Neurogênese Hipocampal Regula o esquecimento durante a idade adulta e na Infância

Karine M. C. Dallagnol

Introdução Nas redes cerebrais há uma troca entre a plasticidade, a capacidade de incorporar novas informações, estabilidade e assegurar que o processo de incorporação de novas

informações não degrade a informação já armazenada nessa rede.

Hipocampo Giro Denteado

Zona Subgranular

Novos Neurônios

Aprendizagem

Como novos neurônios integram no hipocampo, eles competem com as células existentes para inputs e outputs, estabelecendo novas conexões sinápticas que podem coexistir com, ou mesmo substituir, conexões sinápticas já existentes;

Essa remodelação altera necessariamente a configuração de circuitos DG- CA3 e provavelmente vão levar ao esquecimento de informações já armazenadas nos circuitos;

Esse esquecimento induzido é mais pronunciado na infância, quando a neurogênese é alta, sendo diminuido drásticamente com a idade.

A maturação cerebral contínua pode interferir com a consolidação e/ou armazenamento de memórias infantis, tornando-os inacessíveis em momentos posteriores, sendo chamada de amnésia infantil.

Memória de longo prazo:

As regiões do hipocampo responsáveis pela consolidação da memória são chamadas de cornos de Amon – regiões CA, subdivididas em subregiões denominadas: CA1, CA2, CA3, CA4.

Regiões envolvidas com a consolidação da memória: hipocampo (CA1 e CA3 principalmente), córtex entorrinal, córtex perirrinal e giro para-hipocampal. Sendo que as lesões no córtex perirrinal como em CA1 e CA3, levam à déficits agudo de memória.

A ß-endorfina parece ser a substância ligada ao esquecimento.

Objetivo

Testar se a neurogênese pós-natal, em particular, modula as mudanças ontogenéticas na persistência da memória.

Materiais e MétodosAnimais: Camundongos machos e fêmeas, 21 dias de idade, do tipo selvagem (WT) hibridos F1; e geneticamente modificados: 1) Lacz repórter cruzado com Nestina-CRE ERT2 ou com Rosa-Lacz. Foi administrado Tamoxifeno (TAM) para expressar Lacz apenas em células Nestina+ e sua descendencia; 2) Camundongos TK: a modificação do gene HSV - 1 timidina -quinase ( TK ) é expresso sob o controle de um promotor de nestina. Nesses caundongos a administração de ganciclovir (GAN) causa terminação prematura da cadeia de DNA e apoptose de apenas células nestin +. 3) os camundongos iKO-p53 foram cruzados com a linhagem floxed-p53 e nestin - CreERT2. Nesses camundongos, a administração de TAM leva à exclusão de p53 apenas em células nestin+.

Dia de nascimento foi designado P0 .

Guinea pigs: Hartley Guineas Pig.Octodon Degus. Chinchila.

Nestina é uma proteína expressa principalmente em células gliais ou neurais indiferenciadas durante o desenvolvimento.

TratamentosRetrovírus . Os novos neurônios foram marcados com um vetor retroviral deficiente em replicação, no qual um promotor CAG impulsiona a expressão da proteína verde fluorescente (GFP ). Foi infundido o retrovirus no Giro Denteado (DG).

Roda de corrida voluntária (VWR): Um grupo com roda livre, um grupo de roda travada e um grupo sem roda (controle sedentário). BrdU . (5-bromo-2-deoxyuridine): Usado para identificar apoptose celular e marcador de proliferação celular.

Ganciclovir. Antiviral. GAN foi misturado no alimento em pó e dado aos camundongos ad libitum.

Tamoxifeno (TAM): Modulador Seletivo do Receptor de Estrógeno.

Memantina (MEM): Usada no tratamento de Alzheimer, impedindo que o excesso de glutamato atue sobre a molécula receptora de glutamato do neurônio adjacente, evitando a entrada excessiva de cálcio, que levaria à morte neuronal.

Fluoxetina (FLX) ou placebo: antidepressivo, inibidor selectivo da recaptação da serotonina.

Temozolomida (TMZ): Usado no tratamento de câncer, atua no DNA da célula cancerígena alterando ou evitando a duplicação celular, interferindo assim no crescimento do tumor.

P7C3: Usado no tratamento de Alzheimer, possui efeitos neuroprotetor e neurogênico.

Tratamentos

Teste ComportamentalCondicionamento do Medo Contextual: Trata-se de tomar um animal e colocá-o em um ambiente novo, proporcionando um estímulo aversivo (choque), e, em seguida, removê-lo. Quando o animal é devolvido para o mesmo ambiente, ele geralmente vai demonstrar uma resposta de congelamento ao se lembrar e associar do ambiente com o estímulo aversivo.

Congelamento: Foi medido utilizando um software .

Paradima de Aprendizagem Incidental Contextual: Os camundongos foram previamente habituados às câmaras por 10 min. E receberam um único choque.

Labirinto Aquático de Morris .

Teste Comportamental

Teste Labirinto de Barnes : Teste usado para mensurar aprendizado espacial e memória; usa-se de pistas visuais para encontrar uma “toca”. Condicionamento de aversão ao sabor . Os caundongos tiveram restrição gradual de água, até receber o minimo necessario para manter a 90% do peso corporal inicial; as garrafas de água foram substituídas por um único frasco contendo um solução de sacarina.

Procedimentos experimentais específicos

As diferenças de idade na neurogênese em camundongos: Foi infundido no DG retrovírus expressando GFP (green fluorescent protein) em P17 ou P60 .

As diferenças de idade na remodelação sináptica em camundongos. Foi desenvolvido um modelo computacional para estimar diferenças entre camundongos de P17 e P60 da quantidade de remodelação sináptica DG - CA3 que ocorre ao longo do tempo .

As diferenças de idade na persistência da memória em camundongos: Grupos separados de P17 ou P60 foram treinados em Medo Contextual Condicionado e testados 1, 7, 14 , ou 28 dias depois. Outros grupos de controle P17 ou P60 não receberam choques nos pés. Foi medindo a distância percorrida, imediatamente antes e durante os choques nos pés .

Efeito da TAM na aquisição de memória do medo contextual: Avaliou se o tratamento TAM tem efeitos agudos sobre o comportamento e neurogênese, treinando no Medo Condicionado Contextual e testado 24 horas após TAM.

Procedimentos experimentais específicos

Efeito da corrida sobre a neurogênese hipocampal adulta em camundongos adultos: Para avaliar se corrida voluntária aumenta a neurogênese.

Grupos separados de camundongos permaneceram sedentários ou tiveram acesso a uma roda de corrida para 0, 3, 7, 14, ou 28 dias a partir de P60 .

Controle da presença de um objeto novo na gaiola; Injetados com BrdU; Administração de retrovírus expressando GFP infundida no DG. Camundongos LacZ/Rosa foram injetados com a TAM.

Efeito da corrida sobre a memória de medo contextual e bloqueio do efeito da corrida pela supressão genética na neurogenese em camundongos adultos: Camundongos repórter LacZ foram injetados com a TAM e submetidos ao teste de Medo Contextual Condicionado,Camundongos TK+ e WT receberam GAN e foram treinados no Medo Condicionado Contextual.

Efeito do aumento farmacológico na neurogénese sobre a memória de medo contextual e bloqueio por supressão genética em camundongos adultos: Foram submetidos ao Condicionamento de Medo Contextual. Grupos separados receberam as doses de MEM ou veículo em frequências diferentes.Usou-se FLX ou placebo para o Teste Labirinto de Barnes

Efeito do aumento genético na neurogénese sobre a memoria contextual do medo em camundongos adultos: Camundongos iKO-p53 e WT testados por Medo Condicionado Contextual e tratados com TAM.

Efeito da corrida sobre outras memórias dependentes do hipocampo em camundongos adultos: Foram usados os teste de Aprendizagem Contextual Paradigma Incidental e Labirinto Aquático de Morris.

Efeito da corrida sobre a memoria independente do hipocampo em camundongos adultos: Foram treinados na aversão ao sabor condicionado.

Procedimentos experimentais específicos

Efeito de redução genética da neurogénese sobre a memória em camundongos infantis . Camundongos TK + e WT foram administrados com GAN e foram treinados no Medo Condicionado Contextual.

Efeito da redução farmacológica na neurogênese sobre a memória em camundongos infantis: Foram treinados no Paradigma de Aprendizagem Incidental Contextual; receberam veículo ou TMZ ou P7C3

A falta de diferenças de idade na neurogênese e persistência da memória em Guineas Pig e Degus: Sofreram o teste de Medo Condicionado Contextual e o Labirinto Aquatico de Morris.

Efeito da corrida e farmacológico no aumento da neurogenese sobre a persistência da memória em degus e porquinhos da índia infantis: Foram treinados no Medo Condicionado Contextual, depois permaneceram sedentários, correram, ou receberam veículo ou MEM.E foram treinados para localizar a plataforma escondida no labirinto de água, e receberam veículo ou MEM.

Procedimentos experimentais específicos

ResultadosNíveis dependentes da idade na neurogênese hipocampal e estabilidade da

memória são inversamente proporcionais em camundongos.

A) A marcação GFP de células granulares no DG e CA3 1 mês após a infecção retroviral mostra que camundongos infantis (P17) tiveram níveis mais altos de neurogênese do que adultos (P60).

B) Os infantis tinham mais células DCX+ no DG e CA3 do que adultos.

Fig. 1. Age-dependent levels of hippocampal neurogenesis and memory stability are inversely related in mice. (A) GFP labeling of granule cells in the DG and CA3 1 month after retroviral infection shows that infant (P17) mice had higher levels of neurogenesis than adult (P60) mice. (Left) Low magnification of DG and CA3 regions. Scale bar, 200 mm. (Right) High magnification of CA3 region showing GFP+ mossy fibers and LMTs. Scale bar, 50 mm. (B) Top row: Infants had more DCX+ cells in the DG and CA3 than adults. Scale bar, 100 mm. Bottom row: High magnification of DG and CA3. Scale bar, 50 mm. (C to F) Infants showed more (C) GFP+ neurons (t6 = 8.57, P < 0.001), (D) proliferating (Ki67+) cells (t7 = 4.53, P < 0.01), and (E) immature (DCX+) neurons in theDG (t6 = 18.65, P<0.001), as well as more (F) DCX+ LMTs in the CA3 (t6 = 15.03, P < 0.001) than adults (n = 4 to 5 per group). (G) Separate groups of infant and adult mice were trained in contextual fear conditioning and tested 1, 7, 14, or 28 days later (n = 8 to 9 per group). (H) Context fear memory persisted for at least 28 days in adult mice, whereas infants showed intact memory shortly after training but forgetting after longer delays (age × day, F3,62 = 13.07, P < 0.001; post-hoc t tests, 1 day, P < 0.05; 7 days, P < 0.001; 14 days, P < 0.001; 28 days, P < 0.001). (I) Infants and adults showed equivalent shock reactivity during training (P17 n = 9, P60 n = 8; arbitrary units, P > 0.05). (J) Inverse relationship between neurogenesis and memory persistence predicts that increasing neurogenesis in adults will induce forgetting, whereas decreasing neurogenesis in infants will mitigate forgetting. In all panels, cells/LMTs are expressed as number of cells/LMTs per 1000 mm2. *P < 0.05. For all figures, error bars represent standard error of the mean (SEM). DAPI, 4 ,6-diamidino-2-phenylindole.′

C) Infantis mostram mais neurônios GFP+ ; (D) proliferação de células Ki67+; E (E) neurônios imaturos DCX+ no DG; e F) mais LMTs DCX+ no CA3 que em adultos.

Ki-67 é uma proteína presente em todas as fases do ciclo de divisão celular

(H) Memória de medo Contextual persistiu por pelo menos 28 dias em camundongos adultos, os infantis mostraram memória intacta logo após o treino, mas esquecendo no decorrer dos dias.

(I) Infantis e adultos mostraram equivalente reação ao choque durante o treino.

(J) Relação inversa entre neurogênese e persistência da memória prediz que aumentar a neurogênese em adultos induz esquecimento, e diminuindo a neurogênese em crianças atenua o esquecimento.

Corrida voluntária aumena a neurogênese e promove o esquecimento em camundongos adultos

(A) Adultos (P60) que tiveram acesso à VRW por 28 dias apresentaram mais neurônios imaturos (DCX+) no DG e LMTs no CA3 que sedentários.

(B a D) Os adultos aumentaram a proliferação de células Ki67+ e neurônios imaturos (DCX+) no DG e mais LMTs no CA3 comparado com sedentários.

Fig. 2. Voluntary running increases neurogenesis and promotes forgetting in adult mice. (A) Adult (P60) mice given access to a running wheel for 28 days showed more immature (DCX+) neurons in the DG and LMTs in the CA3 than sedentary mice. Scale bar, 50 mm. (B to D) Adult mice were given access to a running wheel for 0, 3, 7, 14, or 28 days. Running increased the number of (B) proliferating (Ki67+) cells (n = 8 per group; running × day, F4,70 = 7.71, P < 0.001; post hoc t tests, 7 days, P < 0.001; 14 days, P < 0.001; 28 days, P = 0.001), and (C) immature (DCX+) neurons in the DG (n = 4 to 8 per group; running ×day, F4,34=3.17, P <0.05; 7 days, P < 0.05; 14 days, P<0.001; 28days, P < 0.05), as well as more (D) DCX+ LMTs in the CA3 (n = 4 per group; running×day, F4,30 = 3.45, P < 0.05; 7 days, P = 0.001; 14 days, P < 0.05; 28 days, P < 0.05) compared with sedentary controls.

(E) Neurogênese remodela circúito DG-CA3; (F) Adultos correram ou permaneceram sedentários após Condicionamento do medo contextual;

(G e H) Correr aumentou a neurogênese e induziu esquecimento;

(I) Adultos correram ou não, antes do medo condicionado;

(J e K) Correr aumentou a neurogênese mas não afetou a formação da memória de medo contextual.

(E) Neurogenesis remodels DG-CA3 circuits. Retrovirus-labeled presynaptic LMTs from new neurons (GFP+) in close apposition to existing presynaptic LMTs from mature neurons (ZnT3+). Scale bar, 50 mm. Confocal stacks used to reconstruct representative three-dimensional images of new LMTs (green) in close contact with existing LMTs (red) in the CA3. (F) Adult mice ran or remained sedentary after contextual fear conditioning. (G and H) Running increased neurogenesis (sedentary n = 8, running n=8; LacZ+ cells; t14=2.81, P < 0.05) and induced forgetting (sedentary n = 9, running n = 8; t15 = 2.75, P < 0.05). (I) Adult mice ran or remained sedentary before contextual fear conditioning. (J and K) Running increased neurogenesis (sedentary n = 7, running n = 8; t13 = 2.96, P < 0.05) but did not affect formation of a context fear memory (sedentary n = 10, running n = 9; P > 0.05). In all panels, cells/LMTs are expressed as number of cells/LMTs per 1000 mm2. *P < 0.05.

Esquecimento depende do aumentou da neurogênese

(A) Adultos tratados com GAN: WT e TK+ correram ou não, ou correram após o condicionamento de medo.

(B) Correr aumentou a neurogênese e (C) induziu o esquecimento da memória de medo contextual em WT.

(D) Adultos WT tratados com MEM após condicionamento de medo mostrou (E) aumento da neurogênese e (F) Esqueceram a memória de medo contextual comparado ao tratado com veículo.

(G) Adultos tratados com GAN: WT e TK+ foram tratados com veículo ou MEM após condicionamento de medo.

MEM (H) aumentou a neurogênese e (I) induziu esquecimento da memória de medo em WT ;

(J) Tratamento com tamoxifeno em pós-treino (K) Aumentou a neurogênese e (L) Induziu esquecimento da memória de medo em iKO-p53 em relação aos WT.

(A) Infantis tratados com GAN: WT ou TK+ foram treinados no medo condicionado ou sem choque.

(B) TK+ tiveram menos proliferação de células Ki67+ e (C) neurônios imaturos (DCX+)no DG que WT.

(D) WT e TK+ chocados, mostraram equivalente memória de medo 1 dia após o treino.

(E) WT chocados apresentaram esquecimento da memória de medo apó 7 dias do treino.

(F) Relação inversa entre proliferação e persistência da memória entre os camundongos chocados 7 dias após o treino.

Diminuição genética e farmacológica na neurogênese atenuando o esquecimento em camundongos infantis

(G) Infantis tratados com veículo ou TMZ , após treinados no Paradigma de aprendizagem incidental contextual.

(H) Tratados com TMZ tiveram baixa proliferação de células Ki67+ e (I) neurônios imaturos (DCX+) no DG.

( J) Os chocados tratados com TMZ mostraram menos esquecimento da memória contextual. (K) Relação inversa entre proliferação e persistência da memória entre os camundongos chocados.

(A) Células DCX+ no DG de Degus infantis e adultos.

(B) Células DCX+ no DG em Guineas Pig de infantis e adultos.

Guineas Pig e Degus mostram baixa neurogênese pós-natal e memórias infantis persistentes

Mostra reduzida queda relacionada à idade em (C) proliferação de células Ki67+ e (D) neurônios imaturos (DCX+) no DG.

(E) Degus infantis e adultos foram treinados no medo condicionado e testado no dia 1 ou 28.

(F) Ambos apresentaram persistência ma memória de medo.(G) Guineas Pig foram treinados no labirinto aquático e testados no dia 1 ou 28.

(H) Ambos mostraram persistência na memória espacial durante o teste.

Comparação entre camundongos, Degus e Guineas Pigs (P17 e P60)

Aumentar a neurogênese promove esquecimento em Degus e Guineas Pig infantis

(A) Degus infantis foram treinados no condicionamento de medo e permaneceram sedentários ou VRW por 28 .

(B) Correr aumentou a neurogênese e (C) induziu esquecimento da memória de medo

(D) Degus infantis foram treinados no condicionamento de medo e tratados com veículo ou MEM por 28 dias.

(E) Tratamento com MEM aumentou a neurogênese e (F) induziu esquecimento da memória de medo.

(G) Guineas Pig infantis foram tratados com veículo ou MEM e após treinados no teste de labirinto aquático.

(H) Tratamento com MEM aumentou a neurogênese e (I) induziu esquecimento da memória espacial.

Conclusão

• A observação de que a neurogênese persiste na idade adulta levou à idéia de que a neurogênese modula a função de memória do hipocampo, promovendo a degradação de memórias dependentes do hipocampo e reconfigurando circúitos DG-CA3;

• Como a neurogênese reconfigura circuitos do hipocampo, isso pode reduzir a capacidade de um dado conjunto de estímulos (ou entradas) para reinvocar o mesmo padrão de atividade;

• Durante a infância, quando os níveis de neurogênese são elevados, altos índices de memórias dependentes tornam-se inacessíveis posteriormente;

• Durante a idade adulta, quando os níveis de neurogênese são menores, as lembranças são mais resistentes à deterioração;

• O aumento artificial da neurogênese é suficiente para induzir o esquecimento.