Noelita Melo de Sousa

UFSM

Tese de Doutorado

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM

RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS

ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS

Noelita Melo de Sousa

PPGMV

Santa Maria, RS, Brasil

2002

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM

RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS

ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS

por

Noelita Melo de Sousa

Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Fisiopatologia da

Reprodução, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Medicina Veterinária

PPGMV

Santa Maria, RS, Brasil

2002

i

Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPOTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS

elaborada por Noelita Melo de Sousa

Como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Medicina Veterinária

COMISSÃO EXAMINADORA:

__________________________ Dr. José Ricardo de Figueiredo

(Presidente/Orientador)

__________________________ ___________________________ Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves Dr. João Francisco C. de Oliveira

__________________________ ___________________________ Dr. José Carlos Ferrugem Moraes Dr. Carlos Fernando de Mello

Santa Maria, 26 de março de 2002

ii

XXXX Sousa, Noelita Melo.

Purificação, caracterização e dosagem radioimunológica de

glicoproteínas associadas à gestação em zebuínos. Santa Maria: UFSM,

2002.

376 p. il.; 290 cm.

Tese (Doutorado) UFSM. CCR

1. Zebu – Reprodução. I. Título

CDD: XXX.XXXXX

© 2002

Todos os direitos autorais reservados a Noelita Melo de Sousa. A reprodução de partes

ou do todo deste trabalho só poderá ser feita com autorização por escrito do autor.

Endereço. Rua Guilherme Rocha, n. 1015, Bairro Centro, Fortaleza, CE, Brasil, CEP

60030-141. Fone/Fax (0xx) 85 2262138; End. Eletr. [email protected]

iii

Não tireis de vosso aprendizado a conclusão de que sabeis tudo, mas sim de que vos resta

infinitamente a saber.

(Pascal)

iv

A Deus, A minha mãe, irmão e amigos A Jean-Pierre A Georgette

Dedico

v

AGRADECIMENTOS

Ao Professor José Ricardo de Figueiredo, pelo apoio incondicional,

pelos inestimáveis conselhos e pela confiança em mim depositada ao longo

dos últimos anos.

Ao Professor Jean-François Beckers, co-promotor deste trabalho, pela

hospitalidade no Serviço de Fisiologia da Reprodução da Universidade de

Liège, Bélgica, e sem o qual não teria sido possível a execução deste

trabalho. A ele, minha mais profunda gratidão pelas críticas sempre

construtivas, pela sua paciência inesgotável e pelos valiosos conselhos

bioquímicos que revelaram em mim o interesse pelo estudo das proteínas

placentárias de ruminantes.

Ao Médico Veterinário Benoît Remy, inestimável amigo, pelos

ensinamentos das técnicas de cromatografia e eletroforese e pelos valiosos

conselhos durante a execução do presente trabalho.

Ao Dr. Jean Closset, do Serviço de Bioquímica do Centro Hospitalar

da Universidade de Liège, pela incansável participação nos seminários que

nos ajudaram a construir o presente projeto de tese.

Ao Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves, co-promotor deste trabalho,

pela sua amável acolhida na Universidade Federal de Santa Maria e pelos

conselhos judiciosos ao longo do doutorado. A ele, minha sincera gratidão

pelo constante encorajamento à realização da tese, em colaboração com a

Universidade de Liège.

Ao Dr. Jairo Pereira Neves, pelos valiosos conselhos em obstetrícia de

ruminantes e pela acolhida na Universidade Federal de Santa Maria.

Ao Dr. Rudi Weiblen, Coordenador do Programa de Pós-Graduação

vi

em Medicina Veterinária, pelos constantes e valiosos conselhos que em

muito asseguraram minha estadia na Universidade de Liège.

À Dra. Margot Alves Nunes Dode, pela sua acolhida no Centro

Nacional de Pesquisa de Gado de Corte (CNPGC) de Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e pelo seu inestimável auxílio nas

fases iniciais de execução do presente trabalho.

Ao Doutor Moussa Zongo, da Universidade de Ouagadogou (Burkina-

Faso), pelos valiosa colaboração ao estudo da endocrinologia placentária

em zebuínos.

Aos Doutores Zladislaw Gajewski (Universidade de Agricultura de

Varsovia, Polônia), Alessandro Debenedetti (Universidade de Perúgia,

Itália), Hamidou Hamadou Tamboura (Centro de Pesquisas Agrárias e

Ambientais, Burkina-Faso), Fernando Moreira da Silva (Universidade dos

Açores, Portugal) e Luc Liégeois (Genes Difusion, Douai, França) pela

preciosa colaboração científica e ensinamentos a mim transmitidos.

A todos os amigos, funcionários, estudantes e estagiários do Serviço

de Fisiologia da Reprodução da Universidade de Liège, e em especial a

Bouchra El Amiri, Raja Fares, Nicole Gerardin-Otthiers, Bianca

Carstanjen, Aude-Marie Bestel, Astrid Rutten, Petry Calero, Salima

Charallah, Christine Poullet, Isabelle Moers, Henri Desbuleux, José Sulon,

Jean-Luc Pirson, Claude Ernotte, Zsolt Pérènyi, Aly Karen e Rogélio

Ledezma pela preciosa colaboração durante minha estadia em Liège e pelo

espírito de grupo com que sempre fui acolhida.

Aos colegas, professores e funcionários do Programa de Pós-

Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Santa

Maria, e em especial a Aura Chaves Rosauro, Silvia Ferreira Carâmbula,

vii

Nilzane Beltrão, Marta Pasin, Patrícia Salla, Daniela dos Santos Brum,

Patrícia Feruzzi e Roselene Ecco, pela amizade e companheirismo que

sempre foram para mim um estímulo à continuação deste trabalho.

Aos colegas, pesquisadores e funcionários do Centro Nacional de

Pesquisa do Gado de Corte, e em especial a Norma Cléa Rodovalho,

Vanessa Gomes Ueno e Paulo Roberto Adona, pela valiosa colaboração na

coleta de placentas e de amostras sangüíneas.

À Coordenação do Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de estudo ao longo do curso.

Ao Fundo Nacional para a Pesquisa Científica e ao Ministério da

Agricultura (Bélgica) pelo suporte financeiro dado à realização do presente

trabalho experimental.

A todos que de uma maneira ou de outra, contribuíram para a

realização deste trabalho. É para mim um dever, mas sobretudo, uma honra

poder agradecer-lhes sinceramente.

viii

SUMÁRIO

Lista de Tabelas.....................…………………………………..… 01

Lista de Figuras…………...…………………………….……..….. 04

Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas……………………..…. 11

Lista de Anexos.………………………………………………..…. 16

Lista de Apêndices……………………………………………..…. 17

Resumo..……………………………………...………………..…... 19

Abstract..………………………………….…………………..…... 20

Résumé.............................................................................................. 21

1. Introdução…….……………………………………….…..…… 22

2. Revisão de Literatura ……………………………………..…… 27

2.1. O gado zebu………………………………................................ 27

2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino.................. 27

2.1.2. As raças zebuínas..................................................................... 30

2.2. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de

origem zebuína............................................................................

32

2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos................ 32

2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral............................ 34

2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação........................................ 38

2.3. Proteases aspárticas.................................................................... 40

2.3.1. Terminologia............................................................................ 40

2.3.2. Classificação das proteases...................................................... 41

2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas……………………...……. 45

2.3.4. Inibição das proteases aspárticas…………............................. 47

ix

2.4. As proteínas placentárias............................................................ 48

2.4.1. A placenta…………………………….…………..…………. 48

2.4.1.1. Tipos de placenta………………………….......…………... 49

2.4.1.2. O placentoma………………………………..…………….. 53

2.4.1.3. As células binucleadas………………………..…………… 54

2.4.2. Proteínas placentárias………………………..……..……….. 57

2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)….……….………..……... 59

2.4.2.2. Interferons tau (IFNτ).……………………..…..…...……... 62

2.4.2.3. Fator precoce da gestação (EPF).………....…….…..…...... 66

2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL)....………..…….. 67

2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas gestação (PAGs).......... 71

a) Família das PAGs bovinas..…..……………………..…..…......... 72

b) Família das PAGs ovinas………………………………..…........ 84

c) Família das PAGs caprinas…………………………..….............. 85

d) Outras PAGs…………….….………………………..….............. 86

e) Dosagens de PAG..…………..………………………….............. 87

f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o

isolamento bioquímico e identificação sorológica das PAGs........

94

3. Material e Metodologia............................................................... 101

3.1. Experimento 1 – Isolamento de glicoproteínas associadas

à gestação.........................................………

101

3.1.1. Protocolo 1……………………………………………..……. 102

3.1.1.1. Determinação da imunorreatividade e da proteína total…... 102

3.1.1.2. Coleta de placentas………….…………...……..…………. 102

3.1.1.3. Isolamento da PAG………….…….…………...…..……… 103

x

a) Extração de proteínas solúveis………….…………...…..……… 103

b) Precipitação ácida…….……………………….……...……......... 104

c) Precipitações ao sulfato de amônia…….…….…….....…………. 105

d) Cromatografia de troca de ânions………….………......………... 106

e) Cromatografia de troca de cátions……………….…..…...….….. 107

3.1.1.4. Caracterização da PAG……………………………..…...… 108

a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida

em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE)…..…

108

b) Western Blot……………………………………………..…..….. 109

c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel

de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio

(2-D SDS-PAGE)……….………………………………..……...

110

d) Análise da seqüência N-terminal…………................................... 111

3.1.2. Protocolo 2…...………….………………………………..…. 112

3.1.2.1. Coleta de placentas…….…………………...………......…. 112

3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis….….………..……..……… 113

3.1.2.3. Cromatografia de afinidade…….…………...……..……… 114

3.1.2.4. Caracterização da PAG…………………………....………. 114

3.2. Experimento 2 – Dosagens radioimunológicas da PAG

durante a gestação e período pós-parto

em fêmeas zebu………………………..….

115

3.2.1. Animais……………………………………………..……….. 115

3.2.2. Amostras de sangue…………………………………..……... 115

3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA…………..…... 116

3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA................. 118

3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA.................................. 120

xi

3.2.6. Análise estatística.................................................................... 120

4. Resultados..................................................................................... 122

4.1. Experimento 1 – Purificação de glicoproteínas associadas à

gestação.......................................……...…..

122

4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias

de troca de íons (Protocolo 1)…………………………..……

122

4.1.2. Análise da sequência N-terminal das proteínas

imunoreativas isoladas com o auxílio de cromatografias

de troca de íons (Protocolo 1)..................................................

129

4.1.3. Caracterização da PAG identificada após a realização

de cromatografias de afinidade em gel de pepstatina

A-agarose (Protocolo 2)……...................................................

131

4.2. Experimento 2 – Dosagens rádio-imunológicas da PAG

(PAG-RIA) durante a gestação e período

pós-parto em fêmeas zebu…………..…….

135

4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA…...............…..…….. 135

4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak…..…………………..…… 137

4.2.3. Perfil atípico de PAG.....................……………………..…… 138

5. Discussão....................................................................................... 141

5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de

troca de íons................................................................................

141

5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização

de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina

A-agarose....................................................................................

145

5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação

e período pós-parto em fêmeas zebu..........................................

148

xii

6. Conclusão...................................................................................... 154

7. Referências Bibliográficas........................................................... 155

1

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio

catalítico de diversas proteases aspárticas. Estão indicados (inclusos

em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal

encontrada nos pepsinogênios A e C. Informações sobre as

seqüências de aminoácidos foram obtidas no banco de dados

GenBank...............................................................................................

45

TABELA 2 - Classificação das placentas em diferentes espécies

mamíferas.............................................................................................

50

TABELA 3 - Identificação de proteínas específicas ou associadas à

gestação em mamíferos euterianos.......................................................

73

TABELA 4 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio

catalítico de diversas PAGs. Estão indicados (inclusos em

retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal

encontrada em proteases enzimaticamente ativas tais como o

pepsinogênio. Informações sobre as seqüências de aminoácidos

foram obtidas do banco de dados GenBank.........................................

78

2

TABELA 5 - Seqüência N-terminal das principais formas de PAG

identificadas até o presente. Com exceção da boPAG-1, todas as

seqüências foram deduzidas a partir do ARN mensageiro ou do

ADN codificante obtidos por biologia molecular................................

81

TABELA 6 - Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de

proteínas totais (PT) obtidas após diferentes etapas de extração e

precipitação..........................................................................................

122

TABELA 7 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de

proteínas totais (PT) mensuradas após eluição na coluna de

Sephadex A25......................................................................................

123


proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM

Cerâmica das frações DEAE 0 M e 0,02 M NaCl................................

124



Cerâmica das frações DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl...........................

125



Cerâmica das frações DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl...........................

126

TABELA 11 - Características eletroforéticas e identidade ao nível

de seqüência N-terminal das proteínas mais imunoreativas isoladas

pela cromatografia em resina CM cerâmica.........................................

129

TABELA 12 - Características dos sistemas RIA com e sem etapa de

pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as

3

concentrações de PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas

zebu gestantes...........................................................................................

135

TABELA 13 - Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e inter-

ensaio dos sistemas de dosagem com e sem etapa de pré-incubação

(RIA-PI e RIA-SPI)..................................................................................

136

4

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae

identificadas até o presente. Entre parênteses constam o nome dado

à espécie domesticada. ✝Espécie extinta. Adaptado de PAYNE

(1991)...................................................................................................

28

FIGURA 2 - Representação esquemática das alterações das

concentrações hormonais durante o ciclo estral de bovinos.

Adaptado de PETERS & LAMMING (1983)......................................

36

FIGURA 3 - Concentração de 17-β-estradiol plasmático durante a

gestação em vacas zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e

gemelares (-▲-▲-). Adaptado de SHELTON & SUMMERS (1983)....

39

FIGURA 4 – Concentração plasmática de progesterona durante a

gestação em vacas zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA

& TEGEGNE (1989)............................................................................

40

FIGURA 5 - Representação da distribuição de resíduos hidrófobos

ao nível do sítio catalítico do pepsinogênio suíno. As cadeias laterais

Asp e Glu estão representadas pela cor preta. Os resíduos

5

hidrófobos, assim como os resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão

representados pela cor cinza escura. Os resíduos situados fora do

centro catalítico estão representados pela cor cinza clara. Adaptado

de DUNN et al. (1995).........................................................................

46

FIGURA 6 - Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre

de gestação. Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da

placenta................................................................................................

52

FIGURA 7 - Diagrama esquemático da migração das células

binucleadas em bovinos. 1) Células binucleadas no lado fetal; 2)

Contato com a junção microvilositária; 3) Fusão com células fetais,

dando origem a células trinucleadas de vida curta; 4) Exocitose dos

grânulos; 5) Células após exocitose, com citoplasma reduzido e

núcleo denso e 6) Células reabsorvidas pelo trofectoderme.

Adaptado de WOODING & WATHES (1980)...................................

56

FIGURA 8 - Micrografia eletrônica do placentoma de vacas no 150o

dia de gestação fixadas em araldite. Os grânulos secretórios foram

corados pelo ácido fosfotungstico. A interrupção da junção

microvilositária entre o trofoectoderma (T) e o epitélio uterino (U) é

indicada por flechas. A) Migração das células trofoblásticas

binucleadas em direção à junção microvilositária; B) Célula

binucleada logo após sua fusão com uma célula epitelial uterina

(indicada por asterisco); C) Célula trinucleada no epitélio uterino.

Adaptado de WOODING & BECKERS (1987)..................................

58

FIGURA 9 - Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio

lactogênio placentário bovino dosado na circulação materna e fetal.

6

Adaptado de BECKERS et al. (1982).................................................. 70

FIGURA 10 - Seqüência de aminoácidos da boPAG-1 deduzida a

partir da seqüência em ADN por XIE et al. (1991). Estão indicados

as seqüências sinal, o propeptídeo, a extremidade N-terminal (20

aminoácidos) assim como a cadeia madura. As flechas indicam o

final do segmento sinal e do propeptídeo. Os sítios catalíticos

encontram-se circundados. Sítios potenciais de glicosilação são

indicados por asteriscos........................................................................

76

FIGURA 11 - A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG-

1. B) Estrutura tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina

A (situada entre P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al.

(1998)...................................................................................................

77

FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos

mostrando o relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o

momento, assim como o de algumas proteinases aspárticas presentes

em mamíferos. Adaptado de GREEN et al. (2000)..............................

82

FIGURA 13 - Variação cronológica do ADN complementar das

PAGs em bovinos (boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da

gestação. Adaptado de GREEN et al. (2000).......................................

83

FIGURA 14 - Expressão do ADN codificante para as PAGs bovinas

e ovinas identificadas até o presente. As PAGs expressas

predominantemente em células binucleadas correspondem a

proteínas estreitamente relacionadas. As PAGs expressas de modo

difuso no trofectoderme representam os mais antigos membros desta

família de proteases aspárticas. Adaptado de GREEN et al.

7

(2000)................................................................................................... 84

FIGURA 15 - Perfil das concentrações de PAG (média ± DP)

calculados no soro de 20 vacas coletadas do 20o dia de gestação ao

100o dia após o parto. Utilizou-se escala aritmética das

concentrações de PAG do 20o ao 220o dia de gestação (A) e escala

logarítmica do 40o dia antes do parto ao 80o dia após o parto (B).

Adaptado de ZOLI et al. (1992a).........................................................

89

FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações

de boPAG-1 observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-)

e de gestações normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al.

(1996a).................................................................................................

91

FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4

(-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação

inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um

diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação

direta da morte fetal (MF). Adaptado de SZENCI et al. (1998a)........

93

FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A,

utilizada para a purificação de proteases aspárticas.............................

97

FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG

extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de

cromatografias de trocas de íons..........................................................

103

FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de

placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de afinidade.......

113

FIGURA 21 - Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32

8

M NaCl submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x

3 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a

10 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas

hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada

cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e

proteína total (PT)................................................................................

127

FIGURA 22 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após

coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas

imunoreativas por meio de Western Blot com o uso do AS497 (anti-

boPAG67). As pistas 1, 2, 3, 4 and 5 correspondem aos piques mais

imunoreativos obtidos após cromatografia em resina CM cerâmica

das frações DEAE 0, 0,02, 0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte

microgramas de proteínas de cada pique foram carregadas. As

massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e

direito das Figuras 22A e 22B, respectivamente..................................

128

FIGURA 23 - 2-D SDS-PAGE do pique mais imunoreativo obtido

após cromatografia em resina CM Cerâmica da fração DEAE 0,32

M NaCl. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas no lado

direito da figura. A escala de pH está indicada na parte superior do

gel. As setas indicam as diferentes isoformas (6,4, 6,3, 6,1 e 5,8) da

alfa-N-acetilgalactosaminidase............................................................

130

FIGURA 24 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-

agarose. A extração das placentas coletadas entre 20 e 21 semanas

de gestação foi feita em pH ácido (KCl a 0,3 M, pH 5,0). A coluna

(1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio

9

50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área

hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica

a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado

por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT)....................................

131

FIGURE 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após

coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas

imunoreativas por meio de Western Blot com o uso dos anti-soros

anti-boPAG67 (AS497), anti-caPAG55+62 (R706) and caPAG55+59

(R708). As pistas 1 e 2 correspondem aos piques mais

imunoreativos obtidos após cromatografia em pepstatina A-agarose

após extração em pH ácido e alcalino, respectivamente. Sessenta

microgramas das proteínas imunoreativas de cada pique foram

carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos

lados esquerdo e direito das Figuras 25A e 25B, respectivamente......

132

FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-

agarose. A extração das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas

de gestação foi feita em pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia

a 0,05 M, pH 8,5). A coluna (1 x 4 cm) foi previamente equilibrada

em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o

gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais

imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e

proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo

método de Lowry (PT).........................................................................

134

FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos

sistemas de dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem

10

etapa de pré-incubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das

concentrações de PAG.........................................................................

136

FIGURA 28 - Concentrações plasmáticas de PAG (média ± DP)

durante a gestação e período pós-parto em 10 fêmeas zebu da raça

Azawak. A 40a semana de gestação corresponde à semana do parto

(0pp). Diferenças significantes entre as semanas de gestação estão

indicadas por asteriscos (*P<0,0001, **P<0,05).................................

138

FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de

PAG mensuradas entre a parturição e a 10a semana pós-parto. As

concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram

concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por

círculos (●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas

concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final

da gestação foram representadas por quadrados (■)...........................

139

FIGURA 30 - Comparação dos perfis de PAG entre vacas Azawak

apresentando gestações normais (população homogênea) e a vaca

que apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um

baixo BCS ao final da gestação............................................................

140

11

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

aa : aminoácido

ADN : ácido desoxirribonucléico

Ag° : antígeno frio ou não-marcado

Ag* : antígeno quente ou marcado

APP : amyloid protein precursor ou proteína precursora de

amilóide

AS : anti-soro

α-GalNAc : alfa n-acetilgalactosaminidase

b ou bo : bovino(a)

B : binding ou ligação

BACE : beta-secretase

BCS : escore de condição corporal

B0 : tubo branco ou sem PAG

BSA : albumina sérica bovina

c ou ca : caprino(a)

°C : graus Celsius

CATD : catepsina D

CATE : catepsina E

cf : conferir

12

CG : chorionic gonadotrophin, gonadotrofina coriônica

ou hormônio coriônico somatomamotrófico

CHYM : quimosina

cm : centímetro

CM : carboximetil

CS : chorionic somatomammotrophin ou

somatomamotrofina coriônica

CV : coeficiente de variação

d : dia, exceto quando se refere a dalton

DEAE : dietilaminoetano

DP : desvio padrão

DTT : ditiotreitol

e ou eq : equino(a)

EDTA : ácido etilenodiaminotetracético

EPF : early pregnancy factor ou fator precoce da gestação

fe : felino

FPLC : fast flow liquid chromatography

FSH : hormônio folículo estimulante

g : grama, exceto quando se refere à aceleração

GLM : General Linear Model

GH : hormônio do crescimento ou hormônio somatotrófico

h : hora, exceto quando se refere à humano 125I : isótopo radioativo iodo 125

IA : inseminação artificial

IFNτ : interferon tau

Ig : imunoglobulina

l : litro

kDa : quilodalton

LH : hormônio luteinizante

M : molar

mA : miliampéres

13

MAF : fator ativador de macrófagos

MF : mortalidade fetal

mg : miligrama

min : minuto

ml : mililitro

mm : milímetro

mM : milimolar

MM : massa molecular

mt : mitocondrial

µg : micrograma

µl : microlitro

µm : micrômetro

n : número

ng : nanograma

NSB : non-specific binding ou atividade não-específica

N-terminal : aminoterminal

o ou ov : ovino(a)

p ou po : porcino(a)

PAG : pregnancy-associated glycoprotein ou glicoproteína

associada à gestação

PAS : ácido periódico de Schiff

PAGE : eletroforese sobre gel de poliacrilamida

PEP : pepsinogênio

PEPC : pepsinogênio C ou progastricsina

pg : picograma

PGE : prostaglantina E

PGF2α : prostaglandina F2α

pH : potencial hidrogeniônico

pI : ponto isoelétrico

PI : pré-incubação

PL : placental lactogen ou hormônio lactogênio placentário

14

PMSF : fenil-metilsulfonilfluoridro

PMSG : pregnant mare’s serum gonadotrophin ou

gonadotrofina sérica da égua prenhe

PRL : prolactina

PSPA : pregnancy-associated protein A ou alfa-fetoproteína

PSPB : pregnancy-associated protein B ou proteína específica

da gestação B

PSP-60 : pregnancy serum protein 60 ou proteína sérica da

gestação 60

PT : proteína total

PVDF : polivinilideno difluoridro

P4 : progesterona

RENI : renina

RIA : radioimunoensaio

S.A. : sulfato de amônia

SAS : Statistical Analysis System

SBU-3 : antígeno SBU-3

SBI : soy bean trypsin

SDS : dodecil sulfato de sódio

SF : serum free ou soro em PAG

SPI : sem pré-incubação

TBS : tampão tris salino

Tc : total counting ou atividade total

Tris : tris-hidroximetil aminometano

ze : zebra

15

Abreviação dos aminoácidos:

Código 1 letra Código 3 letras Aminoácido correspondente

A Ala : alanina

B Asx : aspartato ou asparagina

C Cis : cisteína

D Asp : aspartato ou ácido aspártico

E Glu : ácido glutâmico

F Fen : fenilalanina

G Gli : glicina

H His : histidina

I Ile : isoleucina

K Lis : lisina

L Leu : leucina

M Met : metionina

N Asn : asparagina

P Pro : prolina

Q Gln : glutamina ou glutamida

R Arg : arginina

S Ser : serina

T Tre : treonina

V Val : valina

W Trp : triptofano

Y Tir : tirosina

Z Glx : glutamato ou glutamina

16

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)........ 201

ANEXO B - Método Lowry para a dosagem de proteínas.............. 208

ANEXO C - Eletroforese monodimensional em gel de

poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D

PAGE SDS)………………………….…………………….............

210

ANEXO D – Técnica de Western Blot……………..…...…........... 214

ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D

PAGE-SDS)………………………………….........……………....

218

17

LISTA DE APÊNDICES

Apêndice 1 - Capítulo de Livro Publicado

SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001)

Placental Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and

zootechnical aspects. In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.),

Biotechnology in Animal Husbandry, Ed. Kluwer Academic

Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208. (Capítulo de

Livro)………………………………………….………………….

222

Apêndice 2 - Artigo Completo em Anais

SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R.; EL AMIRI, B.; BANGA-

MBOKO, H.; SZENCI, O. & BECKERS J.F. (2001) Chorioví

gonadotropin a specifický glykoprotein u březích přežvýkavcŭ

(Chorionic gonadotropins and pregnancy-associated

glycoproteins in ruminants). 3rd Central European Buiatric

Congress, 24 e 25 de Maio, Moravian Highlands, República

Tcheca, p. 430-432. (Conferência)…………………..…………...

277

18

Apêndice 3 - Artigo de Revisão (submetido)

MOREIRA DA SILVA, F.; SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R.

& BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação

materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da

mortalidade embrionária em bovinos (Placental proteins secreted

in maternal circulation: useful indicators for both pregnancy

diagnosis and embryonic mortality in bovine species). (artigo de

revisão submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia)………..

285

Apêndice 4 - Artigo Aceito

SOUSA, N.M.; REMY, B.; EL AMIRI, B.; BANGA-MBOKO,

H.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Characterization of

Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu (Bos

indicus) placentas removed at different gestational ages. (aceito

por Reproduction, Nutrition, Development)……...............…...

318

Apêndice 5 - Artigo Submetido

SOUSA, N.M.; ZONGO, M.; PITALA, W.; BOLY, H.;

SAWADOGO, L.; SANON, M.G.; FIGUEIREDO, J.R.;

GONÇALVES, P.B.D.; EL AMIRI, B.; PERÈNYI, Z. &

BECKERS, J.F. Pregnancy-Associated Glycoprotein

concentrations during pregnancy and postpartum period in

Azawak zebu cattle. (submetido à Theriogenology)…………….

348

Apêndice 6 - Resumos e Outros………………..…………….... 370

19

RESUMO Tese de Doutorado

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓG ICA DE

GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃOEM ZEBUÍNOS Autora: Noelita Melo de Sousa

Orientador: José Ricardo de Figueiredo Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.

As glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) constituem uma extensa família de proteases

aspárticas expressas na camada celular externa da placenta de artiodáctilos. Na primeira parte do presente trabalho, dois procedimentos bioquímicos foram usados para caracterizar as PAGs isoladas a partir de cotilédones fetais zebuínos (Bos indicus). O primeiro protocolo, usado para isolar as PAGs de placentas coletadas no último trimestre de gestação, incluiu a extração de proteínas em pH neutro, precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia, cromatografias de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo, usado para isolar a PAG a partir de placentas coletadas ao primeiro e segundo trimestres de gestação, incluiu a extração de proteínas em pH ácido e alcalino, seguida por cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose. O radioimunoensaio utilizado para a dosagem da PAG taurina foi empregado para monitorar a imunoreatividade ao longo do procedimento de isolamento. As frações resultantes das cromatografias de troca de cátions e de afinidade foram analisadas por eletroforese e Western Blot, antes de serem transferidas à membranas de polivinilideno difluoridro para a determinação da seqüência de aminoácidos N-terminal. Diferentes isoformas de PAG, com massas moleculares de 51 a 69 kDa e pIs de 3,1 a 6,7, foram identificadas em placentas de zebuínos. As proteínas imunoreativas resultantes da cromatografia de troca de cátions das frações DEAE 0 M a 0,16 M NaCl revelaram a existência de uma única seqüência N-terminal (entre 10 a 25 aminoácidos de comprimento), a qual é idêntica à seqüência da boPAG-1. A mesma seqüência (14 aminoácidos) foi encontrada após cromatografia de afinidade. Estes resultados indicaram a expressão de uma única seqüência N-terminal de PAG em placentas de zebuínos coletadas em diferentes estádios gestacionais. Na segunda parte do presente trabalho, dois sistemas radioimunológicos foram usados para determinar as concentrações plasmáticas de PAG durante a gestação e período pós-parto em vacas zebus da raça Azawak. Doze fêmeas diagnosticadas como gestantes por palpação retal tiveram amostras de sangue coletadas a intervalos de 5 a 10 dias. As coletas foram feitas aproximadamente entre a 8a semana de gestação e a 10a semana pós-parto. Uma vaca inicialmente diagnosticada como gestante mostrou concentrações de PAG inferiores à sensibilidade do teste (<0,20 ng/ml) e não pariu. Outra vaca mostrou concentrações de PAG anormalmente elevadas durante a gestação, sendo excluída do perfil normal de PAG. As outras 10 vacas diagnosticadas como gestantes apresentaram perfis de PAG bastante homogêneos. Nestes animais, as concentrações aumentaram progressivamente da 8a à 35a semanas de gestação (de 6,0±4,2 ng/ml a 196,0±34,8 ng/ml), permanecendo relativamente constantes até a 39a semana (210,8±74,8 ng/ml). Durante a última semana de gestação, as concentrações de PAG aumentaram significativamente (P<0,0001), sendo alcançadas os mais altos níveis (1.095,6±607,2 ng/ml). Após o parto, as concentrações de PAG diminuíram significativamente (P<0,05) até a 2a semana pós-parto (384,4±85,6 ng/ml) e após lentamente até a 10a semana. Estes resultados demonstraram que as concentrações plasmáticas de PAG em zebuínos foram inferiores às previamente observadas em raças taurinas entre a 35a e a 39a semanas de gestação.

20

ABSTRACT Tese de Doutorado



GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS (Purification, Characterization and Radioimmunoassay of Pregnancy-Associated

Glycoproteins Isolated from Zebu Cattle) Autora: Noelita Melo de Sousa


The pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of aspartic

proteinases expressed in the outer epithelial cell layer of the Artyodactyla placenta. In the first part of the present work, two biochemical approaches were used to characterize PAGs isolated from zebu (Bos indicus) fetal cotyledons. The first procedure, used to isolate PAG from zebu placenta removed late in pregnancy, included extraction of proteins at neutral pH, acidic and ammonium sulfate precipitations, anion and cation exchange chromatographies. The second procedure, used to investigate PAG in placentas removed at early and mid gestational periods, included protein extractions at acid or alkaline pH followed by pepstatin-A agarose affinity chromatography. A bovine PAG radioimmunoassay was used to monitor the immunoreactivity throughout the isolation procedures. The most immunoreactive fractions issued from cation exchange and affinity chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot, before transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH2-microsequence determination. By use of SDS-PAGE and Western Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular masses from 51 to 69 kDa and isoeletric points varying from 3.1 to 6.7 were identified in placentas from different gestational ages. After CM ceramic chromatography of all except 0.32 M NaCl DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal amino acid sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to bovine PAG-1. The same sequence (14 aa long) was found after pepstatin-agarose affinity chromatography of proteins extracted from placentas removed earlier in pregnancy. These results converged towards the expression of one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu placentas at different gestational ages. In the second part of this study, two specific RIA systems were developed then used to measure plasmatic PAG concentrations during gestation and postpartum period in Azawak zebu cows. Twelve females palpated per rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One zebu cow initially diagnosed as pregnant showed PAG concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20 ng/ml) and did not calve. Another cow showed abnormally high PAG concentrations during gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other zebu cows gave a very homogeneous PAG profile. In these animals, concentrations increased progressively from Week 8 to Week 35 of gestation (from 6.0±4.2 to 196.0±34.8 ng/ml), remaining relatively constant until Week 39 (210.8±74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their highest level (1,095.6±607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum. These results revealed that PAG concentrations in zebu cattle were lower than those previously described in taurine breeds between week 35 and 39 of gestation.

21

RESUME Tese de Doutorado



GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS (Purification, Caractérisation et Dosage Radioimmunologique des Protéines

Associées à la Gestation du Bétail Zébu) Autora: Noelita Melo de Sousa


Les protéines associées à la gestation (PAGs) constituent une grande famille de protéinases

aspartiques exprimées dans les cellules épithéliales de la couche superficielle du placenta des artiodactyles. Dans la première partie du présent travail, deux approches biochimiques ont été utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux recueillis à différents stades gestationnels chez le zébu (Bos indicus). Le premier procédé impliquait des précipitations acides et au sulfate d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie d’affinité de pepstatine-A agarose. Un dosage radioimmunologique était utilisé pour suivre l’immunoréactivité des fractions au cours des différentes étapes de purification. Les fractions les plus immunoréactives issues des chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysées par électrophorèse en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF) pour micro séquençage de la partie N-terminale. Différentes isoformes de PAG avec masses moléculaires apparentes allant de 51 à 69 kDa et de points isoélectriques compris entre 3,1 et 6,7 ont été identifiées à partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles. Après cromatographie par échange de cations, (fractions DEAE 0 M à 0,16 M NaCl) le microséquençage de la partie N-terminale (10 à 25 acides aminés) a indiqué l’expression d’une seule séquence N-terminale correspondant à celle décrite pour la PAG-1 de Bos taurus. La même séquence (14 acides aminés) a été obtenue après microséquençage de la partie N-terminale des protéines issues de cromatographies d’affinité. Dans la seconde partie de cette étude, deux systèmes de dosages radioimmunologiques spécifiques ont été développés et utilisés pour mesurer les concentrations plasmatiques de protéines associées à la gestation durant la gravidité et la période post partum chez les vaches Zébu Azawak. Douze femelles testées par palpation rectale et diagnostiquées comme gestantes ont subi des saignées à intervalles de 5 à 10 jours approximativement à partir de la 8e semaine de gestation jusqu’à la 10e semaine post partum. Une vache zébu diagnostiquée au départ comme gestante a montré des concentrations inférieures à la sensibilité du dosage (<0,20 ng/ml) et n’a pas vêlé. Une autre vache a montré des concentrations de PAG anormalement élevées durant la gestation, étant de ce fait statistiquement exclue du profil général de la concentration de PAG au cours de la gestation. Les dix autres vaches ont donné un profil très homogène. Chez ces animaux, les concentrations augmentaient progressivement à partir de la 8e semaine jusqu’à la 35e semaine (de 6,0±4,2 à 196,0±34,8 ng/ml), restaient ensuite relativement constantes jusqu’à la 39e semaine (210,8±74,8 ng/ml) époque à laquelle elles augmentaient rapidement pour atteindre leur valeur la plus élevée (1.095,6±607,2 ng/ml) au moment de la parturition. Après la délivrance, les concentrations de PAG déclinaient significativement (P<0,05) jusqu’à la 2e semaine post partum. Globalement, nos résultats ont montré que les concentrations de PAG chez les zébus étaient inférieurs à celles des races taurines entre la 35e et 39e semaines de gestation.

22

1. INTRODUÇÃO

O gado zebu (Bos indicus) é uma importante fonte de proteína animal

em países em vias de desenvolvimento situados nos continentes africano e

americano (CUNNINGHAM, 1992). Quando comparado ao gado taurino

(Bos taurus), ele apresenta uma notável adaptação ao clima árido ou semi-

árido, sendo mais eficaz quanto à extração de nutrientes de forragens de

qualidade inferior (BARTLE et al., 1994) e mostrando uma notável

habilidade para suportar altas temperaturas (CARVALHO et al., 1995;

GAUGHAN et al., 1999). Algumas diferenças genéticas, bioquímicas e

reprodutivas entre gado zebuíno (identidade taxonômica 9915) e taurino

(identidade taxonômica 9913) já foram relatadas (QUEVAL et al., 1998;

BAKER & MANWELL, 1980; PINHEIRO et al., 1998). Entretanto,

devido à escassez de estudos realizados em zebuínos, a maior parte de suas

particularidades reprodutivas continua ainda por ser esclarecida.

Durante as últimas décadas, diversas equipes vêm realizando trabalhos

relacionados ao isolamento e à caracterização de hormônios e proteínas

sintetizados pela placenta de espécies ruminantes, o que resultou na

descoberta de numerosas famílias de proteínas, dentre as quais merecem ser

citados os interferons tau (IFNτ), os hormônios lactogênios placentários

(PL) e, mais recentemente, as glicoproteínas associadas à gestação (PAGs).

As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como

proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno

SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al., 1986) e proteína sérica da gestação 60

kDa (PSP-60) (MIALON et al., 1993) foram inicialmente descritas como

antígenos placentários, detectáveis no sangue materno de bovinos logo

23

após o início da implantação (BUTLER et al., 1982). Elas foram

inicialmente purificadas a partir da placenta de raças taurinas (BUTLER et

al., 1982; CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991), tendo sido

posteriormente isoladas a partir de placentas de ovinos (ZOLI et al., 1995;

XIE et al., 1997a), caprinos (GARBAYO et al., 1998) e cervídeos

(HUANG et al., 1999).

Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia

molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs

em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b; GREEN

et al., 2000). Entretanto, apesar desta multiplicidade de genes, somente

foram identificadas por procedimentos bioquímicos duas formas principais

de PAG: a PAG-1 bovina (boPAG-1 ou boPAG67) (BUTLER et al., 1982;

CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991) e a PAG-2 bovina (boPAG-2). A

boPAG-1 foi purificada e inicialmente caracterizada em sua seqüência N-

terminal por ZOLI et al. (1991). Ela foi identificada por XIE et al. (1991)

como um membro enzimaticamente inativo pertencente à família das

proteases aspárticas. A boPAG-2 não foi purificada até a homogeneidade,

tendo sido apenas identificada em tentativas de se purificar uma

gonadotrofina coriônica (CG), a partir de placentas de bovinos (BECKERS

et al., 1988).

No que se refere especificamente à boPAG-1, as metodologias

empregadas por BUTLER et al. (1982) e ZOLI et al. (1991) para a sua

purificação foram bastante similares, baseando-se inicialmente na produção

de anti-soros de primeira geração produzidos contra extratos placentários

de raças taurinas. Após a eliminação de proteínas já conhecidas, tais como

a albumina sérica (BSA), a hemoglobina, o hormônio lactogênio

24

placentário e as imunoglobulinas, estes anti-soros foram absorvidos contra

extratos de tecidos presentes em vacas não-gestantes, sendo usados para o

monitoramento das frações mais imunoreativas obtidas ao longo dos

protocolos de purificação.

O uso dos anti-soros de primeira geração produzidos por BUTLER et

al. (1982) em técnicas de imuno-eletroforese permitiu a identificação de

duas proteínas imunoreativas: a primeira correspondendo à alfa-

fetoproteína e a segunda à uma proteína até então desconhecida,

denominada proteína específica da gestação (BUTLER et al., 1982).

Posteriormente, o uso de um anti-soro produzido de maneira semelhante

por ZOLI et al. (1991) permitiu o monitoramento das frações mais

imunoreativas obtidas ao longo do protocolo de purificação, tendo, neste

caso, sido caracterizada apenas a fração mais imunoreativa obtida ao final

do fracionamento de proteínas, a qual foi denominada de glicoproteína

associada à gestação ou PAG. Mais recentemente, a análise de um maior

número de frações imunoreativas mostrou a existência de diferentes formas

de PAGs em extratos cotiledonários de ovinos e caprinos (XIE et al.,

1997a; GARBAYO et al., 1998). Entretanto, até o presente, não foi feita

uma análise detalhada das frações imunoreativas presentes na placenta de

bovinos.

O isolamento de diferentes formas de PAGs em bovinos, ovinos e

caprinos têm possibilitado o desenvolvimento de dosagens

radioimunológicas, as quais têm permitido a caracterização do perfil desta

proteína durante a gestação em diversas espécies de ruminantes. Durante

gestações normais, as concentrações de PAG podem diferir

consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al.,

25

1992a; RANILLA et al., 1994; SOUSA et al., 1999). Em uma mesma

espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais

podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al., 1993; RANILLA et al.,

1994) e o estado nutricional materno (WALLACE et al., 1997a). As

concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com o sistema

radioimunológico utilizado, diferença esta resultando provavelmente da

especificidade do anti-soro (GONZALEZ et al., 1999,2000).

Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em

taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993), em caprinos (SOUSA

et al., 1999; GONZÁLEZ et al., 2000) e em ovinos (RANILLA et al.,

1994; GAJEWSKI et al., 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis

de PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína.

Levando em consideração a ausência de informações sobre as

características bioquímicas da(s) PAG(s) existente(s) na placenta de raças

zebuínas, bem como a inexistência de dados sobre os perfis plasmáticos

desta proteína ao longo da gestação e período pós-parto neste taxa,

tornaram-se objetivos principais do presente trabalho:

1) Isolar e caracterizar, em termos de massa molecular, ponto

isoelétrico e seqüência N-terminal, as proteínas apresentando

imunoreatividade à PAG, extraídas a partir de cotilédones fetais de

fêmeas zebuínas. Para tal, foi utilizado um protocolo dito ‘clássico’

por ser baseado nos protocolos previamente utilizados em outras

espécies ruminantes (ZOLI et al., 1991; GARBAYO et al., 1998);

2) Testar um novo protocolo bioquímico, baseado no uso de

cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose, para o

isolamento da(s) PAG(s) presentes em extratos placentários

26

coletados em diferentes estados gestacionais (primeiro e segundo

trimestres de gestação);

3) Desenvolver um protocolo de dosagem RIA homólogo para a

mensuração das concentrações de PAG em raças zebuínas e

4) Traçar os perfis plasmáticos de PAG durante a gestação e período

pós-parto em fêmeas zebuínas da raça Azawak.

Antes de iniciar a descrição da parte experimental do presente estudo,

julgamos oportuno apresentar uma breve revisão de literatura sobre o gado

zebu, as proteases aspárticas e finalmente sobre as proteínas placentárias,

com enfoque especial às PAGs.

27

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. O Gado zebu

A domesticação do gado bovino pode ser considerada como uma etapa

de grande importância para a evolução da sociedade tal como a

conhecemos. Diversas funções foram atribuídas aos bovinos domésticos

após sua domesticação, tendo os mesmos exercido, direta ou indiretamente,

um importante papel econômico, cultural e mesmo religioso, além de ter se

constituído em uma importante força de tração para as primeiras

comunidades agropastoris existentes durante o período Neolítico (PAYNE,

1991).

Existem dois tipos principais de gado doméstico: o gado zebu (Bos

indicus, classificado por alguns autores como Bos taurus indicus) e o gado

taurino (Bos taurus, também classificado como Bos taurus taurus). O gado

doméstico pertence à Tribo (grupo) Bovini, Família Bovidae, Ordem

Artyodactyla, a qual também inclui o bisão americano (Bison bison), o

bisão europeu (Bison bonasus), o bantengue (Bibos banteng), o gauro

(Bibos gaurus) e o iaque (Phoëphagus mutus) (FIGURA 1). Os gêneros

pertencentes à Tribo Bovini são estreitamente relacionados. Quando

cruzados entre si, eles podem produzir híbridos férteis, ou, em alguns

casos, machos híbridos estéreis.

2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino

Quanto à suas origens, praticamente todas as raças de gado doméstico

são consideradas como originárias do gado selvagem Ure-ox ou Auroque,

espécie Bos primigenius (GRIGSON, 1980), a qual evoluiu separadamente

28

nos continentes asiático, europeu e africano, dando origem às sub-espécies

Bos primigenius namadicus (Ásia), Bos primigenius primigenius (Europa)

e Bos primigenius opisthonomus (África do Norte). Ambas as sub-espécies

asiática e africana foram extintas há aproximadamente 2.000 anos,

enquanto que a espécie européia sobreviveu até o início do século XVII,

período no qual desapareceram os últimos exemplares de Ure-ox, mantidos

em condições naturais no centro da Polônia (SZAFER, 1968).

FIGURA 1 - Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae identificadas

até o presente. Entre parênteses constam o nome da espécie em sua forma selvagem e entre colchetes o nome dado à espécie domesticada. ✝Espécie extinta. Adaptado de PAYNE (1991).

Classe Mammalia

Subclasse Ungulata

Ordem Artiodactyla

Subordem Ruminantia

Família Bovidae

Subfamília Caprinae Subfamília Bovinae

Grupo Bo vini Grupo Bubalina Grupo Syncerina

Gênero Bos

Gênero Peöphagus

B. taurus (gado taurino)

B. indicus (gado zebu)

Espécie B. primigenius ��

(auroque)

Espécie P. mutus

Gênero Bibos

Espécie B. gaurus

(gauro)

Gênero Bison

Espécie B. bison

(bisão americano)

Gênero Bubalus

Gênero Syncerus

Espécie S. caffer

(búfalo africano)

Grupo Caprina Grupo Ovina

Gênero Capra

Gênero Ovies

Espécie C. hircus (cabra)

Espécie O. aries (ovelha)

Interférteis, podendo ser considerados como sub-gêneros de Bos

Espécie B. bubalis

(búfalo asiáticoi)

Espécie B. bonasus

(bisão europeu)

Espécie B. javanicus

(bantín)

B. banteng (vaca de Bali)

B. frontalis (mitan ou gaial)

Espécie B. sauveli (couprei)

P. gruniens (iaque)

29

Conforme calculado por LOFTUS et al. (1994a,b) pelo uso de

marcadores genéticos, os taxas Bos indicus e Bos taurus divergiram entre si

de aproximadamente 200.000 a 1 milhão de anos (LOFTUS et al., 1994a).

Durante este longo período evolutivo, diversas mutações parecem ter

ocorrido, resultando na acumulação de diferenças protéicas e genéticas

entre ambos os tipos de gado.

As diferenças existentes quanto à freqüência alélica de proteínas

séricas ou de alozimas foram as primeiras a permitir a construção de

árvores filogenéticas nas quais foram comparadas diferentes raças de gado

de origem zebuína e taurina (BAKER & MANWELL, 1980).

A partir da década de 50, diversos trabalhos demonstraram uma alta

freqüência alélica da α-lactoalbumina A (BLUMBERG & TOMBS, 1958)

e da αs1-caseína C (BAKER & MANWELL, 1980) em raças zebuínas e sua

baixa freqüência ou inexistência em raças taurinas, assim como a ausência

das variantes zebuínas da hemoglobina C (BRAEND, 1972), albumina

sérica B (BAKER & MANWELL, 1980) e transferrinas B e F (QUEVAL

et al., 1998) em gado taurino.

Estudos genéticos sucederam os estudos bioquímicos realizados em

gado zebuíno. Uma das primeiras evidências da existência de diferenças

genéticas entre Bos indicus e Bos taurus foi obtida em 1968 por KIEFFER

& CARTWRIGHT através da cariotipagem e análise morfológica do

cromossomo Y. Conforme observado por estes autores, gado zebuíno é

caracterizado por possuir cromossomo Y acrocêntrico, enquanto que gado

taurino caracteriza-se por apresentá-lo com uma conformação sub-

metacêntrica. Uma análise mais detalhada dos cromossomo Y demostrou a

existência de polimorfismos ao nível de fragmentos de seqüências de ADN

30

obtidas pelo uso de enzimas de restrição (BRADLEY et al., 1994),

confirmando a hipótese de que ambos os tipos de gado evoluíram

independentemente a partir de ancestrais distintos.

Recentemente, a comparação de seqüências correspondentes às

regiões variáveis do ADN mitocondrial (mtADN loop) (LOFTUS et al.,

1994a), assim como análise de fragmentos de mtADN obtidos pelo uso

ribonucleases demonstrou a existência de diferenças notáveis entre os

grupos de gado Indiano e Afro-Europeu, permitindo a distinção entre os

mesmos (LOFTUS et al., 1994b; BRADLEY et al., 1996).

Paralelamente, a realização de estudos populacionais que visavam a

determinação da origem de raças bovinas existentes nos continentes

Europeu, Asiático e Africano permitiu a demonstração de divergências na

distribuição de diversos microsatélites encontrados em ambos os gados

zebuíno e taurino (BRADLEY et al., 1994, 1996; MacHUGH et al., 1997).

A observação de polimorfismos ao nível de microsatélites também foi

observada em experimentos que visavam a caracterização específica de

genes tais como a prolactina (DIETZ et al., 1992), a capa-caseína

(LEVEZIEL et al., 1994), o hormônio do crescimento (LAGZIEL et al.,

1996) e o fator inibidor de leucemia (PIEDRAHITA et al., 1997).

2.1.2. As raças zebuínas

O continente Asiático contava, já em 1953, com aproximadamente

300 milhões de cabeças de gado, dos quais praticamente metade são

pertencentes às raças zebuínas Hariana, Sahiwal, Thaparker, Red Sindhin,

Ongole, Gyr e Kankrej, originárias da Índia e Paquistão (JOSHI &

PHILIPS, 1953). Um efetivo zebuíno de aproximadamente 20 milhões de

31

cabeças encontra-se localizado na África do Norte e Central, sendo as

principais raças “nativas” denominadas Fulani, Afrikander, Azawak,

Sokoto, Boran e Bororo (ABOGAYE, 1998). No Brasil, importações

realizadas entre 1813 e 1964 deram origem ao gado Nelore, Gir e Guzerá,

originários das raças asiáticas Ongole, Gyr e Kankrej. Essas mesmas raças

foram utilizadas para a formação do gado Brahman, a principal raça

zebuína existente nos Estados Unidos (BREEDS OF CATTLE, 2001).

Fêmeas Nelore têm uma vida reprodutiva bastante longa,

apresentando uma boa habilidade maternal e uma baixa incidência de

distócia devido ao seu porte (450 a 550 kg) e à sua grande abertura pélvica

(BREEDS OF CATTLE, 2001). Por apresentar uma grande rusticidade,

uma excelente taxa de conversão alimentar e um temperamento

extremamente dócil, eles se adaptam facilmente ao sistema de criação

encontrados nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil.

Ao contrário do gado zebu trazido às Américas, no qual tem sido

feitos investimentos em termos de melhoramento genético e de

caracterização dos índices produtivos e reprodutivos, o gado zebu criado no

continente Africano encontra-se pouco caracterizado, tanto em termos

produtivos quanto de performance reprodutiva, sendo o mesmo

tradicionalmente criado em pequenos rebanhos de propriedade familiar

(ABOGAYE, 1998).

A raça Azawak é uma das principais raças existentes no Burkina-Faso.

As fêmeas possuem uma notável rusticidade e resistência à altas

temperaturas e à carência alimentar, possuindo pesos médios de 250 a 300

kg na estação seca e de 300 a 400 kg na estação chuvosa (ZONGO, M.

comunicação pessoal). Apesar da importância econômica e social deste

32

gado para as pequenas comunidades agropastoris locais, dados sobre sua

fisiologia reprodutiva ao longo da gestação, especialmente em condições de

estresse térmico e de carência alimentar nunca foram investigados.

2.2. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de origem

zebuína

2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos

Na fêmea, a produção de gametas é o resultado da associação de dois

fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a oogênese e a

foliculogênese. A oogênese pode ser definida como o conjunto de

processos que compreende o desenvolvimento e a diferenciação das células

germinativas primordiais da fêmea até a formação do oócito haplóide

fecundado. A foliculogênese corresponde ao processo de formação,

crescimento e maturação folicular. Ela inicia-se com a formação do folículo

primordial, culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório, também

conhecido como folículo de De Graaf ou dominante (SAUMANDE, 1991).

A etapa final do desenvolvimento folicular é a ovulação. A ovulação

consiste na liberação do oócito pelo folículo ovariano. Nesta fase, as

células da granulosa do folículo pré-ovulatório hipertrofiam-se e separam-

se, perdendo seu arranjo colunar, enquanto que as células da teca tornam-se

vacuoladas e muito vascularizadas, dando ao folículo uma aparência

hiperêmica. Em zebuínos, a ovulação ocorre entre 26,2 e 30 horas após o

início do estro (PINHEIRO et al., 1998) resultando, assim como descrito

em taurinos, de uma série de alterações na estrutura da parede folicular

causadas pelo aumento na secreção do hormônio do hormônio luteinizante

(LH) pela hipófise (EVANS et al., 1994). Essas alterações consistem

33

basicamente na desintegração das células do ápice do folículo, o que

conduz à ruptura de sua parede (LEMAIRE, 1989).

A grande maioria dos folículos ovarianos não chega até a ovulação,

mas, ao contrário, degenera-se por meio de um processo denominado

atresia. A atresia reduz de maneira significativa o número de ovócitos

potencialmente ovuláveis, reduzindo consequentemente, a produção de

ovócitos viáveis durante a vida útil de um animal. Em bovinos, a ovulação

pode ser considerada como um evento raro uma vez que somente 1 folículo

em 1.000 chega ao estado pré-ovulatório (IRELAND, 1987).

Após a ovulação, é formado o corpo lúteo, estrutura responsável pela

síntese de diversos hormônios esteróides, dentre os quais merece ser

ressaltada a progesterona (P4). O corpo lúteo é formado pela continuidade

da maturação e desenvolvimento das células da granulosa e da teca

(SMITH, 1986). As células da teca interna e da granulosa remanescentes no

folículo após a ovulação darão origem a grandes e pequenas células

esteroidogênicas luteínicas (FIELDS & FIELDS, 1996). Durante a

luteinização, além de um aumento no diâmetro celular, são observadas

também diversas modificações na síntese de esteróides (WILTBANK &

NISWENDER, 1992). A produção de progesterona pode aumentar em até

10 vezes, devido ao aumento na quantidade das enzimas que participam nas

primeiras etapas da síntese de esteróides, enquanto que a síntese de

andrógenos e estrógenos diminui, devido à redução das enzimas que

participam das etapas finais da síntese de esteróides (RODGERS et al.,

1986).

Logo após a ovulação, o corpo lúteo formado é denominado cíclico,

podendo o mesmo sofrer regressão (luteólise), ou ser preservado ao longo

34

da gestação, formando assim o corpo lúteo da gestação ou “corpus luteum

verum”. Na maioria das espécies, a duração do corpo lúteo cíclico é breve,

variando de 12 a 21 dias. No caso do não estabelecimento de uma gestação

viável, o corpo lúteo regride por ação da luteolisina prostaglandina F2α

(PGF2α), iniciando-se um novo ciclo estral. Caso seja estabelecida a

gestação, um mecanismo de reconhecimento materno leva ao bloqueio da

luteólise, com a manutenção de um ou de vários corpos lúteos funcionais

ao longo do período gestacional.

Em diversas espécies, logo após a fecundação, o embrião produz

alguns “sinais”, os quais induzem a transformação do corpo lúteo cíclico

em gestacional. Dentre estes sinais associados ao reconhecimento materno

da gestação, podem ser citados as gonadotrofinas coriônicas, a substância

luteotrópica sintetizada pelas placentas das espécies humana e eqüina, e o

interferon tau, a proteína anti-luteolítica de ação parácrina produzida pelo

embrião de espécies ruminantes, o qual age no epitélio uterino para inibir a

liberação de PFG2α, assegurando, desta forma, a manutenção de um corpo

lúteo funcional.

As principais características dos hormônios e proteínas envolvidos no

reconhecimento materno da gestação, assim como de outras proteínas

sintetizadas pela placenta de mamíferos domésticos serão descritas no

seção sobre proteínas placentárias.

2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral

O ciclo estral dos ruminantes pode ser caracterizado como um

conjunto de alterações comportamentais e de modificações morfológicas e

fisiológicas do aparelho genital, que se produzem com um ritmo regular e

35

contínuo, na ausência da gestação. Estas modificações estão diretamente

relacionadas ao funcionamento cíclico do ovário, sendo reguladas por

mecanismos endócrinos e neuro-endócrinos, principalmente pelos

hormônios hipotalâmicos, gonadotrofinas e esteróides ovarianos.

O início da atividade cíclica ovariana em fêmeas zebuínas parece ser

influenciado por diversos fatores, dentre os quais o principal parece ser o

peso corporal (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). Conforme

observado por PLASSE et al. (1968a), fêmeas zebuínas alcançam a

puberdade com uma maior percentagem de peso corporal, sendo mais

tardias do que fêmeas taurinas (14 a 24 meses versus 11 a 14 meses). Uma

alta incidência de estros silenciosos quando do primeiro ciclo estral

também foi reportada por PLASSE et al. (1968a) em novilhas da raça

Brahman.

Anatomicamente, o sistema reprodutivo de vacas de raças zebuínas é

menor do que o sistema reprodutivo de raças taurinas (MUKASA-

MUGERWA, 1989), sendo observado um menor volume ovariano

(ADEYEMO & HEATH, 1980) além de menores diâmetros tanto do

folículo dominante (FIGUEIREDO et al., 1997) quanto do corpo lúteo

(GALINA et al., 1987; FIGUEIREDO et al., 1997). Entretanto, apesar

destas diferenças, a dinâmica folicular de raças zebuínas parece ser

semelhante à observada em raças taurinas, sendo observadas de 2 a 3 ondas

foliculares durante o ciclo estral (FIGUEREDO et al., 1997).

A duração do ciclo estral em fêmeas zebuínas é comparável à duração

observada em fêmeas taurinas (21,5 ± 1,5 dias) (REKWOT et al., 2000)

(FIGURA 2), sendo a duração dos sinais de estro de aproximadamente 12,5

a 28 horas (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). A ocorrência de ciclos

36

estrais curtos (11 a 17 dias) e longos (26 a 32 dias) foi relatada em 12,8 % e

38,5 % de fêmeas zebuínas pertencentes à raça Bunaji (REKWOT et al.,

2000). Uma maior proporção de ciclos longos (52 %) foi observada por

MUKASA-MUGERWA et al. (1991) em vacas Arsi utilizadas em

programas de inseminação artificial, sendo a mesma provavelmente devida

à uma inadequada detecção de estros nesta raça.

FIGURA 2 - Representação esquemática das alterações das concentrações hormonais durante o ciclo estral de bovinos. Adaptado de PETERS & LAMMING (1983).

Conforme descrito por PINHEIRO et al. (1998) em fêmeas Nelore, a

ovulação ocorre aproximadamente 26 horas após o início do estro. Segundo

37

estes autores, nesta raça, o comportamento de estro é mais curto

comparativamente ao observado em fêmeas taurinas, havendo uma maior

incidência de estros durante a noite, o que dificulta sua detecção em

condições de campo.

Em fêmeas Brahman, o pique ovulatório de LH parece ocorrer mais

precocemente após o início dos sintomas de estro do que em raças mistas

ou em raças taurinas (2,1 ± 1,3, 3,0 ± 1,0 e 6,5 ± 1,8 horas nas raças

Brahman, 1/2 Brahman e 1/2 Hereford e Hereford, respectivamente)

(RANDEL & MOSELEY, 1977). Estudos realizados por RANDEL (1976)

demonstraram ainda intervalos de 18,5 ± 3,1 e 23,3 ± 2,1 horas entre o

pique ovulatório de LH e a ovulação, respectivamente, em vacas das raças

Brahman e Hereford.

Durante o período próximo ao estro, as concentrações de estrógenos

séricos totais são aproximadamente semelhantes em vacas Brahman,

Hereford e mistas (1/2 Brahman e 1/2 Hereford), sendo as mais altas

concentrações observadas respectivamente 24 horas, 8 horas e 16 horas

antes do estro (RANDEL, 1980). O aumento das concentrações de 17-β-

estradiol coincide com o declínio das concentrações de progesterona

ocorridas após a regressão do corpo lúteo.

Em fêmeas da raça Nelore, a luteólise ocorre aproximadamente entre

os dias 15 e 18 pós-ovulação por ação da PGF2α (FIGUEIREDO et al.,

1997). Apesar da inexistência de dados em zebuínos, tem sido suposto que,

assim como em outras espécies ruminantes, o estradiol secretado pelos

folículos em crescimento estimularia a síntese de receptores para a

ocitocina no endométrio uterino (MacCRACKEN et al., 1984). A ocitocina

produzida pelas células luteínicas ligar-se-ia então a receptores

38

endometriais, desencadeando a secreção de PGF2α pelo endométrio uterino

(COOKE & HOMEIDA, 1983). Entretanto, o modo exato pelo qual a

ocitocina mediaria a síntese de PGF2α pelo endométrio uterino ainda não

foi completamente elucidado.

2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação

Conforme descrito por PLASSE et al. (1968b), raças zebuínas tendem

a apresentar gestações mais longas (291 a 295 dias) do que raças taurinas

(282 a 289 dias). Entretanto, conforme descrito pelos mesmos autores,

erros referentes à consideração de montas não-férteis como férteis

poderiam explicar o período gestacional mais longo observado neste taxa.

As concentrações de sulfato de estrona no leite de fêmeas zebuínas

permanecem indetectáveis durante os primeiros meses de gestação, assim

como observado em raças taurinas, aumentando exponencialmente durante

o 4o mês de gestação para atingir valores máximos (1.380,9 ± 164,7 pg/ml)

ao 8o mês de gestação (PRAKASH & MADAN, 1993).

Existem poucos relatos sobre os perfis de estradiol e de progesterona

ao longo da gestação de fêmeas de raças zebuínas. Segundo descrito por

SHELTON & SUMMERS (1983) em fêmeas Brahman, os níveis

plasmáticos de 17-β-estradiol em gestações simples são inferiores aos

observados em gestações múltiplas durante o último mês de gestação

(FIGURA 3).

No que diz respeito à progesterona (FIGURA 4), suas concentrações

permanecem elevadas a partir da 3a semana de gestação (SHELTON &

SUMMERS, 1983), sendo observada uma tendência ao aumento das

mesmas durante o último trimestre de gestação (MUKASA-MUGERWA &

39

TEGEGNE, 1989).

FIGURA 3 - Concentração de 17β-estradiol plasmático durante a gestação em vacas zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e gemelares (-▲-▲-). Adaptado de SHELTON & SUMMERS (1983).

Perfis sorológicos ou plasmáticos de hormônios ou proteínas

associadas à gestação têm sido descritos em diversas raças taurinas,

auxiliando a uma melhor compreensão da função placentária neste taxa.

Entretanto, ao nosso conhecimento, ainda não foram realizados estudos que

visavam sua descrição em vacas de raças zebuínas.

-35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0

Semanas antes do parto

0

100

200

300

400

50017-beta estradiol (pg/ml)

parto

40

FIGURA 4 – Concentração plasmática de progesterona durante a gestação em vacas zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA & TEGEGNE (1989).

2.3. Proteases Aspárticas

As proteínas associadas à gestação (PAGs), objeto de estudo do

presente trabalho, são membros da família das proteases aspárticas,

apresentando uma grande identidade entre sua seqüência de aminoácidos e

a seqüência do pepsinogênio (XIE et al., 1991). Será apresentada a seguir

uma breve descrição das principais características do grupo das proteases

aspárticas, ao qual pertencem as PAGs.

2.3.1. Terminologia

Os termos proteinase e protease são sinônimos. As proteases são

hidrolases que agem em ligações peptídicas de proteínas, diferenciado-se

41

das peptidases as quais agem apenas em cadeias peptídicas apresentando

um número limitado de aminoácidos. Este grupo de enzimas são de

fundamental importância para o remodelamento dos tecidos, em especial

daqueles que apresentam uma alta taxa de transformação, tais como a

placenta.

2.3.2. Classificação das Proteases

As proteases são classificadas de acordo com os grupos químicos

responsáveis por sua atividade catalítica. Elas agem por meio de quatro

mecanismos distintos, sendo por conseqüência divididas em quatro

principais classes: as serina proteases, as metaloproteases, as cisteína

proteases e as proteases aspárticas (IUPAC-IUB, 2002).

Do ponto de vista evolutivo, pode-se afirmar que cada uma das quatro

classes de proteases evoluiu a partir de uma molécula distinta, originando

sub-famílias de enzimas estreitamente relacionadas tanto do ponto de vista

de mecanismo catalítico quanto estrutural. Os membros de uma mesma

família podem ser facilmente reconhecidos pelas similaridades em suas

seqüências de aminoácidos, especialmente na região próxima ao seu centro

catalítico.

2.3.2.1. Serina proteases

Em mamíferos, a maioria das serina proteases são membros da

superfamília das quimotripsinas. Elas incluem enzimas digestivas (ex.:

quimotripsina e tripsina), lisossomais, fibrinolíticas (ex.: fator ativador do

plasminogênio e plasmina) assim como enzimas secretadas pelas células do

sistema imunológico (IUPAC-IUB, 2002).

42

2.3.2.2. Metaloproteases

As metaloproteases constituem a mais diversificada classe de

proteases. Elas incluem enzimas tais como as colagenases e as gelatinases,

estando envolvidas na degradação da matriz extracelular que ocorre durante

a morfogênese e a involução tissula Abreviação dos aminoácidos (IUPAC-

IUB, 2002).

2.3.2.3. Cisteína proteases

Em mamíferos, existem dois principais grupos de cisteína proteases:

as enzimas lisossomais catepsinas B, C, H, L e S, e as calpaínas

citoplasmáticas. As catepsinas estão diretamente envolvidas na degradação

final das proteínas intra-celulares, enquanto que as calpaínas parecem estar

envolvidas tanto na ativação de fostatases e proteases intracelulares, quanto

no remodelamento do citoesqueleto, o que possibilita o transporte

intracelular de vesículas e a estabilização estrutural da estrutura celular

(IUPAC-IUB, 2002).

2.3.2.4. Proteases aspárticas

As proteases aspárticas foram as primeiras enzimas proteolíticas

identificadas em mamíferos. Elas possuem, em sua maioria, uma única

cadeia de aminoácidos, sendo dependentes da existência de dois ácidos

aspárticos em seu sítio catalítico (TABELA 1) para a realização de sua

atividade catalítica (DAVIES, 1990). Apesar de bastante estudado, o

mecanismo catalítico exato das proteases aspárticas ainda não foi

completamente elucidado (SZECSI, 1992).

Dentre as principais proteases aspárticas enzimaticamente ativas

43

existentes em mamíferos, podem ser citadas as catepsinas D e E, a renina, a

beta-secretase, a quimosina, a gastricsina e as pepsinas. As principais

características das proteases aspárticas serão descritas a seguir.

A catepsina D (CATD) é a principal protease presente nos lisossomos

de mamíferos. Ela possui uma cadeia madura de 345 a 358 aminoácidos de

comprimento, sendo constituída de uma cadeia leve e de uma pesada. Na

espécie Gallus gallus, a catepsina D é a principal enzima envolvida na

degradação de proteínas durante a formação do saco vitelino (SWISS-

PROT, 2002).

A catepsina (CATE) é uma protease aspártica intracelular com

atividade catalítica bastante semelhante à da CATD. Ela encontra-se

distribuída em células associadas ao sistema linfóide, possuindo uma única

cadeia de 338 a 343 aminoácidos de comprimento dependendo da espécie

(SWISS-PROT, 2002).

A renina (RENI) é uma protease altamente específica, cuja única

atividade catalítica consiste em clivar a ponte Leu-Leu do

angiotensinogênio, presente na circulação periférica. Essa clivagem dá

origem à angiotensina I, a qual, uma vez liberada, inicia a cascata de

reações que produzem uma elevação da pressão sangüínea e uma maior

retenção renal de sódio. A renina é sintetizada principalmente pelas células

justaglomerulares dos rins e pelas glândulas submandibulares, possuindo,

de acordo com a espécie, entre 331 e 361 aminoácidos de comprimento

(SWISS-PROT, 2002).

A beta-secretase (BACE) é a enzima responsável pela degradação da

proteína precursora de amilóide (APP). Ela é a única protease aspártica

associada a membranas conhecida até o momento, sendo expressa

44

exclusivamente no tecido cerebra (SWISS-PROT, 2002)l.

A quimosina, a pepsina e a gastrina são sintetizadas sob a forma de

zimogênios (proquimosina, pepsinogênio e progastricsina), os quais

possuem pro-peptídeos N-terminais de aproximadamente 50 aminoácidos

de comprimento. Estes pro-peptídeos são clivados quando da ativação dos

zimogênios em pH ácido. A proquimosina (CHYM) é sintetizada pela

mucosa do abomaso de ruminantes lactantes. Após ativada, ela hidrolisa a

caseína para formar a paracaseína. Existem diversas variantes de

proquimosina, sendo as mesmas compostas de formas de aproximadamente

323 aminoácidos. O pepsinogênio (PEP) é a principal protease produzida

pela região fúndica do estômago de mamíferos adultos. Ele é ativado pelo

ácido clorídrico presente no estômago do homem e de todas as espécies

conhecidas de mamíferos, sendo composta, dependendo da espécie, por

uma cadeia de 320 a 330 aminoácidos. A progastricsina, também conhecida

como pepsinogênio C (PEPC), é produzida em todas as regiões da mucosa

gástrica de mamíferos. Ela é mais específica do que a pepsina para a

clivagem de proteínas, tendo como principal substrato a hemoglobina

(SZECSI, 1992).

Mais recentemente, uma nova família de proteases aspárticas foi

identificada na placenta de mamíferos euterianos, sendo esta nova família

denominada de glicoproteína associada à gestação (PAG). Os membros da

família das PAGs podem ser considerados como cataliticamente inativos

em sua maioria, tendo sido identificadas algumas formas cuja seqüência de

aminoácidos ao nível de sítio catalítico poderia indicar uma possível

atividade enzimática. As principais características das PAGs serão

discutidas em detalhes na seção sobre proteínas de origem placentária.

45

2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas

A análise cristalográfica de proteases aspárticas mostrou que estas

enzimas apresentam uma estrutura bilobulada, relativamente simétrica

(FIGURA 5), possuindo duas regiões aproximadamente similares em torno

de seus ácidos aspárticos situados no sítio catalítico (TANG et al., 1978;

GURUPRASAD et al., 1996). Conforme sugerido por TANG et al. (1978),

a existência de regiões topograficamente semelhantes no sítio catalítico

resultaria de uma duplicação de um gene ancestral, o qual fusionou-se

posteriormente originando cada um dos lobos desta proteína.

TABELA 1 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas proteases aspárticas. Estão indicados (inclusos em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal encontrada nos pepsinogênios A e C. Informações sobre as seqüências de aminoácidos foram obtidas no banco de dados GenBank.

Protease Aspártica

Origem Catalí-

tica?

Extremidade

Amino-terminal

Extremidade

carboxi-terminal

Pepsinogênio A Macaco Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

Progastricsina Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

Pepsinogênio F Coelho Sim Leu Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser

Pepsinogênio F Camundongo Sim Leu Asp T Gli Ser Ser Met Asp Tre Gli Tre Ser

Proquimosina Bovino Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Leu Asp Tre Gli Tre Ser

Renina Rato Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser

Catepsina D Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

Catepsina E Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

Beta-secretase Homem Sim Val Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Ser Gli Tre Tre

O sítio catalítico das proteases aspárticas possui entre 20 e 30

angstrons de comprimento, podendo acomodar peptídeos de até 7 resíduos.

46

A interação entre o sítio catalítico das proteases aspárticas e o substrato é

favorecida pela formação de pontes de hidrogênio, sendo a especificidade o

resultado da ação das forças de atração ou de repulsão entre os aminoácidos

presentes no sítio catalítico e aqueles presentes nas cadeias laterais do

substrato (DUNN et al., 1995).

FIGURA 5 - Representação da distribuição de resíduos hidrófobos ao nível do sítio

catalítico do pepsinogênio suíno. As cadeias laterais Asp e Glu estão representadas pela cor preta. Os resíduos hidrófobos, assim como os resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão representados pela cor cinza escura. Os resíduos situados fora do centro catalítico estão representados pela cor cinza clara. Adaptado de DUNN et al. (1995).

Diversas modificações pós-traducionais, tais como fosforilação e

glicosilação, já foram descritas para as proteases aspárticas (SZECSI,

1992). A pepsina porcina, por exemplo, é fosforilada no resíduo de Serina

68 (Ser68), enquanto que a pepsina bovina e a e a catepsina D porcina são

glicosiladas em resíduos de asparagina (Asp). Os mecanismos que

Resíduos hidrófobos

Cadeias laterais Asp e Glu

47

controlam as modificações pós-traducionais de uma dada proteína em uma

determinada espécie ainda não foram completamente elucidados.

2.3.4. Inibição das proteases aspárticas

As proteases aspárticas podem ser inibidas por substâncias

normalmente existentes na natureza (UMEZAWA et al., 1970), ou por

inibidores sintetizados pelo homem (SZEWCZUK et al., 1992).

A pepstatina A consiste em um inibidor de proteases aspárticas. Ela foi

inicialmente isolada como sendo uma substância produzida por

microorganismos do gênero Streptomyces spp., capaz de retardar o

crescimento de seus competidores diretos por fontes nutritivas

(UMEZAWA et al., 1970). Posteriormente, a pepstatina A mostrou ser um

eficiente inibidor de proteases aspárticas como a pepsina, denominando-se,

por similaridade, pepstatina. Ela consiste em uma molécula de massa

molecular 686 daltons, possuindo em sua estrutura um aminoácido raro

chamado estatina, o qual corresponde ao ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-

6-metilheptanóico (MORISHIMA et al., 1972).

A pepstatina A pode ser isolada no filtrado de culturas de

Streptomyces testaceus, Streptomyces argenteolus e Streoptomyces

parvisporogenes através do uso de solventes orgânicos ou pela absorção

por carbono ativado UMEZAWA et al. (1970). Ela polimeriza-se

espontaneamente formando filamentos cristalinos (MOTHES et al., 1994)

cujo ponto de fusão situa-se entre 228° e 229°C (MORISHIMA et al.,

1970). Diversos estudos demonstraram que a pepstatina inibe

especificamente, além da pepsina, outras proteases aspárticas tais como as

catepsinas D e E, a renina (MARCINISZYN et al., 1977), bem como

48

proteases presentes nos vírus da leucemia bovino e humano (KATOH et

al., 1987).

A interação entre a pepstatina A e a pepsina caracteriza-se pela

alteração da conformação da pepsina, resultante do posicionamento de um

dos oxigênios presentes na estatina entre os grupos carboxil situados entre

os ácidos aspárticos 32 e 215 (Asp32 e Asp215), posição normalmente

ocupada por uma molécula de água (FUJINAGA et al., 1995).

Por ser um inibidor reversível, a pepstatina pode ser considerada como

o substrato de escolha para a purificação de proteases aspárticas por meio

do uso de cromatografias de afinidade. Colunas de afinidade pepstatina A

agarose já foram usadas para o isolamento da renina (DZAU et al., 1979) e

da catepsina D (AFTING & BECKER, 1981), não existindo informações

precisas sobre seu uso para o isolamento de proteínas placentárias de

ruminantes.

2.4. As Proteínas Placentárias

2.4.1. A placenta

A placenta é um órgão transitório próprio aos mamíferos euterianos.

Ela é uma estrutura única e especializada, podendo ser definida como a

justaposição, ou fusão, das membranas fetais ao endométrio, permitindo a

realização das trocas fisiológicas necessárias entre mãe e feto. Sua

formação inicia-se no período embrionário, sendo observado, entretanto,

um processo contínuo de remodelação ao longo da gestação, o que assegura

uma perfeita adaptação das estruturas materna e fetal (BEACONSFIELD et

al., 1980).

O desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da

49

placenta dos pontos de vista anatômico, endocrinológico e metabólico. No

que diz respeito à função endócrina da placenta, esta inclui a síntese e

secreção de vários hormônios e proteínas tais como a progesterona, os

estrogêneos, as gonadotrofinas coriônicas, os hormônios lactogênios

placentários (também designados por somatomamotrofinas coriônicas), as

prolactinas, hormônios e fatores de crescimento, além de proteínas e

glicoproteínas específicas ou associadas à gestação. Estas substâncias

podem estar relacionadas ao estabelecimento da gestação, a manutenção do

corpo lúteo, a tolerância imunitária do embrião/feto pela mãe, o

metabolismo materno intermediário, o crescimento fetal e o

desenvolvimento da glândula mamária.

2.4.1.1. Tipos de placenta

As placentas podem ser classificadas de acordo com diferentes

critérios, dentre os quais, os mais importantes relacionam-se com as

características da barreira materno-fetal (estrutura histológica), com o

padrão das vilosidades coriônicas (estrutura anatômica) e com o grau de

perda de tecido por ocasião do parto (TABELA 2).

a) Estrutura histológica

Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos

de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no

número de camadas histológicas que separam a circulação fetal da

circulação materna parece-nos ser a mais precisa. De acordo com este tipo

de classificação, as placentas podem ser divididas em quatro tipos, a saber:

epiteliocorial, sindesmocorial, endoteliocorial e hemocorial.

50

A placenta epiteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos equídeos,

suínos e em alguns ruminantes. Este tipo caracteriza-se pela presença de 6

camadas histológicas interpostas entre as circulações materna e fetal. Os

componentes fetais encontrados neste tipo de placenta são o endotélio dos

capilares coriônicos, o tecido conjuntivo fetal e o trofoblasto. Os

componentes maternos consistem basicamente em três camadas: epitélio

uterino, tecido conjuntivo uterino e endotélio dos capilares maternos

(BJORKMAN, 1982). A placenta sinepiteliocorial é considerada por

diversos autores como o tipo de placenta característico de ovinos e de

algumas espécies de ruminantes selvagens. Ela caracteriza-se pela

formação de um sincício materno-fetal resultante da migração e fusão das

células coriônicas fetais com células do epitélio uterino (WOODING,

1992). Existem ainda dois tipos de placenta: endoteliocorial e hemocorial.

TABELA 2 - Classificação das placentas em diferentes espécies mamíferas.

Espécies

Classificação

Barreiras materno-fetais

Padrão das vilosidades coriônicas

Perda de tecido materno à parturição

Porca Epiteliocorial Difusa Nenhuma (Não-deciduada)

Égua Epiteliocorial Microcotiledonária difusa Nenhuma (Não-deciduada)

Vaca, cabra Epiteliocorial Cotiledonária Nenhuma (Não-deciduada)

Ovelha Sinepiteliocorial Cotiledonária Nenhuma (Não-deciduada)

Gata, cadela Endoteliocorial Zonária Moderada (Deciduada)

Primatas Hemocorial Discóide Extensa (Deciduada)

51

A placenta endoteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos

carnívoros. Ela caracteriza-se pela exposição direta dos capilares maternos

ao trofoblasto. A placenta hemocorial é o tipo de placenta característico da

mulher, primatas e roedores. Ela caracteriza-se pelo contato direto entre o

sangue materno e o trofoblasto (BJORKMAN, 1982).

Conforme descrito por WOODING (1992), em bovinos, a placenta

situa-se entre os tipos epiteliocorial e sinepiteliocorial. Nesta espécie, ao

nível de microvilosidades, podem-se observar tanto a presença do epitélio

uterino intacto, quanto a formação de um híbrido feto-materno formado

pela migração e pela fusão das células binucleadas coriônicas com as

células do epitélio uterino.

b) Estrutura anatômica

Anatomicamente as placentas são classificadas de acordo com a

distribuição de vilosidades coriônicas na superfície do córion. De acordo

com essa classificação, as placentas podem ser difusas ou localizadas. A

placenta difusa é caracterizada pela distribuição uniforme de vilosidades na

superfície do córion. As placentas localizadas podem ser cotiledonárias

(ruminantes), zonárias (carnívoros) ou discóides (primatas e roedores).

A placenta dos ruminantes é do tipo cotiledonário (FIGURA 6). Neste

tipo de placenta, a fixação do embrião ocorre ao nível de um restrito

número de regiões arredondadas ou ovais, chamadas carúnculas. O número

de carúnculas varia segundo a espécie. Na vaca, são observados entre 70 e

150; na ovelha, entre 80 e 100 e, na cabra entre 160 e 180 (BJORKMAN,

1982). Apesar de pouco visíveis, as carúnculas podem ser identificadas em

fêmeas nulíparas por ocasião da puberdade, sendo entretanto muito mais

52

visíveis em multíparas. As áreas intercarunculares (áreas de aposição)

permanecem glandulares durante toda a gestação, sendo também chamadas

paraplacenta (BJORKMAN, 1982).

FIGURA 6 - Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre de gestação.

Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da placenta.

c) Perda de tecido por ocasião do parto

O tecido uterino encontra-se modificado em espécies que possuem

placentas endoteliocorial e hemocorial, ocorrendo o descolamento de

tecidos e hemorragia durante a parturição. As regiões uterinas desprendidas

durante este processo são chamadas decídua, sendo as espécies que

possuem estes tipos de placenta chamadas deciduadas. Em espécies que

possuem placenta epiteliocorial, ao contrário, a parturição é facilmente

53

completada devido à estrutura histológica envolvida. Nestas espécies, a

parturição envolve simplesmente a separação das duas partes apostas da

placenta, não havendo, portanto, perda de tecido materno. Como o tecido

uterino é preservado, as espécies que possuem este tipo de placenta

denomina-se adeciduadas (BJORKMAN, 1982).

2.4.1.2. O placentoma

O placentoma, estrutura de ligação materno-fetal de ruminantes, é

formado pela inserção das vilosidades coriônicas nas criptas das carúnculas

maternas. As carúnculas, verdadeiras projeções da mucosa uterina,

constituem-se em pedículos centrais de tecido conjuntivo uterino, os quais

ramificam-se progressivamente, formando uma extensa cadeia de criptas

que se expandem em toda a espessura da massa caruncular, dando ao tecido

uma aparência areolar (BJORKMAN, 1982). As vilosidades coriônicas

consistem em cones mesenquimatosos vasculares, circundados por células

trofoblásticas cubóides (KING et al., 1980) e por células gigantes

binucleadas (WOODING & WATHES, 1980). Elas aumentam a área da

junção materno-fetal ao penetrar profundamente nas criptas carunculares

(KING et al., 1980).

Na fase inicial de formação dos placentomas, a membrana coriônica

em expansão aproxima-se das regiões carunculares (KING et al., 1981).

Em seguida, as vilosidades coriônicas penetram nos canais pré-formados

das criptas carunculares, expandindo-se em toda a sua extensão até que

suas extremidades alcancem a base das carúnculas, onde uma densa

camada separa a massa caruncular do endométrio glandular ruminantes

(HRADECKY et al., 1988). São formadas assim as interdigitações

54

características dos placentomas de ruminantes.

O tamanho, formato e estrutura dos placentomas sofre uma série de

modificações no decorrer da gestação, sendo seu desenvolvimento

normalmente caracterizado pelo aumento em seu comprimento, diâmetro e

grau de ramificação das vilosidades coriônicas (KING et al., 1979). O

desenvolvimento dos primeiros placentomas no útero de fêmeas gestantes

ocorre na curvatura dorsal uterina, próximo à fixação ao mesométrio. Estes

placentomas são os maiores observados durante todo o decorrer da

gestação. Os menores e mais jovens placentomas situam-se nas

extremidades dos cornos uterinos (HRADECKY et al., 1988).

2.4.1.3. As células binucleadas

O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a

presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas

células inicialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido objeto de

inúmeras investigações nas últimas cinco décadas (DRIEUX & THIERY,

1951; AMOROSO, 1952; WOODING & WHATHES, 1980; KLISCH et

al., 1999). As células binucleadas derivam das células coriônicas

mononucleadas por cariocinese sem subsequente citocinese. As células

mais jovens são localizadas profundamente na trofoderme e a sua

maturação é feita progressivamente quando de sua migração em direção à

superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras células binucleadas

aparecem imediatamente antes da implantação (WANGO et al., 1990a),

podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após a fertilização nos ovinos

(WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos bovinos (KING et al., 1980;

WATHES & WOODING, 1980).

55

As células binucleadas representam 15-20 % do total da população

celular placentária (WOODING, 1983; WOODING et al., 1986; WANGO

et al., 1990b). Cerca de uma em sete migram em direção ao epitélio

uterino, fenômeno este observado ao longo de todo o período gestacional

(WOODING et al., 1996). A migração das células binucleadas representa

um papel importante na remodelação da estrutura da placenta, podendo

resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos

(WOODING & BECKERS, 1987) (FIGURA 7) ou na formação de

extensas placas sinciciais em ovinos (WOODING, 1992).

FIGURA 7 - Diagrama esquemático da migração das células binucleadas em bovinos. 1) Células binucleadas no lado fetal; 2) Contato com a junção microvilositária; 3) Fusão com células fetais, dando origem a células trinucleadas de vida curta; 4) Exocitose dos grânulos; 5) Células após exocitose, com citoplasma reduzido e núcleo denso e 6) Células reabsorvidas pelo trofectoderme. Adaptado de WOODING & WATHES (1980).

56

No que diz respeito à sua função endócrina, no início da década de 40

suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes

estaria relacionada à produção de hormônios essenciais à manutenção da

gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez que vacas

permaneciam gestantes mesmo com atividade hipofisária reduzida, tendo

sido sugerido que as gonadotrofinas sintetizadas pela hipófise fossem

substituídas por hormônios produzidos num outro órgão qualquer. Em 1952

e 1954, respectivamente WEETH & HERMAN e BJÖRKMAN usando

micro-seções de cotilédones coradas com o ácido periódico de Schiff

(PAS), descreveram a presença de numerosas células trofoblásticas

contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde, FOOTE &

KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de atividade do tipo LH em

cotilédones bovinos. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o

caminho para a futura identificação e caracterização de hormônios e

proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes.

Atualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão

diretamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al.,

1991; WANGO et al., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas

(REIMERS et al., 1985a), hormônios lactogênios placentários

(VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) e proteínas

específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985b; GOGOLIN-

EWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al., 1992b;

ATKINSON et al., 1993). Estas substâncias, antes de ser secretadas, são

armazenadas em grânulos densos (FIGURA 8), os quais podem ocupar

mais de 50 % do citoplasma das células binucleadas (LEE et al., 1986).

57

2.4.2. Proteínas Placentárias

Como órgão endócrino, a placenta sintetiza uma grande variedade de

substâncias biologicamente ativas, das quais a maior parte é de origem

protéica (BOHN, 1985). As substâncias produzidas pela placenta, na

maioria dos casos, são idênticas a produtos sintetizados pelos tecidos

normais de indivíduos adultos. Em outros casos, entretanto, estes

compostos são considerados como substâncias específicas à gestação, não

possuindo similares detectáveis em indivíduos não-gestantes (GORDON &

CHARD, 1979).

No que diz respeito à realização de pesquisas fundamentais sobre as

proteínas placentárias, diversas equipes têm investigado suas características

físico-químicas assim como suas funções no organismo materno. No que

diz respeito às suas funções, é sabido, por exemplo, que nos primatas e na

égua, uma gonadotrofina coriônica permite a manutenção do corpo lúteo

(ASCHHEIM, 1927), enquanto que nas espécies ruminantes, essa

manutenção é assegurada por um fator anti-luteolítico chamado interferon

tau (MARTAL et al., 1979). Além de fator anti-luteolítico, o interferon tau

funciona ainda como um fator estimulante da síntese da progesterona. Em

adição a estas ações, esta proteína parece também exercer uma função

importante, principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância

imunológica do embrião/feto pela mãe (FILLION et al., 1991; MARTAL

et al., 1997).

Num estado mais avançado da gestação, a placenta sintetiza as

proteínas associadas à gestação (ZOLI et al., 1992a), assim como

hormônios lactogênios placentários, os quais são responsáveis pela

estimulação da atividade mamogênica (FORSYTH, 1986), estando também

58

envolvidos, ao menos parcialmente, no crescimento fetal (CHENE et al.,

1988) e no metabolismo materno (FREEMARK et al., 1992).

FIGURA 8 - Micrografia eletrônica do placentoma de vacas no 150o dia de gestação fixadas em araldite. Os grânulos secretórios foram corados pelo ácido fosfotungstico. A interrupção da junção microvilositária entre o trofoectoderma (T) e o epitélio uterino (U) é indicada por flechas. A) Migração das células trofoblásticas binucleadas em direção à junção microvilositária; B) Célula binucleada logo após sua fusão com uma célula epitelial uterina (indicada por asterisco); C) Célula trinucleada no epitélio uterino. Adaptado de WOODING & BECKERS (1987).

59

Na prática, a partir do momento em que podem ser detectadas na

circulação materna, as proteínas placentárias constituem-se em um

excelente indicador do bem-estar da unidade feto-placentária, sendo

utilizadas correntemente em testes de diagnóstico de gestação e de estudo

da mortalidade embrionária.

2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)

As espécies humana e eqüina, há muito tempo, são conhecidas como

produtoras, ao nível placentário, de hormônios gonadotróficos. Já em 1927,

ASCHHEIM relatou a presença de um fator gonadotrófico na urina da

mulher grávida, baseando neste fato o seu famoso método de detecção de

gravidez (ASCHHEIM & ZONDEK, 1928a,b). Dois anos mais tarde,

COLE & HART (1930) demonstraram a existência de uma atividade

gonadotrófica no soro de éguas gestantes. Devido à suas propriedades

gonadotróficas, a estas substâncias foram dados os nomes de gonadotrofina

coriônica humana (hCG) e gonadotrofina coriônica eqüina (eCG), também

conhecida por gonadotrofina sérica da égua prenhe (PMSG).

a) Gonadotrofina coriônica humana

O hCG é uma glicoproteína com uma massa molecular aparente de

38,4 kDa e pI situado entre 3,8 e 5,1. Ele é composto de duas subunidades

não-covalentemente ligadas (α e β). A subunidade α compreende uma

cadeia peptídica de 92 aminoácidos (BELLISARIO et al., 1973), possuindo

duas cadeias laterais de oligossacarídeos ligados aos resíduos 52 e 78 (Asn-

52 e Asn-78). Esta subunidade é similar às subunidades α do LH porcino,

ovino e humano. A subunidade β do hCG possui 145 aminoácidos

60

(CARLSEN et al., 1973), dos quais 115 são idênticos à subunidade β do

LH humano, possuindo ainda 30 aminoácidos adicionais localizados na

extremidade carboxiterminal da seqüência (LENTZ et al., 1984). A

subunidade β do hCG contém diversas cadeias laterais de carboidratos

ligadas tanto à serinas (Ser-118 ou Ser-119 e Ser-131) quanto à asparaginas

(Asn-13 e Asn-30) (RAMABHADRAN et al., 1984).

Na mulher, a síntese de hCG inicia-se aproximadamente no 8o dia

após o pique pré-ovulatório de LH (MISHELL et al., 1974), aumentando

continuamente durante os três primeiros meses de gestação, para em

seguida, decrescer e manter-se em baixos níveis até o parto. A meia-vida

do hCG, estimada em 8 horas, é consideravelmente superior àquela

estimada para o LH (12 a 50 minutos), o que se deve provavelmente à seu

alto conteúdo em ácido siálico (BOHN, 1985).

b) Gonadotrofina coriônica eqüina

O eCG ou PMSG é a gonadotrofina coriônica específica da égua. Ele

consiste em uma glicoproteína de massa molecular aparente de 45 kDa

(COMBARNOUS et al., 1981). Assim como o hCG, o eCG é composto

por duas subunidades (α e β), sendo a associação destas subunidades

essencial para a sua atividade biológica. Ele é secretado pelas células

trofoblásticas presentes nos cálices endometriais (ALLEN & MOOR, 1972)

a partir do 32o dia de gestação (WOODING et al., 2001), sendo seu pique

alcançado entre o 50o e 70o dias (MARTINUK et al., 1990). Ao contrário

do observado para o hCG, a secreção de eCG ocorre somente durante o

primeiro trimestre de gestação, não sendo o mesmo detectável próximo à

parturição.

61

c) Gonadotrofina coriônica em ruminantes

A existência de uma atividade do tipo LH em extratos cotiledonários

fetais de espécies ruminantes foi descrita durante anos por diversos grupos

de pesquisa (FOSTER, 1956; FOOTE & KAUSHIK, 1963; AILENBERG

& SHEMESH, 1983; BECKERS et al., 1988). Entretanto, apesar de

inúmeras tentativas, não foi possível isolar-se e caracterizar a seqüência de

aminoácidos N-terminal da(s) molécula(s) teoricamente responsável(is)

pela atividade gonadotrófica observada nestas espécies.

A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na

placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE

et al., os quais demonstraram que o ADN complementar correspondente à

«gonadotrofina coriônica» isolada em bovinos por BECKERS et al. (1988)

correspondia, na verdade, a uma nova forma de proteína associada à

gestação, pertencente à superfamília das proteases aspárticas, sendo a

mesma distinta das seqüências descritas para o hCG e eCG. Uma outra

resposta a esta questão foi dada por NILSON et al. (1991), os quais

demostraram que a expressão do gene codificante da subunidade α,

essencial à atividade luteotrópica do LH e das CGs, seria possível no tecido

hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas restrita às placentas de

eqüinos e primatas.

Com base em ambos argumentos, foi sugerido recentemente que a

atividade coriônica detectada previamente em extratos placentários de

bovinos pelo uso de radioreceptores do tipo LH, seria devida a uma

ativação não-específica dos receptores, e não à existência de gonadotrofinas

coriônicas nesta espécie (BECKERS et al., 1994). Uma ativação

inespecífica de receptores do tipo LH/hCG foi previamente demonstrada

62

para a quimotripsina, uma serina protease expressa no intestino de

mamíferos (WILLEY & LEINDENBERGER, 1989)

2.4.2.2. Interferons tau (IFNττττ)

Nas espécies bovina, ovina e caprina, a transformação do corpo lúteo

cíclico em gestacional é induzida pela ação de um fator protéico sintetizado

pelo concepto próximo à sua implantação. Este fator, o qual foi

inicialmente denominado trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína

trofoblástica (GODKIN et al., 1984), foi recentemente caracterizado como

pertencente a uma subclasse distinta da família do interferon alfa, ao qual

se designou interferon tau (IFNτ) (CHARPIGNY et al., 1988; ROBERTS

et al., 1992).

Os primeiros estudos que demonstraram a presença de um fator anti-

luteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por

MOOR & ROWSON (1966), os quais transferiram embriões ovinos de 14

a 16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12o dia do ciclo estral,

observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual.

No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões ovinos de

14 a 16 dias e injetaram o homogenato no útero de ovelhas receptoras antes

do 12o dia do ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos, ou seja, a

manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. Este fenômeno

não foi contudo observado quando os embriões usados tinham entre 21-23

dias de idade (ROWSON & MOOR, 1967).

O IFNτ, sinal de reconhecimento da gestação em espécies ruminantes,

consiste em um hormônio anti-luteolítico parácrino que age no epitélio

uterino para inibir a liberação de PGF2α, assegurando desta forma a

63

manutenção de um corpo lúteo funcional.

a) Interferon tau bovino

A existência de uma proteína produzida pelo trofoblasto de conceptos

bovinos capaz de prolongar a vida do corpo lúteo, foi descrita pela primeira

vez por NORTHEY & FRENCH em 1980. Eles injetaram o

homogeneizado de extratos de embriões bovinos de 17 a 19 dias à fêmeas

receptoras durante os primeiros 16 dias do ciclo estral, impedindo assim a

regressão do corpo lúteo.

O interferon tau bovino (bIFNτ) demonstrou ter atividade luteotrófica,

sendo capaz de estimular a síntese de progesterona em células luteínicas

(BEAL et al., 1981; HICKEY & HANSEL, 1987). Conforme revisado por

HANSEN et al. (1999), o IFNτ interage com receptores endometriais

provavelmente através dos receptores para o interferon do tipo I, inibindo a

expressão dos receptores para estradiol e prevenindo assim o aumento da

expressão de receptores para ocitocina estrógeno-dependentes. Esta

inibição, associada à ativação do inibidor da ciclo-oxigenase, resulta na

supressão da liberação pulsátil de PGF2α pelo útero assim como no

favorecimento da síntese de PGE (ASSELIN et al., 1997; XIAO et al.;

1999).

Duas formas de IFNτ bovino (bIFNτ-1 e bIFNτ-2) foram isoladas por

HELMER et al. (1987, 1988) a partir do cultivo de células trofoblásticas

provenientes de conceptos bovinos de 17 a 18 dias. Essas proteínas

possuíam massas moleculares de 22 e 24 kDa e pontos isoelétricos de 6,5 e

6,7, respectivamente. Conforme descrito por HELMER et al. (1988), a

forma de 24 kDa constitui-se em uma glicoproteína complexa, enquanto

64

que a forma de 22 kDa constitui-se em uma glicoproteína simples, rica em

manose. Recentemente, uma terceira classe de IFNτ bovino foi descrita em

conceptos de bovinos (bIFNτ-3), sendo a mesma expressa sob a forma de 5

variantes (LARSON et al., 2001).

Os interferons tau bovinos são exclusivamente expressos em células

mononucleadas do trofoblasto (MORGAN et al., 1993). Eles são os

principais produtos secretados pelo concepto bovino entre os dias 16 e 25

após a fecundação (HELMER et al., 1987), sendo constituídos de cadeias

de aminoácidos glicosiladas de 172 a 195 resíduos (IMAKAWA et al.,

1989; LARSON et al., 1999). Quando comparadas entre si, a seqüência de

aminoácidos do boIFNτ-1 apresenta uma identidade de 98,26 % com o

bIFNτ-2 e de 97,67 % com o bIFNτ-3. Apesar de serem um importante

produto de secreção, o interferon τ bovino é liberado localmente no lúmen

uterino, não podendo ser detectado na circulação periférica materna.

b) Interferon tau ovino

O interferon tau ovino (oIFNτ) foi purificado inicialmente por

GODKIN et al. (1982) a partir de blastocistos ovinos de 13 a 21 dias. Ele

possui uma massa molecular de 17 kDa e um ponto isoelétrico de 5,5,

sendo produzido pelas células trofoblásticas entre o 12o e o 21o dias de

gestação (MARTAL et al., 1979). Sua secreção máxima ocorre entre o 15o

e 16o dias de gestação, período que corresponde à implantação (ROBERTS

et al., 1992).

A administração de oIFNτ no útero de ovelhas entre o 10o e o 12o dias

do ciclo estral prolonga a vida do corpo lúteo em dias e até meses

(MARTAL et al., 1979; ELLINWOOD et al., 1979; HEYMAN et al.,

65

1984; HARIDON et al., 1995), sendo seu mecanismo de ação

provavelmente relacionado ao mecanismo previamente descrito em

bovinos.

Até o presente, foram identificados 11 genes codificantes para

diferentes IFNτ ovinos (oIFNτ-1 a oIFNτ-11) (IMAKAWA et al., 1987;

STEWART et al., 1989; KLEMANN et al., 1990; LEAMAN &

ROBERTS, 1992; NEPHEW et al., 1993), os quais codificam proteínas

com seqüências bastante similares, mas com diferentes atividades

biológicas e padrões de expressão (WINKELMAN et al., 1999).

c) Interferon tau caprino

A existência de uma proteína de massa molecular de 17 kDa, capaz de

prolongar a vida do corpo lúteo caprino foi verificada inicialmente por

GNATEK et al. (1989). Recentemente, uma outra forma de IFNτ caprino

(cIFNτ) de massa molecular 22-24 kDa foi purificada e sequenciada em sua

extremidade N-terminal, sendo ambas as formas correspondentes a uma

mesma seqüência de aminoácidos (GUILLOMOT et al., 1998). Segundo

descrito por LEAMAN & ROBERTS (1992), o caIFNτ é constituído por

uma seqüência de 195 aminoácidos, possuindo uma seqüência sinal de 23

aminoácidos e uma cadeia madura de 172 aminoácidos.

Conforme sugerido por GUILLOMOT et al. (1998), o cIFNτ é

expresso no 17o dia de gestação, não sendo entretanto detectado a partir do

18o dia de gestação, o que indicaria a existência de outros fatores

luteotróficos responsáveis pela manutenção do corpo lúteo nesta espécie.

66

2.4.2.3. Factor Precoce de Gestação (EPF)

Apesar da existência de um fator precoce produzido pelo embrião logo

após a fecundação ser contestada por alguns especialistas em

endocrinologia placentária, julgamos necessária sua menção na presente

revisão sobre proteínas placentárias devido ao caráter histórico deste

estudo.

Os primeiro artigo descrevendo a existência de um fator precoce de

gestação (Early Pregnancy Factor ou EPF) foi publicado por MORTON et

al. em 1974. Este ‘fator’ foi descrito como uma substância detectável no

soro de camundongas prenhas durante as primeiras horas após a

fecundação. A detecção do EPF somente foi possível pela utilização do

teste da inibição de rosetas, uma técnica imunológica baseada na

capacidade de algumas substâncias em inibir o ataque de hemácias

provenientes de um animal, pelos linfócitos provenientes de um outro

indivíduo. Apesar de ser usado ainda hoje para a detecção do EPF (CRUZ

et al., 2001), este teste é bastante inespecífico, podendo ter seus resultados

alterados por outros fatores tais como a presença de substâncias imuno-

supressoras nas amostras a serem testadas.

Pelo uso do teste de inibição de roseta, foi possível a identificação do

EPF na circulação periférica materna das espécies murina (Mus musculus),

humana (Homo sapiens), ovina (Ovis aries), bovina (Bos taurus), porcina

(Sus scrofa), leporina (Oryctogalus cuniculus), eqüina (Equus caballus),

assim como em camundongos marsupiais (Sminthopsus macroura)

(MORTON et al., 1974,1977,1979; NANCARROW & WALLACE, 1980;

MORTON et al., 1983; SUEOKA et al., 1989; TAKAGI et al., 1998;

CRUZ et al., 2001).

67

Apesar da precocidade atribuída à detecção do EPF pelo teste de

inibição da roseta, a dificuldade na execução deste teste (KOCH et al.,

1983) e as relativamente baixas sensibilidade e especificidade obtidas pelo

uso deste método colocou em dúvida sua fiabilidade como método de

diagnóstico de gestação (CHAOUAT & MENU, 1993).

A questão da existência ou não de um fator precoce de gestação

produzido pelo embrião somente foi parcialmente esclarecida recentemente

por CAVAGNAGH & MORTON (1994) os quais caracterizaram o EPF

como sendo uma chaperonina 10. Segundo esses autores, a chaperonina 10

poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e

por conseqüência, possuidora de uma forte ação imunosupressora local

(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998).

2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL)

Os hormônios lactogênios placentários (PL), também conhecidos por

somatomamotrofinas coriônicas (CS), são hormônios protéicos possuidores

de uma conformação estrutural e funcional bastante semelhante à do

hormônio de crescimento e da prolactina.

A função dos hormônios lactogênios placentários varia de acordo com

a espécie. Em geral foi sugerido que estes hormônios influenciam a

mamogênese e a lactogênese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al., 1972), a

esteroidogênese ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998)

e placentária (DEAYTON et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et al.,

1988), alterando ainda o metabolismo materno para se adaptar ao do feto,

contribuindo desta forma para o crescimento e desenvolvimento fetal

(FREEMARK et al., 1992).

68

a) Hormônio lactogênio placentário bovino

Estudos relacionados aos hormônios lactogênios placentários

precederam os trabalhos envolvendo as proteínas específicas ou associadas

à gestação em ruminantes domésticos. Em bovinos, a atividade lactogênica

dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por BUTTLE &

FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efetuado recorrendo ao uso de

uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e de tecido

cotiledonário de vaca em diferentes estádios de gestação, durante um

período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância lactogênica

com atividade equivalente a cerca de 300 ng de prolactina bovina.

Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso de placentas

bovinas por várias equipes de investigação (BOLANDER & FELLOWS,

1976; BECKERS et al., 1980; MURTHY et al., 1982) permitiram a

identificação de uma proteína com atividade somatomamotrópica,

denominada mais tarde de somatomamotrofina coriônica bovina (bCS).

O hormônio lactogênio placentário bovino (bPL) existe em várias

isoformas com diferentes massas moleculares (32 a 34 kDa) e pontos

isoelétricos (4,0 a 6,0) (MURTHY et al., 1982). Ele possui

aproximadamente 48 % de identidade com a prolactina (PRL) e 26 a 28 %

com o hormônio do crescimento (GH). Entretanto, como sugerido por

BECKERS (1983), nenhuma reação cruzada pôde ser observada entre esses

3 hormônios por radioimunoensaio.

O bPL é produzido pelas células coriônicas binucleadas

(VERSTEGEN et al., 1985; KAPES et al., 1992), as quais secretam o

conteúdo de seus grânulos na circulação materna após sua migração e fusão

com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com

69

outros hormônios lactogênios placentários, o PL é uma glicoproteína que

contém sítios cadeias laterais de carboidratos ligadas à asparagina

(SHIMOMURA & BREMEL, 1988; BYATT et al., 1987). Esta

composição glicoprotéica, característica também de outras proteínas

placentárias tais como a PAG pode resultar de um mecanismo pós-

traducional altamente desenvolvido existente nas células gigantes do

trofoblasto de bovinos.

O bPL é detectado na circulação materna a partir do quarto mês de

gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior a 2

ng/ml durante a gestação (FIGURA 9). Na circulação periférica do feto a

concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/ml) e apresenta um declínio

com o avanço da gestação (BECKERS et al., 1982; BYATT et al., 1987).

Estas concentrações fetais superiores às maternas são bastante diferentes

das observadas para a PAG bovina, apesar da co-localização de ambas as

proteínas placentárias nas mesmas células.

b) Hormônio lactogênio placentário ovino

O hormônio lactogênio placentário ovino (oPL) é uma holoproteína de

massa molecular 22 kDa e pontos isoelétricos entre 6,8 e 8,8 (CHAN et al.,

1976), secretada pelas células binucleadas de ovelhas gestantes

(WOODING, 1981). Ele é sintetizado a partir do 16o dia de gestação

(REDDY & WATKINS, 1978), somente sendo detectado na circulação

periférica materna a partir do 48o dia de gestação. Seus níveis séricos

aumentam gradativamente para alcançar um pique entre o 131o e 141o dias

de gestação (CHAN et al., 1978).

70

FIGURA 9 - Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio lactogênio placentário bovino dosado na circulação materna e fetal. Adaptado de BECKERS et al. (1982).

O oPL possui uma cadeia de 198 aminoácidos, apresentando uma

identidade de 69 % com o bPL, de 52 % com o oPRL e de 28 % com o

oGH (COLOSI et al., 1989). Ele parece estar envolvido no metabolismo

intermediário materno e no desenvolvimento mamário e fetal

(FREEMARK et al., 1992).

c) Hormônio lactogênio placentário caprino

O hormônio lactogênio placentário caprino (cPL) foi o primeiro

hormônio lactogênio placentário identificado em ruminantes (BUTTLE et

71

al., 1972), tendo sido purificado até a homogeneidade por CURRIE et al.

(1990). Ele é uma proteína de massa molecular 22,5 kDa e ponto

isoelétrico 8,35, sendo detectável na circulação periférica materna a partir

do 44o dia de gestação. As concentrações de cPL aumentam continuamente

durante a gestação até uma semana antes do parto (CARD et al., 1988).

Uma correlação positiva entre o número de fetos e a concentração

plasmática de cPL foi observada no terço final da gestação (HAYDEN et

al., 1979; HAYDEN et al., 1980; CARD et al., 1988).

2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas à gestação (PAGs)

Caracterizadas nos últimos 20 anos, as PAGs constituem uma grande

família de glicoproteínas expressas por células mononucleadas ou

binucleadas da placenta de espécies unguladas (GREEN et al., 2000;

GARBAYO et al., 2000). Elas apresentam um grau de identidade variável

entre suas seqüências de aminoácidos, possuindo uma identidade superior a

50 % com a seqüência da pepsina, catepsinas D e E e renina (XIE et al.,

1991), o que as classifica como pertencentes à superfamília das proteases

aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996; HUGHES et al., 2000). Apesar da

forte identidade observada com enzimas cataliticamente ativas, a maior

parte das PAGs identificadas até o presente constituem-se em formas

enzimaticamente inativas. Isto se deve, provavelmente, à substituição de

alguns aminoácidos em regiões críticas de seus sítios catalíticos

(GURUPRASAD et al., 1996).

Diversas formas de PAG foram purificadas a partir da placenta das

taurinos (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991),

ovinos (ZOLI et al., 1995; XIE et al., 1997a), caprinos (GARBAYO et al.,

72

1998), e de cervídeos (HUANG et al., 1999), sendo possível verificar a

expressão de ADN codificantes para novos membros da família das PAGs

em placentas de suínos (SZAFRANSKA et al., 1995), zebras (GAN et al.,

1997), eqüinos (GREEN et al., 1998), felinos (GREEN et al., 1998) e

camundongos (CHEN et al., 2001). Após terem sido isoladas, algumas

proteínas da família das PAGs foram usadas para imunizar coelhos e o anti-

soro obtido permitiu o desenvolvimento de ensaios radioimunológicos

homólogos (ZOLI et al., 1992a) e heterólogos (RANILLA et al., 1994;

GONZALEZ et al., 1999) para a detecção de PAG no soro sangüíneo

(ZOLI et al., 1992a), plasma (PATEL et al., 1997) ou leite (GONZALEZ et

al., 2001) de diferentes espécies de mamíferos euterianos (TABELA 3). A

dosagem radioimunológica da PAG representa atualmente um ótimo

método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função do

trofoblasto, podendo auxiliar no manejo da reprodução bem como na

investigação dos diferentes aspectos patológicos que possam afetar a

gestação (ZARROUK et al., 1999a,b; DOBSON et al., 1993).

a) Família das PAGs bovinas (boPAGs)

As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como

proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno

SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al., 1986) e proteína sérica da gestação 60

kDa (PSP-60) (MIALON et al., 1993) foram inicialmente descritas como

antígenos placentários, detectáveis no sangue materno do bovinos logo

após o início da implantação (BUTLER et al., 1982).

A metodologia empregada por ZOLI et al. (1991) para a purificação

da PAG foi bastante similar à metodologia previamente empregada por

73

TABELA 3 - Identificação de proteínas específicas ou associadas à gestação em mamíferos euterianos.

Espécie Detecção na circulação

materna ou no leite Caracterização bioquímica Identificação por biologia

molecular

Bo

vid

ae

Bovina (Bos taurus) SASSER et al., 1986, 1989 HUMBLOT et al., 1988a,b ZOLI et al., 1992a DOBSON et al., 1993 MIALON et al., 1993 PATEL et al., 1997

BUTLER et al. 1982 CAMOUS et al., 1988 ZOLI et al., 1991

XIE et al., 1991, 1994, 1997b GREEN et al., 2000

Ovina (Ovis aries) RANILLA et al., 1994, 1997 GAJEWSKI et al., 1999

ATKINSON et al., 1993 ZOLI et al., 1995 WILLARD et al., 1995 XIE et al., 1997a

XIE et al., 1991, 1997a,b

Caprina (Capra hircus) HUMBLOT et al., 1990 FOLCH et al., 1993 SOUSA et al., 1999 GONZÁLEZ et al., 2000, 2001 BATALHA et al., 2001

GARBAYO et al., 1998 GARBAYO et al., 2000

Ibex espanhola (Capra pyrenaica)

FERNÁNDEZ-ARIAS et al., 1999

- -

Cabrito montês (Oreamnos americanus)

HOUSTON et al., 1986 - -

Boi almiscarado (Ovibus moschatus)

ROWELL et al., 1989 - -

Bisão americano (Bison bison)

HAIGH et al., 1991 - -

Búfalo asiático (Bubalus bubalis)

DEBENEDETTI et al., 2001 - -

Cer

vid

ae

Alce (Alces alces) HAIGH et al., 1993 HUANG et al., 2000

HUANG et al., 1999 -

Veado nobre (Cervus elephus)

HAIGH et al., 1988 WILLARD et al., 1994b HUANG et al., 2000

HUANG et al., 1999 -

Veado orelhudo (Odocoileus hemionus)

WOOD et al., 1986 - -

Veado da cauda branca (Odocoileus virginianus)

WOOD et al., 1986 OSBORN et al., 1996

- -

Sika (Cervus nippon) WILLARD et al., 1994a - - Gamo (Dama dama) WILLARD et al., 1994c - - Rena (Rangifer tarandus)

RUSSEL et al., 1998 ROPSTAD et al., 1999

- -

Eq

uid

ae Eqüina (Equus

caballus) - - GAN et al., 1997

GREEN et al., 1999 Zebra (Equus zebra) - - GAN et al., 1997

GREEN et al., 1998

Fel

idae

Felina (Felis domestica)

- - GAN et al., 1997

Su

idae

e Porcina (Sus scrofa) - BAUMBACH et al., 1988 DORÉ et al., 1996

SZAFRANSKA et al., 1995, 2001

74

BUTLER et al. em 1982. Resumidamente, após a produção de anti-soros

de primeira geração, obtidos pela imunização de coelhos contra extratos

placentários bovinos, estes foram imuno-adsorvidos contra as proteínas

majoritárias presentes em fêmeas não gestantes. O antisoro clarificado

assim obtido foi em seguida utilizado para o monitoramento das frações

mais imunoreativas ao longo do protocolo de purificação, o qual incluiu a

extração de proteínas solúveis, seguida de precipitações ácida e por sulfato

de amônia, gel filtrações e cromatografia de troca de íons.

O antisoro obtido por BUTLER et al. (1982) permitiu a purificação

parcial de dois antígenos: a proteína específica da gestação A (PSPA) e a

proteína específica da gestação B (PSPB). A PSPA foi identificada como

sendo uma alfa-fetoproteína, a qual é encontrada na circulação de fêmeas

não-gestantes, enquanto que a PSPB foi identificada como uma proteína

específica da placenta, expressa sob a forma de diferentes massas

moleculares (47 a 53 kDa) e pontos isoelétricos (4,0 a 4,4). Contrariamente

à diversidade de massas moleculares obtidas por BUTLER et al. (1982),

uma única proteína majoritária de massa molecular 67 kDa foi obtida por

ZOLI et al. (1991), apresentando a mesma 4 pontos isoelétricos.

Diferentes moléculas da família das PAGs foram identificadas e

denominadas de modo arbitrário até a presente data. As principais formas

isoladas por procedimentos bioquímicos ou por técnicas de biologia

molecular serão descritas a seguir.

➾➾➾➾ boPAG-1

A boPAG67, também conhecida como boPAG-1, foi purificada por

ZOLI et al. em 1991 e caracterizada em toda a sua seqüência de

75

aminoácidos por XIE et al. em 1991 (FIGURA 10). Ela demonstrou ser

uma proteína ácida de 380 aminoácidos, de massa molecular 67 kDa, e com

quatro isoformas (I, II, III e IV) as quais diferem em pontos isoelétricos

(4,4; 4,6; 5,2 e 5,4). A quantidade de ácido siálico (2,12 %, 0,83 %, 0,64 %

e 0,29 %) de cada uma das isoformas está diretamente relacionada com

seus pontos isoelétricos e com sua imunoreatividade (ZOLI et al., 1991).

Estudos imunocitoquímicos permitiram detectar a boPAG-1

predominantemente no citoplasma de células binucleadas presentes nos

tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992b). A presença de antígenos

imunologicamente idênticos à boPAG-1 foram também encontrados em

extratos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que justifica o

adjetivo associadas e não específicas atribuídas à PAG.

O fato mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a

descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas

proteolíticas (XIE et al., 1995), as quais são conhecidas como proteases

aspárticas, possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as

seqüências da pepsina, da catepsina D e da catepsina E (XIE et al., 1991).

A boPAG-1 conservou a estrutura bilobulada característica de todas as

proteases aspárticas caracterizadas até o presente em eucariotas (FIGURA

11). Ela possui uma fenda entre os lobos capaz de acomodar peptídeos de

até 7 aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al., 1996).

Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras proteases

aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996), a maioria das PAGs são

consideradas como moléculas cataliticalmente inativas devido às mutações

em seu sítio ativo XIE et al. (1991) (TABELA 4).

76

FIGURA 10 - Seqüência de aminoácidos da boPAG-1 deduzida a partir da seqüência em ADN por XIE et al. (1991). Estão indicados as seqüências sinal, o propeptídeo, a extremidade N-terminal (20 aminoácidos) assim como a cadeia madura. As flechas indicam o final do segmento sinal e do propeptídeo. Os sítios catalíticos encontram-se circundados. Sítios potenciais de glicosilação são indicados por asteriscos.

1 11

Met Lis Trp Leu Val Leu Leu Gli Leu Val Ala Fen Ser Glu Cis Ile Val Lis Ile Pro Sinal Propeptídeo

21 31

Leu Arg Arg Leu Lis Tre Met Arg Asn Val Val Ser Gli Lis Asn Met Leu Asn Asn Fen Propeptídeo

41 51 *

Leu Lis Glu His Ala Tir Ser Leu Ser Gln Ile Ser Fen Arg Gli Ser Asn Leu Tre Tre Propeptídeo Sequência N-terminal

61 71 *

His Pro Leu Arg Asn Ile Lis Asp Leu Val Tir Met Gli Asn Ile Tre Ile Gli Tre Pro Sequência N-terminal

81 91

Pro Gln Glu Fen Gln Val Val Fen Asp Tre Ala Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Asp Sítio catalítico 101 111

Fen Cis Tre Ser Pro Ala Cis Ser Tre His Val Arg Fen Arg His Leu Gln Ser Ser Tre 121 * 131

Fen Arg Leu Tre Asn Lis Tre Fen Arg Ile Tre Tir Gli Ser Gli Arg Met Lis Gli Val 141 151

Val Val His Asp Tre Val Arg Ile Gli Asn Leu Val Ser Tre Asp Gln Pro Fen Gli Leu 161 171

Ser Ile Glu Glu Tir Gli Fen Glu Gli Arg Ile Tir Asp Gli Val Leu Gli Leu Asn Tir 181 * 191

Pro Asn Ile Ser Fen Ser Gli Ala Ile Pro Ile Fen Asp Lis Leu Lis Asn Gln Arg Ala 201 211

Ile Ser Glu Pro Val Fen Ala Fen Tir Leu Ser Lis Asp Glu Arg Glu Gli Ser Val Val 221 231

Met Fen Gli Gli Val Asp His Arg Tir Tir Glu Gli Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile 241 251

Gln Ala Gli Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg Lis Ile Ile Ala 261 271

Cis Ser Asp Gli Cis Lis Ala Leu Val Asp Tre Gli Tre Ser Asp Ile Val Gli Pro Arg Sítio catalítico 281 291

Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg Leu Ile Gli Ala Ile Pro Arg Gli Ser Glu His Tir 301 311

Val Pro Cis Ser Glu Val Asn Tre Leu Pro Ser Ile Val Fen Tre Ile Asn Gli Ile Asn 321 331

Tir Pro Val Pro Gli Arg Ala Tir Ile Leu Lis Asp Asp Arg Gli Arg Cis Tir Tre Tre 341 351

Fen Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Tre Glu Tre Trp Tir Leu Gli Asp Val Fen Leu 361 371

Arg Leu Tir Fen Ser Val Fen Asp Arg Gli Asn Asp Arg Ile Gli Leu Ala Arg Ala Val

77

FIGURA 11 - A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG-1. B) Estrutura tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina A (situada entre P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al. (1998).

Conforme discutido no seção sobre proteases aspárticas, a atividade

catalítica das proteases aspárticas é dependente da existência de dois

resíduos de ácido aspártico (Asp) os quais, apesar de situarem-se em lobos

opostos da proteína, encontram-se bastante próximos no interior do sítio

catalítico. Cada um destes resíduos é precedido de um aminoácido

hidrófobo (usualmente a fenilalalina – Fen) sendo seguido invariavelmente

de uma treonina (Tre) e de uma glicina (Gli) (DAVIES, 1990). A

conformação secundária, na qual uma segunda região altamente conservada

encontra-se em torno de cada Asp, também é requerida para a polarização

das pontes de hidrogênio da molécula de água que hidrolisa o substrato

(JAMES & SIELECKI, 1986).

Como demonstrado por XIE et al. (1991), a aparente ausência de

atividade proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76)

no local onde normalmente existe glicina (Gli-76). Esta mutação tem como

A) B)

78

conseqüência o deslocamento da molécula catalítica da água da sua posição

simétrica normal, originando a inatividade desta proteína (DAVIES, 1990).

TABELA 4 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas PAGs. Estão indicados (inclusos em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal encontrada em proteases enzimaticamente ativas tais como o pepsinogênio. Informações sobre as seqüências de aminoácidos foram obtidas do banco de dados GenBank.

Protease Aspártica

Origem Atividade Proteolítica?

Extremidade N-terminal Extremidade C-terminal

Pepsinogênio Macaco Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

boPAG-1 Bovino Provavel/ não Fen Asp Tre Ala Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

boPAG-2 Bovino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Leu Asp Tre Gli Tre Ser

boPAG-8 Bovino Desconhecido Val Asp Tre Gli Trer Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

ovPAG-1 Ovino Provavel. não Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Gli Tre Gli Tre Ser

poPAG-1 Suíno Provavel. não Fen Asp Tre Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gli Ser Ala

poPAG-2 Suíno Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser

eqPAG-1 Eqüino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser

zePAG Zebra Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser

fePAG Gato Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Ile Asp Tre Gli Tre Ser

➾➾➾➾ boPAG-2

Em 1994, XIE et al. caracterizaram a proteína coriônica anteriormente

isolada por BECKERS et al. (1988) como sendo um novo membro da

família das proteases aspárticas, ao qual foi dado o nome de boPAG-2

(BECKERS et al., 1994). Esta glicoproteína foi caracterizada como sendo

um polipeptídeo de 372 aminoácidos estruturalmente semelhante à boPAG-

79

1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma seqüência de 58 %, 58 % e 51 % dos

aminoácidos idênticos, respectivamente).

A classificação da suposta gonadotrofina coriônica de bovinos como

sendo uma protease foi surpreendente mas não a primeira observação de

similaridades entre hormônios placentários e proteases. De fato, WILLEY

& LEIDENBERGER (1989) foram os primeiros a demonstrar uma grande

identidade entre as seqüências de aminoácidos do hCG e da serina protease

quimotripsina. No mesmo estudo, eles também descreveram a redução da

ligação do hCG a seu receptor quando da adição de inibidores de proteases

tais como a ‘soy bean trypsin’ (SBI).

O ADN codificante para a boPAG-2 é detectado a partir do 17o dia de

gestação, coincidindo com o inicio da implantação (GREEN et al., 2000).

Entretanto, diferente da boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi purificada até

a homogeneidade, não podendo ser usada para o desenvolvimento de

dosagens radioimunológicas que permitam sua detecção na circulação

sangüínea materna.

Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um

centro catalítico com uma seqüência de aminoácidos idêntica a outras

proteases aspárticas ativas. Uma possível atividade proteolítica da boPAG-

2 necessita ser comprovada em futuros estudos.

➾➾➾➾ boPAG-3 a boPAG-21

Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia


em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b; GREEN

et al., 2000). O primeiro ADN corresponde à boPAG67 previamente

80

purificada por ZOLI et al. (1991) e o segundo à proteína previamente

identificada por BECKERS et al., 1988 como sendo uma gonadotrofina

coriônica. Os demais ADNs foram identificados em tecidos placentários

apenas por técnicas de biologia molecular, não tendo os mesmos sido

encontrados sob a forma de proteínas maduras.

Os diferentes ADNs complementares identificados até o presente

diferem em pelo menos 5 % em sua seqüência de nucleotídeos,

codificando, em sua maioria, proteínas que diferem em ao menos um dos

20 aminoácidos de sua seqüência N-terminal (TABELA 5). Conforme

descrito por HUANG et al. (2000) e GREEN et al. (2000), as diferentes

PAGs identificadas em taurinos podem ser agrupadas em 3 principais

categorias: a categoria das PAGs do tipo 1 (boPAG-1, -3, -15, -19, -21,

etc.), a categoria das PAGs do tipo 2 (boPAG-2, -12 e –13) e categoria

intermediária entre as PAGs e as enzimas proteolíticas (boPAG-8)

(FIGURA 12).

Conforme descrito por GREEN et al. (2000), a expressão dos

diferentes clones de boPAG parece variar temporal e espacialmente, sendo

algumas formas expressas ao longo de toda a gestação (FIGURA 13), tal

como as boPAGs –8, -10 e -11, ou limitadas durante um determinado

período, tal como a boPAG-9. Evolutivamente, as PAGs expressas em

células binucleadas (FIGURA 14) parecem ser as formas mais recentes

resultantes da duplicação dos genes desta família de proteases aspárticas,

sendo estas formas as únicas passíveis de secreção na circulação periférica

materna. Quando calculadas por curvas de calibração baseadas nas

divergências de seqüências de nucleotídeos, pode ser estimado que o grupo

de PAGs expressas por células binucleadas diverge das expressas

81

difusamente no trofectoderme em aproximadamente 56 ± 6 milhões de anos

(HUGHES et al., 2000).

TABELA 5 - Seqüência N-terminal das principais formas de PAG identificadas até o presente. Com exceção da boPAG-1, todas as seqüências foram deduzidas a partir do ARN mensageiro ou do ADN codificante obtidos por biologia molecular.

Proteína Códido de Acesso

Seqüência N-terminal

1 11

boPAG-1 Q29432 R G S N L T T H P L R N I K D L V Y M G

boPAG-2 Q28057 N D S K I T I H P L R N Y L D T A Y V G

boPAG-4 O46492 R G S N L T I H P L R N I R D F F Y M G

boPAG-5 O46493 R G S N I T I H P L R N I M D M V Y M G

boPAG-6 O46494 R G S N L T H P L R N I R D L F Y M G

boPAG-7 O46495 R G S N L T I H P L R N I R D I F Y M G

boPAG-8 O46496 P D K K F S S H Q L K N F Q N A V Y F G

boPAG-9 O46497 R G S N L T I H P L R N I M N L V Y M G

boPAG-10 O46498 D Q N I I Y H H P L R S Y K D F S Y I G

boPAG-11 O46499 S D P K L S T H P L R N A L D M A Y V G

boPAG-12 O46500 K D S K I T I H P L K N Y L D M A Y M G

boPAG-13 Q9TTW1 N D S K I T I H P L R N Y L D T A Y V G

boPAG-14 Q9TTW0 R G S N L T T H P L M N I W D L L Y L G

boPAG-15 Q9TTV9 H G S N L T I H P L R N I R D L F Y M G

boPAG-16 Q9TTV8 R G S N L T T L P L R N I R D M L Y V G

boPAG-17 Q9TTV7 R G S N L T I H P L R N I M D M L Y V G

boPAG-18 Q9TTV6 C G S N L T F H P L R N I K D R L Y V G

boPAG-19 Q9TTV5 R G S N L T S H P L R N I K D L V Y L A

boPAG-20 Q9TTV4 R G S N L T T H P L R N I W D I F Y I G

boPAG-21 Q9TTV3 R G S N L T T L P L R N I E D L M Y V G

Apesar do imenso interesse econômico que poderia resultar do

isolamento de formas de PAG expressas unicamente no início da gestação,

82

FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos mostrando o relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o momento, assim como o de algumas proteases aspárticas presentes em mamíferos. Adaptado de GREEN et al. (2000).

83

FIGURA 13 - Variação cronológica do ADN codificante para as PAGs em bovinos (boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da gestação. Adaptado de GREEN et al. (2000).

com exceção das boPAG–1, ainda não foi possível purificar-se até a

homogeneidade as proteínas correspondente à estas novas moléculas, não

sendo as mesmas disponíveis para o desenvolvimento de novos testes

radioimunológicos.

84

FIGURA 14 - Expressão dos ADNs codificantes para PAGs bovinas e ovinas identificadas até o presente. As PAGs expressas predominantemente em células binucleadas correspondem a proteínas estreitamente relacionadas. As PAGs expressas de modo difuso no trofectoderme representam os mais antigos membros desta família de proteases aspárticas. Adaptado de GREEN et al. (2000).

b) Família das PAGs ovinas (ovPAGs)

A ovPAG-1 foi a primeira forma de PAG descrita na espécie ovina.

Ela foi isolada e parcialmente caracterizada por ZOLI et al. (1995), sendo

constituída por uma seqüência de 382 aminoácidos. A ovPAG-1

caracteriza-se por possuir massas moleculares variando de 43 a 67 kDa

(XIE et al., 1996), constituindo-se em uma forma enzimaticamente inativa,

tal como a boPAG-1 (XIE et al., 1991). Ela possui aproximadamente 73 %

de sua seqüência de aminoácidos semelhante à da boPAG-1 (XIE et al.,

1991), localizando-se ao nível de células binucleadas do trofoblasto (XIE et

al., 1991).

Uma outra forma de ovPAG, altamente presente em células

mononucleadas da placenta de ovelhas, foi descrita por NAGEL et al.

(1993), sendo esta forma denominada de ovPAG-2. Aparentemente a

85

ovPAG-2 é constituída por uma seqüência de 376 aminoácidos,

apresentando 60 % de sua seqüência semelhante à da ovPAG-1 (NAGEL et

al., 1993). Posteriormente, estudos desenvolvidos por XIE et al. (1997a)

em placentas de ovelhas ao 100o dia de gestação demonstraram a existência

de novas proteínas as quais diferem em massas moleculares (55 kDa, 60

kDa, 61 kDa e 65 kDa) e em seqüências N-terminais, sendo denominadas

respectivamente ovPAG55, ovPAG60, ovPAG61 e ovPAG65. Um número

superior de clones de ADN foram identificados em tecidos placentários,

sendo os mesmos denominados de ovPAG-3 a ovPAG-9 de acordo com a

ordem pela qual foram identificados (XIE et al., 1997a,b). Apenas 2 dos 7

novos clones (ovPAG-3 e ovPAG-7) mostraram ser capazes de codificar

polipeptídeos, sendo ambos expressos nos mesmos tipos de células

binucleadas.

c) Família das PAGs caprinas (caPAGs)

Recentemente, GARBAYO et al. (1998) descreveram mais três

formas de PAG em ruminantes, com diferentes seqüências de aminoácidos

e massas moleculares distintas (62 kDa, 59 kDa e 52 kDa). Estas novas

formas de PAG, purificadas na espécie caprina, foram denominadas

respectivamente de caPAG62, caPAG59 e caPAG55. Cada forma de caPAG

caracterizou-se por possuir diversas isoformas com pontos isoelétricos

distintos. Assim como observado em bovinos, em caprinos, a diferença

observada entre os pontos isoelétricos parece representar diferentes padrões

de glicosilação e/ou fosforilação da PAG.

Diversos clones de PAG diferindo em ao menos 5 % em sua seqüência

nucleotídica, são expressos nas placentas caprinas (caPAG-1 a caPAG-11).

86

Assim como o observado em taurinos e caprinos, a expressão desses clones

é regulada temporal (expressão ao longo de toda a gestação ou restrita a um

determinado período) e espacialmente (expressão em células

mononucleadas, binucleadas ou ambas) (GARBAYO et al., 2000).

d) Outras PAGs

Em suínos foram inicialmente descritas duas formas de PAGs: a

poPAG-1 e a poPAG-2. A poPAG-1 e a poPAG-2 são constituídas por

seqüências de 382 e 387 aminoácidos, respectivamente, sendo ambas

expressas difusamente ao nível de trofectoderma durante o período inicial

da gestação. As poPAGs possuem 63,9 % de identidade entre suas

seqüências de aminoácidos, apresentando, entretanto, apenas 50 % de

identidade com relação às PAGs purificadas em ruminantes

(SZAFRANSKA et al., 1995). Novas formas de PAGs porcina foram

recentemente descritas por SZAFRANSKA et al. (2001), sendo as mesmas

denominadas poPAG-4, -5 e –6.

A existência de um único gene codificante para PAGs nas espécies

eqüina e felina (GREEN et al., 1998, 1999), em zebras (GAN et al., 1997)

e em camundongos (CHEN et al., 2001), em contraste com a existência de

uma grande diversidade dos mesmos nas espécies ruminantes, parece

sugerir que a duplicação de genes responsável pela diversidade de ADNs

codificantes nas espécies pertencentes à ordem Artyodactyla ocorreu

relativamente recentemente, após a especialização da células binucleadas

presentes na placenta de ruminantes (HUGHES et al., 2000). Segundo os

mesmos autores, uma seleção Darwiniana positiva ao nível dos

aminoácidos presentes nas regiões variáveis destas proteínas poderia

87

contribuir para uma diversidade na capacidade de ligação destas proteínas à

diferentes substratos, indicando diferentes especificidades funcionais das

PAGs.

e) Dosagens de PAG

Na prática, a produção de anticorpos específicos contra frações

altamente purificadas de PAG, PSPB ou PSP-60 bovinas tem permitido o

desenvolvimento de dosagens radioimunológicas homólogas altamente

sensíveis e específicas para taurinos (ZOLI et al., 1992a; PERENYI et al.,

2000). Neste tipo de dosagem, todos os reagentes são preparados a partir da

boPAG-1 purificada, não sendo observadas reações cruzadas com outras

proteínas plasmáticas ou com outras proteases aspárticas (PERENYI et al.,

2001). Posteriormente, a obtenção de proteínas semi-purificadas nas

espécies ovina (ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995) e caprina

(GARBAYO et al., 1998) possibilitaram a produção de anticorpos mais

específicos visando o desenvolvimento de dosagens em pequenos

ruminantes. Nestes tipos de dosagens (heterólogas), parte dos reagentes são

provenientes da espécie de origem (ovina ou caprina), enquanto que o

antígeno marcado é proveniente de taurinos (RANILLA et al., 1994;

SOUSA et al., 1999; GONZALEZ et al., 1999).

➾➾➾➾ Dosagem da PAG durante gestações normais

Os perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG durante toda a gestação

foram descritos em taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993;

PATEL et al., 1997), em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ

ORTIZ, 1992; FOLCH et al., 1993), Canindé (SOUSA et al., 1999),

88

Moxotó (SOUSA et al., 1999), Canária (GONZÁLEZ et al., 2000), Alpina

(BATALHA et al., 2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al.,

1997), Churra (RANILLA et al., 1994), Merino (RANILLA et al., 1994) e

Berrichon (GAJEWSKI et al., 1999).

Durante a gestação, as concentrações de PAG diferem

consideravelmente entre as espécies e períodos de gestação (ZOLI et al.,




1994), o número de fetos (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997), o

genótipo fetal (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995) e no caso

de transferência de embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões

(ECTORS et al., 1996a,b). As concentrações de PAG parecem também

diferir de acordo com o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta

resultando provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al.,

1999,2000).

Em raças taurinas, a boPAG-1 (única forma de PAG bovina dosável

na circulação periférica materna) pode ser detectada na circulação materna

tão cedo quanto durante a implantação do trofoblasto nas paredes do útero.

Do princípio da gestação até a 35a semana, as concentrações de PAG

aumentam devagar e gradualmente, permanecendo inferiores a 250 ng/ml

(FIGURA 15). Entre a 35a semana e a última semana de gestação, as

concentrações aumentam rapidamente atingindo valores de 1 a 5 µg/ml

(ZOLI et al., 1992a; PATEL et al., 1997). Após o parto, os níveis de PAG

decrescem regularmente, sendo indetectáveis somente aos 100 dias pós-

parto (ZOLI et al., 1992a). O relativo longo tempo necessário para que a

89

boPAG-1 desapareça da circulação sangüínea materna pode ser explicado

pela elevada concentração presente no sangue materno no momento do

parto (ZOLI et al., 1992a), bem como a meia-vida desta glicoproteína a

qual foi estimada em 7,4 a 9 dias (KIRACOFE et al., 1993; ALI et al.,

1997).

FIGURA 15 - Perfil das concentrações de PAG (média ± DP) calculados no soro de 20 vacas coletadas do 20o dia de gestação ao 100o dia após o parto. Utilizou-se escala aritmética das concentrações de PAG do 20o ao 220o dia de gestação (A) e escala logarítmica do 40o dia antes do parto ao 80o dia após o parto (B). Adaptado de ZOLI et al. (1992a).

Em caprinos (BENITEZ ORTIZ, 1992; SOUSA et al., 1999;

GONZALEZ et al., 2000) e em ovinos (BENITEZ ORTIZ, 1992;

RANILLA et al., 1994), não foi observada tendência a um aumento

90

contínuo das concentrações de PAG ao longo da gestação. No que diz

respeito ao período pós-parto, em ambas as espécies foi verificado um

rápido decréscimo nas concentrações de PAG durante o primeiro mês pós-

parto (BENITEZ ORTIZ, 1992; RANILLA et al., 1994, 1997; SOUSA et

al., 1999).

Concentrações de PAG foram detectadas na circulação periférica de

15 a 20 % de touros e novilhas não prenhes (ZOLI et al., 1992a).

Concentrações de PAG também foram detectadas no soro de fetos bovinos,

tendo sido observada uma acentuada influência da idade sobre estas

concentrações (fetos jovens apresentam concentrações superiores a de fetos

mais velhos). Essas concentrações mais elevadas nos fetos jovens podem

ser devidas à uma maior concentração desta proteína em um menor volume

sangüíneo ou a uma migração mais intensa de células binucleadas no início

da gestação (ZOLI et al., 1992b).

➾➾➾➾ Dosagem da PAG durante gestações anormais

Recentemente, DOBSON et al. (1993) assim como ECTORS et al.

(1996a) demonstraram que em programas de transferência nuclear, mesmo

se a maior parte dos bezerros apresentam pesos e tamanhos normais, alguns

deles podem apresentar anomalias morfológicas tais como edemas do

cordão umbilical com hipertrofia da placenta, as quais são responsáveis por

elevadas concentrações de boPAG-1 na circulação materna. A presença de

mal-formações fetais tais como Schistosomus reflexus (FIGURA 16A)

também parece estar associada com a utilização de técnicas de fecundação

in vitro e clonagem, sendo esta patologia igualmente responsável por

concentrações extremamente elevadas de proteínas placentárias (FIGURA

91

16B), as quais, em alguns casos, podem ultrapassar 10 µg/ml (ECTORS et

al., 1996b). Ao contrário, a verificação de um acentuado decréscimo nas

concentrações de PAG após monta natural, inseminação artificial,

fecundação in vitro ou clonagem podem constituir-se em um forte

indicativo de disfunção placentária ou de sofrimento fetal.

FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações de boPAG-1 observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-) e de gestações normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al. (1996a).

Em um estudo pioneiro realizado por ECTORS et al. (1996a), a

realização de dosagens de PAG em amostras coletadas semanalmente após

transferência de embriões produzidos in vitro permitiu o monitoramento de

mortes embrionárias e fetais em taurinos (ECTORS et al., 1996a). O

mesmo fenômeno de redução nas concentrações de PAG em caso de aborto

foi descrito por SEMAMBO et al. (1992) em vacas experimentalmente

infectadas por Actynomyces pyogenes, assim como em cabras de origem

12 -10 -8 -6 -4 -2 0

Semanas antes do parto

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000PAG (ng/ml)

A) B)

92

norueguesa apresentando abortos de origem infecciosa ou de causa

desconhecida (ZARROUK et al., 1999a,b). Contudo, dadas às elevadas

variações nas concentrações da PAG no sangue materno, somente um

acentuado abaixamento ou desaparecimento total da PAG pode ser um

sinal efetivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações múltiplas e

simples, respectivamente.

Foi demonstrado ainda que a utilização paralela da ultrasonografia

(US) e da dosagem de hormônios tais como a P4 e a PAG pode revelar a

ocorrência de diversos problemas freqüentemente observados em condições

de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas já prenhes ou a

administração de prostaglandina F2α no início de uma gestação viável

causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os casos, os quais

constituem-se em erros no manejo da reprodução, a identificação de

mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida sem o uso destas

técnicas, sendo considerada simplesmente como um retorno tardio ao ciclo

estral.

Em experimentos a campo, SZENCI et al. (1998a) descreveram

diversas situações (FIGURAS 17A, 17B, 17C e 17D) nas quais a dosagem

de proteínas específicas ou associadas à gestação e progesterona

demonstraram ser extremamente úteis quando associadas à técnica de

ultrasonografia. Merece ser citado particularmente o quadro no qual as

concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de

progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de

mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo (FIGURA

17A); a situação na qual as concentrações de PAG mostram claramente que

a vaca tinha sido fecundada quando da primeira inseminação e que a

93

realização de uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou

provavelmente uma contaminação do útero, resultando em mortalidade

fetal (FIGURA 17B); o quadro no qual a dosagem de PAG confirma a

ocorrência de mortalidade embrionária precoce indicada pela

ultrasonografia (FIGURA 17C), e por fim, a situação na qual as

concentrações de PAG demonstram uma vaca teria sido inseminada em um

curto período após o parto (concentrações decrescentes de PAG), e que

neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria preparado para o

estabelecimento de uma nova gestação (FIGURA 17D).

FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4 (-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF ). Adaptado de SZENCI et al. (1998a).

A) B)

C) D)

94

➾➾➾➾ Dosagem da PAG para fins de diagnóstico de gestação

A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é

correntemente usada como método de diagnóstico de gestação a partir dos

29-30 dias após a fecundação em raças taurinas (SASSER et al., 1986;

HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al., 1998a,b, 2000a,b) e dos dias 21-

22 dias em ovinos (KAREN et al., 2001) e caprinos (GONZALEZ et al.,

1999). Em bovinos, os valores preditivos positivos da dosagem de PAG

para fins de diagnóstico de gestação variam de 72 % (dia 29 após

inseminação artificial) (SZENCI et al., 1998b) a 93 % (dia 45 após

inseminação artificial) (ZOLI et al., 1992a), enquanto que os valores

preditivos negativos variam de 95 % a 100 % (respectivamente aos dias 29

e 45 após inseminação artificial) (SZENCI et al., 1998b).

Além da alta precisão obtida, uma outra vantagem da utilização da

dosagem de PAG como método de diagnóstico de gestação diz respeito à

capacidade da PAG em poder conservar-se em níveis detectáveis por até 10

dias após a coleta de sangue (temperatura ambiente), o que abre excelentes

perspectivas em termos de sua utilização em condições de campo

(BISSON, 1992).

f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o isolamento

bioquímico e identificação sorológica das PAGs

Até o presente, os procedimentos bioquímicos foram os únicos a

fornecer os reagentes necessários ao desenvolvimento de dosagens RIA

para a PAG. Estas dosagens têm permitido a determinação dos perfis

sorológicos ou plasmáticos desta proteína ao longo da gestação e período

pós-parto, constituindo-se em uma importante ferramenta de

95

monitoramento da viabilidade placentária. Alguns dos principais aspectos

relativos aos procedimentos de purificação e dosagem da PAG utilizados

até o presente serão descritos a seguir.

➾➾➾➾ Procedimento bioquímico correntemente utilizado para o isolamento

da PAG

Em geral, os protocolos bioquímicos utilizados em espécies

ruminantes foram baseados no mesmo princípio: a extração das proteínas

placentárias em tampão com pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo

uso de diferentes técnicas, tais como precipitações por sulfato de amônia e

cromatografias de troca de íons. Etapas adicionais de precipitação ácida, de

cromatografia em gel de Sephadex G-75 ou de cromatografia em gel de

Blue-Sefarose têm sido realizadas em alguns dos protocolos (ZOLI et al.,

1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998) com vistas a aumentar a

pureza final das proteínas a serem utilizadas para o desenvolvimento de

dosagens RIA.

Uma vez isoladas, as PAGs foram caracterizadas por diversos autores

quanto a suas massas moleculares, pontos isoelétricos e seqüências N-

terminais (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998).

Conforme ressaltado por HUGHES et al. (2000), a comparação das

diferentes seqüências de aminoácidos das PAG identificadas até o presente

é de fundamental importância por fornecer o grau de identidade entre as

proteínas isoladas em diferentes espécies.

Em taurinos, primeira espécie na qual a PAG foi purificada, ao final

dos procedimentos de purificação, somente foi seqüenciada uma única

proteína, a qual correspondia a fração mais imunoreativa obtida (ZOLI et

96

al., 1991). O seqüenciamento desta proteína revelou a existência de uma

única seqüência, a qual é atualmente identificada como boPAG67 ou

boPAG-1.

Em trabalhos mais recentes XIE et al. (1997a) e GARBAYO et al.

(1998) demonstraram que nas espécies ovina e caprina, quando diversas

frações imunoreativas são analisadas, é possível identificar-se diversas

formas de PAG, heterogêneas tanto no que diz respeito a suas massas

moleculares e pontos isoelétricos, quanto no que diz respeito a suas

seqüências N-terminais (XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998).

Entretanto, até o presente, ainda não se sabe se a análise detalhada de um

maior número de frações imunoreativas extraídas a partir da placenta de

bovídeos confirmaria a expressão de uma única proteína ou resultaria na

caracterização de novas seqüências N-terminais de PAG.

➾➾➾➾ Uso de cromatografias de afinidade para o isolamento da PAG

Conforme descrito na seção sobre as proteases aspárticas, diversos

membros pertencentes a esta família puderam ser isolados por meio do uso

de cromatografias de afinidade, com o uso da pepstatina-A como substrato

(FIGURA 18).

Segundo GURUPRASAD et al. (1996), apesar de cataliticamente

inativa, a PAG conservaria uma fenda capaz de acomodar peptídeos de até

7 resíduos de comprimento, podendo ligar-se reversivelmente à pepstatina

A, assim como os demais membros de sua família. Entretanto, apesar de

sugerido por diversos autores (GURUPRASAD et al., 1996; HUGUES et

al., 2000; GARBAYO et al., 2000), ao nosso conhecimento, nenhuma

publicação descreveu com precisão o isolamento de moléculas da família

97

da PAG pelo uso de cromatografia de afinidade empregando a pepstatina-A

como ligante.

FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A, utilizada para a purificação de proteases aspárticas.

➾➾➾➾ Mensuração das concentrações periféricas maternas de PAG por

meio de dosagem RIA

O método radioimunológico, também conhecido como dosagem RIA,

foi inicialmente desenvolvido por YALLOW & BERSON (1960) para a

dosagem da insulina no plasma humano. Atualmente, este método é

comumente usado para a dosagem plasmática ou sorológica de diversos

hormônios e proteínas, dentre os quais a PAG.

Dentre os principais componentes de uma dosagem RIA para a PAG

(dosagem PAG-RIA) podemos citar o antígeno marcado com o isótopo

radioativo iodo 125 (PAG-I125), o antígeno frio ou não marcado (PAG não

marcada), e o anticorpo, também conhecido como anti-soro (AS), o qual

98

contém imunoglobulinas de coelhos produzidos contra a forma de PAG que

se deseja dosar. Participam ainda como reagentes da dosagem PAG-RIA o

soro de novilhas impúberes (serum-free) e o sistema de precipitação pelo

uso do segundo anticorpo, o qual contem imunoglobulinas de ovelha anti-

imunoglobulina de coelhos.

A dosagem PAG-RIA, assim como as demais dosagens

radioimunológicas (CHARD, 1989), baseia-se em um mesmo princípio: a

competição entre ambos os antígenos marcado e não marcado por uma

determinada quantidade de anticorpos. Entretanto, apesar de aparentemente

simples, esta reação não se resume a uma simples diluição isotópica,

obedecendo a lei de ação de massas cujo detalhamento foge aos objetivos

da presente revisão de literatura.

Quanto à origem dos reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA,

podemos classificar os sistemas atualmente utilizados como homólogos ou

heterólogos. Em cervídeos (HUANG et al., 2000), assim como em caprinos

(GONZALEZ et al., 1999) e taurinos (ZOLI et al., 1992a), utiliza-se

sistemas de dosagens homólogos, nos quais os principais reagentes são

produzidos a partir da PAG purificada em uma mesma espécie. Entretanto,

na maioria das espécies, recorre-se ao uso de sistemas de dosagem

heterólogos, nos quais a PAG marcada é normalmente de origem taurina,

sendo o antígeno frio e/ou o antisoro produzidos a partir de PAGs semi-

purificadas em diferentes espécies (RANILLA et al., 1994; SOUSA et al.,

1999; GONZALEZ et al., 1999).

Dentre os principais parâmetros analisados das dosagens de PAG-RIA

podemos citar a especificidade, a sensibilidade e a precisão. A

especificidade da dosagem de PAG taurina foi investigada inicialmente por

99

ZOLI et al. (1991), os quais demonstraram a inexistência de reações

cruzadas entre a boPAG67 e o bPL, o bLH, o FSH de origem porcina e a

alfa-fetoproteína. Mais recentemente, PERENYI et al. (2001)

demonstraram ainda a inexistência de reações cruzadas entre a boPAG67 e

outros membros da família das proteases aspárticas, tais como a pepsina

porcina, a catepsina D, a quimosina e a renina.

No que se refere à sensibilidade, também conhecida como limite

mínimo de detecção, os sistemas de dosagem PAG-RIA taurino e caprino

demonstraram ser altamente sensíveis, detectando concentrações de PAG

tão baixas quanto 0,2 ng/ml (PERENYI et al., 2000). As melhores

sensibilidades são alcançadas quando é feita uma etapa de pré-incubação de

16 horas antes da adição do antígeno marcado (SOUSA et al., 1999;

GONZALEZ et al., 1999).

A precisão de um sistema de dosagens é determinada como o

coeficiente de variação (CV) das concentrações de PAG contidas em uma

mesma amostra quando esta é mensurada repetidamente em uma mesma

série de dosagens (CV intra-ensaio) ou sucessivamente em séries de

dosagens diferentes (CV inter-ensaio). A precisão da dosagem PAG-RIA já

foi calculada por diversos autores, variando de 6,9 a 11,6 % para o sistema

RIA homólogo de taurinos (ZOLI et al., 1992a) e de 3,3 a 13 % para os

sistemas heterólogos caprino e ovino (GONZALEZ et al., 1999; SOUSA et

al., 1999).

Conforme descrito por BATALHA et al. (2001), concentrações de

PAG mensuradas por RIA homólogos são inferiores às dosadas por

sistemas heterólogos, o que poderia indicar uma menor especificidade das

dosagens heterólogas. Entretanto, investigações complementares são

100

necessárias para confirmar esta hipótese.

Uma vez citados alguns dos principais aspectos relacionados ao

estudo das PAGs em ruminantes domésticos, serão apresentadas as

metodologias por nós adotadas para o estudo da PAG em raças zebuínas.

101

3. MATERIAL E METODOLOGIA

3.1. Experimento 1 – Isolamento de glicoproteínas associadas à

gestação:

Dois protocolos foram utilizados para o isolamento de proteínas

associadas à gestação a partir da placenta de fêmeas zebuínas. O primeiro

protocolo baseou-se na extração das proteínas placentárias em tampão com

pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo uso de diferentes técnicas,

tais como as precipitações ácida e por sulfato de amônia e cromatografias

de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo baseou-se na

utilização de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose

para o enriquecimento dos extratos placentários em PAG.

Em ambos os protocolos, as proteínas resultantes do fracionamento

foram caracterizadas quando à sua massa molecular por meio de

eletroforeses monodimensionais, quanto à imunoreatividade por meio de

Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG67 (AS497) e anti-

caPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59 (AS708), e quanto ao ponto

isoelétrico por meio de eletroforeses bidimensionais. As proteínas

consideradas como imunoreativas foram então sequenciadas em sua

extremidade N-terminal (entre 10 e 25 aminoácidos), tendo suas seqüências

comparadas com as seqüências já existentes nos bancos de dados por meio

do uso do programa Fasta 3 do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI,

2001). Os procedimentos metodológicos utilizados nos protocolos de

isolamento da PAG serão descritos a seguir.

102

3.1.1. Protocolo 1

3.1.1.1. Determinação da imunoreatividade e da proteína total

O radioimunoensaio (RIA) desenvolvido por ZOLI et al. (1992a) para

dosagem da PAG de origem taurina foi utilizado para detectar a

imunoreatividade do tipo PAG ao longo deste protocolo de purificação (cf.

Anexo A). Este RIA constituiu-se em um sistema semi-quantitativo de

mensuração das quantidades relativas de PAG presentes nas amostras

obtidas nas diferentes etapas de fracionamento protéico.

A determinação da quantidade total de proteína (TP) obtida nas

diferentes etapas foi feita pelo método previamente descrito por LOWRY

et al. (1951) (cf. Anexo B) com o uso da albumina séria bovina (BSA; ICN

Biomedicals Inc., Aurora, OH) como proteína de referência.

3.1.1.2. Coleta de placentas

Os úteros de 3 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em

abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. O estágio de

gestação foi estimado com base no comprimento entre o côndilo occipital e

a última vértebra coccígea fetais. De acordo com o comprimento obtido (69

cm, 70 cm e 77 cm), foram estimados estágios gestacionais entre 30 e 31

semanas de gestação (último trimestre de gestação) (REXROAD et al.,

1974).

Logo após o abate, os cotilédones fetais foram imediatamente

dissecados e lavados com solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl) a

uma concentração de 0,9 %. Após transportados ao laboratório a uma

temperatura de aproximadamente 4°C, os cotilédones foram pesados e

identificados, sendo armazenados a –20°C até seu processamento A

103

FIGURA 19 esquematiza o fracionamento de proteínas realizado no

Protocolo 1.

Cotilédones fetais

Iso

lam

ento

Extração de proteínas em pH neutro

Precipitação ácida

Precipitação a 40-80 % de sulfato de amônia

Cromatografia de troca de ânions (Coluna DEAE Sephadex A25)

Cromatografia de troca de cations de todas as frações DEAE (Coluna CM Cerâmica)

Car

acte

riza

ção

Eletroforese monodimensional (1-D SDS-PAGE)

Coloração Coomassie Blue

Western blot

Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE)

Sequenciamento N-terminal

FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de trocas de íons.

3.1.1.3. Isolamento da PAG

a) Extração de proteínas solúveis

Aproximadamente 2.145,4 gramas de cotilédones fetais foram

descongelados e utilizados no presente protocolo. O descongelamento foi

feito a 4°C durante 24 horas. Após descongelados, os cotilédones foram

novamente lavados com solução fisiológica (5 litros de NaCl a 0,9 %, 4°C)

e pesados. Foi obtido um total de 1.921,5 gramas de cotilédones fetais.

Os cotilédones fetais foram inicialmente moídos com o auxílio de um

triturador de carne. Em seguida, o extrato cotiledonário foi finamente

104

homogeneizado em tampão fosfato de potássio a 0,01 M (KH2PO4; Merck)

contendo 0,10 M de cloreto de potássio (KCl, pH 7,6; Merck) tendo para

tal sido utilizado um mixer industrial Multipulver (Dusseldorf, Alemanha).

Foi utilizada uma proporção entre tampão e tecido de 3,5 : 1 (volume :

peso). No momento da homogeneização foram adicionados 0,001 mM de

leupeptina (Sigma, St. Louis, USA), 0,2 mM de fenil-metilsulfonilfluoreto

(PMSF; Sigma), 0,2 % de EDTA sódico (peso : volume; Sigma) e 0,02 %

de azida sódica (NaN3; peso : volume; Vel Inc., Leuven, Bélgica).

A primeira extração consistiu na homogeneização do extrato

placentário durante 2 horas a 4°C. A homogeneização foi feita pelo uso de

um agitador industrial do tipo vortex (Modelo 50 MHz; Kargh GMBH,

Hannover, Alemanha). Após centrifugação deste extrato a 27.000 g durante

1 hora, o sobrenadante foi mensurado e armazenado em um recipiente à

parte, tendo o sedimento sido novamente triturado em 4 litros do mesmo

tampão pelo uso de um mixer industrial. No momento da segunda

trituração, foram igualmente adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM

de PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de NaN3. Após uma segunda

homogeneização durante aproximadamente 16 horas, o segundo extrato

placentário foi centrifugado a 27.000 g por 1 hora, tendo o precipitado sido

eliminado. O segundo sobrenadante, assim como o primeiro, foi mensurado

quanto ao volume. Ambos os sobrenadantes foram misturados, tendo seu

pH sido ajustado a 7,6 pelo uso de 0,5 M de hidróxido de potássio (KOH;

Merck).

b) Precipitação ácida

Os sobrenadantes resultantes de primeira (7.940 ml) e da segunda

105

(3.890 ml) extrações foram misturados. O pH da solução final (11.830 ml)

foi ajustado a 4,5 pelo uso de ácido fosfórico a 0,5 N (H3PO4; Fluka). A

solução foi então deixada em repouso a 4°C durante 2 horas. Após este

período, a solução foi centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a eliminação

do precipitado. O sobrenadante teve seu pH novamente ajustado para 7,6

pelo uso de hidróxido de potássio a 0,5 N (KOH; Merck).

c) Precipitações ao sulfato de amônia

Após a precipitação ácida, foram adicionadas 243,0 gramas de sulfato

de amônia (S.A.; Merck) por litro de sobrenadante (11,83 l), tendo sido

obtida uma taxa de saturação de 40 %. Após a dissolução completa do S.A.,

a solução foi deixada em repouso por 16 horas, tendo sido em seguida

centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a separação entre as proteínas

precipitadas e não precipitadas.

Ao sobrenadante foi novamente adicionado S.A. até obter-se uma taxa

de saturação de 80 % (adição de 285,0 gramas de S.A. por litro de solução).

Após 16 horas de repouso, a solução foi novamente centrifugada a 27.000 g

durante 1 hora, tendo o sobrenadante sido descartado.

As proteínas precipitadas pela saturação 40-80 % de S.A., foram

ressuspendidas em 500 ml de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6). Esta

suspensão foi exaustivamente dialisada contra um grande volume do

mesmo tampão (4 banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo).

Após o último banho de diálise, a solução contendo a fração 40-80 % de

S.A. foi centrifugada a 36.000 g durante 20 minutos, tendo o precipitado

sido eliminado e o sobrenadante mensurado e imediatamente depositado

sobre uma coluna contendo gel DEAE-Sephadex para a realização de

106

cromatografia de troca de ânions.

d) Cromatografia de troca de ânions

A quantidade de gel utilizada nesta cromatografia foi calculada a

partir da estimativa da quantidade total de proteínas presente na fração 40-

80 % de S.A.. Foi utilizada uma proporção de 4 mg de proteína por

mililitro de gel DEAE Sephadex A-25 (Amersham Pharmacia Biotech,

Uppsala, Suécia) hidratado. A coluna de DEAE Sephadex A-25 (14 cm x

18cm) foi previamente equilibrada em tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6).

A fração 40-80 % S.A. foi depositada sobre a coluna de DEAE

Sephadex a um fluxo de 2,5 ml por minuto. As proteínas não adsorvidas

foram eluídas pela lavagem com 10 litros de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH

7,6). As proteínas adsorvidas ao gel foram fracionadas pelo uso de forças

iônicas crescentes, obtidas pela adição de concentrações crescentes (0,02

M, 0,04 M, 0,08 M, 0,16 M e 0,32 M) de cloreto de sódio (NaCl) ao

tampão Tris-HCl 0,01 M. A coluna foi lavada sucessivamente com 10 litros

de tampão contendo cada uma das concentrações em NaCl (0,02 M a 0,32

M NaCl).

Cada fração (0 M a 0,32 M NaCl) foi concentrada em cassetes de

concentração (Millipore, Dusseldorf, Alemanha) até um volume de

aproximadamente 1 litro, sendo em seguida concentrada até um volume de

200 ml em células de concentração Amicon (Amicon Ultrafiltraton System;

Danvers, MA).

Após concentradas, cada uma das frações foi dialisada contra um

volume total de 80 litros de tampão bicarbonato de amônia a 5 mM (4

banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo, pH 8,0). A

107

cromatografia em gel DEAE-Sephadex, assim como as diálises, foram

feitas a uma temperatura de 4°C.

Após o final da diálise de cada uma das frações, as mesmas foram

centrifugadas a 36.000 g durante 30 minutos. Os precipitados foram

eliminados e o sobrenadante correspondente a cada fração foi identificado e

liofilisado.

e) Cromatografia de troca de cátions

Cada uma das frações da DEAE (doravante chamadas DEAE 0 M,

DEAE 0,02 M, DEAE 0,04 M, DEAE 0,08 M, DEAE 0,16 M e DEAE 0,32

M NaCl) foi submetida separadamente a uma cromatografia de troca de

cátions em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650

(Millipore Corp., Bedford, MA). A coluna utilizada (coluna CM Cerâmica

HyperD F; 1 cm x 3 cm; BioSepra, Cergy-Saint Christophe, França) foi

previamente equilibrada com tampão acetato de amônia 0,01 M (pH 5,0).

A cada cromatografia, 200 mg de proteína proveniente de uma das

diferentes frações de DEAE foram solubilisadas em 20 ml de tampão de

equilíbrio, sendo em seguida centrifugadas a 1.500 g durante 5 minutos

para a eliminação dos resíduos insolúveis.

Cada fração da DEAE foi injetada sobre a coluna CM cerâmica a um

fluxo constante de 0,5 ml por minuto. Após a diluição da fração não

adsorvida, um gradiente linear de NaCl (0 a 1,0 M) foi aplicado a um fluxo

constante de 2 ml/min. Frações de 1 ml foram coletadas separadamente.

As frações correspondentes a um mesmo pique de proteína (conforme

observado pela densidade óptica a 280 nm), foram misturadas, sendo

identificadas e dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia 5 mM (pH

108

8,0).

Após o final das diálises, as proteínas de cada pique foram

centrifugadas e o sobrenadante liofilizado. Cada fração da CM cerâmica

(doneravante denominadas pique CM pique I, CM pique II, ... CM pique n)

foram analisadas quanto à quantidade total de proteína e quanto à

quantidade estimada de PAG.

3.1.1.4. Caracterização da PAG

a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida em

presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE)

Eletroforeses monodimensionais foram utilizadas para analisar as

proteínas fracionadas durante o protocolo de purificação.

As eletroforeses monodimensionais foram realizadas de acordo com o

método descrito por LAEMMLI (1970) na presença e na ausência do

agente redutor mercaptoetanol (5 %). As proteínas contidas em cada pique

da coluna CM cerâmica foram diluídas na proporção de 1 µg para cada 1 µl

de Laemmli (cf. Anexo C), tendo sido desnaturadas pelo aquecimento a

uma temperatura de aproximadamente 100°C durante 5 minutos. Amostras

padrão com massas moleculares de 94 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1

kDa e 14,4 kDa (Kits de Calibração para Eletroforese LMW; Pharmacia)

foram corridas simultaneamente com as proteínas obtidas após as

cromatografias de troca de íons.

A análise das proteínas foi feita em sistemas verticais de eletroforese,

com capacidade de um gel cada. Os géis de poliacrilamida utilizados (20 x

10 x 0,25 cm) foram preparados de acordo com a fórmula descrita no

Anexo C. Amperagens de 20 mA foram aplicadas durante a migração das

109

proteínas no gel de compressão, sendo o tempo de migração de

aproximadamente 1 hora e 30 minutos. Durante a migração no gel de

separação, foram aplicadas amperagens constantes de 40 mA. O tempo de

migração no gel de separação foi de aproximadamente 6 horas.

Após o final da migração, as proteínas presentes em cada gel foram

coradas pela solução de Azul de Coomassie R 250 durante um mínimo de 1

hora, sendo descoloradas durante 6 a 12 horas. Os pesos moleculares das

bandas mais visíveis presentes nos géis foram estimados com base em uma

curva calculada a partir das massas moleculares das diferentes proteínas

padrão corridas simultaneamente com as amostras.

b) Western Blot

Uma vez caracterizadas quanto à suas massas moleculares aparentes,

as proteínas presentes em cada pique da coluna CM Cerâmica foram

analisadas quanto às suas imunoreatividades pelo uso da técnica de

Western Blot com o uso de 3 diferentes anti-soros: anti-boPAG67 (AS 497),

anti-caPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59 (AS708). Detalhes sobre os

reagentes e a técnica de Western Blot utilizada encontram-se descritos no

Anexo D.

Resumidamente, após o final da migração das proteínas em um gel de

poliacrilamida a 12 %, cada gel teve suas proteínas transferidas sobre uma

membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Pharmacia). A transferência foi

feita em um aparelho Multiphor II (Pharmacia) pela aplicação de uma

tensão constante de 24 volts durante uma hora, e de 36 volts durante

aproximadamente 12 horas.

Após a transferência, as proteínas foram visualizadas pela coloração

110

com a solução Vermelho de Ponceau S (Merck). Em seguida, as

membranas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos com o tampão Tris

salino (TBS) contendo 3 % de BSA (37°C). Após lavagem, as membranas

foram incubadas durante 3 horas a 37°C em uma solução contendo um dos

anti-soros anti-PAG (diluição a 1 : 200 em Tris contendo 1 % de BSA),

sendo posteriormente lavadas com tampão TBS contendo 1 % de BSA (3

lavagens de 10 minutos a 37°C).

Uma incubação com imunoglobulina de ovelha anti-imunoglobulina

de coelho acoplada à peroxidase (diluição a 1 : 2.000 em TBS contendo 1

% de BSA; HPR-POD, Chemicon International Inc., Temecula, CA) foi

feita durante 2 horas a 37°C e sob agitação. Após esta segunda incubação, a

membrana de nitrocelulose foi lavada em TBS sem BSA (4 lavagens de 10

minutos a 20°C). A identificação das proteínas imunoreativas às PAGs foi

feita após a incubação com as soluções de revelação durante um período de

aproximadamente 10 minutos.

c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel de

poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (2-D SDS-

PAGE)

As proteínas presentes nos piques CM contendo bandas imunoreativas

à PAG foram submetidas a eletroforeses bidimensionais. A primeira

dimensão (isofocalização) foi feita em géis Immobiline DryStrip com pH

variando entre 3 e 10 (11 cm; Pharmacia). Os géis usados para

isofocalização foram hidratados com o tampão de reidratação (cf. Anexo E)

contendo 200 a 250 µg de proteínas a serem analisadas. A hidratação foi

feita durante 16 horas em um Immobiline DryStrip Reswelling Tray

111

(Pharmacia). A focalização foi feita em um aparelho FlatBed (FBE-3000;

Pharmacia) pela aplicação de tensões de 300 volts por 30 minutos, de 1.000

volts por 30 minutos, de 1.550 volts por 16 horas e de 1.850 volts por 1

hora. Como segunda dimensão foram feitas eletroforeses verticais em SDS-

PAGE, conforme anteriormente descrito para as eletroforeses

monodimensionais.

Após o final da migração no gel de separação, as proteínas foram

transferidas para membranas de polivinilideno difluoridro (PVDF; BioRad,

Richmond, CA) com o auxílio do Aparelho Multiphor II (Pharmacia). A

transferência foi feita pela aplicação de uma corrente constante de 12 volts

durante 45 minutos e de 36 volts durante 45 minutos. A visualização das

proteínas foi feita após a coloração das membranas em solução Azul de

Coomassie para PVDF durante 10 minutos, seguida pela descoloração

durante 20 a 30 minutos.

d) Análise da seqüência N-terminal

A análise da seqüência N-terminal de aminoácidos das proteínas

correspondentes às bandas imunoreativas identificadas pela técnica de

Western Blot foi feita pelo método da degradação automatizada de Edman

em sequenciador protéico de fase líquida (Procise 492 Applied Biosystems,

Foster City, CA). As seqüências obtidas foram comparadas com as

seqüências existentes nos bancos de dados SWISS-PROT, EMBL e

TrEMBL através do programa Fasta 3 (PEARSON && LIPMAN, 1988) do

Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, 2001).

112

3.1.2. Protocolo 2

3.1.2.1. Coleta de placentas

Os úteros de 10 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em

abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. Os estágios de

gestação foram estimados com base no comprimento entre o côndilo

occipital e a última vértebra coccígea de cada feto. De acordo com os

comprimentos obtidos, 7 placentas foram consideradas como pertencentes

ao primeiro trimestre de gestação (entre 10 e 11 semanas) e 3 placentas

foram consideradas como pertencentes ao segundo trimestre de gestação

(entre 20 e 21 semanas).

Assim como descrito no Protocolo 1, logo após o abate, os cotilédones

fetais foram imediatamente dissecados e lavados em solução de NaCl a 0,9

%, sendo em seguida transportados ao laboratório, pesados, identificados e

armazenados a –20°C até seu processamento A FIGURA 20 esquematiza a

metodologia utilizada no Protocolo 2.

3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis

Aproximadamente 890 gramas e 553 gramas de cotilédones fetais

pertencentes ao segundo e primeiro trimestres de gestação foram moídos

separadamente com o auxílio de um triturador de carne. Em seguida, os

extratos cotiledonários foram finamente triturados com auxílio de um mixer

industrial respectivamente em solução de KCl a 0,3 M (pH 5,0; Merck) e

tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M (pH 8,5; Vel). Foi utilizada uma

proporção entre tampão e tecido de 3,5:1 (volume : peso). No momento da

homogeneização foram adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM de

PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de azida sódica. A extração das

113

proteínas solúveis foi feita durante 4 horas, tendo para tal sido utilizado um

agitador industrial do tipo vortex. Após centrifugação destes extratos a

27.000 g durante 1 hora, os precipitados foram descartados e os

sobrenadantes foram concentrados até volumes de aproximadamente 250 a

500 ml. Ambos os sobrenadantes resultantes das extrações de proteínas em

meio alcalino e ácido foram carregados sobre colunas de Sephadex G-25

previamente calibradas e equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,005

M (pH 5,2). As frações obtidas foram monitoradas por espectrometria

óptica a um comprimento de onda de 280 nm.

As frações ricas em proteína de cada uma das extrações ácida e

alcalina foram novamente misturadas e concentradas, tendo desta vez seus

volumes ajustados a respectivamente 1.000 e 60 ml.

Cotilédones fetais

Iso

lam

ento

Extração de proteínas em pH ácido (placentas de 20-21 semanas de gestação)

Extração de proteínas em pH alcalino (placentas de 10-11 semanas de gestação)

Cromatografia de afinidade (gel de pepstatina A-agarose)

Cromatografia de afinidade (gel de pepstatina A-agarose)

Car

acte

riza

ção

Eletroforese monodimensional (1-D SDS-PAGE)

Coloração Coomassie Blue

Western blot

Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE)

Sequenciamento N-terminal

FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de afinidade.

114

3.1.2.3. Cromatografia de afinidade

Aproximadamente 40 e 20 ml (500 e 800 mg) dos extratos brutos

contendo as proteínas extraídas em meio ácido e alcalino foram depositadas

sobre colunas de pepstatina-A agarose (1 cm x 4 cm; Sigma, St Louis,

USA) previamente equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,05 M (pH

5,2) em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650

(Millipore Corp., Bedford, MA).

Após a eliminação das proteínas adsorvidas pela lavagem com o

tampão inicial, um gradiente linear (0-1 M NaCl) foi aplicado a um fluxo

constante de 0,5 ml/min. Em seguida, um gradiente de pH de 5 a 10 foi

aplicado a fim de liberar proteínas fortemente retidas pela afinidade à

pepstatina A.

Frações de 1 ml foram coletadas e monitoradas por espectrometria a

280 nm. Todas as frações pertencentes a um mesmo pique de proteína

foram misturadas, dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia a 5 mM

(pH 8), centrifugadas a 36.000 g por 30 minutos e finalmente liofilizadas.

3.1.2.4. Caracterização da PAG

Assim como descrito no protocolo anterior, as proteínas presentes nos

diferentes piques das colunas de pepstatina A-agarose foram caracterizadas

quanto à massa molecular (1-D SDS-PAGE), quanto à imunoreatividade

(Western Blot) e quanto ao ponto isoelétrico (2-D SDS-PAGE). As

proteínas imunoreativas após Western Blot foram seqüenciadas em sua

extremidade N-terminal.

115

3.2. Experimento 2 – Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA)

durante a gestação e período pós-parto em

fêmeas zebu

3.2.1. Animais

Os animais utilizados no presente estudo foram provenientes da zona

Sub-Saheliana do Burkina Faso (12°22’ de latitude Norte e 1°31’ e de

longitude Oeste). Esta região caracteriza-se por apresentar uma

precipitação anual média de 894 mm, com temperaturas mínimas variando

entre 8 e 20°C na estação chuvosa (Junho a Outubro) e de 26 a 39°C na

estação seca (Novembro a Maio).

Doze vacas zebu da raça Azawak, com idades variadas e, em sua

maioria múltiparas, foram diagnosticadas como gestantes por palpação

retal, sendo usadas no presente estudo. Todos os animais apresentavam

aparência clínica normal e escores de condição corporal (BCS) entre 4 e 5

no início do experimento. A condição corporal foi estimada de acordo com

uma escala a qual varia de 1 a 9 pontos (EVERSOLE et al., 2000).

As vacas Azawak foram criadas em um sistema semi-intensivo,

alimentando-se de pastagem nativa (savana, com predominância de

espécies arbustivas) e tendo livre acesso à água e à suplementação mineral.

Os animais pastavam aproximadamente durante 6 horas por dia, sendo

liberadas pela manhã e presas no curral a tarde

3.2.2. Amostras de sangue

As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados a 5-10

dias de intervalo. As coletas foram feitas por punção da veia jugular,

aproximadamente da 8a semana de gestação até a 10a semana pós-parto

116

(pp). O plasma foi obtido por centrifugação imediata das amostras de

sangue (1.500 g durante 15 min), tendo sido estocado a –20°C até o

momento das dosagens.

3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA

Os principais reagentes utilizados foram preparados com o uso de

PAG purificada a partir da placenta de zebuínos. Esta PAG foi utilizada

tanto como solução padrão (antígeno frio ou não marcado) quanto como

marcador (antígeno quente ou marcado).

3.2.3.1. Tampão da dosagem RIA

A solução estoque do tampão de dosagem (tampão Tris) foi

constituída de Tris a 25 mM, contendo MgCl2 a 10 mM e 0,1 mg/ml de

sulfato de neomicina. Esta solução teve seu pH ajustado a 7,5 pelo uso de

HCl (0,5 N). Pouco antes da realização das dosagens, foi adicionada uma

proporção de 1,0 grama de BSA por litro de tampão.

3.2.3.2. Antígeno marcado

A boPAG67 de origem zebuína obtida no Experimento 1 (DEAE 0,08

M, CM pique IX) foi marcada com o isótopo radioativo I125 pelo método da

cloramina T (GREENWOOD et al., 1963). Maiores detalhes sobre esta

técnica são fornecidas no Anexo A.

3.2.3.3. Curvas padrão

Dois sistemas de dosagem foram usados para medir as concentrações

periféricas maternas de PAG ao longo da gestação e período pós-parto em

117

fêmeas zebuínas.

O primeiro sistema, chamado sem pré-incubação (RIA-SPI), foi

utilizado para mensurar as mais altas concentrações de PAG observadas ao

longo da gestação e período pós-parto. Neste caso, a curva padrão possuía

pontos de diluição variando entre 0,8 e 100 ng/ml.

O segundo sistema de dosagem, denominado dosagem com etapa de

pré-incubação (RIA-PI) foi utilizado para mensurar as mais baixas

concentrações observadas durante o início da gestação e o final do período

pós-parto. Neste caso a curva padrão variava de 0,2 a 25 ng/ml.

A preparação purificada de PAG de origem zebuína foi inicialmente

diluída em tampão fosfato na proporção de 10 µg de proteína/100 ml de

tampão. Essa solução foi aliquotada, constituindo-se no primeiro ponto de

diluição da curva padrão usada no RIA-SPI.

3.2.3.4. Soro sem PAG

O soro ou plasma de novilhas impúberes foi coletado e testado

diversas vezes para comprovar a ausência de PAG nestas amostras. Estas

amostras de soro ou plasma comprovadamente sem PAG (serum free ou

SF) foram aliquotadas, sendo adicionadas às curvas padrão para diminuir a

influência das proteínas do plasma sangüíneo sobre as concentrações de

PAG obtidas pelas dosagens RIA.

3.2.3.5. Anti-soro

O anti-soro (AS), também conhecido como primeiro anticorpo, foi

produzido em coelhos segundo o protocolo descrito por VAITUKAITIS et

al. (1971) com algumas modificações (cf. Anexo A). Três diferentes

118

preparações de PAG (DEAE 0,08 M, CM pique IX; pique imunoreativo

reativo da pepstatina-A agarose obtido de extratos cotiledonários extraídos

em KCl e DEAE 0,04 M, CM pique XI) foram utilizadas para imunizar

coelhos (782, 785 e 786).

Os anti-soros foram testados quanto ao título de anticorpos presentes e

quanto à ligação não-específica do mesmo (non-specific binding ou NSB).

A diluição ideal de cada anti-soro foi considerada como sendo aquela na

qual 30 % da PAG marcada foi ligada ao anticorpos presentes na ausência

da PAG não marcada (tubo branco contendo 0 ng de PAG/ml ou B0). Para a

realização das dosagens ao longo da gestação e período pós-parto foi

escolhido o AS782, o qual mostrou ter títulos de anticorpos ideais a uma

diluição de 1:150.000, com NSB inferiores a 1 %.

3.2.3.6. Sistema de precipitação

A separação entre as frações radioativas livre e conjugada foi feita

pela adição de um sistema precipitante o qual contém um segundo

anticorpo dirigido contra imunoglobulinas de coelhos. Este sistema

precipitante é composto basicamente por uma mistura de imunoglobulina de

ovelha anti-IgG de coelho (0,83 % volume : volume), de soro normal de

coelho (0,17 % volume : volume), de polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel),

de celulose microcristalina (0,05 mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN

Biochemicals) diluídos em tampão Tris-HCl (pH 7,5).

3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA

As amostras de sangue foram primeiramente dosadas no sistema RIA-

SPI. Resumidamente, 0,1 ml de cada amostra a ser dosada ou de cada ponto

119

de diluição da curva padrão foram aliquotadas em duplicata em tubos de

poliestireno, tendo essas amostras sido diluídas respectivamente com 0,1 e

0,2 ml de tampão Tris-BSA. Nos tubos correspondentes ao branco (B0) e ao

NSB, a amostra da curva padrão é substituída por 0,1 ml de tampão.

Para diminuir a interferência das proteínas do plasma, 0,1 ml de

plasma sem PAG (SF) foram adicionados a todos os pontos de diluição da

curva padrão, aos tubos NSB e B0. Em seguida, 0,1 ml de 125I-PAG

(aproximadamente 28.000 cpm) e 0,1 ml de AS782 foram adicionados a

todos os tubos exceto os tubos NSB, nos quais o anti-soro foi substituído

por 0,1 ml de tampão Tris-BSA. Os tubos correspondentes à radioatividade

total (Tc) receberam 0,1 ml de 125I-PAG cada.

Uma vez adicionados, todos os reagentes foram incubados durante

aproximadamente 16 horas a uma temperatura de 20°C. No dia seguinte,

1,0 ml do sistema de precipitação foi adicionado a todos os tubos exceto os

Tc, tendo sido feita uma curta incubação de 30 minutos à temperatura

ambiente. As frações contendo as PAGs marcadas livre e ligada ao

anticorpo foram separadas por centrifugação (1.500 g x 20 min) após a

lavagem com 2 ml de Tris-BSA. O sobrenadante foi aspirado e o

precipitado foi lavado uma segunda vez com 2 ml de Tris-BSA. Após

aspiração do segundo sobrenadante, foi feita a contagem da radioatividade

dos precipitados dos tubos da curva padrão e das amostras de plasma. A

contagem foi feita durante 2 minutos em um contador de radioatividade

MultiGamma (LKB Wallac 1261; Turku, Finlândia).

A taxa de ligação entre a PAG-I125 e o AS782 foi considerada como

100 % no tubo considerado como branco (B0), o qual contém 0 ng PAG/ml.

As amostras de plasma contendo concentrações de PAG inferiores à

120

80 % de ligação entre a amostra padrão mais diluída e o ponto

correspondente a B0 (B/B0 < 80 %) foram dosadas em um sistema RIA-PI.

Neste sistema, uma etapa adicional de 16 horas de incubação foi feita antes

da adição da PAG marcada. No dia seguinte, a PAG marcada foi

adicionada e uma segunda etapa de incubação de 4 horas foi feita antes da

adição do sistema precipitante.

As amostras de plasma contendo concentrações de PAG superiores a

20 % de ligação entre a amostra padrão mais concentrada e o ponto

correspondente a B0 (B/B0 > 20 %) foram diluídas na proporção 1/10 e

1/50, sendo novamente dosadas no RIA-SPI.

3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA

Os limites mínimos de detecção (LMD) de ambos os RIA foram

determinados como sendo a média subtraída de duas vezes o desvio padrão

de 20 replicatas do amostra B0.

Quatro amostras contendo concentrações diferentes de PAG foram

usadas para calcular os coeficientes de variação intra-ensaio e inter-ensaio

de ambos os sistemas (RODBARD et al., 1974).

3.2.6. Análise estatística

As concentrações de PAG durante a gestação e período pós-parto

foram apresentadas como média ± desvio padrão (média ± DP). As

concentrações de PAG obtidas em uma fêmea Azawak (ZSand) foram

consideradas como anormais pelo teste de comparação de médias

(DAGNIELE, 1975), tendo sido excluídas da análise estatística.

O efeito da semana sobre as concentrações de PAG foi testado contra

121

os erros residuais usando-se para tal as opções STDERR e PDIFF do

Procedimento GLM do SAS (User´s Guide, 2002).

A meia vida da PAG foi calculada conforme previamente descrito por

KLINDT et al. (1979).

122

4. RESULTADOS

4.1. Experimento 1 – Purificação e caracterização de glicoproteínas

associadas à gestação

4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de

íons (Protocolo 1)

Conforme mostrado na TABELA 6, as proteínas imunoreativas à PAG

representaram 0,93 % do total de proteínas solúveis extraídas de placentas

de vacas zebu coletadas entre a 30a e 31a semanas de gestação.

Aproximadamente 87,89 % das proteínas imunoreativas presentes no

extrato inicial (extrato bruto) permaneceram no sobrenadante após sua

acidificação a pH 4,5. Após precipitações em sulfato de amônia a 0-40 %

de saturação e a 40-80 % de saturação, as proteínas imunoreativas

representavam respectivamente 0,23 % e 91,15 % das proteínas

imunoreativas inicialmente presentes no extrato bruto.

TABELA 6 - Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após diferentes etapas de extração e precipitação.

Etapa analisada PAGa (mg) PTb (mg) Proporção PAG:PT

Extração bruta 334,5 35.924 0,93 %

Precipitação ácida 294,0 20.236 1,45 %

Fração 0-40 % S.A. 0,76 173 0,44 %

Fração 40-80 % S.A. 304,9 3.855 7,91 % aQuantidade de PAG estimada por RIA. bProteína total (PT) calculada pelo método de Lowry.

123

Como pode ser visto na TABELA 7, as proteínas contidas na fração

40-80 % S.A. foram eluídas da coluna DEAE equilibrada em tampão Tris-

HCl (pH 7,6) principalmente quando foram atingidas as concentrações

correspondentes a 0,04 M, 0,08M e 0,16 M de NaCl (17,64 %, 45,96 % e

20,56 % do total de proteínas imunoreativas obtidas após a cromatografia).

Estas frações, assim como as frações DEAE menos imunoreativas foram

em seguida submetidas a cromatografia de troca de cátions em resina CM

cerâmica.

TABELA 7 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) mensuradas após eluição na coluna de Sephadex A25.

Fração DEAE PAGa (mg) TPb (mg) Proporção PAG:PT

0 M NaCl 8,33 282,7 2,95 %

0,02 M NaCl 5,63 114,6 4,91 %

0,04 M NaCl 30,74 176,3 17,44 %

0,08 M NaCl 80,07 292,9 27, 34%

0,16 M NaCl 35,78 666,0 5,37 %

0,32 M NaCl 7,49 292,4 2,56 % aQuantidade de PAG estimada por RIA. bProteína total (PT) calculada pelo peso após liofilização.

Como pode ser visto nas TABELAS 8, 9 e 10, após cada

cromatografia em coluna CM, foram observados entre 10 e 20 piques de

proteínas. Os perfis cromatográficos destas cromatografias encontram-se

descritos em maiores detalhes na FIGURA 21.

124

TABELA 8 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0 M e 0,02 M NaCl.

DEAE 0 M DEAE 0,02 M Pique Concen-

tração inicial de

NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

Concen-tração

inicial de NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

I 0 0,04 0,1995 87,9 0,23 0 0 0 5,5 0 II 0,04 0,08 0,0002 0,1 0,20 0 0 0 2,4 0 III 0,08 0,09 0 0,1 0 0 0 0 2,4 0 IV 0,09 0,12 0,0183 1,0 1,83 0 0,08 0 2,5 0 V 0,12 0,14 0,0494 0,5 9,88 0,08 0,13 0 1,0 0 VI 0,14 0,17 0,1588 1,0 15,88 0,13 0,26 0 4,0 0 VII 0,17 0,18 0,1944 1,0 19,44 0,26 0,33 0 5,6 0 VIII 0,18 0,22 0,3876 1,8 21,53 0,33 0,36 0,0184 10,4 0,18 IX 0,22 0,27 0,6677 2,8 23,85 0,36 0,38 0,1879 4,8 3,91 X 0,27 0,33 1,1947 2,9 41,20 0,38 0,39 0,7552 3,8 19,87 XI 0,33 0,38 0,9876 3,7 26,69 0,39 0,41 0,8932 3,9 22,90 XII 0,38 0,46 0,1017 17,7 0,57 0,41 0,42 0,6386 15,2 4,20 XIII 0,46 0,65 0,0118 15,6 0,08 0,42 0,46 0,0143 5,8 0,25 XIV - - - - - 0,46 0,48 0,0034 3,1 0,11 aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

Quando calculada a proporção entre a quantidade estimada de PAG

obtida por RIA e a quantidade de proteína total (PT) presentes em cada

pique das diferentes cromatografias em resina CM cerâmica, foram

observados piques únicos de PAG.

Os piques CM mais imunoreativos foram obtidos após cromatografia

das frações DEAE 0,04 e 0,08 M de NaCl, tendo sido eluídos por

concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,18 M. Os piques CM

apresentando menor imunoreatividade foram obtidos após cromatografia

125

das frações DEAE 0 M, 0,02 M, 0,16 M e 0,32 M de NaCl, tendo sido

eluídos por concentrações de NaCl situadas entre 0,21 e 0,41 M.

TABELA 9 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl.

DEAE 0,04 M DEAE 0,08 M Pique Concen-

tração inicial de

NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

Concen-tração

inicial de NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

I 0 0 0 0 0 0 0 0,0033 16,5 0,02 II 0 0 0 7,9 0 0 0 0,0012 1,6 0,08 III 0 0 0 2,5 0 0 0,02 0,0190 4,4 0,43 IV 0 0,02 0 1,2 0 0,02 0,04 0,0045 0,7 0,64 V 0,02 0,04 0 1,8 0 0,04 0,06 0,0026 2,2 0,12 VI 0,04 0,06 0 4,4 0 0,06 0,08 0,0016 1,5 0,11 VII 0,06 0,08 0 1,9 0 0,08 0,11 0,0483 1,6 3,02 VIII 0,08 0,10 0 2,8 0 0,11 0,14 7,9478 13,6 58,44 IX 0,10 0,14 0,0017 6,8 0,03 0,14 0,17 20,9184 19,5 > 100 X 0,14 0,16 2,5081 8,6 29,16 0,17 0,19 3,0624 8,0 38,28 XI 0,16 0,18 12,7215 10,7 > 100 0,19 0,22 0,7722 5,2 14,85 XII 0,18 0,24 5,0146 15,3 32,78 0,22 0,24 0,7226 5,9 12,25 XIII 0,24 0,26 0,2799 3,2 8,75 0,24 0,27 0,3240 5,3 6,11 XIV 0,26 0,35 0,2967 16,6 1,79 0,27 0,32 0,2288 14,9 1,54 XV 0,35 0,37 0,0201 1,5 1,34 0,32 0,37 0,0970 9,6 1,01 XVI 0,37 0,44 0,0338 7,6 0,45 0,37 0,56 0,1009 8,9 1,13 XVII 0,44 0,46 0,0060 0,8 0,75 0,56 0,67 0,0108 1,3 0,83 XVIII 0,46 0,48 0,0058 0,7 0,82 - - - - - XIX 0,48 0,51 0,0058 0,6 0,97 - - - - - XX 0,51 0,58 0,0038 0,5 0,76 - - - - -

aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

126

TABELA 10 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl.

DEAE 0,16 M DEAE 0,32 M Pique Concen-

tração inicial de

NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

Concen-tração

inicial de NaCl (M)

Concen-tração

final de NaCl (M)

PAGa (mg)

PTb (mg)

Propor-ção

PAG:PT (%)

I 0 0 0,0052 29,0 0,02 0 0 0,7821 126,1 0,62 II 0 0,02 0,0067 6,1 0,11 0 0,21 0,2736 0,7 39,08 III 0,02 0,04 0,0029 2,4 0,12 0,21 0,27 0,1936 0,3 64,55 IV 0,04 0,08 0,0024 1,7 0,14 0,27 0,30 0,0398 0,2 19,90 V 0,08 0,12 0,0064 4,0 0,16 0,30 0,35 0,0358 0,6 5,97 VI 0,12 0,19 0,0035 2,9 0,12 0,35 0,40 0,0081 1,0 0,81 VII 0,19 0,23 0,0026 1,6 0,16 0,40 0,44 0,0031 1,2 0,26 VIII 0,23 0,30 2,825 9,6 29,43 0,44 0,49 0,0032 1,2 0,27 IX 0,30 0,32 1,3308 18,8 7,08 0,49 0,60 0,0017 0,5 0,34 X 0,32 0,36 0,2567 38,7 0,66 0,60 0,85 0,0022 0 0 XI 0,36 0,39 0,0443 13,1 0,34 - - - - - XII 0,39 0,44 0,0336 4,4 0,76 - - - - - XIII 0,44 0,52 0,0115 1,7 0,68 - - - - - aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

Após cromatografia em resina CM cerâmica, as proteínas existentes

no pique mais imunoreativo de cada cromatografia foram analisadas quanto

a suas massas moleculares, a suas imunoreatividades com o uso de 3 anti-

soros de origens distintas e quanto a seus pontos isoelétricos. A FIGURA

22 mostra a análise eletroforética (1-D SDS-PAGE e Western Blot) das

proteínas presentes no pique mais imunoreativo de diferentes CM

cerâmicas realizadas. As massas moleculares calculadas para as bandas

mais imunoreativas, assim como seus respectivos pontos isoelétricos

calculados por 2-D SDS-PAGE estão descritos na TABELA 11.

127

FIGURA 21 - Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32 M NaCl submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x 3 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a 10 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e proteína total (PT).

41,2 %

22,9 %

> 100 % > 100 %

29,4 %

64,6 %

128

FIGURA 22 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso do AS497 (anti-boPAG67). As pistas 1, 2, 3, 4 and 5 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em resina CM cerâmica das frações DEAE 0, 0,02, 0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte microgramas de proteínas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 22A e 22B, respectivamente.

A banda mais intensamente corada de cada pique CM revelou-se

imunoreativa após Western Blot com o uso de anti-soro anti-boPAG67

(AS497). Uma imunoreatividade semelhante foi observada após Western

Blot com o uso dos anti-soros anti-caPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59

(AS708). A redução com o agente redutor mercaptoetanol não afetou a

massa molecular das proteínas imunoreativas.

129

4.1.2. Análise da seqüência N-terminal das proteínas imunoreativas

isoladas com o auxílio de cromatografias de troca de íons

(Protocolo 2)

Após transferidos sob membrana de PVDF, os spots correspondentes

às bandas imunoreativas detectadas por Western Blot foram seqüenciados

em sua porção N-terminal. Os quatro spots correspondentes à fração DEAE

0,08 M NaCl, CM pique IX foram seqüenciadas, revelando a seqüência

Arg-Gli-Ser-A?n-Leu-Tre-Tre-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lis-A?n-Leu-Val-

Tir-Met-Gli-Asn-Ile-Tre -Ile-Gli, a qual corresponde à extremidade N-

terminal da boPAG-1 (código de acesso SWISS-PROT Q29432). A mesma

seqüência foi verificada em um dos spots da fração DEAE 0,04 M NaCl,

CM pique XI. Esta seqüência foi depositada no banco de dados SWISS-

PROT, tendo recebido o código de acesso P83126.

TABELA 11 - Características eletroforéticas e identidade ao nível de seqüência N-

terminal das proteínas mais imunoreativas isoladas pela cromatografia em resina CM cerâmica.

Fração

DEAE de origem

MM das principais bandas coradasa pIs das proteínas imunoreativasb

Identidade ao nível de seqüência de aa

N-terminal Coomassie Blue Western Blot

0 M NaCl 51 kDa 50 kDa 6,4, 6,6, 6,7 boPAG-1 (10 aa)

0,02 M NaCl 62 kDa 56 kDa 5,2, 5,5 boPAG-1 (10 aa)

0,04 M NaCl 66 kDa 67 kDa 5,1, 5,2, 5,4 boPAG-1 (25 aa)

0,08 M NaCl 67 kDa 71 kDa 5,0, 5,1, 5,2, 5,3 boPAG-1 (25 aa)

0,16 M NaCl 67 kDa

60 kDa

67 kDa

-

4,4, 5,0, 5,5, 6,0

-

boPAG-1 (10 aa)

-

0,32 M NaCl 62 kDa 62 kDa 5,8, 6,1, 6,3, 6,4 α-N-acetil-galacto-saminidase (12 aa)

aMassas moleculares (MM) foram estimadas por 1-D PAGE-SDS. bPontos isoelétricos (pIs) foram estimados por 2-D PAGE-SDS.

130

O microseqüenciamento N-terminal (10 aa) das proteínas

imunoreativas provenientes dos piques CM das frações DEAE 0 M, 0,02 M

e 0,16 M NaCl também revelaram 100 % de identidade com a seqüência N-

terminal da boPAG-1.

Apesar da alta imunoreatividade detectada após RIA de um dos piques

CM da fração DEAE 0,32 M NaCl (62,55 %), o microseqüenciamento da

proteína mais imunoreativa (FIGURA 23) revelou a seqüência Leu-Glu-

Asp-Gli-Leu-Leu-Arg-Lis-Pro-Pro-Met-Gli, a qual apresenta uma alta

identidade (91,65 %) com a alfa-N-acetilgalactosaminidase de

camundongos (código de acesso SWISS-PROT O88620). A seqüência da

proteína correspondente à galactosaminidase, isolada a partir da placenta de

zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT, tendo recebido

o código de acesso P83127.

FIGURA 23 - 2-D SDS-PAGE do pique mais imunoreativo obtido após cromatografia em resina CM Cerâmica da fração DEAE 0,32 M NaCl. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas no lado direito da figura. A escala de pH está indicada na parte superior do gel. As setas indicam as diferentes isoformas (6,4, 6,3, 6,1 e 5,8) da alfa-N-acetilgalactosaminidase.

131

4.1.3. Caracterização da PAG identificada após a realização de

cromatografias de afinidade em gel de pepstatina A-agarose

(Protocolo 2)

4.1.3.1. Extração ácida

Conforme estimado por RIA, as proteínas reativas à PAG

representavam 0,61 % (73,73 mg) das proteínas extraídas em pH ácido. O

pique imunoreativo obtido após cromatografia em gel de pepstatina A-

agarose foi eluído a concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,43

(FIGURA 24). Este pique apresentou uma proporção de 15,74 % entre a

quantidade estimada de PAG (mensurada por RIA) e a quantidade de PT

(mensurada pelo método de Lowry). Conforme observado por

espectrometria (comprimento de onda de 280 nm), após a aplicação do

gradiente de pH, nenhum pique protéico foi observado.

FIGURA 24 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração das placentas coletadas entre 20 e 21 semanas de gestação foi feita em pH ácido (KCl a 0,3 M, pH 5,0). A coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT).

15,7 %

132

Uma única banda protéica foi observada após 1-D SDS-PAGE do

pique imunoreativo (FIGURA 25A, pista 1). A realização de 2-D SDS-

PAGE com uma maior quantidade de proteínas provenientes deste pique

(200 µg) revelou a existência de três spots, o primeiro correspondendo a

uma massa molecular de 67 kDa, e os dois outros correspondendo a uma

massa molecular de 84 kDa (pI 4,4 e 5,4).

FIGURA 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG67 (AS497), anti-caPAG55+62 (AS706) and caPAG55+59 (AS708). As pistas 1 e 2 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em pepstatina A-agarose após extração em pH ácido e alcalino, respectivamente. Sessenta microgramas das proteínas imunoreativas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 25A e 25B, respectivamente.

133

O microseqüenciamento da extremidade N-terminal (14 aa) do spot de

67 kDa revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1. Os

spots de 84 kDa tiveram o seqüenciamento bloqueado ao 1o e 6o ciclos (pI

de 4,4 e 5,4, respectivamente). O seqüenciamento do spot correspondente

ao pI 4,4 revelou a seqüência Ala-Val-Asp-Gli-Gli-His, a qual não

corresponde a nenhum membro da família das PAGs.

4.1.3.2. Extração alcalina

Conforme estimado por RIA, as proteínas imunoreativas à PAG

representavam 1,81 % (43,57 mg) das proteínas extraídas em pH alcalino.

Após cromatografia em coluna de pepstatina A-agarose, as proteínas

extraídas em pH alcalino foram fracionadas em diversos piques (FIGURA

26), o mais reativo deles tendo sido eluído a concentrações de NaCl

situadas entre 0,19 e 0,42 M. Nenhuma proteína foi eluída após a aplicação

do gradiente de pH.

A análise eletroforética (1-D SDS-PAGE) do pique imunoreativo

revelou a existência de uma banda protéica mais fortemente corada com

uma massa molecular aparente de 69 kDa, e de diversas bandas mais

fracamente coradas, cujas massas moleculares variaram entre 20 kDa e 84

kDa (FIGURA 25A, pista 2). Após Western Blot, duas bandas

imunoreativas foram reveladas. Essas bandas apresentavam massas

moleculares aparentes de 69 e 84 kDa (FIGURA 25B, pistas 2).

Após análise por 2-D SDS-PAGE, foram visualizadas três variantes

isoelétricas correspondentes à massa molecular de 69 kDa (pI 3,1, 3,3 e

6,18). O microseqüenciamento N-terminal de um destes spots (14 aa)

revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1.

134

FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas de gestação foi feita em pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M, pH 8,5). A coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT).

Apesar de altamente reativa após Western Blot com o uso de anti-

soros de origem bovina e caprina, a proteína 84 kDa revelou a seqüência

Asp-Lis-Asn-Ala-Tir-Gli-Ile-Asp-Leu-Ile-Leu, a qual apresenta 77,78 % de

identidade com a metaloproteinase alcalina (código de acesso GenBank

AAK22731) identificada no genoma do Caulobacter crescentus. A

seqüência da proteína correspondente à metaloproteinase, isolada a partir

da placenta de zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT,

tendo recebido o código de acesso P83128.

3,3 %

135

4.2. Experimento 2 - Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA)

durante a gestação e período pós-parto em

fêmeas zebu

4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA

As TABELAS 12 e 13 resumem algumas das principais características

dos sistemas RIA homólogos usados para mensurar as concentrações

plasmáticas de PAG no plasma de fêmeas zebuínas.

TABELA 12 - Características dos sistemas RIA com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as concentrações de PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas zebu gestantes.

Sistema

Limite mínimo de detecção (ng/ml)

Ligação não-específica (%)

B0/T (%)a

Dose estimada (ng/ml) a B/B0b

20 % 50 % 80 %

RIA-PI 0,20 < 1,0 23 7,83 2,47 0,76

RIA-SPI 1,11 < 1,0 28 114,34 26,67 6,24

aB0/T = Quantidade de PAG marcada no tubo B0 Quantidade total de PAG marcada adicionada.

bB/B0 = Quantidade de PAG marcada na curva padrão Quantidade de PAG marcada no tubo B0.

Na presença de excesso de anticorpos, 83,6 % da PAG marcada foi

ligada. O deslocamento das curvas padrão foi altamente reproduzível,

variando de 90,7 ± 2,0 % a 12,5 ± 1,1 % (n = 10) de ligação no sistema

RIA-PI, e de 92,2 ± 1,2 % a 6,4 ± 1,0 % (n = 10) no sistema RIA-PI

(FIGURA 27).

136

TABELA 13 - Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e inter-ensaio dos sistemas de dosagem com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI).

Intra-ensaio Inter-ensaio

Concentração de PAGa (ng/ml)

CV (%) Concentração de PAGa (ng/ml)

CV (%)

RIA-PI

Amostra 1 1,49 ± 0,11 7,4 1,62 ± 0,15 9,4

Amostra 2 3,24 ± 0,11 3,5 3,37 ± 0,05 1,6

Amostra 3 12,73 ± 0,63 4,9 12,01 ± 0,57 4,8

RIA-SPI

Amostra 2 3,09 ± 0,34 11,1 3,11 ± 0,43 13,8

Amostra 3 11,73 ± 0,76 6,5 11,99 ± 0,74 6,1

Amostra 4 60,22 ± 4,81 8,0 53,04 ± 6,06 11,4 a(média ± DP)

FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos sistemas de

dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem etapa de pré-incubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das concentrações de PAG.

0,1 1 10 100

PAG (ng/mL)

0

20

40

60

80

100B/Bo x 100

0,1 1 10 100

PAG (ng/mL)

0

20

40

60

80

100B/Bo x 100B/Bo x 100

PAG ng/ml

137

4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak

Uma das 12 vacas Azawak inicialmente diagnosticadas como

gestantes por palpação retal mostrou concentrações de PAG inferiores ao

limite mínimo de detecção (< 0,2 ng/ml) e não pariu.

Dez vacas Azawak tiveram gestações simples, parindo um total de 3

bezerros machos e 7 fêmeas. Uma outra fêmea zebu deu cria a uma fêmea

emaciada. Esta fêmea apresentou concentrações de PAG extremamente

elevadas ao longo da gestação, tendo suas concentrações excluídas do perfil

geral. Clinicamente, esta vaca caracterizou-se por apresentar um declínio

de sua condição corporal, a qual passou de 4-5 no início da gestação, à 1-2

no terço final.

A FIGURA 28 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período

pós-parto em 10 vacas zebuínas da raça Azawak. As concentrações médias

semanais de PAG variaram significativamente entre os animais (P<0,0001)

e períodos de gestação (P<0,0005). Entretanto, diferenças significativas

entre as diferentes semanas de gestação somente foram verificadas uma

semana antes do parto.

As concentrações médias de PAG aumentaram progressivamente da 8a

à 35a semanas de gestação (de 6,0 ± 4,2 ng/ml a 196,0 ± 34,8 ng/ml). Em

seguida, as concentrações permaneceram relativamente constantes até a 39a

semana (210,8 ± 74,8 ng/ml), alcançando seus mais altos níveis (1.095,6 ±

607,8 ng/ml) na semana do parto (40a semana).

Após o parto, as concentrações de PAG decresceram

significativamente (P<0,05), sendo os mais baixos níveis (5,1 ± 5,2 ng/ml)

alcançados na 10a semana pós-parto.

138

FIGURA 28 - Concentrações plasmáticas de PAG (média ± DP) durante a gestação e período pós-parto em 10 fêmeas zebu da raça Azawak. A 40a semana de gestação corresponde à semana do parto (0pp). Diferenças significantes entre as semanas de gestação estão indicadas por asteriscos (*P<0.0001, **P<0.05).

Após o parto foi calculada uma meia-vida de 10,1 dias para a PAG.

Quando estimado pela equação de regressão (FIGURA 29), seria

necessário um período de aproximadamente 14 semanas para que as

concentrações de PAG se tornassem indetectáveis (< 0,2 ng/ml).

4.2.3. Perfil atípico de PAG

A FIGURA 30 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período

pós-parto em uma fêmea zebu Azawak apresentando concentrações de

PAG aproximadamente 3,5 vezes superior a média obtida para a raça. Da

10a semana da gestação até o parto, foi obtida uma média semanal de 227,6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp 10pp 15pp

Semanas de gestaçao e pos-parto

0

500

1000

1500

2000PAG (ng/ml)

* **

*

parto↓

139

ng de PAG/ml, enquanto que a média semanal obtida nas outras 10 fêmeas

gestantes foi de aproximadamente 64,1 ng de PAG/ml.

FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de PAG mensuradas entre a parturição e a 10a semana pós-parto. As concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por círculos (●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da gestação foram representadas por quadrados (■).

A meia-vida da PAG estimada para esta vaca foi de aproximadamente

9,2 dias. Assim como o calculado para o restante da raça, seria necessário

um período de 14 semanas para que as concentrações de PAG se tornassem

indetectáveis (< 0,2 ng/ml).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Semanas apos o parto

0

1

2

3

4

5

6

7

8Ln PAG (ng/ml)

População homogênea

Y = -0,5095x + 7,42951

Vaca apresentando concentrações elevadas de PAG

Y = -0,5165x + 7,67758

140

FIGURA 30 - Comparação dos perfis de PAG entre vacas Azawak apresentando gestações normais (população homogênea) e a vaca que apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da gestação.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp 10pp15pp

Semanas antes e apos a gestaçao

0

200

400

600

800

1000

PAG (ng/ml)

Vaca apresentando concentrações elevadas de PAG

População homogênea

141

5. DISCUSSÃO

5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de

íons

O uso de protocolos de purificação com diversas etapas de

fracionamento já permitiu o isolamento de diversas formas de PAG a partir

da placenta de vacas de raças taurinas (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et

al., 1988; ZOLI et al., 1991), de cabras (GARBAYO et al., 1998), de

ovelhas (WILLARD et al., 1995; XIE et al., 1997a) e de cervídeos

(HUANG et al., 1999). Estas formas de PAG foram caracterizadas

principalmente quanto à suas massas moleculares e pontos isoelétricos,

tendo algumas delas sido caracterizadas também quanto a suas seqüências

N-terminais.

Na primeira parte do presente estudo, um protocolo de purificação

incluindo precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia e

cromatografias de troca de íons foi utilizado para purificar glicoproteínas

associadas à gestação extraídas a partir de placentas de fêmeas zebuínas.

Considerada por alguns autores como desnecessária (HUANG et al.,

1999), a realização da precipitação mostrou ser uma etapa de grande

utilidade ao isolamento da PAG. Ela permitiu a eliminação de mais de 40

% (16 g) das proteínas solúveis presentes no extrato placentário bruto, com

uma perda mínima de proteínas imunoreativas à PAG (recuperação de 88

% da imunoreatividade inicial).

Não se sabe ao certo se a precipitação ácida seria responsável pela

eliminação de algumas formas de PAG. Entretanto, a utilização desta etapa

no protocolo de purificação utilizado na espécie caprina não interferiu no

142

isolamento de 3 novas formas de PAG, as quais possuíam diferentes

massas moleculares, cada qual constituída por diversas isoformas

(GARBAYO et al., 1998).

Como demonstrado por diversos autores, a realização de

cromatografias de troca de íons tem demonstrado ser bastante efetiva para a

separação de diferentes formas de PAG extraídas a partir de placentas de

cabras (GARBAYO et al., 1998), de ovelhas (WILLARD et al., 1995; XIE

et al., 1997a) e de cervídeos (HUANG et al., 1999). Na espécie caprina,

por exemplo, após cromatografia em coluna DEAE Celulose, as proteínas

imunoreativas foram igualmente eluídas pelas concentrações de 0,04 e 0,08

M de NaCl. O fracionamento posterior de ambas as frações demonstrou a

existência de uma PAG de massa molecular 55 kDa (caPAG55) nas duas

frações DEAE, assim como a existência de PAGs distintas com massas

moleculares 59 kDa (caPAG59) e 62 kDa (caPAG62), respectivamente nas

frações 0,04 e 0,08 M NaCl.

Na espécie ovina, a associação entre as cromatografias de troca de

ânions e de cátions levou à caracterização de 4 PAGs: a ovPAG55, a

ovPAG60, a ovPAG61 e a ovPAG65 (XIE et al., 1997a). Cada uma destas

proteínas demonstrou ser possuidora de uma seqüência N-terminal distinta,

apresentando, entretanto, uma alta identidade com os demais membros da

família das proteases aspárticas.

Em vistas de se investigar a possível existência de diferentes formas

de PAG na placenta de zebuínos, todas as frações DEAE foram

sistematicamente submetidas a cromatografia de troca de cátions em coluna

CM cerâmica, sendo as proteínas presentes nos piques mais imunoreativos

analisadas por SDS-PAGE e Western Blot com o uso de anti-soros

143

produzidos contra diferentes formas de PAGs. Se levarmos em

consideração as diferentes massas moleculares (51 a 67 kDa) e pontos

isoelétricos (3,1 a 6,7) encontrados no presente trabalho, nossos resultados

confirmam uma grande heterogeneidade de formas de PAGs presentes nos

extratos placentários de zebuínos. Considerando-se especificamente as

seqüências N-terminais obtidas, nosso primeiro protocolo não revelou a

existência de diferentes formas de PAG eluídas em diferentes condições

iônicas. De fato, todas as proteínas da família das PAGs bovinas

purificadas até o presente (boPAG67, bPSPB, PSP-60) apresentaram a

mesma seqüência N-terminal, tendo estas seqüências sido obtidas por meio

de microseqüenciamento (CAMOUS et al., 1988) ou deduzidas a partir da

seqüência de DNA (XIE et al., 1991; LYNCH et al., 1992).

Existem ao menos três possíveis explicações para a aparente

discrepância entre os resultados obtidos por técnicas bioquímicas e de

biologia molecular, a qual permitiu a identificação de 21 ADNs

codificantes para diferentes PAGs em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al.,

1994; XIE et al., 1997a,b; GREEN et al., 2000). A primeira seria a de que,

apesar dos ADNs codificantes para diferentes PAGs poderem ser

transcritos e traduzidos sob a forma de proteínas, estas poderiam ser

rapidamente degradadas, não acumulando em quantidades suficientes, de

forma a poder ser identificadas por técnicas bioquímicas. A segunda

explicação seria a de que, em bovinos, algumas formas de PAG teriam o

seqüenciamento N-terminal bloqueado. Neste caso, apenas proteínas

majoritárias não bloqueadas poderiam ser identificadas pela degradação de

Edman. A terceira explicação seria a de que algumas das PAGs

identificadas por biologia molecular poderiam ser ligadas à membranas via

144

ácidos graxos, sendo consequentemente dificilmente extraíveis pelos

procedimentos utilizados no Protocolo 1. Entretanto esta hipótese parece

ser bastante improvável devido ao fato de que os ADNs codificantes para

PAGs identificados até o presente parecem codificar proteínas com uma

estrutura bastante próxima à do pepsinogênio (GURUPRASAD et al.,

1996), o qual não é originalmente ligado à membranas.

De acordo com XIE et al. (1991), a presença de cadeias laterais de

carboidratos seria responsável, ao menos parcialmente, pelas diferenças

observadas nas massas moleculares das PAGs. Um outro fator que poderia

estar implicado na diferença de suas massas moleculares seria a existência

de fragmentos de PAG os quais poderiam constituir-se nas formas de

menor massa molecular observadas por eletroforese.

Segundo sugerido por ZOLI et al. (1991), os diferentes graus de

glicosilação parecem estar também implicados na heterogeneidade dos

pontos isoelétricos observados para a boPAG67. No que concerne à

seqüência N-terminal, de forma semelhante ao observado em taurinos

(ZOLI et al., 1991), ovinos (XIE et al., 1997a) e caprinos (GARBAYO et

al., 1998), a PAG extraída da placenta de raças zebuínas falhou em dar

sinais no 4o ciclo o que indica a presença de uma cadeia de carboidratos

ligada às Asp 4.

Apesar da alta imunoreatividade observada na fração DEAE 0,32 M

CM pique III, o seqüenciamento de sua proteína majoritária (62 kDa)

mostrou mais de 75 % de identidade com a seqüência N-terminal da alfa-

N-acetilgalactosaminidase (α-GalNAc), uma exoglicosidase lisossomal

sintetizada em diversos tecidos das espécies humana (WANG et al., 1990),

murina (HERRMANN et al., 1998) e de galináceos (DAVIS et al., 1993).

145

A α-GalNAc não é estruturalmente, nem enzimaticamente, relacionada às

proteinases aspárticas lisossomais tais como a catepsina D. Entretanto, uma

expressão anormal de ambas parece estar diretamente relacionada a

condições patológicas tais como o câncer (YAMAMOTO et al., 1997;

VIGNESWARAN et al., 2000) e doenças neurológicas distróficas ou

degenerativas (LADROR et al., 1994; WOLFE et al., 1995).

A forma humana da α-GalNAc também foi acidentalmente

identificada como sendo uma das cinco bandas protéicas majoritárias

resultantes de procedimentos de purificação das sialidases placentárias

(TSUJI et al., 1989). Conforme descrito por SWEELEY et al. (1983), na

espécie humana, α-GalNAc parece ser sintetizada como um precursor

glicosilado de 65 kDa, o qual é processado a uma forma madura de 48 kDa.

Devido ao fato de ser diretamente responsável pela imunosupressão por um

mecanismo que envolve a deglicosilação do precursor do fator ativador de

macrófagos (MAF) em pacientes cancerosos (YAMAMOTO et al., 1997),

poderia ser sugerido que a forma placentária da α-GalNAc poderia estar, de

alguma forma, envolvida com o mecanismo de imunoregulação ao nível de

interface materno-fetal. Entretanto, estudos complementares são

necessários para comprovar esta hipótese.

5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização de

cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose

O estudo comparativo entre as estruturas tridimensionais das PAGs

bovinas e do pepsinogênio porcino demonstrou que as PAGs teriam

conservado a estrutura bilobulada característica das proteases aspárticas,

possuindo uma fenda entre os dois lobos capaz de acomodar peptídeos de

146

até sete aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al., 1996).

Como conseqüência, tem sido sugerido que proteínas da família das PAGs

poderiam ser purificadas pelo uso de cromatografia de afinidade com o uso

de gel de pepstatina A-agarose (GURUPRASAD et al., 1996; GARBAYO

et al., 2000).

A pepstatina A é um inibidor extremamente potente das proteases

aspárticas (MARCINISZYN et al., 1977). Ela se liga reversivelmente a

pepsina, a renina e a catepsina D, tendo por isso sido usado como ligante

para a realização de cromatografias de afinidade para purificação destas

enzimas (DZAU et al., 1979; AFTING & BECKER, 1981).

Na segunda parte do presente estudo, um protocolo de purificação

baseado na utilização da coluna de afinidade com gel de pepstatina agarose

foi testada para o isolamento da PAG a partir de placentas de fêmeas

zebuínas coletadas durante o primeiro e segundo trimestres de gestação.

Algumas formas de PAG, diferentes quanto a suas massas moleculares

e pontos isoelétricos, puderam ser identificadas após cromatografia de

afinidade com o uso de gel de pepstatina A agarose. Quando extratos de

placentas coletadas no segundo trimestre de gestação foram extraídas em

pH ácido, o uso de gel de pepstatina A-agarose permitiu o enriquecimento

do mesmo por um fator de 25,8 (proporção PAG : PT de 15,74 % após a

cromatografia versus 0,61 % antes da cromatografia). Uma menor eficácia

foi observada após cromatografia de afinidade dos extratos placentários

coletados durante o primeiro trimestre de gestação e extraídos em pH

alcalino (proporção PAG:PT de 3,26 % após a cromatografia versus 1,81 %

antes da cromatografia). Esta baixa eficiência obtida com o isolamento da

PAG a partir de extratos placentários coletados durante o primeiro trimestre

147

de gestação parece ser devida principalmente à alta viscosidade do mesmo,

o que poderia ter tornado difícil uma adequada interação entre a pepstatina

A e a PAG.

Em ambas as cromatografias de afinidade, a fração contendo a PAG

foi eluída antes que fosse atingida uma alta concentração em NaCl,

indicando uma fraca interação entre a PAG e a pepstatina A. Este achado é

consistente com a teoria de que a substituição de uma Tir89 e de uma

Leu220 (numeração de acordo com a seqüência do pepsinogênio porcino)

por resíduos de Asp resultaria em uma fraca interação entre a boPAG67 e o

inibidor pepstatina (GURUPRASAD et al., 1996).

Após cromatografia de afinidade, o extrato de placentas coletadas nos

dois primeiros trimestres de gestação revelaram a existência de uma única

proteína imunoreativa de 67 a 69 kDa de massa molecular aparente. Esta

proteínas possuíam, assim como as proteínas isoladas no primeiro

protocolo, seqüências N-terminais 100 % idênticas às da proteína

previamente isolada e partir da placenta de raças taurinas.

Como pôde ser observado na FIGURA 25 (pista 2), uma outra

proteína com massa molecular de 84 kDa altamente imunoreativa a anti-

soros anti-PAG bovina e caprina foi identificada após a cromatografia de

afinidade. O seqüenciamento desta proteína revelou 77,78 % de identidade

com a seqüência N-terminal de uma metaloproteinase alcalina previamente

identificada no genoma do Caulobacter crescentus (NIERMAN et al.,

2001). Três principais possibilidades poderiam ser sugeridas para a

identificação desta proteína em extratos placentários de raças zebuínas. A

primeira seria a ocorrência de proliferação bacteriana durante o

procedimento de purificação. A segunda possibilidade seria a de que ambas

148

as classes de proteínas possuiriam alguns epitopes em comum, podendo ser

reconhecidas como resultado de reações cruzadas dos anti-soros policlonais

utilizados. A terceira possibilidade seria a expressão natural desta

metaloproteinase em extratos placentários de zebuínos. Investigações

complementares estão sendo realizadas no sentido de investigar a

possibilidade da ocorrência de reações cruzadas entre ambas as classes de

proteínas.

5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação e período

pós-parto em fêmeas zebu

Durante gestações normais, as concentrações de PAG podem diferir

consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al.,




1994), o número de fetos (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997), o

genótipo fetal (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995), o estado

nutricional da fêmea (WALLACE et al., 1997a) e no caso de transferência de

embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões (ECTORS et al.,

1996a,b). As concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com

o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta resultando

provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al.,

1999,2000).

Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em

taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997),

em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ ORTIZ, 1992;

149

FOLCH et al., 1993), Canindé (SOUSA et al., 1999), Moxotó (SOUSA et

al., 1999), Canária (GONZÁLEZ et al., 2000), Alpina (BATALHA et al.,

2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al., 1997), Churra

(RANILLA et al., 1994), Merino (RANILLA et al., 1994) e Berrichon

(GAJEWSKI et al., 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis de

PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína.

Na última parte do presente trabalho, foi descrito o perfil plasmático

de PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebuínas

gestantes pertencentes à raça Azawak. Algumas das principais

características dos sistemas homólogos desenvolvidos para a dosagem da

PAG em raças zebuínas também foram descritos.

Os sistemas radioimunológicos desenvolvidos a partir do uso da PAG

purificada a partir da placenta de fêmeas zebuínas mostraram ser bastante

precisos para a mensuração da PAG na circulação periférica materna. Os

coeficientes de variação obtidos tanto para o sistema RIA com pré-

incubação (RIA-PI) quanto para o sistema de dosagem sem etapa de pré-

incubação (RIA-SPI) foram bastante baixos (1,6 a 13,8 %). Eles foram

comparáveis aos resultados obtidos por ZOLI et al. (1992a) para a dosagem

da PAG de origem taurina (6,9 a 11,6 %) e por GONZALEZ et al. (1999)

para a dosagem da PAG caprina (6,9 a 11,6 %). Um outro importante

aspecto observado foi o de que quando uma mesma amostra foi dosada por

ambos os sistemas (PI e SPI), as concentrações de PAG permaneceram

constantes, mesmo se dosadas nas regiões menos sensíveis das curvas

padrão (B/B0 inferior a 80 % de ligação ou superior a 20 % de ligação).

No que se refere à aplicação prática dos sistemas RIA aqui descritos,

enquanto que o sistema RIA-PI mostrou ser adequado à dosagem da PAG

150

durante o início da gestação (concentrações entre 0,8 e 7,8 ng/ml), o

sistema RIA-SPI mostrou ser capaz de detectar concentrações tão altas

quanto 100 ng/ml, sendo mais adequado ao monitoramento das

concentrações de PAG ao longo da gestação e reduzindo a necessidade da

diluição das amostras durante a maior parte da gestação.

No que diz respeito à comparação dos perfis de PAG em animais de

raças zebuína e taurina (ZOLI et al., 1992a; PATEL et al., 1997), em

ambos os taxas foi observado um lento aumento destas concentrações entre

a 8a e a 35a semanas de gestação, período durante o qual as concentrações

de PAG permaneceram inferiores a 200 ng/ml. Entretanto, enquanto que

em zebuínos as concentrações de PAG permaneceram em níveis

relativamente constantes da 35a à 39a semanas de gestação (196,0 ± 34,8

ng/ml a 210,8 ± 74,8 ng/ml), em raças taurinas este período correspondeu a

um rápido aumento das concentrações de PAG (158,9 ± 60,2 a 1.551,9 ±

589,7 ng/ml) (ZOLI et al., 1992a). Ainda não se sabe se as concentrações

relativamente constantes de PAG observadas na raça Azawak resultam do

uso de uma PAG purificada a partir da placenta de zebuínos ou a diferenças

inerentes à própria raça. Entretanto, a primeira hipótese parece menos

provável devido ao fato de que quando diferentes amostras plasmáticas

foram dosadas em ambos os sistemas taurino e zebuíno, nenhuma diferença

foi observada nas concentrações de PAG.

As concentrações de PAG observadas no período próximo ao parto

foram inferiores em fêmeas zebuínas (1.095 ng/ml) do que o observado

previamente por ZOLI et al. (1992a) e PATEL et al. (1997) em fêmeas de

raças taurinas (1.352,8 a 2.462,4 ng/ml). Essas concentrações de PAG

aparentemente mais baixas em zebuínos podem ser devidas a diversos

151

fatores, dentre os quais podemos citar o fluxo sangüíneo placentário e a

massa da placenta. Existem poucas informações sobre o efeito do fluxo

sangüíneo placentário sobre as concentrações de hormônios e/ou proteínas

de origem placentária (NEWNHAM et al., 1986). Entretanto, devido ao

fato de que os fluxos sangüíneos uterino e placentário parecem ser menores

em raças zebuínas do que em raças taurinas (FERREL, 1991), esta hipótese

deve ser levada em consideração como uma das possíveis causas dos níveis

inferiores de PAG observados no presente estudo.

Diversos autores reportaram o efeito da massa placentária sobre as

concentrações de PAG (DOBSON et al., 1993; MIALON et al., 1993;

PATEL et al., 1997). Conforme descrito por MIALON et al. (1993),

próximo ao parto, as concentrações de PSP-60 são significativamente

inferiores em raças taurinas que portam bezerros de menor porte (ex.: raça

Holandesa e Normanda) do que naquelas que portam bezerros maiores (ex.:

raça Charolesa). Segundo esses autores, estas diferenças de concentração

são provavelmente devidas à diferenças de massa placentária, o que

refletiria indiretamente o número total de células binucleadas produtoras de

hormônios e proteínas placentárias. No presente estudo, a massa placentária

e o peso dos bezerros não puderem ser obtidos logo após o parto.

Entretanto, devido ao fato de que vacas Azawak possuem pesos médios

situados entre 300 e 410 kg (PAYNE, 1970), pode-se supor que a massa

placentária nesta raça seria inferior àquela estipulada para raças taurinas,

explicando parcialmente os menores níveis plasmáticos de PAG

observados ao final da gestação.

No que diz respeito ao período pós-parto, o período estimado para que

as concentrações plasmáticas de PAG se tornem inferiores ao limite

152

mínimo de detecção do sistema RIA-PI (< 0,2 ng/ml) foi de

aproximadamente 14 semanas. Este período foi comparável aos períodos

estimados por ZOLI et al. (1992a) e por MIALON et al. (1993) em raças

taurinas (11 a 17 semanas), sendo entretanto, bastante superior ao tempo

estimado por KIRAKOFE et al. (1993) em raças taurinas de corte

histerectomizadas (10 semanas) ou não (12 semanas).

O tempo relativamente longo necessário para que sejam alcançados

níveis indetectáveis de PAG parece ser devido principalmente à longa

meia-vida desta glicoproteína. A meia vida da PAG calculada no presente

trabalho (9,2 a 10,1 dias) foi maior do que a previamente descrita em

taurinos (7,0 a 8,8 dias) (SASSER et al., 1986; SEMAMBO et al., 1992;

ALI et al., 1997). Uma vez que a meia-vida das glicoproteínas é

diretamente influenciada pela presença de cadeias laterais de carboidratos e

de ácido siálico (RAFFERTY et al., 1995), pode-se supor que um padrão

diferente de glicosilação poderia estar envolvido com as diferenças de

meia-vida observadas.

Durante o presente estudo, uma vaca zebu Azawak apresentou um

baixo escore de condição corporal (BCS 1 a 2) associado a altas

concentrações de PAG durante o final da gestação. Esta vaca foi fecundada

no início da estação de chuvas (Julho), parindo no final da estação seca

(Abril), momento no qual a vegetação da savana apresentava-se escassa e

de má qualidade. A associação entre uma grave carência protéica e/ou

energética e a massa placentária total já foram descritas tanto na espécie

humana (LUMEY, 1998) quanto na espécie ovina (WALLACE et al.,

1997b). Uma associação entre altos níveis energéticos na dieta, redução da

massa placentária e baixas concentrações de PSPB durante a gestação foi

153

recentemente descrita por WALLACE et al. (1997a) na espécie ovina. Estes

achados parecem indicar conjuntamente que, em alguns casos, um consumo

insuficiente de alimentos poderia estar associado com um aumento

compensatório da massa placentária com o objetivo de que seja assegurado

suporte nutricional necessário ao desenvolvimento do feto. Um outro fator

que poderia contribuir para as altas concentrações de PAG observadas ao

final da gestação da vaca ZSand seria uma reduzida taxa de clearance desta

proteína na circulação materna. Entretanto, devido ao fato de que a meia-vida

da PAG foi menor neste animal (9,2 dias) do que nos demais (10,1 dias), esta

explicação parece improvável.

154

6. CONCLUSÃO

− Diferentes formas de PAG, com massas moleculares variando de 51 a

69 kDa e pontos isoelétricos variando de 3,1 a 6,7 podem ser

identificadas na placenta de zebuínos pelo uso de técnicas como

cromatografia de troca de íons ou cromatografia de afinidade,

associadas ao uso das técnicas de eletroforese monodimensional (1-D

SDS PAGE), eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE) e de

Western Blot.

− O microsequenciamento da extremidade N-terminal de diversas

proteínas identificadas na placenta de zebuínos (10 a 25 aminoácidos)

revelou a existência de uma única seqüência de PAG, a qual é idêntica à

seqüência previamente descrita no taxa Bos taurus.

− Além da PAG, outras proteínas imunoreativas à PAG podem ser

identificadas na placenta de zebuínos. Dentre estas, podem ser citadas

alfa-N-acetilgalactosaminidases e metaloproteinases alcalinas.

− As concentrações plasmáticas de PAG em gado zebu aumentam

lentamente até a 39a semana de gestação, permanecendo inferiores a 250

ng/ml. Uma semana antes do parto, elas aumentam significativamente,

ultrapassando 1.000 ng/ml.

155

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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200

ANEXOS

201

ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)

1. Reagentes

- Tubos de poliestireno de dimensões 13 x 70 mm;

- Reagentes de qualidade analítica.

1.1. Tampão utilizado

1.1.1. Tampão Tris (solução estoque)

3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano, C4H11NO3 (Merck)

2,0 g de Cloreto de magnésio, MgCl2 (Merck)

0,1 g de Nitrato de sódio, NaN3 (Vel)

- Todos os reagentes são misturados em 800 ml de H2O deionizada.

- Após dissolução completa dos reagentes, o pH da solução é ajustado à

7,5 com o uso de HCl 1,0 N (Merck).

- Uma vez ajustado o pH, o volume da solução é completado a 1.000 ml,

e a solução pode ser armazenada a 4°C.

1.1.2. Tampão Tris-BSA (solução pronta para uso)

- Antes de iniciar-se uma dosagem radioimunológica, é adicionada 1 g de

BSA (ICN Biochemicals) por litro de solução estoque de Tris, sendo

este tampão conservado a 4°C.

1.2. Antígeno frio ou não marcado (Ag°)

- A PAG purificada e liofilizada é dissolvida em tampão fosfato 0,5 M

(pH 7,5) na proporção de 10 µg/100 ml, sendo feitas alíquotas de 1

202

ml/tubo. Essa solução estoque contitui-se no primeiro ponto de diluição

da curva padrão no sistema de dosagem sem pré-incubação (SPI), ou

seja, corresponde ao ponto 100 ng/ml. A partir deste ponto, são feitas

diluições na proporção de 500 µl da diluição precedente + 500 µl de

tampão, da maneira a obter-se os seguintes pontos de diluição:

Sistema radioimunológico

Sem pré-incubação (SPI) Com pré-incubação (PI)

Diluição 1 → 100 ng/ml Diluição 1 → 25 ng/ml

Diluição 2 → 50 ng/ml Diluição 2 → 12,5 ng/ml

Diluição 3 → 25 ng/ml Diluição 3 → 6,25 ng/ml

Diluição 4 → 12,5 ng/ml Diluição 4 → 3,13 ng/ml





1.3. Antígeno quente ou marcado (Ag* ou 125I-PAG)

- A PAG utilizada no presente trabalho foi marcada pela técnica da

Cloramina T (GREENWOOD et al., 1963). Resumidamente, em um tubo

de poliestireno (8 x 40 mm) contendo 10 µg de PAG liofilizada diluída

em 10 µg de tampão fosfato 0,5 M (pH 7,5), são adicionados 10 µl de 125I-

Na (correspondente a 1 mCu; Pharmacia) e 10 µl de uma solução de

Cloramina T (Sigma) diluída a 1 mg/ml em H2O destilada. O tubo é

agitado durante 50 a 60 segundos, sendo adicionados logo em seguida

10 µl de uma solução de 30 mg/ml de metabisulfito de sódio (Sigma)

203

diluído em de H2O destilada.

- Após uma última agitação, a solução é depositada sobre uma coluna de

Sephadex G-75 (1 x 35 cm; Pharmacia) previamente equilibrada com

tampão Tris-HCl contendo 1 % de BSA. A coluna é lavada com 30 ml

do mesmo tampão, sendo coletadas frações de 1 ml cada.

- Para a escolha da fração radioativa a ser utilizada, 50 µl de cada fração

são diluidos em 950 µl de tampão de dosagens, sendo mensurada a

radioatividade de 50 µl de cada diluição.

- A fração radioativa apresentando a maior percentagem de B0/T

associada à menor radioatividade não específica (NSB) é diluída de

formas a obter-se entre 28.000 e 30.000 cpm/100 µl de Ag*.

1.4. Soro sem PAG

- O soro sem PAG (serum free ou SF) é obtido de novilhas impúberes,

por meio de punção da veia jugular. Uma vez coletado, o soro é deixado

em repouso por aproximadamente 12 horas, sendo em seguida separado

do coágulo sanguíneo, centrifugado e testado em RIA. Se

comprovadamente negativo em duas dosagens consecutivas de PAG, o

soro é alíquotado a 2,5 ml/tubo, sendo congelado e armazenado como

solução estoque.

1.5. Primeiro anticorpo

- Para a produção do primeiro anticorpo, utiliza-se o protocolo de

VAITUKAITIS et al. (1971) com algumas modificações.

- As frações liofilizadas de PAG são inicialmente diluídas em tampão

fosfato na proporção de 250 µg de proteína diluída para cada 500 µl de

204

tampão. Aproximadamente 500 µl de adjuvante completo de Freund

(GibCo BRL; Grand Island, NY, USA) são utilizados na primeira

imunização, sendo o mesmo substituído pelo adjuvante incompleto de

Freund (GibCo) a partir da segunda imunização.

- Ao total, são feitas 8 imunizações a intervalos de duas semanas. A

coleta de sangue é feita a intervalos regulares de 10 dias, sendo a

primeira coleta feita 30 dias após a primeira imunização.

- O soro sanguíneo (anti-soro) é obtido após a retração do coágulo

sanguíneo (por aproximadamente 12 horas), sendo centrifugado,

identificado e aliquotado na proporção de 1 ml/tubo.

- O nível de anticorpos de cada coleta é então mensurado por meio de

diluições seriadas do anti-soro, como mostrado a seguir:

100 µl de soro puro + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/10 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/100 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/1.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/10.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/100.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/1.000.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA

- A diluição ideal é considerada como aquela na qual são obtidos 30 % de

ligação entre o antígeno marcado e o anticorpo.

1.6. Segundo anticorpo

- Imunoglobulinas anti-IgG de coelhos, produzidas em ovinos são utilizadas

para precipitar o primeiro anti-soro, constituindo-se no segundo anti-soro.

O sistema de precipitação pelo uso do segundo anti-soro é composto por

205

uma mistura de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho (0,83 %

volume/volume), de soro normal de coelho (0,17 % volume/volume), de

polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel), de celulose microcristalina (0,05

mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals) diluídos em

tampão Tris-HCl, pH 7.5.

2. Metodologia

- Todos os tubos são dosados em duplicata.

- As incubações são feitas à temperatura ambiente (20°C).

2.1. Sistema sem pré-incubação

- No primeiro dia da dosagem RIA-SPI, são adicionados 100 µl de

tampão Tris-BSA a todos os tubos da curva padrão ou aos tubos

correspondentes às amostras a serem dosadas, assim como 200 µl de

tampão ao tubo ‘zero PAG’ (B0) e 300 µl ao tubo NSB (atividade não-

específica).

- Em seguida, são adicionados 100 µl de cada ponto de diluição da curva

padrão e 100 µl de amostra a ser dosada. No caso de dosagens de

amostras sanguíneas, são adicionados 100 µl de soro testado sem PAG

(SF) a todos os pontos de diluição da curva padrão. No caso de

dosagens de amostras resultantes de protocolos de purificação, esses

100 µl são substituídos por 100 µl de tampão.

- Em seguida, são adicionados a todos os tubos 100 µl de Ag* contendo

28.000 a 30.000 cpm.

- Por fim, são adicionados 100 µl de anti-soro diluídos de forma a obter-

se 25 a 30 % de ligação entre o Ag* e o anti-soro (B0/T).

206

- Uma vez adicionados todos os reagentes (conferir tabela abaixo), os

tubos são agitados no vortex e deixados em repouso durante

aproximadamente 16 horas.

Tubos Reagentes Atividade

total (Tc) Atividade não-

específica (NSB)

Amostra padrão sem Ag° (B0)

Ponto de diluição da curva padrão

(STD)

Amostra a ser dosada

(UKN)

Tampão - 300 µl 200 µl 100 µl 100 µl

Ag° - - - 100 µl 100 µl

Soro sem PAG(a) - 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Anti-soro - - 100 µl 100 µl 100 µl

Ag* (b) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Total 100 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl (a)Substituído por 100 µl de tampão no caso de dosagens ao longo dos protocolos de purificação de proteínas. (b)Adicionado no segundo dia no caso de dosagens com pré-incubação

- No dia seguinte, são adicionados a todos os tubos (exceto Tc) 1 ml do

sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. Após uma

incubação adicional de 30 minutos, são adicionados 2 ml de tampão

Tris-BSA por tubo, sendo as frações de Ag° e Ag* separadas por meio

de centrifugação a 1.500 g durante 20 minutos. O sobrenadante é então

aspirado, e uma segunda lavagem e centrifugação são feitas. Após a

aspiração do segundo sobrenadante, é feita a contagem da

radioatividade do precipitado por meio de um contador de

radioatividade gama (Multigamma Counter LKB Wallac 1261; Turku,

Finlândia).

207

2.2. Sistema com pré-incubação

- No primeiro dia da dosagem RIA-PI, com exceção do Ag*, são

adicionados todos os reagentes previamente detalhados no sistema SPI.

- No segundo dia, após aproximadamente 16 horas de pré-incubação, são

adicionados 100 µl de Ag* a todos os tubos. Uma segunda incubação

com duração mínima de 4 horas é então realizada antes da adição de 1

ml do sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. O restante

do procedimento é similar ao descrito previamente para o sistema sem

pré-incubação.

208

ANEXO B - Método LOWRY para a dosagem de proteínas

1. Reagentes

- Solução A: Solução de 0,1 N de NaOH contendo 2 % de Na2CO3

(Merck).

- Solução B: Solução de Tartrato de Sódio (Merck) a 1 %.

- Solução C: Adicionar 50 mg de Sulfato de Cobre (CuSO4; Sigma) à

10 ml da Solução B. Preparar imediatamente antes do uso.

- Solução D: Solução final para a dosagem de proteínas: 50 ml da

Solução A + 1 ml da solução B.

- Reagente de Folin-Ciocalteu (Merck).

- Solução padrão de 1 mg de BSA/ml de H2O destilada.

2. Metodologia

A estimativa da concentração de proteínas presentes nas frações

obtidas ao longo do processo de purificação da PAG foi feita pelo método

de LOWRY et al. (1951).

- Curva padrão: preparar em duplicata as seguintes diluições:

1/1 = 1000 µg de BSA/ml

1/2 = 500 µg de BSA/ml



- B0: preparar em quadruplicata os tubos considerados como ‘zero BSA’

da curva padrão.

- Amostras: diluir as amostras a serem dosadas de acordo com a

quantidade estimada de proteína (ex.: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8,

1/16, 1/32).

209

- Adicionar em cada tubo:

- 200 µl de cada diluição da curva padrão ou da amostra a ser dosada.

- Nos pontos zero da curva padrão (pontos B0) devem ser adicionados

200 µl de H2O destilada ou do tampão nos quais as amostras

encontram-se diluídas.

- 200 µl de H2O destilada.

- 2 ml da solução D.

- Agitar no vortex e deixar incubar durante 10 minutos.

- Adicionar 200 µl de Folin.

- Vortexar e deixar incubar a abrigo da luz durante 30 minutos.

- Ler em cuvetas de vidro a 550 nm de densidade óptica ou em cuvetas de

quartz a 260 ou 280 nm de densidade óptica.

210

ANEXO C - Eletroforese monodimendional em gel de poliacrilamida

em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D PAGE

SDS)

1. Reagentes

1.1. Preparação das soluções estoque

- Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) (Conservar a 4°C)

6,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano (Pharmacia)

60,0 ml de H2O destilada

Ajustar a pH 6,8 com HCl (Merck) e após ajustar o volume a 100 ml

com H2O destilada.

- Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) (Conservar a 4°C)

27,23 g de Tris

80 ml de H2O destilada

Ajustar a pH 8,8 com HCl e após ajustar o volume a 150 ml com H2O

destilada.

- Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Merck) (Conservar a T°

ambiente.)

20,0 g de SDS (Merck)

200,0 ml de H2O destilada.

- Solução de acrilamida (30 %T, 2.67 % C) (Conservar a 4°C)

29,2 g de acrilamida (Pharmacia)

0,8 g de Metileno-bisacrilamida (Pharmacia)

Ajustar a 100 ml com H2O destilada.

211

- Solução azul de bromofenol a 0,8 % (Conservar a T° ambiente)

32,0 mg de azul de bromofenol (Bromophenol blue; Sigma)


- Solução de Laemmli (Conservar a –20°C)

1,0 ml de tampão Tris 0,5 M (pH 6,8)

0,8 ml de glicerol

2,0 ml de solução de SDS a 10 %

0,4 ml de mercaptoetanol (Sigma)*

0,4 ml de azul de bromofenol a 0,8 %


*Substituir por 0,4 ml de H2O destilada quando não for necessária a ação

do agente redutor mercaptoetanol.

- Tampão de eletroforese (10 vezes concentrado) (Conservar a 4°C)

60,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano

288,0 g de glicina

20,0 g de SDS

1.000 ml de H2O destilada

Agitar e ajustar a 2.000 ml com H2O destilada.

Antes do uso, diluir 200 ml de tampão em 1.800 ml de H2O destilada.

- Solução descolorante para azul de Coomassie (T° ambiente)

100,0 ml de ácido acético

400,0 ml de metanol


212

- Colorante azul de Coomasie (Conservar a T° ambiente)

250,0 ml de metanol (Merck)

1,0 g de Azul de Coomassie (Merck)

39,0 ml de ácido acético (Merck)


1.2. Preparação dos géis

- Gel de agarose

500,0 mg de agarose (Bio-Rad)

50,0 ml de H2O deionizada

- Gel de separação a 12 %

Reagente Quantidade/volume H2O destilada 16,75 ml Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) 12,5 ml Solução de SDS a 10 % 500 µl Acrilamida (30 % T, 2.67 % C) 20 ml Persulfato* a 12,5 % 250 µl Temed 25 µl Volume total 50 ml

Preparar imediatamente antes do uso. *Produto Pharmacia

- Gel de compressão

Reagente Quantidade/volume H2O destilada 6,1 ml Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) 2,5 ml Solução de SDS a 10 % 100 µl Acrilamida (30 % T, 2.67 % C) 1,3 ml Persulfato 12,5 % 100 µl Temed 20 µl Volume total 10 ml

Preparar imediatamente antes do uso.

213

2. Metodologia

- Os dois primeiros géis (gel de agarose e gel de separação) são

preparados no mesmo dia sendo versados entre as duas paredes da cuva

em um sistema de eletroforese vertical.

- No segundo dia, após a polimerização do terceiro gel (gel de

compressão), as pistas a serem utilizadas são identificadas, sendo

adicionado logo em seguida o tampão de eletroforese.

- Em cada pista, são depositados 6 µl de proteínas de calibração ou 20 a

30 µl de proteínas a serem analisadas, segundo protocolo pré-

estabelecido.

- Uma vez conectadas ao sistema de resfriamento, as cuvas são

inicialmente submetidas a uma amperagem de 20 mA (migração no gel

de compressão) e em seguida a uma amperagem de 40 mA (migração do

gel de separação).

- Após o final da migração, o gel poder ser corado pelo Azul de

Coomassie (mínimo de 1 hora) e descolorado (mínimo de 4 horas), para

a visualização de proteínas, ou utilizado para a realização da técnica de

Western Blot, a qual permite a visualização de proteínas imuno-reativas

pelo uso de diferentes anti-soros.

214

ANEXO D – Técnica de Western Blot

1. Reagentes

1.1. Soluções estoque

- TBS a 0 % de BSA (Conservar a 4°C)


45,0 g de NaCl

Ajustar a 5.000 ml com H2O destilada

- Ajustar o pH a 7,6 com o uso de HCl antes da adição do NaCl.

- Conservar a 4°C.

- TBS contendo 1 % de BSA (solução de lavagem)

Adicionar 10,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a

4°C).

- TBS contendo 3 % de BSA (solução de saturação)

Adicionar 30,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a

4°C).

- Tampão anodo (Conservar a 4°C)


14,0 g de glicina


Agitar e ajustar a 900 ml com H2O destilada.

100,0 ml de metanol

215

- Tampão catodo (Conservar a 4°C)


14,0 g de glicina

1,0 g de SDS

Agitar e ajustar a 1.000 ml com H2O destilada.

- Preparação do primeiro anti-soro

200 µl de anti-soro puro

15,0 ml de TBS contendo 1 % de BSA

4,8 ml de soro normal sem PAG (SF)

- Preparação do segundo anti-soro

50 µl de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à

peroxidase (POD-HR; Merck)

100 ml de TBS contendo 1 % de BSA

- Solução corante Rouge Ponceau

0,2 g de Rouge Ponceau S (Sigma)

10 ml de ácido acético

190 ml de H2O2 destilada

- Soluções de revelação (a serem preparadas imediatamente antes do uso)

Solution A (Mantida a 4°C)

100 ml de TBS a 0 % BSA

100 µl de H2O2 (Sigma)

216

Solution B (Mantida a 4°C)

20 ml de Metanol

60 mg de Cloronaftol

2. Metodologia

2.1. Transferência das proteínas sobre membrana de nitrocelulose

- Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia) são

embebidas em tampão catodo durante um mínimo de 30 minutos.

- Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia), assim como

uma membrana de nitrocelulose, são embebidas em tampão anodo

durante um mínimo de 30 minutos.

- Após o final da migração da 1-D SDS-PAGE (conferir Anexo C), os

papeis eletrodo, assim como a membrana de celulose e o gel, são

colocados delicadamente entre as duas placas do aparelho de

transferência Multiphor II (Pharmacia), conforme indicado na figura a

seguir:

Eletrodo (-) Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo

Gel Membrana de nitrocelulose

Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo Eletrodo (+)

- A transferência das proteínas sobre a membrana de nitrocelulose é feita

pela aplicação de uma tensão elétrica de 24 volts durante 1 hora seguida

de 36 volts durante 16 horas.

- Após o final da transferência, a membrana é corada durante 10 minutos

com a solução de Rouge Ponceau S. As bandas correspondentes à cada

217

proteína são marcadas com o auxílio de um objeto perfurante.

2.2. Revelação das protéinas imunoreativas

- A membrana de nitrocelulose é inicialmente incubada (sob agitação) em

uma solução de TBS contendo 3 % de BSA (a 37°C).

- Em seguida, é feita uma incubação durante 3 horas em 20 ml de anti-

soro saturado (a 37°C, sob agitação).

- A membrana de nitrocelulose é lavada por 3 banhos de TBS contendo 1

% de BSA (10 minutos cada, a 37°C).

- Uma segunda incubação de 2 horas é feita com o segundo anti-soro

(imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à peroxidase) (a

37°C, sob agitação).

- Finalmente, 4 lavagens (10 minutos, a 20°C) são feitas com TBS sem

BSA.

- A proteínas imuno-reativas contidas na membrana são reveladas pelo

uso das Soluções A e B, as quais são misturadas imediatamente antes da

revelação.

218

ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D PAGE-

SDS)

1. Soluções estoque

- Tampão de reidratação dos strips contendo o gel de isofocalização

9,9 g de uréia (Pharmacia)

3,8 g de tio-uréia (Pharmacia)

125 µl de triton X 100 (Pharmacia)

500 µl de tampão IPG 3-10 (Bio-Rad)


Alguns grânulos de bromofenol

- Agitar e ajustar a 25 ml com H2O destilada

- Adicionar 2,8 mg de DTT/ml de solução imediatamente antes do uso.

- Assim como o DTT, as amostras de proteína devem ser adicionadas

imediatamente antes do uso. Para um strip de 11 cm com uma gama de

pH variando de 3 a 10 é recomendado um volume final (amostra +

tampão de reidratação) de 200 µl.

- Conservar a –20°C.

- Tampão de lavagem dos strips após a isofocalização:

26,8 ml de tampão Tris 1,5 M (pH 8,8)

288,3 g de uréia

276,0 ml de glicerol (Merck)

16,0 g de SDS



219

- Agitar e ajustar a 800 ml com H2O destilada

- Adicionar 100,0 mg de DTT/10 ml de solução imediatamente antes do

uso.

- Conservar a –20°C.

- Solução de seladora de agarose


50 ml de tampão de eletroforese (10 x concentrado)

2,5 g de agarose


- Esquentar sob agitação após a adição de todos os ingredientes e estocar

em alíquotas de 30 ml.

- Conservar a T° ambiente.

- Corante para PVDF (Conservar a T° ambiente)

2 g de Azul de Coomassie

100 ml de Metanol


Alguns grânulos de DTT

- Solução descolorante para PVDF (Conservar a T° ambiente)

600 ml de Metanol


Alguns grânulos de DTT

2. Metodologia

- A primeira dimensão é feita em Immobiline Drystrips de 11 cm com pH

220

variando de 3 a 10 (Pharmacia) ou de 3 a 6 (Bio-Rad), sendo seguida

por uma SDS-PAGE a 12 %, conforme descrito no Anexo C.

- A hidratação dos strips é feita durante 16 horas em um Immobiline

DryStrip Reswelling Tray (Pharmacia), sendo a mesma seguida pela

eletro-focalisação das proteínas.

- A eletro-focalisação (separação das proteínas de acordo com o ponto

isoelétrico) é feita pela aplicação de uma corrente de 300 V por 30

minutos, de 1.000 V por 30 minutos, de 1.550 V por 16 horas e de 1.850

V por 1 hora em um aparelho Flat Bed (FBE-3000, Pharmacia).

- A fim de evitar-se a oxidação das proteínas transferidas, são adicionadas

pequenas quantidades de DTT em todos os tampões.

- Após a eletro-focalização, aplica-se o strip sobre o gel de separação de

uma eletroforese monodimensional clássica, obtendo-se desta forma a

separação das proteínas de acordo com sua massa molecular.

- A preparação dos papéis eletrodo para a transferência das proteínas

sobre a membrana de 0,2 µm de polivinilideno difluoridro (PVDF; Bio-

Rad, Richmond, CA) é semelhante à preparação descrita na técnica de

Western blot (Anexo C). Entretanto, devido à natureza hidrófoba da

membrana PVDF, faz-se necessária a utilização de um banho de

metanol antes que a mesma seja embebida no tampão anodo. A

disposição dos papéis eletrodo, do gel e da membrana são mostradas a

seguir:

221

Eletrodo (-) Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo + DTT

Gel Membrana de PVDF

Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo + DTT Eletrodo (+)

- A transferência das proteínas sobre a membrana de PVDF é feita pela

aplicação de uma tensão elétrica de 12 volts durante 45 minutos seguida

de 36 volts durante igualmente 45 minutos.

- Após o final da migração, a membrana é lavada 3 vezes em H2O

destilada contendo DTT, corada durante 15 minutos com a solução

corante para PVDF, descolorada durante 30 minutos, e finalmente

lavada 2 vezes com H2O destilada sem DTT.

Por fim, cada membrana é secada pelo uso de gás nitrogênio sendo

identificada e enviada ao microsequenciamento de proteínas.

222

Apêndice 1

SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001) Placental Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and zootechnical aspects. In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.), Biotechnology in Animal Husbandry, Ed. Kluwer Academic Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208.

223

Placental Proteins in Ruminants.

Biochemical, physiological and zootechnical aspects

SOUSA, N.M1., FIGUEIREDO, J.R.1 & BECKERS, J.-F.2

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil 2Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of

Liège, Belgium

Abstract

During the last decade, investigations were carried out by several

research groups in order to characterize proteins or glycoproteins

synthesized in the ruminant placenta. Recently, as results of this research, a

large family of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) was

discovered. Using molecular biology techniques, they were found to be

members of the superfamily of the aspartic proteinases which also contains

pepsinogen, chymosin, renin, beta-secretase, cathepsin D and E etc.

Synthesized in the mono and/or binucleate cells of the trophoblast, some

forms of PAG seem lacking of proteinase activity. It is likely they are

synthesized together with molecules involved in the tissue remodeling of

the placenta. Their release in large quantities into the maternal blood

circulation results in measurable plasma concentrations.

Thanks to international collaborative studies, we have shown that

PAG levels are a good indicator of feto-placental weel-being and that sharp

224

decreases in PAG levels occur just before pregnancy failure in cows and in

goats. In some countries, the PAG assay is available for Doctors in

Veterinary Medicine in the regional laboratories responsible for animal

health including immunodiagnosis for brucellosis, IBR, BVD, CAEV,

VISNA-MEDI etc.

1. Introduction

Placenta is a polyvalent organic system with a vital biological role for

the perpetuation of the eutherian mammals. Fetal development is related to

that of the placenta from the anatomical, genetic and metabolic points of

view. As far as metabolism is concerned, endocrine function is particularly

important. The endocrine function of the mammalian placenta includes

various hormones: progesterone, oestrogens, chorionic gonadotropins,

placental lactogens, also designed “chorionic somatomammotropins”,

prolactins, growth hormones and a series of growth factors, proteins and

glycoproteins interfering with the establishment of pregnancy, corpus

luteum maintenance, immunotolerance of the conceptus by the mother,

intermediate maternal metabolism, fetal growth and mammary growth.

The study of the endocrine function of the ruminant placenta will be

discussed below. Emphasis will be given to pregnancy-associated (specific)

proteins, but information related to other polypeptide hormones will be

freely utilized in order to develop our comparative understanding of the

structure, function and release in maternal circulation of the placental

proteins.

225

2. The Placenta

The placenta plays an essential role in both establishment and

maintenance of pregnancy as well as in fetal development, working as a

respiratory, nutritional, epurative, endocrine and immunological organ. The

placenta is not only barrier, as it was thought before, but it has a real active

and selective exchanger role which is developed in harmony with other

systems.

The topography and structure of the placenta vary according to the

species and depend on the behavior of the egg which, at the time of its

attachment, either remains in the uterine lumen or implants interstially in

the uterine mucosa.

Various classifications have been proposed though the most widely

used, despite some imperfections, is the classification based on the

histological structure, or, more precisely, the number of histological layers

separating the maternal and fetal blood. Four types of placenta may be

distinguished histologically: the epitheliochorial placenta (Equidae,

Suidae), the synepitheliochorial placenta (ruminants), the endotheliochorial

placenta (carnivores) and the haemochorial placenta (human, primates and

rodents).

The uterine connective tissue is modified in both endothelial and

haemochorial placentas and tearing of the uterine tissues accompanied by

bleeding occurs during parturition. The uterine regions shed in this way are

said to be deciduous and the species with these types of placenta are called

deciduates.

The mature ruminant placenta is neither entirely syndesmochorial with

226

no uterine epithelium, nor epitheliochorial with two apposed cell layers

whose the only anatomical interaction observed is the presence of

interdigitated microvilli. The uterine epithelium persists but is modified to

a variable degree into a hybrid fetomaternal syncytium formed by the

migration and fusion of the fetal chorionic binucleate cells with those of the

uterine epithelium (WOODING, 1992).

2.1. Binucleate cells

The most characteristic element of the ruminant placenta is the

presence of binucleate cells or diplokaryocytes in the trophectoderm

(WIMSATT, 1951). First described by ASSHETON in 1906, these cells

have been the subject of numerous investigations over the last 5 decades

(DRIEUX and THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING and

WATHES, 1980; KLISCH et al., 1999).

Binucleate cells derive from chorionic mononucleate cells by

karyokinesis without subsequent cytokinesis. The youngest cells are

located deep in the trophectoderm and maturation takes place progressively

as they rise to the maternal surface (WOODING, 1983).

Young binucleate cells have a small volume of dense ribosome-filled

cytoplasm, which, after cytoplasmic re-organization to a spherical or oval

cell, has no contact with either the basement membrane or the atypical

trophectodermal tight junction. As the binucleate cells increase in size it

develops an extensive array of rough endoplasmic reticulum and a large

Golgi body. The latter produces a considerable number of characteristic

granules that contain numerous protein and glycoprotein constituents

227

(WOODING, 1992).

The first binucleate cells appear just before implantation (WANGO et

al., 1990a). They can be recognized from day 14 after fertilization in the

ovine trophectoderm (WOODING, 1984) and from day 16-17 in the

bovine.

The binucleate cells represent 15-20% of the total population within

the mature placenta (WOODING, 1983; WANGO et al., 1990b). Of these,

about one in seven are migrating towards the uterine epithelium at any time

of gestation (WOODING et al., 1986). The migration of binucleate cells

plays an important role in the remodeling of placental structure and leads to

a reaction with the uterine cells: the formation of a hybrid fetomaternal

tissue in the ewe and goat (the syncytium plaques) and the maternal giant

cells in the cow (the trinucleate cells) (WOODING, 1984; WOODING and

BECKERS, 1987).

Trinucleate cells are short-lived structures, which, after exocitosis, are

resorbed by the trophectoderm (WOODING and WATHES, 1980).

Contrary to the ewe, in which binucleate cell migration is essential to

support the enormous growth in area of the fetomaternal interface layer as

the placentome develops (WOODING et al., 1981), in cow placentomes the

binucleate cell migration has no barrier or structural role (WOODING and

WATHES, 1980).

Special cells of the ruminant placenta were suspected as responsible

for an important endocrine function during gestation as early as 1940. In

this decade, it was observed for the fist time a reduction in the pituitary

gonadotropic activity in the pregnant cow and suggested that the corpus

228

luteum was replaced by additional luteotropic substances produced

elsewhere. Using microsections of cotyledons and staining for

carbohydrates like periodic acid-Schiff (PAS), WEETH and HERMAN

(1952) and BJÖRKMAN (1954) described the presence of numerous

trophoblastic cells containing glycoproteins. About 10 years later, FOOTE

and KAUSHIK (1963) demonstrated the presence of a LH-like activity in

the cotyledons. They used the bioassay of PARLOW (1961) in order to

identify this LH-like activity. These studies were pioneers in this field: they

opened the way for further identification and characterization of placental

hormones and proteins in the ruminant species.

Binucleate cells are directly involved in the production of

progesterone (WANGO et al., 1991; WANGO et al., 1992; WOODING et

al., 1996), prostaglandins (REIMERS et al., 1985b), placental lactogen

hormones (VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) and

pregnancy-associated (specific) glycoproteins (REIMERS et al., 1985a;

GOGOLIN-EWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al.,

1992a; ATKINSON et al., 1993). These secretory products are stored in

dense granules which occupy more than 50% of the cytoplasm (LEE et al.,

1986) and deliver their content directly in the maternal system after

binucleate cell migration (WOODING, 1984).

3. Placental Proteins

Proteins secreted by the placenta, when detected in the peripheral

circulation of the mother, can be useful indicators of both pregnancy and

feto-trophoblast well-being. Despite many attempts to investigate the

229

physiological functions of the placental proteins, the exact biofunction of

most of them (e.g. pregnancy-associated glycoprotein) are still not known.

In ruminant species, interferon tau allows the maintenance of the

corpus luteum aging as an antiluteolytic factor (MARTAL et al., 1979). In

primates this role in corpus luteum maintenance is played by the chorionic

gonadotropin (ASCHHEIM, 1927). This glycoprotein acts as a

luteotropine-like hormone having also an important role in progesterone

synthesis stimulation. The interferon tau, in addition to its antiluteolytic

function also has an important role in the first steps of immunotolerance of

the conceptus by the mother (FILLION et al., 1991; MARTAL et al.,

1997).

Later in pregnancy placenta produces a placental lactogen hormone,

responsible for the stimulation of the mammogenic activity (FORSYTH,

1986). This hormone is also involved, at least partially, in the fetal growth

(CHENE et al., 1988) and in the long term changes of the maternal

metabolism (FREEMARK et al., 1992).

The main groups of polypeptide placental proteins and their relevant

aspects are discussed below.

3.1. Pregnancy-Associated Glycoproteins (PAGs)

Characterized in the last 20 years (BUTLER et al., 1982; BECKERS

et al., 1988a,b; ZOLI et al., 1991, XIE et al., 1991), the pregnancy-

associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of glycoproteins

expressed specifically in the outer epithelial cell layer

(chorion/trophectoderm) of the placenta of ungulate species

230

(GURUPRASAD et al., 1996; XIE et al., 1997b). They are members of the

aspartic proteinase gene family having greatest sequence identity with

pepsinogens (GREEN et al., 1998a).

By using biochemical procedures, some molecules of the PAG family

were isolated from cotyledons of cow (ZOLI et al., 1991), ewe (ZOLI et

al., 1995; XIE et al., 1997a) and goat (GARBAYO et al., 1998). These

molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed

the development of homologous and heterologous radioimmunoassay

systems (ZOLI et al., 1992b; RANILLA et al., 1994; GONZÁLEZ et al.,

1999).

In veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in

maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of

the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the

management of reproduction, while the second concerns more specifically

clinicians and researchers in their investigation to establish differential

diagnosis of pathologies affecting pregnancy (ZARROUK et al., 1999a,b).

Screening of placental libraries with nucleic acid probes has identified

additional cDNA that are very abundant and code for polypeptides related

but structurally (amino acid sequence) distinct from PAGs isolated by

biochemical procedures. Some of these molecules have sequences of amino

acids that are consistent with their being potentially functional proteinases

(ROBERTS et al., 1995). It remains to be determined whether the PAGs

expressed in the ungulate placenta are catalytically active and, even if they

are, whether their physiological function is that of proteinases.

231

3.1.1. Historical Overview of PAGs and Related Proteins Isolated by

Biochemical Procedures

The PAGs, also known under a variety of other names including

pregnancy-specific protein B (BUTLER et al., 1982; LYNCH et al., 1992)

and pregnancy-specific protein 60 (MIALON et al., 1993), were first

described as placental antigens of cattle placenta that were also present in

the blood serum of the mother soon after implantation.

The methodology employed for bovine PAG purification by ZOLI et

al. (1991) was similar to that previously described by BUTLER et al.

(1982). Briefly, an antiserum was first generated against placental extracts

from which antibodies against common maternal antigens had been

removed (or neutralized) by immunoadsorption. This reagent was then used

to follow the immunoreactive fractions throughout the isolation procedure

(a series of extractions of soluble proteins, acid and ammonium sulfate

precipitations, gel filtration and ion exchange chromatographies).

The cleared antisera obtained by Sasser and coworkers (BUTLER et

al., 1982) allowed the partial purification of two antigens; pregnancy-

specific protein A (PSP-A) and pregnancy-specific protein B (PSP-B).

PSP-A was identified as α-fetoprotein, which is not strictly limited to

pregnancy; PSP-B represented a novel antigen. Subsequent biochemical

analysis indicated that PSP-B probably represented a mixture of related

proteins since multiple molecular weight forms (47 000-90 000) and

isoeletric variants (pI 3.7-4.4) were reported (BUTLER et al., 1982).

Alternatively to the results obtained by BUTLER et al. (1982), the use

of antisera raised against specific antigens of fetal cotyledons by ZOLI et

232

al. (1991) resulted in the purification of one major placental protein: the

bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 (boPAG-1).

3.1.1.1. The bovine PAG family: after the isolation of ZOLI et al. (1991)

and the first characterization of XIE et al. (1991), different PAG molecules

were identified justifying an arbitrary numbered nomenclature adopted till

now.

3.1.1.1.1. boPAG-1: The bovine PAG (bPAG) purified by ZOLI et al.

(1991), later designed boPAG-1 (XIE et al., 1994; XIE et al., 1995), was

shown to be an acidic glycoprotein with 67 000 molecular weight. Four

isoforms (I, II, II and IV) with different isoeletric points (4.4, 4.6, 5.2 and

5.4) were detected in this initial preparation. The pI were closely related to

the amount of sialic acid of each isoform (2.12%; 0.83%, 0.64% and

0.29%, respectively). Moreover, pI, sialic acid content and

immunoreactivity were closely related, with the most basic form being the

most immunoreactive (ZOLI et al., 1991). Immunocytochemical

investigations allowed the localization of boPAG-1 predominantly in the

cytoplasm of large binucleate cells present in the fetal cotyledonary tissue

(ZOLI et al., 1992a). The presence of antigens immunologically similar to

boPAG-1 has also been demonstrated in testicular and ovarian extracts

(ZOLI et al., 1990b,c), justifying the adjective “associated” and not

“specific” given to this glycoprotein.

The most surprising feature of boPAG-1, revealed by Roberts and

coworkers soon after its purification (XIE et al., 1991), was the fact that

this protein belongs to a family of proteolytic enzymes known as aspartic

233

proteinases, with more than 50% amino acid sequence identity to pepsin,

cathepsin D and cathepsin E.

The boPAG-1 has the bilobed structure typical of all known

eukaryotic aspartic proteinases and possesses a cleft between the two lobes

capable of accommodating peptides up to 7 amino acid long (XIE et al.,

1997b). However, despite its structural similarity with other active aspartic

proteinases, this molecule is considered as catalytically inactive because of

key mutations close to the active site (Table 1) (XIE et al., 1991).

Catalytic activity of aspartic proteinases is dependent upon two

conserved aspartic acid residues (Asp) that are in close contiguity in the

center of the substract-binding cleft, even if they are localized in opposite

lobes of the molecule. Each of these residues is preceded by a hydrophobic

amino acid (usually phenylalanine - Phe) and followed by invariant

threonine (Thr) and glycine (Gly) (DAVIES, 1990). A twofold symmetry,

with a second conserved region centering around each aspartic acid is also

required to polarize the bound water molecule which hydrolyses the scissile

bond of the substract (JAMES and SIELECKI, 1986).

As demonstrated by XIE et al. (1991), the apparent lack of proteolytic

activity of boPAG-1 is due to the presence of an alanin (Ala-76) in place of

a normally invariant glycine (Gly-76) residue in the Phe-Asp-Thr-Gly-Ser-

Ser sequence (N-terminal lobe). This mutation has as consequence a subtle

change in the placement of the catalytic water molecule from its normal

symmetric position (DAVIES, 1990), rendering this protein catalytically

inactive.

234

TABLE 1 - Alignment at the active site residues found in a variety of aspartic proteinases. The open boxes denote amino acid substitutions. Data for aspartic proteinase sequences are obtained in the GenBank database.

Aspartic Proteinase

Specie Proteolytic Activity ?

NH2-terminus COOH-terminus

Pepsinogen A Monkey Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

Progastricsin Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

Pepsinogen F Rabbit Yes Leu Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser

Chymosin Bovine Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Leu Asp Thr Gly Thr Ser

Renin Rat Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser

Cathepsin D Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

Cathepsin E Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

Beta-secretase Human Yes Val Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr

boPAG-1 Bovine Probably no Phe Asp Thr Ala Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

boPAG-2 Bovine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ala Leu Asp Thr Gly Thr Ser

ovPAG-1 Ovine Probably no Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Gly Thr Gly Thr Ser

poPAG-1 Porcine Probably no Phe Asp Thr Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala

poPAG-2 Porcine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser

eqPAG-1 Equine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser

➡➡➡➡ PAG and PSPB radioimmunoassays

In practice, antisera raised in rabbits against pregnancy-associated

(specific) proteins have allowed the development of specific

radioimmunoassays for bovine PAG and PSP-B (SASSER et al., 1986;

HUMBLOT et al., 1988a,b; SASSER et al., 1989; ZOLI et al., 1992b).

Higher PAG concentrations are observed in maternal than in fetal serum,

suggesting that this glycoprotein is delivered preferentially in the maternal

235

system (ZOLI et al., 1992b).

PAG can be detected in maternal circulation at around the time when

the trophoblast forms definitive attachment to the uterine walls. In early

and mid gestation, concentrations increase slowly and gradually (Figure 1).

Around parturition concentrations increase rapidly to reach peak values of

1 to 5 µg/ml only few days before delivery (Figure 2) (ZOLI et al., 1992b;

PATEL et al., 1997). Concentrations decrease steadily in the postpartum

period reaching undetectable levels only by day 100 postpartum (ZOLI et

al., 1992b). Detectable levels of boPAG-1 have been also found in about

20% of unbred heifers and non-pregnant cows and 15% of bull sera (ZOLI

et al., 1992b). The relatively long time needed for boPAG-1 to be cleared

from maternal circulation can be explained by the very high concentrations

present in maternal blood at parturition and by a long half-life of this

glycoprotein, estimated to be 7.4 to 9 days (KIRACOFE et al., 1993; ALI

et al., 1997).

FIGURA 1 - PAG profiles (mean ± S.E.M) during early pregnancy in heifers embryo transferred with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations. Adapted from ECTORS et al. (1996a).

3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

5

10

15

20

25

30

35

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Weeks

0

5

10

15

20

25

30

35PAG (ng/ml)

236

FIGURA 2 - PAG profiles (mean ± S.E.M) in heifers embryo transferred with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations during the last 11 weeks before parturition. Adapted from ECTORS et al. (1996a).

PAG detection in serum or plasma samples is currently used as a

specific serological method for pregnancy diagnosis in cattle from days 28

(SZENCI et al., 1998a,b) to 30 (SASSER et al., 1986; HUMBLOT et al.,

1988a) after breeding.

Investigations realized in peripartum clearly demonstrated the positive

influence of both maternal environment and fetal genotype (sex and race)

on peripheral blood concentrations of boPAG-1. In fact, PAG

concentrations were found to be more elevated in maternal circulation of

the intra-species crossbreeds than in inter-species ones (GUILBAULT et

al., 1991). Moreover, ECTORS and coworkers (1996) showed that in

nuclear transfer programs, even if the majority of calves are of normal size,

some of them can present morphological abnormalities like edema of the

umbilical cord with placental hypertrophy, responsible for higher

concentrations of PAG in maternal blood. In the same way, abnormally

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 360

500

1000

1500

2000

2500

3000

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

Weeks bef ore parturition

0

500

1000

1500

2000

2500

3000PAG (ng/ml)

237

high PAG concentrations in maternal circulation can indicate the presence

of a abnormal amount of trophoblast tissues, as observed in hydatiform

molar pregnancy (Figures 3A and 3B) (ECTORS et al., 1996b).

After IVF or cloning, the PAG follow-up in plasma samples collected

weekly was able to monitor embryonic and fetal deaths (ECTORS et al.,

1996a). However, due to the large variations of PAG concentrations in

maternal blood, only a marked decrease (or disappearance) in plasma

concentrations of this protein can be a no controversial predictive sign of

embryonic or fetal death (SZENCI et al., 1999).

3.1.1.1.2. boPAG-2: in 1994, Xie et al. identified the poorly

characterized bovine chorionic gonadotropin isolated by BECKERS et al.

(1988a) as a new member of the aspartic proteinase family: the boPAG-2

(BECKERS et al., 1994).

The classification of the LH-like factor of the bovine placenta as a

proteinase was surprising but not the first observation on similarities

between placental hormones and proteinases. In fact, previous studies

developed by WILLEY and LEINDENBERGER (1989) had already

demonstrated a high analogy between primary sequences of human

chorionic gonadotropin (hCG) and the serine proteinase chymotrypsin. In

that study it was also observed that proteinaceous proteinase inhibitors like

soy bean trypsin (SBI) are capable to neutralize the agonistic activity of

hCG and to reduce the binding of hCG to its receptor and to its specific

antisera.

The boPAG-2 was characterized by XIE et al. (1994) as a polypeptide

238

of 372 amino acids long, structurally related to boPAG-1, ovPAG-1 and

pepsin (58%, 58% and 51% amino acid sequence identity, respectively).

Unlike boPAG-1, boPAG-2 has a catalytic center with the amino acid

consensus sequence of other active aspartic proteinases. However, it

remains unclear whether boPAG-2 has a proteolytic activity.

Expression of boPAG-2 mRNA is detected as early as 17-19 days of

pregnancy, coinciding with the beginning of implantation. Its mRNA is

expressed in fetal placenta but not in other fetal organs, and is localized in

both mononucleate and binucleate cells. Interestingly, boPAG-2 is

synthesized by placental explants as a 70 000 molecular weight isoform

that is processed to smaller molecules (XIE et al., 1996).

FIGURE 3 - A) Hydatiform molar pregnancy; B) Abnormally high PAG concentrations observed in hydatiform molar pregnancy (-▲-▲-) versus normal gestations (-×-×-). Adapted from ECTORS et al., 1996(a).

3.1.1.2. The ovine PAG family: the identification of antigen(s)

immunologically related to boPAG-1 (bPSP-B) in the peripheral circulation

A) B)

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

W eeks before pa rtu rition

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000PAG (ng/m l)

239

of pregnant ewes (RUDER et al., 1988) has led to the isolation and partial

purification of pregnancy-associated glycoproteins in ewes (ZOLI et al.,

1990a; ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).

3.1.1.2.1. ovPAG-1: The ovine PAG, later designated ovPAG-1, was

initially identified as a molecule close to the boPAG-1, containing 382

amino acids (XIE et al., 1991). Parallel to the cDNA characterization,

several attempts were developed in order to purify the ovine PAG starting

from fetal cotyledons. In comparison to bovine PAG, the ovine PAG was

more difficult to purify and only semi-purified preparations were made

available (ZOLI et al., 1990a, ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).

The ovPAG-1 showed multiple molecular weight isoforms (43 000-67 000)

with different pI ranging from 4.06 to 4.65 (WILLARD et al., 1995).

Molecular cloning studies have shown the ovPAG-1, like boPAG-1,

belongs to the aspartic proteinase family showing 73% amino acid

sequence identity with this protein (XIE et al., 1991). As observed for

boPAG-1, it seems that ovPAG-1 is a catalytically inactive form of aspartic

proteinase secreted by binucleate cells of the trophoblast (XIE et al., 1991).

In this case, the lack of enzymatic activity results from the mutation of the

catalytically essential aspartic acid within the C-terminal lobe (Asp-257) to

one glycine (Gly-257) (XIE et al., 1991). A comparable change in pepsin,

where the active site Asp-32 of the first lobe is replaced by alanine (a Asp-

32-Ala mutation) abolishes all activity, even though the molecule is still

capable of binding pepstatin A (a potent inhibitor of aspartic proteinases)

with high affinity (LIN et al., 1989).

Time-course studies of placental explants recently showed that

ovPAG-1 is first detectable as a precursor with high molecular weight (67

240

000-70 000), which is gradually processed to smaller products (XIE et al.,

1996). The basis of the variety of molecular weight forms remains to be

elucidated, but the differences seem likely to be due to some unusual form

of posttranslational modification introduced in the binucleate cells (XIE et

al., 1996; GREEN et al., 1998a).


The development of heterologous radioimmunoassays for ovPAG-1

and oPSP-B has allowed its detection in maternal blood 3 weeks

(WILLARD et al., 1995) to 4 weeks (RANILLA et al., 1994) after

breeding. The PAG-RIA is based on the utilization of boPAG-1 as tracer

and standard, and antisera raised in rabbits immunized against a preparation

of ovine PAGs (ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).

PAG profiles in pregnant ewes (Figure 4) (RANILLA et al., 1994;

RANILLA et al., 1997a; GAJEWSKI et al., 1999) appeared to be quite

different than those obtained in cattle (ZOLI et al., 1992b). In Churra and

Merino ewes, for example, after a first period of high concentrations

around day 60, the concentrations decrease until day 90 and increase again

to remain elevated and stable until parturition (RANILLA et al., 1994).

After parturition, the rate of decline in PAG concentrations is faster in

ewes (4 weeks) than in cows (about 14 weeks), with no correlation being

observed between this rate and the interval to first ovulation (RANILLA et

al., 1997b).

3.1.1.2.2. Others ovPAGs: an additional member of PAG family

(ovPAG-2) was isolated from cDNA library prepared from day 13 whole

conceptuses (NAGEL et al., 1993; GURUPRASAD et al., 1996). This

241

protein is expressed in both mononucleate and binucleate cells of the

placenta (NAGEL et al., 1993).

FIGURE 4 - PAG profiles during gestation and postpartum periods in Berrichon ewes. Adapted from GAJEWSKI et al., 1999.

Several other different PAGs have been recently purified from ovine

placental conditioned media by using a series of chromatography

precedures (XIE et al., 1997a). Amino-terminal sequencing of four of the

purified products revealed that three of them were novel and that each of

them had been processed by removal of the pro-peptide within what

appeared to be a consensus sequence between the pro-peptide and the

mature molecule. None of these purified molecules demonstrated any

enzymatic activity in a standard proteinase assay with denatured

haemoglobin (XIE et al., 1997a).

Another subset of PAGs was identified in extracts of sheep placenta

by ATKINSON et al. (1993) who used the monoclonal antibody against

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Weeks

0

100

200

300

400

500

600

700PAG (ng/ml)

Parturition

242

SBU-3 developed by GOGOLIN-EWENS et al. (1986). The three proteins

affinity-purified with the SBU-3 antibody had molecular weights of 57 000,

62 000 and 69 000, showing partial amino acid sequence homology to the

ovPAG-1, boPAG-1 and rabbit pepsinogen F (ATKINSON et al., 1993).

3.1.1.3. The caprine PAG family: three different PAGs were isolated and

partially characterized from goat placenta (GARBAYO et al., 1998). These

proteins differed in amino acid sequence and apparent molecular weight

(55 000, 59 000 and 62 000) showing several isoforms with different pI:

caPAG55 (pI: 5.3, 5.1, 4.9), caPAG59 (pI: 6.2, 5.9, 5.6) and caPAG62 (pI:

5.1, 4.8).

Caprine PAGs showed high sequence homology to each other (60% to

73% residues identical) and a high sequence identity (from 30% to 81%

between the first 27 amino acids sequenced) with proteins of the aspartic

proteinase family like boPAG-1, ovPAG-1, boPAG-2, SBU-3 and rabbit

pepsinogen F (GARBAYO et al., 1998).


The use of two semi-purified preparations (one containing the

caPAG55 and caPAG59 forms, and the other containing the caPAG55 and

caPAG62) allowed the development of an accurate system for pregnancy

diagnosis in goats (GONZÁLEZ et al., 1999). PAG concentrations are

significantly higher in pregnant than in non-pregnant females as early as 21

days after artificial insemination (GONZÁLEZ et al., 1999).

During gestation, PAG concentrations reach maximal levels in week

8, decrease between weeks 12 and 14 and remain relatively constant until

243

parturition (Figure 5) (FOLCH et al., 1993; GONZÁLEZ et al., 2000a).

After parturition, concentrations decrease rapidly reaching lower levels at

the 4th week postpartum (SOUSA et al., 1999).

FIGURE 5 - PAG profiles (mean ± S.E.M) during gestation and postpartum periods in Blanca-Celtiberica goats with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations. Adapted from Folch et al., 1993.

As observed in cattle (GUILBAULT et al., 1991; PATEL et al.,

1997), both number and genotype of fetus can influence PAG

concentrations over gestation. From days 21-24 and throughout gestation,

twin bearing goats have higher PAG (or PSP-B) concentrations than goats

bearing one fetus (HUMBLOT et al., 1990; SOUSA et al., 1999;

GONZÁLEZ et al., 2000a,b). PAG levels in maternal circulation of inter-

specific pregnancies (spanish ibex embryos transferred to domestic goats)

are also higher (about ten times) when compared to that found in normal

intra-specific gestations (FERNÁNDEZ-ARIAS et al., 1999).

Sequential measurement of PAG in goats also allows for the

determination of the onset of the disturbance of trophoblastic activity

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

Weeks

0

100

200

300

400

500PAG (ng/ml)

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 270

100

200

300

400

500

Parturition

244

associated with the death of a fetus (ZARROUK et al., 1999a,b). As

demonstrated by ZARROUK et al. (1999a), in goats carrying a single fetus,

PAG levels fall under the positive pregnancy threshold when the

trophoblast died, while in goats carrying 2 or 3 fetuses, analysis of the

profiles clearly shows marked drops in concentration that could indicate

placental distress at different times. Therefore, systematic application of

this test in herds with a high rate of pregnancy failure could help to

pinpoint phenomena which might be implicated in triggering these events.

3.1.2. Molecular Studies of New PAG Related Molecules

By cloning expressed genes from ovine and bovine placental cDNA

libraries, by Southern genomic blotting, by screening genomic libraries,

and by using PCR to amplify portions of PAG genes from genomic DNA,

it was recently estimated that cattle, sheep and most probably all ruminant

Artiodactyla possesses many, possibly 100 or more, PAG genes, many of

them being placentally expressed (XIE et al., 1997b; GREEN et al., 1998a;

GARBAYO et al., 1999; GREEN et al., 2000). New members of the PAG

family gene family have also been found to be expressed in the porcine

(BAUMBACH et al., 1988; BAUMBACH et al., 1990a; SZAFRANSKA

et al., 1995; DORÉ et al., 1996), equine (GREEN, et al., 1998b; GREEN et

al., 1999), carnivora (GAN et al., 1997) and zebra (GREEN et al., 1994;

GREEN et al., 1999) placentas, showing that PAGs are not restricted to

ruminant species.

The equine PAG (eqPAG-1) is expressed in the placenta of the horse

and zebra and secreted from cultured placental tissues as both a processed

245

(mature) and unprocessed (zymogen) form (GREEN et al., 1999). The

processed form is an active proteinase and may, therefore, be the horse

homologue of pepsinogen F (XIE et al., 1997b).

In porcine species, two different PAG cDNAs have been found: the

poPAG-1 and poPAG-2. They share 64% homology sequence to each

other, and about 50% amino acid sequence identity with the PAGs of

ruminants. Interestingly, poPAG-1 has amino acid substitutions within its

catalytic center that together were likely to render it enzymatically inactive,

whereas poPAG-1 retained sequences identical to pepsin in these regions

(SZAFRANSKA et al., 1995). They seem occupy an intermediate position

between the enzymatically functional aspartic proteinases and the PAGs

from cattle and sheep (XIE et al., 1997b).

3.1.3. Identification of Pregnancy-Associated (Specific) Proteins in Wild

Ruminants

Serologically similar antigens to PAG or PSP-B (Table 2) have been

found in maternal circulation of wild ruminants like mule deer (WOOD de

et al., 1986), white-tailed deer (WOOD et al., 1986; OSBORN et al.,

1996), mountain goats (HOUSTON et al., 1986), red deer (HAIGH et al.,

1988), musk-oxen (ROWELL et al., 1989), bison (HAIGH et al., 1991),

moose (HAIGH et al., 1993), sika deer (WILLARD et al., 1994a;

WILLARD et al., 1996), elk (WILLARD et al., 1994b), fallow deer

(WILLARD et al., 1994c; WILLARD et al., 1998; WILLARD et al., 1999)

and reindeer (RUSSEL et al., 1998; ROPSTAT et al., 1999).

246

TABLE 2 - Pregnancy-associated glycoproteins and related molecules belonging to the aspartic proteinases family.

Family Specie Detection in maternal blood or milk*

Proteic Biochemical Characterization

cDNA clonage

Bovidae

Bovine (Bos taurus)

SASSER et al., 1986,1989 HUMBLOT et al., 1988a,b ZOLI et al., 1992

BUTLER et al. 1982 ZOLI et al., 1991

XIE et al., 1991,1994

Ovine (Ovis aries)

RANILLA et al., 1994,1997a GAJEWSKI et al., 1999

ATKINSON et al., 1993 ZOLI et al., 1995 WILLARD et al., 1995 XIE et al., 1997a,b

XIE et al., 1991,1997b

Caprine (Capra hircus)

HUMBLOT et al., 1990 FOLCH et al., 1993 SOUSA et al., 1999 GONZALEZ et al., 2000a,b*

GARBAYO et al., 1998 GARBAYO et al., 1999

Spanish ibex (Capra pyrenaica)

FERNANDEZ-ARIAS et al., 1999

- -

Montain goat (Oreamnos americanus)

HOUSTON et al., 1986 - -

Musk oxen (Ovibus moschatus)

ROWELL et al., 1989 - -

Bison (Bison bison)

HAIGH et al., 1991 - -

Cervidae

Moose (Alces alces)

HAIGH et al., 1993 HUANG et al., 1999, 2000

-

Elk (Cervus elephus)

HAIGH et al., 1988 WILLARD et al., 1994b

HUANG et al., 1999, 2000

-

Mule deer (Odocoileus hemionus)

WOOD et al., 1986 - -

White-tailed deer (Odocoileus virginianus)

WOOD et al., 1986 OSBORN et al., 1996

- -

Sika deer (Cervus nippon)

WILLARD et al., 1994a - -

Fallow deer (Dama dama)

WILLARD et al., 1994c - -

Rein deer (Rangifer tarandus)

RUSSEL et al., 1998 ROPSTAT et al., 1999

- -

Equidae

Horse (Equus caballus)

- - GREEN et al., 1994, 1998b

Zebra (Equus zebra)

- - GAN et al., 1997 GREEN et al., 1998

Felidae Cat (Felis domestica)

- - GAN et al., 1997

Suidae

Pig (Sus scrofa)

- BAUMBACH et al., 1988 DORE et al., 1996

SZAFRANSKA et al., 1995

247

The recent isolation and characterization of new forms of pregnancy-

associated (specific) proteins from elk and moose placenta (HUANG et al.,

1999) allowed the development of a more specific radioimmunoassay to

quantify this protein in maternal serum of wild species (HUANG et al.,

2000).

3.2. Placental Lactogens (PL)

Placental lactogens (PL), also known as chorionic

somatomammotropins (CS), are proteinaceous hormones of placental

origin that share structural and functional homology to growth hormone

(GH) and prolactin (PRL).

The function of PL varies according the species. In general it has been

suggested that PL influences mammogenesis and lactogenesis (FORSYTH,

1986), ovarian (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998) and

placental steroidogenesis (DEAYTON et al., 1993), fetal growth (CHENE

et al., 1988) and that it alters the maternal metabolism to accommodate the

growth and development of the fetus (FREEMARK et al., 1992).

3.2.1. Human Placental Lactogen (hPL) or Human Chorionic

somatomammotropins (hCS) (see MARTAL and CÉDART, 1993

for review)

The human placental lactogen (hPL), later called human chorionic

somatomammotropin (hCS), is a non glycosylated single chain protein that

contains 191 amino acids and two intra disulfide bonds. Its molecular

weight is about 22 300, but polymeric forms with higher molecular weights

248

have also been described. hPL is secreted by the syncytiotrophoblast cells

of the placenta, however the mechanisms by which this hormone is

released in the maternal circulation have not been totally elucidated.

Quantitatively, hPL is one of the most important soluble proteins of

the human placenta, corresponding to approximately 10% of the total

proteins. Its production rate is very high varying between 0.3 and 1 g/day at

term. Human PL is detected in the placenta 5 to 10 days after implantation

and in peripheral blood 3 to 4 weeks later. The level increases in the

maternal serum as pregnancy progresses and the rate of secretion is related

to the placental weight. As the half-life of hPL is very short (10-30 min), its

assay gives an estimation of the placental activity at the time of collection.

Human PL is a regulator of lipids, carbohydrates and proteins

metabolism. It increases the general metabolism of the adipose tissue

provoking either lipolysis or lipogenesis depending on the circumstances.

In pregnant women, it acts as an insulin antagonist and may be responsible

for the diabetic acidosis observed during pregnancy.

3.2.2. Bovine Placental Lactogen (bPL) or Bovine Chorionic

Somatomammotropin (bCS)

Studies on placental lactogens hormones preceded those of PAG in

domestic ruminants. In bovine species, for example, the lactogenic activity

of cotyledons was first demonstrated by BUTTLE and FORSYTH in 1976

by use of a 5 day co-culture of mouse mammary tissue and cow

cotyledonary tissue at different stages of pregnancy. These authors

obtained a lactogenic substance with about 300 ng of equivalent bovine

249

PRL (bPRL). In parallel studies, starting from bovine placenta, several

research groups (BOLANDER and FELLOWS, 1976; BECKERS et al.,

1980) identified and purified a protein with a somatomammotropic activity.

The purified bPL exists in multiple isoforms (Mr 32 000 to 34 000)

with at least five isoeletric variants ranging from 4 to 6 (MURTHY et al.,

1982). Bovine PL shares 48 to 50% sequence homology with PRL and 26

to 28% with GH. However, by use of radioimmunoassay (BECKERS,

1983) it was demonstrated that there is no cross reaction between bPL, PRL

or GH.

Bovine PL is produced by chorionic binucleate cells (DUELLO et al.,

1985; MILOSAVLJENIC et al., 1989; KAPPES et al; 1992) which seem to

deliver their product to the maternal circulation by migrating to and fusing

with endometrial epithelium. It co-localizes in the same cells with other

proteins like SBU-3 antigen and boPAG-1 (WOODING, 1992). In contrast

to other placental lactogens, bPL is a glycoprotein containing both N-linked

and O-linked oligosaccharides (SHIMOMURA and BREMEL, 1988;

BYATT et al., 1990). This glycoproteic composition characteristic of

placental proteins like bPL, boPAG-1 and SBU-3 can result of a highly

developed posttranslational mechanism expressed in bovine giant

trophoblastic cells (GOGOLIN-EWENS et al., 1986).

Bovine PL is detectable in maternal circulation by the 4th month of

gestation, but its concentration remains lower than 1-2 ng/ml through

gestation. In the peripheral circulation of the fetus, bPL concentrations are

higher (about 5 to 25 ng/ml) and shows a decline with advancing

gestational age (BECKERS et al., 1982; BYATT et al., 1987). These ratios

of fetal and maternal bPL concentrations are quite different of those

250

observed for boPAG-1, despite the co-localization of both placental

proteins in the same cells.

In cattle, the mammary growth seems to be, at least partially,

controlled by hormones of placental origin like bPL. Both calf birth weight

and placental mass are positively correlated with milk production during

subsequent lactation (ERB et al., 1980; COLLIER et al., 1982).

Interestingly, endometrium, corpus luteum as well as maternal and

fetal liver contain mRNA encoding the bGH and bPRL receptors (bGHR

and bPRLR) (SCOTT et al., 1992). Specific binding sites for bPL, with

little affinity for bGH and bPRL, have also been identified in endometrium

(GALOSY et al., 1991; KESSLER et al., 1991).

Recent evidence (SCOTT et al., 1992) indicates that bPL competes

with equal affinity with bPRL for a recombinant bPRLR (rbPRLR).

Diversely, bPL seems to bind the bGHR in a 1:1 stoichiometry rather than

1:2 stoichiometry reported for bGH (STATEN et al., 1993).

It is possible that, in some adult tissues (e.g. liver and corpus luteum),

bPL may exert its actions through either the bGH or bPRL receptors. This

action was supposed to be exerted either by a heterodimer of bPRLR and

bGHR monomers, or through a heterodimer of either one monomer of the

bPRLR of bGHR and a unique receptor monomer (ANTHONY et al.,

1995).

3.2.3. Ovine Placental Lactogen (oPL) or Ovine Chorionic

Somatomammotropin (oCS)

Ovine placental lactogen (oPL) was studied and purified by

251

HANDWERGER et al. (1974), MARTAL and DJIANE (1975) and CHAN

et al. (1976). However, due to the fact that the amino terminal residue of

oPL was blocked, the full sequence of ovine PL was not elucidated until

quite recently (COLOSI et al., 1989; WARREN et al. 1990). Although the

primary structure of oPL and bPL are similar in 67%, oPL has a molecular

weight of 22 000 and no potential N-linked glycosylation sites (CHAN et

al., 1976). The degree of amino acid sequence homology between of oPL

and PRL is higher than that to GH (49% and 28%, respectively). So, it is

not surprising to observe that oPL can demonstrate a higher lactogenic than

somatogenic activity.

Binding sites for oPL have been identified in fetal ovine liver

approximately at day 70 of gestation and increase in number through

pregnancy to reach a peak 3 to 7 days before parturition (FREEMARK et

al., 1986). These sites are also found in maternal liver during gestation as

well as in neonatal liver for more than 1 week postpartum. FREEMARK

and coworkers (1990) demonstrated a decreased binding of oPL to fetal

liver during maternal fasting, and later (FREEMARK et al., 1992) they

suggest that oPL receptor may be either a variant or a shortened form of

somatotropin receptor.

In trophoblastic tissue oPL is detectable at day 16-17 of gestation

(Reddy and Watkins, 1978). In maternal blood, oPL can be detected at day

40 to 50 of gestation and peaks during the last trimester of pregnancy

(CHAN et al., 1978). These values are positively correlated to fetal

number, milk yield and placental mass. Ovine PL fetal concentrations

decline from mid gestation until 1 to 2 weeks before parturition. Although

fetal sera concentration and total fetal weight were not correlated (KAPPES

252

et al., 1992), the entry rate of oPL into fetal vasculature increases with

advancing gestation age (SCHOKNECHT et al., 1992).

Biological activities of oPL have been observed in ovarian

steroidogenesis, maternal intermediary metabolism, mammary and fetal

growth. ANTHONY et al. (1995) suggest that oPL acts through a

structurally distinct receptor within fetus, influencing the fetal production

of one or more insulin growth factors (IGFs) and playing an important role

in fetal growth regulation.

The factors that regulate secretion of oPL are still poorly understood

but it is clear that oPL is not regulated by the same way in the fetal and

maternal compartments, and nutritional factors seem to be involved

(BYATT et al., 1992). A better knowledge about PL hormones probably

will help to understand the metabolic way of trouble occurring in late

pregnancy, in postnatal development and milk production.

3.2.4. Caprine Placental Lactogen (cPL) or Caprine Chorionic

Somatomammotropin (cCS)

Caprine placental lactogen (cPL) was the first placental lactogen

described in ruminants (BUTTLE et al., 1972). Several studies described

the presence of prolactin-like and growth hormone-like activities in the

blood of pregnant goats and several research groups (BECKA et al., 1977;

NUGENT and HAYDEN, 1987) tried to purify this protein. Early nineties,

cPL has been purified to homogeneity (CURRIE et al., 1990).

Caprine PL has a molecular weight of 22 000 and an isoeletric point

of 8.35. Despite its purification, the primary amino acid sequence of cPL

253

was not determined. Based on the close phylogenic relationship between

caprine and ovine species, it is likely that oPL and cPL have a high

percentage of amino acid sequence similarity to each other. Also by

similarity, it seems that cPL, like oPL, is a non-glycosylated form of

placental lactogen (BYATT et al., 1992).

Caprine PL is detected from day 44 of pregnancy in jugular plasma

(CURRIE et al., 1990) and can be used as a late pregnancy diagnosis from

the day 60th (SARDAJANA et al., 1988). The level of cPL increases during

pregnancy. Maximal concentrations are observed from mid to late

pregnancy, followed by a gradual decline through the last week of gestation

(CARD et al., 1988). Caprine PL concentrations are undetectable as early

as 18 h postpartum (CURRIE et al., 1990). As observed for PAG, cPL

concentrations are higher in multiple than in single gestations (CURRIE et

al., 1990) and are directly related with the total weight of placentomes and

with the total fetal weight.

Placental lactogen seems to have a significant role in the control of

normal mammary development and function in goats. Milk yield is related

with the weekly mean of PL between week 11 and term (HAYDEN et al.,

1979). The increase in secretion of PL coincides with the onset of rapid

lobule alveolar development of the mammary gland.

3.3. Proteins Associated with the Embryonic Signal

In some species, even before implantation, the embryo produces some

“signals” which are recognized by the mother and induce an inhibition of

luteolysis and the transformation of a cyclic corpus luteum into a

254

pregnancy corpus luteum. Among these signals, it can be mentioned the

chorionic gonadotropin (CG), a luteotropic factor produced by the human

and equine placentas, and the interferon tau (IFNτ), the antiluteolytic factor

responsible for the rescue of the corpus luteum in ruminant species, and

probably, at least partially in porcine and equine species.

3.3.1. The Chorionic Gonadotropins (CG) (see LEYMARIE and

MARTAL, 1993 and DERIVAUX et al., 1988 for review)

Human and equine species have long been known to display a

placental gonadotropic activity. As early as 1927, ASCHHEIM reported the

presence of a gonadotropic factor in the urine of pregnant woman and

during the following year they based their famous method for the early

diagnosis of pregnancy on this finding (ASCHHEIM and ZONDEK,

1928a,b). Due to its properties, this gonadotropic factor was later called

human chorionic gonadotropin (hCG). Three years later, COLE and HART

(1930) showed the existence of a gonadotropic activity in the serum of

pregnant mares. This pregnant mare serum gonadotropin (PMSG), after a

better characterization, was called equine chorionic gonadotropin (eCG).

3.3.1.1. Human Chorionic Gonadotropin (hCG): the human chorionic

gonadotropin (hCG) is a glycoprotein with a molecular weight of 38 400

and isoeletric points varying from 3.8 to 5.1. In early gestation, the

synthesis of hCG increased in parallel with the trophoblastic activity.

The hCG is secreted by the trophoblast as soon as the blastocyst

leaves its zona pellucida. It is first found in the maternal blood from day 8-

255

12 after fertilization, to achieve maximal concentrations during the first

trimester of pregnancy. Afterwards, the levels decrease, but are still

detectable till parturition.

Structurally, the hCG is composed by two subunits: alpha and beta.

The alpha subunit comprises a peptide chain of 92 amino acids with 2

oligosaccharide chains attached at residues 52 and 78 (Asn-52 and Asn-78).

This alpha subunit is similar to the alpha subunits of human, ovine and

porcine LH. The beta hCG subunit is very similar to the beta subunit of

human LH. It comprises 145 amino acids long, of those, 115 identical to

the beta subunit of LH, with an additional fragment (30 amino acids) in the

carboxy terminal side. The beta subunit contains several additional

carbohydrate chains linked to the serines (Ser-118 or Ser-119 and Ser-131)

and to the asparagines (Asn-13 and Asn-30). Due to its high content in

sialic acid, the half life of hCG (about 8 hours) is much longer then that of

LH, estimated to be only 12 to 50 min. The biological activity of hCG is

rapidly abolished by hydrolysis with trypsin or chymotrypsin.

Human CG produces an effect on luteal cells of LH type which

involves the same receptors as the hypophyseal gonadotropin. However, its

action is more sustained since the hCG receptor complex is internalized 50

times more slowly than the LH receptor complex.

3.3.1.2. Equine Chorionic Gonadotropin (eCG): the equine chorionic

gonadotropin (eCG), also known as PMSG, is specific to the mare. It

represents the main luteotropic factor responsible for progesterone ovarian

secretion until the placenta becomes able to carry out this progestagens

256

secretion.

The eCG is synthesized by the endometrial cups which are composed

by typical trophoblastic cells with one or two nuclei. These cells release the

eCG only during the first trimester of pregnancy (between 45 and 130 days

of gestation). Initial eCG secretion coincides with the formation of the

secondary corpus luteum in the ovaries.

Equine CG is a glycoprotein with an apparent molecular weight

between 45 000 and 64 000. Like hCG, eCG is composed by subunits alpha

and beta. Its plasmatic half-life (about 6 days) is due to its high sialic acid

content (10 to 13.5%) and to the length of its carbohydrate chains. Contrary

to the hCG, eCG was not detected in urine of pregnant females.

The activity of this hormone presents analogies with that of the

hypophyseal gonadotropin FSH. It can be therefore used in hormonal

control programs when a FSH-like activity is required.

3.3.2. Interferon Tau (IFNτ)

In domestic ruminants, ovarian production of progesterone is required

for about 55 days in ewes, for at least 165-180 days in cattle

(ESTERGREEN et al., 1967) and till the end of pregnancy in goats. In

these species, rescue of the corpus luteum occurs before implantation

(around day 15 to 22 after fertilization) and appears to be initiated by the

release of a proteinaceous factor present in the pre-implantation conceptus.

This factor, initially called trophoblastin (MARTAL et al., 1979) or ovine

trophoblast protein-1 (GODKIN et al., 1984), was recently officially

designated as a distinct subclass of the interferon alpha (IFNα) family: the

257

IFN tau (IFNτ) (CHARPIGNY et al., 1988).

The first studies that demonstrated the presence of an antiluteolytic

factor produced by the conceptus were realized by MOOR and ROWSON

(1966), who transferred 14-16 days old ovine embryos to ewes during the

estrus cycle, before the 12th day, and observed the maintenance of the

corpus luteum and the interruption of the cycle. The following year, the

same authors homogenized 14-16 day ovine embryos and injected the

homogenate into the uterus before the 12th day of the cycle. The same

results were obtained: maintenance of the corpus luteum and interruption of

the estrous cycle. This phenomenon was not observed if the homogenates

were obtained from 21-23 day embryos.

NORTHEY and FRENCH (1980) and Humblot and DALLA PORTA

(1984) carried out similar experiments in the cow. They transferred 15-17

days old embryos or their homogenates to recipients during the first 16

days of the estrous cycle obtaining the maintenance of the corpus luteum.

3.3.2.1. Bovine interferon tau (boIFNτ): the boIFNτ is a glycoprotein with

approximately 172 amino acids, produced by mononucleate cells of the

trophectoderm (MORGAN et al., 1993). It is the major secretory product

produced by day 16-25 cow conceptus. When analyzed by two-dimensional

gel electrophoresis, the boIFNτ fells into two major molecular weight

classes (22 000 and 24 000) with isoeletric points between 6.5 and 6.7

(HELMER et al., 1988a,b). The 24 000 molecular weight form is complex

in nature whereas the 22 000 form is a single high-mannose type

glycoprotein, indicating that these products undergoes differential

258

posttranslational glycosylations (HELMER et al., 1988b). The entire cDNA

sequence of the boIFNτ shared 79% identity with bovine interferon alpha II

(IFNα II) (IMAKAWA et al., 1989).

IFNτ is produced by the trophectoderm during the phase of

trophoblast elongation. It alters uterine release of PGF2α which results in

rescue of the corpus luteum and continued release of progesterone. The

mechanism of action of IFNτ includes inhibition of oestradiol receptors,

consequent reduction in oxytocin receptors, activation of a cyclooxygenase

inhibitor, and a shift in the prostaglandins to favour PGE2 over PGF2α

which also induces several endometrial proteins that may be critical for

surviving of the developing embryo (HANSEN et al., 1999).

3.3.2.2. Ovine interferon tau (ovIFNτ): in ewes, ovIFNτ is produced

transiently and when introduced into the non-pregnant female uterus,

extends corpus luteum life only for a short period of few days in most

ewes, although a functional corpus luteum can persists much longer in

others (MARTAL et al., 1979; GODKIN et al., 1982).

MARTAL et al. (1979) were the first to suggest that the antiluteolytic

factor produced by the ovine conceptus was a termolabile protein of

trophoblastic origin. This protein contains 172 amino acids (IMAKAWA et

al., 1987; ROBERTS et al., 1991) and presents a molecular weight of 20

000 (GODKIN et al., 1982). Its mRNA is expressed during a relatively

short period (11 to 22 days) (CHARLIER et al., 1989) that corresponds

closely to the time at which the embryo acts to extend luteal lifespan. The

highest level of mRNA expression was observed on the 22nd of pregnancy

259

(HANSEN et al., 1988). There is a greater structural identity between ovine

and bovine IFNτ (85%) than between this protein and the closest

homologous IFN omega (70%) (CHARLIER et al., 1991).

Like boIFNτ, the ovIFNτ bind receptors on the uterine endometrim

(Bazer, 1989) and seems to suppress transcription of the estrogen and

oxytocin receptors genes to block pulsatile release of PGF2α (GODKIN et

al., 1997).

3.3.2.3. Caprine interferon tau (caIFNτ): IFNτ molecules has also been

identified in caprine species (GNATEK et al., 1989). Two classes of

protein (17 000 and 22 000-24 000) (GUILLOMOT et al., 1998), each with

different isoeletric points, were identified from goat conceptus culture

medium (BAUMBACH et al., 1990b). The goat IFNτ is present in the

trophoblastic cells as early as day 14 and until day 17. However, by day 18,

as implantation proceeded, goat IFNτ is no longer detected suggesting that,

in this specie, other factors need to be present by day 18 to take over a role

in the maintenance of luteal function (GUILLOMOT et al., 1998).

3.3.3. Early Pregnancy Factor (EPF)

Early-pregnancy factor was first discovered in the early stages of

gestation by use of the rosette inhibition test (MORTON et al., 1979).

Despite several attemps, the use of this assay is not yet reliable as a current

pregnancy diagnosis test in animal species (TAKAGI et al., 1998).

Recently, it was observed that approximately 70% of the amino acid

260

sequence of EPF are identical to that of rat chaperonin 10, a member of the

highly conserved heat-shock family. Investigations with the latter

confirmed that chaperonin 10 is the moiety in pregnancy serum which

initiates response in the EPF bioassay (CAVANAGH and MORTON,

1994). As well as being a monitor of the presence of a viable embryo

(SHU-XIN and ZHEN-QUN, 1993), it is necessary for embryonic survival.

In this capacity it acts as both an immunosuppresant and growth factor

(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998).

4. Acknowledgements

This review is part of a study supported by the following grants. The

investigations realized in Belgium were funded by FNRS and IRSIA grants

to J.-F. Beckers. N.M. Sousa is supported by a grant from CAPES. We also

thank the NIH Bettesda USA for gift of hormones.

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Apêndice 2

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278

Chorionic Gonadotropins and Pregnancy-Associated Glycoproteins in

Ruminants

SOUSA, N.M.1, FIGUEIREDO, J.R.1, EL AMIRI, B.2, BANGA-MBOKO,

H.2, SZENCI, O.3 & BECKERS, J.F.2


Liège, Belgium 3Department of Obstetrics and Reproduction, University of Veterinary

Science, Hungary

1. Introduction

In the genital tract of the female, a developing embryo induces the

transformation of the cyclic corpus luteum into a pregnancy corpus luteum.

In ruminants, the mechanism of maternal recognition of pregnancy

involves an interferon tau synthesized in the external layers of the

trophoblast. This molecule interacts with the endometrium to inhibit the

PGF2α synthesis and/or release.

In almost all mammalian species, the progesterone secretion by the

corpus luteum is rescued by the placenta. In ewes, for example,

progesterone synthesis is assumed by the placenta around day 50 after

fertilization. If an early embryonic mortality occurs, a return to estrus can

be observed around days 40 to 50 after fertilization.

279

In the bovine species, the corpus luteum is necessary for pregnancy

maintenance till day 200 after fertilization. Afterwards, the production of

progesterone by the placenta is sufficient to maintain the pregnancy. In cow

suffering of embryonic or fetal mortality, the return of estrus occurs in an

unpredictable delay varying largely between different individuals.

In goat, the corpus luteum is necessary for the whole pregnancy and

after embryonic mortality, it survives often for a long period,

approximately the length of a normal gestation (150 to 155 days). This

characteristic explains the syndrome known as pseudopregnancy and/or

hydrometra.

The maternal recognition of pregnancy in non-ruminant species

involves another mechanism. In primates and in horses, the placenta

synthesizes a two-subunit glycoprotein closely related to the pituitary

follitropin (FSH) and lutropin (LH). These chorionic gonadotropins were

discovered in 1927 (ASCHHEIM) in human and in 1930 (COLE and

HART) in mare, being named hCG and eCG, respectively. hCG and eCG

could be demonstrated by various biological, immunological, immuno-

electrophoretic and radio-immunological techniques, as well as by

inhibition of latex agglutination and hemagglutination.

After this discovery, there were many attempts in order to identify an

equivalent of the choriogonadotropin in other animal species (FOSTER,

1956). However, after the elucidation of the principal molecular

mechanisms of interferon tau in the maintenance of the corpus luteum in

ovine and bovine species, the scientific interest of the question on the

existence of a chorionic gonadotropin in ruminants was decreased.

280

2. Does the Ruminant Placenta Secrete Gonadotrophic Substances ?

As early as 1940, NALBANDOV and CASIDA observed a reduction

in the pituitary gonadotrophic activity in the pregnant cow and suggested

that the corpus luteum was replaced by additional luteotrophic substances

produced elsewhere. Approximately 10 years later, WEETH and

HERMAN (1952) and BJÖRKMAN (1954) found that bovine

trophoblastic cells contain glycoproteins.

In the sixties, using extracts of fetal and maternal cotyledons and

Parlow’s test (depletion of ascorbic acid), FOOTE and KAUSHIK (1963)

demonstrated the presence of a LH-like activity. In 1967, testing extracts of

fetal cotyledons, Lunen and Foote obtained a significant response with the

ventral prostate test and Parlow’s test (PARLOW, 1961) and suggested that

a LH-like substance was present in the bovine placenta (bovine chorionic

gonadotropin or bCG).

More recently, AILENBERG and SHEMESH (1983) working on

cotyledons collected during the first three months of pregnancy (20 to 100

days) looked for a gonadotrophic-like substance capable to stimulate the

progesterone production in bovine granulosa cells culture. For this purpose,

they used a radio-receptor method on Leydic cells according to the

technique previously described by RAMACHANDRAN and SAIRAM

(1975). They isolated a thermolabile substance with an apparent molecular

mass of 60 000 daltons and with a biological activity related to that of bLH,

that they considered to be a true bovine chorionic hormone. This hormone

could have a special importance in the cow, as in this species, the corpus

luteum is required for the maintenance of gestation throughout most of this

process (at least for 200 days).

281

BECKERS et al. (1987) continued to study this question by using the

radioreceptor assay method with membrane receptors and by looking for a

luteotrophic activity in fetal cotyledonary extracts and in all the fractions

obtained during biochemical purification procedures. The membrane

receptors were prepared from corpora lutea after tissue homogenization

followed by centrifugation. After several successive purification steps (90

000 times purification), in 1987 they isolated a substance with an activity

400 times greater than that isolated by AILENBERG and SHEMESH

(1983). The molecular mass was 30 000 daltons. This hormone could not

be confounded with hypophyseal LH as there was no arc of precipitation

between purified bCG and anti-bLH antiserum following radial

immunodiffusion in agar gel. However, this purified hormone was closely

related to pituitary LH as the anti-bCG serum tested presented a cross-

reaction with this substance.

Similarly to previous observations in the bovine species, it was

observed that homogenates of 13 to 15 days old sheep embryos prolonged

the life of the corpus luteum. GODKIN et al. (1978) showed that these

homogenates stimulate progesterone production by cultured luteal cells,

and one year later, LACROIX and MARTAL (1979) were able to

demonstrate a luteotrophic factor of placental origin by use of a

radiocompetitive binding method with corpus luteum membrane receptors.

The secretion of this ‘luteotrophic factor’ seemed to be very low in early

pregnancy. As the non-regression of the cyclic corpus luteum and its

transformation into a pregnancy corpus luteum did not appear to increase

its concentration, another anti-luteolytic substance was suspected to be

involved in this mechanism. This factor was later described as

282

trophoblastin or interferon tau.

3. bCG as an Aspartic Protease Family Member: the PAG-2

The question on the existence of a gonadotrophic substance in

ruminant placenta was partly solved by the study of XIE et al. (1994), who

showed that the cDNA sequence corresponding to the bCG molecule was

closely related to those of the aspartic proteinase family.

This finding was highly surprising however, previous investigations

have shown that chymotrypsinogen, a serine proteinase, can bind to the

LH/hCG receptor and activate it (WILLEY and LEINDENBERGER,

1989).

4. The Lack of Expression of the Gonadotropin αααα-Subunit in

Ruminant Placenta

One other answer to this important question could be given by the

investigation described by NILSON et al. (1991). These authors showed

that the expression of the glycoprotein hormone α-subunit gene occurs in

the pituitary of all mammals, but exclusively in placenta from primates and

horses.

In humans, two different elements, termed upstream regulatory

element (URE) and cAMP response element (CRE), are required for

placenta-specific expression of the α-subunit gene. The URE binds a

protein unique to placenta whereas the CRE binds a ubiquitous protein.

Comparative analysis of the promoter-regulatory region of the α-

283

subunit gene in some mammalian species indicates that a functional URE

has been retained and suggests a potential for its specific expression in

ruminant placenta. Indirect evidence also indicates that the URE binding

protein has been conserved, even in placenta from mammals that fail to

express the α-subunit gene. The lack of expression of the α-subunit gene in

placenta of rodents and cattle can be traced as a single nucleotide mutation

that renders the CRE-like sequence of these genes incapable of binding the

protein that confers responsiveness to cAMP.

Indirectly, this study comforts the hypothesis of a certain luteotropin-

like activity of the ruminant pregnancy-associated glycoprotein II (boPAG-

2). However, the biochemical difficulty to isolate this molecule from

placenta extracts did not allow the development of physiological studies

and keep this question unsolved.

In conclusion, the endocrine activity of the ruminant placenta and the

reciprocal relationships between the sources of hormones during gestation

remain to be described in details. The discovery of prostaglandins,

interferons tau and more recently of the pregnancy-associated

glycoproteins family gave probably main parts of this puzzle.

5. References

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285

Apêndice 3

MOREIRA DA SILVA, F., SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em bovinos. (Submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia)

286

Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao

diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em

bovinos

MOREIRA DA SILVA, F.1, SOUSA, N.M.2, FIGUEIREDO, J.R.2 &

BECKERS, J.F.3

1Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores, Portugal 2Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa

Maria, Brasil 3Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Liège, Bélgica

Resumo

Durante as últimas décadas, várias equipas de investigação têm

envidado esforços para caracterizar proteínas ou glicoproteínas produzidas

pela placenta dos ruminantes, a qual resultou na descoberta de uma grande

família de glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) expressas na

placenta de bovinos, ovinos e caprinos. Recorrendo a técnicas de biologia

molecular, as PAGs foram identificadas como pertencendo à superfamília

das proteinases asparticas, da qual também fazem parte os pepsinogênios, a

renina, as catepsinas D e E, entre outras. Um vez que as PAGs são

produzidas em largas quantidades pelas células binucleadas do trofoblasto,

os seus níveis são facilmente detectáveis na circulação materna a partir do

início da gestação. No presente trabalho, além de serem caracterizados os

principais aspectos fisiológicos e bioquímicos das PAGs bovinas, será

287

demonstrada que a determinação dos níveis de PAGs são um óptimo

instrumento de trabalho para o diagnóstico da gestação, servindo ainda

como indicador do bem estar do feto e do estado sanitário da placenta.

Informações relativas a outras proteínas placentais serão discutidas

comparativamente às informações disponíveis sobre as PAGs.

Placental proteins secreted in maternal circulation: useful indicators

for both pregnancy diagnosis and embryonic mortality in bovine

species

Summary

During the last decades, several research groups developed

investigations in order to characterize proteins or glycoproteins synthesized

by ruminant placenta. As result of these investigations, a large family of

pregnancy-associated glycoproteins was identified in bovine ovine and

caprine placenta. By using molecular biology techniques, it was

demonstrated that they are members of the aspartic proteinase superfamily,

in which they co-exist with pepsinogens, renin, cathepsin D and E, etc. Due

to their secretion in large amounts by the trophoblastic binucleated cells,

bovine PAGs are detectable in maternal circulation soon after implantation.

In the present work, in addition to the physiological and biochemical

characterization of bovine PAGs, it will be showed how the measurement

of PAG concentrations in maternal blood is useful for both pregnancy

confirmation and follow-up of the fetus-placental well-being. Available

information related to other placental proteins will be also discussed.

288

1. Introdução

A placenta é um sistema orgânico polivalente com uma função

fisiológica vital na perpetuidade da mamíferos euterianos: o

desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da placenta

do ponto de vista anatómico, genético e metabólico. No que diz respeito à

função endócrina dos mamíferos, esta inclui várias hormonas tais como a

progesterona, estrogéneos, gonadotrofinas coriónicas, lactogénes placentais

(também designados por somatomamotrofinas), prolactinas, hormonas e

factores de crescimento, além de proteínas e glicoproteínas específicas ou

associadas à gestação, as quais interferem com o estabelecimento da

gestação a manutenção do corpo lúteo, a tolerância imunitária do

embrião/feto pela mãe, o metabolismo materno intermédio, o crescimento

fetal e o desenvolvimento da glândula mamária.

O estudo da função endócrina da placenta dos bovinos será discutida

no presente trabalho. As proteínas associadas à gestação, bem como o seu

relacionamento com outras hormonas peptídicas serão usadas como termos

de comparação para compreensão da sua estrutura, função e produção das

proteínas placentais.

2. A Placenta

A placenta desempenha um papel essencial no estabelecimento e

manutenção da gravidez bem como no desenvolvimento fetal, funcionando

como um órgão respiratório, nutricional, endócrino e imunológico.

Contrariamente ao que se acreditou durante muitos anos, a placenta não

representa somente uma barreira mãe/filho, possuindo efectivamente um

papel activo e selectivo de trocas entre a mãe e o feto, o qual evolui em

289

harmonia com outros sistemas. A estrutura da placenta varia de acordo com

as espécies, e dela depende o comportamento do embrião na altura da

nidação, quer esta seja nos tecidos de lúmen uterino ou então apenas na

mucosa uterina.

Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos

de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no

número de camadas histológicas que separam o feto do sangue materno

parece-nos ser a mais precisa. Neste tipo de classificação, os diferentes

tipos de placentas são divididos em quatro grupos: placentas epitéliocoriais

(ex. equinos e suínos), placentas sindesmocoriais (ex. ruminantes),

placentas endotéliocoriais (ex. carnívoros) e finalmente placentas

hemacoriais (ex. primatas e roedores). O grau de ligação entre o epitélio

uterino e a placenta é praticamente nulo nas placentas epitéliocoriais, sendo

máximo nas placentas hemacoriais, onde o tecido uterino é modificado e

rompido pelos tecidos da placenta, sendo este fenómeno responsável pelo

sangramento que ocorre durante o parto. Quanto aos bovinos, a placenta

situa-se entre dois tipos, não sendo completamente sindesmocorial nem

epitéliocorial. Nesta espécie existe a presença de microvilosidades nas

quais o epitélio uterino persiste mas é modificado num híbrido feto-

materno formado pela migração e pela fusão das células binucleadas do

corion fetal com as do epitélio uterino (WOODING, 1992).

2.1. Células binucleadas

O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a

presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas

células primordialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido

290

objecto de inúmeras investigações através das últimas cinco décadas

(DRIEUX e THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING e

WHATHES, 1980; KLISCH et al., 1999). As células binucleadas derivam

das células coriónicas mononucleadas por cariocinese sem subsequente

citocinese. As células mais jovens são localizadas profundamente na

trofoderme e a sua maturação é feita progressivamente quando do seu

aparecimento na superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras

células binucleadas aparecem imediatamente antes da implantação

(WANGO et al., 1990a), podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após

a fertilização nos ovinos (WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos

bovinos (WATHES e WOODING, 1980).

Após o desenvolvimento da placenta, as células binucleadas

representam 15-20% do total da população celular placentária

(WOODING, 1983; WOODING et al., 1986; WANGO et al., 1990b) das

quais cerca de uma em sete migram em direcção ao epitélio uterino, em

qualquer altura de gestação (WOODING et al., 1996). A migração das

células binucleadas representa um papel importante na remodelação da

estrutura da placenta, induzindo uma reacção com as células uterinas o que

pode resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos

(WOODING e BECKERS, 1987) ou na formação de extensas placas

sinciciais em ovinos (WOODING, 1992).

No que diz respeito à sua função endócrina, na década de 40

suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes

estaria relacionada com a produção de hormonas essenciais à manutenção

da gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez a redução da

actividade gonadotrófica da pituitária na vaca gestante, sugerindo-se que o

291

corpo lúteo fosse substituído por substâncias luteotróficas produzidas num

outro órgão qualquer. Em 1952 e 1954, respectivamente WEETH e

HERMAN e BJÖRKMAN usando micro-secções de cotilédones corados

com “periodic acid Schiff (PAS)”, descreveram a presença de numerosas

células trofoblásticas contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde,

FOOTE e KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de actividade LH

nos cotilédones. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o

caminho para a futura identificação e caracterização de hormonas e

proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes.

Actualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão

directamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al.,

1991; WANGO et aI., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas

(REIMERS et al., 1985b), hormonas placentárias lactogénicas

(VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) e glicoproteínas

específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985a; GOGOLIN-

EWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al., 1992a;

ATKINSON et al., 1993). Estes produtos antes de serem secretados são

armazenados em grânulos densos, os quais ocupam mais de 50% do

citoplasma (LEE et al., 1986) e os quais libertam o seu conteúdo

directamente no sistema materno após a migração das células binucleadas

(WOODING, 1984).

3. Proteínas placentais

As proteínas secretadas pela placenta, após o momento em que podem

ser doseadas na circulação sanguínea materna, apresentam-se como um

óptimo indicador de gestação bem como do estado sanitário da unidade

292

feto-placentária. Contudo, apesar de muita investigação ter sida

desenvolvida sobre as funções fisiológicas destas proteínas placentais, a

exacta função da maior parte delas contínua ainda desconhecida.

É sabido, por exemplo, que nas espécies ruminantes, o interferon tau

permite a manutenção do corpo lúteo funcionando como um agente anti-

luteolítico (MARTAL et al., 1979), enquanto que nos primatas, esta

manutenção é assegurada pela gonadotrofina coriônica (ASCHHEIM,

1927). Além de factor anti-luteolítico, o interferon tau funciona ainda como

um factor estimulante na síntese da progesterona. Em adição a estas acções,

esta glicoproteína parece também exercer uma função importante,

principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância imunitária

do embrião/feto pela mãe (FILLION et al., 1991; MARTAL et al., 1997).

Num estado mais avançado da gestação, a placenta produz a hormona

lactogéne placental, a qual é responsável pela estimulação da actividade

mamogénica (FORSYTH, 1986), estando também envolvida, pelo menos

parcialmente, no crescimento fetal (Chene et al., 1988) e no metabolismo

materno (Freemark et al., 1992).

Os maiores grupos das proteínas placentais e os seus aspectos mais

relevantes, são discutidos a seguir.

3.1. Proteínas associadas à gestação (PAGs)

As PAGs, conhecidas com uma enorme variedade de nomes os quais

incluem “Pregnancy-Specific Protein B” (PSPB) (BUTLER et al., 1982;

LYNCH et al., 1992) e “Pregnancy-Specific Protein 60” (CAMOUS et al.,

1988; MIALON et al., 1993) foram primeiramente descritas como

antígenes placentais da placenta de bovinos, os quais estavam presentes no

293

soro sanguíneo da mãe a partir do primeiro mês de gestação. Nos últimos

20 anos, Butler, Beckers, Zoli e Xie e colaboradores (BUTLER et al. 1982;

BECKERS et al., 1988b; ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1991) identificaram

uma longa variedade desta família de glicoproteínas produzidas

especificamente pela camada celular externa da placenta das espécies

unguladas (ZOLI et al., 1992a; GREEN et al., 2000).

Usando procedimentos bioquímicos, algumas moléculas da família

das PAGs foram isoladas a partir de cotilédones de vaca (ZOLI et al.,

1991), da ovelha (ZOLI et al., 1995, XIE et al., 1997a) e da cabra

(GARBAYO et al., 1998). Após terem sido isoladas, estas moléculas foram

usadas para imunizar coelhos e o anti-soro obtido permitiu o

desenvolvimento de ensaios radio-imunológicos para a detecção de PAG

no soro sanguíneo das diferentes espécies (ZOLI et al., 1992b; RANILLA

et al., 1994; GONZALEZ et al., 1999).

O doseamento das concentrações de PAG representa actualmente um

óptimo método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função

do trofoblasto, podendo ajudar no maneio da reprodução bem como nos

aspectos clínicos e de investigação para determinar diferentes aspectos

patológicos que possam afectar a gestação (ZARROUK et al., 1999a,b).

3.1.1. Família das PAGs bovinas (boPAGs)

a) A boPAG-1

Após terem sido isoladas por ZOLI e colaboradores em 1991, e após a

primeira caracterização por XIE e colaboradores em 1991, diferentes

moléculas da família das PAGs foram identificadas e denominadas dum

modo arbitrário até à presente data.

294

A boPAG purificada por ZOLI et al. em 1991 e que posteriormente

passou e designar-se de boPAG-1 (XIE et al., 1995) demonstrou ser uma

proteína acídica com um peso molecular de 67 000, existindo quatro

isoformas (I, II, III e IV) com diferentes pontos isoeléctricos (4,4; 4,6; 5,2 e

5,4). O ponto isoeléctrico está directamente relacionado com a quantidade

de ácido siálico existente em cada isoforma (2,12%, 0,83%, 0,64% e

0,29%, respectivamente). Estudos imunoquímicos permitiram detectar a

boPAG-1 predominantemente no citoplasma de células binucleadas

presentes nos tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992a). A presença de

antígenes imunologicalmente idênticos à boPAG-1 foram também

encontrados em extractos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que

justifica o adjectivo “associadas” e não “específicas” que são dadas a esta

glicoproteína.

O facto mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a

descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas

proteolíticas, as quais são conhecidas como proteinases aspárticas,

possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as sequências da

pepsina, da quimosina, da catepsina D e E, da renina, da napsina e da

memapsina. Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras

proteinases aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996; XIE et al., 1997b),

esta molécula é considerada como cataliticalmente inactiva. XIE e

colaboradores (1991) demonstraram que a falta aparente da actividade

proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76) no local

onde normalmente existe glicina (Gly-76). Esta mutação tem como

consequência uma mudança do local da molécula catalítica da água da sua

posição simétrica normal, originando a inactividade catalítica desta

295

proteína (DAVIES, 1990).

b) A boPAG-2

Em 1994, XIE e colaboradores identificaram uma proteína coriônica

anteriormente isolada por BECKERS e a sua equipa (1988a) como sendo

um novo membro da família das proteinases aspárticas, à quaI foi dado o

nome de boPAG-2 (BECKERS et al., 1994). Esta glicoproteína foi

caracterizada como sendo um polipéptido de 372 aminoácidos

estruturalmente semelhante à boPAG-1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma

sequência de 58%, 58% e 51% dos aminoácidos idênticos,

respectivamente).

O ADN complementar da boPAG-2 é detectado a partir dos 17 dias de

gestação, coincidindo com o inicio da implantação. Contudo,

contrariamenteao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi

purificada até à homogeneidade, não podendo ser usada para o

desenvolvimento de dosagens radio-imunológicas que permitam a sua

detecção na circulação sanguínea materna.

Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um

centro catalítico com uma sequência de aminoácidos idêntica a outras

proteinases aspárticas activas. Uma possível actividade proteolítica da

boPAG-2 continua, contudo, ainda por esclarecer.

c) Outras boPAGs

Até ao presente, como resultado do uso de técnicas de biologia


na espécie bovina (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b;

296

GREEN et al., 2000). Estas moléculas diferem em ao menos 5% em sua

sequência de nucleotídeos, sendo expressas em células mononucleadas,

binucleadas ou mesmo em ambas. Entretanto, com excepção das boPAGs –

1 e –2, ainda não foi possível isolar a maioria destas proteínas a partir de

placentas, não sendo as mesmas identificáveis na circulação periférica

sanguínea.

3.1.2. Ensaios radio-imunológicos para dosear a boPAG-1

a) Doseamento de PAG durante a gestação normal

Na prática, o anti-soro produzido em coelhos contra a boPAG-1,

PSPB ou PSP-60 tem permitido o desenvolvimento de ensaios radio-

imunológicos específicos para dosear estas proteínas no sangue de vacas

(SASSER et al., 1986; HUMBLOT et al., 1988ab; SASSER et al., 1989;

ZOLI et al., 1992b; MIALON et al., 1993; SKINNER et al., 1996). Uma

vez que as concentrações de PAG são mais elevadas no soro da mãe que no

do feto (ZOLI et al., 1992b), pode concluir-se que esta glicoproteína é

libertada preferencialmente no sistema materno em detrimento do do feto.

Na circulação materna, a PAG pode ser detectada ao mesmo tempo

que o trofoblasto estabelece ligações definitivas com as paredes do útero.

Desde o início da gestação até uma semana antes do parto, as

concentrações aumentam devagar e gradualmente (Figura 1). Durante o

período do parto as concentrações aumentam rapidamente atingindo

valores de 1 à 5 µg/ml alguns dias antes do parto (ZOLI et al., 1992b;

PATEL et al., 1997) (Figura 1),. As concentrações baixam após o parto,

atingindo níveis basais, indetectáveis cerca de 100 dias pós-parto (ZOLI et

aI., 1992b). O relativo longo tempo necessitado pela boPAG-1 para

297

desaparecer da circulação sanguínea materna pode ser explicada pela

elevada concentração presente no sangue matemo na altura do parto, bem

como a longa vida-média desta glicoproteína a qual está estimada em 7,4 a

9 dias (KIRACOFE et al., 1993; ALI et al., 1997). Investigações realizadas

durante o periparto demonstraram ainda a influência do ambiente maternal

e do genótipo fetal (sexo e raça) nas concentrações periféricas de boPAG-1.

De facto, as concentrações de PAG são mais elevadas na circulação

materna em cruzamentos de raças que em raças puras (GUIBAULT et al.,

1991).

Figura 1. Perfil das concentrações de PAG (média ± desvio padrão) calculados no soro de 20 vacas coletadas do dia 20 de gestação ao dia 100 pós-parto. A remarcar a escala aritmética das concentrações de PAG do dia 20 ao dia 220 de gestação e a escala logarítmica do dia –40 antes do parto ao dia 80 pós-parto. Adaptado de ZOLI et al., 1992b.

A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é

correntemente usada como método para diagnósticos de gestação em

bovinos a partir dos 29-30 dias após a fecundação (SASSER et al., 1986;

298

HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al., 1998a,b, 2000a,b). Os valores

preditivos positivos do doseamento de PAG para fins de diagnóstico de

gestação variam de 72% (dia 29 após inseminação artificial; SZENCI et al.,

1998b) a 93% (dia 45 após inseminação artificial; ZOLI et al., 1992b),

enquanto que os valores preditivos negativos variam de 95% a 100%

(respectivamente aos dias 29 e 45 após inseminação artificial; SZENCI et

al., 1998b).

b) Doseamento de PAG durante gestações anormais

Recentemente, ECTORS e colaboradores (1996a) demonstraram que

em programas de transferência nuclear, mesmo se a maior parte dos

bezerros apresentam pesos e tamanhos normais. Em 1999 Horta

demonstrou existir um maior crescimento do feto durante a gestação,

quando os vitelos resultam a partir de embriões produzidos in vitro. Além

do aumento do peso alguns bezerros podem apresentar anomalias

morfológicas tais como edemas do cordão umbilical com hipertrofia da

placenta, as quais são responsáveis por elevadas concentrações de boPAG-

1 na circulação materna. Em alguns casos, estas concentrações podem

atingir entre 9 µg a 12,35 µg/ml (ECTORS et al., 1996b).

Consequentemente, concentrações anormalmente elevadas de boPAG-1 na

circulação materna podem poderão ser um importante indício da presença

de quantidades anormais de tecidos do trofoblasto.

No caso contrário, a observação de um acentuado decréscimo nas

concentrações de boPAG-1 após monta natural, inseminação artificial,

fecundação in vitro ou clonagem podem são um forte indicativo de

disfunção placentária ou sofrimento fetal. Num estudo pioneiro, o

299

doseamento de concentrações de boPAG-1 em amostras colectadas

semanalmente após transferência de embriões produzidos in vitro permitiu

a detecção de mortes embrionárias e fetais na espécie bovina (ECTORS et

al., 1996a). O mesmo fenómeno de redução nas concentrações de PAG em

caso de abortamentos de origem infecciosa e não infecciosa foi descrito por

ZARROUK et al. (1999a,b) em cabras de origem norueguesa. Contudo,

dadas as elevadas variações nas concentrações da PAG no sangue materno,

somente uma acentuado decréscimo ou desaparecimento total da PAG pode

ser um sinal efectivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações

múltiplas e simples, respectivamente.

Foi demonstrada ainda que a utilização paralela da ultrasonografia

(US) e do doseamento de hormonas como a progesterona (P4) e a boPAG-1

pode revelar a ocorrência de diversos problemas frequentemente

observados em condições de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas

já grávidas ou a administração de prostaglandina F2α no início de uma

gestação viável causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os

casos, os quais se traduzem em erros no maneio da reprodução, a

identificação de mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida

sem o uso destas técnicas, sendo considerada simplesmente como um

retorno tardio em cio.

SZENCI e colaboradores (1998a) descreveram diversas situações nas

quais o doseamento de proteínas associadas à gestação e progesterona

demonstraram ser extremamente úteis quando associadas a técnica de US.

Merecem ser citados particularmente o caso da vaca no 3129 (Figura 2), no

qual as concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de

progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de

300

mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo; a vaca no

3369, no qual as concentrações de PAG mostram claramente que a vaca

tinha sido fecundada quando da primeira fecundação e que a realização de

uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou provavelmente uma

contaminação do útero, resultando em mortalidade fetal; a vaca no 3570, na

qual o doseamento de PAG confirma a ocorrência de mortalidade

embrionária precoce indicada pela US, e por fim, o caso da vaca no 3004,

no qual as concentrações de PAG demonstram que esta vaca teria sido

inseminada num curto período após o parto (concentrações decrescentes de

PAG), e que neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria

preparado para o estabelecimento de uma nova gestação.

Figura 2. Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-•-•-) e progesterona (-▲-▲-) em

4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF). A vaca no 3369 foi re-inseminada (I.A.) no 20o dia após a primeira inseminação. Adaptado de SZENCI et al., 1998a.

301

3.2. Lactogénes placentais

As lactogénes placentais, também conhecidas por

somatomamotrofinas coriónicas, são hormonas proteinaceas de origem

placental com uma parte estrutural e funcional idênticas às hormonas de

crescimento e à prolactina.

A função das hormonas lactogénes placentais varia de acordo com as

diferentes espécies. Em geral foi sugerido que estas hormonas influenciam

a mamogénese e a lactogénese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al., 1972),

as esteroidogéneses ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al.,

1998) e placentária (Deayton et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et

al., 1988), alterando ainda o metabolismo maternal para acomodar o do

feto, contribuindo para o seu crescimento e desenvolvimento (FREEMARK

et aI., 1992).

3.2.1. Lactogéne placental bovina ou somatomamotrofina coniónica

bovina (bCS)

Estudos efectuados em hormonas placentais precederam os estudos

feitos sobre as PAGs nos ruminantes domésticos. Na espécie bovina, a

actividade lactogénica dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por

BUTTLE e FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efectuado

recorrendo ao uso de uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e

de tecido cotiledonar de vaca em diferentes estágios de gestação, durante

um período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância

lactogénica com actividade equivalente à cerca de 300 ng da actividade da

prolactina bovina. Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso

de placentas bovinas por várias equipas de investigação (BOLANDER e

302

FELLOWS, 1976; BECKERS et al., 1980; MURTHY et al., 1982)

permitiram a identificação de uma proteína com actividade

somatomamotrópica, denominada mais tarde de hormona lactogène

placental (bPL) ou somatomamotrofina coniónica bovina (bCS).

A bPL é produzida pelas células coriónicas binucleadas

(VERSTEGEN et al., 1985; KAPES et al., 1992), as quais libertam os seus

productos para a circulação materna após sua migração e fusionamento

com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com

outras lactogénes placentais, a PL bovina é uma glicoproteína que contém

n-ligandos e o-ligandos oligosacarídeos (SHIMOMURA e BREMEL,

1988; BYATT et al., 1987). Esta composição glicoproteica, característica

também de outras proteínas placentais tais como a boPAG pode resultar

dum mecanismo post translacional altamente desenvolvido o qual foi

identificado existir nas células gigantes do trofoblasto de bovinos

(GOGOLIN-EWENS et al., 1986).

A PL bovina é detectada na circulação materna a partir do quarto mês

de gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior

a 2 ng/ml durante a gestação (Figura 3). Na circulação periférica do feto a

concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/mI) apresentando um

declínio com o avanço da gestação (BECKERS et al., 1982; BYATT et al.,

1987). Estas concentrações fetais vs maternais de bPL são bastante

diferentes das observadas para a boPAG-1, apesar da co-localização de

ambas as proteínas placentais nas mesmas células.

Nos bovinos o crescimento da glândula mamária parece ser, pelo

menos parcialmente controlada por hormonas de origem placental, tais

como a bPL. O crescimento do bezerro e o peso da placenta estão

303

positivamente relacionados com a produção de leite na Iactação seguinte

(ERB et aI., 1980; COLLIER et al., 1982).

Figura 3. Perfil das concentrações plasmáticas da hormona lactogéne placental bovina doseada em vacas e em fetos. Adaptado de BECKERS et al., 1982.

3.3. Proteínas associadas ao sinal embrionário

Em algumas espécies, mesmo antes da implantação, o embrião produz

alguns “sinais” os quais são reconhecidos pela mãe inibindo a luteolise e

induzindo a transformação do corpo lúteo cíclico num corpo lúteo

gravídico. Dentro destes sinais, pode ser referida a gonadotrofina coriónica

(GC), um factor luteotrófico produzido pelas placentas dos humanos e dos

equinos, e o interferon tau, bem como o factor anti-luteolítico responsável

pela permanência do corpo lúteo nas espécies ruminantes.

304

3.3.1. Gonadotrofina coriónica (GC)

As espécies humana e equina são conhecidas, desde há muito tempo,

como produtoras, ao nível placentário, de hormonas gonadotróficas. Já em

1927, ASCHHEIM relatou a presença dum factor gonadotrófico na urina da

mulher grávida, baseando neste facto o seu famoso método de detecção de

gravidez (ASCHHEIM e ZONDEK, 1928a,b). Dadas as suas propriedades,

este factor gonadotrófico foi mais tarde chamado de gonadotrofina

coriónica humana (hCG). Dois anos mais tarde, COLE e HART (1930)

demonstraram existir actividade gonadotrófica no soro de éguas gestantes.

Esta gonadotrofina, vulgarmente conhecida por PMSG, após uma melhor

caracterização passou a ser denominada de gonadotrofina coriónica equina

(eCG).

Uma substância possuidora de uma actividade do tipo LH foi isolada

pela primeira vez a partir de extractos cotiledonários fetais bovinos por

FOOTE e KAUSHIK (1963). A partir desta época, numerosas equipas

(AILENBERG e SHEMESH, 1983; BECKERS et al., 1988a) tentaram

purificar e caracterizar um equivalente da gonadototrofina coriônica na

espécie bovina. Em especial, foi parcialmente purificada uma substância

com grande actividade LH, e a qual não apresentou reacções cruzadas com

anti-soro anti-LH bovino (BECKERS et al., 1988a). Entretanto, apesar das

numerosas tentativas feitas durante várias décadas, não foi possível isolar e

caracterizar (sequência de aminoácidos) a molécula teoricamente

responsável pela actividade gonadotrópica observada na placenta de fêmeas

bovinas.

A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na

placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE e

305

colaboradores, os quais demonstraram que o ADN complementar

correspondente à “gonadotrofina coriônica” isolada em bovinos por

BECKERS e colaboradores (1988a) correspondia, na verdade, a uma nova

forma de protease aspártica pertencente a família das PAGs (boPAG-2).

Uma outra resposta a esta questão foi dada por NILSON e colaboradores

(1991), os quais mostraram que a expressão de genes codantes para a sub-

unidade alfa, essencial à atividade luteotrópica do LH e das GCs, seria

possível no tecido hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas

restrita às placentas de equinos e primatas. Com base em ambos

argumentos, pode ser deduzido que actividade coriónica previamente

detectada em extractos placentários de bovinos pelo uso de dosagens

baseadas em radio-receptores (LH) seria devida a uma activação não-

específica de receptores LH, e não à existência de gonadotrofinas

coriônicas nesta espécie.

3.3.2. Interferon tau

Nos ruminantes domésticos, a produção ovárica de progesterona é

requerida durante cerca de 55 dias nas ovelhas sendo este período pelo

menos 165-180 dias nos bovinos (ESTERGREEN et al., 1967). Nos

caprinos a progesterona ovárica é produzida até ao final da gestação. Nestas

espécies, a transformação do corpo lúteo ciclico em gravídico parece ser

induzida pela acção de um factor proteináceo sintetizado pelo concepto

próximo à sua implantação. Este factor a que primeiramente se denominou

trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína trofoblástica (GODKIN

et al., 1984) foi recentemente designado como uma subclasse distinta da

família do interferon alfa ao qual se designou interferon tau (CHARPIGNY

306

et al., 1988).

Os primeiros estudos que demonstraram a presença dum factor anti-

luteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por

MOOR e ROWSON (1966), os quais transferiram embriões de ovino com

14-16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12o dia do ciclo sexual,

observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual.

No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões de ovinos

com 14-16 dias e injectaram o homogeneizado no útero antes do 12° dia do

ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos: a manutenção do corpo lúteo

e a interrupção do ciclo sexual. Este fenómeno não foi contudo observado

quando os embriões usados tinham entre 21-23 dias de idade.

NORTHEY e FRENCH (1980) bem como HUMBLOT e DALLA

PORTA (1984) fizeram experiências idênticas na vaca. Transferiram

embriões entre 15-17 dias de idade ou os seus homogeneizados para

recipientes durante os primeiros 16 dias do ciclo sexual obtendo a

manutenção do corpo lúteo.

O interferon tau é o principal produto secretado pelo concepto bovino

entre os dias 16 e 25 pós-fecundação, alterando a libertação uterina de

PGF2α, o que resulta na manutenção do corpo lúteo responsável pela síntese

de progesterona no início da gestação. O mecanismo de ação do interferon

tau inclui a inibição dos receptores para estradiol com uma consequente

redução dos receptores para oxitocina, a activação do inibidor da ciclo-

oxigenase e o favorecimento da síntese de PGE em detrimento da síntese

de PGF2α (HANSEN et al., 1999). Apesar de ser um importante produto de

secreção, esta molécula é libertada localmente no lúmen uterino, não

podendo ser detectada na circulação periférica materna.

307

3.3.3. Factor precoce de gestação (EPF)

O factor precoce de gestação foi primeiramente descoberto nos

primeiros estágios de gestação por Morton e colaboradores em 1974.

Colocado em evidência pelo teste de inibição da roseta, o EPF foi

considerado como sendo um importante factor imunosupressor responsável

pela tolerância imunológica do concepto pelo sistema imunológico

materno. Recentemente CAVAGNAGH e MORTON (1994)

caracterizaram o EPF como sendo na verdade uma chaperonina 10, a qual

poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e

por consequência, possuidora de uma forte acção imunosupressora local

(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998). Apesar da precocidade

atribuída ao aparecimento do EPF, a utilização do teste de inibição da

roseta para fins de diagnóstico de gestação em diversas espécies não tem

sido considerada como fiável (CHAOUAT e MENU, 1993).

4. Agradecimentos

Este trabalho representa parte de estudos financiados pela FNRS e

IRSIA belgas (J.F. Beckers). A fundação Luso-Americana para o

desenvolvimento (Projecto 858/2000) financiam parcialmente os trabalhos

de F. Moreira da Silva (Portugal) desenvolvidos neste domínio. A autora

N.M. Sousa é financiada pela CAPES brasileira.

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318

Apêndice 4

SOUSA, N.M., REMY, B., EL AMIRI, B., FIGUEIREDO, J. R., BANGA-MBOKO, H., GONÇALVES, P.B.D. & BECKERS, J.F. Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu (Bos indicus) placentas removed at different gestational ages. (submetido à Reproduction, Nutrition, Development)

319

Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins Extracted

from Zebu (Bos indicus) Placentas Removed at Different Gestational

Periods

SOUSA, N.M.1, REMY, B.2, EL AMIRI, B.2, FIGUEIREDO, J.R.1,

BANGA-MBOKO, H.2 GONÇALVES, P.B.D.1 & BECKERS, J.F.2


Liège, Belgium

Abstract

The pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family

of aspartic proteinases expressed in the outer epithelial cell layer of the

Artyodactyla placenta. In the present work, two biochemical approaches

were used to characterize PAGs isolated from Bos indicus fetal cotyledons.

The first procedure, used to isolate PAG from zebu placenta removed late

in pregnancy, included extraction of proteins at neutral pH, acidic and

ammonium sulfate precipitations, anion and cation exchange

chromatographies. The second procedure, used to investigate PAG in

placentas removed at early and mid gestational periods, included protein

extractions at acid or alkaline pH followed by pepstatin-agarose affinity

chromatography. A bovine PAG radioimmunoassay was used to monitor

the immunoreactivity throughout the isolation procedures. The most

immunoreactive fractions issued from cation exchange and affinity

320

chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western blot, before

transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH2-

microsequence determination. In the first protocol, PAG was mainly eluted

at NaCl concentrations of 0.04, 0.08 and 0.16 M in DEAE-Sephadex

column. After CM ceramic chromatography of all except 0.32 M NaCl

DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal

amino acid sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to

bovine PAG-1. The same sequence (14 aa long) was found after pepstatin-

agarose affinity chromatography of proteins extracted from placentas

removed earlier in pregnancy. These results converged towards the

expression of one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu

placentas at different gestational ages.

Key words: pregnancy, trophoblast, placenta, reproductive technology

Caractérisation des protéines associées à la gestation extraites du

placenta de zébu recueilli à différentes périodes gestationnelles

Résumé - Dans le présent travail, deux approches biochimiques ont été

utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux

recueillis à différents stades gestationnels chez le zébu (Bos indicus). Le

premier procédé impliquait des précipitations acides et au sulfate

d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation

tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie

d’affinité de pepstatine-agarose. Un dosage radioimmunolgique était utilisé

pour suivre l’immunoréactivité des fractions au cours des différentes étapes

de purification. Les fractions les plus immunoréactives issues des

321

chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysés par

électrophorèse en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de

polyvinylidene difluoride (PVDF) pour micro séquençage de la partie N-

terminale. Par comparaison des électrophorèse en SDS et Western Blot,

différents isoformes de masses moléculaires apparentes allant de 51 à 69

kDa et de points isoélectriques compris entre 4,4 et 6,7 ont été identifiées à

partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles. Le

micro séquençage de la partie N-terminal (10 à 25 acides aminés) indique

l’expression d’une seule séquence N terminal correspondant à celle décrite

pour la PAG-1 de Bos taurus.

protéines associées à la gestation / purification / zébu / placenta / micro

séquençage N-terminal

1. Introduction

Recently, a polymorphic family of placenta-expressed proteins has

been discovered in ruminant species. These pregnancy-associated

glycoproteins (PAGs), also known as pregnancy-specific protein B (PSPB)

(BUTLER et al., 1982) and pregnancy serum protein (PSP-60) (CAMOUS

et al., 1988), constitute a large family of aspartic proteinases, showing a

greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et al., 1991). PAGs are

synthesized by mono and/or binucleate trophoblastic cells, some of them

being released in maternal circulation during almost the whole pregnancy

period (SASSER et al., 1986; ZOLI et al., 1992; MIALON et al., 1993). In

veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in

maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of

322

the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the

management of reproduction, while the second concerns more specifically

clinicians and researchers in their investigation to establish differential

diagnosis of pathologies affecting pregnancy (SOUSA et al., 2001).

Two approaches have been used for PAG characterization in ruminant

placentas: biochemistry and molecular biology. Biochemical procedures

allowed the isolation of different PAG molecules, heterogeneous in

molecular weight and charge (BUTLER et al., 1982; XIE et al., 1997a;

GARBAYO et al., 1998). Further characterization of these molecules by

means of NH2-terminal amino acid sequencing revealed the existence of

one PAG in cows (boPAG67), four in ewes (ovPAG55, ovPAG60, ovPAG61

and ovPAG65) and three in goats (caPAG55, caPAG59 and caPAG62) (ZOLI

et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998). By use of

molecular biology techniques, a larger variety of PAG cDNAs has been

identified in bovine (boPAG-1 to –21), ovine (ovPAG-1 to –9) and caprine

placental libraries (caPAG-1 to –11) (XIE et al., 1997a,b; GREEN et al.,

2000; GARBAYO et al., 2000). As described by GREEN et al. (2000),

these PAG cDNAs appear to be differentially expressed in early, mid and

late gestational periods. However, in spite of several attempts in order to

purify the different PAG molecules identified by nucleotidic sequencing,

only two PAGs (boPAG67 and ovPAG65) could be successfully shown by

both approaches (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a).

In this paper we describe the isolation, characterization and N-

terminal microsequencing of PAG molecules extracted from zebu placenta

removed at different gestational ages. The biochemical protocol previously

described for PAG isolation in ruminant species was used to purify and

323

characterize PAG extracted from placentas removed late in pregnancy. In

placentas removed earlier in pregnancy, a pepstatin affinity

chromatography was used for the first time in order to enrich the

preparations in PAG molecules before N-terminal microsequencing of

immunoreactive proteins.

2. Materials and Methods

2.1. Assays for total protein and PAG-immunoreactivity

Total protein (TP) concentrations of all the fractions were determined

by using the method of LOWRY et al. (1951) with bovine serum albumin

(BSA; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) as standard. The estimation of

PAG concentrations in each purification step was determined by a bovine

PAG-1 radioimmunoassay (boPAG-1 RIA; ZOLI et al., 1992). Pure

boPAG-1 (ZOLI et al., 1991) was used as tracer and standard, and antibody

(R497) against boPAG-1 was used for binding at a final dilution of 1:300

000.

2.2. Collection of cotyledons

Uteri were collected from pregnant zebu (Bos indicus) females within

5-30 min of slaughter. Fetal cotyledons were immediately dissected away

from caruncular tissue, washed with 0.9% NaCl, and stored at –20°C until

use. The stage of pregnancy was estimated by measurement of fetal crown-

rump length. According to gestational age, placentas were classified as

early (10-11 wk), middle (20-21 wk) or late placentas (30-31 wk). Figure 1

shows schematically the protocols of fractionation of proteins extracted

324

from zebu placentas.

2.3. Protocol 1

2.3.1. Protein Extraction

Approximately 1 920 g of fetal cotyledons from late placentas were

thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a hand mixer in

10 mM potassium phosphate buffer (KH2PO4 + KCl, 100 mmol, pH 7.6)

with a ratio of buffer to tissue of 3.5:1 (v/w). Leupeptin (0.001 mmol),

PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2% w/v) and NaN3 (0.02% w/v) were

added at the time of homogenization. The homogenate was stirred at 4°C

for 2 hours, then it was centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The pellet

obtained after the first centrifugation was homogenized in 4 liters of the

same buffer (10 mM potassium phosphate), gently stirred overnight, and

centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The second supernatant, as the first, was

retained and the pellet was discarded.

2.3.2. Acid Precipitation

Supernatants from the first and second extractions were collected

together. The supernatant solution (35 924 mg of protein) was adjusted to

pH 4.5 with 1 M H3PO4, stirred for 5 min and then allowed to precipitate at

4°C for 2 hours. Afterwards, the sample was centrifuged at 27 000 X g for

1 h, and the pellet was discarded. Its pH was readjusted to 7.6 with 1 M

KOH.

325

Fetal cotyledons

Protocol 1 Protocol 2

Isol

atio

n

Protein extraction at neutral pH Protein extraction at acid or alkaline pH

Acid precipitation

40-80% AS precipitation

DEAE Sephadex A25 Pepstatin-agarose affinity chromatography

CM Ceramic of all DEAE fractions

Cha

ract

eriz

atio

n

One-dimensional SDS-PAGE

Coomassie Blue staining

Western blot

Two-dimensional SDS-PAGE N-terminal amino acid sequencing

FIGURE 1- Schematic outline of PAG purification from zebu placentas removed in late (Protocol 1), middle or early (Protocol 2) gestational periods.

2.3.3. Ammonium Sulfate Precipitations

The proteins (20 236 mg) were precipitated by ammonium sulfate

(AS) at 40% saturation for 16 h. After centrifugation (27 000 X g for 1 h),

ammonium sulfate was added to the supernatant to achieve 80% saturation.

After an overnight precipitation, the solution was centrifuged at 27 000 X g

for 1 h 30 min. The pellet (3 855 mg of protein) was resuspended in 500 ml

of Tris-HCl buffer (10 mmol, pH 7.6), extensively dialyzed against the

same buffer (48 h) and centrifuged (36 000 X g for 30 min) to eliminate

326

insoluble proteins.

2.3.4. Anion-Exchange Chromatography

The fraction isolated by 40-80%-saturated ammonium sulfate was

loaded on a 14 X 18-cm diethylaminoethyl (DEAE) Sephadex A25

(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) column which had

previously been equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6). Five

steps of increasing ionic-strength buffer (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M

NaCl) were used for the elution of the column. All the fractions from

DEAE-Sephadex chromatography were concentrated (Amicon

Ultrafiltraton System; Danvers, MA) to a final volume of 200 ml,

extensively dialyzed against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8) and

lyophilized.

2.3.5. Cation-Exchange FPLC

Approximately 200 mg from each DEAE step was chromatographed

separately on a 1 X 3-cm CM Ceramic HyperD F column (BioSepra,

Cergy-Saint Christophe, France) previously equilibrated in 10 mM

ammonium acetate (pH 5.2). After elution of the unbound proteins, a linear

salt gradient (0-0.5 M NaCl) was applied at a flow rate of 1.5 ml/min.

Fractions of 3 ml were collected and monitored by UV absorption at 280

nm. Fractions of each peak were pooled, extensively dialyzed (36-48 h)

against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8), centrifuged at 36 000 X g for

30 min and lyophilized.

327

2.4. Protocol 2

2.4.1. Protein Extraction

Fetal cotyledons from early (553 g) and middle (890 g) gestational

ages were thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a

hand mixer in 50 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8.5) or 300 mM

KCl solution (pH 5), respectively. The ratio of buffer to tissue was 3.5:1

(v/w). Leupeptin (0.001 mmol), PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2%

w/v) and NaN3 (0.02% w/v) were added at the time of homogenization. The

homogenates were stirred at 4°C for 4 hours, then they were centrifuged at

27 000 X g for 1 h and the pellets were discarded. The supernatant

solutions containing soluble proteins (2 405 and 12 096 mg, respectively)

were exchanged into 5 mM sodium acetate buffer (pH 5.2) by means of

Sephadex G-25 filtration (Pharmacia) and concentrated by ultrafiltration to

60 and 1 000 ml, respectively.

2.4.2. Affinity Column Chromatography

Approximately 800 and 500 mg (20 and 40 ml) of crude extract

placental proteins from early and middle gestational ages were loaded

separately on a 1 x 4-cm pepstatin-agarose column (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) previously equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH

5.2). After loading, the column was washed with the equilibration buffer

until the optical density (OD) at 280 nm decreased below to 0.05. After the

application of a linear salt gradient (0 to 1 M NaCl) to elute the weakly

bound proteins, a linear pH gradient (5.2-10) was applied at a flow rate of

0.5 ml/min. Fractions of 1.0 ml were collected and monitored by

328

spectrophotometry at 280 nm. Fractions from a same peak were pooled,

extensively dialyzed (36-48 h) against 5 mM ammonium bicarbonate (pH

8), centrifuged at 36 000 X g for 30 min and lyophilized.

2.5. Gel electrophoresis

One-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) were carried out with and without

mercaptoethanol (5%) on a vertical cell system. Slab gels (12%

acrylamide) were run at 20 mA during the migration in the stacking gel and

at 40 mA (6h) in the separating gel (20 X 10 X 0.2 cm). Molecular weight

standards (LMW Electrophoresis Calibration Kit; Pharmacia) were run

simultaneously. Proteins were either visualized after Coomassie Brilliant

Blue R250 (Merck, Darmstad, Germany) staining or transferred onto a

nitrocellulose membrane (Hybond ECL, Pharmacia) for Western blotting.

Two-dimensional gel electrophoresis were performed by using pH 3-

10 Immobiline Drystrips (11 cm, Pharmacia) for the first dimension,

followed by SDS-PAGE (12%) in the second dimension. After an

overnight hydration in a Immobiline DryStrip Reswelling Tray

(Pharmacia), focusing was carried out at 300 V for 30 min, 1 000 V for 30

min, 1 550 V for 16 h min and then at 1 850 V for 1 h in a Flat Bed

Apparatus (FBE-3000, Pharmacia). Proteins were transferred to 0.2 µm

polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Bio-Rad, Richmond, CA)

on a 2117 Multiphor II Apparatus (Pharmacia). Transfer was carried out at

constant voltages (12 V for 45 min and 36 V for 45 min).

329

2.6. Immunoblotting of transferred proteins

Proteins in the slab gel were transferred onto nitrocellulose membrane

immediately after one-dimensional SDS-PAGE, essentially as described by

TOWBIN et al. (1979). Transfer was carried out at a constant current of 24

mA for 1 h and then at 36 mA overnight (Multiphor II Apparatus;

Pharmacia). After protein visualization with Ponceau S (Merck),

nitrocellulose membranes were washed with Trisbuffered saline (TBS, pH

7.6) containing 3% BSA (3 X 10 min at 37°C), and then incubated

separately (3 h at 37°C) with three different rabbit antisera raised against

bovine (boPAG-1; R497) or caprine PAGs (anti-caPAG55+62 and

caPAG55+59; R706 and R708, respectively). Antisera were used at a dilution

of 1:200 in a mixture of PAG-serum free and TBS containing 1% BSA

(24:75 v/v). After incubation, the membranes were washed with TBS

containing 1% BSA (3 X 10 min at 37°C) and incubated (2 h at 37°C) with

sheep anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HPR-POD; Chemicon

International Incorporation, Temecula, CA) diluted at 1:2 000 in TBS

containing 1% BSA. After the second incubation, nitrocellulose paper was

washed with TBS (4 X 10 min at 20°C) and the peroxidase substrate (100

ml TBS, 100 µl H2O2, 20 ml methanol and 60 mg chloronaphthol; 15 min

at 0°C) was added to visualize the antigen-antibody complexes.

2.7. NH2-terminal microsequence analysis

The NH2-terminal amino acid (aa) sequences of the blotted proteins

were determined by the Edman degradation method on a pulse liquid-phase

protein sequencer (Procise 492 Applied Biosystems, Foster City, CA). The

330

sequences obtained were compared to known protein sequences in the

Swiss-Prot, Trembl and TremblNew data banks by the Fasta 3 search

program (PEARSON and LIPMAN, 1988).

3. Results

3.1. Isolation and characterization of PAG extracted from zebu

placenta collected in late pregnancy

As determined by RIA, PAG-like proteins represented approximately

0.93% of the total soluble proteins extracted from 30-31-wk zebu

placentas. Immunoreactive proteins (334.5 mg) were extracted from fetal

cotyledons by homogenization treatment and remained in the supernatant

after pH acidification (294.0 mg). After ammonium sulfate precipitation at

0%-40% and 40%-80% saturation, immunoreactive proteins represented

0.44% (0.76 mg) and 7.91% (304.91 mg) of the total soluble proteins,

respectively. As shown in Table 1, the 40%-80% ammonium sulfate

fraction bound quantitatively to the DEAE column at pH 7.6.

Immunoreactive proteins were mainly eluted at NaCl concentrations of

0.04, 0.08 and 0.16 M (17.64%, 45.96% and 20.56% of total DEAE PAG-

like activity, respectively). Despite the relatively low PAG:TP ratio of the

other DEAE steps, all the fractions were treated by cation exchange

chromatography.

Fast protein liquid chromatography (FPLC) profiles on CM ceramic

column were shown in Figure 2. One single immunoreactive peak was

observed for all DEAE fractions loaded. A major peak of PAG (eluted at

NaCl concentrations of 0.14 to 0.18 mol) was observed for both 0.04 and

331

0.08 M NaCl DEAE fractions. Minor reactive peaks (eluted at NaCl

concentrations of 0.21 to 0.41 mol) were observed for the other steps of

DEAE. The molecular weight and isoeletric points of the highly

immunoreactive proteins from CM ceramic chromatographies are described

in Table 2.

TABLE 1 - Quantity of immunoreactive PAG and total protein (TP) of the fractions eluted from the DEAE-Sephadex A25.

DEAE fraction (NaCl concentration)

PAGa (mg) TPb (mg) PAG:TP ratio

0 M 8.33 282.7 2.95%

0.02 M 5.63 114.6 4.91%

0.04 M 30.74 176.3 17.44%

0.08 M 80.07 292.9 27.34%

0.16 M 35.78 666.0 5.37%

0.32 M 7.49 292.4 2.56% aDetermined by boPAG-1 RIA bDetermined by Lowry method as BSA equivalent.

CM ceramic highly immunoreactive peaks from all DEAE fractions

gave several stained bands after SDS-PAGE (Figure 3A). The major band

of each peak was immunoreactive by Western blotting analysis with the use

of anti-boPAG-1 antiserum (R497; Figure 3B). A similar reactivity was

observed when using anti-caPAG55+62 (R706) and anti-caPAG55+59 (R708)

332

antisera (data not shown). Reduction with β-mercaptoethanol had no effect

on apparent molecular masses of major-stained bands (data not shown).

FIGURE 2 - FPLC CM ceramic chromatography profiles of all DEAE fractions (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M NaCl). The column (1 x 3 cm) was previously equilibrated in 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2. The black lines indicate the salt gradients and the stippled areas indicate the most immunoreactive fractions. Percentages indicated by arrows give the PAG:total protein ratio, as determined by RIA (PAG) and Lowry (TP).

Non-absorbed 0.02 M

0.04 M 0.08 M

0.16 M 0.32 M

41.2

22.9

>100%

>100%

29.4

64.6%

333

TABLE - 2

Electrophoretic characteristics and N-terminal microsequence identities of the highly immunoreactive proteins isolated after CM ceramic chromatography of DEAE fractions.

DEAE fraction origin

MW of major stained bands* pIs of major reactive

proteins**

Identity at the N-terminal aa sequence Coomassie

Blue Western Blot

0 M 51 kDa 50 kDa 6.4, 6.6, 6.7 boPAG-1 (10 aa)

0.02 M 62 kDa 56 kDa 5.2, 5.5 boPAG-1 (10 aa)

0.04 M 66 kDa 67 kDa 5.1, 5.2, 5.4 boPAG-1 (25 aa)

0.08 M 67 kDa 71 kDa 5.0, 5.1, 5.2, 5.3 boPAG-1 (25 aa)

0.16 M 67 kDa 60 kDa

67 kDa -

4.4, 5.0, 5.5, 6.0

-

boPAG-1 (10 aa) -

0.32 M 62 kDa 62 kDa 5.8, 6.1, 6.3, 6.4 α-N-acetyl-galactosaminidase (12 aa)

*Molecular weights (MW) were estimated after one-dimensional SDS-PAGE. **Isoeletric points (pIs) were estimated after two-dimensional SDS-PAGE.

3.2. N-terminal amino acid sequence analysis of immunoreactive

proteins extracted from zebu placenta collected late in pregnancy

The major-stained SDS-PAGE proteins corresponding to the

immunoreactive Western Blot bands had their amino-terminal sequences

determined. After CM ceramic chromatography of 0.04 and 0.08 M NaCl

DEAE fractions, the immunoreactive bands revealed the

RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG amino acid sequence, corresponding to

the amino terminus of boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number

Q29432). N-terminal microsequencing (10 aa) of immunoreacive bands

from 0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions also revealed 100%

sequence identity with boPAG-1.

334

FIGURE 3 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497). Lanes 1, 2, 3, 4 and 5 correspond to the most immunoreactive peaks from CM ceramic chromatography of 0, 0.02, 0.04, 0.08 and 0.16 M NaCl DEAE fractions. Twenty micrograms of each CM ceramic peak were loaded on each lane. Molecular weights (x 10-3) are indicated on the left and right sides of the figure.

Two-dimensional gel electrophoresis analysis showed that each

immunoreactive band was composed by several proteins with different

isoeletric points (Table 2). Microsequencing of the N-terminus (20 aa) of

the four major spots corresponding to the immunoreactive 67 kDa band

from the 0.08M NaCl fraction (data not shown) confirmed the presence of a

single amino acid sequence.

Despite a relatively high PAG:TP ratio (65.55%) observed for the

most immunoreactive peak obtained after CM ceramic chromatography of

0.32 M DEAE fraction, N-terminal microsequence of the 62 kDa protein

(Figure 4) revealed the LENGLLRKPPMG sequence, which has high

335

sequence identity (91.7 %) with murine alpha-N-acetylgalactosaminidase

(Swiss-Prot database accession number O88620).

FIGURE 4 - Two-dimmensional electrophoresis of the most immunoreactive peak from CM ceramic chromatography of 0.32 M NaCl DEAE fraction. Molecular weights (x 10-3) are indicated in the right side. The pH scale is indicated at the top of the gel. Arrows indicate the different charged isoforms (6.4, 6.3, 6.1 and 5.8) of alpha-N-acetylgalactosaminidase.

3.3. Characterization of PAG isolated by means of pepstatin-agarose

affinity chromatography

As estimated by RIA, PAG-like proteins represented approximately

1.81% (43.57 mg) and 0.61% (73.73 mg) of total proteins extracted from

10-11 wk and 20-21 wk gestational age zebu placenta at alkaline (pH 8.5)

and acid (pH 5) conditions, respectively. Crude extracts from 10-11 wk old

zebu placenta gave several peaks after chromatography on a pepstatin-

agarose column (Figure 5). The most immunoreactive peak showed a low

PAG:TP ratio (3.26%), being eluted at NaCl concentrations of 0.19 to 0.42

336

mol. After pH gradient application (5.2-10) no proteins were eluted. SDS-

PAGE analysis revealed the presence of a single major stained protein with

apparent molecular masse of 69 kDa and several weak stained bands

ranging from 20 to 84 kDa (Figure 6A, lane 2). After Western Blot, major

immunoreactive bands were observed at 69 kDa and 84 kDa (Figure 6B,

lanes 2). Analyzed in two-dimensional electrophoresis the 69 kDa protein

gave 3 isoeletric variants with pIs of 3.1, 3.3 and 6.18. Microsequencing of

the 14 N-terminal aa of this protein showed 100% identity with the

boPAG-1. Despite the high immunoreactivity observed with use of bovine

R497 and caprine R706 and R708 antisera, the 84 kDa protein revealed the

DKNAYGIDLIL sequence, which shows 77.78% identity with the alkaline

metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731)

identified in the Caulobacter crescentus genome.

FIGURE 5 - Pepstatin-agarose chromatographic elution profiles of proteins extracted from placentas removed at 10-11 wk and 20-21 wk of gestation. The column (1 x 3 cm) was previously equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH 5.2). The black lines indicate the salt gradients and the stippled areas indicate the most immunoreactive fractions. Percentages indicated by arrows give the PAG:total protein ratio, as determined by RIA (PAG) and Lowry (TP).

3.3% 15.7%

20-21 wk 10-11 wk

337

FIGURE 6 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497), anti-caPAG55+62 (R706) and caPAG55+59 (R708). Lanes 1 and 2 correspond to the most immunoreactive peaks from pepstatin-agarose affinity chromatography of proteins extracted from of placentas removed at 20-21 wk and 10-11 wk of gestation. Sixty micrograms of each immunoreactive peak were loaded on each lane. Molecular weights (x 10-3) are indicated on the left and right sides of the figure.

4. Discussion

In the last two decades, the biochemical isolation of pregnancy-

associated or specific proteins constituted a fundamental step for the

development of specific RIA systems applicable for pregnancy diagnosis in

ruminant species. By means of multiple step purification procedures,

several PAG molecules differing in molecular masses and charges were

isolated from placentas of cows (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et al.,

1988; ZOLI et al., 1991), ewes (WILLARD et al., 1995; XIE et al., 1997a),

goats (GARBAYO et al., 1998), moose and elk (HUANG et al., 1999),

some of them being characterized at their N-terminal amino acid sequence.

338

However, at our knowledge, no publication was made on placental proteins

extracted from zebu placentas.

In the first part of this study, a protocol including extraction of soluble

proteins, acid and ammonium sulfate precipitations and ion exchange

chromatographies was used to purify PAG molecules extracted from zebu

placentas collected at the third trimester of pregnancy. Considered by some

authors as unnecessary (HUANG et al., 1999), acid precipitation

constituted a critical step for PAG purification in zebu taxa. It allowed the

elimination of more than 40% (approximately 16 g) of total crude extract

soluble proteins with an optimal recovery of immunoreactive proteins

(approximately 294 mg, corresponding to 88% of the initial PAG

immunoreactivity). If the pH treatment is responsible for elimination of

some PAG isoforms extracted from ruminant placenta is not known.

Nevertheless, the utilization of a similar purification protocol including

acid precipitation in caprine species allowed the isolation of three distinct

PAGs with different molecular masses, each containing several isoforms

(GARBAYO et al., 1998).

As recently described, ion exchange chromatography has been proved

to be very effective for separation of different PAG molecules extracted

from goat and sheep placental tissues. In caprine species for example, after

DEAE chromatography, immunoreactive proteins were equally apportioned

between the 0.04 M and 0.08 M NaCl fractions. Further fractionation of

these steps revealed the presence of a common 55 kDa protein, as well as

the presence of distinct PAG molecules with masses of 59 kDa and 62 kDa,

eluted respectively at 0.04 and 0.08 M NaCl (GARBAYO et al., 1998). In

ovine species, association of anion and cation exchange chromatographies

339

allowed the characterization of four distinct PAG molecules: ovPAG55,

ovPAG60, ovPAG61 and ovPAG65 (XIE et al., 1997a). Each of these

proteins had a distinct NH2-terminal amino acid sequence and a high amino

acid identity with other members of aspartic proteinase family. In the light

of these findings, in the first protocol, all DEAE fractions were

systematically purified by CM ceramic chromatography and analyzed by

SDS-PAGE and Western Blot. Microsequencing of the 51, 62 and 67 kDa

immunoreactive proteins from CM ceramic peaks revealed the

RGSXLTTHPL (0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions) or

RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG (0.04 and 0.08 M NaCl DEAE fractions)

N-terminal amino acid sequences, which were identical to the N-terminus

of the boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number Q29432).

Surprisingly, only one PAG N-terminal microsequence was identified in

zebu placenta, despite the recent finding that probably all ruminant

Artyodactyla possess possibly 100 or more PAG genes, many of which

being placentally expressed (XIE et al., 1997b).

In fact, till now, all PAG or PSPB related proteins isolated from

bovine fetal cotyledons by different research groups shared the same N-

terminal microsequence (CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991;

LYNCH et al., 1992). There seem to be at least three possible explanations

for this apparent reduced variability of PAG expression in bovine

placentas. The first is that, although some of the recently characterized

PAG cDNAs (XIE et al., 1997b; GREEN et al., 2000) could be transcribed

and translated into PAG molecules, these proteins are rapidly degraded and

thus could not accumulate at detectable levels. The second is that, in bovine

species, some of the PAG molecules could be N-terminally blocked. In this

340

case, only co-purified non-blocked immunoreactive proteins could be

identified after Edman degradation. The third explanation is that some

PAGs could be linked to membranes via fatty acid linkages, being

consequently more difficult to extract by conventional procedures. The

latter explanation seems more unlikely because bovine PAG cDNAs code

for relatively well-conserved pepsinogen-like structure (GURUPRASAD et

al., 1996), which is not originally linked to membranes.

According to XIE et al. (1991), the presence of N-linked carbohydrate

chains accounts, at least partially, for discrepancies in molecular masses

observed after SDS-PAGE. As previously suggested by ZOLI et al. (1991),

different degrees of glycosilation are also involved in the heterogeneity of

isoeletric point estimated for boPAG-1. Concerning N-terminal amino

sequencing, similarly to the previous observations made in taurine, ovine

and caprine species (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et

al., 1998), Edman sequencing of PAGs extracted from zebu placenta failed

to give any signal on cycle 4, indicating the presence of a N-glycosilated

asparagine.

Although a high RIA immunoreactivity was observed for one CM

ceramic peak from the 0.32 M NaCl DEAE fraction (64.55% PAG:TP

ratio), N-terminal sequencing of its major protein (62 kDa) showed more

than 75% identity with the alpha-N-acetylgalactosaminidase (α-GalNAc), a

lysosomal exoglycosidase synthesized in various tissues of murine

(HERRMANN et al., 1998), chicken (DAVIS et al., 1993) and human

species (WANG et al., 1990). The α-GalNAc is not structurally neither

enzymatically related to the lysosomal aspartic proteinase cathepsin D.

Nevertheless, an abnormal expression of both of them seems to be directly

341

related to pathological conditions like cancer (YAMAMOTO et al., 1997;

VIGNESWARAN et al., 2000) and neurological dystrophic or

degenerative diseases (LADROR et al., 1994; WOLFE et al., 1995). The

human α-GalNAc was also accidentally found as one of the five major

bands during purification of placental sialidases (TSUJI et al., 1989). In

this species, α-GalNAc seemed to be synthesized as a 65 kDa glycosylated

precursor, which is processed to a mature 48 kDa isoform (SWEELEY et

al., 1983). Directly responsible for immunosuppression by a mechanism

that involves the deglycosilation of the precursor of macrophage activating

factor (MAF) in cancer patients (YAMAMOTO et al., 1997), it can be

hypothesized that this protein could also play an important role on the local

immunology regulation at the foeto-maternal interface.

According to comparative molecular modeling studies, PAGs have

retained the well-known bilobed structure of aspartic proteinases, and a

peptide binding cleft between the two lobes capable of accommodating

peptides up to 7 amino acids (GURUPRASAD et al., 1996). Thus, it has

been hypothesized that they could be purified by use of pepstatin-agarose

affinity chromatography (GURUPRASAD et al., 1996). Pepstatin A is an

extremely powerful inhibitor of aspartic proteinases (MARCINISZYN et

al., 1977). It binds reversibly to the active center of pepsin, renin and

cathepsin D, being widely used as ligant in affinity chromatography

protocols for isolation of these enzymes (DZAU et al., 1979; AFTING and

BECKER, 1981). In the present work, PAG molecules have been

successfully identified after pepstatin affinity chromatography of

cotyledonary extracts from placentas collected in the first and second

trimesters of gestation. When crude extracts from 20-21 wk old zebu

342

placentas were loaded, PAG concentration was enriched by a factor of 25.8

(15.74% PAG:TP ratio after the column procedure vs 0.61% PAG:TP ratio

in crude extract). A lower efficacy was observed after affinity

chromatography of 10-11 wk old zebu placenta (PAG:TP ratio 3.26% vs

1.81%). In this case, the lower efficacy was probably due to the higher

viscosity of crude extracts, which could make difficult an ideal pepstatin A-

PAG interaction. PAG molecules were eluted before a high ionic strength

was attempted, indicating a weaker interaction of PAG with pepstatin A

substract. This observation is consistent with theoretical binding studies of

PAG molecules which suggested that the substitution of Tyr189 and

Leu220 (porcine pepsinogen numbering) by Asp residues in boPAG-1

molecule are likely to induce a weaker binding to pepstatin A

(GURUPRASAD et al., 1996).

After affinity chromatography, extract of placenta removed at both

gestational ages revealed the presence of a 67 kDa immunoreactive protein,

which was 100% identical to boPAG-1 (14 aa long). As observed in Figure

6B (lanes 2), another protein with an apparent molecular weight of 84 kDa

and showing a high immunoreactivity with 3 antisera (R497, R706 and

R708) was observed after extraction of 10-11 wk old zebu placentas. Its

microsequencing revealed 77.78% amino acid sequence identity to alkaline

metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731),

which was previously identified in the Caulobacter crescentus genome by

NIERMAN et al. (2001). Two possibilities can be argued to explain the

presence of this metalloproteinase in our preparation: first, a bacterial

proliferation during the first steps of purification; second, the specific

expression of this type of metalloproteinase in zebu placenta. It was

343

interestingly that all the 3 antisera recognized this protein. The

characterization of the epitope(s) responsible for this cross-reaction are

worthy of further investigations.

In summary, this investigation is the first on the pregnancy-associated

glycoproteins in Bos indicus placenta. By use of SDS-PAGE and Western

Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular weights from 51

to 69 kDa and isoeletric points varying from 4.4 to 6.7 were identified in

placentas from different gestational ages. N-terminal microsequencing

indicates the expression of one single PAG amino acid sequence in Bos

indicus placenta. However, our data are to be considered carefully because

it is not excluded that some important differences exist in the hypervariable

D-loop region of the molecule. In addition to PAG molecules, two other

immunoreactive enzymes showing high N-terminal amino acid identity

with alpha-N-acetylgalactosaminidase and alkaline metalloproteinase were

identified for the first time in zebu placenta extracts.

5. Acknowledgments

The authors thank Dr. M.A.N. Dode for assistance with zebu placenta

collection, Mrs. N. Gérardin-Otthiers (University of Liège) and Dr. R.

Wattiez (University of Mons-Hainaut) for peptide sequence analyses, Dr.

E. McNamara, Department of General Human Biochemistry and Pathology

(Ulg) for carefully reading the manuscript and Mr. C. Ernotte for editorial

assistance. Supported by a scholarship from Brazilian Coordination of

Training of Higher Educate Graduate (CAPES/Brazil) to N.M.S. and by

grants from F.N.R.S. and Belgium Ministry of Agriculture to J.F.B.

344

6. References

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348

Apêndice 5

SOUSA, N.M., ZONGO, M., PITALA, W., BOLY, H., RUTTE N A., DODE, M.A.N., SANON, M.G., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B. , PERÈNYI, ZS & BECKERS, J.F. Homologous redioimmunoassay system for Pregnancy-Associated Glycoprotein measurement in zebu plasma. (submetido à Theriogenology)

349

Pregnancy-Associated Glycoprotein Concentrations During Pregnancy

and Postpartum Period in Azawak Zebu Cattle

SOUSA, N.M.1, ZONGO, M.2, PITALA, W.2, BOLY, H.2, SAWADOGO,

L.2, SANON, M.2, FIGUEIREDO, J.R.1, SULON, J.3, GONÇALVES,

P.B.1, EL AMIRI, B.3, PERÈNYI, Z.3 & BECKERS, J.F.3

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria,

Brazil. 2UFR/SVT, Ouagadougou University, 03 BP 7021, Ouagadougou 03,

Burkina Faso. 3Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, B-4000, Belgium.

Abstract

Specific RIA systems were developed then used to measure

pregnancy-associated glycoprotein (PAG) concentrations during gestation

and postpartum period in Azawak zebu cows. Twelve females palpated per

rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval

approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One

zebu cow (Z15) initially diagnosed as pregnant showed PAG

concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20 ng/ml) and did not

calve. Another cow (ZSand) showed abnormally high PAG concentrations

during gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other

zebu cows gave a very homogeneous PAG profile. In these animals,

concentrations increased progressively from Week 8 to Week 35 of gestation

(from 6.0 ± 4.2 to 196.0 ± 34.8 ng/ml), remaining relatively constant until

350

Week 39 (210.8 ± 74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their

highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG

concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum

(348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum. Our results

revealed that PAG pattern in zebu cattle was similar to those of taurine breeds

during the first two trimesters of pregnancy, but differed in the peripartum

period.

Key words: Azawak zebu, PAG, RIA, gestation, postpartum

1. Introduction

Zebu (Bos indicus) cattle is an important source of animal protein in

Africa and South America developing countries (CUNNINGHAM, 1992).

When compared with taurine (Bos taurus) cattle, they present some notable

arid-adaptive characteristics. They are more effective in extracting nutrients

from low quality roughages (BARTLE et al., 1994), having also a

remarkable ability to tolerate high temperatures (CARVALHO et al., 1995;

GAUGHAN et al., 1999). Reproductive differences between taurine and

zebu cattle have also been reported (CHENOWETH, 1994). Zebu females

are generally considered to take longer to achieve puberty (PLASSE et al.,

1968a) and to have longer gestation lengths (PLASSE et al., 1968b). Some

breeds appear to produce calves lighter at birth, being less vulnerable to

calving difficulty and losses (DOWLING, 1979). However, because of the

few investigations carried out in this taxa, most of their reproductive

characteristics remain unknown.

In the last two decades, a highly polymorphic family of placenta-

expressed proteins has been discovered in ruminant species. These

351

pregnancy-associated glycoproteins (PAGs), also known as pregnancy-

specific protein B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), SBU-3 antigen

(GOGOLIN-EWENS, 1986) and 60-kDa pregnancy serum protein (PSP-

60) (CAMOUS et al., 1988), constitute a large family of aspartic

proteinases, showing a greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et

al., 1991). They are synthesized by mono and/or binucleate cells of the

trophectoderm (GREEN et al., 2000), some of them being released in the

maternal circulation soon after implantation (ZOLI et al., 1992).

By using biochemical procedures, several molecules of the PAG

family were isolated from cotyledons of ewes (ZOLI et al., 1995; XIE et

al., 1997), goats (GARBAYO et al., 1998), taurine (BUTLER et al., 1982;

ZOLI et al., 1991) and zebu cattle (SOUSA et al., 2001). Some of these

molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed

the development of homologous (ZOLI et al., 1992) and heterologous

(RANILLA et al., 1994; GONZÁLEZ et al., 1999) RIA systems for PAG

measurements in serum (ZOLI et al., 1992), plasma (PATEL et al., 1997)

or milk samples (GONZÁLEZ et al., 2001).

During gestation, PAG concentrations differ largely between species

and the period of pregnancy (ZOLI et al., 1992; RANILLA et al., 1994;

SOUSA et al., 1999). In a same species, they can be influenced by several

other aspects like the breed of the female (MIALON et al., 1993; RANILLA

et al., 1994), the foetal number (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997),

the fetal genotype (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995) and

after embryo transfer, by the length of the period of embryo culture in vitro

(ECTORS et al., 1996). PAG concentrations seems also differ according to

the RIA system, this difference being probably due to the specificity of the

352

antisera (GONZALEZ et al., 1999; GONZALEZ et al. 2000).

Although there is a relatively abundant literature on the

characterization of PAG profiles during gestation in domestic (ZOLI et al.,

1992, RANILLA et al., 1994, SOUSA et al., 1999) and wild ruminant

species (HAIGH et al., 1991; WILLARD et al., 1994; WILLARD et al.,

1999), at our knowledge, there is no report on the plasmatic profiles of this

protein in zebu cattle. The objectives of this study where therefore (i) to

develop homologous RIA systems for PAG measurement in the plasma of

pregnant zebu females, and (ii) to characterize the time-related profile of

changes in peripheral concentrations of PAG throughout gestation and

postpartum period in the Azawak zebu breed.

2. Materials and Methods

2.1. Animals and Samples

This study was carried out in the Sudan-Sahelian zone of Burkina-

Faso (12°22’N, 1°31’W). Mean annual precipitation is 894 mm. Mean

monthly minimum and maximum temperatures range from 8 to 20°C in the

wet season (June to October) and from 26 to 39°C in the dry season

(November to May). Twelve Azawak zebu cows of mixed age and parity

were palpated per rectum and diagnosed as pregnant, being selected for this

study. All were clinically normal and with good body condition scores

(BCS 4 to 5) at the beginning of the experiment (July 1998). The BCS was

determined using a 9-point scale, as previously described by EVERSOLE

et al. (2000). The females were bred in a semi-intensive system, grazing

typical vegetation (savanna) and having free access to water and mineral

blocks. The animals were bled at 5-10 days interval approximately from

353

Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). Heparinized blood

samples (5 ml) were collected from the jugular vein. The plasma was

removed by centrifugation (1,500 x g for 15 min) immediately after

collection and stored at –20°C until assayed for PAG. Sex of offspring was

recorded at birth.

2.2. PAG Radioimmunoassays

A pure preparation of zebu PAG (SOUSA et al., 2001) was used as

standard and tracer. A rabbit antiserum (R782) raised against the same

preparation was used as the first antibody at an initial dilution of 1:150,000.

The double antibody precipitation system was composed by a mixture of

sheep anti-rabbit immunoglolobulin (0.83% v:v), normal rabbit serum

(0.17% v:v), polyethylene glycol 6000 (20 mg/ml; Vel, Leuven, Belgium),

cellulose microcrystalline (0.05 mg/ml; Merck, Darmstad, Germany) and

BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) diluted in Tris buffer

(25 mM Tris, 10 mM MgCl2 and 0.1 mg/ml neomycin sulfate; pH 7.5). Pure

stock zebu PAG (lyophilized powder) was diluted with assay buffer (Tris

containing 1 mg/ml BSA) to give standard curves ranging from 0.2 to 25

ng/ml in a preincubated system and from 0.8 to 100 ng/ml in a non-

preincubated system. The radiolabelled 125I-PAG was prepared according to

the chloramine T method (GREENWOOD et al., 1963). The first antibody

was raised in rabbits as described elsewhere (ZOLI et al., 1992).

Plasma samples were firstly assayed in the non-preincubated system.

Briefly, 0.1 ml of each sample or appropriated standard dilution were

aliquoted into duplicate assay tubes and diluted respectively with 0.1 ml and

0.2 ml of Tris-BSA buffer. To minimize nonspecific interference of plasma

354

proteins, 0.1 ml of PAG-free plasma was added to all standard tubes.

Thereafter, 0.1 ml of radiolabelled 125I-PAG (28,000 counts per min) and 0.1

ml of the diluted antiserum (R782; 1:150,000) were added and the tubes were

incubated overnight at room temperature. The following day, the double

antibody precipitation system (1.0 ml) was added to all except total count

tubes (T) and a further 30 min incubation was made at room temperature.

Bound (B) and free PAG were separated by centrifugation (1,500 g x 20 min)

after 2 washes with 2 ml of Tris-BSA buffer. The supernatants were

discarded and the radioactivity of the pellet was determined using a

Multigamma Counter (LKB Wallac 1261; Turku, Finland) with a counting

efficiency of 75%. The binding ratio of the radiolabelled 125I-PAG to the

antiserum was considered as 100% in the zero standard (B0) assay tube.

Samples with lower PAG concentrations than the estimated standard

dose at which the percentage B/B0 was 80% (ED-80) (Table 1) were

reassayed in a preincubated system in which an incubation step of 16 h (at

room temperature) was made before the addition of the radiolabelled PAG.

The next day, 125I-PAG was added and a further 4 h incubation was made

before the addition of the double antibody precipitation system.

TABLE 1 - Characteristics of the preincubated and non-preincubated RIA systems used for PAG measurement in zebu plasma samples.

System Minimum detection limit

(ng/ml)

Non-specific binding (%)

B0/T (%)

Estimated dose (ng/ml) at B/B0 20% 50% 80%

Preincubated 0.20 < 1 23 7.83 2.47 0.76 Non-preincubated 1.11 < 1 28 114.34 26.67 6.24 B0/T = Tracer bound in the zero standard / total tracer added. B/B0 = Tracer bound / tracer bound in the zero standard.

355

Samples with higher concentrations than the estimated standard dose at

which the percentage B/B0 was 20% (ED-20) (Table 1) were diluted (1/10 or

1/50) and reassayed without preincubation.

2.3. PAG Assay Validation

The minimal detection limits (MDL) of both RIA systems (Table 1)

were determined as the mean concentration minus twice the standard

deviation of 20 replicates of the zero standard. Four plasma samples with

known PAG concentrations (Table 2) were used to calculate intra-assay

and inter-assay variations in both systems (RODBARD et al., 1974).

TABLE 2 - Intra and inter-assay coefficients of variation of preincubated and non-preincubated PAG-RIA systems.

Intra-assay Inter-assay

PAG concentrationa (ng/ml)

CV (%) PAG concentrationa

(ng/ml) CV (%)

Preincubated

Sample 1 1.49 ± 0.11 7.4 1.62 ± 0.15 9.4

Sample 2 3.24 ± 0.11 3.5 3.37 ± 0.05 1.6

Sample 3 12.73 ± 0.63 4.9 12.01 ± 0.57 4.8

Non-preincubated

Sample 2 3.09 ± 0.34 11.1 3.11 ± 0.43 13.8

Sample 3 11.73 ± 0.76 6.5 11.99 ± 0.74 6.1

Sample 4 60.22 ± 4.81 8.0 53.04 ± 6.06 11.4 a(mean ± SD)

356

2.4. Data Analysis

Data are presented as mean ± standard deviation (mean ± SD). PAG

concentrations from one pregnant Azawak female (Z Sand) were considered

as abnormal after a test of comparison of means (DAGNELIE, 1975), being

excluded from further statistical analysis. PAG concentrations during

gestation and postpartum period were analyzed as a split-plot design model

where the week of pregnancy was the main-plot treatment. The main effect of

the week on PAG concentrations was tested against residual error using the

STDERR and PDIFF statements of the GLM Procedure in SAS (SAS, 2000).

Half-life for PAG was calculated as previously described by KLINDT et al.

(1979).

3. Results

3.1. PAG Assay Validation

Tables 1 and 2 summarize the characteristics of the homologous RIA

systems used to measure plasmatic PAG concentrations in zebu plasma. In

the presence of excess antibody, 83.6% of labeled zebu PAG was bound.

The displacement of standard inhibition curves was highly repeatable

ranging from 90.7 ± 2.0% to 12.5 ± 1.1% of binding in the non-

preincubated system (n=10) and from 92.2 ± 1.2% to 6.4 ± 1.0% (n=10) in

the preincubated system (Figure 1).

3.2. PAG Profiles

One of the twelve Azawak zebu cows palpated per rectum and

initially diagnosed as pregnant (Z15) showed PAG concentrations lower

than the assay sensitivity (<0.2 ng/ml) and did not calve. Ten Azawak zebu

357

females gave birth to single normal calves (3 males and 7 females).

Another zebu cow (ZSand) gave birth to an emaciated female and showed

abnormally high PAG concentrations during gestation, having their data

excluded from the general PAG profile. Clinically, this cow presented a very

low body condition score at the end of gestation (BCS 1 to 2).

Figure 1. Standard curves (mean ± SD) for PAG in the preincubated (-▼-▼-) and non-preincubated (-▲-▲-) RIA systems (B/B0 function of Log PAG concentrations).

Figure 2 shows the PAG profile during gestation and postpartum

period in 10 Azawak zebu cows. Mean weekly PAG concentration varied

significantly among the animals (P<0.0001) and the periods of pregnancy

(P<0.0005). However, the time-related variation on PAG concentration was

significant only at the end of gestation.

The mean PAG concentration increased progressively from the Week

8 to the Week 35 of gestation (from 6.0 ± 4.2 ng/ml to 196.0 ± 34.8 ng/ml).

0,1 1 10 100

PAG (ng/mL)

0

20

40

60

80

100B/Bo x 100

0,1 1 10 100

PAG (ng/mL)

0

20

40

60

80

100B/Bo x 100B/Bo x 100

PAG ng/mL

358

Thereafter, PAG concentrations remained relatively constant until Week 39

(210.8 ± 74.8 ng/ml), then they increased significantly reaching their

highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition (Week 40). After

delivery, plasma PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till

the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml). Afterwards, PAG

concentrations decreased slowly reaching the lowest levels (5.1 ± 5.2

ng/ml) at the Week 10 postpartum.

FIGURE 2 - PAG concentrations (mean ± SD) during gestation and postpartum period in plasma of 10 Azawak zebu cows. Week 40 of gestation corresponds to the Week 0 postpartum (0pp). Significant differences between weeks of gestation are indicated by asterisks (*P<0.0001, **P<0.05).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp 10pp 15pp

Weeks after fertilization and parturition

0

500

1000

1500

2000PAG (ng/mL)

* **

*

parturition↓

359

The half-life of PAG calculated after parturition was 10.1 days. When

estimated by regression equation (Figure 3), a period of 14 weeks would be

required to reach undetectable PAG concentrations (<0.2 ng/ml) in

maternal bloodstream.

FIGURE 3 - Plasmatic PAG concentrations and regression curves calculated for PAG from parturition (Week 0) to the Week 10 postpartum. Azawak zebu cows that presented clinically normal ongoing gestations (n=10) were represented by dots (●). The zebu cow presenting higher PAG levels during pregnancy with low BCS at the end of gestation (ZSand) was represented by squares (■).

3.3. Atypical PAG Profile

The PAG profile during gestation and postpartum period in the Azawak

zebu cow (ZSand) presenting high PAG concentrations during pregnancy is

given in Figure 4. From Week 10 till parturition, mean weekly concentrations

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Weeks postpartum

0

1

2

3

4

5

6

7

8Ln PAG (ng/mL)

Homogeneous populationy = -0.5095x + 7.42951

Cow ZSandy = -0.5165x + 7.67758

360

(227.6 ng/ml) were approximately 3.5 times higher than that calculated for

the other 10 females (64.1 ng/ml). The estimated PAG half-life in this cow

was 9.2 days and the clearance rate after parturition was similar to that

observed after normal gestations (14 weeks).

FIGURE 4 - PAG profile of Azawak zebu cows presenting clinically normal gestations (homogeneous population) and PAG profile of the individual cow having presented an extremely low BCS at the end of gestation (ZSand). Week 40 of gestation corresponds to the Week 0 postpartum (0pp).

4. Discussion

In this study we describe for the first time the plasmatic profiles of

PAG concentrations throughout gestation and postpartum period in zebu

females. The characteristics of two homologous RIA systems developed for

PAG measurement in peripheral circulation of zebu females were also

0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp 10pp 15pp

Weeks before and after parturition

0

200

400

600

800

1000

PAG (ng/mL)

Homogeneous population

ZSand

361

examined.

Our data showed that both preincubated and non-preincubated

homologous RIA systems developed with the use of a purified preparation of

zebu PAG (SOUSA et al., 2001) were very precise for measuring PAG

concentrations in maternal bloodstream. Intra-assay and inter-assay

coefficients of variation were relatively low (1.6 to 13.8%), being

comparable to those calculated by ZOLI et al. (1992) for the boPAG-1 RIA

(6.9 to 11.6%), and by GONZALEZ et al. (1999) for homologous and

heterologous caprine RIA systems (5.5 to 10.1%). In addition, when a same

sample was measured by both systems, PAG concentrations remained

almost the same even if presenting percentage B/B0 ratios lower than 80%

or higher than 20%. Regarding their practical application in laboratory

routine, while the preincubated system showed to be suitable to measure

lower PAG concentrations (0.8 to 7.8 ng/ml; Table 1), as observed in early

pregnancy, the non-preincubated system proved to be able to detect a larger

range of concentrations (6.2 to 114.3 ng/ml; Table 1), being very usefull for

the follow-up of PAG levels during gestation.

In both zebu and taurine taxa (ZOLI et al., 1992; PATEL et al., 1997),

PAG concentrations increased slowly from Week 8 to the Week 35 of

gestation, remaining lower than 200 ng/ml. However, while in zebu

females PAG levels remained relatively constant from Week 35 to the last

week of gestation (196.0 ± 34.8 ng/ml to 210.8 ± 74.8 ng/ml), in taurine

breeds this period corresponded to a rapid increase on PAG concentrations

(158.9 ± 60.2 ng/ml to 1,551.9 ± 589.7 ng/ml) (ZOLI et al., 1992). If the

relatively constant PAG concentrations measured in this study result from

the use of a zebu PAG preparation in our RIA systems or from genetic

362

differences between these two clades of cattle it is not known. However,

the first hypothesis is more unlikely because when different plasmatic

samples recovered at early, mid or late gestational periods were measured

by both taurine and zebu homologous RIA systems (data not shown), no

differences were found on PAG concentrations.

At parturition, zebu females reached lower PAG concentrations than

taurine cows (1,095.6 ng/ml in zebu versus 1,352.8 ng/ml to 2,462.4 ng/ml

in taurine cows) (ZOLI et al., 1992; PATEL et al., 1997). Differences on

PAG concentrations next to the parturition may be due to a variety of

factors, such as the placenta blood flow at late gestation and the placenta

mass. There is currently little information about the effect of placental

blood flow on the maternal concentration of placenta-specific hormones

(NEWNHAM et al. 1986). Nevertheless, because uterine and umbilical

blood flows were found to be smaller in zebu than in taurine breeds

(FERRELL, 1991), this hypothesis must be taken into consideration to

explain some differences on PAG concentrations.

Several authors reported an effect of placental mass on PAG

concentrations (DOBSON et al., 1993; MIALON et al., 1993; PATEL et

al., 1997). As described by MIALON et al. (1993), PSP-60 concentrations

at calving are significantly lower in taurine breeds that gave birth to small

calves (e.g. Holstein and Normande) than in those that calved larger calves

(e.g. Charolais), this difference being probably due to the differences in

placental masses and consequently in the total number of binucleate cells.

In our study, placenta mass and calf birth weights could not be recorded at

parturition. However, because liveweight of Azawak cows are considered

to varies between 300 to 410 kg (PAYNE, 1970), it can be supposed that

363

placental mass in this breed is smaller than those recorded in european

taurine breeds, justifying the lower PAG levels observed at parturition.

With regard to the postpartum period, the time expected for PAG to be

undetectable in maternal bloodstream of zebu females (14 weeks) was in

the range of those previously described by ZOLI et al. (1992) and

MIALON et al. (1993) for taurine cows (average of 11 to 17 weeks), but

longer than those estimated by KIRAKOFE et al. (1993) for postpartum

beef cows (12 weeks) and for hysterectomised beef cows (10 weeks). This

relatively long clearance rate of PAG observed in postpartum zebu cows

seems to be more likely due to the long half-life of the molecule than to the

concentrations reached at parturition, as previously argued by ZOLI et al.

(1991). PAG half-lives were consistently longer in zebu (9.2 to 10.1 days)

than in taurine cattle (7.0 to 8.8 days) (SASSER et al., 1986; SEMAMBO et

al., 1992; ALI et al., 1997). As the half-lives of glycoproteins are directly

influenced by the presence of N-linked carbohydrate and sialic acid chains on

their structures (RAFFERTY et al., 1995), it can be hypothesed that different

glycosilation patterns exist on PAG molecules extracted from zebu placentas.

However, further studies are needed to confirm this hypothesis.

During the course of this study, one Azawak cow (ZSand) presented a

very low BCS (1 to 2) and higher PAG concentrations during the last two

trimesters of pregnancy. This cow was fecundated early in the wet season

(July) and calved late in the dry season (April), when savanna typical

vegetation is scarce and with bad quality. An association between severe

energy or protein underfeeding and an increase in placental size has been well

characterized in both human (LUMEY, 1998) and ovine species (WALLACE

et al., 1997a). Furthermore, an opposite association, i.e. between higher

364

energetic levels, reduced placental size and lower peripheral PSPB

concentrations during gestation was recently demonstrated in ovine species

(WALLACE et al., 1997b). These findings support the assumption that, in

some conditions, an inadequate food intake by pregnant zebu cows could be

associated with a compensatory placental hypertrophy to assure the survival

of a developing fetus. Another contributing factor for the higher PAG levels

observed in the ZSand cow could be a reduced metabolic clearance of PAG

in the maternal circulation. However, because the PAG half-life was smaller

in this animal (9.2 days) than in the others (10.1 days), this association seems

to be improbable.

To conclude, our results indicate that plasma PAG concentrations in

zebu cattle were similar to concentrations of taurine breeds during the first

two trimesters of pregnancy, but differ in the peripartum period. In addition,

our data support the assumption that, in extreme conditions, the nutrition

status of the mother could be reflected as a sharp on peripheral concentration

of placental proteins. Better adapted to severe energy and protein

underfeeding, zebu cattle could constitute an excellent model for the

investigation of the consequences of nutritional status of the mother on the

placental synthesis of hormones and pregnancy-associated proteins.

5. Acknowledgments

This work was supported by grants from CIUF-SPA/Burkina Faso,

FNRS and Belgian Ministry of Agriculture. N.M. Sousa was supported by a

fellowship from the Brazilian Coordination of Training of Higher Educate

Graduate (CAPES/Brazil). The authors are grateful to Dr. M.A.N. for

providing the facilities. Authors thank Mrs. R. Fares for her secretariat

365

assistance.

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Documents

Noelita Melo de Sousa