New Universidade de São Paulo - USP · 2009. 3. 11. · simbióticas com a maioria das plantas vasculares. Normalmente, as hifas dos FMAs crescem no solo e colonizam o interior das

Universidade de Satildeo Paulo

Escola Superior de Agricultura ldquoLuiz de Queirozrdquo

Comunidades de fungos micorriacutezicos arbusculares no solo e raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar

Lucas Carvalho Basilio de Azevedo

Tese apresentada para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em

Agronomia Aacuterea de concentraccedilatildeo Solos e Nutriccedilatildeo de

Plantas

Piracicaba

2008


Engenheiro Agrocircnomo

Comunidades de fungos micorriacutezicos arbusculares no solo e raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

Orientador

Prof Dr MAacuteRCIO RODRIGUES LAMBAIS

Tese apresentada para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em


Plantas

Piracicaba

2008

Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo na Publicaccedilatildeo

DIVISAtildeO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTACcedilAtildeO - ESALQUSP

Azevedo Lucas Carvalho Basilio de Comunidades de fungos micorriacutezicos arbusculares no solo e raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

Lucas Carvalho Basilio de Azevedo - - Piracicaba 2008 110 p il

Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz 2008 Bibliografia

1 Cana-de accediluacutecar 2 Ecologia do solo 3 Micorriza 4 Raiacutezes 5 Sequenciamento geneacuteticoI Tiacutetulo

CDD 63361 A994c

ldquoPermitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash O autorrdquo

3

DEDICO

A Deus

Aos meus pais Marlene e Erasmo aos meus irmatildeo Mateus Ana Julia e Maria Luiza

Aos meus avoacutes tios e tias

Pelo apoio e incentivos recebidos sendo essenciais para essa etapa de minha vida

4

AGRADECIMENTOS

Eu gostaria de agradecer ao CNPq pela bolsa no iniacutecio do Curso agrave FAPESP pela bolsa

concedida no restante do curso e agrave CAPES pela concessatildeo da bolsa de estudo para estaacutegio no

exterior por 5 meses

Ao Prof Dr Maacutercio Rodrigues Lambais pela orientaccedilatildeo e incentivo ao longo do curso

Ao Dr Prof Ari Jumpponen (Kansas State University Manhattan KS USA) por ter me

acolhido e me recebido nos EUA pela amizade pela sua constante confianccedila em nosso trabalho e

pelo seu incentivo agrave vida profissional

Ao Dr Prof Sidney Luiz Stuumlrmer por ter realizado o aacuterduo trabalho de identificaccedilatildeo dos

esporos de FMAs parte essencial desse trabalho

Ao Dr Prof Francisco de Sousa por disposiccedilatildeo em ajudar com discussotildees e

esclarecimentos sobre os trabalhos pela internet

Agrave Prof Dra Elke JBN Cardoso pela concessatildeo do material do laboratoacuterio de

Microbiologia do Solo e material da Coleccedilatildeo de FMAs aleacutem do constante apoio disposiccedilatildeo para

atender aos alunos e pela confianccedila depositada em mim

Agrave parte essencial de minha vida portanto desse trabalho tambeacutem

Meu Pai Erasmo minha Matildee Marlene meus irmatildeos Mateus Ana Julia e Maria Luiza aos

meus avoacutes Florinda Naziozeno (in memorian) e Quiteacuteria aos meus tios Maria Elena Malu

Ismael (in memorian) Raquel Israel e Maria Aparecida que sempre me incentivaram

acreditando e investindo em mim

Agradeccedilo especialmente agrave Simone por sua confianccedila apoio paciecircncia e por sua

companhia e incentivo

Aos teacutecnicos dos laboratoacuterios de Microbiologia Luis Fernado Baldesin Wladimir

Rosignolo e especialmente agrave Denise de Lourdes C Mescolotti pela ajuda nos experimentos em

laboratoacuterio

Ao Dr Joseacute Pereira Silva Juacutenior pela amizade esclarecimentos e ajuda na elaboraccedilatildeo do

projeto

Aos colegas e amigos durante a jornada de doutorado Adriano Lucheta Alessandra de

Paula Alexandre Martines Andreacute Nakatani Carolina Baretta Christie Monteiro Daniel

Lammel Daniele Takahashi Denise Santos Dilmar Baretta Eduardo Armas Elaine Malosso

5

Flaacutevio Alves Flaacutevio de Paula Gisele Lopes Giselle Gomes Heacutelio Jackson Lange Juliano Cury

Karina Cenciani Luiz Fernando Romanholo Magnus Marcela Arnaldo Maacutercio Morais Pablo

Hardoim Rafael Armas Rafael Leal Rafaela Robinson Moresca Simatildeo Lindoso Sandra

Soraya Kiriachek Winston todos estagiaacuterios e demais amigos natildeo mencionados aqui

Aos amigos que encontrei e que me acolheram em Manhattan Adelaide Altair Ana

Anand Daniel Dave David Fellipe Flaacutevia German Greg Keerthi Lia Leila Lorena Maria

Michael Nicolas Renata Thais William

6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 DESENVOLVIMENTO 12

21 Revisatildeo bibliograacutefica 12

211 Micorrizas Arbusculares 12

212 Estudo de comunidades de fungos micorriacutezicos arbusculares 13

213 Taxonomia e identificaccedilatildeo molecular de fungos micorriacutezicos arbusculares 16

22 Material e meacutetodos 19

221 Comparaccedilatildeo dos meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA das raiacutezes 19

222 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de grupos especiacuteficos de FMAs 24

223 Estrutura da comunidade de FMAs em raiacutezes e solo rizosfeacuterico de cana-de-accediluacutecar sob

diferentes manejos de colheita 27

2231 Anaacutelises quiacutemicas do solo 28

2232 Extraccedilatildeo de esporos de FMAs do solo 29

2233 Colonizaccedilatildeo micorriacutezica intrarradicular 29

2234 Anaacutelise do gene rRNA 18S fuacutengico em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar 30

22341 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de fungos gerais e FMAs 30

22342 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de grupos especiacuteficos de FMAs em cana-de-accediluacutecar 31

22343 Purificaccedilatildeo dos amplicons 32

22344 Clonagem dos amplicons do gene rRNA 18S 33

22345 Extraccedilatildeo do DNA plasmidial 33

7

22346 Sequenciamento dos clones do gene rRNA 18S 34

22347 Anaacutelise de sequecircncias do gene rRNA 18S 35

23 Resultados e Discussatildeo 36


232 Desenho e validaccedilatildeo de iniciadores especiacuteficos para grupos de FMAs 41



2331 Atributos quiacutemicos do solo 56

2332 Produtividade da cana-de-accediluacutecar 59

2333 Fungos micorriacutezicos arbusculares no solo 60


2335 Anaacutelise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS7e F1Ra em raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar 73

2336 Anaacutelise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS31 e AM1 em raiacutezes de


2337 Anaacutelise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores especiacuteficos para grupos de

FMAs em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar 83

3 CONCLUSOtildeES 100

REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO


Os fungos micorriacutezicos arbusculares (FMAs filo Glomeromycota) formam associaccedilotildees

simbioacuteticas com a maioria das plantas vasculares Normalmente as hifas dos FMAs crescem no

solo e colonizam o interior das raiacutezes No entanto natildeo se sabe se as espeacutecies mais abundantes

detectadas no solo por meio da identificaccedilatildeo com base na morfologia dos esporos assexuais satildeo

tambeacutem as mais abundantes no interior das raiacutezes devido agraves dificuldades para a identificaccedilatildeo dos

FMAs com base nas estruturas intrarradiculares Assim o objetivo do presente trabalho foi

avaliar a estrutura da comunidade de FMAs em cana-de-accediluacutecar sob dois manejos de colheita por

meio da identificaccedilatildeo das espeacutecies que estatildeo no solo na forma de esporos assexuais e aquelas que

estatildeo nas raiacutezes usando o sequenciamento de clones do gene rRNA 18S Amostras de solo e

raiacutezes de cana-de-accediluacutecar de trecircs variedades e dois manejos de colheita SEM QUEIMA preacutevia e

COM QUEIMA preacutevia agrave colheita foram coletadas em um experimento localizado no municiacutepio

de Novo Horizonte SP Foram utilizadas trecircs abordagens para a identificaccedilatildeo dos FMAs no

interior das raiacutezes emprego de (1) iniciador especiacutefico para fungos em geral (2) iniciador

especiacutefico para FMAs e (3) iniciadores especiacuteficos para grupos de FMAs O nuacutemero de esporos

por 50 g de solo a riqueza de espeacutecies observada e estimada e a diversidade de esporos natildeo

diferiram significativamente entre os manejos SEM QUEIMA e COM QUEIMA Efeitos

significativos de variedades de cana-de-accediluacutecar ou na interaccedilatildeo dos fatores manejo e variedade

natildeo foram observados A anaacutelise de ordenaccedilatildeo com base nos esporos identificados tambeacutem natildeo

indicou separaccedilatildeo das amostras em funccedilatildeo dos tratamentos Entretanto plantas do tratamento sob

manejo SEM QUEIMA apresentaram as maiores taxas de colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular

quando comparadas agraves plantas do tratamento sob manejo COM QUEIMA Esses dados indicam

que a taxa de colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular eacute um indicador mais sensiacutevel agrave mudanccedila de

manejo de colheita da cana-de-accediluacutecar do que os outros indicadores avaliados Apoacutes a extraccedilatildeo de

DNA das raiacutezes o uso dos iniciadores especiacuteficos para fungos em geral para FMAs e iniciadores

especiacuteficos para grupo de FMAs natildeo resultou em sequecircncias de Glomeromycota Mesmo assim a

comunidade de fungos associados agraves raiacutezes detectada por sequenciamento do gene rRNA 18S foi

avaliada Os resultados indicam que a estrutra da comunidade fuacutengica associada agraves raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar diferiu significativamente entre os manejos de colheita SEM QUEIMA e COM

QUEIMA preacutevia apesar de natildeo haver diferenccedilas na riqueza e iacutendices de diversidade de unidades

taxonocircmicas operacionais observadas Em geral estudos adicionais devem ser feitos para

otimizar as condiccedilotildees para amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de FMAs para melhor entender a

ecologia dos mesmos

Palavras-chave Micorriza arbuscular rRNA18S Ecologia Fungos

9

ABSTRACT

Arbuscular mycorrhizal fungi communities in soil and sugarcane roots

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF Glomeromycota) form mutualistic symbioses with

most land plants AMF hypha generally grow through the soil and colonize the cortical tissue of

the plant roots However it is not known whether the most abundant species in the soil

determined based on the morphology of asexual spores are the most abundant inside the roots

due the difficulties in identifying AMF based on intraradical structures Therefore the aim of this

study was to evaluate the AMF community structure in sugarcane rhizosphere and roots under

two harvesting managements based on spores in the soil and sequencing of 18S rRNA gene

clones respectively Sugarcane rhizosphere soil and roots were sampled from three varieties

under two harvesting managements without pre-harvesting burning and with pre-harvesting

burning at an experimental field located in Novo Horizonte (Satildeo Paulo Brazil) Three

approaches were used to identify AMF inside the roots (1) using fungi-specific primers (2)

using AMF-specific primers and (3) using AMF group-specific primers The number of spores in

the soil the observed and estimated species richness and the diversity of AMF spores in the

treatments without and with pre-harvesting burning were not statistically different Statistically

significant effects of sugarcane varieties or the interaction of the factors Harvesting Management

and Varieties were not observed Ordination analysis based on the identified spores did not show

clustering by treatments However intraradical root colonization rates were higher in the

treatment without pre-harvesting burning as compared to the treatment with pre-harvesting

burning These data indicate that intraradical colonization rate may be used as a more sensitive

indicator of environmental changes due to harvesting management as compared to the other

indicators evaluated The use of fungi-specific AMF-specific and AMF group-specific primers

did not allow the detection of Glomeromycota in the sugarcane roots sampled from the field

experiment Nonetheless the fungal communities associated with sugarcane roots detected by

18S rRNA gene clone sequencing were evaluated The results indicate that the fungal

communities associated with sugarcane roots from the treatments without and with pre-harvesting

burning were statistically different even though no differences in operational taxonomic unit

richness and diversity indices were observed In general additional studies are necessary to

optimize AMF 18S rRNA gene amplification for a better understanding of their ecology

Keywords Arbuscular mycorrhiza 18S rRNA Ecology Fungi

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

Os fungos micorriacutezicos arbusculares (FMAs) formam associaccedilotildees simbioacuteticas com a

maioria das plantas vasculares terrestres (SMITH READ 1997) incluindo algumas de

importacircncia econocircmica para o homem (OrsquoCONNOR SMITH SMITH 2002) A associaccedilatildeo

micorriacutezica geralmente propicia melhor desenvolvimento vegetal devido ao aumento de absorccedilatildeo

de aacutegua e nutrientes principalmente foacutesforo (P) pelas hifas do FMA O fungo recebe em troca

fotoassimilados e fatores de crescimento necessaacuterios para completar o seu ciclo de vida (SMITH

BARKER 2002)

Entre as plantas que formam micorrizas arbusculares estaacute a cana-de-accediluacutecar uma cultura

de grande importacircncia econocircmica no Brasil (MAPA 2008) A expansatildeo das aacutereas cultivadas com

cana-de-accediluacutecar tem sido incentivada pelo interesse na produccedilatildeo de aacutelcool para uso como

combustiacutevel alternativo Previamente agrave colheita parte dessa aacuterea cultivada eacute queimada podendo

contribuir para o aumento de gases poluentes e responsaacuteveis pelo efeito estufa Assim a praacutetica

de colheita da cana-de-accediluacutecar sem queima vem ganhando interesse por causar menores impactos

ambientais No entanto os efeitos dessa alteraccedilatildeo do manejo da cultura de cana-de-accediluacutecar sobre a

microbiota dos solos satildeo poucos conhecidos

O uso da microbiota edaacutefica como indicador de impactos ambientais tem sido

extensivamente discutidos (NIELSEN WINDING 2002 LAMBAIS et al 2005 BUNEMANN

SCHWENKE GD VAN ZWIETEN 2006 FLIEszligBACH et al 2007 FRANCHINI et al

2007) Nesse contexto alteraccedilotildees na estrutura da comunidade de FMAs poderiam ser indicadores

de estresses ambientais No entanto para o eficiente uso dos FMAs como indicadores de

estresses ambientais eacute necessaacuterio identificar as espeacutecies presentes no ecossistema tanto em

associaccedilatildeo com o vegetal como no solo A identificaccedilatildeo dos FMAs eacute normalmente feita com base

na morfologia dos esporos pois as estruturas intrarradiculares de diferentes espeacutecies natildeo podem

ser diferenciadas morfologicamente O uso de teacutecnicas moleculares eacute uma alternativa para

superar essas dificuldades e viabilizar o estudo da ecologia dos FMAs Para a investigaccedilatildeo de

comunidades de FMAs iniciadores especiacuteficos para amplificar fragmentos do gene rRNA eou

espaccedilos intergecircnicos tecircm sido usados (HIJRI et al 2006 SANTOS-GONZAacuteLEZ FINLAY

TEHLER 2007 LEE LEE YOUNG 2008)

Entretanto a amplificaccedilatildeo de fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs por PCR (Reaccedilatildeo

em Cadeia da Polimerase) ainda eacute limitada pois os iniciadores existentes natildeo amplificam o DNA

11

de todos os organismos do filo Glomeromycota Essa ineficiecircncia pode ser resultado do baixo

nuacutemero de sequecircncias do gene rRNA 18S disponiacuteveis para o desenho de iniciadores especiacuteficos

Alternativamente se iniciadores mais geneacutericos fossem usados a aplicaccedilatildeo dos meacutetodos de

sequenciamento em larga escala do gene rRNA 18S (rDNA) de amostras ambientais poderia

contornar o problema de especificidade dos iniciadores

Assim os objetivos deste estudo satildeo (1) avaliar meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA e

desenvolver meacutetodos de amplificaccedilatildeo por PCR e sequenciamento de clones de fragmento do gene

rRNA 18S para a anaacutelise de comunidades de FMAs (2) investigar a diversidade e a estrutura das

comunidade de FMAs no solo rizosfeacuterico e raiacutezes de cana-de-accediluacutecar utilizando a teacutecnica

desenvolvida neste estudo em condiccedilotildees de campo e (3) determinar os efeitos da queima da

cana-de-accediluacutecar preacutevia agrave colheita na diversidade e estrutura das comunidades de FMAs

12

2 DESENVOLVIMENTO

21 Revisatildeo bibliograacutefica

211 Micorrizas Arbusculares

As micorrizas arbusculares (MAs) satildeo associaccedilotildees entre certos fungos do solo e uma

grande parte das plantas vasculares Esta associaccedilatildeo eacute encontrada em cerca de 70 de espeacutecies

vegetais e estaacute distribuiacuteda em vaacuterios ecossistemas terrestres (SMITH READ 1997) As MAs

tecircm importacircncia para a nutriccedilatildeo vegetal e ocorrem na maioria das espeacutecies cultivadas pelo

homem (BURROWS PFLEGER 2002 OrsquoCONNOR SMITH SMITH 2002)

Os FMAs pertencem ao filo Glomeromycota classe Glomeromycetes a qual possui 4

ordens 10 famiacutelias e 13 gecircneros com aproximadamente 180 espeacutecies descritas (SCHUumlSSLER

2008) Esses fungos colonizam o coacutertex das raiacutezes crescendo inter- e intracelularmente Em certo

momento da simbiose haacute uma intensa divisatildeo dicotocircmica do aacutepice da hifa no interior de ceacutelulas

corticais formando o arbuacutesculo estrutura possivelmente responsaacutevel pela troca de nutrientes

entre os simbiontes (BONFANTE-FASOLO 1984) Em estaacutedios mais tardios da colonizaccedilatildeo haacute

formaccedilatildeo de vesiacuteculas estruturas intrarradiculares com suposta funccedilatildeo de reserva de lipiacutedios e

formaccedilatildeo de esporos no solo ou no interior das raiacutezes

Os FMAs em associaccedilatildeo com o vegetal conectam o solo com as raiacutezes aumentando o

volume de solo explorado e ultrapassando a zona de depleccedilatildeo de alguns nutrientes Assim os

benefiacutecios nutricionais satildeo proporcionados pela maior absorccedilatildeo de elementos minerais

especialmente aqueles pouco moacuteveis no solo como P aleacutem de Zn e Cu (COLOZZI-FILHO

BALOTA 1994 SIQUEIRA 1996) Dessa forma em consequecircncia da melhoria do estado

nutricional da planta a associaccedilatildeo micorriacutezica pode trazer uma seacuterie de benefiacutecios para o

hospedeiro vegetal como a reduccedilatildeo dos estresses de origem bioacutetica e abioacutetica (QUILAMBO et

al 2005 COLLA et al 2008) e aumento da taxa fotossinteacutetica (SHENG et al 2008) Haacute

evidecircncias de que as MAs aumentam tambeacutem a absorccedilatildeo de aacutegua (ALMEIDA 1985 AL-

KARAKI MCMICHAEL ZAK 2004 AUGEacute et al 2004) conferindo agraves plantas maior

toleracircncia ao estresse hiacutedrico O miceacutelio crescendo no solo contribui para o aumento da

agregaccedilatildeo das partiacuteculas do solo por meio do enovelamento das hifas e produccedilatildeo de glomalina

(NOacuteBREGA et al 2001) A intensidade e a qualidade dos efeitos das MAs nas plantas e solo

13

dependem da interaccedilatildeo entre os genomas da planta do fungo e destes com o ambiente Poreacutem

em condiccedilotildees de baixa disponibilidade de nutrientes principalmente P a maior eficiecircncia

simbioacutetica promove uma maior conservaccedilatildeo de nutrientes no agroecossistema Sendo a simbiose

mutualista os FMAs tambeacutem se beneficiam recebendo fotoassimilados que necessitam para

completar seu ciclo de vida Dessa forma a base do mutualismo das MAs eacute a transferecircncia

bidirecional de nutrientes entre os simbiontes (SMITH BARKER 2002)

As MAs satildeo especialmente importantes nos ecossistemas de regiotildees tropicais uma vez

que nos solos dessas regiotildees boa parte do P estaacute fortemente associada a oacutexidos de ferro e

alumiacutenio acarretando uma baixa disponibilidade para as plantas O estudo da ecologia dos FMAs

nos solos apresenta no entanto uma seacuterie de limitaccedilotildees impostos principalmente pela

impossibilidade de se cultivar os FMAs in vitro

212 Estudo de comunidades de fungos micorriacutezicos arbusculares

Os estudos de comunidades de FMAs tem aumentado ao longo dos anos (KOYDE

MOSSE 2004) em face dos efeitos beneacuteficos das MAs para a nutriccedilatildeo das plantas e para a

conservaccedilatildeo de ecossistemas Segundo demonstrado por Heijden et al (1998) o aumento da

riqueza de espeacutecies de FMAs no solo aumenta a diversidade vegetal a entrada de nutrientes e a

produtividade do ecossistema Por outro lado existem indicativos de que a comunidade vegetal

tambeacutem pode influenciar as comunidades de FMAs (JOHNSON et al 2003) Por suas funccedilotildees

nos ecosistemas as comunidades de FMAs podem ser usadas para monitorar alteraccedilotildees na

qualidade do solo em funccedilatildeo de eventos de praacuteticas de manejo agriacutecola (NIELSEN WINDING

2002 LAMBAIS et al 2005 FLIEszligBACH et al 2007)

Alguns dos distuacuterbios impostos ao ambiente podem causar alteraccedilotildees nas comunidades de

FMAs que perduram durante anos dependendo de como ela eacute manejada Moreira et al (2007)

utilizaram atributos ecoloacutegicos com base nas comunidades de FMAs na forma de esporos no

solo para distinguir uma floresta nativa de uma aacuterea reflorestada com Araucaacuteria haacute 18 anos e

tendo pasto sob as aacutervores As duas aacutereas foram discriminadas com base em anaacutelise discrimante

canocircnica sendo que o iacutendice de Diversidade de Shannon de FMAs foi o atributo ecoloacutegico que

mais contribuiu para a distinccedilatildeo da aacuterea de floresta nativa e a aacuterea reflorestada Foram

identificadas 27 espeacutecies de FMAs nas duas aacutereas sendo que a aacuterea natural apresentou maior

14

diversidade e nuacutemero total de esporos do que a aacuterea reflorestada Os autores sugerem que a

ausecircncia de distuacuterbios e a maior diversidade de plantas tenha contribuiacutedo para a maior

diversidade e abundacircncia de FMAs

As praacuteticas agriacutecolas podem influenciar de forma significativa a composiccedilatildeo da

comunidade de FMAs na forma de esporos no solo Mathimaran et al (2007) avaliaram os efeitos

de cinco anos de rotaccedilatildeo de culturas sobre a comunidade de FMAs em um Ferralsol no Kenya

Haviam dois tratamentos de plantio rotaccedilatildeo de milho com crotalaacuteria e plantio contiacutenuo de

milho e dois tratamentos de adubaccedilatildeo com ou sem adubaccedilatildeo fosfatada Os autores acessaram a

comunidade por meio da extraccedilatildeo e identificaccedilatildeo de esporos e por sequenciamento da subunidade

maior do gene rRNA de esporos de cultura armadilha A diversidade de FMAs natildeo foi afetada

pelos manejos de plantio ou pela adubaccedilatildeo de P No entanto a abundacircncia relativa de espeacutecies foi

maior para o tratamento com rotaccedilatildeo de cultura

Em determinadas situaccedilotildees a mudanccedila do manejo da lavoura pode natildeo levar a mudanccedilas

na comunidade de FMAs O efeito do manejo de cultivo convencional e orgacircnico de pomares e

viveiros de citros sobre as comunidades de FMAs foi avaliado por Focchi et al (2004) Em 36

amostras de 6 pomares dois viveiros e uma aacuterea de mata nativa foram recuperadas 26 espeacutecies

de FMAs Os autores natildeo encontraram diferenccedilas nas comunidades de FMAs em funccedilatildeo do

manejo adotado embora praacuteticas conservacionistas como rotaccedilatildeo de culturas possam contribuir

para o aumento da diversidade e riqueza de FMAs no solo (DOUDS JANKE PETERS 1993

ROSALES VALDEacuteZ 1996)

Outro fator que pode causar alteraccedilotildees da estrutura da comunidade de FMAs eacute a queima

da biomassa vegetal Eom et al (1999) estudaram a comunidade fuacutengica em uma pradaria dos

EUA de 9 anos sob diferentes tratamentos regimes de queima corte da cobertura vegetal e

adubaccedilotildees nitrogenadas eou fosfatadas Os autores coletaram esporos para identificaccedilatildeo

morfoloacutegica e raiacutezes para determinaccedilatildeo da colonizaccedilatildeo micorriacutezica e verificaram que a queima

anual diminuiu a diversidade de FMAs mas natildeo a abundacircncia de esporos e a colonizaccedilatildeo

intrarradicular As interaccedilotildees dos tratamentos de queima roccedilagem da cobertura vegetal e

adubaccedilatildeo resultaram em mudanccedilas de diversidade e abundacircncia de FMAs mostrando que essas

praacuteticas influenciam os fatores do solo como teor de N e umidade os quais podem alterar a

comunidade de FMAs (EOM et al 1999)

15

Poucos trabalhos existem na literatura que tenham estudado a interaccedilatildeo de FMAs com

cana-de-accediluacutecar Paula et al (1991) estudaram a interaccedilatildeo de Gluconacetobacter diazotrophicus

com Glomus clarum em trecircs culturas incluindo a cana-de-accediluacutecar Os autores verificaram que a

inoculaccedilatildeo do FMA junto com uma mistura de bacteacuterias diazotroacuteficas resultou em maior

colonizaccedilatildeo micorriacutezica e maior populaccedilatildeo de G diazotrophicus na parte aeacuterea da cana-de-

accediluacutecar o que evidencia um sinergismo entre os dois microrganismos Gosal Gupta e Gosal

(2001) verificaram que a inoculaccedilatildeo com FMAs em cana-de-accediluacutecar micropropagada aumentou a

sobreviecircncia apoacutes transplante das plantas para o solo em relaccedilatildeo agraves placircntulas natildeo micorrizadas

Alguns trabalhos investigaram a influecircncia dos FMAs no desenvolvimento da cana-de-

accediluacutecar em condiccedilotildees de campo Foi observada que a resposta dessa cultura agrave MA aos 83 dias

apoacutes o plantio eacute baixa (KELLY et al 2001 2005) Por outro lado Reddy et al (2004)

verificaram aumento do crescimento da cana-de-accediluacutecar com inoculaccedilatildeo de alguns FMAs aos 40

e 80 dias apoacutes o plantio Em outro estudo foi observado que a produccedilatildeo de cana-de-accediluacutecar eacute

maior com a inoculaccedilatildeo de FMAs somente em tratamentos com adubaccedilatildeo inferior de nitrogecircnio

foacutesforo e potaacutessio comparada agrave cana-de-accediluacutecar sem inoculaccedilatildeo (QUILLOY LANSANG 1992)

Apesar desses trabalhos com cana-de-accediluacutecar nenhum deles avaliaram os efeitos dos

FMAs na produccedilatildeo final e na qualidade do produto como os teores de accediluacutecar Aleacutem do que na

maior parte dos estudos foi aplicada apenas uma variedade de cana-de-accediluacutecar Existe apenas um

artigo (REIS PAULA DOumlBEREINER 1999) e uma dissertaccedilatildeo de mestrado (ANDREOLA

1982) investigando a comunidade de FMAs em cana-de-accediluacutecar em condiccedilotildees de campo Reis

Paula e Doumlbereiner (1999) estudaram 14 variedades de cana-de-accediluacutecar em diversas lavouras no

estado do Rio de Janeiro e em Pernambuco Esses autores encontraram um total de 18 espeacutecies de

FMAs na forma de esporos e indicaccedilotildees de que a praacutetica da queima do canavial antes da colheita

pode reduzir a diversidade de FMAs Andreola (1982) analisou um ensaio de adubaccedilatildeo

nitrogenada e fosfatada e aplicaccedilatildeo de vinhaccedila em cana-de-accediluacutecar sobre um Latossolo no

municiacutepio de Araras SP ao longo de 13 meses O autor verificou maiores nuacutemeros de esporos e

taxa de colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular nos meses com maior precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica Jaacute a

aplicaccedilatildeo de vinhaccedila e a adubaccedilatildeo nitrogenada e fosfatada natildeo mudaram o nuacutemero de eporos no

solo e a taxa de colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular Assim os resultados de Andreola (1982)

mostram variaccedilatildeo de esporos e taxa de colonizaccedilatildeo micorriacutezica em funccedilatildeo da pluviosidade e

ausecircncia de resposta agrave aplicaccedilatildeo de vinhaccedila ou adubos fosfatados e nitrogenados

16

Portanto considerando os poucos trabalhos no assunto e a importacircncia da cultura para o

Brasil eacute tambeacutem importante o conhecimento sobre a comunidade de FMAs associada agrave cana-de-

accediluacutecar e os efeitos sofridos por essa comunidade em razatildeo de mudanccedilas de manejo ou alteraccedilotildees

do ambiente

213 Taxonomia e identificaccedilatildeo molecular de fungos micorriacutezicos arbusculares

A taxonomia dos FMAs eacute feita com base na morfologia e ontogenia de esporos assexuais

como tamanho cor forma nuacutemero de paredes caracteriacutesticas da hifa de sustentaccedilatildeo etc (Figura

1) Devido agrave semelhanccedila das estruturas fuacutengicas intrarradiculares natildeo eacute possiacutevel a identiicaccedilatildeo de

espeacutecies com base nas mesmas Assim existem vaacuterios limitantes para o estudo da ecologia dos

FMAs em condiccedilotildees de campo A morfologia e a produccedilatildeo dos esporos satildeo dependentes do

estaacutedio fisioloacutegico da planta hospedeira e das condiccedilotildees ambientais A magnitude da esporulaccedilatildeo

no solo pode natildeo refletir o grau de colonizaccedilatildeo das raiacutezes Assim uma espeacutecie de FMA pode

esporular abundantemente no solo mas colonizar uma pequena proporccedilatildeo do sistema radicular da

planta Em contraste uma espeacutecie que colonize uma grande proporccedilatildeo do sistema radicular pode

natildeo produzir um grande nuacutemero de esporos (REDECKER HIJRI WIEMKEN 2003) Essas

informaccedilotildees sugerem que as espeacutecies mais abundantes na forma de esporos no solo podem natildeo

representar as mais abundantes no interior das raiacutezes (CLAPP et al 1995 e ROSENDAHL

STUKENBROCK 2004) As dificuldades nos estudos de ecologia de FMAs tornam-se ainda

maiores devido ao fato dos mesmos serem biotroacuteficos obrigatoacuterios e natildeo serem passiacuteveis de

cultivo in vitro O uso de culturas armadilhas ou raiacutezes transformadas para a multiplicaccedilatildeo de

FMAs seria uma alternativa mas essa abordagem eacute trabalhosa e geralmente demanda longo

tempo aleacutem de existir a possibilidade de seleccedilatildeo de espeacutecies de FMAs pela planta hospedeira

usada (CARRENHO TRUFEM BONONI 2002)

Os esforccedilos para identificar espeacutecies conhecer a diversidade e a dinacircmica de comunidades

de FMAs satildeo cada vez maiores devido aos seus impactos na organizaccedilatildeo e produccedilatildeo de

ecossistemas incluindo agroecossistemas Para contornar tais problemas uma alternativa seria o

uso de teacutecnicas moleculares independentes de cultivo (REDECKER HIJRI WIEMKEN 2003

STUKENBROCK ROSENDAHL 2005 HEMPEL RENKER BUSCOT 2007) Por meio da

anaacutelise de certas regiotildees do DNA de FMAs eacute possiacutevel estabelecer relaccedilotildees filogeneacuteticas entre

17

diferentes filotipos encontrados em amostras de solo eou raiacutezes e definir a dinacircmica populacional

da aacuterea de estudo por exemplo Com o emprego da teacutecnica da PCR eacute possiacutevel produzir

relativamente grandes quantidades de DNA para anaacutelise a partir de amostras com concentraccedilotildees

iacutenfimas de DNA total Assim o uso da PCR revolucionou os estudos de filogenia e diversidade

geneacutetica de FMAs jaacute que os mesmos natildeo podem ser cultivados axenicamente Anaacutelises geneacuteticas

tecircm permitido a identificaccedilatildeo de FMAs em raiacutezes colonizadas bem como a definiccedilatildeo das

relaccedilotildees filogeneacuteticas de isolados de FMAs na forma de esporos (RENKER et al 2003

SHEPHERD et al 2007 CROLL et al 2008)

Figura 1 ndash Caracteriacutesticas morfoloacutegicas utilizadas para a identificaccedilatildeo taxonocircmica de FMAs A esporo de Glomus

etunicatum mostrando a hifa de sustentaccedilatildeo (ldquosubtending hyphardquo) e uma camada da parede do esporo

(ldquoL2rdquo) B esporos de Glomus clavisporum em esporocarpo mostrando a rede de hifas (ldquohyphal plexusrdquo)

C placa (ou escudo) de germinaccedilatildeo presente em esporo de Scutellospora scutata D detalhe de

ornamentaccedilatildeo da parede externa de um esporo de Acaulospora denticulata Fonte INVAM (2008)

Sequecircncias do gene rRNA 18S tecircm sido utilizadas para a identificaccedilatildeo taxonocircmica de

FMAs (HELGASON et al 1998 ROSENDAHL STUKENBROCK 2004) a qual

A Fonte INVAM 2008 B Fonte INVAM 2008

D Fonte INVAM 2008 C Fonte INVAM 2008

18

normalmente coincide com a taxonomia baseada em morfologia dos esporos (MORTON

REDECKER 2001 SCHWARZOTT WALKER SCUumlSSLER 2001 WALKER et al 2004)

Alternativamente os espaccediladores internos transcritos (ITS do inglecircs Internal Transcribed

Spacer) sequecircncias que separam os genes rRNA 18S 58S e 25S28S tambeacutem podem ser

utilizados para estudos filogeneacuteticos Poreacutem as sequecircncias dos ITS de FMAs satildeo altamente

variaacuteveis devido agrave grande variabilidade geneacutetica dos nuacutecleos dos esporos (SANDERS et al

1995 LLOYD-MACGILP et al 1996) o que pode inviabilizar a identificaccedilatildeo de espeacutecies com

base nessas sequecircncias

O uso de PCR para amplificar fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs ainda eacute limitado

O iniciador AM1 (HELGASON et al 1998) geralmente utilizado nos estudos de comunidades

de FMAs natildeo amplifica o DNA de todas as espeacutecies de FMAs e pode amplificar o DNA de

alguns fungos que natildeo pertencem ao filo Glomeromycota (REDECKER 2000 DOUHAN et al

2005 LEE LEE YOUNG 2008) Outro iniciador utilizado para estudos de ecologiafilogenia de

FMAs eacute o VANS1 Poreacutem esse iniciador eacute complementar a uma regiatildeo natildeo muito conservada do

gene rRNA 18S de Glomeromycota (SIMON LALONDE BRUNS 1992 SCHUumlSSLER et al

2001) e pode natildeo amplificar o DNA de todas as espeacutecies de Glomeromycota A eficiecircncia dos

iniciadores para PCR depende do nuacutemero de sequecircncias de diferentes espeacutecies usadas para definiacute-

los De acordo com as bases de dados integradas pelo Centro Nacional de Informaccedilatildeo para

Biotecnologia (NCBI httpwwwncbinlmnihgov) no ano de 2006 existiam cerca de 3800

sequecircncias do gene rRNA 18S de fungos Glomeromycota depositadas e aproximadamente

49000 sequecircncias de fungos de outros filos Jaacute em 2008 aproximadamente 6500 sequecircncias do

gene rRNA 18S de Glomeromycota e 86000 sequecircncias de fungos de outros filos estavam

disponiacuteveis

Uma vez que as informaccedilotildees sobre sequecircncias do gene rRNA 18S na base de dados do

NCBI tecircm aumentado constantemente com maior nuacutemero tanto de sequecircncias alvo como natildeo-

alvo o desenho de novos iniciadores especiacuteficos mais eficientes se torna possiacutevel No entanto

como o filo Glomeromycota eacute bastante diverso para os genes rRNA uma alternativa seria o

desenho de iniciadores para grupos especiacuteficos de FMAs com menor diversidade geneacutetica

19

22 Material e meacutetodos

221 Comparaccedilatildeo dos meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA das raiacutezes

Para o estudo de comunidades de FMAs colonizando as raiacutezes das plantas eacute necessaacuteria a

extraccedilatildeo do DNA total das raiacutezes colonizadas o qual eacute composto de DNA da planta e DNA de

fungos e outros microrganismos associados agraves raiacutezes Os meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA de plantas

utilizam diferentes processos para a lise de membranas para a liberaccedilatildeo e a purificaccedilatildeo desses

aacutecidos nucleacuteicos da amostra Considerando-se a complexidade do DNA total extraiacutedo de raiacutezes

coletadas no campo os diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA podem apresentar eficiecircncias

variaacuteveis Dessa forma foram testados cinco meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA de raiacutezes visando a

anaacutelise de FMAs a elas associadas Foi avaliada a concentraccedilatildeo pureza e a viabilidade de

amplificaccedilatildeo do DNA total obtido utilizando-se raiacutezes de Brachiaria sp inoculadas com

diferentes espeacutecies de FMAs

As plantas foram previamente inoculadas com diferentes espeacutecies de FMAs e cultivadas

em vasos contendo solo esterilizado em autoclave Os FMAs utilizados foram

- Acaulospora scrobiculata

- Glomus clarum

- Gigaspora rosea

- Paraglomus brasilianum

- Glomus etunicatum

- Gigaspora rosea e Scutellospora heterogama

Foram utilizados cinco meacutetodos para extraccedilatildeo de DNA das raiacutezes colonizadas por FMAs

(Quadro 1) sendo dois deles com kits comerciais e outros trecircs adaptados de procedimentos

documentados na literatura conforme descrito abaixo

Antes da extraccedilatildeo de DNA as raiacutezes foram lavadas quatro vezes com aacutegua destilada para

remoccedilatildeo de impurezas mais grosseiras homogeneizadas e maceradas em nitrogecircnio liacutequido com

o uso de almofariz e pilatildeo de porcelana Cada amostra foi dividida em 5 aliacutequotas de mesma

massa fresca (200 a 500 mg) e transferidas para tubos de polietileno Assim foi utilizada a

mesma quantidade de material vegetal de cada amostra de raiacutezes para cada um dos 5 meacutetodos de

extraccedilatildeo de DNA

20

Meacutetodos

1 Kit FastDNA Spin (Bio 101 Vista Califoacuternia)

2 Kit UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories Carlsbad CA USA)

3 Meacutetodo adaptado de Edwards et al (1997)

4 Meacutetodo adaptado de Doyle e Doyle (1990)

5 Meacutetodo adaptado de Redecker (2000)

Quadro 1 ndash Meacutetodos utilizados para extraccedilatildeo de DNA de raiacutezes de braquiaacuteria

colonizadas por FMAs

Meacutetodo 1 kit FastDNA Spin (Bio 101 Vista Califoacuternia) O DNA total da amostra de

raiacutezes foi extraiacutedo de acordo com as instruccedilotildees do fabricante No microtubo de lise foram

adicionadas as raiacutezes maceradas e 800 μL de soluccedilatildeo de lise para tecidos vegetais (CLS-VF) mais

100 μL da soluccedilatildeo PPS Cada microtubo de lise continha granada finamente moiacuteda e 2 esferas de

ceracircmica O microtubo foi agitado em um homogeneizador FP120Fast Prep Cell Disruptor (Bio

101 Vista Califoacuternia) por 20 segundos com velocidade de 4ms-1

As amostras foram

centrifugadas por 10 minutos a 13000 g 600 μL da fase superior foram transferidos para novos

microtubos de 15 mL Foram adicionados 600 μL da soluccedilatildeo com matriz de ligaccedilatildeo e

prosseguiu-se com inversatildeo dos tubos por 20 vezes e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente com leve

agitaccedilatildeo Em seguida as amostras foram centrifugadas a 13000 g por 1 minuto e o sobrenadante

foi descartado O peacutelete foi ressuspendido em 500 μL da soluccedilatildeo de lavagem SEWS A soluccedilatildeo

foi transferida para o filtro Spin Filter reg o qual foi acoplado a um microtubo Este conjunto foi

centrifugado por duas vezes a 13000 g por 1 minuto O filtrado foi descartado O filtro foi entatildeo

transferido para novo tubo e adicionaram-se 50 μL da soluccedilatildeo DES sobre a matriz de ligaccedilatildeo

contida no tubo A matriz foi ressuspendida cuidadosamente para hidrataccedilatildeo e solubilizaccedilatildeo do

DNA Essa mistura foi incubada por 5 minutos a temperatura ambiente e centrifugou-se a 13000

g por um minuto para recuperar o DNA eluiacutedo com DES O DNA obtido foi armazenado a -20

ordmC

Meacutetodo 2 Kit UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories Carlsbad CA

USA) O DNA foi extraiacutedo de acordo com o manual do fabricante com modificaccedilotildees conforme

descrito a seguir As raiacutezes maceradas foram transferidas para tubo contendo a soluccedilatildeo de lise

21

Bead A mistura foi agitada gentilmente e adicionaram-se 60 L da Soluccedilatildeo 1 Depois de inverter

o tubo por vaacuterias vezes este foi incubado a 70o C por 10 minutos Adicionaram-se 200 L de

Soluccedilatildeo IRS (Soluccedilatildeo de Remoccedilatildeo de Inibidor) e a soluccedilatildeo foi homogeneizada no

homogeneizador FP120Fast Prep Cell Disruptor (Bio 101 Vista Califoacuternia) por 20 segundos

com velocidade de 4 ms-1

O tubo foi centrifugado a 10000 g por 30 segundos e o sobrenadante

transferido para um novo tubo onde foram adicionados 250 L da Soluccedilatildeo 2 A soluccedilatildeo foi

homogeneizada em vortex por 5 segundos e o tubo incubado a 4o C por 5 minutos para depois ser

centrifugado a 10000 g por 1 minuto Todo o sobrenadante foi transferido para um novo tubo

onde se adicionaram 13 mL da Soluccedilatildeo 3 e a soluccedilatildeo foi homogeneizada em vortex por 5

segundos 700 L foram transferidos para o filtro do kit e o conjunto filtro-tubo foi centrifugado

agrave 10000 g por 1 minuto O filtrado foi descartado e adicionaram-se mais 700 L de soluccedilatildeo ao

mesmo filtro Em seguida o tubo foi centrifugado agrave 10000 g por 1 minuto O processo foi

repetido ateacute que todo o sobrenadante fosse filtrado Foram adicionados entatildeo 300 L da Soluccedilatildeo

4 sobre o filtro centrifugou-se a 10000 g por 30 segundos O filtrado foi descartado e

centrifugou-se novamente por 1 minuto Para recuperar o DNA o filtro foi transferido para um

novo tubo e adicionaram-se 50 l da Soluccedilatildeo 5 no centro do filtro O conjunto filtro-tubo foi

centrifugado a 10000 g por 30 segundos e depois o filtro foi descartado A soluccedilatildeo de DNA

obtida foi armazenada a ndash20o C

Meacutetodo 3 Meacutetodo adaptado de Edwards (1997) Agraves raiacutezes maceradas foram

adicionados 800 μL de soluccedilatildeo tampatildeo de Etil Xantana de Potaacutessio (625 mM de Etil Xantana de

Potaacutessio - PEX 100 mM de tris-HCl pH 75 700 mM NaCl 10 mM EDTA pH 80) As

suspensotildees foram homogeneizadas em vortex e incubadas a 65 ordmC por uma hora Depois da

incubaccedilatildeo foram adicionados 500 μL de fenolclorofoacutermioaacutelcool isoamiacutelico (25241 vvv) e a

mistura foi emulsificada em vortex Os microtubos foram centrifugados a 12000 g por 5 minutos

Uma aliacutequota de 650 μL do sobrenadante foi coleta e transferida para um novo tubo A essa

soluccedilatildeo foram adicionados mais 650 μL de fenolclorofoacutermioaacutelcool isoamiacutelico A mistura foi

emulsificada e centrifugada a 12000 g por 2 minutos A fase aquosa sobrenadante foi transferida

para novo tubo e misturada com 650 μL de clorofoacutermioaacutelcool isoamiacutelico (241 vv) As misturas

foram homogeneizadas novamente em vortex e centrifugadas a 12000 g por 5 minutos Um

volume de 500 μL do sobrenadante foi transferido para novo tubo onde foi adicionado 110 do

volume de acetato de soacutedio 3M (pH 52) e igual volume (500 μL) de isopropanol para

22

precipitaccedilatildeo do DNA A precipitaccedilatildeo do DNA foi feita por uma hora a 4 oC Em seguida os

tubos foram centrifugados por 15 minutos a 12000 g e a 4 ordmC O sobrenadante foi descartado e

adicionaram-se 500 μL de etanol 70 ao peacutelete formado Os microtubos foram centrifugados a

12000 g por 5 minutos O DNA precipitado foi seco em cacircmara de fluxo ressuspendido em 100

μL de TE (10 mM Tris HCl 1 mM de EDTA pH 80) e armazenado a -20 ordmC

Meacutetodo 4 Meacutetodo adaptado de Doyle Doyle (1990) Em cada microtubo de 15 mL

contendo as raiacutezes maceradas foram adicionados 650 μL da soluccedilatildeo tampatildeo de extraccedilatildeo (2 de

brometo de cetiltrimetilamocircnio (CTAB) 14 M de NaCl 100 mM deTris-HCl pH 80 20 mM de

EDTA pH 80 1 de polivinilpirrolidona PVP) Os microtubos foram agitados em vortex e

incubados em banho-maria a 55ordm C por 50 minutos Foram adicionados 650 μL de

clorofoacutermioaacutelcool isoamiacutelico (241 vv) e agitou-se em voacutertex ateacute formar uma emulsatildeo

Centrifugaram-se as amostras por 5 minutos a 12000 g para separaccedilatildeo do sobrenadante A fase

aquosa de cada amostra foi transferida para um novo microtubo onde se adicionou o mesmo

volume de isopropanol para precipitaccedilatildeo de DNA Em seguida os tubos foram centrifugados por

5 minutos a 12000 g Os peacuteletes formados foram lavados duas vezes com etanol 70 com

centrifugaccedilatildeo a 12000 g por 2 minutos para remoccedilatildeo de sais O DNA precipitado foi seco em

cacircmara de fluxo ressolubilizado em 50 μL de TE (10 mM Tris HCl 1 mM de EDTA pH 80) e

armazenado a -20 ordmC

Meacutetodo 5 Meacutetodo adaptado de Redecker (2000) A cada aliacutequota de raiacutezes maceradas

foram adicionados 300 μL de NaOH 025M Os microtubos foram incubados a 90 ordmC por 10

minutos Em seguida adicionaram-se 150 μL de Tris-HCl 05 M e 300 μL de HCl 025 M e

procedeu-se a incubaccedilatildeo por 10 minutos a 90 ordmC As amostras foram centrifugadas a 12000 g por

5 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo microtubo O DNA foi precipitado

adicionando-se o mesmo volume de isopropanol Em seguida os tubos foram centrifugados por 5

minutos a 12000 g Os peacuteletes de DNA foram lavados por duas vezes com etanol 70 seguido

de centrifugaccedilatildeo a 12000 g por 2 minutos para remoccedilatildeo de sais O DNA precipitado foi seco em

cacircmara de fluxo ressolubilizado em 50 μL de aacutegua ultrapura e armazenado a -20 ordmC

O DNA extraiacutedo por diferentes meacutetodos foi quantificado em gel por meio de comparaccedilatildeo

com marcador de massa Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) apoacutes eletroforese A imagem do gel

de agarose (1) foi analisada com o programa FragmeNT Analysis Application version 11

(Molecular Dynamics GE Healthcare) O DNA tambeacutem foi quantificado por espectrofotometria

23

agrave 260 nm (SAMBROOK FRITSCH MANIATS 1989) O caacutelculo da concentraccedilatildeo de DNA na

amostra foi feito de acordo com a equaccedilatildeo

[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde

D = fator de diluiccedilatildeo da amostra

A260 = absorbacircncia a 260 nm


A pureza do DNA foi determinada pela relaccedilatildeo das absorbacircncias a 260 e 280 nm

(SAMBROOK FRITSCH MANIATS 1989)

As amostras de DNA de raiacutezes de braquiaacuteria foram adicionalmente submetidas agrave PCR

com o objetivo de determinar se o DNA era amplificaacutevel Para isso foram utilizados os pares de

iniciadores NS1 e NS8 complementares ao gene rRNA 18S (WHITE et al 1990) e os

iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1 complementares agrave regiatildeo ITS (RENKER et al 2003) A

amplificaccedilatildeo do DNA foi feita em soluccedilatildeo contendo 04 M de cada iniciador 200 M de cada

um dos nucleotiacutedeos (dNTPs) 15 mM de MgCl2 (para o par de iniciadores NS1 e NS8) ou 20

mM de MgCl2 (para o par de iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1) 15 U de DNA polimerase

Taq e 1x o tampatildeo de reaccedilatildeo totalizando um volume de 30 l Os fragmentos de rDNA 18S

(iniciadores NS1 e NS8) foram amplificados apoacutes a desnaturaccedilatildeo inicial a 94 ordmC por 2 minutos

em 30 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 ordmC por 30 segundos pareamento do iniciador a 53ordmC por 1

minuto extenccedilatildeo a 72 ordmC por 2 minutos seguidos de um periacuteodo final de extensatildeo de 10 minutos

a 72ordm C A regiatildeo ITS (iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1) foi amplificada apoacutes desnaturaccedilatildeo

inicial a 94 ordmC por 10 minutos em 40 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 ordmC por 40 segundos 54 ordmC por

30 segundos 72 ordmC por 40 segundos seguidos de extensatildeo a 72 ordmC por 10 minutos Para todos os

ensaios empregou-se uma reaccedilatildeo controle negativo sem DNA Os amplicons obtidos foram

analisados por eletroforese em gel de agarose 1 (mv) e visualizados apoacutes coloraccedilatildeo com SYBR

Green

O experimento para comparaccedilatildeo dos meacutetodos de extraccedilatildeo de DNA teve um delineamento

inteiramente aleatorizado Para cada meacutetodo as repeticcedilotildees constituiacuteram-se das 6 amostras de

raiacutezes com diferentes espeacutecies de FMAs inoculadas Os dados de concentraccedilatildeo de DNA e da

24

relaccedilatildeo da absorbacircncia a 260 e 280 nm foram analisados por ANOVA e as meacutedias comparadas

pelo teste de Tukey Os dados foram transformados para x05

para normalizaccedilatildeo

222 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de grupos especiacuteficos de FMAs

Esta etapa do trabalho foi desenvolvida no laboratoacuterio do Professor Ari Jumpponnen

(Division of Biology Kansas State University USA)

Com o objetivo de se desenhar iniciadores para amplificar DNA de FMAs sequecircncias do

gene rRNA 18S foram obtidas da base de dados do NCBI Nessa etapa natildeo foram utilizadas

sequecircncias de origem ambiental pois o desenho dos iniciadores deveria se basear em organismos

identificados Para que os iniciadores fossem discriminatoacuterios contra outros grupos de fungos

tambeacutem se utilizou sequecircncias do gene rRNA 18S de fungos dos filos Basidiomycota

Ascomycota Zygomycota e Chytriodiomycota Essas sequecircncias foram utilizadas como natildeo-alvo

na validaccedilatildeo dos iniciadores A entrada para a busca no NCBI foi ldquo(Glomeromycota AND 18S)

NOT (environmental OR uncultured)rdquo para as sequecircncias de FMAs e ldquo(Grupo de Fungo AND

18S AND AFTOL) NOT (internal)rdquo para cada um dos 4 grupos citados acima como

ldquo(Basidiomycota AND 18S AND AFTOL) NOT (internal)rdquo para Basidiomycota O termo

ldquointernalrdquo foi utilizado para se excluir sequecircncias da regiatildeo ITS no banco de dados Foram

coletadas 100 sequecircncias do gene rRNA 18S de FMAs e 59 sequecircncias de fungos natildeo-

micorriacutezicos arbusculares

Todas as sequecircncias foram importadas para o programa Sequencher 46 para o

alinhamento e formaccedilatildeo de contigs A formaccedilatildeo desses contigs permitiu a separaccedilatildeo em grupos

baseados nas diferenccedilas das sequecircncias dos organismos portanto baseado na filogenia

Inicialmente os paracircmetros de alinhamento foram ajustados da seguinte forma o algoritmo de

agrupamento (Assembly Algorithm) utilizou os dados impuros (Dirty Data) para haver mais rigor

na formaccedilatildeo de agrupamentos e para evitar a inserccedilatildeo de grandes ldquogapsrdquo Foi utilizado o

ReAligner (ANSON MYERS 1997) para otimizar ldquogapsrdquo como pequenos insertos A

percentagem miacutenima de coincidecircncia das sequecircncias (Minimum Match Percentage) foi 100

enquanto a cobertura miacutenima (Minimum Overlap) foi 100 A percentagem miacutenima de

similaridade das sequecircncias foi iniciada com o maior valor para se detectar e se eliminar as

sequecircncias idecircnticas visando a formaccedilatildeo de um banco de dados com sequecircncias uacutenicas apenas

25

Depois do primeiro alinhamento com 100 de similaridade seacuteries de alinhamentos foram feitos

com o paracircmetro de percentagem miacutenima de similaridade diminuindo um ponto percentual a cada

alinhamento O valor da cobertura miacutenima permaneceu a 100 para excluir a possibilidade de

alinhamento de regiotildees incorretas Assim os contigs para os grupos de sequecircncias de

Glomeromycota Acaulosporaceae Gigasporaceae Glomus grupo A e Glomus grupo B foram

usados para o desenho dos iniciadores que amplificassem o seu DNA alvo

Para a obtenccedilatildeo das sequecircncias consenso de cada grupo fez-se o alinhamento no

programa Multalin (CORPET 1988) No desenho dos iniciadores empregaram-se as sequecircncias

consenso dos grupos de FMAs nos programas Beacon Designer 702 (Premier Biosoft

International Palo Alto CA EUA) e Primer3 v040 (ROZEN SKALETSKY 2000) aleacutem da

busca manual dos iniciadores Na busca manual procuraram-se as regiotildees consenso para os

grupos de FMAs e que fossem dissimilares agraves sequecircncias natildeo-alvo

Apoacutes se encontrarem os possiacuteveis iniciadores especiacuteficos eles foram validados quanto agrave

especificidade utilizando o BLAST Nessa etapa a especificidade foi considerada quando a

similaridade e a cobertura para sequecircncias alvo foram de 100 e quando esses valores foram

menores para sequecircncias natildeo-alvo Assim a anaacutelise de similaridade foi feita utilizando-se as

seguintes entradas para busca no BLAST Glomeromycota o grupo de espeacutecies de cada iniciador

e Eucariotos sem Glomeromycota Os iniciadores ainda foram alinhados com as sequecircncias alvo

e natildeo-alvo para confirmar a especificidade a similaridade e a posiccedilatildeo de alinhamento no

programa Multialin Depois avaliou-se a temperatura de desnaturaccedilatildeo (melting temperature) o

tamanho do oligonucleotiacutedeo a formaccedilatildeo de grampos e o autopareamento utilizando-se o

programa Oligo Analyzer (Copyright (C) 2000-2002 Teemu Kuulasmaa) Por fim procedeu-se os

ensaios de amplificaccedilatildeo de DNA alvo por meio de PCR utilizando-se os iniciadores grupo-

especiacuteficos como Forward e um iniciador modificado de Borneman e Hartin (2000) como

Reverse (Tabela 1) Apoacutes a verificaccedilatildeo em alinhamentos com sequecircncias de Glomeromycota o

iniciador nu-SSU-1196 (BORNEMAN HARTIN 2000) foi alterado com degeneraccedilatildeo de uma

base ldquoCrdquo por ldquoC ou Trdquo (Y) Essa degeneraccedilatildeo permitiu obter 100 de similaridade entre as

sequecircncias de FMAs testadas

26

Tabela 1 ndash Iniciadores grupo-especiacuteficos para FMAs

Iniciador Sequecircncia (5rsquo 3rsquo) Especificidade Referecircncia

ACAU220 GGG GTT TCC CAT TGG TGR ATC AT Acaulosporaceae Esse estudo

GLOMB652 TAA GGG GTA TGA ACT GGT GTA G Glomus Grupo B Esse estudo

GLOMB673 GTC AAT TTC TCA CCT TCT GGA G Glomus Grupo B Esse estudo

GIGA202 AAA CCA ATA RCC TTC GGG TTT C Gigasporaceae Esse estudo

GIGA615 TAG TTG AAT TTC GGG GTT CTA C Gigasporaceae Esse estudo

GLOMA189 TTA GAT AAA AAA CCA ATA TCG GG Glomus Grupo A Esse estudo

GLOMA690 CGT AAT GCC ATT AAT TTG GTG T Glomus Grupo A Esse estudo

nu-SSU-1196

modificado TCT GGA CCT GGT GAG TTT YC Fungi

Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

Para validaccedilatildeo dos iniciadores utilizaram-se amostras de DNA de FMAs provenientes de

vasos de multiplicaccedilatildeo obtidos de culturas do INVAM (West Virginia University) As espeacutecies

de FMAs utilizadas pertencem aos 4 grupos de FMAs Acaulospora lacunosa e A longula

(Acaulosporacea) Glomus claroideum (Glomus grupo B) Glomus caledonium (Glomus grupo

A) Scutellospora castanea e S calospora (Gigasporaceae) O DNA total foi extraiacutedo a partir do

substrato dos vasos de multiplicaccedilatildeo que continham esporos e raiacutezes colonizadas utilizando-se o

Ultra Clean Soil DNA Kit (MoBio Laboratories Carlsbad CA EUA)

Para otimizar as condiccedilotildees da amplificaccedilatildeo do DNA alvo para cada iniciador desenhado

foram testados os gradientes de concentraccedilatildeo de DNA temperatura de pareamento dos

iniciadores concentraccedilatildeo de MgCl2 concentraccedilatildeo de dNTPs concentraccedilatildeo de iniciadores

concentraccedilatildeo da enzima DNA Polimerase Taq aleacutem da presenccedila ou ausecircncia de BSA (Albumina

de Soro Bovino) As condiccedilotildees da PCR otimizadas foram 50 ng de DNA 15 mM de MgCl2

200 microM de cada dNTP 04 microM de cada iniciador 125 U da DNA polimerase Taq 1x tampatildeo

para a DNA polimerase sem o uso de BSA para um volume final de 25 microL O programa de

amplificaccedilatildeo foi 94 ordmC por 2 minutos para a desnaturaccedilatildeo inicial seguido por 30 ciclos de 94 ordmC

por 1 minuto 61 ordmC por 1minuto e 72 ordmC por 2 minutos e um passo de extensatildeo final a 72 ordmC por

8 minutos

Previamente aos ensaios com amostras ambientais a habilidade dos iniciadores em

amplificar o DNA alvo foi testada em amostras de DNA extraiacutedos de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar e

27

Brachiaria sp inoculadas com FMAs e cultivadas em casa-de-vegetaccedilatildeo Amostras de DNA de

raiacutezes de uma pradaria dos Estados Unidos tambeacutem foram utilizadas para verificar a eficiecircncia e a

especificidade dos iniciadores em amostras do campo Essas amostras foram coletadas de um

experimento em pradaria conduzido na Konza Prairie Biological Station (estaccedilatildeo de estudos

bioloacutegicos da Kansas State University em Manhattan KS - httpwwwkonzaksuedukonza)

com comunidade vegetal dominada por espeacutecies nativas como Andropogon gerardii Panicum

virgatum e Sorghastum nutans As amostras satildeo de dois tratamentos sem adubaccedilatildeo nitrogenada e

com aplicaccedilatildeo de 10 g de N por m2

(JUMPPONEN et al 2005) O DNA dessas amostras foi

extraiacutedo com o kit MoBio Ultra Clean Soil DNA Kit

Foi necessaacuterio utilizar a nested PCR para a amplificaccedilatildeo do DNA alvo nas amostras

provenientes da pradaria Na primeira PCR foram utilizados os iniciadores NS1 e NS8 (WHITE

1990) A amplificaccedilatildeo foi feita com desnaturaccedilatildeo inicial a 94 ordmC por 2 minutos 25 ciclos de 94

ordmC por 1 minuto 58 ordmC por 1 minuto e 30 segundos e 72 ordmC por 2 minutos e extensatildeo final a 72

ordmC por 8 minutos Na segunda PCR utilizaram-se os iniciadores grupos especiacuteficos desenhados

nesse trabalho com as mesmas condiccedilotildees descritas acima para o DNA de raiacutezes de vasos de

multiplicaccedilatildeo Os produtos de PCR das amostras ambientais amplificados com o uso dos

iniciadores grupo-especiacuteficos foram ligados em vetor TOPO (Invitrogen) e clonados em

Escherichia coli Para o sequenciamento do DNA alvo os insertos foram amplificados a partir

das colocircnias de E coli e foram selecionados a partir do padratildeo de bandas apoacutes a digestatildeo com as

endonucleases AluI e HinfI Os clones que apresentaram os mesmos padrotildees de bandas foram

considerados iguais Escolheram-se apenas 1 a 3 representantes para o sequenciamento

dependendo do nuacutemero de clones com o mesmo padratildeo As sequecircncias foram obtidas utilizando-

se sequenciador capilar de alta capacidade da High-Throughput Sequencing Solutions empresa

administrada pela Universidade de Washington EUA


diferentes manejos de colheita

As amostras de solos e raiacutezes de cana-de-accediluacutecar foram coletadas para a extraccedilatildeo de

esporos para a determinaccedilatildeo da colonizaccedilatildeo intrarradicular e para a identificaccedilatildeo de sequecircncias

do gene rRNA 18S de FMAs nas raiacutezes Para tanto utilizou-se uma aacuterea experimental do Centro

28

de Tecnologia Canavieira (CTC) localizada na Usina Satildeo Joseacute da Estiva (21ordm30rsquo45rdquoS e

49ordm13rsquo08rdquoW) no municiacutepio de Novo Horizonte SP O experimento foi instalado em 16042004

sobre um latossolo vermelho-amarelo com dois tratamentos de manejo de colheita SEM

QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia e trecircs variedades de cana-de-accediluacutecar (1) SP813250 (2)

SP801842 e (3) RB72454 As variedades foram plantadas com espaccedilamento de 15 m entre

linhas com seis repeticcedilotildees em blocos aleatorizados Anteriormente agrave implantaccedilatildeo do experimento

na aacuterea houve o cultivo de cana-de-accediluacutecar variedade SP711406 com 10 cortes e queima

previamente agrave cada colheita seguido de um cultivo de soja A amostragem foi feita aos 84 dias

apoacutes a primeira colheita da cana-de-accediluacutecar em 15122005 na profundidade de 0-10 cm sob as

trecircs variedades de cana-de-accediluacutecar A produtividade em toneladas de colmos por hectare (TCH)

tambeacutem foi calculada para as trecircs variedades

2231 Anaacutelises quiacutemicas do solo

As amostras de solo coletadas foram secas ao ar para a anaacutelise de pH H+Al Al Ca Mg

K P Carbono orgacircnico (CO) soma de bases (SB) capacidade de troca catiocircnica a pH 70 (CTC)

e saturaccedilatildeo da CTC por bases (Quadro 2)

Atributo Meacutetodo ou extrator Referecircncia

pH Medido em CaCl2 001M Raij et al 2001

H+Al pH em SMP Raij et al 2001

Al trocaacutevel KCl 1M e titulaccedilatildeo com NaOH 0025M Raij et al 2001

Ca Mg trocaacuteveis e P Resina trocadora de iacuteons Raij et al 2001

K trocaacutevel Melich 1 Silva 1999

Carbono orgacircnico (CO) Colorimetria Raij et al 2001

Soma de bases (SB) Somatoacuteria de Ca Mg K -

CTC (pH 70) Somatoacuteria de H+Al Ca Mg K -

Saturaccedilatildeopor bases da

CTC (V)

Saturaccedilatildeo = (Ca Mg K)100CTC -

Quadro 2 ndash Metodologias utilizadas para a anaacutelise quiacutemica do solo

A CTC a pH 70 foi calculada somando-se os teores de H + Al Ca Mg e K Depois

29

foram calculadas as porcentagens da saturaccedilatildeo da CTC por Ca Mg K e por Al (m) da seguinte

forma Saturaccedilatildeo do Elemento () = (teor do ElementoCTC)100

2232 Extraccedilatildeo de esporos de FMAs do solo

Os esporos dos FMAs foram extraiacutedos do solo por peneiramento uacutemido (GERDEMANN

NICOLSON 1963) e centrifugaccedilatildeo por duas vezes em soluccedilatildeo de sacarose 70 a 560 g por 2

minutos Os esporos foram identificados conforme descrito no International Culture Collection

of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhiza Fungi (INVAM 2007) Para a anaacutelise estatiacutestica o nuacutemero

de esporos foi transformado para (x + 05)05

O iacutendice de diversidade de Shannon o reciacuteproco do

iacutendice de Simpson as estimativas de riqueza de espeacutecies e a estimativa de cobertura de

amostragem foram realizadas com o uso do programa SPADE (CHAO SHEN 2003) O iacutendice

de equitabilidade de Pielou foi calculada de acordo com Magurran (1988)

Para determinar a influecircncia das variaacuteveis ambientais na variabilidade de ocorrecircncia das

espeacutecies de FMAs sob cana-de-accediluacutecar foi realizada uma anaacutelise de redundacircncia canocircnica (RDA)

utilizando-se o programa ldquoCanoco for windows 45rdquo com transformaccedilatildeo dos dados para log x e

avaliaccedilatildeo da anaacutelise por meio do teste de permutaccedilatildeo de Monte-Carlo Na RDA a ordenaccedilatildeo das

amostras eacute condicionada diretamente pelas variaacuteveis ambientais e assim permite medida direta

da relaccedilatildeo entre as variaacuteveis ambientais e as espeacutecies detectadas Para eliminar a colinearidade de

dados e selecionar as variaacuteveis que melhor explicaram de forma significativa a variabilidade dos

dados utilizou-se Forward selection na RDA Dados de presenccedila e ausecircncia de espeacutecies de

FMAs foram utilizados para os caacutelculos

2233 Colonizaccedilatildeo micorriacutezica intrarradicular

Para a avaliaccedilatildeo da colonizaccedilatildeo intrarradicular pelos FMAs as raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

foram lavadas e imersas em KOH 10 por uma noite Depois foram aquecidas a 60ordmC em KOH

10 por 10 minutos para clarificaccedilatildeo Apoacutes a clarificaccedilatildeo as estruturas fuacutengicas foram coradas

por 3 minutos a 90ordmC com tinta de caneta comercial Parkerreg 5 diluiacuteda em soluccedilatildeo de aacutecido

aceacutetico 5 e lactoglicerol 10 A colonizaccedilatildeo das raiacutezes foi analisada sob microscoacutepio

estereoscoacutepio pelo meacutetodo da placa reticulada segundo Giovannetti e Mosse (1980) Os dados

30

foram transformados para arcsen(x + 1)05

para as anaacutelises estatiacutesticas

2234 Anaacutelise do gene rRNA 18S fuacutengico em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

O DNA das amostras de raiacutezes do campo foi extraiacutedo com o objetivo de amplificar e

clonar fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs O DNA foi extraiacutedo com kit comercial Fast

DNA (Bio101 Vista) apoacutes a lavagem das raiacutezes com aacutegua desionizada e maceraccedilatildeo em

nitrogecircnio liacutequido A clonagem do gene rRNA 18S de FMAs foi realizada usando trecircs

abordagens A primeira abordagem foi com a utilizaccedilatildeo de iniciadores especiacuteficos para um

segmento do gene rRNA 18S conservado em fungos (NS7 e F1Ra) Assim apoacutes o

sequenciamento de clones poderiacuteamos detectar as populaccedilotildees de fungos em geral incluindo as

populaccedilotildees de FMAs A segunda abordagem teve como objetivo amplificar parte do gene rRNA

18S de fungos do filo Glomeromycota utilizando-se o iniciador AM1 descrito como especiacutefico

para FMAs (HELGASON et al 1998) A terceira abordagem foi desenhar iniciadores especiacuteficos

para amplificar fragmentos do gene rRNA 18S de grupos especiacuteficos de FMAs nas amostras de

raiacutezes de cana-de-accediluacutecar do campo Para o desenho dos iniciadores inicialmente procurou-se

obter sequecircncias de FMAs mantidos em vasos de multiplicaccedilatildeo As abordagens e meacutetodos

utilizados estatildeo descritos em detalhes abaixo

22341 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de fungos gerais e FMAs

O gene rRNA 18S fuacutengico foi amplificado por nested PCR com os iniciadores universais

para eucariotos NS1 e NS8 (WHITE et al 1990) na primeira reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo Os

produtos da primeira PCR foram diluiacutedos 50 vezes e utilizados em uma segunda reaccedilatildeo de

amplificaccedilatildeo com o par de iniciadores NS7 e F1Ra (SOUZA et al 2004) para amplificar DNA

de fungos em geral e os iniciadores NS31 e AM1 para amplificar DNA de Glomeromycota A

primeira reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo foi realizada com DNA total extraiacutedo das raiacutezes em soluccedilatildeo

contendo 04 M de cada um dos iniciadores (NS1 e NS8) 200 M de cada um dos nucleotiacutedeos

(dNTPs) 15 mM de MgCl2 1 U da enzima (DNA polimerase Taq) e 1x o tampatildeo de reaccedilatildeo

totalizando um volume de 30 l Apoacutes desnaturaccedilatildeo inicial a 94 ordmC por 2 minutos os fragmentos

de rDNA 18S foram amplificados em 30 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 ordmC por 30 segundos

31

pareamento do iniciador a 53ordmC por 1 minuto extenccedilatildeo a 72 ordmC por 2 minutos seguidos de um

periacuteodo final de extensatildeo de 10 minutos a 72ordm C

A segunda reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo foi realizada com o produto de amplificaccedilatildeo da

primeira reaccedilatildeo diluiacutedo em soluccedilatildeo contendo 04 M de cada um dos iniciadores (NS7 e F1Ra ou

NS31 e AM1) 200 M de cada um dos nucleotiacutedeos (dNTPs) 10 mM de MgCl2 2 U da enzima

(DNA polimerase Taq) e 1x o tampatildeo de reaccedilatildeo totalizando um volume de 20 l A

amplificaccedilatildeo com os iniciadores NS7 e F1Ra foi feita apoacutes desnaturaccedilatildeo inicial a 94 ordmC por 2

minutos em 30 ciclos de 94 ordmC por 1 minuto 62ordmC por 28 segundos 72 ordmC por 1 minuto

seguidos de 5 minutos a 72ordm C para extensatildeo final A amplificaccedilatildeo com os iniciadores NS31e

AM1 foi feita apoacutes desnaturaccedilatildeo inicial a 94ordm C por 2 minutos em 35 ciclos de 94ordm C por 30

segundos 60ordm C por 30 segundos 72ordm C por 45 segundos (aumentando 1segundo por ciclo) e

seguido de extensatildeo final a 72ordm C por 5 minutos Os amplicons corados com SYBR Green foram

visualizados em gel de agarose 1 apoacutes eletroforese

22342 Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S de grupos especiacuteficos de FMAs em cana-de-

accediluacutecar

Os iniciadores desenhados foram utilizados para avaliar a estrutura das comunidades de

FMAs em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar sob os manejos SEM QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia agrave

colheita O DNA total extraiacutedo das raiacutezes usando o meacutetodo 1 (kit Bio101) foi amplificado com os

iniciadores NS31 e AM1 para comparaccedilatildeo da eficiecircncia dos mesmos As condiccedilotildees para a

amplificaccedilatildeo utilizando os iniciadores aqui desenhados foram as mesmas descritas acima para as

raiacutezes da pradaria A ligaccedilatildeo dos amplicons transformaccedilatildeo de E coli clonagem e extraccedilatildeo de

DNA plasmidial foi feita conforme descrito acima para os inciadores NS7 e F1Ra e para NS31 e

AM1 Para as raiacutezes de cana-de-accediluacutecar 20 clones obtidos com cada iniciador e de cada um dos

tratamentos de colheita foram sequenciados O sequecircnciamento de ampliconsobtidos de raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar foi feito em sequenciador automaacutetico ABI 3100 utilizando-se o DYEnamic ET

Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Prism 3100 Applied Biossystems) As sequecircncias foram

analisadas para detecccedilatildeo de quimeras no programa Chimera Check utilizando o mesmo meacutetodo

descrito acima

32

Na anaacutelise de BLAST as sequecircncias obtidas de cada iniciador foram avaliadas

separadamente Tanto as sequecircncias obtidas do NCBI para o desenho de iniciadores como as

sequecircncias de cana-de-accediluacutecar do campo foram alinhadas por meio do ClustalW no programa

MEGA 40 (TAMURA et al 2007) e manualmente ajustadas para a anaacutelise filogeneacutetica As

sequecircncias ambientais obtidas com o emprego do iniciador ACAU220 foram alinhadas em 624

posiccedilotildees sendo 304 parsimocircnia-informativas As sequecircncias do iniciador GIGA202 foram

alinhadas em 586 posiccedilotildees sendo 313 parsimocircnia-informativas Alinharam-se as sequecircncias de

GLOMA690 em 298 posiccedilotildees com 115 parsimocircnia-informativas Por fim as sequecircncias do

iniciador GLOMB673 foram alinhadas em 498 posiccedilotildees sendo 239 parsimocircnia-informativas As

relaccedilotildees filogeneacuteticas entre as sequecircncias fuacutengicas foram inferidas por meio da anaacutelise de

neighbor joining (NJ) (SAITOU NEI 1987) no programa MEGA 40 Sequecircncias do gene rRNA

18S de milho (Zea mays) soja (Glycine max) e Homo sapiens foram utilizadas como outgroup

Na anaacutelise de NJ os ldquoGapsrdquo e ldquomissing datardquo sofreram deleccedilatildeo completa o modelo de

substituiccedilatildeo foi o de Jukes-Cantor com taxas uniformes entre sites A robustez da topologia

inferida foi testada com 1000 replicatas de ldquobootstraprdquo

As sequecircncias obtidas com todos os iniciadores em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar foram

alinhadas em 256 posiccedilotildees sendo 124 parsimocircnio-informativas Utilizou-se o programa DOTUR

para o agrupamento de sequecircncias em unidades taxonocircmicas operacionais (UTOs) para a anaacutelise

de diversidade e para a obtenccedilatildeo da curva de rarefaccedilatildeo de sequecircncias As sequecircncias com uma

similaridade gt 99 foram consideradas pertencentes agrave mesma UTO Foi feita comparaccedilatildeo entre

as bibliotecas de sequecircncias por meio do programa webLIBSHUFF (SINGLETON et al 2001)

utilizando-se as matrizes de distacircncias evolutivas calculadas

22343 Purificaccedilatildeo dos amplicons

Os amplicons foram purificados dos geacuteis de agarose com o kit GFX PCR DNA and Gel

Band Purification (GE Healthcare) conforme instruccedilotildees do fabricante

As bandas de DNA foram excisadas do gel de agarose e colocadas em microtubo de 15

mL adicionando-se 1 microL de uma soluccedilatildeo tampatildeo de captura (GE Healthcare) por mg de gel O

microtubo foi agitado vigorosamente em vortex e incubado a 60oC ateacute que a agarose estivesse

completamente dissolvida Apoacutes a dissoluccedilatildeo total da agarose a amostra foi centrifugada por 30

33

segundos a 12000 g e incubada agrave temperatura ambiente durante 10 minutos Uma aliacutequota de

aproximadamente 300 microL da amostra foi transferida para a coluna de purificaccedilatildeo incubada

durante 10 minutos a temperatura ambiente e centrifugada por 30 segundos a 12000 g Este

processo foi entatildeo repetido com o volume restante da amostra O liacutequido que passou pela coluna

durante a centrifugaccedilatildeo foi descartado e adicionou-se agrave coluna 500 microL de tampatildeo de lavagem

(GE Healthcare) seguido de uma incubaccedilatildeo durante 10 minutos a temperatura ambiente e

centrifugaccedilatildeo por 30 segundos a 12000 g A coluna foi entatildeo transferida para um microtubo de

15 mL Para eluiccedilatildeo do DNA adicionou-se 50 microL de TE (pH 80) diretamente na matriz da

coluna incubando-se por 10 minutos e em seguida centrifugou-se por 30 segundos a 8000 g O

DNA recuperado no microtubo foi novamente centrifugado por 90 segundos a 8000 g para

remover a resina remanescente A soluccedilatildeo de DNA foi entatildeo transferida para novo microtubo de

15 mL A qualidade do DNA foi determinada apoacutes eletroforese em gel de agarose 1 (TBE 05

X) e coloraccedilatildeo com SYBR-Green I (Moleculat Probes) O marcador de massa Low DNA Mass

Ladder (Invitrogen) foi utilizado como padratildeo de tamanho e quantidade de DNA

22344 Clonagem dos amplicons do gene rRNA 18S

Os amplicons de parte do gene rRNA 18S foram clonados no vetor pGEM-T Easy

(Promega) segundo as instruccedilotildees do fabricante A reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo dos amplicons ao plasmiacutedeo

foi feita utilizando-se tampatildeo de ligaccedilatildeo raacutepida 1X (30 mM Tris-HCl pH 78 10 mM DDT 1

mM ATP 5 polietilenoglicol PEG) e 3 U de DNA ligase T4 A soluccedilatildeo foi incubada a 4 ordmC

durante 16 horas Em seguida ceacutelulas competentes de Ecoli DH5α foram transformadas por

meio de choque teacutermico utilizando-se os produtos da reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo As ceacutelulas transformadas

foram plaqueadas em meio Luria Bertani (LB-aacutegar) contendo ampicilina (50 microg mL-1

) e X-Gal

(5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactosideo 20 microg mL-1

) As bacteacuterias contendo plasmiacutedeos

recombinantes foram selecionadas para cultivo em meio LB liacutequido contendo ampicilina (50 microg

mL-1

) durante 22 horas a 38 ordmC sob agitaccedilatildeo horizontal a 300 rpm

22345 Extraccedilatildeo do DNA plasmidial

Apoacutes o cultivo das bacteacuterias contendo o plasmiacutedeo recombinante em microplacas as

34

suspensotildees celulares foram centrifugadas por 6 minutos a 4000 g a 20 oC O sobrenadante foi

descartado e o peacutelete obtido foi lavado com 240 microL de uma soluccedilatildeo tampatildeo contendo 25 mM

Tris-HCl (pH 80) 10 mM EDTA (pH 80) e 50 mM de glicose centrifugado a 20oC por 6

minutos e 4000 g Apoacutes descarte do sobrenadante foi adicionado 80 microL da soluccedilatildeo tampatildeo e em

seguida as ceacutelulas foram ressuspendidas por agitaccedilatildeo Para uma microplaca de fundo ldquoUrdquo

contendo 1 microL de RNAse em cada cavidade (10 mg mL-1

) foram transferidos 60 microL de cada

suspensatildeo de ceacutelulas Em cada poccedilo da placa foram adicionados 60 microL da soluccedilatildeo de lise (NaOH

02 N e SDS 1) a placa foi selada a suspensatildeo homogeneizada por inversatildeo e incubada a

temperatura ambiente por 10 minutos Em seguida foram adicionados 60 microL de soluccedilatildeo

contendo 3M de acetato de potaacutessio 10 de aacutecido aceacutetico glacial misturando por inversatildeo A

placa foi mantida por 10 minutos agrave temperatura ambiente e entatildeo incubada aberta em estufa a

90oC por 30 minutos Apoacutes esse tempo a placa foi resfriada em gelo por 10 minutos e

centrifugada por 4 minutos (4000 g 20oC) O sobrenadante foi transferido para uma placa de 96

poccedilos Millipore (MAGV N22) fixada sobre uma placa de fundo ldquoVrdquo de 250 microL e o conjunto

centrifugado (sem a tampa) por 4 minutos a 4000 g e 4 oC Ao filtrado adicionou-se 110 microL de

isopropanol gelado e em seguida centrifugou-se por 45 minutos a 4000 g a 4 oC O precipitado

de DNA foi entatildeo lavado com 180 microL de etanol 70 Centrifugou-se novamente a 4000 g por 5

minutos a 4 oC Apoacutes o descarte do sobrenadante inverteu-se a placa sobre papel absorvente e

centrifugou-se por 1 minuto a 900 g e 4 oC Apoacutes secar durante 1 hora a temperatura ambiente o

DNA foi ressolubilizado em 80 microL de aacutegua ultrapura esterilizada durante toda a noite e

armazenado a -20 oC O DNA foi quantificado atraveacutes de espectrofotometria a 260 nm e sua

integridade determinada por eletroforese em gel de agarose 1 (TBE 05 X)

22346 Sequenciamento dos clones do gene rRNA 18S

Para o sequenciamento dos clones de fragmentos do gene rRNA 18S utilizou-se 200-500

ng de DNA plasmidial 10 pmol do iniciador M13f (5rsquo GTA AAA CGA CGG CCA G 3rsquo) 2 microL

de DYEnamic ET Terminator (GE Healthcare) 2 microL de soluccedilatildeo tampatildeo Save Money (200 mM

Tris-HCl pH 90 5 mM MgCl26H2O) e aacutegua ultrapura para um volume final de 10 microL A

amplificaccedilatildeo por PCR foi realizada em um termociclador Mastercycler Gradiente (Eppendorf)

com as seguintes condiccedilotildees 25 ciclos de 20 segundos a 95 oC 15 segundos a 50

oC e 1 minuto a

35

60 o

C Os produtos de PCR foram precipitados com 110 de volume de uma soluccedilatildeo de acetato de

soacutedio 15 M e EDTA 250 mM e 6 volumes de etanol 95 gelado As suspensotildees foram

centrifugadas a 4000 g por 45 minutos e o peacutelete lavado com etanol 70 a temperatura

ambiente O peacutelete foi seco no escuro por no miacutenimo 2 horas ressuspendido em formamida e

desnaturado a 96oC por 5 minutos O sequenciamento foi realizado em um sequenciador capilar

automaacutetico ABI 3100 (Applied Biosystems) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante

22347 Anaacutelise de sequecircncias do gene rRNA 18S

A similaridade com sequecircncias de DNA existentes no banco de dados do GenBank foi

determinada pelo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) no NCBI (ALTSCHUL et al

1990) A existecircncia de quimeras foi determinada usando o Chimera Check version 27 do

Ribosomal Database Project (RDP) (MAIDAK et al 1999) Foi considerado que as sequecircncias

satildeo potencialmente quimeacutericas se elas tecircm um ponto de quebra de quimera distinto gt20 no

Chimera Check Para se confirmar a indicaccedilatildeo do programa Chimera Check as sequecircncias foram

re-analisadas usando-se o BLAST depois da exclusatildeo dos nucleotiacutedeos anteriores e posteriores ao

ponto de quebra da quimera Se um dos dois seguimentos isto eacute o anterior ou o posterior ao

ponto de quebra foi mais similar a outro organismo do que o organismo mais similar agrave sequecircncia

original completa entatildeo a sequecircncia foi considerada como quimera

Para a anaacutelise filogeneacutetica as sequecircncias foram agrupadas por UPGMA com distacircncia-p

Cada grupo foi formado com valor de corte de 04 de distacircncia entre as sequecircncias Uma

sequecircncia representativa de cada grupo formado foi utilizada para construccedilatildeo da aacutervore

filogeneacutetica por neighbor-joining (NJ) utilizando-se o programa MEGA versatildeo 31(KUMAR

TAMURA NEI 2004) apoacutes alinhamento das sequecircncias no programa ClustalW e ajuste manual

O alinhamento das sequecircncias foi feito com deleccedilatildeo completa dos ldquogapsrdquo e a matriz de distacircncia

foi calculada utilizando-se o paracircmetro Jukes-Cantor como modelo de substituiccedilatildeo assumindo

taxa uniforme de substituiccedilatildeo para siacutetios variaacuteveis A robustez da topologia inferida por NJ foi

testada por 1000 repeticcedilotildees de bootstrap (PEER WACHTER 1994)

Para o agrupamento de sequecircncias em unidades taxonocircmicas operacionais (UTOs)

empregou-se o programa DOTUR (SCHLOSS HANDELSMAN 2005) Para isso foi utilizada

uma matriz de distacircncia evolutiva calculada com o programa DNADIST com algoritmo de

36

Jukes-Cantor apoacutes alinhamento das sequecircncias dos clones das bibliotecas da amostra de raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar SEM QUEIMA e da amostra COM QUEIMA preacutevia agrave colheita As sequecircncias

com uma similaridade gt 99 foram consideradas pertencentes agrave mesma UTO A estimativa de

riqueza de UTOs pelos meacutetodos natildeo-parameacutetricos ACE-1 (CHAO LEE 1992) e e Chao1

(CHAO 1984) dos iacutendices de diversidade de Shannon reciacuteproco do iacutendice de Simpson e a

cobertura de amostragem foram realizadas com o programa SPADE (CHAO SHEN 2003) A

comparaccedilatildeo estatiacutestica das bibliotecas de clones foi feita por meio do programa webLIBSHUFF

(SINGLETON et al 2001) utilizando as matrizes de distacircncias evolutivas calculadas

anterormente

23 Resultados e Discussatildeo


O DNA total extraiacutedo das raiacutezes de braquiaacuteria inoculadas com FMAs apoacutes a eletroforese

pode ser visto na Figura 2 As amostras extraiacutedas com o meacutetodo adaptado de Redecker (2000)

foram as uacutenicas a natildeo apresentar bandas no gel As concentraccedilotildees de DNA obtidas com cada

meacutetodo satildeo apresentadas na Figura 3 Pode-se observar com base no desvio padratildeo que o meacutetodo

que apresenta menor variaccedilatildeo na quantidade de DNA extraiacuteda entre amostras eacute o kit MoBio

seguido pelo kit Bio101 Os meacutetodos adaptados de Edwards et al (1997) de Doyle e Doyle

(1990) e de Redecker (2000) apresentaram maior variabilidade entre as amostras Poreacutem a

concentraccedilatildeo dada pela comparaccedilatildeo com marcador molecular diferiu em ordem e em magnitude

da concentraccedilatildeo determinada com base na absorbacircncia

37

Figura 2 ndash Eletroforese em gel de agarose (2) do DNA total extraiacutedo de raiacutezes de braquiaacuteria colonizadas com

FMAs usando 5 diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo A espeacutecie de FMA inoculada nas raiacutezes de braquiaacuteria

estaacute descrita acima do grupo de amostras LM - marcador de massa Low DNA Mass Ladder 1 ndash

extraccedilatildeo de DNA com kit FastDNA Spin (Bio 101 Vista Califoacuternia) 2 ndash extraccedilatildeo de DNA com kit

UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories Carlsbad CA USA) 3 ndash extraccedilatildeo de DNA com

meacutetodo adaptado de Edwards et al (1997) 4 ndash extraccedilatildeo de DNA com meacutetodo adaptado de Doyle amp

Doyle (1990) 5 ndash extraccedilatildeo de DNA com meacutetodo Adaptado de Redecker (2000)

As amostras extraiacutedas pelos meacutetodos do kit Bio101 adaptado de Edwards et al (1997) e

adaptado de Doyle e Doyle (1990) apresentaram DNA de melhor qualidade com base na relaccedilatildeo

A260A280 (Figura 4) Na Figura 4 eacute possiacutevel observar maior variabilidade na relaccedilatildeo A260A280

para as amostras do kit MoBio seguidas do kit Bio101 protocolo adaptado de Edwards (1997)

Doyle e Doyle (1990) e de Redecker (2000) Apesar disso as amostras do kit Bio101 foram as

que apresentaram maior eficiecircncia na amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S por PCR (Tabelas 2 e 3)

A eficiecircncia na amplificaccedilatildeo natildeo seguiu a ordem de concentraccedilatildeo de DNA inicial de qualquer um

dos meios de quantificaccedilatildeo tampouco apresentou maior frequecircncia de amplificaccedilatildeo as amostras

com valores de A260A280 mais proacuteximos a 18 Apesar de menor quantidade de DNA em relaccedilatildeo

ao extraiacutedo pelos meacutetodos adaptados de Edwards et al (1997) e de Doyle e Doyle (1990) a

eficiecircncia de amplificaccedilatildeo foi maior para as amostras obtidas com o Kit Bio101 Utilizando-se o

par de iniciadores NS1 e NS8 natildeo foi possiacutevel amplificar o DNA das amostras extraiacutedas com o

meacutetodo adaptado de Redecker (2000) ou com o adaptado de Edwards et al (1997) (Tabela 2) A

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38

maior frequumlecircncia de amplificaccedilatildeo foi obtida com o DNA extraiacutedo com kit Bio101 (83 )

seguida pelo DNA extraiacutedo com o meacutetodo adaptado de Doyle e Doyle (1990) (67 ) e

finalmente pelo DNA extraiacutedo com o kit MoBio (50 ) A avaliaccedilatildeo do gel de agarose apoacutes

eletroforese do DNA extraiacutedo sugere que esses resultados podem estar relacionados a impurezas

presentes na amostra Apoacutes a eletroforese nota-se um efeito de arraste nas amostras mais

concentradas sendo mais intenso nas amostras de DNA obtidas com os meacutetodos adaptados de

Edwards et al (1997) e de Doyle e Doyle (1990)

Quando se utilizou o par de iniciadores SSU Glom1 e LSU Glom1 o miacutenimo de 3

amostras de DNA de um total de 5 de cada meacutetodo apresentou amplificaccedilatildeo positiva (Tabela 3)

Novamente a maior frequecircncia de amplificaccedilatildeo foi observada com as amostras de DNA extraiacutedo

pelo kit Bio101 (100 ) seguidas do meacutetodo adaptado de Edwards et al (1997) e de Doyle e

Doyle (1990) (83 ) e pelo kit MoBio e o meacutetodo adaptado de Redecker (2000) (67 ) Sendo

assim o meacutetodo usando o kit Bio101 foi o escolhido para as extraccedilotildees de DNA das raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar em condiccedilotildees do campo

Figura 3 ndash Concentraccedilatildeo de DNA de raiacutezes de braquiaacuteria extraiacutedo com os 5 meacutetodos A - concentraccedilatildeo determinada

por comparaccedilatildeo com marcador de massa B - concentraccedilatildeo medida a partir da absorbacircncia a 260 nm As

barras verticais indicam o desvio padratildeo Meacutedias seguidas de letras iguais natildeo diferem estatisticamente

pelo Tukey (p lt 005) O DNA extraiacutedo com o meacutetodo adaptado adaptado de Redecker (2000) natildeo foi

visualizado no gel apoacutes a eletroforese

A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39

Figura 4 ndash Valores da relaccedilatildeo entre as absorbacircncias a 260 e 280 nm (A260A280) do DNA extraiacutedo de raiacutezes de

Brachiaria sp As barras representam o desvio padratildeo

Pode-se concluir que as quantificaccedilotildees de DNA por comparaccedilatildeo com marcador de massa

e por espectrofotometria nem sempre refletem a quantidade e a viabilidade de amplificaccedilatildeo do

DNA em amostras ambientais com uma comunidade microbiana diversa Sendo assim em

estudos de amostras ambientais natildeo eacute adequado se fazer generalizaccedilotildees sobre a metodologia mais

eficiente para a quantificaccedilatildeo do DNA ou para a avaliaccedilatildeo de sua qualidade O ideal seria um

estudo preacutevio para determinar as melhores condiccedilotildees de extraccedilatildeo e quantificaccedilatildeo para a

investigaccedilatildeo pretendida

A260A

280

40

Tabela 2 - Amplificaccedilatildeo do fragmento do gene rRNA 18S de amostras de DNA extraiacutedo de raiacutezes de braquiaacuteria utilizando

os iniciadores NS1 e NS8

FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50

Adaptado de Edwards et al (1997) - - - - - - -

Adaptado de Doyle amp Doyle (1990) + + - + - + 67

Adaptado de Redecker (2000) - - - - - - -

FA ()

40 60 40 40 - 60

FA - Frequecircncia de amplificaccedilatildeo

Tabela 3 - Amplificaccedilatildeo do fragmento do gene rRNA 18S de amostras de DNA extraiacutedo de raiacutezes de braquiaacuteria utilizando os

iniciadores SSU Glom1 e LSU Glom1

FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67

Adaptado de Edwards et al (1997) + + + + - + 83

Adaptado de Doyle amp Doyle (1990) - + + + + + 83

Adaptado de Redecker (2000) + - + + - + 67

Freq () 60 80 100 80 60 100


41

232 Desenho e validaccedilatildeo de iniciadores especiacuteficos para grupos de FMAs

Para a obtenccedilatildeo de sequecircncias do gene rRNA 18S de FMAs comuns a ecossistemas

brasileiros inicialmente foram utilizadas espeacutecies isoladas da coleccedilatildeo de FMAs do Departamento

de Ciecircncia do Solo da ESALQ mantidas em plantas multiplicadoras em casa-de-vegetaccedilatildeo A

amplificaccedilatildeo com os pares de iniciadores NSF4 e NSR1787 ou NS1 e NS8 do DNA extraiacutedo de

esporos das espeacutecies Gigaspora margarita Gigaspora rosea Scutellospora heterogama Glomus

intraradices Glomus formasanum Acaulospora scrobiculata e Paraglomus brasilianum

apresentou aproximadamente 30 de eficiecircncia No entanto a clonagem desses fragmentos em

E coli natildeo foi possiacutevel Considerando-se que existe um bom nuacutemero de sequecircncias do gene

rRNA 18S de espeacutecies de FMAs comuns em ecossistemas brasileiros depositadas nos bancos de

dados puacuteblicos e que o dispecircndio de recursos e tempo para otimizaccedilatildeo da teacutecnica natildeo eacute

compensador decidiu-se usar tais sequecircncias depositadas para desenho de iniciadores especiacuteficos

para grupos de FMAs Desse modo nesse trabalho foram desenhados iniciadores especiacuteficos

para os grupos de FMAs mais frequentes em amostras ambientais Acaulosporaceae

Gigasporaceae Glomus Grupo A e Glomus Grupo B

As sequecircncias utilizadas para o desenho dos iniciadores satildeo apresentadas na Tabela 4

Essas foram alinhadas e agrupadas em funccedilatildeo de sua similaridade usando-se o programa

Sequencher 46 A famiacutelia Acaulosporaceae formou um agrupamento a 96 de similaridade o

Glomus Grupo B formou um agrupamento a 95 Gigasporaceae a 94 e Glomus Grupo A a

93 de similaridade

A formaccedilatildeo de um agrupamento somente com as sequecircncias de Glomeromycota natildeo foi

possiacutevel porque a diversidade de sequecircncias entre os FMAs eacute alta ao ponto de o agrupamento

apresentar sequecircncias de outros fungos Isto eacute uma das limitaccedilotildees para se desenhar um iniciador

que seja especiacutefico para todos os fungos de Glomeromycota A razatildeo para isso eacute a divergecircncia

dos grupos basais de Archaeosporaceae e Paraglomeraceae A Figura 5 apresenta a anaacutelise

filogeneacutetica das sequecircncias do gene rRNA 18S representativas dos gupos e que foram utilizadas

para o desenho de iniciadores

42

Tabela 4 ndash Sequecircncias de fungos alvo e natildeo-alvo obtidas do banco de dados do NCBI para o desenho de iniciadores

especiacuteficos para amplificarem o gene rRNA 18S de Glomeromycota

(continua)

Organismo Grupo Filo Acesso

Acaulospora laevis Acaulosporaceae Glomeromycota [AJ2508471]

Acaulospora laevis Acaulosporaceae Glomeromycota [Y176332]

Acaulospora longula Acaulosporaceae Glomeromycota [AJ3064391]

Acaulospora scrobiculata Acaulosporaceae Glomeromycota [AJ3064421]

Entrophospora colombiana Acaulosporaceae Glomeromycota [AB2201701]

Gigaspora albida Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8526001]


Gigaspora decipiens Gigasporaceae Glomeromycota [U961461]

Gigaspora gigantea Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8526021]


Gigaspora gigantea Gigasporaceae Glomeromycota [EF0143621]

Gigaspora margarita Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8526051]



Gigaspora margarita Gigasporaceae Glomeromycota [AM1811441]


Gigaspora rosea Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8526081]



Gigaspora rosea Gigasporaceae Glomeromycota [X587261]

Scutellospora aurigloba Gigasporaceae Glomeromycota [AJ2760932]


Scutellospora calospora Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064461]



Scutellospora castanea Gigasporaceae Glomeromycota [AF0385901]

Scutellospora cerradensis Gigasporaceae Glomeromycota [AB0413451]


Scutellospora fulgida Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064351]

Scutellospora gilmorei Gigasporaceae Glomeromycota [AJ2760942]

Scutellospora gregaria Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8712751]


Scutellospora heterogama Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064341]

Scutellospora heterogama Gigasporaceae Glomeromycota [AY6358321]

Scutellospora heterogama Gigasporaceae Glomeromycota [U365931]


Scutellospora nodosa Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064371]

Scutellospora projecturata Gigasporaceae Glomeromycota [AJ2427291]

Scutellospora reticulata Gigasporaceae Glomeromycota [AJ8712731]

Scutellospora spinosissima Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064361]

Scutellospora weresubiae Gigasporaceae Glomeromycota [AJ3064441]

Glomus caledonium Glomus grupo A Glomeromycota [Y176532]


Glomus clarum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ2760842]


Glomus coremioides Glomus grupo A Glomeromycota [AJ2497151]

Glomus coronatum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ2760862]

Glomus fasciculatum Glomus grupo A Glomeromycota [Y176402]

Glomus fragilistratum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ2760852]

Glomus geosporum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ2456372]

Glomus intraradices Glomus grupo A Glomeromycota [AJ3018591]

43



(continuaccedilatildeo)



Glomus intraradices Glomus grupo A Glomeromycota [AY6358311]

Glomus intraradices Glomus grupo A Glomeromycota [DQ3226301]

Glomus intraradices Glomus grupo A Glomeromycota [X587251]

Glomus manihotis Glomus grupo A Glomeromycota [U365901]

Glomus manihotis Glomus grupo A Glomeromycota [Y176483]

Glomus mosseae Glomus grupo A Glomeromycota [AJ3064381]

Glomus mosseae Glomus grupo A Glomeromycota [AY6358331]

Glomus mosseae Glomus grupo A Glomeromycota [U961431]



Glomus sinuosum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ1337061]

Glomus verruculosum Glomus grupo A Glomeromycota [AJ3018581]

Glomus etunicatum Glomus grupo B Glomeromycota [AJ8525981]

Glomus cf etunicatum Glomus grupo B Glomeromycota [Y176442]

Glomus luteum Glomus grupo B Glomeromycota [U365911]

Glomus claroideum Glomus grupo B Glomeromycota [AF1397321]

Glomus viscosum Glomus grupo B Glomeromycota [Y176522]

Glomus etunicatum Glomus grupo B Glomeromycota [Y176392]

Glomus luteum Glomus grupo B Glomeromycota [AJ2760893]

Glomus lamellosum Glomus grupo B Glomeromycota [AJ2760872]

Glomus claroideum Glomus grupo B Glomeromycota [AJ2760802]




Archaeospora leptoticha Ambisporaceae Glomeromycota [AB0150521]


Archaeospora leptoticha Ambisporaceae Glomeromycota [AJ0064661]


Acaulospora trappei Archaeosporaceae Glomeromycota [AJ0068001]


Archaeospora trappei Archaeosporaceae Glomeromycota [AM1142741]

Archaeospora trappei Archaeosporaceae Glomeromycota [Y176343]

Diversispora spurca Diversisporaceae Glomeromycota [AJ2760772]

Diversispora spurca Divesisporaceae Glomeromycota [Y176502]

Glomus versiforme Diversisporaceae Glomeromycota [AJ2760883]

Glomus versiforme Diversisporaceae Glomeromycota [X866873]

Glomus fulvum Glomeraceae Glomeromycota [AM4185431]

Pacispora scintillans Pacisporaceae Glomeromycota [AJ6199551]



Glomus occultum Paraglomeraceae Glomeromycota [AJ0067981]


Paraglomus brasilianum Paraglomeraceae Glomeromycota [AJ3018621]

Paraglomus occultum Paraglomeraceae Glomeromycota [AJ2760813]


Paraglomus occultum Paraglomeraceae Glomeromycota [DQ3226291]

Geosiphon pyriformis natildeo-alvo Glomeromycota [AJ2760742]

Geosiphon pyriformis natildeo-alvo Glomeromycota [AM1839231]

Geosiphon pyriformis natildeo-alvo Glomeromycota [X866862]

Geosiphon pyriformis natildeo-alvo Glomeromycota [Y159043]

44






Buellia dialyta natildeo-alvo Ascomycota [DQ9730091]

Capnodium coffeae natildeo-alvo Ascomycota [DQ2478081]

Capnodium salicinum natildeo-alvo Ascomycota [DQ6779971]

Capronia munkii natildeo-alvo Ascomycota [EF4136031]

Capronia pilosella natildeo-alvo Ascomycota [DQ8231061]

Cladonia caroliniana natildeo-alvo Ascomycota [AY5846641]

Diaporthe eres natildeo-alvo Ascomycota [DQ4710151]

Geoglossum nigritum natildeo-alvo Ascomycota [AY5446941]

Ophioparma lapponica natildeo-alvo Ascomycota [DQ9730051]

Orbilia auricolor natildeo-alvo Ascomycota [DQ4710011]

Orbilia vinosa natildeo-alvo Ascomycota [DQ4710001]

Peziza proteana f sparassoides natildeo-alvo Ascomycota [AY5447031]

Peltula umbilicata natildeo-alvo Ascomycota [DQ7828871]

Peziza vesiculosa natildeo-alvo Ascomycota [DQ4709951]

Taphrina wiesneri natildeo-alvo Ascomycota [AY5482931]

Xylaria acuta natildeo-alvo Ascomycota [AY5447191]

Xylaria hypoxylon natildeo-alvo Ascomycota [AY5446921]

Amanita brunnescens natildeo-alvo Basidiomycota [AY7070961]

Lactarius lignyotus natildeo-alvo Basidiomycota [DQ4576261]

Pleurotus ostreatus natildeo-alvo Basidiomycota [AY6570151]

Puccinia poarum natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8310292]

Rhodotorula glutinis natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8321941]

Rhodotorula hordea natildeo-alvo Basidiomycota [AY6570131]

Rhodotorula mucilaginosa natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8321991]

Sphenospora kevorkianii natildeo-alvo Basidiomycota [DQ3545201]

Tilletiaria anomala natildeo-alvo Basidiomycota [AY8037521]

Trechispora sp natildeo-alvo Basidiomycota [AY8037531]

Tremella aurantia natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8360001]

Udeniomyces puniceus natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8360061]

Uromyces appendiculatus natildeo-alvo Basidiomycota [DQ3545101]

Ustilago tritici natildeo-alvo Basidiomycota [DQ8468951]

Chytriomyces hyalinus natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ5364871]

Cladochytrium replicatum natildeo-alvo Chytridiomycota [AY5466831]

Cyllamyces aberensis natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ5364811]

Gaertneriomyces semiglobiferus natildeo-alvo Chytridiomycota [AF1642472]

Olpidium brassicae natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ3226241]

Physoderma maculare natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ5364891]

Polychytrium aggregatum natildeo-alvo Chytridiomycota [AY6017111]

Rhizidium endosporangiatum natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ5364841]

Rhizophlyctis harderi natildeo-alvo Chytridiomycota [AF1642722]

Rhizophlyctis rosea natildeo-alvo Chytridiomycota [AY6358291]

Rhizophydium elyensis natildeo-alvo Chytridiomycota [DQ5364791]

Rozella allomycis natildeo-alvo Chytridiomycota [AY6358381]

Spizellomyces punctatus natildeo-alvo Chytridiomycota [AY5466841]

Basidiobolus ranarum natildeo-alvo Zygomycota [AY6358411]

Coemansia reversa natildeo-alvo Zygomycota [AY5466851]

Cokeromyces recurvatus natildeo-alvo Zygomycota [AY6358431]

Endogone lactiflua natildeo-alvo Zygomycota [DQ5364711]

Endogone pisiformis natildeo-alvo Zygomycota [DQ3226281]

Entomophthora muscae natildeo-alvo Zygomycota [AY6358201]

45



(conclusatildeo)


Mortierella sp natildeo-alvo Zygomycota [AY6358281]

Orphella haysii natildeo-alvo Zygomycota [DQ3226261]

Phycomyces blakesleeanus natildeo-alvo Zygomycota [AY6358371]

Rhizopus stolonifer natildeo-alvo Zygomycota [DQ5364741]

Rhopalomyces elegans natildeo-alvo Zygomycota [AY6358341]

Umbelopsis ramanniana natildeo-alvo Zygomycota [DQ3226271]

Nessa anaacutelise verifica-se que membros das classes Archaeoporales e Paraglomerales

formam clades mais distantes filogeneticamente dos demais Glomeromycota o que estaacute de

acordo com outros estudos filogeneacuteticos com base no gene rRNA 18S desses fungos

(REDECKER MORTON BRUNS 2000) Aleacutem disso com as sequecircncias desse estudo e

utilizando o programa Sequencher 46 foi observado que esses dois grupos basais de FMAs estatildeo

associados com outros fungos em um agrupamento a 90 de similaridade enquanto as

sequecircncias restantes de FMAs formam um agrupamento distinto Haacute formaccedilatildeo de um

agrupamento com todos as sequecircncias de FMAs a 89 de similaridade mas esse tambeacutem inclui

sequecircncias de vaacuterios outros fungos Ainda assim uma sequecircncia consenso formada somente por

Glomeromycota foi obtida apoacutes alinhamento das sequecircncias com o programa Multalin e utilizada

para o desenho de iniciadores No entanto natildeo haacute uma regiatildeo conservada no gene rRNA 18S de

Glomeromycota que exclua outros fungos Portanto a divergecircncia de sequecircncias do gene rRNA

18S dentro do grupo de Glomeromycota impossibilita o desenho de iniciadores especiacuteficos para

amplificar uma regiatildeo do gene rRNA 18S comum a todos os FMAs

Ao contraacuterio do presente trabalho Lee Lee e Young (2008) desenharam os iniciadores

AML1 e AML2 especiacuteficos para todos os fungos de Glomeromycota inclusive os grupos basais

Archaeosporales e Paraglomerales No entanto verifica-se 100 de similaridade quando alinha-

se o iniciador AML1 com sequecircncias de fungos natildeo-alvo do banco Genbank tais como as

sequecircncias do gene rRNA 18S de Taphrina wiesneri (Ascomycota acesso AY5482931)

Amanita brunnescens (Basidiomycota acesso AY7070961) Rhizidium endosporangiatum

(Chytridiomycota acesso DQ5364841) e Endogone pisiformis (Zygomycota acesso

DQ3226281) (dados natildeo mostrados) O AML2 pode ser usado alternativamente como o segundo

iniciador (reverso) na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo apesar de ele apresentar as 7 primeiras bases na

extremidade 3rsquo similar a alguns fungos natildeo-alvo (dados natildeo mostrados)

46

Figura 5 ndash Relaccedilotildees filogeneacuteticas entre os diferentes fungos micorriacutezicos arbusculares determinadas por neighbor-

joining com base nas sequecircncias dos genes rRNA 18S Essas satildeo sequecircncias representativas dos grupos

utilizados para o desenho de iniciadores Os nuacutemeros sobre os ramos indicam a percentagem de 1000

repeticcedilotildees da anaacutelise de bootstrap A barra representa duas substituiccedilotildees a cada 100 nucleotiacutedeos Os

nomes dos iniciadores desenhados nesse trabalho estatildeo grafados em itaacutelico e negrito abaixo do nome dos

seus grupos ndash Gigasporaceae Acaulosporaceae Glomus grupo A e Glomus grupo B As linhas

transversais tracejadas indicam famiacutelias ou grupos e as linhas cheias indicam os filos

47

O baixo nuacutemero de sequecircncias e espeacutecies de Diversisporaceae e Pacisporaceae

disponiacuteveis nos bancos de dados puacuteblicos eacute insuficiente para o desenho de iniciadores

especiacuteficos por essa razatildeo esses dois grupos de FMAs natildeo foram considerados para o desenho

dos iniciadores grupo-especiacuteficos

Desenho de iniciadores grupo-especiacuteficos Utilizando os programas Beacon Designer

702 Primer3 e a busca manual foram encontradas por volta de 150 sequecircncias de

oligonucleotiacutedeos com potencial para serem usadas como iniciadores Para os ensaios de PCR

sete desses oligonucleotiacutedeos foram selecionados com base na avaliaccedilatildeo de especificidade

utilizando o BLAST e o alinhamento com sequecircncias alvo e natildeo-alvo e segundo as propriedades

dos iniciadores avaliadas no programa Oligo Analyzer O programa Beacon Designer 702 natildeo

possibilitou o desenho de iniciadores especiacuteficos As sequecircncias dos sete iniciadores selecionados

satildeo apresentadas na Tabela 5 juntamente com suas respectivas temperaturas de desnaturaccedilatildeo

(Tm) calculada com o programa Oligo Analyzer e tamanho esperado dos amplicons quando

utilizados com o iniciador nu-SSU-1196 modificado

Nas Figuras 6 a 11 satildeo mostrados os alinhamentos dos iniciadores com as sequecircncias alvo

e diversas sequecircncias natildeo-alvo representadas pelos grupos filogeneacuteticos Glomeromycota

Ascomycota Basidiomycota Chytridiomycota Zygomycota Faneroacutegamas e Homo sapiens

Tabela 5 ndash Iniciadores selecionados e suas respectivas temperaturas de desnaturaccedilatildeo (Tm) e

tamanho de amplicons esperados quando utilizados com o iniciador nu-SSU-1196

modificado

Iniciador Sequecircncia (5 rarr 3) Especificidade Tm (ordmC)

Tamanho

esperado do

amplicon (pb)

ACAU220 GGG GTT TCC CAT TGG TGR ATC AT Acaulosporaceae 646 995

GLOMB652 TAA GGG GTA TGA ACT GGT GTA G Glomus Grupo B 603 565

GLOMB673 GTC AAT TTC TCA CCT TCT GGA G Glomus Grupo B 603 544

GIGA202 AAA CCA ATA RCC TTC GGG TTT C Gigasporaceae 603 987

GIGA615 TAG TTG AAT TTC GGG GTT CTA C Gigasporaceae 584 574

GLOMA189 TTA GAT AAA AAA CCA ATA TCG GG Glomus Grupo A 557 1018

GLOMA690 CGT AAT GCC ATT AAT TTG GTG T Glomus Grupo A 565 517

48

ACAU220 GGGGTTTCCCATTGGTGRATCAT

Acaulospora longula TTTTGGGGTTTCCCATTGGTGGATCATAATAACTTT

Acaulospora scrobiculata GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT

Acaulospora laevis GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT

Entrophospora colombiana GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT

Scutellospora heterogama -CTTCGGGTTTCAC-TTGGTGATTCATGATAACTTT

Pacispora scintilans TTCG-GGGTTTC-CTTTGGTGATTCATGATAACTTT

Glomus intraradices GCAACCGA-TTC-CCTTGGTGATTCATAATAACTTT

Glomus etunicatum GCAACCAACTAAACCTTGGTGATTCATGATAACTTT

Paraglomus brasilianum TATGCCGG--AA-CTGTGGTGAATCATGATAACTTG

Archaeospora leptoticha TTCGGGCGAGTCCC-TTGGTGATTCATGGTAACTTT

Pleurotus ostreatus -CTCGCCGCTCCC--TTGGTGATTCATAATAACTTC

Rhizidium endosporangiatum -GCAACCGGTTCT--TTGGTGATTCATGGTAACTTT

Chytriomyces hyalinus ---AAACGGTTCT--TTGGTGATTCATAGTAACTTT

Capnodium coffeae -CCCTTCGGGGCTCAATGGTGAATCATAATAACTTA

Ustilago tritici -CTCCTCGGAGTT---TGGCGATTCATAATAACTTC

Rhizopus stolonifer TAAAACCTGTTTC--TTGGTGAATCATAATAATTAA

Endogone pisiformis -AACCACTCATC----TGGTGATTCATAATAACTTT

Cladonia caroliniana -CCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTC

Zea mays TCTGCCCGCCGAT--CCGATGATTCATGATAACTTG

Glycine max TCTGCCTGTTGCT--TTGATGATTCATGATAACTCG

Figura 6 ndash Local de ancoramento do iniciador ACAU220 (5rsquorarr 3rsquo) nas sequecircncias do gene rRNA 18S de FMAs e

outros organismos O iniciador e o local de iniciaccedilatildeo nas sequecircncias alvo satildeo mostrados em negrito

Similaridades das sequecircncias dos organismos e do iniciador estatildeo marcadas em cinza

GIGA202 AAACCAATARCCTTCGGGTTTC

Scutellospora heterogama AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora calospora AGAT-GAAAACCAATAGCCTTCGGGTTTCCAC----TTGGTG

Scutellospora projecturata AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCCAC----TTGGTG

Gigaspora gigantea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG

Gigaspora margarita AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG

Gigaspora rosea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG

Scutellospora gilmorei AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora fulgida AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora spinosissima AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora gregaria AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora weresubiae AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AT----ATGGTG

Scutellospora cerradensis AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Gigaspora albida AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG

Scutellospora nodosa AGGT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCCAG----TTGGTG

Scutellospora castanea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG

Scutellospora aurigloba AGAT-AAAAACCAATAGCCTTCGGGTTTCAAC----TTGGTG

Pacispora scintillans AGATAAAAAACCAATAGCCCTTCGGGGTT--TCCT-TTGGTG

Glomus intraradices AGATAAAAAACCAATATCGGGCAACCGAT--TCCC-TTGGTG

Acaulospora longula AGATAAAAAACCAATAACTCCTTTTGGGGTTTCCCATTGGTG

Glomus etunicatum AGATAAAAAACCAACAGTTGGGCAACCAACTAAACCTTGGTG

Paraglomus brasilianum AGATAAAAAGCCAACCCGGCTTATGCCGGAACT---GTGGTG

Archaeospora leptoticha AGATACAAAACCAATCTCGTCTTCGGGCGAGTCCC-TTGGTG

Capnodium coffeae AGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCAA-----T-GGTG

Cladonia caroliniana AGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCC------TTGGTG

Pleurotus ostreatus AGATAAAAAACCGACGCGGCTCGCCGCTCCC-----TTGGTG

Endogone pisiformis AGATAAAAAACCAACGTGGGCAACCACTCAT-----CTGGTG

Ustilago tritici AGAT-AAAAACC-ATCCTCCTCGGAGT---------TTGGCG

Chytriomyces hyalinus AGATAAAAAACCAACCCGGAAACGGTT-C-T-----TTGGTG

Rhizidium endosporangiatum AGATAAAAAACCAACCCGGGCAACCGGTTCT-----TTGGTG

Rhizopus stolonifer AGAT--AAAACCAACGCGGGGTAAAACCTGTTTC--TTGGTG

Zea mays AGATAAAAGGCTGACGCGGGCTCTGCCCGCCGAT--CCGATG

Glycine max AGATAAAAGGTCAACACAGGCTCTGCCTG-TTGCT-TTGATG

Homo sapiens AGAT-CAAAACCAACCCGGTCAGCCCCTCTCCGGCCCCGGCC

Figura 7 ndash Local de ancoramento do iniciador GIGA202 (5rsquorarr 3rsquo) nas sequecircncias do gene rRNA 18S de FMAs e



49

GIGA615 TAGTTGAATTTCGGGGTTCTAC

Scutellospora heterogama GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCCACCGTTG

Scutellospora calospora GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora projecturata GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCATTG

Gigaspora gigantea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Gigaspora margarita GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Gigaspora rosea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora gilmorei GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora fulgida GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora spinosissima GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora gregaria GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora weresubiae GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora cerradensis GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Gigaspora albida GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG

Scutellospora nodosa GCTCGTAGTTGAATTTCGGAATTTTACCGTTG

Scutellospora castanea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTTTACCGTTG

Scutellospora aurigloba GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTCTACCGTCG

Pacispora scintillans GCTCGTAGTTGAATTTCGAAATTTTTTTATCG

Glomus intraradices GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTAGTAGGTTG

Acaulospora longula GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTTGTCAGTTG

Glomus etunicatum GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTGACACATCG

Paraglomus brasilianum GCTCGTAGTTGAACTTCAGGCCTGGCTGGACG

Archaeospora leptoticha GCTCGTAGTTGAATTTTGGGTCTGGCCGGGCG

Capnodium coffeae GCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCG

Cladonia caroliniana GCTCGTAGTTGAAACTTGGGCCTGGCTGACCG

Pleurotus ostreatus GCTCGTAGTTGAACTTCAGACCTGGCTGGGCG

Endogone pisiformis GCTCGTAGTTGAATTTTAGCTCTGGCTGGGCG

Ustilago tritici GCTCGTAGTTGAAGTTTGGTCTCGGACGCTGG

Chytriomyces hyalinus GCTCGTAGTTGAATTTTGGGCCGGGTTTGAAG

Rhizidium endosporangiatum GCTCGTAGTTGAATTTTGGGCTGGGCTGGGCG

Rhizopus stolonifer GTCCGTAGTCAAACTTTAGTCTT--ACTGGCG

Zea mays GCTCGTAGTTGGACCTTGGGCCGGGCCGGGTG

Glycine max GCTCGTAGTTGGACCTTGGGTTGGGTCGATCG

Homo sapiens GCTCGTAGTTGGATCTTGGGAGCGGGCGGGCG




GLOMB652 TAAGGGGTATGAACTGGTGTAG

Glomus luteum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACG

Glomus lamellosum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGNTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC

Glomus etunicatum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC

Glomus viscosum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTGAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC

GLOMB673 GTCAATTTCTCACCTTCTGGAG

Pacispora scintilans AATCAACAGG--TTCGTACTGATTTTAAGAATTTCT-ACCTTCTGGAG-AACC

Glomus intraradices ATGCCTCTGG--TATGTACTGGTCTCACTGATTCCT--CCTTCCTTATGAACC

Acaulospora longula GGCTTAACTG--TCCGTATTGACTTGATGGATTCTT-ACCTTC-TGAGTAACC

Scutellospora heterogama GGG-CTATTG--TCTGTACTGGTGTGTGGAATTTCT-ACCTTCTGGGG-AACT

Paraglomus brasilianum GCCTTCCGGG--TGAGTACTGTCTGTGGTCGGGTCCTACCTTCTGGCG-AAGC

Archaeospora leptoticha ACCT-TCTGG--TGAGCACTGTTCCGACGCCGGGCCTATCCTTCTGGTGAGAC

Pleurotus ostreatus_ CG-CTTAACGG-CGTGTACTGT-CT-GGCTGGGCCTTACCTCTTGGTG-AGCC

Rhizidium endosporangiatum CGCCGCAA-GG-TGAGCACTGCT-C-CGGTCTGG-TCTTTCCTTCTGGGGATC

Chytriomyces hyalinus TGCC--AATGG-CATGTACT--T-TCGGCC-TGG-TCTTTCCTTGTGGGGAAC

Endogone pisiformis TGCCTTTACGG-TGGGTACTACT-TTGGCTGGGGTTCACCTTCTGGTG-AGCT

Rhizopus stolonifer GGTCTTCATTGACC-AAGCTCATTGC-TGCCGGAGACTCCATGTTCATTA-GG

Cladonia caroliniana CGCCTCACCGCGT--GCACTGGC-TCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGG-AACC

Ustilago tritici TGCTTCATTG--CATGTACTTG-GC-GGTCCGAGACTTCCTTCCTGGTGAACG

Capnodium coffeae CGCCTCACCGCGT--GTACTGGT-CCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGG-AACC

Zea mays CGCCGTACGGG-CA-GAACCGA--CCGGCTCGA---C--CCTTCTGCCGGCGA

Glycine max CGCC-TCCGGTGT--GCACCGGT-CGGCTCGTCCCTTCTGCCGGCGAT-GCGC

Homo sapiens CGCCGCGAGGCGAGCCACCGCCCGT-CCCCGCCCCTTGCCT-CTCGGCGCCCC

Figura 9 ndash Locais de ancoramento dos iniciadores GLOMB652 e GLOMB673 (5rsquorarr 3rsquo) nas sequecircncias do gene

rRNA 18S de FMAs e outros organismos Os iniciadores e os locais de de iniciaccedilatildeo nas sequecircncias alvo

satildeo grafados em negrito Similaridades das sequecircncias dos organismos e do iniciador GLOMB652 estatildeo

marcadas em cinza e marcadas em preto para o iniciador GLOMB673

50

GLOMA189 TTAGATAAAAAACCAATATCGGG

Glomus manihotis TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-AAACCGA

Glomus clarum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-AAACCGA

Glomus intraradices TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus verruculosum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus caledonium TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus fragislistratum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus mosseae TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus coronatum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus geosporum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Glomus sinuosum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGGGCAACCTG

Glomus coremioides TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA

Acaulospora longula TATTTATTAGATAAAAAACCAATAACTCC-TTTTGGG

Glomus etunicatum TATTTATTAGATAAAAAACCAACAGTTGGGCAACCAA

Paraglomus brasilianum TATTTATTAGATAAAAAGCCAACC-C-GG-CTTA-TG

Archaeospora leptoticha TATTTATTAGATACAAAACCAATCTCGT--CTTCGGG

Scutellospora heterogama TATTTATTAGATAAAAA-CCAATAAC----CTTCGGG

Pacispora scintilans TATTTATTAGATAAAAAACCAATA--GCC-CTTCGGG

Pleurotus ostreatus TATTTATTAGATAAAAAACCGACGC--GG-CT-CGCC

Rhizidium endosporangiatum TATTTATTAGATAAAAAACCAACC-CGGG-CAACCGG

Chytriomyces hyalinus TATTTATTAGATAAAAAACCAACC-CGG---AAACGG

Endogone pisiformis TATTTATTAGATAAAAAACCAACGT-GGGC-AACCAC

Zea mays CATTTATTAGATAAAAGGCTGACG-CGGG-CTCTGCC

Glycine max CATTTATTAGATAAAAGGTCAACA-CAGG-CTCTGCC

Rhizopus stolonifer CACTTATTAGATAAAA--CCAACG-CGGG-GTAAAAC

Cladonia caroliniana TATTTATTAGATAAAAAACCAAT---GCC-CTTCGGG

Ustilago tritici TATTTATTAGATAAAAA-CCA-TC-CTC--CTCGGAG

Capnodium coffeae TATTTATTAGATAAAAAACCAAT---GCC-CTTCGGG

Figura 10 ndash Local de ancoramento do iniciador GLOMA189 (5rsquorarr 3rsquo) nas sequecircncias do gene rRNA 18S de FMAs e



51

GLOMA690 CGTAATGCCATTAATTTGGTGT

Glomus manihots GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Glomus clarum (1) GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Glomus clarum (2) GAACTGTAATGTCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Glomus intraradices GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Glomus verruculosum AAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG

Glomus caledonium GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG

Glomus fragilistratum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACCGGG

Glomus mosseae GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTACGGGG

Glomus coronatum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG

Glomus geosporum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG

Glomus sinuosum GAGCCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Glomus coremioides GAGCCGTAATGTCATTAATTTGGTGTTGCGGGG

Acaulospora longula TAACCAGCATGCTATTAAGTTAGTGCGTTGGGG

Pacispora scintilans GAACCTTAATGTCATTTATTTGATGTTTTGGGA

Glomus etunicatum GAACCGCGATGCCCTTAATTGGGTGTCACGGGG

Paraglomus brasilianum GAAGCGTCATGGCCTTAACCGGCCGTGGCGGGG

Archaeospora leptoticha GAGACGGCATGCCCTTCGCTGGGTGTGTCGGGG

Scutellospora heterogama GAACTATCATGTTATTAATTTAGCGTGGTAGGA

Pleurotus ostreatus GAGCCGGCGTGCCCTTTATT-GGTGTGCGTTGG

Rhizidium endosporangiatum GATCTAGCGTGCGCTTCACT--GTGTGCGTTAG

Chytriomyces hyalinus GAACACGTGTGCACTTTACTGTGTGTGCGTGGG

Endogone pisiformis GAGCTGGCATGTTCTTAACTGGATGTGTCAGGG

Ustilago tritici -GAACGGCCG--CCTTCG---GGTGGTCC---G

Capnodium coffeae GAACCG-CATGCCCTTCACTGGGCGTGTGTGGG

Cladonia caroliniana -AACCG-CATGGCCTTCATT-GGTCGTGTTGGG

Rhizopus stolonifer GTTCATTAGGGGAAAATCTCTAGGGGTTTTTTT

Zea mays ATGCGCTCCTGGCCTTAACTGGCCGGGTCGTGC

Glycine max ATGCGCTCCTGTCCTTAACTGGCCGGGTCGTGC

Homo sapiens GCCCCCTCGATGCTCTTAGCTGAGTGTCCCGCG




Utilizando-se as amostras de DNA de FMAs provenientes de vasos de multiplicaccedilatildeo em

casa-de-vegetaccedilatildeo verificou-se que a temperatura de 61 ordmC foi adequada para o pareamento dos

iniciadores desenhados e para a eficiente amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S (Figura 12) Quando

testados com amostras de DNA de FMAs natildeo-alvo os iniciadores utilizados natildeo permitem a

amplificaccedilatildeo do DNA (Figura 13) O iniciador ACAU469 mostrou-se inespeciacutefico (Figura 13) e

o iniciador GLOMA348 apresentou pouca repetibilidade nas reaccedilotildees de amplificaccedilatildeo Em razatildeo

disso esses dois iniciadores foram excluiacutedos das anaacutelises posteriores Foram feitas tentativas para

a amplificaccedilatildeo por meio de PCR multiplex onde todos os 4 iniciadores foram usados ao mesmo

tempo Entretanto natildeo foi possiacutevel a amplificaccedilatildeo

Nas amostras de raiacutezes de Brachiaria sp e de cana-de-accediluacutecar inoculadas com FMAs em

casa-de-vegetaccedilatildeo os iniciadores tambeacutem amplificaram especificamente o DNA alvo (Figura

12) No entanto em amostras de raiacutezes ambientais do experimento com gramiacuteneas em pradaria

dos EUA foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de nested PCR para a amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S

usando os iniciadores grupo-especiacuteficos Sugere-se que esse fato seja decorrente da baixa

52

concentraccedilatildeo do DNA alvo em relaccedilatildeo ao DNA total das amostras Com exceccedilatildeo dos iniciadores

para Gigasporaceae todos os outros iniciadores amplificaram DNA de amostras de raiacutezes da

pradaria No entanto a concentraccedilatildeo de amplicons obtida com o iniciador ACAU220 foi baixa e

natildeo foi possiacutevel sua clonagem e sequenciamento Os produtos de PCR usando DNA das amostras

de raiacutezes de pradaria foram clonados e sequenciados para verificar a especificidade dos

iniciadores e determinar a estrutura da comunidade de FMAs Pela anaacutelise de similaridade e

filogeneacutetica os iniciadores GLOMA189 e GLOMA690 amplificaram especificamente o DNA de

Glomus grupo A em raiacutezes de pradaria (Figuras 14 e 15)

Figura 12 ndash Amplificaccedilatildeo por PCR do DNA de raiacutezes de plantas cultivadas em casa-de-vegetaccedilatildeo e inoculadas com

FMAs 1 Brachiaria sp inoculada com Acaulospora scrobiculata (Acaulosporaceae) 2 Brachiaria sp

inoculada com Gigaspora rosea (Gigasporaceae) 3 Brachiaria sp inoculada com Glomus clarum

(Glomus grupo A) 4 Brachiaria sp inoculada com Glomus etunicatum (Glomus grupo B) 5

Brachiaria sp inoculada com G rosea e Scutellospora heterogama 6 cana-de-accediluacutecar inoculada com

mistura de FMAs (G clarum Glomus intraradices G rosea Paraglomus sp Acaulospora sp) 7

cana-de-accediluacutecar natildeo-inoculada 8 Controle negativo da primeira reaccedilatildeo de PCR 9 Controle negativo da

segunda reaccedilatildeo de PCR 10 DNA de Glomus caledonium (Glomus grupo A) de vaso de multiplicaccedilatildeo

11 DNA de Acaulospora longula (Acaulosporaceae) de vaso de multiplicaccedilatildeo 12 DNA de

Scutellospora calospora (Gigasporaceae) de vaso de multiplicaccedilatildeo 13 DNA de Glomus claroideum

(Glomus grupo B) de vaso de multiplicaccedilatildeo M marcador molecular PCR markers (Promega) pb

tamanho em pares de base dos fragmentos do marcador molecular

Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53

Figura 13 ndash Amplificaccedilatildeo do gene rRNA 18S por PCR em soluccedilotildees contendo mistura de DNA natildeo-alvo para cada

iniciador Canaletas 1 ndash Iniciador ACAU220 e 2 ndash Iniciador ACAU469 especiacuteficos para

Acaulosporaceae em DNA de Glomus claroideum G caledonium Scutellospora calospora Agaricus

sp Saccharomyces sp Canaletas 3 ndash Iniciador GLOMB652 e 4 ndash Iniciador GLOMB673 especiacuteficos

para Glomus grupo B em DNA de Acaulospora longula G caledonium S calospora Agaricus sp

Saccharomyces sp Canaletas 5 ndash Iniciador GLOMA189 6 ndash Iniciador GLOMA348 e 7 ndash Iniciador

GLOMA690 especiacuteficos para Glomus grupo A em DNA de A longula G claroideum S calospora

Agaricus sp Saccharomyces sp Canaletas 8 ndash Iniciador GIGA202 e 9 - Iniciador GIGA615

especiacuteficos para Gigasporaceae em DNA de A longula G claroideum G caledonium Agaricus sp

Saccharomyces sp M ndash Marcador molecular PCR Markers (Promega) pb tamanho em pares de base

dos fragmentos do marcador molecular

pb

1000 750

500

300 150

50

54

Figura 14 ndash Relaccedilotildees filogeneacuteticas entre as sequecircncias do rDNA 18S obtidas de raiacutezes de raiacutezes de pradaria

utilizando o iniciador GLOMA189 e sequecircncias de FMAs determinadas usando neighbor joining

Nuacutemeros sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repeticcedilotildees da anaacutelise de bootstrap A barra

representa uma substituiccedilatildeo a cada 100 nucleotiacutedeos As sequecircncias de raiacutezes com adubaccedilatildeo

nitrogenada estatildeo grafadas em preto e negrito e das raiacutezes sem adubaccedilatildeo estatildeo grafadas em vermelho e

negrito

55






negrito

Dessa forma confirma-se a especificidade dos iniciadores GLOMA189 e GLOMA690

para amplificaccedilatildeo do grupo alvo Glomus grupo A No entanto os iniciadores GLOMB652

GLOMB673 e AM1 apresentaram vieacutes de especificidade amplificando apenas sequecircncias

relacionadas a Ascomycota segundo as anaacutelises por BLAST (dados natildeo mostrados) Esses

resultados corroboram os resultados obtidos por Jumpponen et al (2005) os quais amplificaram

as mesmas amostras de DNA utilizando os iniciadores NS31 e AM1 Nesse primeiro trabalho

verificou-se que todas as sequecircncias obtidas do referido gene eram relacionadas a Glomus grupo

56

A

Portanto na anaacutelise final apoacutes o sequecircnciamento dos amplicons de raiacutezes da pradaria os

iniciadores GLOMA189 e GLOM1690 foram confirmados como especiacuteficos e funcionais em

amostras ambientais Os iniciadores GLOMB652 GLOMB673 GIGA202 e GIGA615 foram

funcionais com amostras de raiacutezes inoculadas com um uacutenico FMA em condiccedilotildees de casa-de-

vegetaccedilatildeo mas em amostras ambientais os iniciadores GLOMB652 e GLOMB673 foram

inespeciacuteficos e os iniciadores GIGA202 e GIGA615 natildeo amplificaram o DNA Como natildeo foi

possiacutevel a clonagem e sequenciamento do fragmento amplificado com o iniciador ACAU220 natildeo

se pode afirmar se esse iniciador eacute funcional ou natildeo



2331 Atributos quiacutemicos do solo

Dos atributos quiacutemicos do solo avaliados os valores de pH foram os que apresentaram

diferenccedilas significativas entre os manejos de colheita avaliados enquanto a soma de bases (SB) e

saturaccedilatildeo por Mg foram afetados pela interaccedilatildeo dos fatores manejo e variedade de cana-de-accediluacutecar

(Tabela 6) O solo sob o manejo SEM QUEIMA apresentou valor de pH ligeiramente maior (59

versus 58) (Tabela 7) Com relaccedilatildeo agrave SB o solo sob a variedade RB72454 SEM QUEIMA e sob

a variedade SP801842 COM QUEIMA apresentaram valores 113 e 111 vezes maiores

respectivamente em relaccedilatildeo ao solo sob RB72454 COM QUEIMA (Tabela 8) O solo sob a

variedade SP801842 SEM QUEIMA apresentou valor de Mg 113 vezes maior em relaccedilatildeo ao

solo sob SP813250 SEM QUEIMA

Apesar de maior aporte de material vegetal ao solo os teores de carbono orgacircnico no solo

natildeo diferiram entre os tratamentos sob os dois manejos de colheita Tal resultado pode ser devido

ao pouco tempo decorrido apoacutes a colheita sendo que a palhada ainda estava sobre o solo na

eacutepoca de amostragem Provavelmente parte do carbono natildeo foi incorporado agrave mateacuteria orgacircnica

do solo mesmo 84 dias apoacutes a colheita Nenhuma das 36 amostras apresentou Al trocaacutevel Isso se

deve ao fato de o pH estar proacuteximo de 60 onde todo o Al se precipita e tambeacutem aos altos teores

das bases Ca Mg e K sendo que a saturaccedilatildeo da CTC por esses elementos variou de 68 a 72

57

Tabela 6 - Teste de F na anaacutelise da variacircncia dos atributos quiacutemicos do solo para os

fatores Manejo Variedade e Interaccedilatildeo Manejo x Variedade

Variaacuteveis Manejo Variedade ManejoVariedade

Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns

C orgacircnico (gkg-1

) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns

Saturaccedilatildeo por bases (V) ns ns ns

Saturaccedilatildeo por Ca () ns ns ns

Saturaccedilatildeo por Mg () ns ns

Saturaccedilatildeo por K () ns ns ns

Saturaccedilatildeo por Na () ns ns ns

ns ndash natildeo significativo - p lt 005 - p lt 001

Tabela 7 - Valores meacutedios das variaacuteveis analisadas sob os manejos SEM

QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA (CQ) preacutevia agrave colheita

Variaacuteveis SQ CQ

Solo

pH 59 plusmn 022 A 58 plusmn 021 B

H+Al (mmolckg-1

) 122 plusmn 10 A 128 plusmn 100 A

Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1


Saturaccedilatildeo por bases (V) 710 plusmn 276 A 694 plusmn 328 A

Saturaccedilatildeo por Ca () 436 plusmn 187 A 428 plusmn 183 A

Saturaccedilatildeo por Mg () 178 plusmn 239 A 176 plusmn 355 A

Saturaccedilatildeo por K () 96 plusmn 158 A 90 plusmn 116 A

Os valores correspondem agrave Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo (seis repeticcedilotildees)

Letras iguais dentro da linha natildeo diferem significativamente pelo teste de Tukey-Krumer (Ple005)

SB - Soma das bases Ca+ Mg

+ e K

+

58

Tabela 8 - Valores meacutedios dos atributos quiacutemicos do solo na interaccedilatildeo dos fatores Manejo de Colheita e Variedade

Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454

pH 59 plusmn 0 23 a 60 plusmn 017 a 60 plusmn 025 a 58 plusmn 015 a 57 plusmn 023 a 58 plusmn 026 a

H+Al (mmolckg-1

) 128 plusmn 117 a 117plusmn 082 a 122 plusmn 075 a 125 plusmn 055 a 130 plusmn 126 a 128 plusmn 117 a

Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1

) 292 plusmn 147ab 297plusmn 121ab 317 plusmn 372 a 300 plusmn 415ab 312 plusmn 232 a 280 plusmn 477 b

CTC (mmolckg-1


Saturaccedilatildeo por bases (V) 694 plusmn 326 a 715plusmn 127 a 722 plusmn 291 a 700 plusmn 320 a 701 plusmn 323 a 681 plusmn 360 a

Saturaccedilatildeo por Ca () 433 plusmn 185 a 435 plusmn 179 a 440 plusmn 202 a 429 plusmn 183 a 445 plusmn 199 a 410 plusmn 195 a

Saturaccedilatildeo por Mg () 167 plusmn 237 b 189 plusmn 172 a 178 plusmn 325ab 180 plusmn 308ab 170 plusmn 353ab 179 plusmn 368ab

Saturaccedilatildeo por K () 94 plusmn 161 a 89 plusmn 101 a 104 plusmn 131 a 91 plusmn 063 a 87 plusmn 103 a 93 plusmn 153 a




+ e K

+

59

A palhada deixada sobre o solo em manejo de colheita de cana-de-accediluacutecar sem queima

preacutevia pode influenciar os atributos fiacutesicos quiacutemicos e bioloacutegicos do solo No entanto os

trabalhos sobre alteraccedilatildeo dos atributos quiacutemicos em funccedilatildeo apenas da palhada aplicada no solo

satildeo escarccedilos na literatura Por isso essa aacuterea de pesquisa carece de estudos mais aprofundados

para se conhecer os esfeitos da aplicaccedilatildeo de palhada sobre os processos bioquiacutemicos e fiacutesicos no

solo

2332 Produtividade da cana-de-accediluacutecar

O uso ou natildeo da praacutetica da queima previamente agrave colheita da cana-de-accediluacutecar pode mudar

o equiliacutebrio do agrossistema por afetar entre outras coisas a estrutura da comunidade

microbiana afetando alguns processos bioquiacutemicos importantes O depoacutesito de palha sobre o solo

pode tambeacutem interferir na produtividade da cana-de-accediluacutecar (RESENDE et al 2006) No entanto

no presente estudo a produtividade da cana-de-accediluacutecar natildeo diferiu entre os dois manejos de

colheita entre as variedades ou entre as interaccedilotildees dos fatores manejo e variedade (pgt005) No

primeiro corte a cana-de-accediluacutecar colhida com manejo SEM QUEIMA apresentou uma

produtividade de 1274 Mgha-1

enquanto que a colhida COM QUEIMA preacutevia apresentou uma


(Tabela 9)

Tabela 9 - Produtividade em Mgha-1

das trecircs variedades de cana-de-accediluacutecar sob

os dois manejos de colheita

Variedade Manejo

Meacutedia SEM QUEIMA COM QUEIMA

SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120

Os dados representam meacutedia de trecircs repeticcedilotildees desvio padratildeo da meacutedia

Apesar de maior aporte de material orgacircnico na forma de palhada o qual pode variar de 7

a 15 Mgha-1

ano-1

na colheita mecanizada (CAMPOS 2003) isso natildeo foi suficiente para causar

60

mudanccedilas no sistema de modo a aumentar a produccedilatildeo pelo menos no periacuteodo avaliado Tal

resultado pode ser devido ao pouco tempo com manejo SEM QUEIMA tendo havido apenas

uma colheita apoacutes implantaccedilatildeo do experimento e desse modo havendo pouca influecircncia da

palhada que foi depositada sobre o solo Isso eacute demonstrado pela ausecircncia de diferenccedila no teor de

carbono orgacircnico do solo entre o cultivo COM QUEIMA e o SEM QUEIMA preacutevia da cana-de-

accediluacutecar (Tabela7) Aleacutem do teor de carbono a maioria dos atributos quiacutemicos tambeacutem natildeo

respondeu com os tratamentos de manejo de colheita Mudanccedilas de produtividade tambeacutem natildeo

foram encontradas no primeiro corte da cana-de-accediluacutecar em um ensaio de longa duraccedilatildeo em que

Resende et al (2006) mostram que aumentos na produtividade de cana-de-accediluacutecar COM

QUEIMA em relaccedilatildeo agrave SEM QUEIMA apareceram somente na terceira colheita de um ciclo de

produccedilatildeo de sete cortes e a partir da segunda colheita no segundo ciclo de seis cortes Segundo os

autores as diferenccedilas de produtividade dos dois manejos foram mais fortes no segundo ciclo

indicando que essas diferenccedilas devem-se ao efeito cumulativo do aporte de material orgacircnico no

solo ao longo dos anos a partir do primeiro ciclo

2333 Fungos micorriacutezicos arbusculares no solo

O nuacutemero de esporos no solo rizosfeacuterico nos diferentes tratamentos eacute apresentado na

Figura 16 Natildeo houve diferenccedilas significativas (Tukey p gt 005) na densidade de esporos entre

os dois manejos de colheita entre as variedades de cana-de-accediluacutecar ou na interaccedilatildeo dos fatores

manejo e variedade O nuacutemero meacutedio de esporos por 50 g de solo variou de 23 no tratamento da

variedade RB72454 COM QUEIMA a 34 no tratamento da variedade SP813250 SEM QUEIMA

O nuacutemero meacutedio de esporos estaacute dentro da ampla faixa (19 a 815 esporos50ml-1

) encontrada

por Reis Paula e Doumlbereiner (1999) em um estudo sobre comunidades de FMAs na forma de

esporos no solo sob diversas lavouras de cana-de-accediluacutecar

61

Figura 16 ndash Nuacutemero de esporos de FMAs no solo sob as variedades SP813250 SP801842 e RB72454 de cana-de-

accediluacutecar sob manejo SEM QUEIMA (barras cinzas) e COM QUEIMA (barras pretas) Tratamentos com

mesma letra natildeo diferiram pelo teste de Tukey (p gt 005)

No presente trabalho foram observados 33 morfotipos de FMAs no solo rizosfeacuterico de

cana-de-accediluacutecar sendo 26 no manejo SEM QUEIMA e 24 no manejo COM QUEIMA Destes 18

morfotipos satildeo comuns aos dois tratamentos Dentre os esporos foram recuperadas espeacutecies dos

gecircneros Acaulospora Archaeospora Gigaspora Glomus (inclusive Glomus grupo A ndash Glomus

mosseae e Glomus clarum e Glomus grupo B ndash Glomus lamellosum) Paraglomus e

Scutellospora (Figura 17) Dentre o gecircnero Archaeospora houve apenas esporos de A Trappei

em uma amostra de solo sob a variedade RB72454 no tratamento SEM QUEIMA O tratamento

com a variedade SP813250 SEM QUEIMA foi o uacutenico a natildeo apresentar espeacutecies do gecircnero

Paraglomus Alguns dos esporos satildeo mostrados na Figura 18 Do filo Glomeromycota natildeo foram

encontrados esporos dos gecircneros Ambispora Diversispora Entrophospora Intraspora

Kuklospora e Pacispora

O nuacutemero de 33 espeacutecies encontradas sob cana-de-accediluacutecar estaacute dentro da faixa encontrada

em ecossistemas naturais ou manejados de acordo com os trabalhos levantados por Douds e

Millner (1999) Poreacutem a maior abrangecircncia de espeacutecies vegetais pode resultar em maior nuacutemero

de espeacutecies de FMAs no solo Blaszkowski (1994) recuperou 34 espeacutecies de FMAs em

ecossistema com 20 espeacutecies de plantas hospedeiras Andreola (1982) por outro lado recuperou

7 espeacutecies de FMAs em canaviais no municiacutepio de Araras SP Em outro estudo Reis Paula e

Doumlbereiner (1999) encontraram 18 espeacutecie em 35 amostras coletadas sob 14 variedades de cana-

Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62

de-accediluacutecar em trecircs diferentes localidades Andreola (1982) recuperou 7 espeacutecies em cana-de-

accediluacutecar de um ensaio com tratamentos de aplicaccedilatildeo de vinhaccedila e adubaccedilatildeo nitrogenada e

fosfatada Portanto as espeacutecies recuperadas no presente trabalho podem indicar uma alta riqueza

de espeacutecies de FMAs no solo sob cana-de-accediluacutecar do experimento avaliado

Figura 17 ndash Nuacutemero de morfotipos de FMAs por gecircnero recuperados de solo sob trecircs variedades de cana-de-accediluacutecar

(SP813250 SP801842 e RB72454) com manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia

As espeacutecies de FMAs identificadas na forma de esporos e a frequecircncia relativa de

ocorrecircncia nas amostras de solo satildeo mostradas na Tabela 10 As espeacutecies exclusivas do manejo

SEM QUEIMA satildeo Acaulospora sp 3 Acaulospora sp 6 Glomus clarum Glomus lamellosum

Glomus mosseae Glomus sp 10 Scutellospora sp e S verrucosa Jaacute as espeacutecies que ocorrem

apenas no manejo COM QUEIMA satildeo Acaulospora sp 2 Acaulospora sp 5 Acaulospora sp 7

Glomus coremioides Glomus sp 8 Glomus sp 9 e Paraglomus occultum As espeacutecies com

maior meacutedia de frequecircncia (gt 50 ) nas amostras de solo sob a cana-de-accediluacutecar em ordem

decrescente satildeo S pellucida A morrowiae Glomus sp 1 A scrobiculata G macrocarpum e

Glomus sp 6 Pode-se notar que as espeacutecies com frequecircncias maiores do que 50 nas amostras

de cana-de-accediluacutecar tambeacutem apresentam as maiores meacutedias de densidades de esporos (Tabela 11)

Satildeo elas em ordem decrescente Glomus sp 6 Glomus macrocarpum Glomus sp1 S pellucida

A scrobiculata e A morrowiae Essas 6 espeacutecies dominam a comunidade pois representam 79

Variedade

Nuacutemero de morfotipos

63

dos esporos recuperados do solo sob cana-de-accediluacutecar Assim essas espeacutecies mais abundantes e

frequentes nas amostas indicam que haacute a dominacircncia de poucas espeacutecies na comunidade de

esporos de FMAs no solo

No levantamento de Reis Paula e Doumlbereiner (1999) foram encontradas espeacutecies dos

gecircneros Acaulospora Entrophospora Gigaspora Glomus Paraglomus e Scutellospora sendo

que as espeacutecies predominantes nas trecircs localidades estudadas foram Acaulospora sp 1

(denominaccedilatildeo dos autores) S heterogama Glomus etunicatum Paraglomus occultum e

Gigaspora margarita Provavelmente os diferentes histoacutericos e caracteriacutesticas das aacutereas onde as

35 amostras foram coletadas por Reis Paula e Doumlbereiner (1999) influenciaram na estrutura da

comunidade de FMAs na forma de esporos a qual diferiu daquela reportada no presente trabalho

Eacute provaacutevel que a cana-de-accediluacutecar natildeo promova a seleccedilatildeo de espeacutecies de FMAs no solo jaacute que as

estruturas de comunidades de FMAs nos diferentes solos sob cana-de-accediluacutecar natildeo estatildeo

relacionadas No entanto tanto no presente estudo como no de Reis Paula e Doumlbereiner (1999) e

de Andreola (1982) haacute o predomiacutenio de espeacutecies do gecircnero Glomus dentre os gecircneros de FMAs

econtrados nas amostras

64

Tabela 10 ndash Frequecircncia de ocorrecircncia () de espeacutecies de FMAs em amostras de solo coletadas sob trecircs variedades de

cana-de-accediluacutecar (SP813250 SP801842 e RB72454) com manejo SEM QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA

preacutevia (CQ)

SQ CQ

Espeacutecies SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454 Meacutedia1

Acaulpospora mellea 25 66 25 40 - 25 302

Acaulospora morrowiae 25 66 50 100 66 100 678

Acaulospora scrobiculata 75 33 50 80 33 75 577

Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193

Acaulospora sp 2 - - - - 33 - 55

Acaulospora sp 3 - - 25 - - - 42

Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130



Acaulospora sp 7 - - - - - 25 42

Archaeospora trappei - - 25 - - - 42

Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335

Glomus clarum 25 - - - - - 42

Glomus coremioides - - - 20 - - 33

Glomus lamellosum - - 25 - - - 42

Glomus macrocarpum 50 33 50 60 66 75 557

Glomus mosseae - 33 - - - - 55

Glomus sinuosum 25 - - 40 - 25 150

Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42

Paraglomus laccatum - 33 25 - 33 50 235

Paraglomus occultum - - - 20 - - 33

Scutellospora pellucida 75 100 25 100 66 50 693

Scutellospora sp - 33 - - - - 55

Scutellospora verrucosa 25 - - - - - 42

Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818

1 ndash Meacutedia das frequecircncias de ocorrecircncia de espeacutecies de FMAs

65

Tabela 11 ndash Nuacutemero de esporos de FMAs em solo sob as variedades SP813250 SP801842 e RB72454 com manejo

SEM QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA preacutevia (CQ)

SQ CQ

Espeacutecies SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454 Meacutedia




Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004






Dados representam as meacutedias (seis repeticcedilotildees) do nuacutemero de esporos por 50 g de solo

- Meacutedia do nuacutemero de esporocarpos por 50 g de solo

66

Figura 18 ndash Esporos de FMAs coletados sob cana-de-accediluacutecar (A) Acaulospora scrobiculata (B) Glomus

macrocarpum (C) Scutellospora pellucida (D) Glomus sp 6 (E) Acaulospora morrowiae

A riqueza observada as estimativas de riqueza de espeacutecies determinadas pelos meacutetodos

de ACE (CHAO LEE 1992) e CHAO-1 (CHAO 1984) e os iacutendices de diversidade natildeo

diferiram entre os manejos de colheita entre as variedades de cana-de-accediluacutecar ou na interaccedilatildeo dos

fatores manejo e variedade (Tabela 12) O nuacutemero de espeacutecies dentro de cada tratamento da

interaccedilatildeo manejo e variedade variou de aproximadamente 6 a 8 e a estimativa meacutedia de espeacutecies

por tratamento foi de aproximadamente 12 (ACE) e 10 (CHAO-1) Considerando-se todas as

amostras a cobertura de amostragem foi de aproximadamente 98

Pela anaacutelise de RDA as variaacuteveis CO P H+Al Bases CTC e Mg foram escolhidas

com o uso do Forward Selection do programa ldquoCanoco fo Windows 45rdquo (Figura 19) Essas

variaacuteveis explicam significativamente e se relacionam agrave variabilidade dos dados pelos teste de

permutaccedilatildeo de Monte-Carlo As relaccedilotildees satildeo significativas entre as espeacutecies de FMAs e as

variaacuteveis quiacutemicas do solo no primeiro eixo canocircnico (p = 0038) e em todos os eixos canocircnicos

(p = 0034) Os dois primeiros eixos explicam 169 da variabilidade dos dados sendo 101

no primeiro eixo e 68 no segundo As variaacuteveis quiacutemicas do solo explicam 42 da

variabilidade sendo que 259 desse valor eacute explicado nos dois primeiros eixos Outros autores

encontraram valores de correlaccedilotildees significativos abaixo de 060 entre variaacuteveis do solo e as

C B

A

D

E

67

espeacutecies de FMAs na forma de esporos (CUENCA MENESES 1996 CARRENHO et al

2001) sugerindo que os atributos do solo afetam a distribuiccedilatildeo de espeacutecies de FMAs na forma de

esporos no solo poreacutem em menor magnitude do que outros fatores desconhecidos

A RDA natildeo indicou separaccedilatildeo das amostras de acordo com o manejo de colheita ou com

variedades de cana-de-accediluacutecar Pelas variaacuteveis do solo verifica-se que a maioria das espeacutecies

estatildeo relacionadas positivamente com o teor de carbono orgacircnico (CO) ou com a saturaccedilatildeo da

CTC por bases As espeacutecies relacionadas positivamente com a saturaccedilatildeo por bases tecircm relaccedilatildeo

negativa com o teor de H+Al o que eacute coerente uma vez que quanto maior o teor de bases na

CTC menor a quantidade de H e Al trocaacuteveis A relaccedilatildeo positiva de apenas algumas espeacutecies de

FMAs com o teor de P eacute devido provavelmente pelo fato de que altas concentraccedilotildees desse

elemento inibem a colonizaccedilatildeo micorriacutezica e posteriormente diminuiriam a esporulaccedilatildeo das

outras espeacutecies natildeo relacionadas positivamente com o teor de P Dentre as espeacutecies mais

abundantes e frequentes (Tabelas 10 e 11) Glomus sp 6 Glomus sp 1 e S pellucida satildeo

relacionadas positivamente agrave saturaccedilatildeo de bases G macrocarpum e A morrowiae estatildeo

relacionadas positivamente com o teor de P mas negativamente com a saturaccedilatildeo de bases e teor

de CO e A scrobiculata estaacute relacionada positivamente com o teor de CO Assim a RDA mostra

que haacute relaccedilatildeo da variabilidade das espeacutecies com as variaacuteveis do solo mas natildeo permite a

separaccedilatildeo de amostras de acordo com os tratamentos

68

Tabela 12 ndash Meacutedia da riqueza observada estimativas de nuacutemero de espeacutecies iacutendices de diversidade e cobertura de amostragem

da comunidade de FMAs calculadas a partir dos esporos coletados e identificados sob as variedades SP813250

SP801842 e RB72454 com manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia

Iacutendices de diversidade Estimativa de riquezas de UTOs

Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983

Os valores correspondem agrave Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo (seis repeticcedilotildees) a ndash Riqueza de espeacutecies de FMAs na forma de esporos

b ndash Estimador de maacutexima semelhanccedila

c ndash Reciacuteproco do iacutendice de Simpson

d ndash Equitabilidade de

Pielou e -

Estimativa de Cobertura da Amostragem

f ndash Dados representam os valores obtidos de todas as amostras

69

Figura 19 ndash Triplot de espeacutecies de FMAs amostras e variaacuteveis do solo sob cana-de-accediluacutecar da Anaacutelise de

Redundacircncia (RDA) Realizou-se a anaacutelise com Forward Selection selecionando teor de C orgacircnico

no solo (CO) H+Al saturaccedilatildeo de bases P CTC e toer de Mg em amostras sob cana-de-accediluacutecar com

colheita SEM QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia (P = 0038 para o primeiro eixo canocircnico P = 0034

para a soma dos eixos segundo o teste de Monte Carlo)

Ao contraacuterio do que foi observado neste trabalho Reis Paula e Doumlbereiner (1999)

verificaram que a aacuterea com manejo SEM QUEIMA da cana-de-accediluacutecar apresentou maior riqueza

de espeacutecies de FMAs no solo No entanto esses autores compararam lavouras SEM QUEIMA e

COM QUEIMA com diferentes histoacutericos o que dificulta a comparaccedilatildeo direta das amostras

Por fim esse eacute um dos primeiros levantamentos de FMAs em solo sob cana-de-accediluacutecar a

campo no Brasil e os dados aqui apresentados serviratildeo como base de comparaccedilatildeo para futuros

estudos sobre a contribuiccedilatildeo das MAs para a cultura Os indicadores de diversidade de FMAs na

forma de esporos densidade de esporos riqueza diversidade e estimativa de nuacutemero de espeacutecies

natildeo apresentam diferenccedilas entre os manejos de colheita entre as variedades ou na interaccedilatildeo dos

fatores manejo e variedade A RDA utilizada para a ordenaccedilatildeo dos dados foi significativa

70

poreacutem natildeo permitiu qualquer discriminaccedilatildeo com base nos tratamentos O pouco tempo decorrido

desde a implantaccedilatildeo da cultura ateacute a avaliaccedilatildeo das amostras de solo (20 meses) pode ter

contribuiacutedo para que essas diferenccedilas na comunidade de FMAs na forma de esporos entre os

tratamentos natildeo fosse observada Como alguns esporos podem ficar em estado de dormecircncia

(TOMMERUP 1983 GEMMA KOSKE 1988) parte das espeacutecies de FMAs na forma de

esporos presentes nas amostras pode ser reflexo dos cultivos anteriores agrave instalaccedilatildeo do

experimento Assim novas amostragens devem ser feitas apoacutes ter passado um periacuteodo de tempo

maior desde a implantaccedilatildeo do experimento pois eacute possiacutevel que efeitos significativos da alteraccedilatildeo

do manejo possam ser observados somente a longo prazo


Todas as amostras de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar analisadas apresentaram colonizaccedilatildeo

micorriacutezica arbuscular Foi possiacutevel visualizar e identificar vaacuterias estruturas de FMAs incluindo

hifa extrarradicular apressoacuterio nas ceacutelulas da epiderme hifas intercelulares e intracelulares

arbuacutesculos e hifas intracelulares enoveladas (pelototildees) (Figura 20) A presenccedila de arbuacutesculos

tiacutepicos e de pelototildees foram observados simultaneamente na mesma amostra tanto em raiacutezes sob

manejo SEM QUEIMA como COM QUEIMA

A taxa de colonizaccedilatildeo variou de 30 a 52 e natildeo foi significativamente diferente entre

as variedades mas variou significativamente (p lt 005) entre os manejos SEM QUEIMA e COM

QUEIMA preacutevia agrave colheita (Tabela 13) As raiacutezes de plantas sob manejo SEM QUEIMA

apresentaram as maiores taxas de colonizaccedilatildeo A maior colonizaccedilatildeo micorriacutezica pode ser devido

ao maior teor de umidade no solo assegurada pela quantidade de palhada depositada apoacutes a

colheita Como visto em outros trabalhos a umidade estaacute positivamente correlacionada com a

colonizaccedilatildeo intrarradicular (HE MOURATOV STEINBERG 2002 LINGFEI ANNA

ZHIWEI 2005)

71

Figura 20 - Colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular em cana-de-accediluacutecar (A a H) ap ndash apressoacuterio hi ndash hifa intercelular

pe ndash ponto de entrada de hifa na raiz ar ndash arbuacutesculo en ndash hifa enovelada ve ndash vesiacutecula

A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72

Tabela 13 - Colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular () em raiacutezes de cana-de-

accediluacutecar sob manejo SEM QUEIMA preacutevia e COM QUEIMA

preacutevia agrave colheita

Manejo

Variedade SEM QUEIMA COM QUEIMA

SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB


Meacutedias seguidas de mesma letra maiuacutescula na linha e minuacutescula na coluna natildeo diferem

estatisticamente pelo teste de Tukey (p gt 005)

A colonizaccedilatildeo micorriacutezica eacute pouca estudada em cana-de-accediluacutecar e poucos trabalhos sobre o

assunto foram publicados Kelly et al (2001) verificaram que plantas de cana-de-accediluacutecar

cultivadas em casa-de-vegetaccedilatildeo possuem taxas de ateacute 60 de colonizaccedilatildeo em baixos niacuteveis de

foacutesforo no solo (entre 27 e 82 mg Pkg-1

) No entanto a micorrizaccedilatildeo natildeo trouxe ganhos na

massa seca das plantas Takahashi (2005) e Souza (2006) estudaram a colonizaccedilatildeo micorriacutezica

intrarradicular em mudas micropropagadas de cana-de-accediluacutecar inoculadas e crescidas em casa-de-

vegetaccedilatildeo em condiccedilotildees de baixo teor de P (20 mgKg-1

) e alto teor (200 mgKg-1

) no solo A

taxa de colonizaccedilatildeo intrarradicular variou de 10 a 34 nos tratamentos com alto teor de P e de

40 a 60 nos tratamentos com baixo teor de P sendo que Takahashi (2005) natildeo observou

alteraccedilatildeo da produccedilatildeo de biomassa das plantas inoculadas em relaccedilatildeo agraves natildeo-inoculadas

De acordo com a anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson e RDA das espeacutecies de esporos no solo

natildeo haacute correlaccedilatildeo da taxa de colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular em cana-de-accediluacutecar e a

distribuiccedilatildeo de esporos no solo Poreacutem uma vez que a comunidade de FMAs medida pela

ocorrecircncia densidade e diversidade de esporos no solo natildeo apresentou diferenccedilas entre os

manejos apoacutes 20 meses de implantaccedilatildeo do experimento a colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular a

qual foi diferente entre os manejos e variedades pode ser um paracircmetro mais sensiacutevel agraves

alteraccedilotildees que ocorrem no ambiente Assim a colonizaccedilatildeo micorriacutezica arbuscular poderia ser

utilizada como um indicador de mudanccedilas ambientais

73



Da biblioteca de clones dos fragmentos do gene rRNA 18S amplificados com o par de

iniciadores NS7 e F1Ra de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar sob manejo SEM QUEIMA e COM

QUEIMA preacutevia agrave colheita foram sequenciados 128 clones das amostras Das sequecircncias obtidas

duas do tratamento SEM QUEIMA foram consideradas quimeacutericas e excluiacutedas das demais

anaacutelises A comparaccedilatildeo por BLAST das sequecircncias obtidas com sequecircncias conhecidas (Tabela

14) e anaacutelise filogeneacutetica (Figura 21) possibilitam a afiliaccedilatildeo das mesmas ao reino Fungi Todas

as sequecircncias obtidas de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar do tratamento COM QUEIMA e a maioria do

tratamento SEM QUEIMA satildeo representadas por fungos do Filo Ascomycota Em raiacutezes do

tratamento sob manejo SEM QUEIMA 4 sequecircncias (87 ) pertencem ao filo Zygomicota

Nenhum dos 126 clones apresentou similaridade elevada com sequecircncias de FMAs apesar de as

amostras apresentarem colonizaccedilatildeo micorriacutezica intrarradicular consideraacutevel

As sequecircncias relacionadas agrave Phoma sp apresentam dominacircncia tanto na biblioteca de

raiacutezes provenientes de manejo SEM QUEIMA (681 das sequecircncias) como COM QUEIMA

(802 das sequecircncias) Depois dessas sequecircncias as maiores frequecircncias observadas satildeo de

sequecircncias relacionadas agrave Leptosphaeria (106 ) e agrave Pleosporales (43 ) em manejo SEM

QUEIMA e relacionadas agrave Fusarium (79 ) em manejo COM QUEIMA Membros das classes

Eurotiomycetes e Sordariomycetes foram detectados apenas em raiacutezes do tratamento sob manejo

COM QUEIMA (clones B Scane D0408 B Scane E0909 e B Scane B0703) enquanto que os

Zygomycetes (clones UB Scane C1105 e UB Scane G0814) foram detectados somente em raiacutezes

do tratamento sob manejo SEM QUEIMA Dos 13 acessos com maior similaridade agraves sequecircncias

obtidas determinada utilizando-se o BLAST apenas trecircs (N quadriseptata Phoma sp e

Pleosporales sp) foram comuns agraves duas bibliotecas (Tabela 14)

As estimativas de riqueza os iacutendices de diversidade de UTOs e a estimativa de cobertura

de amostragem satildeo apresentados na Tabela 15 O nuacutemero de UTOs detectadas foi de 10 para

cana-de-accediluacutecar do tratamento sob manejo SEM QUEIMA e 11 para a amostra do tratamento sob

manejo COM QUEIMA Natildeo houve diferenccedila significativa entre as estimativas de riqueza e

iacutendices de diversidade de UTOs dos dois sistemas de manejos de colheita A estimativa de

riqueza de UTOs relacionadas agrave raiacutezes foi de 18 e 34 (segundo os iacutendices ACE-1 e Chao1

74

respectivamente) para o manejo SEM QUEIMA e de 23 e 51 para o manejo COM QUEIMA

preacutevia agrave colheita Apesar de natildeo apresentar diferenccedilas de riqueza e de diversidade de UTOs entre

os dois manejos a comparaccedilatildeo de curvas de cobertura homoacuteloga e heteroacuteloga utilizando o

webLIBSHUFF mostrou que as comunidades fuacutengicas das raiacutezes de cana-de-accediluacutecar dos dois

tratamentos satildeo significativamente diferentes (p lt 005) (Figura 22) Para as duas bibliotecas de

clones o tamanho da amostra analisada foi suficiente para cobrir a maioria dos grupos

filogeneacuteticos A taxa de cobertura homoacuteloga foi aproximadamente 82 em Distacircncias

Evolutivas maiores do que 001 que eacute o valor adotado para definir espeacutecie em estudos com

fungos (WALDROP et al 2006 JUMPPONEN JOHNSON 2005 ANDERSON et al 2003)

Tabela 14 ndash Similaridade das sequecircncias dos clones do gene rRNA 18s obtidas por amplificaccedilatildeo do DNA total

de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar colonizadas por FMAs e utilizando os iniciadores NS7 e F1Ra em

relaccedilatildeo a sequecircncias de bancos de dados puacuteblicos

Manejo Clone Sequecircncia mais similar [Acesso] Similaridade Freq

(1)

SEM QUEIMA

UB SCane B0103 Candida xylopsoci [AY4881281] 99 21

UB SCane D0707 Cladosporium cladosporioides [DQ6780041] 100 21

UB SCane D0208 Heteromita globosa [AY4960431] 99 21

UB SCane F0911 Leptosphaeria korrae [AF4866261] 100 106

UB SCane G0814 Mucor circinelloides f lusitanicus [AF1134271] 99 64

UB SCane C1105 Mucor circinelloides f lusitanicus [AF1134271] 99 21

UB SCane D0907 Neophaeosphaeria quadriseptata [AF2508261] 99 21

UB SCane H0915 Phoma sp [AB2528691] 99 681

UB SCane E1010 Pleosporales sp [AB1956311] 99 43

COM QUEIMA

B SCane A0101 Debaryomyces mycophilus [AF4400171] 98 13

B SCane D1208 Debaryomyces mycophilus [AF4400171] 98 13

B SCane D0408 Eupenicillium javanicum [U212981] 100 13

B SCane B0703 Fusarium sp [AB2454421] 99 79

B SCane B1204 Galactomyces geotrichum [U009741] 100 13

B SCane C0705 Neophaeosphaeria quadriseptata [AF2508261] 99 13

B SCane A0202 Phoma sp [AB2528691] 98 776


B SCane E1010 Pleosporales sp [AB1956311] 99 13

B SCane E0909 Talaromyces flavus [M832621] 99 26

As sequecircncias foram comparadas usando-se o BLAST Cada clone representa um dos grupos formados por

UPGMA A coluna de frequecircncia se refere agrave proporccedilatildeo dos clones do grupo em cada biblioteca (1)

Frequecircncia de sequecircncias representadas pelo clone em cada um dos manejos (2)

Classe ldquoDothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedisrdquo

75

Figura 21 ndash Relaccedilotildees filogeneacuteticas entre a sequecircncias do gene rRNA 18S obtidas de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar com o

par de iniciadores NS7 e F1Ra e sequecircncias de fungos determinadas usando-se neighbor-joining

Nuacutemeros sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repeticcedilotildees da anaacutelise de bootstrap Cada clone

representa um dos grupos formados por UPGMA Os valores entre parecircnteses representam a

percentagem do clone em cada biblioteca A barra representa uma substituiccedilatildeo a cada 100 nucleotiacutedeos

Clones grafados em negrito em preto satildeo referentes agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar colhida SEM QUEIMA

enquanto os grafados em vermelho se referem agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar COM QUEIMA preacutevia agrave

colheita

- Classe ldquoDothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedisrdquo

76

Tabela 15 - Estimativas de UTOs iacutendices de diversidade e cobertura de amostragem determinadas com base no sequenciamento de

clones do gene rRNA 18S de fungos associados a raiacutezes de cana-de-accediluacutecar com ou SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita

obtidos utilizando-se o par de iniciadores NS7 e F1Ra

Comunidade NS NU Estimativa de riquezas de UTOs Iacutendices de diversidade ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908

Valores entre parecircnteses representam o intervalo com 95 de confianccedila NS ndash nuacutemero de sequecircncias NU ndash nuacutemero de UTOs a

Estimador de maacutexima

semelhanccedila b

ndash Reciacuteproco do iacutendice de Simpson c ndash Estimativa de Cobertura da Amostragem Distacircncia evolutiva usada para as estimativas foi 001

77

Figura 22 - Anaacutelise de LIBSHUFF de comunidade de fungos associados agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar sob dois manejos de colheita quando empregado o par de

iniciadores NS7 e F1Ra A manejo SEM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo COM QUEIMA B manejo COM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo SEM

QUEIMA As comunidades satildeo diferentes significativamente com P lt 005 A distribuiccedilatildeo de (Cy-Cyx)2 como uma funccedilatildeo de D indica a diferenccedila

entre as duas comunidades

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06

Distacircncia Evolutiva (D)

Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78



Das bibliotecas de clones do gene rRNA 18S de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar SEM QUEIMA

e COM QUEIMA preacutevia agrave colheita foram sequenciados 47 e 42 clones respectivamente Das

sequecircncias obtidas 9 foram consideradas quimeras com base nas anaacutelises feitas utilizando o

Chimera Check e BLAST Assim para as anaacutelises posteriores foram utilizadas 41 e 39

sequecircncias dos tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA respectivamente

Todas as sequecircncias foram mais similares ao Filo Ascomycota e natildeo foi possiacutevel

discriminar espeacutecies a partir dessas sequecircncias de acordo com as comparaccedilotildees feitas utilizando-

se o BLAST (Tabela 16) e a anaacutelise filogeneacutetica (Figura 23) Em uma das clades haacute o

agrupamento de diferentes classes de fungos uma sequecircncia de um clone do manejo COM

QUEIMA (B AM1 D1107) duas sequecircncias de Phoma (Ascomycota Mitospoacuterico) e uma

sequecircncia de Didymella (Dothideomycetes) Esses resultados mostram que a regiatildeo sequenciada

natildeo eacute informativa filogeneticamente Nenhuma sequecircncia apresentou alta similaridade com

sequecircncias de FMAs apesar do iniciador AM1 ser supostamente especiacutefico para essse grupo de

fungos Assim mesmo as riquezas de UTOs e os iacutendices de diversidade foram estimados (Tabela

17) Da mesma forma a comparaccedilatildeo das bibliotecas por meio do programa webLIBSHUFF foi

feita (Figura 24) Assim como no Brasil os amplicons obtidos com o uso dos iniciadores NS31 e

AM1 em amostras de DNA de cana-de-accediluacutecar durante o estaacutegio na Universidade do Estado do

Kansas EUA resultou em sequecircncias relacionadas somente agrave Ascomycota (dados natildeo

mostrados) mesmo fazendo-se a seleccedilatildeo de raiacutezes finas e claras para a extraccedilatildeo de DNA natildeo

houve a amplificaccedilatildeo do DNA de FMAs

Natildeo houve diferenccedilas entre as estimativas de UTOs entre os dois manejos utilizando-se

sequecircncias obtidas com ambos conjuntos de iniciadores No entanto o iacutendice de diversidade de

Shannon foi significativamente maior no manejo SEM QUEIMA usando-se o par de iniciadores

NS31 e AM1 Assim como no uso do conjunto de iniciadores NS7 e F1Ra o emprego do par

NS31 e AM1 resultou em uma taxa de cobertura elevada (Figura 24) De acordo com as anaacutelises

de Libshuff as duas bibliotecas foram significativamente diferentes (P lt 005)

79


de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar colonizadas por FMAs e utilizando os iniciadores NS31 e AM1 em


Manejo Clone Sequecircncia mais similar [Acesso] Similaridade Freq(1)

SEM QUEIMA

UB AM1 G0414 Fusarium oxysporum [DQ9161501] 99 122

UB AM1 C0406 Fusarium cerealis [AF1419471] 98 24

UB AM1 H0315 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 99 537

UB AM1 B0204 Penicillium glabrum [AF5480901] 99 49

UB AM1 D0107 Phialophora verrucosa [EF4136141] 99 141

UB AM1 B0303 Phialophora verrucosa [EF4136141] 100 122

COM QUEIMA

B AM1 F0812 Fusarium oxysporum [DQ9161501] 99 948

B AM1 H0715 Fusarium oxysporum [DQ9161501] 98 26

B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80


par de iniciadores NS31 e AM1 e sequecircncias de fungos determinadas usando-se neighbor-joining






colheita


81



obtidos utilizando-se o par de iniciadores NS31 e AM1


ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974



semelhanccedila b ndash Reciacuteproco do iacutendice de Simpson

c ndash Estimativa de Cobertura da Amostragem Distacircncia evolutiva usada para as estimativas foi 001

82


iniciadores NS31 e AM1 A manejo SEM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo COM QUEIMA B manejo COM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo SEM



00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83

2337 Anaacutelise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores especiacuteficos para grupos

de FMAs em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

Para determinar a estrutura da comunidade de FMAs por meio do sequenciamento dos

amplicons os iniciadores aqui desenhados e validados foram testados em amostras de raiacutezes de

cana-de-accediluacutecar do campo Apoacutes a amplificaccedilatildeo de fragmentos do gene rRNA 18S com os

iniciadores ACAU220 GIGA202 GLOMA690 e GLOMB673 e o sequenciamento dos

amplicons foram obtidas 161 sequecircncias Dessas 35 foram retiradas das anaacutelises por

consistirem quimeras ou sequecircncias de baixa qualidade Verificou-se que nenhum dos

iniciadores desenhados foi especiacutefico para FMAs de acordo com a comparaccedilatildeo das sequecircncias

obtidas com sequecircncias de bancos de dados por meio de BLAST (Tabelas 18 19 20 e 21) As

sequecircncias de parte do gene do rRNA 18S obtidas foram alinhadas para a anaacutelise filogeneacutetica

(Figuras 25 26 27 e 28) As sequecircncias obtidas natildeo se agruparam com as sequecircncias de fungos

do filo Glomeromycota do banco de dados (GenBank) Os amplicons obtidos com o iniciador

ACAU220 em sua maioria foram mais similares a Cladosporium (Dothideomycetes

Ascomycota) (Tabela 18 e Figura 25) A maioria dos amplicons obtidos com o iniciador

GIGA202 foram mais similares agrave Fusarium (Sordariomycetes Ascomycota) (Tabela 19 e

Figura 26) Quando utilizou-se o iniciador GLOMA690 a maioria dos amplicons foram mais

similares a Monodictys (Sordariomycetes Ascomycota) e a Cryptococcus (Tremellomycetes

Basidiomycota) (Tabela e Figura 27) Jaacute com o uso do iniciador GLOMB673 a maioria dos

amplicons foram mais similares a Phoma (Ascomycota mitospoacuterico) (Tabela 21 e Figura 28)

Com exceccedilatildeo de um amplicon obtido com o iniciador ACAU220 e alguns amplicons obtidos

com o iniciador GLOMB673 os quais foram mais similares agrave Basidiomycota todas os outros

amplicons obtidos com o emprego dos iniciadores desenhados foram mais similares a

Ascomycota Portanto uma vez que nenhuma sequecircncia obtida estaacute relacionada ao filo

Glomeromycota ao qual pertencem os FMAs os iniciadores desenhados foram inespeciacuteficos

para identificaccedilatildeo desses fungos nas raiacutezes de cana-de-accediluacutecar em condiccedilatildeo de campo

Mesmo assim foram estimadas a riqueza de UTOs e os iacutendices de diversidade de

Shannon e reciacuteproco de Simpson com os dados obtidos Pelo programa Spade foram estimadas

um total de 49 UTOs sendo 26 do tratamento SEM QUEIMA e 25 do tratamento COM

QUEIMA (Tabela 22) A estimativa de riqueza de fungos variou de 64 no manejo COM

84

QUEIMA 216 no manejo SEM QUEIMA a 265 espeacutecies de fungos considerando-se as

amostras dos dois tratamentos de colheita Os dois tratamentos tambeacutem natildeo apresentaram

diferenccedilas quanto aos iacutendices de diversidade A estimativa de cobertura da amostragem foi de

683 no tratamento sob manejo COM QUEIMA e 701 no tratamento sob manejo SEM

QUEIMA Verifica-se que a curva de rarefaccedilatildeo natildeo atinge a assiacutentota isto eacute somente uma

porccedilatildeo da riqueza de fungos associados agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar foi amostrada (Figura 29)

As sequecircncias obtidas natildeo se agrupam com base em suas relaccedilotildees filogeneacuteticas em

funccedilatildeo do tratamento (SEM QUEIMA ou COM QUEIMA) Existem apenas 7 UTOs (56 do

total de UTOs) em comum entre os tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA As UTOs

em comum satildeo as identificadas pelos nuacutemeros 1 2 3 4 7 16 e 23 nas Tabelas 18 a 21 Esse

nuacutemero reduzido de UTOs em comum aos dois tratamentos indicaram diferenccedila na comunidade

de fungos associados agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar A anaacutelise de Libshuff mostrou que as

comunidades de fungos dos dois tratamentos satildeo significativamente diferentes (p lt 005)

(Figura 30)

Muitas sequecircncias do gene rRNA 18S amplificadas de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar com o

uso dos iniciadores desenhados podem representar novos taxa Um total de 52 (416 )

sequecircncias apresentam similaridade menor do que 96 agraves sequecircncias disponiacuteveis no banco de

dados do NCBI Essas sequecircncias foram verificadas como natildeo quimeacutericas e satildeo mais similares

a sequecircncias de Ascomycota e Basidiomycota com base na anaacutelise filogeneacutetica Empregando-

se os iniciadores aqui desenhados as seis UTOs mais frequentes representam 568 do total

de sequecircncias enquanto as UTOs contendo um uacutenica sequecircncia (singletons) representam 735

do total de UTOs mostrando a existecircncia de dominacircncia de algumas espeacutecies fuacutengicas na

comunidade associada agraves raiacutezes

As sequecircncias obtidas com os iniciadores grupo-especiacuteficos de FMAs desenhados no

presente trabalho natildeo tem regiatildeo em comum com as sequecircncias de clones das bibliotecas

obtidas utilizando os iniciadores da primeira abordagem (NS7 e F1Ra) No entanto a regiatildeo

amplificada do gene rRNA 18S obtida com uso dos iniciadores da segunda abordagem (NS31 e

AM1) eacute comum agrave parte da regiatildeo amplificada com o uso dos iniciadores grupo-especiacuteficos

Pela anaacutelise filogeneacutetica usando neighbor joining as sequecircncias da segunda abordagem

mostraram-se relacionadas a algumas sequecircncias obtidas com os iniciadores especiacuteficos (dados

natildeo mostrados) Isso mostra a consistecircncia do meacutetodo de PCR e sequenciamento para o

85

levantamento populacional dos fungos associados agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar em condiccedilotildees de

campo apesar de o nuacutemero de UTOs recuperadas ser menor com o uso do iniciador AM1

Tabela 18 - Anaacutelise do BLAST de sequecircncias obtidas das bibliotecas de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar COM

QUEIMA e SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita utilizando o iniciador ACAU220

Manejo Clone iniciador UTO(1)

Sequecircncia mais similar [Acesso] Similaridade

(2)

SEM QUEIMA

A01 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 100

G01 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 96

F02 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 95


B03 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 93

C03 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 93

D03 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU7234841] 93

E01 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 93

D02 ACAU220 UTO 2 Penicillium brevicompactum [EU2636081] 98

H01 ACAU220 UTO 2 Penicillium freii [AY6409981] 98

A03 ACAU220 UTO 2 Phialocephala fortinii [EU3820701] 96

B02 ACAU220 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191]] 93

C01 ACAU220 UTO 4 Penicillium purpurogenum [DQ3659471] 96

C02 ACAU220 UTO 5 Hypocrea koningii [EU7224041] 92

D01 ACAU220 UTO 6 Pseudocolus fusiformis [AF0266231] 98

E02 ACAU220 UTO 7 Fusarium oxysporum [EU7108211] 98

Com Queima

H03 ACAU220 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 96




B04 ACAU220 UTO 2 Penicillium glabrum [AF5480901] 93

A04 ACAU220 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 97

G03 ACAU220 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 97

E05 ACAU220 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 94

D04 ACAU220 UTO 3 Didymella exitialis [EU1675641] 91

B05 ACAU220 UTO 4 Penicillium purpurogenum [DQ3659471] 96

C05 ACAU220 UTO 16 Monodictys arctica [EU6865191] 93

F03 ACAU220 UTO 28 Paraconiothyrium brasiliense [EU2956511] 91

F05 ACAU220 UTO 29 Alternaria sp [EU8264791] 97

G05 ACAU220 UTO 30 Lithothelium septemseptatum [AY5846621] 96

Os E-values de todas as comparaccedilotildees foram iguais a zero (1)

Identidade das Unidades Taxonocircmicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao niacutevel de 99 de

similaridade (2)

Similaridade da sequecircncia ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela anaacutelise de BLAST

86


QUEIMA e SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita utilizando o iniciador GIGA202



(2)

SEM QUEIMA

A06 GIGA202 UTO 1 Cladosporium cladosporioides [EU3755231] 96

D07 GIGA202 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 95

H06 GIGA202 UTO 4 Penicillium purpurogenum [AF2452571] 97

B08 GIGA202 UTO 4 Penicillium purpurogenum [DQ3659471]] 93

A08 GIGA202 UTO 7 Fusarium oxysporum [EF5903261] 96


F07 GIGA202 UTO 7 Fusarium oxysporum [EF5903261] 94

E06 GIGA202 UTO 7 Fusarium oxysporum [EF5903261] 93


C07 GIGA202 UTO 7 Fusarium oxysporum [EF5903261] 92

D06 GIGA202 UTO 7 Fusarium oxysporum [EF5903261] 92

B06 GIGA202 UTO 8 Fusarium oxysporum [EF5903261] 90




G06 GIGA202 UTO 12 Monodictys arctica [EU6865191] 87

G07 GIGA202 UTO 13 Fusarium oxysporum [EF5903261] 91

COM QUEIMA



E10 GIGA202 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 99

F09 GIGA202 UTO 3 Phaeosphaeria nodorum [EU1892131] 99

G09 GIGA202 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 99

B09 GIGA202 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 97

C09 GIGA202 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 96

H08 GIGA202 UTO 3 Phaeosphaeria nodorum [EU1892131] 96




E09 GIGA202 UTO 30 Paraconiothyrium variabile [EU2956531] 95

A10 GIGA202 UTO 31 Monodictys arctica [EU6865191] 89

C10 GIGA202 UTO 32 Penicillium purpurogenum [DQ3659471] 92

E08 GIGA202 UTO 33 Pyrenochaeta nobilis [DQ8982871] 98


H09 GIGA202 UTO 35 Monodictys arctica [EU6865191] 95


Unidades Taxonocircmicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao niacutevel de 99 de similaridade (2)


87


QUEIMA e SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita utilizando o iniciador GLOMA690



(2) E-value

SEM QUEIMA

A11 GLOMA690 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 99 00

B11 GLOMA690 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 99 8e-167


D11 GLOMA690 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 98 8e-162

F11 GLOMA690 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 97 5e-159

A01 GLOMA690 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 97 00

C01 GLOMA690 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 97 00

B01 GLOMA690 UTO 14 Phoma sp [EU8264811] 98 00

A12 GLOMA690 UTO 14 Monodictys arctica [EU6865191] 97 3e-151

E11 GLOMA690 UTO 14 Monodictys arctica [EU6865191] 94 2e-142

C11 GLOMA690 UTO 15 Cryptococcus vishniacii [AB0326571] 99 1e-164

H12 GLOMA690 UTO 16 Monodictys arctica [EU6865191] 98 1e-159

G11 GLOMA690 UTO 16 Monodictys arctica [EU6865191] 97 4e-155


E12 GLOMA690 UTO 17 Cryptococcus aerius [EU8476621] 96 6e-148




D01 GLOMA690 UTO 21 Cryptococcus gastricus [DQ6455131] 97 00

COM QUEIMA

C02 GLOMA690 UTO 3 Phoma medicaginis [EU1675751] 97 00

A03 GLOMA690 UTO 36 Cryptococcus terreus [AB0326491] 97 00

E02 GLOMA690 UTO 36 Cryptococcus terreus [AB0326491] 98 00

B03 GLOMA690 UTO 36 Cryptococcus terreus [AB0326491] 96 00


D03 GLOMA690 UTO 38 Dothidotthia aspera [EU6732281] 88 1e-139

E01 GLOMA690 UTO 39 Phoma sp [EU8264811] 93 00


F01 GLOMA690 UTO 41 Cryptococcus terreus [AB0326491] 93 00

G02 GLOMA690 UTO 42 Phoma sp [EU8264811] 97 00

H02 GLOMA690 UTO 43 Phoma sp [EU8264811] 97 00

(1) Unidades Taxonocircmicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao niacutevel de 99 de similaridade

(2) Similaridade da sequecircncia ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela anaacutelise de BLAST

88


QUEIMA e SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita utilizando o iniciador GLOMB673



(2) e-value

SEM QUEIMA

A05 GLOMB673 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 99 00

A06 GLOMB673 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 99 00

D06 GLOMB673 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 99 00

B05 GLOMB673 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 98 00

E04 GLOMB673 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 98 00


C06 GLOMB673 UTO 3 Leptosphaeria doliolum [U434571] 97 00

D05 GLOMB673 UTO 3 Monodictys arctica [EU6865191] 96 00


A04 GLOMB673 UTO 22 Phoma medicaginis [EU1675751] 92 7e-156

C04 GLOMB673 UTO 23 Monodictys arctica [EU6865191] 98 00

F04 GLOMB673 UTO 24 Rhytidhysteron rufulum [AF2014521] 95 00

F05 GLOMB673 UTO 25 Monodictys arctica [EU6865191] 94 00

G05 GLOMB673 UTO 26 Pleosporales [FJ1768441] 99 00

H05 GLOMB673 UTO 27 Phoma sp [EU8264811] 96 00

COM QUEIMA

G08 GLOMB673 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 99 00

C08 GLOMB673 UTO 3 Phoma sp [EU8264811] 97 00


G07 GLOMB673 UTO 16 Monodictys arctica [EU6865191] 96 00



B07 GLOMB673 UTO 34 Trichocladium asperum [EU2636131] 94 00

E06 GLOMB673 UTO 34 Trichocladium asperum [EU2636131] 94 3e-174

F06 GLOMB673 UTO 35 Phoma sp [EU8264811] 99 00


E07 GLOMB673 UTO 44 Dothidotthia aspera [EU6732251] 90 1e-162

F07 GLOMB673 UTO 45 Monodictys arctica [EU6865191] 91 2e-180

F08 GLOMB673 UTO 46 Phoma sp [EU8264811] 90 8e-170

G06 GLOMB673 UTO 47 Coniothyrium palmarum [AY6425141] 95 00

H06 GLOMB673 UTO 48 Pleosporales sp [FJ1768441] 92 2e-161




89

Figura 25 ndash Relaccedilotildees filogeneacuteticas entre as sequecircncias do rDNA 18S obtidas de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

utilizando o iniciador ACAU220 e sequecircncias de fungos determinadas usando neighbor joining

Nuacutemeros sobre os ramos indicam a percentagem de 1000 repeticcedilotildees da anaacutelise de bootstrap O

comprimento da barra representa duas substituiccedilotildees a cada 100 nucleotiacutedeos As sequecircncias do

tratamento SEM QUEIMA estatildeo grafadas em preto e negrito e as do tratamento COM QUEIMA

estatildeo em vermelho e negrito

90


utilizando o iniciador GIGA202 e sequecircncias de fungos determinadas usando neighbor joining





91


utilizando o iniciador GLOMA690 e sequecircncias de fungos determinadas usando neighbor joining





92


utilizando o iniciador GLOMB673 e sequecircncias de fungos determinadas usando neighbor joining





93

Figura 29 ndash Curvas de rarefaccedilatildeo para bibliotecas de clones do gene rRNA 18S obtidas usando os iniciadores

FMAs grupo-especiacuteficos em amostras DNA de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar sob tratamento SEM

QUEIMA e COM QUEIMA A curva de rarefaccedilatildeo foi gerada com o programa DOTUR (SCHLOSS

HANDELSMAN 2005) utilizando o niacutevel de 99 de similaridade

94

Tabela 22 - Estimativas de UTOs iacutendices de diversidade e cobertura de amostragem calculadas a partir de bibliotecas de rDNA 18S

de fungos associados a raiacutezes de cana-de-accediluacutecar com ou SEM QUEIMA preacutevia agrave colheita utilizando os iniciadores

ACAU220 GIGA202 GLOMA690 e GLOMB673





Comunidade NS NU Estimativa de riquezas de UTOs Iacutendices de diversidade

ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683

Todas as sequecircncias 125 49 2130(1077 5072)

2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95

Figura 30 - Anaacutelise de LIBSHUFF de comunidade de fungos associado agraves raiacutezes de cana-de-accediluacutecar sob dois manejos de colheita utilizando o conjunto de

iniciadores desenhados ACAU220 GIGA202 GLOMA690 e GLOMB673 A manejo SEM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo COM QUEIMA B

manejo COM QUEIMA (homoacutelogo) x manejo SEM QUEIMA As comunidades satildeo diferentes significativamente com P lt 005 A distribuiccedilatildeo de

(Cy-Cyx)2 como uma funccedilatildeo de D indica a diferenccedila entre as duas comunidades

B A

96

Os estudos de comunidades de FMAs satildeo importantes devido aos efeitos das MAs para as

plantas e para os ecossistemas terrestres (HEIJDEN et al 1998) Poreacutem a principal dificuldade

nas investigaccedilotildees do ciclo de vida da filogenia organizaccedilatildeo geneacutetica dinacircmica e estrutura das

comunidades dos FMAs eacute o seu biotrofismo obrigatoacuterio As abordagens moleculares

principalmente a caracterizaccedilatildeo de genes do rRNA tecircm contribuido para a elucidaccedilatildeo da

ecologia dos FMAs Esses genes satildeo muito utilizados por suas caracteriacutesticas evolutivas as quais

permitem a investigaccedilatildeo em diferentes niacuteveis de resoluccedilatildeo filogeneacutetica (HILLIS DIXON 1991)

Aleacutem disso eacute um gene que ocorre em muacuteltiplas coacutepias no genoma sendo a sua detecccedilatildeo mais

faacutecil em relaccedilatildeo a outros genes Segundo Oumlpik et al (2006) de 26 trabalhos 23 investigaram

comunidade de FMAs utilizando o gene rRNA 18S 7 investigaram regiotildees ITS e 4 avaliaram o

gene rRNA 28S sendo que alguns dos trabalhos utilizaram mais de um locus gecircnico

O desenho de novos iniciadores para a amplificaccedilatildeo de DNA dos organismos pertencentes

ao filo Glomeromycota eacute importante para evitar o vieacutes causado pelo uso do tradicional iniciador

AM1 (HELGASON 1998) Esse iniciador tem sido usado em inuacutemeros estudos de comunidades

de FMAs em campo (OumlPIK et al 2006) no entanto ele natildeo amplifica o DNA dos grupos basais

de Glomeromycota como Archaeosporales (REDECKER 2000 SANTOS FINLAY TEHLER

2006 SANTOS-GONZAacuteLEZ et al 2007) Aleacutem disso o iniciador AM1 pode amplificar

sequecircncias de fungos natildeo-micorriacutezicos arbusculares (DOUHAN et al 2005) Jaacute o emprego de

iniciadores especiacuteficos para fungos em geral pode natildeo cobrir toda a comunidade fuacutengica e dessa

forma natildeo refletir a comunidade de FMAs da amostra ou natildeo identificar sequer uma sequecircncia

de fungo do filo Glomeromycota (Tabela 14 e Figura 21) Por essa razatildeo o desenho de

iniciadores especiacuteficos para os principais grupos de Glomeromycota eacute de suma importacircncia

Mesmo com a colonizaccedilatildeo micorriacutezica variando de 30 a 52 natildeo foi possiacutevel a

detecccedilatildeo de FMAs nas raiacutezes utilizando-se as trecircs abordagens (1) aplicaccedilatildeo do iniciador AM1

(2) iniciador F1Ra especiacutefico para fungos em geral e (3) uso dos iniciadores aqui desenhados A

ausecircncia de sequecircncias clonadas que fossem mais similares agraves sequecircncias de Glomeromycota

mesmo utilizando iniciadores especiacuteficos e funcionais em amostras de casa-de-vegetaccedilatildeo e em

amostras de campo (raiacutezes da pradaria Konza) pode indicar um ambiente com uma comunidade

fuacutengica diversa e complexa nas raiacutezes de cana-de-accediluacutecar do campo Com os iniciadores

desenhados neste estudo houve um maior nuacutemero de UTOs detectadas em relaccedilatildeo aos

iniciadores AM1 ou F1Ra O nuacutemero de 49 UTOs sequenciadas e 265 UTOs estimadas somente

97

nas raiacutezes da cana-de-accediluacutecar (Tabela 22) indicam alta diversidade fuacutengica em relaccedilatildeo agrave outros

ambientes Waldrop et al (2006) avaliaram a diversidade de fungos do solo empregando-se o

par de iniciadores ITS1F e ITS4 e o sequenciamento dos clones provenientes de amostras de

aacutereas com diferentes nuacutemeros de espeacutecies vegetais no estado de Minnesota EUA Esses autores

obtiveram um total de 149 UTOs de fungos do solo em 7 diferentes tratamentos com um nuacutemero

maacuteximo de 40 UTOs quando se sequenciaram 72 clones de um tratamento Mas esses resultados

foram obtidos de amostras de DNA extraiacutedo do solo o qual geralmente apresenta maior

diversidade fuacutengica do que aquela associada agraves raiacutezes Neubert et al (2006) avaliaram a estrutura

da comunidade de fungos nos diferentes oacutergatildeos de caniccedilo e verificaram que as raiacutezes satildeo os

oacutergatildeos com maior diversidade A alta diversidade poderia ser a causa do vieacutes na amplificaccedilatildeo nos

experimentos deste trabalho no entanto Vandenkoornhuyse et al (2002) estudaram a

diversidade de fungos em raiacutezes da Poaceae Arrhenatherum elatius com o uso de iniciadores

especiacuteficos para fungos em geral e encontraram 49 filotipos sendo 3 relacionados agrave

Glomeromycota Husband et al (2002) amplificaram o DNA de FMAs de raiacutezes de floresta

tropical do Panamaacute empregando os iniciadores NS31 e AM1 e mostram que a

ldquohiperdiversidaderdquo pode natildeo ser a explicaccedilatildeo para o problema

Por outro lado considerando que quanto maior a diversidade vegetal maior o nuacutemero de

nichos e portanto maior a diversidade de fungos (LODGE 1997) a diversidade em raiacutezes de

uma lavoura de cana-de-accediluacutecar natildeo seria alta ao ponto de mascarar a presenccedila de FMAs Em

aacutereas de monocultura como as de cana-de-accediluacutecar haveria uma dominacircncia de um pequeno grupo

de fungos resultando em amostras de DNA com prevalecircncia desses organismos os quais se

sobrepujariam em relaccedilatildeo aos FMAs nas amostras de DNA total Como foi mostrado pelo

sequenciamento de clones do gene rRNA 18S e anaacutelise pelo DOTUR aproximadamente 60

das sequecircncias pertencem a apenas seis UTOs de um total de 49 UTOs Desse modo pode haver

uma razatildeo DNA alvo DNA natildeo-alvo desfavoraacutevel agrave amplificaccedilatildeo especiacutefica

Considerando que os iniciadores desenhados obtiveram resultados positivos nos testes in

silico e em amostras controle de casa-de-vegetaccedilatildeo eacute possiacutevel que o problema resida nas

condiccedilotildees suboacutetimas de PCR Assim paracircmetros como temperatura de pareamento dos

iniciadores concentraccedilotildees de cloreto de magneacutesio e diluiccedilatildeo da primeira PCR podem estar em

niacuteveis natildeo ideais Os testes para esses e outros paracircmetros tais como presenccedila ou ausecircncia de

BSA ou DMSO (Dimetil Sulfoacutexido) foram feitos nas amostras controle provindas de casa-de-

98

vegetaccedilatildeo e natildeo nas raiacutezes de cana-de-accediluacutecar do campo Eacute possiacutevel que as amplificaccedilotildees

inespeciacuteficas com o emprego dos iniciadores desenhados usando DNA de raiacutezes de cana-de-

accediluacutecar poderiam ser evitadas com a otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees de PCR O BSA eacute um adjuvante

que pode aumentar a eficiecircncia da amplificaccedilatildeo O DMSO eacute um agente desnaturante que inibe

formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias e eacute utilizado para melhorar a eficiecircncia e a especificidade de

amplificaccedilatildeo (KITADE et al 2003) Entretanto o problema pode ter mais de uma origem em

razatildeo de o emprego dos iniciadores Glomus grupo A (GLOMA189 e GLOMA690) em raiacutezes da

pradaria Konza resultar em amplicons especiacuteficos e em ausecircncia de sequecircncias natildeo-alvo (Figuras

14 e 15) Esses resultados nos mostra que haacute um problema especiacutefico com as amostras de raiacutezes

de cana-de-accediluacutecar onde pode haver um inibidor natildeo universal uma vez que a siacutentese de

amplicons apesar de serem inespeciacuteficos ocorre Um possiacutevel fator para a natildeo detecccedilatildeo de

FMAs nas raiacutezes eacute a incapacidade do meacutetodo de extraccedilatildeo de homogeneizar completamente o

tecido vegetal o que deixaria as hifas dos FMAs protegidas ou ligadas aos tecidos da cana-de-

accediluacutecar Essa proteccedilatildeo diminuiria a eficiecircncia da extraccedilatildeo do DNA de FMAs nas amostras de

raiacutezes de cana-de-accediluacutecar

Esses problemas podem contribuir para a amplificaccedilatildeo do DNA de determinados fungos

em funccedilatildeo do ambiente Esse vieacutes jaacute foi constatado em outros trabalhos (ANDERSON et al

2003 JUMPPONEN 2007) e pode ser decorrecircncia do fato de os iniciadores terem sido

desenhados com base em sequecircncias de espeacutecimes mantidas em coleccedilotildees de culturas e em

laboratoacuterios e natildeo em sequecircncias de organismos que ocorrem naturalmente no campo Uma vez

que os FMAs satildeo simbiotroacuteficos obrigatoacuterios a obtenccedilatildeo desse tipo de sequecircncia eacute dificultada

Assim a inespecificidade dos iniciadores pode ter origem na baixa relaccedilatildeo DNA alvo

DNA natildeo-alvo nas condiccedilotildees suboacutetimas de PCR ou em problemas inerentes agraves amostras ou ao

meacutetodo de extraccedilatildeo de DNA de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar A soluccedilatildeo para a validaccedilatildeo dos

iniciadores especiacuteficos e para o acesso agrave comunidade de Glomeromycota nas raiacutezes de cana-de-

accediluacutecar pode ser alcanccedilada por meio de experimentos para se testar esses paracircmentros Outro

ponto a ser observado eacute que eacute preciso ser cauteloso para conclusotildees tiradas sobre comunidades de

FMAs quando se emprega o par de iniciadores NS31 e AM1 sem o uso do sequenciamento como

nas anaacutelises de T-RFLP e DGGE Os resultados podem natildeo refletir a real da comunidade de

FMAs nas amostras

99

Apesar de a detecccedilatildeo de FMAs natildeo ser possiacutevel as sequecircncias obtidas satildeo informativas

quanto ao que ocorre com a estrutura da comunidade fuacutengica nas raiacutezes A alta frequecircncia de

sequecircncias de Ascomycota nas bibliotecas obtidas com os iniciadores F1Ra (especiacutefico para

fungos) AM1 (especiacutefico para FMAs) e os especiacuteficos para grupos de FMAs ACAU220

GIGA202 GLOMA690 e GLOMB673 indicam uma dominacircncia de fungos desse filo nas raiacutezes

de cana-de-accediluacutecar

Com o emprego do iniciador F1Ra foi estimada uma riqueza de ateacute 51 UTOs (Tabela 15)

e do AM1 uma riqueza de ateacute 65 UTOs (Tabela 17) em duas amostras de cana-de-accediluacutecar sob

manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA A razatildeo para a diferenccedila eacute que o iniciador F1Ra eacute

universal para Fungi enquanto o segundo eacute especiacutefico para um grupo de fungos No entanto com

o uso dos iniciadores grupo-especiacuteficos aqui desenhados foi estimada uma riqueza de ateacute 265

UTOs nas 36 amostras de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar Com relaccedilatildeo agrave estrutura da comunidade

fuacutengica o uso dos iniciadores F1Ra ou AM1 e dos iniciadores especiacuteficos aqui desenhados

indicam diferenccedilas entre as comunidades fuacutengicas nos tratamento SEM QUEIMA e COM

QUEIMA pela anaacutelise de Libshuff Esses resultados podem indicar que o uso de apenas um par

de iniciadores mesmo universal para fungos e poucas repeticcedilotildees de amostras pode resultar em

baixa cobertura de amostragem da comunidade fuacutengica

Os iacutendices estimados de riqueza e de diversidade de UTOs com o uso dos iniciadores

especiacuteficos para fungos FMAs e FMAs grupo-especiacutefico natildeo foram diferentes entre os dois

manejos de colheita sugerindo que a comunidade fuacutengica natildeo eacute afetada em nuacutemero e diversidade

de organismos pelo sistema de colheita adotado pelo menos na eacutepoca avaliada Isso pode ser

explicado pelo pouco tempo de manejo SEM QUEIMA em que o teor de C no solo ainda natildeo foi

alterado (Tabela 7) indicando que a deposiccedilatildeo de palha sobre o solo ainda natildeo afeta

significativamente as propriedades quiacutemicas e bioloacutegicas do solo

100

3 CONCLUSOtildeES

A abundacircncia riqueza e diversidade de FMAs determinadas com base na presenccedila de

esporos assexuais no solo natildeo diferiu entre os tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA

preacutevia agrave colheita nem entre as variedades de cana-de-accediluacutecar e na interaccedilatildeo dos fatores Manejo de

Colheita e Variedades de cana-de-accediluacutecar

O manejo de colheita SEM QUEIMA preacutevia estimulou a colonizaccedilatildeo micorriacutezica

arbuscular em cana-de-accediluacutecar em relaccedilatildeo ao manejo com colheita COM QUEIMA preacutevia logo

apoacutes a primeira colheita

O uso de iniciadores especiacuteficos para fungos em geral (Reino Fungi) do iniciador AM1 e

dos iniciadores especiacuteficos para grupos de FMAs natildeo permitiu a detecccedilatildeo de FMAs nas raiacutezes de


Os iacutendices de riqueza e diversidade e a estrutura da comunidade fuacutengica associados agraves

raiacutezes de cana-de-accediluacutecar determinados por meio dos dados de sequenciamento do gene rRNA

18S natildeo diferiram entre os manejos de colheita SEM QUEIMA e COM QUEIMA preacutevia

O manejo da cana-de-accediluacutecar e colheita COM QUEIMA preacutevia agrave colheita alterou a

estrutura da comunidade fuacutengica associada agraves raiacutezes logo apoacutes a primeira colheita

101

REFEREcircNCIAS

AL-KARAKI G McMICHAEL B ZAK J Field response of wheat to arbuscular mycorrhizal

fungi and drought stress Mycorrhiza New York v 14 n 4 p 263-269 2004

ALMEIDA RT Estudo sobre micorrizas vesiacuteculo-arbusculares no Cearaacute Fitopatologia

Brasileira Brasiacutelia v 10 n 2 p 210-212 1985

ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DL A basic local

alignment search tool Journal of Molecular Biology Amsterdam v 215 n 3 p 403-410

1990

ANDERSON IC CAMPBELL CD PROSSER JI Potential bias of fungal 18S rDNA and

internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity

in soil Environmental Microbiology Oxford v 5 n 1 p 36ndash47 2003

ANDREOLA F Micorrizas vesiacuteculo-arbusculares em cana-de-accediluacutecar 1982 74 p

Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia Agriacutecola) - Escola Superior de Agricultura ldquoLuiz de

Queirozrdquo Universidade de Satildeo Paulo Piracicaba 1982

ANSON EL MYERS EW ReAligner a program for refining DNA sequence multi-

alignments In ANNUAL CONFERENCE ON RESEARCH IN COMPUTATIONAL

MOLECULAR BIOLOGY 1 1993 Santa Fe Proceedings hellip Santa Fe ACM 1997 p 9-16

AUGEacute RM SYLVIA DM PARK S BUTTERY BR SAXTON AM MOORE JL

CHO K Partitioning mycorrhizal influence on water relations of Phaseolus vulgaris into soil and

plant components Canadian Journal of Botany Ottawa v 82 n 4 p 503-514 2004

BLASZKOWSKI J Arbuscular fungi and mycorrhizae (Glomales) of the Hel Peninsula Poland

Mycorrhiza New York v 5 n 1 p 71-88 1994

BONFANTE-FASOLO P Anatomy and morphology of VA mycorrhizae In POWELL CL

BAGYARAJ DJ (Ed) VA mycorrhiza Boca Raton CRC Press 1984 chap 2 p 5-33

BORNEMAN J HARTIN RJ PCR primers that amplify fungal rRNA genes from

environmental samples Applied Environmental Microbiology Washington v 66 p 4356ndash

4360 2000

BRASIL Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria e Abastecimento Disponiacutevel em

lthttpwwwagriculturagovbrgt Acesso em 22 abr 2007

BUNEMANN EK SCHWENKE GD VAN ZWIETEN L Impact of agricultural inputs on

soil organisms ndash a review Australian Journal of Soil Research Collingwood v 44 p 379-

406 2006

102

BURROWS RL PFLEGER FL Host responses to AMF from plots differing in plant

diversity Plant Soil Dordrecht v 240 n 1 p 169-179 2002

CAMPOS DC de Potencialidade do sistema de colheita Sem Queima da cana-de-accediluacutecar

para o sequumlestro de carbono 2003 103 p Tese (Doutorado em Microbiologia Agriacutecola) -

Escola Superior de Agricultura ldquoLuiz de Queirozrdquo Universidade de Satildeo Paulo Piracicaba 2003

CARRENHO R TRUFEM SFB BONONI VLR Effects of using differents host plants on

the detected biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi from an agrossystem Revista

Brasileira de Botacircnica Satildeo Paulo v 25 n 1 p 93-101 2002

CARRENHO R SILVA ES TRUFEM SFB BONONI VLR Sucessive cultivation of

maize and agricultural practices on root colonization number of spores and species of arbuscular

mycorrhizal fungi Brazilian Journal of Microbiology Satildeo Paulo v 32 p 262-270 2001

CHAO A Nonparametric estimation of the number of classes in a population Scandinavian

Journal of Statistics Oslo v 11 p 265-270 1984

CHAO A LEE SM Estimating the number of classes via sample coverage Journal of the

American Statistical Association Alexandria v 87 p 210-217 1992

CHAO A SHEN TJ Program SPADE (Species Prediction And Diversity Estimation) -

program and userrsquos guide Disponiacutevel em lthttpchaostatnthuedutwgt 2003-2008 Acesso em

08 dez 2008

CLAPP JP YOUNG JPW MERRYWEATHER JW FITTER AH Diversity of fungal

symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural community New Phytologist Lancaster

v 130 p 259ndash265 1995

COLLA G ROUPHAEL Y CARDARELLI M TULLIO M RIVERA CM REA E

Alleviation of salt stress by arbuscular mycorrhizal in zucchini plants grown at low and high

phosphorus concentration Biology and Fertility of Soils Berlim v 44 n 3 p 501-509 2008

COLOZZI FILHO A BALOTA EL Micorrizas arbusculares In HUNGRIA M ARAUJO

RS (Ed) Manual de meacutetodos empregados em estudos de microbiologia agriacutecola Brasiacutelia

Embrapa SPI 1994 p 383-418

CORPET F Multiple sequence alignment with hierarchical clustering Nucleic Acids Research

London v 16 n 22 p 10881-10890 1988

CROLL D WILLEL GAMPER HA MATHIMARAN N LAMMERS PJ CORRADI

N SANDERS IR Genetic diversity and host plant preferences revealed by simple sequence

repeat and mitochondrial markers in a population of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus

intraradices New Phytologist Lancaster v 178 n 3 p 672-687 2008

CUENCA G MENESES E Diversity patterns of arbuscular mycorrhiza fungi associated with

cacao in Venezuela Plant and Soil The Hague v 183 p 315-322 1996

103

DOUDS DD MILLNER PD Biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in agroecosystems

Agriculture Ecosystems and Environment Amsterdam v 74 p 77-93 1999

DOUDS JUNIOR DD JANKE RR PETERS SE VAM fungus spore populations and

colonization of roots of maize and soybean under conventional and low-input sustainable

agriculture Agriculture Ecosystems and Environment Amsterdam v 43 p 325-335 1993

DOUHAN GW PETERSEN C BLEDSOE CS RIZZO DM Contrasting root associated

fungi of three common oak-woodland plant species based on molecular identification host

specificity or non-specific amplification Mycorrhiza New York v 15 p 365-372 2005

DOYLE JJ DOYLE JL Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus Arlington v 12

p 13-15 1990

EDWARDS SG FITTER AH YOUNG PW Quantification of an arbuscular mycorrhizal

fungus Glomus mosseae within plant roots by competitive polymerase chain reaction

Mycological Research Amsterdam v 101 n 12 p 1440-1444 1997

EOM A-H HARTNETT C WILSON GWT FIGGE DAH The effect of fire mowing

fertilizer amendment on arbuscular mycorrhizas in Tallgrass prairie The American Midland

Naturalist Notre Dame v 142 p 55-70 1999

FLIEszligBACH A OBERHOLZER HR GUNST L MAumlDER P Soil organic matter and

biological soil quality indicators after 21 years of organic and conventional farming


FOCCHI SS SOGLIO FKD CARRENHO R SOUZA PVD LOVATO PE Fungos

micorriacutezicos arbusculares em cultivos de citros sob manejo convencional e orgacircnico Pesquisa

Agropecuaacuteria Brasileira Brasiacutelia v 39 n 5 p 469-476 2004

FRANCHINI JC CRISPINO CC SOUZA RA TORRES E HUNGRIA M

Microbiological parameters as indicators of soil quality under various soil management and crop

rotation systems in southern Brazil Soil amp Tillage Research Amsterdam v 92 p 18ndash29 2007

GEMMA JN KOSKE RE Seasonal variation in spore abundance and dormancy of

Gigaspora gigantea and in mycorrhizal inoculum potential of a dune soil Mycologia New York

v 80 n 2 p 211-216 1988

GERDEMANN JW NICOLSON TH Spores of mycorrhizal Endogone species extracted

from soil by wet sieving and decanting Transaction of the British Mycological Society

London v 46 p 235-244 1963

GIOVANNETTI M MOSSE B An evaluation of techiniques for measuring vesicular

arbuscular mycorrhizal infecion in roots New Phytologist Cambridge v 84 p 489-500 1980

104

GOSAL SK GUPTA RP GOSAL SS In vitro establishment of vesicular-arbuscular

mycorrhiza in roots of micropropagated sugarcane Annals of Agri Bio Research Hisar v 6

n 1 p 19-22 2001

HE X MOURATOV S STEINBERG Y Temporal and spatial dynamics of vesicular-

arbuscular mycorrhizal fungi under the canopy of Zygophyllum dumosum Boiss in the Negev

Desert Journal of Arid Environments Cambridge v 52 p 379-387 2002

HEIJDEN MGA van der KLIRONOMOS JN URSIC M MOUTOGLIS P

STREITWOLF-ENGEL R BOLLER T WIEMKEN A SANDERS IR Mycorrhizal fungal

diversity determines plant biodiversity ecosystem variability and productivity Nature London

v 396 p 69-72 1998

HELGASON T DANIELL TJ HUSBAND R FITTER AH YOUNG JPW Ploughing up

the wood-wide web Nature London v 394 n 431 p 431 1998

HEMPEL S RENKER C BUSCOT F Differences in the species composition of arbuscular

mycorrhizal fungi in spore root and soil communities in a grassland ecosystem Environmental

Microbiology Oxford v 8 n 9 p 1930-1938 2007

HIJRI I SYacuteKOROVAacute Z OEHL F INEICHEN K MADER P WIEMKEN REDECKER

D Communities of arbuscular mycorrhizal fungi in arable soils are not necessarily low in

diversity Molecular Ecology Vancouver v 15 p 2277-2289 2006

HILLIS DM DIXON MT Ribosomal DNA molecular evolution and phylogenetic inference

Quarterly Review of Biology Chicago v 66 p 411-453 1991

HUSBAND R HERRE EA TURNER SL GALLERY R YOUNG JPW Molecular

diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and patterns of host association over time and space in a

tropical forest Molecular Ecology Vancouver v 11 p 2669-2678 2002

INTERNATIONAL CULTURE COLLECTION OF (VESICULAR) ARBUSCULAR

MYCORRHIZAL FUNGI Disponiacutevel em ltinvamcafwvuedugt Acesso em 18 nov 2008

JOHNSON D VANDENKOORNHUYSE PJ LEAKE JR GILBERT L BOOTH RE

GRIME JP YOUNG JPW READ DJ Plant communities affect arbuscular mycorrhizal

fungal diversity and community composition in grassland microcosms New Phytologist

Cambridge v 161 p 503-515 2003

JUMPPONEN A Soil fungal communities underneath willow canopies on a primary

successional glacier forefront rDNA sequence results can be affected by primer selection and

chimeric data Microbiology Ecology Vancouver v 53 p 233-246 2007

JUMPPONEN A JOHNSON LC Can rDNA analyses of diverse fungal communities in soil

and roots detect effects of environmental manipulations - a case study from tallgrass prairie

Mycologia New York v 97 n 6 p 1177-1194 2005

105

JUMPPONEN A TROWBRIDGE J MANDYAM K JOHNSON L Nitrogen enrichment

causes minimal changes in arbuscular mycorrhizal colonization but shifts community

compositionmdashevidence from rDNA data Biology and Fertility of Soil Berlim v 41 p 217-

224 2005

KELLY RM EDWARDS DG THOMPSON JG MAGAREY RC Responses of

sugarcane mayze and soybean to phosphorus and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi

Australian Journal of Agricultural Research Collingwood v 52 p 731-743 2001

______ Growth responses of sugarcane to mycorrhizal spore density an phosphorus rate


KITADE Y OOTSUKA S IITSUKA O SAGA N Effect of DMSO on PCR of Porohyra

yezoensis (Rhodophyta) gene Journal of Applied Phycology v 15 p 555-557 2003

KOIDE RT MOSSE B A history of research on arbuscular mycorrhiza Mycorrhiza New

York v 14 p 145-163 2004

KUMAR S TAMURA K NEI M MEGA3 Integrated software for molecular evolutionary

genetics analysis and sequence alignment Briefings in Bioinformatics Oxford v 5 p 150-163

2004

LAMBAIS MR CURY JC MALUCHEndashBARETTA CR BUumlLL RC Diversidade

microbiana nos solos definindo novos paradigmas In VIDAL-TORRADO P ALLEONI

LRF COOPER M SILVA AP CARDOSO EJ (Org) Toacutepicos em ciecircncia do solo

Viccedilosa Sociedade Brasileira de Ciecircncia do Solo 2005 v 4 p 43-84

LEE J LEE S YOUNG JPW Improved PCR primers for the detction and identification of

arbuscular mycorrhizal fungi FEMS Microbiology Ecology Amsterdam v 65 p 339-349

2008

LINGFEI L ANNA Y ZHIWEI Z Seasonality of arbuscular mycorrhizal symbiosis and dark

septate endophytes in a grassland site in southwest ChinaFEMS Microbiology Ecology

Amsterdam v 54 p 367-373 2005

LLOYD-MACGILP SA CHAMBERS SM DODD JC FITTER AH WALKER C

YOUNG JPW Diversity of the ribosomal internal transcribed spacers within and among

isolates of Glomus mosseae and related mycorrhizal fungi New Phytologist Lancaster v 133

p 103ndash111 1996

LODGE DJ Factors related to diversity of decomposer fungi in tropical forests Biodiversity

and Conservation Dordrecht v 6 p 681-688 1997

MAGURRAN AE Ecological diversity and its measurement Princeton Princenton

University Press 1988 179 p

106

MAIDAK BL COLE JR PARKER JUacuteNIOR CT GARRITY GM LARSEN N LI B

LILBURN TG MCCAUGHEY MJ OLSEN GJ OVERBEEK R PRAMANIK S

SCHMIDT TM TIEDJE JM WOESE CR A new version of the RDP (Ribosomal Database

Project) Nucleic Acids Research London v 27 n 1 p 171-173 1999

MATHIMARAN N RUH R JAMA B VERCHOT L FROSSARD E JANSA J Impact

of agricultura management on arbuscular mycorrhizal fungal communities in Kenyan Ferralsol


MOREIRA M BARETTA D TSAI SM GOMES-DA-COSTA SM CARDOSO EJBN

Biodiversity and distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in Araucaria angustifolia forest

Scientia Agricola Piracicaba v 64 n 4 p 393-399 2007

MORTON JB REDECKER D Two new families of Glomales Archaeosporaceae and

Paraglomaceae with two new genera Archaeospora and Paraglomus based on concordant

molecular and morphological characters Mycorrhiza New York v 93 p 181ndash195 2001

NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION Disponiacutevel em

lthttpwwwncbinlmnihgovgt Acesso em 21 abr 2007

NEUBERT K MENDGEN K BRINKMANN H WIRSEL SGR Only a few fungal

species dominate highly diverse mycofloras associated with the common reed Applide and

Environmental Microbiology Washington v 72 n 2 p 1118-1128 2006

NIELSEN MN WINDING A Microorganisms as indicators of soil health Denmark

National Environmental Research Institute 2002 82 p (Technical Report 388)

NOacuteBREGA JCA LIMA JM CURI N SIQUEIA JO MOTTA PEF Fosfato e

micorriza na estabilidade de agregados em amostras de latossolos cultivados e natildeo cultivados

Pesquisa Agropecuaacuteria Brasileira Brasiacutelia v 36 n 11 p 1425-1435 2001

OrsquoCONNOR PJ SMITH SE SMITH FA Arbuscular mycorrhizas influence plant diversity

and community structure in a semiarid herbland New Phytologist Lancaster v 154 n 1

p 209-218 2002

OumlPIK M MOORA M LIIRA J ZOBEL M Composition of root-colonizing arbuscular

mycorrhizal fungal communities in different ecosystems around the globe Journal of Ecology

London v 94 p 778-790 2006

PAULA MA REIS VM DOumlBEREINER J Interaciotns of Glomus clarum with Acetobacter

diazotrophicus in infection os sweet potato (Ipomoea batatas) sugarcane (Saccharum spp) and

sweet sorghum (Sorghum vulgare) Biology and Fertility of Soils Berlim v 11 p 111-115

1991

PEER Y van de WACHTER R de TREECON for Windows a software package for the

construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment

Bioinformatics Oxford v 10 n 5 p569-570 1994

107

QUILAMBO OA WEISSENHORN I DODDEMA H KUIPER PCJ STULEN I

Arbuscular mycorrhizal inoculation of peanut in low-fertile tropical soil II Alleviation of

drought stress Journal of Plant Nutrition Philadelphia v 28 p 1645-1662 2005

QUILLOY OT LANSANG PF Effectiveness of vesicular arbuscular mycorrhiza (VAM) in

promoting growth and yields of sugarcane Philippine Sugar Quarterly Quezon v 3 n 1 p 1-

7 1992

RAIJ B van ANDRADE JC CANTARELLA H QUAGGIO JA Anaacutelise quiacutemica para

avaliaccedilatildeo da fertilidade de solos tropicais Campinas Instituto Agronocircmico 2001 284 p

REDDY CN BHARATI BK TAJKUMAR HG SUNANDA DN Infectivity and efficacy

of four native vesicular-arbuscular mycorrhiza fungi on sugar cane Mycorrhiza News New

Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004

REDECKER D Specific PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal fungi within colonized

roots Mycorrhiza New York v 10 p 73-80 2000

REDECKER D HIJRI I WIEMKEN A Molecular identification of arbuscular mycorrhizal

fungi in roots perspectives and problems Folia Geobotanica Praha v 38 n 2 p 113-124

2003

REDECKER D MORTON J BRUNS TD Ancestral lineages of arbuscular mycorrhizal

fungi (Glomales) Molecular Phylogenetics and Evolution San Diego v 14 n 2 p 276-284

Feb 2000

REIS VM PAULA MA DOumlBEREINER J Ocorrecircncia de micorrizas arbusculares e da

bacteacuteria diazotroacutefica Acetobacter diazotrophicus em cana-de-accediluacutecar Pesquisa Agropecuaacuteria


RENKER C HEINRICHS J KALDORF M BUSCOT F Combining nested PCR and

restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize arbuscular mycorrhizal

fungi in roots from the field Mycorrhiza New York v 13 n 4 p 191-198 2003

RESENDE AS XAVIER RP OLIVEIRA OC URQUIAGA S ALVES BJR

BODDEY RM Long-term effects of pre-harvest burning and nitrogen and vinasse applications

on yield of sugar cane and soil carbon and nitrogen stocks on a plantation in Pernambuco NE

Brazil Plant and soil Dordrecht v 281 p 339-351 2006

ROSALES AM VALDEacuteZ M Arbuscular mycorrhizal colonization of lime in different

agroecosystems on the dry tropics Mycorrhiza New York v 6 p 105-109 1996

ROSENDAHL S STUKENBROCK E Community structure of arbuscular mycorrhizal fungi

in undisturbed vegetation revealed by analyses of LSU rDNA sequences Molecular Ecology

Oxford v 13 p 3179ndash3186 2004

108

ROZEN S SKALETSKY H Primer3 on the for general users and for biologists Programmers

Methods in Molecular Biology Clifton v 132 p 365-386 2000

SAITOU N NEI M The neighbor-joining method A new method for reconstructing

phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution Oxford v 4 p 406-425 1987

SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATS T Molecular cloning a laboratory manual 2nd

ed New York Cold Spring Harbor Laboratory 1989 653 p

SANDERS IR ALT M GROPPE K BOLLER T WIEMKEN A Identification of

ribosomal DNA polymorphisms among and within spores of the Glomales application to studies

on the genetic diversity of arbuscular mycorrhizal fungal communities New Phytolologist

Lancaster v 130 p 419ndash427 1995

SANTOS JC FINLAY RD TEHLER A Molecular analysis of arbuscular mycorrhizal fungi

colonising a semi-natural grassland along a fertilisation gradient New Phytolologist Lancaster

v 172 p 159ndash168 2006

SANTOS-GONZAacuteLEZ JC FINLAY RD TEHLER A Seasonal dynamics of arbuscular

mycorrhizal fungal communities in roots in a seminatural grassland Applied and


SCHLOSS PD HANDELSMAN J Introducing to DOTUR a computer program for defining

operacional taxonomic units and estimanting species richness Applied and Environmental

Microbiology Washington v 71 p 1501-1506 2005

SCHUumlSSLER A Glomeromycota phylogeny Disponiacutevel em

lthttpwwwlrz-muenchende~schuessleramphylogt Acesso em 08 dez 2008

SCHUumlSSLER A GEHRIG H SCHWARZOTT D WALKER C Analysis of partial

Glomales SSU rRNA gene sequence implications for primer design and phylogeny Mycological

Research Amsterdam v 105 p 5-15 2001

SCHWARZOTT D WALKER C SCHUumlSSLER A Glomus the largest genus of the

arbuscular mycorrhizal fungi (Glomales) is nonmonophyletic Molecular Phylogenetics and

Evolution San Diego v 21 p 190ndash197 2001

SHENG M TANG M CHEN H YANG B ZHANG F HUANG Y Influence of

arbuscular mycorrhizae on photosynthesis and water status of maize plants under salt stress

Mycorrhiza New York v 18 p 287-296 2008

SHEPHERD M NGUYEN L JONES ME NICHOLS JD CARPENTER FL A method

for assessing arbuscular mycorrhizal fungi group distribution in tree roots by intergenic

transcribed sequence variation Plant and Soil Dordrecht v 290 p 259-268 2007

SILVA FC da (Coord) Manual de anaacutelises quiacutemicas de solos plantas e fertilizantes

Campinas Embrapa Informaacutetica Agropecuaacuteria Rio de Janeiro Embrapa Solos 1999 370 p

109

SIMON L LALONDE M BRUNS TD Specific amplification of 18S fungal ribosomal

genes from vesicular-arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing roots Applied

Environmental Microbiology Washington v 58 p 291-295 1992

SINGLETON DR FURLONG MA RATHBUN SL WHITMAN WB Quantitative

comparisons of 16S rRNA gene sequence libraries from environmental samples Applied and


SIQUEIRA JO Avanccedilos em fundamentos e aplicaccedilatildeo de micorrizas Lavras Universidade

Federal de Lavras 1996 290 p

SMITH SE BARKER SJ Plant phosphate transporter genes help harness the nutritional

benefits of arbuscular mycorrhizal symbiosis Trends in Plant Science London v 7 p 189-

190 2002

SMITH SE READ D J Mycorrhizal symbiosis 2nd

ed New York Academic Press 1997

605 p

SOUZA FA KOWALCHUK GA LEEFLANG P VEEN JAV SMIT E PCR-

Denaturing gradient gel electrophoresis profiling of inter- and intraspecies 18S rRNA gene

sequence heterogeneity is an accurate and sensitive method to assess species diversity of

arbuscular mycorrhizal fungi of the genus Gigaspora Applied and Environmental

Microbiology Washington v 70 n 3 p 1413ndash1424 2004

SOUZA SL Anaacutelises do proteome de raiacutezes de cana-de-accediluacutecar e da expressatildeo de uma

peroxidase apoplaacutestica responsiva agrave micorriza arbuscular 2006 100p Tese (Doutorado em

Microbiologia Agriacutecola) ndash Escola Superior ldquoLuiz de Queirozrdquo Universidade de Satildeo Paulo

Piracicaba 2006

STUKENBROCK EH ROSENDAHL S Development and amplification of multiple co-

dominat genetic markers from single spores of arbuscular mycorrhizal fungi by nested multiplex

PCR Fungal Genetics and Biology San Diego v 42 n 1 p 73-80 2005

TAKAHASHI D Anaacutelise de sequumlecircncias expressas em raiacutezes de cana-de-accediluacutecar colonizadas

por Glomus clarum 2005 117 p Tese (Doutorado em Microbiologia Agriacutecola) ndash Escola

Superior ldquoLuiz de Queirozrdquo Universidade de Satildeo Paulo Piracicaba 2005

TAMURA K DUDLEY J NEI M KUMAR S MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics

Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution Oxford v 24

p 1596-1599 2007

TOMMERUP IC Spore dormancy in vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi Transactions of

the British Mycological Society London v 81 n 1 p 37-45 1983

VANDENKOORNHUYSE P BALDAULF SL LEYVAL C STRACZEK J YOUNG

JPW Extensive fungal diversity in plant roots Science Washington v 295 p 2051 2002

110

WALDROP MP ZAK DR BLACKWOOD CB CURTIS CD TILMAN D Resource

availability controls fungal diversity across a plant diversity gradient Ecology Letters Oxford

v 9 p 1127-1135 2006

WALKER C BLASZKOWSKI J SCHWARZOTT D SCHUumlSSSLER A Gerdemannia gen

nov a genus separated from Glomus and Gerdemanniaceae fam nov a new family in the

Glomeromycota Mycological Research Amsterdam v 108 p 707ndash718 2004

WHITE T J BRUNS T LEE S TAYLOR J Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics In INNIS MA GELFAND DH SNINSKY JJ

WHITE TJ (Ed) Protocols a guide to methods and applications San Diego Academic Press

1990 p 315-322


Engenheiro Agrocircnomo


Orientador

Prof Dr MAacuteRCIO RODRIGUES LAMBAIS

Tese apresentada para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em


Plantas

Piracicaba

2008







CDD 63361 A994c


3

DEDICO

A Deus




4

AGRADECIMENTOS
























laboratoacuterio


projeto




5








6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322







CDD 63361 A994c


3

DEDICO

A Deus




4

AGRADECIMENTOS
























laboratoacuterio


projeto




5








6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

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-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

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10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

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(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

3

DEDICO

A Deus




4

AGRADECIMENTOS
























laboratoacuterio


projeto




5








6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

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Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

4

AGRADECIMENTOS
























laboratoacuterio


projeto




5








6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

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72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

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00

01

02

03

04

05

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07

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10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

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(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

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09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

5








6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

6

SUMAacuteRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9





















7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

7



















REFEREcircNCIAS 101

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

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05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

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0008

0010

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(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

8

RESUMO

































ecologia dos mesmos


9

ABSTRACT































10








BARKER 2002)
























11












12

2 DESENVOLVIMENTO





























13






























14































15
































16




do ambiente


























17


















18























disponiacuteveis






19
















- Glomus clarum

- Gigaspora rosea


- Glomus etunicatum











20

Meacutetodos














As amostras foram












ordmC




21

































22
































23



[DNA] = (50 ngμL-1

x D) x (A260 - A320)

Onde






















Green




24































25





























26










nu-SSU-1196


Modificado de

Borneman

Hartin (2000)

















8 minutos



27































28


























CTC (V)




29





























30





























31















accediluacutecar













descrito acima

32






























33























) e X-Gal




mL-1




34































oC e 1 minuto a

35

60 o






























36









anterormente












37





















Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

Massa (ng)

100 60 40

20

10

5

38




















A B

a a

b b

c

a

b bc

c

39










A260A

280

40



FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + - + 83

Kit MoBio - + + - - + 50




FA ()

40 60 40 40 - 60




FMA inoculado

Meacutetodo

A

scrobiculata

G

rosea

G

clarum

G

etunicatum

P

brasilianum

G rosea e S

heterogama FA ()

Kit Bio101 + + + + + + 100

Kit MoBio - + + - + + 67




Freq () 60 80 100 80 60 100


41




















93 de similaridade








42



(continua)





















































43
























































44
























































45



(conclusatildeo)
































46








47




















modificado


Tamanho

esperado do

amplicon (pb)








48






























































49

































































50
































51
















































52





















Iniciador

Iniciador

Iniciador

Amostra

Amostra

1000 750 500 300 150 50

pb

1000 750 500 300 150 50

pb

53












pb

1000 750

500

300 150

50

54






negrito

55






negrito








56

A




























57




Solo

pH ns ns

H+Al (mmolckg-1

) ns ns ns

Ca (mmolckg-1

) ns ns ns

Mg (mmolckg-1

) ns ns ns

K (mmolckg-1

) ns ns ns

P (mgkg-1

) ns ns ns


) ns ns ns

CTC (mmolckg-1

) ns ns ns

Soma de Bases ns ns










Solo


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

58


Atributo SQ CQ

SP813250 SP801842 RB72454 SP813258 SP801842 RB72454


H+Al (mmolckg-1


Ca (mmolckg-1


Mg (mmolckg-1


K (mmolckg-1


P (mgkg-1




SB (mmolckg-1


CTC (mmolckg-1









+ e K

+

59






solo












(Tabela 9)




Variedade Manejo


SP813250 1350 73 1341 142 1346 101

SP801842 1226 95 1435 141 1330 157

RB72454 1247 17 1384 138 1315 115

Meacutedia 1274 83 1386 128 1330 120



a 15 Mgha-1

ano-1


60






















) encontrada



61






















Esp

oro

s p

or

50

g d

e so

lo

Variedade

Manejo

62



















Variedade


63
















64



preacutevia (CQ)

SQ CQ





Acaulospora sp 1 25 33 - - 33 25 193



Acaulospora sp 4 - 33 25 20 - - 130





Gigaspora sp 25 33 25 60 33 25 335







Glomus sp 1 50 100 50 80 66 50 660

Glomus sp 2 - 33 - 40 33 - 177

Glomus sp 3 50 33 - 20 - - 172

Glomus sp 4 50 33 25 20 33 25 310

Glomus sp 5 25 33 25 - 33 - 193

Glomus sp 6 50 66 50 80 33 50 548

Glomus sp 7 - - 50 20 - - 117

Glomus sp 8 - - - - 33 - 55

Glomus sp 9 - - - 20 - - 33

Glomus sp 10 25 - - - - - 42






Meacutedia1

1894 2406 1742 2485 1900 1818


65



SQ CQ





Acaulospora sp 1 050 033 - - 167 025 046

Acaulospora sp 2 - - - - 067 - 011

Acaulospora sp 3 - - 050 - - - 008

Acaulospora sp 4 - 067 050 040 - - 026

Acaulospora sp 5 - - - - 033 - 006

Acaulospora sp 6 - - 025 - - - 004

Acaulospora sp 7 - - - - - 025 004


Gigaspora sp 025 033 025 060 067 025 039

Glomus clarum 025 - - - - - 004





Glomus sinuosum 025 - - 040 - 025 017

Glomus sp 1 275 900 100 840 267 200 430

Glomus sp 2 - 100 - 040 067 - 034

Glomus sp 3 125 033 - 020 - - 030

Glomus sp 4 075 100 100 040 100 025 073

Glomus sp 5 125 133 025 - 067 - 058

Glomus sp 6 925 400 275 360 400 500 477

Glomus sp 7 - - 200 060 - - 043

Glomus sp 8 - - - - 100 - 017

Glomus sp 9 - - - 020 - - 003

Glomus sp 10 025 - - - - - 004








66



















C B

A

D

E

67



















68





Comunidade SFMAsa

Shannonb 1D

bc Equitabilidade

d ACE-1

Chao1

ECA

e

SEM QUEIMA

SP813250 625 138 348 080 1108 945 088

SP801842 800 171 452 082 1407 115 088

RB72454 575 139 373 081 653 61 093

COM QUEIMA

SP813258 820 176 494 085 1232 1166 090

SP801842 667 157 445 087 707 69 098

RB72454 600 136 320 081 1893 1225 061

Todos os

tratamentosf 33 248 878 071 562 481 0983





Pielou e -



69
















70
























ZHIWEI 2005)

71



A

hi

hi

ap

ap

he

B ap

F en

G

ve ve

ve

ve

H ar

ar

ar ar

ar

ar

E ar

D

hi

hi

hi

C

pe

hi

hi

72




Manejo


SP813250 5187 1085 aA 3623 1044 aB

SP801842 4520 1511 aA 3010 394 aB

RB72454 4933 643 aA 3124 1088 aB













) no solo A












73































74














(1)

SEM QUEIMA










COM QUEIMA















75








colheita


76





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 50 10 34 (14 165) 18 (11 53) 134 (099 169) 233 (132 909) 0880

COM QUEIMA 76 11 51 (18 246) 23 (13 79) 099 (067 131) 164 (078 1429) 0908



semelhanccedila b


77





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Cob

ertu

ra

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cx-C

xy)2Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0005

0010

0015

0020

0025

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

78





























79





SEM QUEIMA







COM QUEIMA



B AM1 D1107 Phoma sp [EU8264811] 100 26





80








colheita


81





ACE-1 Chao1

Shannona

1Dab

SEM QUEIMA 41 6 64 (60 116) 65 (60 144) 1366 (1103 1630) 292 (209 484) 0976

COM QUEIMA 39 3 40 (31 141) 35 ( 30 114) 0320 (0058 0583) 117 (049-320) 0974





82





00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

00 01 02 03 04 05 06


Co

ber

tura

0000

0100

0200

0300

0400

0500

0600

0700

0800

(Cy

-Cy

x)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cx-Cxy)2

95XY

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

0 01 02 03 04 05 06


Co

bertu

ra

0000

0002

0004

0006

0008

0010

0012

(Cx

-Cx

y)2

Homoacutelogo

Heteroacutelogo

(Cy-Cyx)2

95YX

A B

83































84














(Figura 30)


















85







(2)

SEM QUEIMA

















Com Queima

















similaridade (2)


86





(2)

SEM QUEIMA


















COM QUEIMA





















87





(2) E-value

SEM QUEIMA




















COM QUEIMA














88





(2) e-value

SEM QUEIMA
















COM QUEIMA



















89







90







91







92







93





94









ECAc

ACE-1 Chao1

Shannona

1Da b

SEM QUEIMA 67 26 1777 (621 6645)

2160 (1066 4738)d

2544 (2242 2845) 679 (447 1412) 0701

COM QUEIMA 58 28 1080 (511 3057) 641( 391 1457) 2808 (2520 3096) 904 (631 1953) 0683


2650(1145 7616) 3134 (2898 3370) 1083 (715 2232) 0712

95





B A

96
































97
































98






























FMAs nas amostras

99

























100

3 CONCLUSOtildeES
















101

REFEREcircNCIAS







1990



















4360 2000





406 2006

102


















08 dez 2008



v 130 p 259ndash265 1995








London v 16 n 22 p 10881-10890 1988







103










p 13-15 1990


















v 80 n 2 p 211-216 1988



London v 46 p 235-244 1963



104



n 1 p 19-22 2001







v 396 p 69-72 1998



















Cambridge v 161 p 503-515 2003







105




224 2005









York v 14 p 145-163 2004



2004







2008



Amsterdam v 54 p 367-373 2005




p 103ndash111 1996





106


























p 209-218 2002



London v 94 p 778-790 2006




1991




107






7 1992





Delhi v 16 n 2 p 9-12 2004





2003



Feb 2000
















108













v 172 p 159ndash168 2006























109











190 2002



605 p









Piracicaba 2006









p 1596-1599 2007





110



v 9 p 1127-1135 2006







1990 p 315-322

Documents

New Universidade de São Paulo - USP · 2009. 3. 11. · simbióticas com a maioria das plantas vasculares. Normalmente, as hifas dos FMAs crescem no solo e colonizam o interior das