva de T3 dos grupos OVX + EB e OVX diferem significativamente da curva do
grupo SHAM. Neste último, as concentrações de T3 iniciam-se elevadas e tendem
a reduzir em função do tempo, portanto as diferenças observadas se devem
principalmente aos primeiros dias após a ovariectomia. De fato, a curva do grupo
SHAM situa-se fora da região tracejada para valores normais, nos primeiros dias
após a ovariectomia.
Gráfico 9. T3 (média ± SEM) sérico em função do tempo de tratamento em dias.O
dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo =45,65 – 62,57) (n=6).
Observando-se os valores deste hormônio em cada tempo de tratamento
separadamente, verificou-se nos dias 3 e 6 uma elevação nas concentrações de
T3 no grupo SHAM, sendo tais valores diferentes significativamente apenas no
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Tempo de tratamento (dias)
T3
(ng
/dL
)
95% das médias populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Tempo de tratamento (dias)
T3
(ng
/dL
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Tempo de tratamento (dias)
T3
(ng
/dL
)
95% das médias populacionais
60
sexto dia em relação aos demais grupos. Os valores deste hormônio para o grupo
OVX + EB encontram-se reduzidos em relação aos demais, contudo esta
diferença não é significativa, provavelmente devido à variabilidade dos dados
neste grupo.
No final do experimento, os valores de T3 não são significativamente
diferentes entre os grupos.
Tabela 9. T3 sérica (ng/dL) em ratas controle (C), controle falso-operadas (SHAM),
ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de estrogênio
(OVX + EB).
Os valores representam média ± erro de T3 (ng/dL) dos grupos experimentais nos
tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os grupos
experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a
ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não diferem
entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
41,71 ± 2,9a57,45 ± 7,5a45,36 ± 9,2a48,49 ± 9,2a13
43,10 ± 5,1a56,67 ± 8,1a65,37 ± 6,3a46,66 ± 8,0a9
34,28 ± 10,3a61,27 ± 7,3a92,88 ± 10,5b53,46 ± 5,4a6
60,47 ± 7,6a43,47 ± 12,5a72,41 ± 11,1a62,42 ± 4,0a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
41,71 ± 2,9a57,45 ± 7,5a45,36 ± 9,2a48,49 ± 9,2a13
43,10 ± 5,1a56,67 ± 8,1a65,37 ± 6,3a46,66 ± 8,0a9
34,28 ± 10,3a61,27 ± 7,3a92,88 ± 10,5b53,46 ± 5,4a6
60,47 ± 7,6a43,47 ± 12,5a72,41 ± 11,1a62,42 ± 4,0a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
61
5.4. Tetraiodotironina (T4)
Pelo observação do gráfico 10 e da tabela 10 podem-se observar
diferenças importantes entre os grupos experimentais em relação ao hormônio T4.
A curva temporal do grupo OVX + EB difere significativamente das demais,
apresentando este grupo valores mais reduzidos de T4. a partir do nono dia de
ovariectomia. Os grupos OVX + EB e SHAM encontram-se fora do espaço
tracejado para valores de normalidade, estando ambos abaixo destes valores. O
grupo OVX está fora dos valores normais apenas no décimo terceiro dia após a
ovariectomia, momento no qual este grupo apresenta uma elevação importante
nos seus valores de T4; e esta diferença é significativa em comparação aos outros
grupos. Neste momento, o grupo OVX + EB também difere significativamente dos
demais, apresentando valores reduzidos de T4.
Gráfico 10. T4 sérico (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias.O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo = 8,24 – 10,24) (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
10.5
12.0
13.5
Tempo de tratamento (dias)
T4
(µµ µµ
g/d
L)
95% das médias populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
10.5
12.0
13.5
Tempo de tratamento (dias)
T4
(µµ µµ
g/d
L)
95% das médias populacionais
62
Tabela 10. T4 sérica (µg/dL) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de T4 (µg/dL) dos grupos
experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os
grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a
ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não diferem
entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
5.5. TSH
Para o hormônio TSH, a curva do grupo OVX difere significativamente das
curvas dos demais, sendo a única curva a se manter dentro dos limites de
normalidade durante todo o experimento (Gráfico 11).
4,39 ± 0,73c13,03 ± 0,67b6,92 ± 0,68a8,87 ± 0,85a13
6,64 ± 0,86a7,40 ± 0,70a7,58 ± 0,99a8,28 ± 0,47a9
6,25 ± 0,71a6,65 ± 0,91a7,71 ± 1,01a8,46 ± 0,85a6
6,15 ± 1,04bc3,92 ± 0,63c7,73 ± 1,06b10,82 ± 1,04a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
4,39 ± 0,73c13,03 ± 0,67b6,92 ± 0,68a8,87 ± 0,85a13
6,64 ± 0,86a7,40 ± 0,70a7,58 ± 0,99a8,28 ± 0,47a9
6,25 ± 0,71a6,65 ± 0,91a7,71 ± 1,01a8,46 ± 0,85a6
6,15 ± 1,04bc3,92 ± 0,63c7,73 ± 1,06b10,82 ± 1,04a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
63
Gráfico 11. TSH sérico (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias. O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB;
♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo = 0.96 – 1.6) (n=6).
Quando são analisados separadamente os grupos em cada tempo de
tratamento (Tabela 11), observam-se diferenças importantes. No dia nove após a
ovariectomia observa-se um aumento nas concentrações de TSH no grupo OVX +
EB em relação aos outros grupos, e esta diferença é significativa. Em relação aos
grupos C, SHAM e OVX não há diferença significativa entre eles. No décimo
terceiro dia verifica-se uma redução nas concentrações de TSH nos grupos
SHAM, OVX e OVX + EB em relação ao grupo C. Este último difere de todos os
outros grupos significativamente.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
2.1
TS
H (
ng
/dL
)95% das médias
populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
2.1
TS
H (
ng
/dL
)95% das médias
populacionais
64
Tabela 11. TSH sérica (ng/dL) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de TSH (ng/dL) dos grupos
experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os
grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a
ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não diferem
entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
1,10 ± 0, 07b1,09 ± 0,06b0,94 ± 0,09b1,50 ± 0,11a13
1,68 ± 0,15b1,12 ± 0,08a0,83 ± 0,10a1,14 ± 0,09a9
1,13 ± 0,12a1,24 ± 0,14a1,16 ± 0,21a1,53 ± 0,53a6
1,34± 0,13a1,20 ± 0,15a1,32 ± 0,12a1,08 ± 0,12a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
1,10 ± 0, 07b1,09 ± 0,06b0,94 ± 0,09b1,50 ± 0,11a13
1,68 ± 0,15b1,12 ± 0,08a0,83 ± 0,10a1,14 ± 0,09a9
1,13 ± 0,12a1,24 ± 0,14a1,16 ± 0,21a1,53 ± 0,53a6
1,34± 0,13a1,20 ± 0,15a1,32 ± 0,12a1,08 ± 0,12a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
65
6.. Verificação dos parâmetros séricos na ovariectomia e na reposição
hormonal - Citocinas
6.1. IL-1ββββ
Através do gráfico 12, pode-se observar uma nítida e importante diferença
entre os grupos em relação a interleucina 1. Os grupos OVX e OVX + EB, apesar
de apresentarem uma curva semelhante, suas curvas diferem entre si
significativamente. Os valores observados para o grupo OVX + EB são superiores
àqueles observados para o grupo OVX, durante todo o experimento. Ainda, a
curva de ambos os grupos difere da curva do grupo SHAM.
Gráfico 12. IL-1β sérica (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias.O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo = 7,86 – 14,32) (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tempo de tratamento (dias)
IL-1
(p
g/m
l)
95% das médias populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tempo de tratamento (dias)
IL-1
(p
g/m
l)
95% das médias populacionais
66
No terceiro dia após a ovariectomia já se observa uma diferença
significativa entre os grupos ovariectomizados e o grupo SHAM (Tabela 12). Neste
momento, os valores para o grupo C não puderam ser quantificados, pois se
encontram abaixo do limite de detecção do teste utilizado.
Tabela 12. IL-1β sérica (pg/ml) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de IL-1β (pg/ml) dos
grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças
entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias
após a ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não
diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05). ND: valores não
detectáveis pelo método utilizado.
44,79 ± 3,89c35,61 ± 1,62b18,76 ± 1,95a13,25 ± 3,36a13
46,29 ± 3,11b40,03 ± 2,27b12,19 ± 3,67a9,39 ± 2,02a9
46,86 ± 2,93b39,94 ± 2,55b9,28 ± 1,61a11,77 ± 3,06a6
38,22 ± 2,48b34,95 ± 4,70b8,78 ± 2,27aND3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
44,79 ± 3,89c35,61 ± 1,62b18,76 ± 1,95a13,25 ± 3,36a13
46,29 ± 3,11b40,03 ± 2,27b12,19 ± 3,67a9,39 ± 2,02a9
46,86 ± 2,93b39,94 ± 2,55b9,28 ± 1,61a11,77 ± 3,06a6
38,22 ± 2,48b34,95 ± 4,70b8,78 ± 2,27aND3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
67
No sexto e nono dias após a ovariectomia, o comportamento dos grupos
ovariectomizados, com ou sem reposição de estrogênio é diferente daquele
observado para os grupos SHAM e C. Os valores de IL-1β nos grupos
ovariectomizados encontram-se elevados.
No décimo terceiro dia após a ovariectomia, nota-se o efeito da reposição
estrogênica na elevação dos níveis de IL-1β sérica. O grupo OVX + EB difere
significativamente do grupo OVX neste momento, e ambos diferem dos grupos
controle.
6.2. IL-6
Em relação a interleucina 6, não são observadas diferenças significativas
entre as curvas temporais dos diferentes grupos (Gráfico 13)
Gráfico 13. IL-6 sérica (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias. O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB;
♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo = 10,82 – 13,8) (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
5
10
15
20
25
30
Tempo de tratamento (dias)
IL-6
pg
/ml
95% das médias populacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
5
10
15
20
25
30
Tempo de tratamento (dias)
IL-6
pg
/ml
95% das médias populacionais
68
Contudo, quando se analisa separadamente cada tempo de tratamento,
observa-se uma elevação nos valores desta citocina nos grupos OVX e SHAM no
terceiro dia. O grupo OVX difere significativamente dos demais, com exceção do
grupo SHAM. Nos dias subseqüentes, não são observadas diferenças
significativas entre os grupos e no final do experimento todos os grupos
encontram-se dentro da faixa de normalidade (Tabela 13)
Tabela 13. IL-6 sérica (pg/ml) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de IL-6 (pg/ml) dos grupos
experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças entre os
grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias após a
ovariectomia) (n= 6). Os valores representados pela mesma letra, não diferem
entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05). ND: valores não detectáveis pelo
método utilizado.
ND12,16 ± 2,31a13,34 ± 1,92a11,27 ± 1,14a13
16,08 ± 1,66a16,66 ± 2,15a13,04 ± 1,06a13,68 ± 2,41a9
16,56 ± 1,74a13,42 ± 1,83a14,45 ± 6,10a12,35 ± 0,81a6
12,06 ± 0,67a17,37 ± 1,19b16,19 ± 3,84ab10,88 ± 0,54a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
ND12,16 ± 2,31a13,34 ± 1,92a11,27 ± 1,14a13
16,08 ± 1,66a16,66 ± 2,15a13,04 ± 1,06a13,68 ± 2,41a9
16,56 ± 1,74a13,42 ± 1,83a14,45 ± 6,10a12,35 ± 0,81a6
12,06 ± 0,67a17,37 ± 1,19b16,19 ± 3,84ab10,88 ± 0,54a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
69
6.3. IL-10
Observando-se a curva de IL-10 em função do tempo (Gráfico 14), pode-se
verificar o comportamento semelhante entre os grupos ovariectomizados com ou
sem reposição de estrogênio. A curva do grupo SHAM difere das demais. As
diferenças ainda são significativas em todos os dias analisados (Tabela 14). Pela
análise das curvas, pode-se observar que os grupos ovariectomizados
apresentam valores elevados desta interleucina em relação ao grupo SHAM, o
que se torna significativo a partir do nono dia após a ovariectomia.
Gráfico 14. IL-10 sérica (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias. O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB;
♦= SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo =10,42 – 16,22) (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
Tempo de tratamento (dias)
IL-1
0
(pg
/ml) 95% das médiaspopulacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
Tempo de tratamento (dias)
IL-1
0
(pg
/ml) 95% das médiaspopulacionais
70
Tabela 14. IL-10 sérica (pg/ml) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
Os valores representam média ± erro padrão da média de IL-10 (pg/ml) dos
grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças
entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias
após a ovariectomia) (n = 6). Os valores representados pela mesma letra, não
diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p> 0,05).
Nos dias 3 e 6 após a ovariectomia, as diferenças entre os grupos ainda
não são significativas. Contudo, pode-se observar que os valores de IL-10 para os
grupos OVX e OVX + EB já se apresentam ligeiramente elevados em relação aos
grupos controle. O grupo OVX + EB apresenta valores ainda mais elevados
quando comparado ao grupo OVX, apesar destas diferenças não serem
significativas até este momento.
17,11 ± 1,33bc15,84 ±1,54bc9,41 ± 1, 50a11,75 ± 0,77ab13
17,02 ± 0,97b16,76 ± 1,97b10,18 ± 1,71a11,18 ± 1,07a9
17,26 ± 1,47a12,17 ± 1,82a10,30 ± 1,15a14,13 ± 3,73a6
12,44 ±1,00a11,63 ± 1,59a9,18 ± 0,34a10,58 ± 0,99a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
17,11 ± 1,33bc15,84 ±1,54bc9,41 ± 1, 50a11,75 ± 0,77ab13
17,02 ± 0,97b16,76 ± 1,97b10,18 ± 1,71a11,18 ± 1,07a9
17,26 ± 1,47a12,17 ± 1,82a10,30 ± 1,15a14,13 ± 3,73a6
12,44 ±1,00a11,63 ± 1,59a9,18 ± 0,34a10,58 ± 0,99a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
71
No nono dia após a ovariectomia, os grupos OVX e OVX + EB diferem
significativamente dos grupos C e SHAM, e estes não diferem entre si. Os valores
de IL-10 dos grupos ovariectomizados são mais elevados quando comparado aos
valores dos grupos controle.
No décimo terceiro dia após a ovariectomia, os grupos OVX e OVX + EB
continuam não diferindo entre si, entretanto, o grupo C também não difere
significativamente deles. Apenas o grupo SHAM difere significativamente dos
grupos OVX e OVX + EB neste momento. Os grupos C e SHAM também não
diferem entre si.
6.4. TNF-αααα
Pela observação do gráfico 15, pode-se observar que a curva de TNF-α em
função do tempo difere pouco em relação a ovariectomia. Há grande variabilidade
de dados dentro do mesmo grupo, o que dificulta a análise das diferenças entre os
grupos experimentais.
Gráfico 15. TNF-α sérica (média ± SEM) em função do tempo de tratamento em
dias.O dia zero corresponde ao dia da ovariectomia (▲= OVX ; ▼= OVX + EB; ♦=
SHAM). Iniciou-se o tratamento com benzoato de estradiol (EB) na dose
0,7µg/100g p.c. no dia 1. O espaço entre as linhas pontilhadas corresponde a 95%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
10
20
30
40
50
Tempo de tratamento (dias)
TN
F-
αα αα(p
g/m
l)
95% das médiaspopulacionais
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
10
20
30
40
50
Tempo de tratamento (dias)
TN
F-
αα αα(p
g/m
l)
95% das médiaspopulacionais
72
das medidas populacionais, obtido através dos valores de variância encontrados
para o grupo C (limites deste intervalo = 7,54 – 18,3) (n=6).
Observando-se a tabela 14, verifica-se que não há diferença significativa
entre os grupos experimentais em qualquer momento do experimento. No décimo
terceiro dia, não foi possível mensurar os valores de TNF-α para todos os animais
do grupo C, pois a maioria deles se encontra abaixo do limite de detecção do teste
utilizado.
Tabela 15. TNF-α sérica (pg/ml) em ratas controle (C), controle falso-operadas
(SHAM), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas com administração de
estrogênio (OVX + EB).
.
Os valores representam média ± erro padrão da média de TNF-α (pg/ml) dos
grupos experimentais nos tempos de tratamento. A tabela mostra as diferenças
entre os grupos experimentais em cada tempo de tratamento (3, 6, 9 e 13 dias
após a ovariectomia) (n= 6.). Os valores representados pela mesma letra, não
19,51 ± 6,54a26,77 ± 10,72a24,10 ± 14,67aND13
15,12 ± 11,06a10,92 ± 2,55a12,50 ± 3,33a15,55 ± 6,11a9
17,31 ± 6,48a24,48 ± 11,81a11,74 ± 7,67a6,19 ± 1,24a6
22,48 ± 6,58a25,02 ± 10,28a7,67 ± 3,09a16,66 ± 3,69a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
19,51 ± 6,54a26,77 ± 10,72a24,10 ± 14,67aND13
15,12 ± 11,06a10,92 ± 2,55a12,50 ± 3,33a15,55 ± 6,11a9
17,31 ± 6,48a24,48 ± 11,81a11,74 ± 7,67a6,19 ± 1,24a6
22,48 ± 6,58a25,02 ± 10,28a7,67 ± 3,09a16,66 ± 3,69a3
OVX + EBOVXSHAMControle
Tratamento
Dias
73
diferem entre si pelo teste estatístico utilizado (p>0,05). ND: valores não
detectáveis pelo método utilizado.
74
DDDiiissscccuuussssssãããooo
A relação entre estrogênio e peso corporal vem sendo discutida em muitos
estudos na última década. Na maioria das vezes observa-se ganho de peso
corporal significativo nos animais ovariectomizados (Vasconcellos e cols, 2004;
Roesch, 2006). No entanto, o momento exato e a relação causa-consequência
deste ganho de peso não estão bem definidos. Os resultados são na maioria das
vezes conflitantes, devido à variedade e a complexidade dos métodos de
avaliação adotados.
Vários fatores influenciam o ganho de peso corporal total, como
hereditariedade, idade, consumo alimentar, sedentarismo e outros (Wadden,
1993). Neste trabalho pretendeu-se eliminar tais intercorrências, mantendo-se os
animais em gaiolas individuais, aferindo-se os consumos hídrico e alimentar dos
mesmos diariamente, e utilizando-se animais da mesma idade, peso inicial
semelhante e que apresentassem ciclo estral regular. Foi criado um grupo
experimental que sofreu estresse cirúrgico, a fim de simular o estresse a que os
animais que sofrem ovariectomia são submetidos (SHAM), eliminando desta forma
a possibilidade da interferência do estresse nos parâmetros avaliados.
Observou-se ganho de peso significativo no grupo OVX, o que coincide com
os dados da literatura. Também se verificou a prevenção do ganho de peso pela
administração de estrogênio em doses fisiológicas aos animais ovariectomizados
(OVX + EB) nos primeiros dias após a ovariectomia, quando comparados aos
animais OVX.
Contrariando dados recentemente publicados (Vasconcellos e cols, 2004),
verificamos que o ganho de peso nos animais OVX inicia-se precocemente, logo
após o procedimento de ovariectomia, sendo significativo em torno do 13° dia; e
continua pelo menos até o quadragésimo oitavo dia após a ovariectomia, como se
pode observar pelos resultados da primeira fase dos experimentos. De acordo
com Vasconcellos e cols (2004), o ganho de peso corporal só é
significativo a partir da 9° semana após a ovariectomia e prossegue por muitas
75
semanas após a retirada dos ovários. As divergências entre os resultados podem
ser explicadas, em parte, pela metodologia empregada. No estudo citado, também
foram utilizadas ratas Wistar, contudo estas ratas apresentavam peso de 200g ±
15 g no início do experimento; enquanto em nosso estudo as ratas apresentavam
peso de 150g ± 20g no início do experimento. Tal fato talvez justifique as
diferenças nos achados em relação ao início do ganho de peso após a
ovariectomia. No entanto, ambos os estudos concordam no que diz respeito ao
ganho de peso significativo nos animais ovariectomizados.
De acordo com os resultados obtidos para peso corporal na primeira fase
dos experimentos, traçou-se o desenho experimental da segunda fase dos
experimentos; com o objetivo de verificar as possíveis alterações que estariam
envolvidas na gênese do ganho de peso corporal nos animais OVX. Nesta fase,
observou-se que, em um primeiro momento, provavelmente devido à intervenção
cirúrgica, os animais OVX, OVX + EB e SHAM perdem peso (3° dia), entretanto
isto é significativo apenas para os animais OVX e OVX + EB em relação aos
animais C. Esta perda de peso é temporária e é revertida rapidamente. O grupo
OVX + EB inicia o ganho de peso tardiamente em comparação ao grupo OVX,
mantendo-se menor em relação aos demais até o 9° dia após a ovariectomia. No
13° dia o peso corporal dos animais OVX + EB iguala-se ao peso corporal dos
animais SHAM e C, entretanto, permanece reduzido em relação ao grupo OVX.
Isto sugere um papel do estrogênio na prevenção de ganho de peso corporal
inicialmente. De fato, segundo Roesch (2006) os animais ovariectomizados que
recebem reposição estrogênica iniciam o ganho de peso mais tardiamente. Em
seu trabalho, o autor obteve uma diferença significativa entre o ganho de peso dos
animais ovariectomizados e ovariectomizados que recebem reposição hormonal.
Os últimos sofrem um acréscimo significativamente menor no peso corporal
quando comparados aos ovariectomizados sem reposição hormonal.
Neste trabalho não foi possível avaliar a prevenção do ganho de peso pela
administração de estrogênio exógena a longo prazo, pois os animais foram
monitorados apenas no período inicial após a ovariectomia.
76
No final do décimo terceiro dia observou-se um ganho de peso
significativamente maior no grupo OVX em relação aos demais, o que corrobora
os achados da primeira fase dos experimentos.
O ganho de peso corporal foi acompanhado de algumas alterações nos
estoques de gordura corporal. Devido à variabilidade nos dados não se observou
diferença significativa entre os grupos em relação à gordura retroperitoneal.
Entretanto, verificou-se um comportamento bastante diferenciado neste
compartimento de gordura entre os grupos OVX e OVX + EB. Enquanto o primeiro
sofreu elevação, o segundo sofreu redução nos seus valores. Este fato se tornou
mais proeminente a partir do nono dia após a ovariectomia. Mas foi no
compartimento periinguinal que os grupos demonstraram maior diferença. Ambos
sofreram redução significativa nestes valores em relação aos grupos SHAM e C a
partir do 6°dia, o que se manteve até o final do experimento. A gordura corporal
sofre alterações com a ovariectomia, e é provável que exista um aumento nos
estoques de gordura subcutânea em ratos (Heine e cols, 2000). Neste trabalho,
não foi possível determinar uma possível migração desses estoques, pois para tal
seria necessário quantificar a gordura corporal na carcaça do animal. De acordo
com Lafontan & Berlan (2003) as principais co-morbidades associadas à
obesidade relacionam-se ao acréscimo de gordura nos compartimentos
subcutâneo e visceral em humanos. Isto pode explicar a ocorrência de
dislipidemias e o aumento do risco de doenças cardiovasculares freqüentemente
observados em mulheres na menopausa (Gaspard & Brule, 2003; Lovejoy, 2003).
Em relação ao consumo alimentar, no presente estudo, não foram
observadas diferenças significativas entre os grupos. A maioria dos estudos
publicados justifica o ganho de peso corporal nos animais ovariectomizados pelo
aumento no consumo alimentar nestes animais (Hrupka e cols 2002; Shimizu e
cols, 1996; Ainslie e cols, 2001). De fato, o estrogênio exerce um papel anorético
(Liang e cols, 2002). Contudo, alguns estudos não observaram acréscimo no
consumo alimentar dos animais ovariectomizados em relação aos grupos controle
e àqueles repostos com estrogênio (Katz e cols, 2000; Dubnov e cols, 2003) o que
corrobora nossos achados. Tais resultados conflitantes podem ser devidos à
77
metodologia utilizada nos diferentes trabalhos. A maioria não afere o consumo
alimentar diariamente, o que pode mascarar os resultados. Ainda, a redução no
consumo alimentar observada nos animais ovariectomizados repostos com
estrogênio, é verificada quando o animal recebe estrogênio na dose
suprafisiológica (Ainslie e cols, 2001). Desta forma, concluímos que o ganho de
peso que acontece nos primeiros dias após ovariectomia não se deve a hiperfagia,
mas provavelmente ocorra devido à redução no gasto energético, promovendo
maior acúmulo de tecido adiposo. Entretanto, os mecanismos responsáveis por
essas alterações ainda são desconhecidos.
O consumo hídrico também não se alterou entre os grupos. Nesse trabalho
não foi possível se verificar a retenção hídrica dos animais OVX, pois os animais
não foram alocados em gaiolas metabólicas. Entretanto, com os dados obtidos até
o momento pode-se observar que o consumo hídrico não está aumentado nos
animais OVX. Contrariando este estudo, Fernandez e cols (2001), demonstraram
que ratas fêmeas castradas ingerem mais água que ratas fêmeas intactas.
Segundo Krause e cols (1996) a reposição com estrogênio na dose de 10 µg/0.1
ml de óleo, reduz o consumo de água em ratas ovariectomizadas. O autor
considera um possível efeito do estrogênio como redutor do consumo hídrico. Tais
diferenças podem ser devidas à dose de estrogênio administrada nos diferentes
estudos. No presente estudo, administrou-se estrogênio na dose de 0,7µg/100g
p.c., que é a dose considerada fisiológica para estes animais (Lima e cols, 2006).
No estudo de Krause e cols (1996) a dose administrada foi maior, o que talvez
possa explicar um efeito mais pronunciado deste hormônio.
No presente trabalho, as concentrações de leptina plasmáticas mantiveram-
se inalteradas nos animais OVX, mesmo após o início do ganho de peso corporal.
Observou-se uma redução nos valores de leptina nos animais que receberam
reposição de estrogênio (OVX + EB), o que foi significativo no sexto dia após a
ovariectomia. Contudo, estes valores prontamente retornam aos valores normais
em torno do décimo terceiro dia após a ovariectomia. Isso sugere que o estrogênio
é possivelmente capaz de prevenir a elevação nas concentrações de leptina logo
após a ovariectomia, mas este efeito não se mantém em longo prazo. Em
78
contrapartida, a maioria dos estudos ressalta que o estrogênio é um fator
estimulante para a secreção de leptina em humanos e em animais (Tommaselli e
cols, 2001; Isidori e cols, 2000; Shimizu e cols, 1997). Tais diferenças nos
resultados se devem provavelmente ao momento no qual se dosou este hormônio.
Nestes estudos, as concentrações de leptina foram medidas após semanas da
ovariectomia, e a reposição de estrogênio se iniciou depois de alguns dias de
ovariectomia. Em nosso estudo, as concentrações de leptina foram medidas em
vários momentos do experimento e a reposição hormonal foi iniciada logo no
primeiro dia após a ovariectomia, o que nos permite uma visão mais detalhada das
possíveis variações nas concentrações de leptina em função do tempo da
ovariectomia e da ação do estrogênio exógeno. No estudo de Pelleymounter
(1999), não foram verificadas alterações nas concentrações de leptina nos animais
que receberam reposição hormonal. No presente trabalho, apesar das alterações
obtidas em curto prazo, o que se verifica é a manutenção nos níveis deste
hormônio dentro da faixa de normalidade até o final do experimento. Ainda, a
redução temporária nas concentrações de leptina nos animais OVX + EB não
resultou em modulação do consumo alimentar destes animais. Tal fato demonstra
que a leptina não exerce papel fundamental na gênese e no estabelecimento do
sobrepeso em animais ovariectomizados. Este hormônio não está relacionado à
causa, mas provavelmente é uma conseqüência da instalação do sobrepeso,
estando aumentado após a instalação do sobrepeso e/ou obesidade.
A leptina também tem sido relacionada ao ganho de peso em animais
ovariectomizados em muitos estudos. Meli e cols (2004) relataram em seu estudo
uma elevação significativa nos níveis de leptina sanguíneos nos animais OVX. Em
contrapartida, Tomaselli e cols (2001), relataram redução significativa nestes
níveis. Pelleymounter (1999) foi além, definindo que a leptina estaria aumentada
apenas após a instalação do sobrepeso, o que acontece alguns dias após a OVX.
Para este autor, antes da instalação do sobrepeso os níveis de leptina
permanecem inalterados nestes animais. Alguns autores consideram a existência
de uma resistência à ação deste hormônio o fator mais importante para o
79
estabelecimento do sobrepeso e/ou obesidade após a ovariectomia (Chen e cols,
2001).
Em relação ao hormônio corticosterona, dado interessante é o papel do
estrogênio na redução das concentrações sorológicas deste hormônio nos animais
OVX + EB. Neste trabalho tal efeito foi evidenciado apenas nos primeiros dias
após a ovariectomia. No décimo terceiro dia, os valores de corticosterona já se
encontravam dentro da faixa de normalidade para este grupo. Se observarmos o
acréscimo nas concentrações deste hormônio no grupo SHAM e OVX logo no
sexto dia de ovariectomia, é possível inferir o efeito do estresse cirúrgico nestes
grupos e o efeito protetor ao estresse mediado pelo estrogênio. A redução nas
concentrações de corticosterona nos animais OVX + EB coincide com a elevação
nos níveis das citocinas IL-1β no décimo terceiro dia, e de IL-6 no terceiro dia
nestes animais. De fato, o estresse agudo via produção aumentada de
corticosterona, está relacionado à inibição na síntese de citocinas inflamatórias, o
que talvez possa explicar o efeito anorexígeno do estresse agudo (Stewart, 2005).
Este fato talvez possa explicar o retardo no ganho de peso nos animais OVX + EB
em comparação aos animais OVX.
Nossos resultados indicam a presença de uma interação imunoendócrina
importante nos animais ovariectomizados. Foram observadas alterações
significativas nas concentrações de algumas citocinas plasmáticas após os
primeiros dias de ovariectomia. No presente trabalho, as citocinas IL-1β e IL-10
apresentaram alterações significativas em seus níveis sanguíneos nos animais
ovariectomizados (OVX) e naqueles ovariectomizados com reposição de
estrogênio (OVX + EB), apresentando-se ambas elevadas nestes dois grupos.
A IL-1 permaneceu elevada desde o início (3° dia) até o final do
experimento (13° dia) nos grupos que sofreram ovariectomia. A diferença entre os
animais ovariectomizados (OVX e OVX + EB) foi significativa em relação aos
grupos controle (I e SHAM) em todos os momentos. De acordo com Hauner
(2004), a obesidade freqüentemente vem acompanhada de um recrutamento de
macrófagos para o tecido adiposo. Estes macrófagos estariam produzindo
citocinas inflamatórias naquele tecido, o que por sua vez, estaria exacerbando o
80
processo de ganho de peso corporal, contribuindo sobremaneira com os
processos lipogênicos. Diversas citocinas têm sido envolvidas neste processo,
entre elas IL-1, IL-6 e TNF-α. Estas citocinas são pró-inflamatórias e níveis
elevados em suas concentrações plasmáticas têm sido correlacionados à gênese
e ao estabelecimento da obesidade. Trabalhos recentes demonstraram uma
ligação entre a produção destas citocinas e a resistência à insulina (Bastard e
cols, 2006).
A elevação nas concentrações das citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-
α (Speyer e cols, 2005; Zeng e cols, 2005; Dinarello e cols, 1990) e a redução nas
concentrações da citocina IL-10 em animais ovariectomizados têm sido descrita na
literatura. Esta última está relacionada à prevenção da resistência à insulina em
camundongos tratados com IL-6 (Kim e cols, 2004). Contudo, todos os estudos
observaram variações nas concentrações destas citocinas algumas semanas após
a ovariectomia, quase sempre após a instalação do sobrepeso e/ou obesidade
nestes animais. Neste trabalho, procurou-se investigar possíveis modificações nas
concentrações de citocinas em ratas ovariectomizadas, logo após o procedimento
cirúrgico, antes do estabelecimento do sobrepeso.
Nosso estudo demonstrou elevação nas concentrações de IL-1β e IL-10
independentemente do estabelecimento do sobrepeso, já que estão elevadas nos
animais OVX e OVX + EB, animais que ganharam e perderam peso
respectivamente, durante o experimento. Tal fato pode sugerir o envolvimento
destas citocinas na modulação do peso corporal, não necessariamente apenas no
sobrepeso.
Observou-se ainda que o estrogênio tem um papel importante na
modulação da citocina IL-1β. Nos animais OVX + EB verificou-se valores elevados
desta citocina durante todo o experimento, e isso se tornou significativamente
diferente dos animais OVX no décimo terceiro dia. Neste dia, aquele grupo (OVX +
EB) apresentou valores elevados de IL-1β em relação a todos os grupos, inclusive
ao OVX. Este achado, talvez justifique a ineficiência da reposição hormonal em
doses consideradas fisiológicas, em manter o peso corporal reduzido até o 13°
81
dia. De fato, o estrogênio exógeno não é capaz de manter inalterados os valores
de alguns parâmetros que eram constantes antes do procedimento cirúrgico.
Comportamento semelhante foi observado para IL-10. Esta é uma citocina
antiinflamatória, responsável por combater os efeitos deletérios provocados pelas
citocinas inflamatórias (Hauner, 2004). Segundo Kim e cols (2003) esta citocina é
capaz de reverter e/ou inibir a resistência à insulina provocada por outras
citocinas, como IL-1, IL-6 e TNF-α. Por este motivo, esperava-se obter valores
reduzidos desta citocina nos animais OVX e OVX + EB; situações onde há
freqüentemente aumento nas concentrações das citocinas inflamatórias. No
entanto, obteve-se valores elevados desta citocina nos animais ovariectomizados.
Contudo, esta elevação não ocorreu logo nos primeiros dias de experimento,
tendo sido uma elevação tardia, podendo ser observada a partir do nono dia após
a ovariectomia. Neste momento os grupos OVX e OVX + EB diferiram
significativamente dos grupos C e SHAM. Tais resultados sugerem um mecanismo
de defesa orgânico em relação às alterações provocadas pela privação de
estrogênio endógeno. A produção elevada de IL-10 nos animais ovariectomizados
pode ser uma tentativa de promover o retorno dos parâmetros modificados pela
ovariectomia aos valores normais, anteriores ao procedimento; incluindo o peso
corporal. Contudo, a elevação nas concentrações de IL-10 não é eficaz para
manter o peso corporal estável, pois se observa elevação progressiva neste
parâmetro até o final do experimento nos animais OVX e OVX + EB.
Em relação a citocina IL-6 não foram verificadas diferenças importantes
entre os grupos OVX e OVX + EB, e os grupos I e SHAM, até o final do
experimento. De acordo com Hauner (2006), as concentrações de IL-6 circulantes
estão diretamente relacionadas ao peso corporal, estando elevadas na obesidade
e no sobrepeso. A ovariectomia em ratos eleva significativamente a expressão
gênica de IL-6 no tecido adiposo e sua concentração no plasma. A administração
de estrogênio reverte estes efeitos (Bruun e cols, 2003; Zeng e cols, 2005). Tal
efeito foi verificado neste trabalho apenas em um primeiro momento. No terceiro
dia após a ovariectomia o grupo OVX e SHAM apresentou valores elevados desta
citocina em relação aos demais. Contudo, o grupo OVX + EB apresentou valores
82
elevados para esta citocina no dia 6 após a ovariectomia, que retornou aos valores
normais no 13° dia. Neste caso, o estrogênio, em doses consideradas fisiológicas,
não foi eficaz em conter a elevação nas concentrações desta citocina no sexto dia
após ovariectomia. Desta forma, conclui-se que a citocina IL-6 não está
relacionada diretamente à gênese do ganho de peso corporal nos animais
ovariectomizados, mas pode estar envolvida mais tardiamente, na manutenção do
peso corporal mais elevado.
TNF-α foi uma citocina que também não apresentou diferenças
significativas entre os grupos no presente trabalho. Tal fato pode ser devido à
grande variabilidade entre os grupos analisados, o que dificulta a interpretação
estatística dos resultados. Contudo, pode ser observada uma discreta elevação
nos valores desta citocina nos grupos OVX e OVX + EB, grupos que sofreram a
retirada dos ovários, nos primeiros dias após a ovariectomia (terceiro dia).
Segundo Speyer e cols (2005), a privação de estrogênio é um estímulo à
produção de TNF-α, citocina relacionada ao ganho de peso corporal; e a
reposição hormonal é capaz de reverter este quadro. De fato, os animais que
receberam estrogênio (OVX + EB) obtiveram redução nas concentrações de TNF-
α inicialmente aumentadas logo a partir do sexto dia de ovariectomia. Entretanto,
no 13° dia estes valores estavam elevados novamente. Tal fato pode sugerir um
efeito do estrogênio na prevenção da elevação deste parâmetro apenas em curto
prazo, nos dias 6 e 9 após a ovariectomia.
As modificações no peso corporal associam-se diretamente à função
tireoideana. Vários trabalhos da literatura demonstram o papel termogênico dos
hormônios tireóideos na modulação do peso corporal nas mais diferentes
situações.
No presente trabalho, não foi observado modificações significativas nas
concentrações do hormônio T3 nos animais OVX e OVX + EB, apesar de ter sido
observada uma redução nas concentrações de T3 nos animais OVX + EB, não
significativa, no sexto dia após a ovariectomia. A ovariectomia freqüentemente é
seguida de uma redução nas concentrações de T3 e T4 livre em ratos (Thomas e
cols, 1986; Jeusete e cols, 2006).
83
No entanto, em relação ao hormônio T4, diferenças importantes foram
constatadas. Observou-se redução nos valores deste hormônio no grupo OVX +
EB durante todo o experimento, apesar desta diferença não ter sido significativa
em todos os momentos do experimento. Os animais OVX apresentaram valores
significativamente reduzidos deste hormônio em relação aos animais SHAM e C
logo no terceiro dia após a ovariectomia, e estes valores foram progressivamente
aumentando, até tornarem-se significativamente elevados em relação aos demais
no décimo terceiro dia após a ovariectomia, o que coincidiu com o acréscimo no
peso corporal total. Pode-se dizer que os animais OVX apresentaram redução nas
concentrações dos hormônios tireóideos logo após a ovariectomia (3° dia), o que
se reverteu com o decorrer do tempo. Tais resultados foram observados no estudo
de Jeusette e cols (2006). Em seu estudo, este autor observou redução nas
concentrações de T4 em animais castrados logo após a ovariectomia; valores que
se elevaram depois de um tempo da intervenção cirúrgica. Entretanto, o autor
somente observou aumento nas concentrações de T4, após seis meses da
ovariectomia, diferentemente dos dados encontrados neste estudo; os quais
apontam uma elevação nas concentrações de T4 após 13 dias de ovariectomia.
Este fato pode ser explicado pela diferença entre as espécies animais estudadas.
Jeusette e cols (2006) utilizaram cadelas castradas, enquanto neste trabalho
foram utilizadas ratas fêmeas ovariectomizadas.
Tais resultados sugerem um mecanismo de defesa tardio do organismo nos
animais OVX; como tentativa de conter o acréscimo de peso corporal observado
após o décimo terceiro dia de ovariectomia.
Entretanto, a elevação dos níveis de T4 no décimo terceiro dia após a
ovariectomia não foi acompanhada de uma redução no peso corporal pelos
animais ovariectomizados. O hormônio T3 é o mais ativo. T4 deve ser convertido
em T3 para exercer suas funções. A maior via para a produção de T3 é a via da
5’desiodação, do anel externo de T4, por iodotironina-desiodases (Yen, 2001).
Nossos resultados sugerem um mecanismo ineficiente na conversão de T4 a T3,
pelas desiodases presentes nos diferentes tecidos periféricos. Contudo, é
84
necessário se fazer um estudo cinético da atividade destas enzimas nos primeiros
dias após a ovariectomia para se confirmar tal hipótese.
De fato, outro trabalho do grupo, mostrou redução nas concentrações de T3
em animais ovariectomizados, após 21 dias de ovariectomia, acompanhada da
redução na atividade da enzima desiodase tipo I. A reposição com estrogênio nas
doses de 0,7µg/100g p.c. e 14µg/100g p.c é capaz de reverter à redução nas
concentrações de T3 e restaurar a atividade da enzima (Marassi e cols, 2006).
Entretanto, em trabalhos do grupo, não foram observadas elevações nas
concentrações de T4 nestes animais (Marrassi e cols, 2006; Lima e cols, 2006).
Em função dos achados até o momento, pode-se supor que há um acréscimo nas
concentrações de T4 inicialmente após a ovariectomia, o que se torna significativo
no 13° dia, como observamos neste estudo. Contudo, esta elevação se reverte ao
longo do tempo. Este acréscimo pode estar refletindo o papel da ausência de
estrogênio na modulação positiva da função tireóidea, logo após a ovariectomia.
Resumindo, neste estudo, o que se verificou foi uma elevação nos níveis de
T4 acompanhada de inalteração nos níveis de T3, que é o hormônio tireóideo mais
ativo, no final do experimento. Neste caso, ou a tireóide estaria produzindo
maiores quantidades de T4, ou este estaria sendo convertido na sua forma mais
ativa, T3 em menor proporção, o que causaria seu menor clearance e maior
concentração plasmática. Sem o aumento nas concentrações de T3 não há
elevação no gasto metabólico, fator que possivelmente interromperia o ganho de
peso corporal progressivo nestes animais.
Tais modificações observadas para T3 e T4 foram eficientes em modular os
valores de TSH em alguns momentos do experimento. Dado interessante é o
papel do estresse na modulação imediata do eixo hipófise-tireóide. Observou-se
elevação nos níveis do hormônio T3 nos animais estressados cirurgicamente no
terceiro dia após a ovariectomia (SHAM), com posterior redução nas
concentrações de TSH (no nono dia), evidenciando o “feedback” negativo dos
hormônios tireóideos na secreção do hormônio hipofisário TSH. O estrogênio
endógeno parece ser importante nesta modulação de T3, já que nos animais OVX
e OVX + EB, nos quais foram retirados os ovários e conseqüentemente, o
85
suprimento endógeno de estrogênio, não se observou este efeito do estresse na
modulação positiva de T3.
Há uma forte correlação entre estresse e modulação do eixo tireóideo via
modulação da atividade da desiodase do tipo II (DIO 2). Essa enzima é modulada
por estímulos estressores, como estimulação adrenérgica, via geração de AMPc
intracelular em tecido adiposo marrom. A ação desta enzima promove um maior
aporte de T3 (Mentuccia e cols, 2002). Contudo, tais alterações não resultaram na
modulação de peso corporal neste grupo, o que leva a crer que não são os
hormônios tireóideos os principais responsáveis pela gênese do ganho de peso
corporal em animais ovariectomizados.
Recentemente tem sido demonstrada uma interação entre hormônios
tireóideos, estrogênio e produção de citocinas inflamatórias por monócitos
circulantes. Animais hipertireoideos por administração de L-tiroxina, apresentam
elevação na produção das citocinas IL-1β, IL-6 e TNF-α. A ovariectomia nestes
animais não altera as concentrações elevadas destas citocinas. Em contrapartida,
animais ovariectomizados também demonstram elevação nas concentrações
plasmática destas citocinas, e a administração de L-tiroxina, tornando estes
animais hipertireoideos, mantém a produção elevada destas citocinas (Simsek e
cols, 2003). Segundo o autor, o hipertireoidismo é mais eficaz em elevar a
produção de citocinas inflamatórias, especialmente IL-1β, em relação a
ovariectomia. Tal achado sugere que em situações onde há elevação nas
concentrações de T4, ocorrerá maior liberação de citocinas inflamatórias. De fato,
no presente estudo, a elevação significativa nas concentrações de T4 ocorreu nos
animais OVX, os mesmos que apresentaram maior secreção de IL-1β e IL-10
durante todo o experimento. O mesmo não se observou para os animais OVX +
EB, onde a elevação na secreção destas citocinas não foi acompanhada de
elevação nas concentrações plasmáticas de T4. Este achado demonstra um papel
do estrogênio na regulação da secreção de T4, independente da liberação de
citocinas inflamatórias.
É interessante notar que a maioria dos parâmetros alterados nos animais
OVX e OVX + EB iniciam esta modificação a partir do nono dia de ovariectomia. É
86
a partir deste momento, que a gordura retroperitoneal demonstra comportamento
oposto entre eles; o hormônio T4 começa a sofrer uma elevação no grupo OVX; o
hormônio TSH passa a ser significativamente diferente entre os grupos,
apresentando valores elevados neste momento para o grupo OVX + EB; e a
citocina IL-10 está elevada nos grupos OVX e OVX + EB. Provavelmente este é o
momento crucial para o desequilíbrio energético nos animais ovariectomizados.
Os resultados obtidos até o momento, sugerem uma possível relação entre
a produção de citocinas inflamatórias, especialmente IL-1β e IL-10, estrogênio e a
alteração no peso corporal nos animais ovariectomizados. O desequilíbrio
energético estabelecido, talvez esteja induzindo a elevação tardia nos níveis da
citocina antiinflamatória IL-10, como mecanismo de defesa do organismo. Contudo
o que se observa é que não há o estabelecimento da homeostase energética nos
animais OVX; nestes o ganho de peso prossegue atingindo o peso corporal
valores significativamente elevados até o final do experimento. Nos animais OVX +
EB o estrogênio parece manter o peso corporal similar aos grupos controle no 13°
dia após a ovariectomia, mesmo com as alterações observadas em seus níveis de
IL-1β e IL-10 sorológicos. Conclui-se que estas citocinas, na presença de
estrogênio, não são eficazes em promover ganho de peso.
87
CCCooonnncccllluuusssõõõeeesss
A ovariectomia resulta em ganho de peso corporal significativo a partir do
décimo terceiro dia após o procedimento cirúrgico, e, a reposição estrogênica na
dosagem de 0,7µg/100g p.c., previne este ganho de peso corporal durante os
primeiros dias após a ovariectomia. Este ganho de peso corporal nos animais OVX
não se deve ao acréscimo no consumo alimentar no período analisado.
A leptina e o TNF-α não parecem estar relacionados à gênese do ganho de
peso corporal nos animais OVX. Esses fatores provavelmente estão relacionados
à manutenção do sobrepeso e/ou obesidade após estas condições já estarem
instaladas, ou são apenas conseqüência do acúmulo de gordura corporal.
Há elevação nas concentrações da citocina IL-1β nos animais logo a partir
do 3° dia após a ovariectomia, e, a administração de estrogênio não reverte esse
aumento.
Provavelmente, há tentativa do organismo em contrabalancear a produção
da citocina inflamatória IL-1β, pelo aumento progressivo da produção da citocina
antiinflamatória IL-10, o que ocorre mesmo nos animais repostos com estrogênio,
os quais não desenvolvem sobrepeso.
O estrogênio é capaz de reduzir as concentrações de corticosterona e
leptina plasmáticos, o que sugere uma via de regulação do peso corporal por este
hormônio.
88
Figura 14. Esquema proposto para as principais alterações ocorridas
imediatamente após a ovariectomia em ratas.
OVXOVX
↑ IL-6 ↑ IL-1β
↑ IL-10
↑ Peso corporalsem hiperfagia
OVX + EB
↓ Corticosterona↓ Leptina
?
↓ Peso corporal inicialmente
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