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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
EMÍLIA SOUSA DE OLIVEIRA
EMERGÊNCIA DE Enterococcus sp. RESISTENTES À VANCOMICINA NA
CIDADE DO NATAL-RN
Natal 2019
Emília Sousa de Oliveira
EMERGÊNCIA DE Enterococcus sp. RESISTENTES À VANCOMICINA NA
CIDADE DO NATAL-RN
Dissertação apresentada ao Programa Pós-
Graduação em Ciências Biológicas – linha de
pesquisa Biológica Parasitária e Microbiologia,
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito para obtenção parcial do
grau de Mestre.
Orientadora: Profª Dra. Maria Celeste Nunes de
Melo
Natal 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Oliveira, Emília Sousa de.
Emergência de enterococcus sp. resistentes à
vancomicina na cidade do Natal-RN / Emília Sousa de Oliveira. - 2019.
99 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós
Graduação em Ciências Biológicas, Natal, RN, 2019. Orientadora: Profa. Dra. Maria Celeste Nunes de Melo.
1. Enterococcus - Dissertação. 2. Resistência à
vancomicina - Dissertação. 3. Cultura de vigilância -
Dissertação. 4. PFGE - Dissertação. 5. MLST - Dissertação.
6. Dispersão clonal - Dissertação. I. Melo, Maria Celeste
Nunes de. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU
615.33
Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262
Este trabalho de pesquisa foi realizado nos seguintes centros de pesquisa:
Laboratório Principal: Laboratório de Bacteriologia Médica do Departamento
Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. Sob orientação da Profa. Dra. Maria Celeste
Nunes de Melo.
Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Farmácia da Universidade de
Porto em Porto, Portugal. Sob orientação da Profa. Dra. Luíza Peixe e com auxílio da
Profa. Dra. Carla Novais e da pós-doutoranda Dra. Ana Freitas.
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho à Deus
e a minha família.
AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a Deus por ter me acompanhado em toda a
trajetória dando-me forças quando achava que não conseguiria continuar e
lembrando-me sempre que com Ele tudo é possível.
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Celeste, por acreditar em mim,
desde o momento que cheguei ao laboratório na graduação e por embarcar comigo
em mais uma etapa do meu processo de formação. E pelos vastos ensinamentos
que me fizeram conhecer melhor e amar a pesquisa.
Às professoras e pesquisadoras da Universidade de Porto, em especial a
Prof. Luíza Peixe – coordenadora do Laboratório de Microbiologia da Universidade
de Farmácia-, a Prof. Carla Novais e a pós-doutoranda Ana Feitas por aceitarem a
colaboração e por me acolherem no laboratório para a realização dos experimentos.
Que mesmo com pouco tempo de contato, puderam me ensinar muito sobre os
Enterococcus e tornaram os experimentos na Universidade de Porto uma
experiência imensurável.
A todos do LaBMed, aos que já saíram, aos que permanecem e aos que
acabaram de entrar. E principalmente aqueles que me ajudaram na realização dessa
pesquisa, em especial, as alunas de Iniciação Científica Camila e Isabelle que tive o
prazer de tutoriar.
Às técnicas do laboratório de microbiologia por estarem sempre dispostas
a ajudar nas muitas vezes que precisei utilizar algum equipamento do laboratório
escola ou mesmo em responder as minhas inúmeras dúvidas.
Aos meus pais, pela formação, sempre incentivado ao estudo e pesquisa,
pelo carinho e apoio e por serem meu alicerce nessa jornada. Aos meus irmãos por
estarem presentes em todos os momentos, mesmo longe ainda estão comigo sendo
sempre o meio alicerce. Às minhas tias e tios por me apoiarem sempre e me
incentivarem ao estudo e dedicação sendo exemplos de vida.
Aos meus amigos e colegas que foram de suma importância e essenciais
nessa caminhada. Em especial ao grupo 9 - Sara Ester, Raquel, Talita, Gustavo,
Daniel, Pedro, Marcel e Renata. Às minhas amigas de longa data Mirella, Andréa,
Maria Júlia, Stella, por estarem sempre comigo me apoiando. E às amigas Bruna
Évora e Aldemara que estiveram comigo nesse mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
CAPES, pela concessão da bolsa de estudo. Às Pró-reitoria de Pós-Graduação, a
Pró-Reitoria de Pesquisa, o Centro de Biociências e o Programa de Pós-Graduação
pelo auxílio com o envio do material biológico para os experimentos realizados na
Universidade de Porto como também com a minha ida até Porto em Portugal.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente com a minha
formação.
“Será que você não sabe? Nunca ouviu falar? O Senhor é o Deus eterno, o Criador
de toda a terra. Ele não se cansa nem fica exausto, sua sabedoria é insondável.
Ele fortalece ao cansado e dá grande vigor ao que está sem forças.
Até os jovens se cansam e ficam exaustos, e os moços tropeçam e caem;
mas aqueles que esperam no Senhor renovam as suas forças. Voam bem alto como
águias; correm e não ficam exaustos, andam e não se cansam.”
Isaías 40:28-31
RESUMO
Surtos e dispersões clonais do gênero Enterococcus resistente à vancomicina (ERV) vêm ocasionando um dos maiores problemas de saúde pública em todo o mundo. No Brasil, diversos estudos já reportaram esse cenário por ERV, sendo a maioria ocasionado pelas espécies Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. O objetivo desse estudo foi caracterizar, a nível molecular, isolados de ERV de pacientes oriundos de diferentes hospitais de Natal/RN. Foram analisados 62 isolados de cultura de vigilância e de outros espécimes clínicos de ERV de 51 pacientes de 7 hospitais, no período de dois anos (2015-2016). Os isolados foram identificados a nível de espécie por primers específicos sodA e ddl pela técnica de Reação de Cadeia em Polimerase (PCR). A susceptibilidade aos antibióticos foi avaliada por disco-difusão, fita contendo antibiótico (vancomicina) em gradiente e diluição em ágar (teicoplanina) (EUCAST, 2018; CLSI, 2018). As pesquisas para os determinantes da resistência à vancomicina (vanA/vanB) e da virulência (cylA/asa1/gelE/esp) foram analisadas pela PCR. A relação clonal foi observada pela técnica de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE) e isolados representativos dos principais clones foram também avaliados pela técnica de Tipagem por Sequenciamento de Multilocus (MLST). Sessenta e um isolados foram identificados como Enterococcus faecalis e somente um como Enterococcus faecium. A resistência à vancomicina, ciprofloxacina, tetraciclina e eritromicina foram observados em todos os isolados, e 98,4% foram resistentes à teicoplanina. A CIM para vancomicina e para a teicoplanina observada foi de 16 até ≥ 256 µg/ml e 4 até
64µg/L, respectivamente. Ademais, 88,7% (n=55) e 40,3% (n=25) dos isolados também foram resistentes à gentamicina e estreptomicina, respectivamente. Nenhum isolado foi resistente à linezolida ou ao cloranfenicol. Somente o E. faecium foi resistente à ampicilina. Todos os isolados apresentaram o gene vanA. A ocorrência dos fatores de virulência para E. faecalis incluiu gelE (98,4%; n=60), asa1 (100%; n=61), cylA (16,4%; n=10) e esp (9,8%; n=6). Dois perfis PFGE foram identificados: clone A (50,8%; n=31) e clone B (49,18%; n=30). Os MLST dos isolados representantes foram tipados como ST525 e ST6. Os dois perfis clonais foram co-circulantes nos hospitais pesquisados durante o período do estudo. Essa pesquisa destacou uma alta taxa de colonização de pacientes por E. faecalis resistente à vancomicina com operon vanA e uma disseminação silenciosa de dois clones previamente associados a infecções humanas no Brasil (ST525) e no mundo (ST6). Embora a emergência do ERV em Natal permaneça sem esclarecimento, a disseminação inter-hospitalar durante um longo período de tempo destaca a necessidade de medidas preventivas que possam conter esse cenário de potencial epidemia de infecções por ERV.
PALAVRA-CHAVES: Enterococcus resistente à vancomicina; dispersão clonal; cultura de vigilância; PFGE; MLST.
ABSTRACT
Vancomycin-resistant enterococci (VRE) clonal spread and outbreaks cause major problems in health institutions around the world. In Brazil, several available studies describe VRE outbreaks or clonal dissemination scenarios mostly involving Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. We aimed to characterize, at molecular level, the VRE recovered from patient in different hospitals of Natal. Sixty-two VRE isolates from surveillance culture and others clinical specimens were collected from 51 patients of 7 hospitals, for two years (2015-2016). Identification at the species level by specific primers sodA and ddl was performed by Polymerase Chain Reation (PCR). Susceptibility to antibiotics were assessed by disk-difusion, MIC test strip (vancomycin) and agar dilution (teicoplanin) (EUCAST, 2018; CLSI, 2018). Search of vancomycin resistance (vanA/vanB) and putative virulence (cylA/asa1/gelE/esp) genes was performed by PCR. Clonal relationship was evaluated by Pulse-filed Gel Electrophoresis (PFGE), and representative strains from main PFGE types also by Multilocus Sequence Typing (MLST). Sixty-one isolates were identified as Enterococcus faecalis and only one as Enterococcus faecium. Resistance to vancomycin, teicoplanin ciprofloxacin, tetracycline and erythromycin were observed in all isolates, and 98,4% were to teicoplanin. Vancomycin and teicoplanin MICs were 16 to ≥ 256 µg/ml and 4 to 64µg/L, respectively. In addition,
88,7% (n=55) and 40,3% (n=25) isolates were also resistant to gentamicin or streptomycin, respectively. None was resistant to linezolid or chloramphenicol. Just the E. faecium was ampicillin resistant. Operon vanA was observed in all isolates. Occurrence of E. faecalis virulence factors included gelE (98,4%; n=60), asa1 (100%; n=61), cylA (16,4%; n=10) and esp (9,8%; n=6). Two PFGE types were identified; type A (50,8%; n=31) and type B (49,18%; n=30). The MLSTs of the representative isolates were typed as ST525 and ST6. Both clones were co-circulating during the period of the study. This study highlights a high rate of patient colonization with vancomycin-resistant E. faecalis with vanA and a silent spread of two clones previously associated with human infections in Brazil (ST525) or worldwide (ST6). Although their transmission routes of this ERV in Natal remain to clarify, the inter-hospital spread during a long period of time highlight the need of preventions measures to contain a potential ERV infection epidemic scenario. KEY-WORDS: Vancomycin-resistant Enterococcus; clonal spread; surveillance culture; PFGE; MLST.
XI
LISTA ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Organização genética dos três principais operons van (VanA, VanB,
VanC), onde as setas indicam a direção da transcrição. Setas verdes: genes de
regulação; setas vermelhas: genes de resistência; setas laranjas: genes acessórios.
..................................................................................................................................... 35
Figura 2: Produto da PCR para os genes sodA, específico para a espécie E. faecalis
e ddl, específico para a espécie E. faecium. .............................................................. 50
Figura 3: Gel demonstrando os amplicons vanA e vanB, determinantes de
resistência à vancomicina. .......................................................................................... 53
Figura 4: Gel representando os amplicons para os genes de virulência pesquisados
(cylA, gelE, asa1 e esp), pela técnica de PCR. .......................................................... 53
Figura 5: Gel com os perfis de PFGE. A: isolados do clone A; B: isolados do clone B;
Seta azul: controle do clone A (Ef.71); Seta vende: controle do clone B (Ef.24). ...... 56
Gráfico 1: Perfil de resistência em porcentagem dos isolados de Enterococcus aos
antimicrobianos testados. ........................................................................................... 51
Gráfico 2: Distribuição dos determinantes da virulência pesquisados. ...................... 54
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resistência intrínseca e extrínseca dos enterococos. ............................... 28
Tabela 2: Antibióticos para avaliação do fenótipo da resistência à níveis elevados de
aminoglicosídios (HLAR). ............................................................................................ 33
Tabela 3: Características dos principais operons van. ............................................... 35
Tabela 4: Primers utilizados para confirmação da espécie dos isolados de
Enterococcus. .............................................................................................................. 41
Tabela 5: Primers utilizados para avaliar a resistência à vancomicina ...................... 44
Tabela 6: Primers para pesquisa dos genes de virulência esp, cylA, gelE e asa1. ... 45
Tabela 7: Primers utilizados na análise do MLST....................................................... 47
Tabela 8: Distribuição dos ERV em relação ao hospital de origem e as espécies
identificadas................................................................................................................. 49
Tabela 9: Perfil de susceptibilidade para o teste do fenótipo de resistência a níveis
elevados de aminoglicosídios. .................................................................................... 52
Tabela 10: Distribuição do genótipo de virulência para a espécie E. faecalis. .......... 54
Tabela 11: Distribuição dos perfis PFGE da espécie E. faecalis com relação ao
hospital de origem e determinantes de virulência. ..................................................... 57
Tabela 12: Perfil alélico encontrado após o sequenciamento por MLST e a análise
dos locus dos isolados ................................................................................................ 58
XIII
LISTA DE ABREVIAÇÕES DE SIGLAS
AAC(6’) Enzima 6’-acetiltransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APH(2’’) Enzima 2-fosfotransferase
AS Substância de agregação
ATCC American Type Culture Collection
BRCAST Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
BHI Brain Heart Infusion
CC Complexo Clonal
CCIH Comissão de Controle de Infecção Hospitalares
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical and Laboratory Stardards Institute
Cyl Citolisina
DNA Ácido Desoxirribonucleico
D-Ala D-Alanina
D-Lac D-Lactase
D-Ser D-Serina
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
ERV Enterococcus resistentes à vancomicina
Esp Proteína de superfície de enterococos
Gel Gelatinase
HLAR High-Level Aminoglycoside Resistance
IRAS Infecções relacionadas à assistência à saúde
LaBMed Laboratório de Bacteriologia Médica
LPS Lipopolissacarídeo
LPxTG Leucina-Prolina-any-Treonina-Glicina
MIC Minimal Inibitory Concentration
MLST Multilocus Sequence Typing
MMR Micro-organimos Multiressistentes
mRNA RNA mensageiro
MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
XIV
OD Origem desconhecida
OMS Organização Mundial de Saúde
PBP Penicilin Binding Protein
PCR Polimerase Chain Reaction
PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis
pH Potencial de Hidrogênio Iônico
PM Peso molecular
PYR Pirrolodonil Arilamidase
rDNA DNA ribossômico
RGD Argenina-Glicina-Aspartato
RNA Ácido Ribonucleico
rRNA RNA ribossomal
ST Sequence Types
tRNA RNA transportador
TRL Receptor Toll-like
Tn transposons
UFC Unidades Formadora de Colônias
UTI Unidade de Terapia Intensiva
VRE Vancomycin-Resistent Enterococcus
XV
LISTA DE SÍMBOLOS
µm Micrometro
°C Graus celsius
° Grau
β Beta
mg Miligrama
mL Mililitro
µL Microlitro
µg/mL Micrograma por mililitro
mg/mL Miligrama por mililitro
µL/mL Microlitro por mililitro
% Porcento
> Maior
≥ Maior igual
≤ Menor igual
= Igual
± Mais ou menos
pb Pares de base
® Marca registrada
M Mol
mM Micromol
V Voltz
U Unidade
V/cm Voltz por centímetro
rpm Rotação por minuto
U/µL Unidade por microlitro
U/mL Unidade por mililitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 18
2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................... 19
2.1 GÊNERO ENTEROCOCCUS .............................................................................. 19
2.1.1 IMPORTÂNCIA DO GÊNERO ENTEROCOCCUS ....................................................... 20
2.1.2 EPIDEMIOLOGIA DO ENTEROCOCCUS RESISTENTE À VANCOMICINA ...................... 22
2.2 FATORES DE VIRULÊNCIA DOS ENTEROCOCCUS SPP. ................................ 23
2.3 RESISTÊNCIAS ANTIMICROBIANAS EM ENTEROCOCCUS SPP. ................... 27
2.3.1 Resistências aos β-lactâmicos ............................................................ 29
2.3.2 Resistência às tetraciclinas ................................................................. 30
2.3.3 Resistência às quinolonas ................................................................... 31
2.3.4 Resistência aos macrolídeos ............................................................... 31
2.3.5 Resistência aos aminoglicosídios ....................................................... 32
2.3.6 Resistência aos glicopepitídios ........................................................... 33
2.4 DISSEMINAÇÃO CLONAL DO ENTEROCOCCUS RESISTENTE À
VANCOMICINA ........................................................................................................... 37
3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 39
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 39
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 39
4 METODOLOGIA ............................................................................................... 40
4.1 TIPO DE PESQUISA ...................................................................................... 40
4.2 AMOSTRA ..................................................................................................... 40
4.3 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS BACTERIANOS .. 40
4.4 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS .............. 42
4.5 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA ........................... 43
4.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA RESISTÊNCIA................................ 44
4.7 PESQUISA DE GENES DE VIRULÊNCIA ..................................................... 45
4.8 TIPAGEM MOLECULAR DAS CEPAS DE ENTEROCOCCUS ........................... 46
4.9 ANÁLISE POR SEQUENCIAMENTO DE MULTILOCUS .............................. 47
5 RESULTADOS .................................................................................................. 49
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................. 49
5.2 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS .............. 50
5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA ........................... 52
5.4 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA RESISTÊNCIA................................ 52
5.5 PESQUISA DE GENES DE VIRULÊNCIA ..................................................... 53
5.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL CLONAL POR TIPAGEM MOLECULAR .............. 55
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 59
7 CONCLUSÃO ................................................................................................... 67
REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ............................................................................. 68
APÊNDICE A .............................................................................................................. 87
APÊNDICE B .............................................................................................................. 90
ANEXO A .................................................................................................................... 92
18
1 INTRODUÇÃO
As bactérias do gênero Enterococcus colonizam naturalmente o trato
intestinal e o geniturinário de animais e humanos, além de estarem amplamente
distribuídas na água, no solo e nos alimentos (KONEMAN et al., 2014). Ao longo de
décadas, essas bactérias foram utilizadas na indústria de alimentos para a produção
de probióticos e como cultura de arranque (FOULQUIÉ MORENO et al., 2006).
Por muito tempo, esse gênero bacteriano foi considerado de pouca
importância clínica em comparação a outras bactérias Gram positivas tidas como
mais virulentas, como o por exemplo, a espécie Staphylococcus aureus. Porém, nos
últimos anos, os Enterococcus sp. vêm emergindo como um importante agente
patogênico. Contudo, somente com o surgimento de cepas que expressam a
resistência à vancomicina que as atenções começam a se voltar para essas
bactérias. Atualmente, os Enterococcus sp. resistentes à vancomicina – vancomycin-
resistant Enterococcus (ERV/VRE) estão entre as principais causas de infecções
nosocomiais (BRASIL, 2016; ECDC, 2012; WEINER et al., 2016), sendo
considerado uma das principais espécies bacterianas responsáveis por infecções
relacionadas à assistência à saúde (IRAS) com altas taxas de morbidade e
mortalidade.
Apesar da crescente emergência do ERV no Brasil e no mundo, ainda são
poucos os estudos regionais que apresentam a análise epidemiológica e de
similaridade genética do ERV, reforçando, dessa forma, a importância da pesquisa
de vigilância desse micro-organismo no nordeste brasileiro. A emergência de ERV
em Natal é um fato importante para a comunidade médica, uma vez que essa
resistência não era comum na região (COSTA, 2012). A caracterização genética
dessas cepas contribui para o entendimento da epidemiologia dos Enterococcus e
as suas mudanças na região da cidade do Natal no Rio Grande do Norte e auxiliar
na elaboração de medidas de controle e prevenção desses agentes.
19
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 GÊNERO Enterococcus
Esse gênero bacteriano faz parte da família Enterococcaceae e é
composto por 58 espécies descritas até o presente momento (PARTE, 2014).
Observados pela primeira vez em 1899, pelo francês Thiercelin, foram chamados de
“entérocoque” para enfatizar a sua origem entérica saprofíta (KÖHLER, 2007;
THIERCELIN, 1899). No entanto, por sua semelhança fenotípica a outros Gram
positivos, no século XX, estas bactérias pertenciam ao gênero bacteriano
Streptococcus. Somente em 1984, Schleifer e Kilpper-Bälz, utilizando-se de técnicas
moleculares de hibridização de ácido desoxiribonucleico (DNA) e de 16S DNA
ribossômico (rDNA) conseguiram distinguir o gênero Enterococcus do Streptococcus
(FOULQUIÉ MORENO et al., 2006; SCHLEIFER; KILPPER-BÄLZ, 1984).
O gênero Enterococcus é um ‘low G-C’ pertencente ao grande grupo das
bactérias Gram-positivas assim como o Staphylococus e o Streptococcus. São
patógenos oportunistas que apresentam a habilidade de colonizar e permanecer em
diversos ambientes e hospedeiros. Desse modo, podemos encontrá-lo na microbiota
do trato gastrointestinal de muitos animais desde insetos, aves, répteis até
mamíferos, incluindo o ser humano (GILMORE; LEBRETON; VAN SCHAIK, 2013;
HUYCKE; SAHM; GILMORE, 1998; KONEMAN et al., 2014; MARTIN; MUNDT,
1972; MUNDT, 1963). Nas fezes humanas, a sua concentração normalmente
encontrada pode ser de até 108 Unidade Formadora de Colônias (UFC) por grama,
já no cólon humano é possível observar até 1012 UFC por grama (GILMORE et al.,
2014; HUYCKE; SAHM; GILMORE, 1998; RICE et al., 1995). Também é possível
observá-lo colonizando a cavidade oral, a pele e o trato genitourinário, em menores
frequências (KONEMAN et al., 2014). Além disso, podem ser isolados da vegetação,
do solo e da água, muitas vezes associados a contaminação por material fecal ou
esgoto não tratado, e, em virtude disso, por anos foi utilizado como indicador de
contaminação do solo e de alimentos juntamente com outras bactérias entéricas
(GILMORE et al., 2014; HUYCKE; SAHM; GILMORE, 1998).
Os enterococos possuem a morfologia de cocos ovalados, com dimensão
variadas entre 0,6 a 2,5 µm, dispostos, normalmente, em diplococos, pequenas
20
cadeias ou mesmo como células isoladas (FACKLAM; CARVALHO; TEIXEIRA,
2002; KONEMAN et al., 2014). São aeróbios facultativos, por isso cresce tanto em
ambiente com oxigênio como com a redução do mesmo. São micro-organismos
extremamente resilientes a diferentes condições ambientais, crescem em
temperaturas variantes de 10 e 45°C, em ambientes hipertônicos – até 6,5% de
cloreto de sódio – como também em hipotônicos, em pH variante do ácido até básico
(pH entre 4 e 9,6) e resistem a 60°C por até 30 minutos (KONEMAN et al., 2014;
SHERMAN, 1937). São capazes de hidrolisar bile na presença de esculina e
produzir pirrolodonil arilamidase. Sobrevivem a concentrações elevadas de sais
biliares e azida de sódio, sendo estes utilizados como agentes seletivos para
enterococos in vitro (HUYCKE; SAHM; GILMORE, 1998; KONEMAN et al., 2014).
2.1.1 Importância do gênero Enterococcus
O fato do gênero Enterococcus apresentar capacidade de sobrevida e
adaptação em diversos tipos de ambientes, bem como pela produção de
bacteriocinas, leva ao estudo crescente de suas propriedades funcionais. Esses
micro-organismos se destacam por serem utilizados em diversas áreas como na
biotecnologia ambiental, na biorremediação de poluentes; nos tratamentos
terapêuticos com os probióticos; na indústria alimentícia com a biopreservação de
alimentos, além de cultura de arranque para produção de alimentos como queijos e
leites fermentados (FOULQUIÉ MORENO et al., 2006; FRANZ et al., 2003, 2011;
GIRAFFA, 2002; TANG et al., 2016).
Apesar disso, esse gênero bacteriano tem emergido como um importante
agente causador de infecções tanto comunitária quanto hospitalares (CETINKAYA;
FALK; MAYHALL, 2000). A maioria das infecções enterocócicas é originária da
microbiota do próprio paciente e em menor proporção podem ser transmitidas por
contato ou pelo consumo de alimentos contaminados (KONEMAN et al., 2014). As
espécies consideradas importantes agentes patógenos, por promoverem tanto a
colonização e a infecção nos seres humanos, são o Enterococcus faecalis e o
Enterococcus faecium, numa proporção de 80-90% e 10-15%, respectivamente.
(DEVRIESE et al., 1995; GILMORE et al., 2014; RUOFF et al., 1990). No Brasil, de
acordo com o boletim de avaliação dos indicadores nacionais das IRAS da Agência
21
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), sua proporção para a espécie E. faecalis
varia de 50-60%, enquanto a E. faecium oscila de 5-20% (BRASIL, 2016).
As infecções mais comuns associadas com esses patógenos são as do
trato urinário, intra-abdominais, pélvicas, bacteremias, endocardites, cutâneas,
neonatais, do sistema nervoso central e do trato respiratório (GILMORE et al., 2014;
VAN TYNE; GILMORE, 2014). Além disso, esse gênero é considerado umas das
causas mais comum de IRAS do trato urinário e de feridas, além de ser considerado
um dos maiores causadores de bacteremia nosocomial (CETINKAYA; FALK;
MAYHALL, 2000; CRISTINA et al., 2005; WEINER et al., 2016). Estudos
epidemiológicos já demostraram que eles ocupam a quarta posição nos Estados
Unidos e a quinta posição no continente europeu dos agentes etiológicos
causadores de infecções de corrente sanguínea, no entanto, apresenta uma menor
incidência na América Latina (DESHPANDE et al., 2007). No Brasil, de acordo com o
boletim da ANVISA, o enterococos ocupa a 7ª posição dos micro-organismos mais
isolados de infecções primárias da corrente sanguínea tanto das unidades de terapia
intensiva (UTI) adulta, como na pediátrica e neonatal (BRASIL, 2016). Atualmente o
ERV é considerado pela OMS como pertencente a lista das bactéria
multirresistentes de prioridade alta (TACCONELLI et al., 2018; WHO, 2017).
A ocorrência do ERV no ambiente hospitalar, já foi observado resultando
na elevação do custo direto em até três vezes, com também do tempo de internação
em 12 dias (DREES et al., 2008; SONG et al., 2003). Além do mais, estudos de
coorte já demostraram que a bacteremia por ERV resulta no aumento da taxa de
mortalidade dos pacientes em duas vezes em comparação com a taxa de pacientes
com bacteremia por Enterococcus sensíveis (EDMOND et al., 1997; SONG et al.,
2003). A maior preocupação em torno da aquisição de infecções nos hospitais por
esse gênero está relacionada a pacientes com a presença de dispositivos invasivos
como cateter e ventilação mecânica; após procedimento cirúrgicos; além de já
colonizados por ERV (PITTET et al., 2008). Já foi observado que pacientes
colonizados apresentam altas taxas para desenvolverem infecções decorrentes
desses micro-organismos (DREES et al., 2008).
22
2.1.2 Epidemiologia do Enterococcus resistente à vancomicina
O primeiro ERV foi reportado em 1988, em uma cultura de vigilância de um paciente
com leucemia linfocítica aguda, na França (LECLERCQ et al., 1988). No mesmo
ano, outro ERV foi isolado na Inglaterra (UTTLEY et al., 1988). A posteriori, diversos
casos de surtos e dispersões clonais foram e ainda são reportados ao redor do
mundo em todos os continentes (ALOTAIBI; BUKHARI, 2017; ANTALEK et al., 1995;
BELL; PATON; TURNIDGE, 1998; BONTEN et al., 1996; BOYCE et al., 1994;
FRIEDEN et al., 1993; GORDTS et al., 1995; HANDWERGER et al., 1993; LIU et al.,
2011; LIVORNESE et al., 1992; LOCHAN et al., 2016; MURRAY et al., 1992;
SIVERTSEN et al., 2016; TIMMERS et al., 2002). No Brasil, o ERV foi reportado no
ano de 1998, na cidade de Curitiba, dez anos após o primeiro isolado no mundo
(DALLA COSTA et al., 1998). Posteriormente, outros isolados foram reportados por
diversas cidades do Brasil, concentrando-se principalmente na região Sul e Sudeste
(CORREA et al., 2015; RESENDE et al., 2014; RIBAS et al., 2007; SACRAMENTO
et al., 2016; ZANELLA et al., 1999, 2006). E somente em 2006, o primeiro isolado de
ERV do Nordeste foi descrito em Recife, Pernambuco (VILELA et al., 2006). Nos
últimos anos, o ERV vem sendo reportado e estudado em outros estados do
nordeste brasileiro como na Bahia, no Ceará e em Pernambuco (COELHO et al.,
2011; FREITAS, 2018; MENEZES et al., 2015; NUNES; CAMPELO; XIMENES,
2017; PINTO et al., 2011; PORTO et al., 2013). No estado do Rio Grande do Norte,
o único relato do ERV ocorreu em 2012 em estudo de caracterização das infecções
enterocócicas da região, o qual identificou um amostra com E. faecium com vanA
(COSTA, 2012). Nenhum outro relato foi reportado.
23
2.2 FATORES DE VIRULÊNCIA DOS Enterococcus spp.
Os fatores de virulência dos enterococos estão intimamente relacionados
a colonização, infecção e permanência nos ambientes bióticos e abióticos. Em
decorrência desses fatores, esse gênero bacteriano apresenta a habilidade de se
estabelecer em ambientes inóspitos, como por exemplo, apresentando altas
temperaturas e com alta concentração de sal (MURRAY, 1990). Além disso, estudos
já demostram que são tolerantes ao cloro, aos desinfetantes e as soluções
alcoólicas utilizadas em hospitais, deste modo, capazes de persistir no ambiente e
nos equipamentos médicos (KEARNS; FREEMAN; LIGHTFOOT, 1995; PIDOT et al.,
2018). Contudo, comparativamente com outros patógenos do grupo das Gram
positivas, o Enterococcus possui uma pequena quantidade de fatores de virulência.
A colonização bacteriana ocorre quando o microrganismo está presente
na superfície do corpo, como na pele, na boca, no intestino, sem resultar em
infecções ou danos ao hospedeiro. Sabe-se pouco, até o momento, sobre os
mecanismos utilizados pelo enterococos para a colonização natural do trato
gastrointestinal dos indivíduos (GILMORE et al., 2014). Contudo, a exposição do
organismo à pressão seletiva dos antibióticos resulta na modificação da microbiota e
facilita a colonização pelo ERV. Estudo já demostrou que, em modelo animal, a
redução da população entérica das Gram negativas ocasiona a diminuição da
produção da proteína antimicrobiana intestinal RegIIIγ pelas células paneth,
acarretando no crescimento populacional dos ERV (BRANDL et al., 2008). Os
componentes bacterianos como flagelo, lipossacarídeo (LPS) e o ácido lipoteicóicos
são reconhecidos pelos seus receptores Toll-like (TLR) e Nod das células intestinais
e estimulam a produção das proteínas antimicrobianas. Já observado que a
expressão da proteína RegIIIγ foi restaurada após o tratamento com a TLR4 -
agonista ao LPS - ou TLR5 – agonista da flagelina, proteína presente no flagelo
bacteriano -, e como consequência, proporcionou o restauro do sistema de defesa
imune inata e a restrição da colonização pelos Enterococcus resistentes
(KINNEBREW et al., 2010). Além disso, a recolonização da microbiota intestinal, em
ratos, já demostrou ocasionar a redução significativa da população do ERV (UBEDA
et al., 2013).
24
A colonização intestinal pelos enterococos resistentes suscita no
carreamento silencioso desses micro-organismos por longos períodos, o que
favorece a disseminação de cepas adaptadas por transferência horizontal através do
contato direto entre os pacientes, como também pelo contato com os profissionais
de saúde (BALDASSARRI et al., 2005; TORNIEPORTH et al., 1996). Outra forma de
transmissão menos frequente é em virtude da contaminação dos equipamentos
médicos (LIVORNESE et al., 1992).
Cepas mais adaptadas ao ambiente hospitalar apresentam, muitas vezes,
além dos genes de resistência aos antibióticos, genes de virulência que ocasionam o
aumento da gravidade das infecções bacterianas. Estes fatores, relacionados a
adesão, invasão tecidual e evasão do sistema imune, são localizados tanto na
superfície celular, como também, são proteínas secretadas (VAN TYNE; GILMORE,
2014). Dentre os vários fatores de virulência estudados para o enterococos podemos
destacar: a proteína de superfície do enterococos, as substâncias de agregação, a
gelatinase e a citolisina.
A proteína de superfície de enterococos (Esp) é codificada pelo gene esp
da ilha de patogenicidade-Esp. É uma proteína ancorada ao domínio LPxTG
(Leucina-Prolina-any-Treonina-Glicina) da superfície da membrana celular e, em sua
estrutura, apresenta uma região central composta por unidades repetidas in tandem
que permite conformações alternativa como resultados de adições ou deleções
dessas unidades. Desse modo, pode servir como um braço retrátil que se estende
através da parede celular, facilitando, assim, a evasão ao sistema imune. (GILMORE
et al., 2014; HENDRICKX et al., 2009; SHANKAR et al., 1999). Além disso, a Esp
contribui para a adesão tecidual e a formação do biofilme, sendo estes dois fatores
importantes para a sobrevida e persistência do enterococos (TOLEDO-ARANA et al.,
2001). Como também, está presente nas linhagens mais adaptadas ao hospital,
tanto na espécie E. faecalis como na E. faecium, detectado em abundância em
isolados de bacteremia e endocardites, no entanto raro quando isolados de
indivíduos saudáveis (KAYAOGLU; ØRSTAVIK, 2004; SHANKAR et al., 1999;
TOLEDO-ARANA et al., 2001).
As substâncias de agregação (AS) são um grupo de proteínas, adesinas,
ancoradas a superfície bacteriana, responsivas a feromônio e codificadas pelos
genes asa1, asc10, asp1 presentes em plasmídeos conjugativos – pAD1, pCF10 e
25
pPD1, respectivamente (DUNNY, 2013; HENDRICKX et al., 2009). As expressões
dessas proteínas são induzidas por um sinal químico autocrino produzido por outras
células no quorum sensing. Essas proteínas apresentam uma sequência sinal na
região N-terminal, uma região C-terminal ancorada a LPxTG, dois domínios RGD
(Argenina-Glicina-Aspartato) e uma região de ligação ao ácido lipoproteíco
(HENDRICKX et al., 2009). Elas atuam na adesão facilitando o contato entre as
células doadora e receptora no primeiro estágio (formação de par do acasalamento)
da conjugação bacteriana, como também, é imprescindível na ligação aos
componentes da matriz extracelular, ligando-se a fibrina, fibronectina e
trombospondina (ROZDZINSKI et al., 2001). Ademais, contribui para a formação do
biofilme. A região RGD age mediando a adesão e a internalização bacteriana em
célula eucarióticas, além de favorecer para a evasão do sistema imune (GALLI;
LOTTSPEICH; WIRTH, 1990; GILMORE et al., 2014; KAYAOGLU; ØRSTAVIK,
2004). Estudos já demostraram que as AS são prevalentes tanto em isolados
clínicos, principalmente de endocardites, como também de amostras fecais de
pacientes em hospitais, no entanto são raras no ambiente comunitário (HENDRICKX
et al., 2009; KAYAOGLU; ØRSTAVIK, 2004; KREFT et al., 1992). A sua presença
contribui para a colonização do trato gastrointestinal através da sua habilidade de
ligar-se à células epiteliais (KREFT et al., 1992; VAN TYNE; GILMORE, 2014).
A gelatinase (Gel) é uma enzima extracelular zinco-metaloproteolítica
codificada pelo gene gelE e regulado pelo sistema fsr do quorum sensing
dependente do feromônio de ativação da biossíntese da gelatinase, presentes no E.
faecalis. Pertence à família metaloproteína da matriz e apresenta uma capacidade
de hidrolisar gelatina, fibrinogênio, colágeno, caseína, hemoglobina, insulina e outros
peptídeos bioativos (GAO; HOWDEN; STINEAR, 2018). Possui um importante papel
na morte celular durante o processo de formação do biofilme, como também na
evasão ao sistema imune por clivagem dos componentes do sistema complemento
(PARK et al., 2008; THOMAS et al., 2009). Já demostrado, em modelo animal, que
essa enzima está relacionada a gravidade da endocardite pelo enterococos
(THURLOW et al., 2010).
A citolisina (Cyl) pertence à classe das lantibiótico das bacteriocinas
sendo expressas em diversas cepas de E. faecalis. É uma toxina bacteriana que
atua contra todas as espécies das Gram positivas, além da sua capacidade de lisar
26
eritrócitos, e outras células eucarióticas, contribuindo para a gravidade da infecção
(ROUX; PAYNE; GILMORE, 2009; VAN TYNE; GILMORE, 2014; VAN TYNE;
MARTIN; GILMORE, 2013). Ela é codificada pelo operon cyl, composto por um
conjunto de oito genes (cylR1, cylR2, cylLL, cylLS, cylM, cylB, cylA e cyII), que pode
estar presente tanto em ilha de patogenicidade como também em transposon
responsivo à feromônio, como o pAD1 (COBURN; GILMORE, 2003; VAN TYNE;
MARTIN; GILMORE, 2013). A citolisina é composta por duas subunidades CylLL e
CylLS, que são ativadas pela CylA (GILMORE et al., 2014). Essa toxina apresenta
importantes papéis na patogenicidade do Enterococcus. Suas funções são a
eliminação de outras bactérias, a produção de dano tecidual e consequente invasão
da corrente sanguínea, como também a lise de linfócitos contribuindo para evasão
do sistema imune (KAYAOGLU; ØRSTAVIK, 2004; VAN TYNE; MARTIN; GILMORE,
2013).
27
2.3 RESISTÊNCIAS ANTIMICROBIANAS EM Enterococcus spp.
A resistência genética à substâncias danosas é um processo natural de
proteção de algumas espécies bacterianas que, em alguns casos, foram
predeterminados há milhões de anos (BARLOW; HALL, 2002; LEBRETON et al.,
2017). Contudo, o uso excessivo e indiscriminado dos antibióticos tanto no
tratamento de infeções humanas como na pecuária resultou no aumento
exponencial da taxa de resistência. Atualmente, a resistência bacteriana é
considerada um dos maiores problemas relacionados à saúde pública associados à
morbidade e à letalidade.
A resistência bacteriana aos antimicrobianos pode ter origem intrínseca a
espécie como também pode ser adquirida. O termo resistência inerente ou intrínseca
é utilizando quando a propriedade está presente em todos ou na grande maioria dos
isolados da espécie, sendo, normalmente uma característica cromossomial
(MURRAY, 1990). Já a resistência adquirida pode ocorrer tanto por mutação de uma
porção genética já existente como por aquisição de elementos genéticos móveis,
como plasmídeos e transposons. Outro termo que também pode ser utilizado é a
tolerância natural a alguns antimicrobianos, implicando na inibição do micro-
organismo dependendo da concentração do agente, contudo somente em altas
concentrações é possível ter ação bactericida (KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014)
O ambiente hospitalar fornece um ambiente ideal para a supressão ou
eliminação das cepas susceptíveis à antibióticos e ocasiona a seleção de micro-
organismos resistentes, ademais promove a disseminação da resistência intra e
inter-espécies, como também a dissipação de clones nosocomiais (MURRAY, 1990).
A sobrevida do gênero Enterococcus nesse ambiente está relacionada com a
presença da resistência intrínseca a uma grande variedade de antibióticos utilizados
na rotina clínica (CETINKAYA; FALK; MAYHALL, 2000). Além do mais, a sua grande
plasticidade genômica facilita a aquisição e a transferência de genes de resistência
aos antimicrobianos (CLEWELL, 1990; MURRAY, 1990). As principais resistências
do enterococos tanto intrínsecas como extrínsecas estão resumidas na tabela 1. Os
principais mecanismos de resistência adquirida às classes dos β-lactâmicos, das
tetraciclinas, das quinolonas, dos macrolídeos, dos aminoglicosídios e dos
28
glicopeptídios, encontrados no gênero dos enterococos, serão resumidos nos
subitens a seguir.
Tabela 1: Resistência intrínseca e extrínseca dos enterococos.
Antimicrobiano Espécies mais comuns Mecanismo de resistência
Resistência intrínseca
β-lactâmicos Todas as espécies Baixa afinidade às Proteínas Ligadoras de Penicilina (PBP); • Penicilinas -Baixos
concentrações
• Carbapenêmicos
• Cefalosporinas Aminoglicosídios
• Baixas concentrações
Todas as espécies Permeabilidade reduzida da parede celular.
• Concentrações moderadas
E. faecium Produção da enzima cromossomal AAC(6’)li.
Lincosamidas, clindamicina e Estreptograminas A
E. faecalis Bomba de efluxo da família ABC, codificado pelo gene lsa
Estreotogramina B – baixas concentrações
E. faecium Bomba de efluxo da família ABC, codificado pelo gene msrC
Sulfanamidas e Trimetropim
Todas Utilização de ácido fólico pré-sintetizado.
Glicopeptídios (baixo nível) E. gallinarum, E. casseliflavus
Produção de precursores do peptidoglicano (D-Ala-D-Ser).
Resistência adquirida
Ampicilina - alto concentrações
E. faecium, E. hirae Superprodução ou alterações da PBP4 ou 5.
E. faecalis Β-lactamase (rara). Aminoglicosídios – altas concentrações
E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus
Produção de enzima modificadoras do aminoglicosídeo; AAC(6’)-APH(2’’). Alteração ribossomal;
Macrolídeos Maioria dos enterococos Metilação ribossomal. Cloranfenicol E. faecium, E. faecalis CAT codificando enzimas. Tetraciclina E. faecium, E. faecalis Modificação de proteína
ribossomal; Bomba de efluxo.
Quinolonas E. faecium, E. faecalis Alterações na DNA girase e Topoisomerase IV; Bomba de efluxo.
Glicopeptídios – altas concentrações
E. faecium, E. faecalis Modificação do sítio alvo.
Oxazolidinonas E. faecium, E. faecalis Mutação no gene 23S ou 16S RNA ribossômico (rRNA); Metilação da rRNA (enzima Cfr); Bomba de efluxos (protetores ribossomais).
Daptomicina E. faecium, E. faecalis Alteração das proteínas de ligação na membrana.
Adaptado de TOP; WILLEMS; BONTEN, 2008.
29
2.3.1 Resistências aos β-lactâmicos
Os β-lactâmicos constituem a maior classe farmacológica de
antimicrobianos além de ser a mais amplamente utilizadas no tratamento de
infecções bacterianas, tanto por Gram positivas como por Gram negativas. Esta
classe de fármacos atua na parede celular das bactérias, mais especificamente, liga-
se as Proteínas Ligadoras de Penicilina (PBPs), ocasionando a inativação da enzima
da transpeptidase e interferindo na síntese dos peptídeos de mureína
(peptídeoglicanos) da parede celular. Quimicamente, o anel β-lactâmicos define esta
classe, esse anel é análogo ao dipeptídeo D-Alanina-D-Alanina (D-Ala-D-Ala) e sua
ligação covalente à transpeptase resulta na inibição enzimática irreversível e
posteriormente a autólise e morte celular das células em divisão. (KASMAR;
HOOPER, 2009; KONEMAN et al., 2014). Essa classe está dividida em quatro
famílias que diferem estruturalmente: as penicilinas, as cefalosporinas, os
monobactâmincos e os carbapenêmico.
Os enterococos apresentam intrinsicamente susceptibilidade reduzida
aos β-lactâmicos por expressar PBPs com baixa afinidade a essa classe de
antibióticos. Fato comumente observada na espécie E. faecium, pois apresentam o
gene pbp5 que produz uma proteína com baixa afinidade a ampicilina e
cefalosporinas. Desse modo, essa classe farmacológica não pode ser administrada
de forma isolada. (MILLER; MUNITA; ARIAS, 2014). A resistência total do gênero a
essa classe é consequência da aquisição de genes de resistência ou mutação,
sendo as duas maneiras por alteração nas PBPs (PBP4 e 5) ou por produção de
enzimas β-lactamases. A resistência à penicilina e à ampicilina, normalmente, é
atribuída a enzima β-lactamases, e quase exclusivamente descrito na espécie E.
faecalis com a aquisição do operon da espécie S. aureus (GILMORE; SHEPARD,
2002).
Até 2006, o Clinical and Laboratory Stardards Institute (CLSI)
recomendava que os resultados obtidos tanto para a ampicilina como para penicilina
poderiam predizer a resistência às demais penicilinas, no entanto, começou a
observar isolados de enterococos com fenótipos de resistência à penicilina e
sensibilidade à ampicilina (METZIDIE et al., 2006). Por tanto, as normas atuais são
30
que a resistência à ampicilina prediz à resistência à penicilina, contundo o inverso
não é verdadeiro (BRCAST, 2018; CLSI, 2018; EUCAST, 2018).
2.3.2 Resistência às tetraciclinas
A tetraciclina é uma classe de antibióticos bacteriostáticos de amplo
espetro amplamente utilizados na clínica. Algum dos fármacos que constituem essa
classe são a tetraciclina, doxiciclina, minociclina, metaciclina, entre outros. Essa
classe farmacológica age ligando-se reversivelmente ao RNA ribossomal (rRNA)
16S da subunidade 30S, ocasionando a inibição da síntese proteica por bloqueio da
junção do anticódon de RNA transportador (tRNA) – aminoacil tRNA - ao códon do
RNA mensageiro (mRNA) (RYOU; COEN, 2009; SCHNAPPINGER; HILLEN, 1996).
A penetração desses fármacos nas células bacterianas depende da
difusão passiva por porinas e do transporte ativo através da membrana. Por
consequência disso, a resistência a essa classe ocorre normalmente em virtude do
aumento do efluxo ou por redução do influxo. As bombas de efluxo são os
mecanismos mais difundidos e mais eficientes na resistência a tetraciclina. Outros
mecanismos que conferem resistência são a produção de proteínas que interferem
na ligação ao sítio alvo e a inativação enzimática do agente (MILLER; MUNITA;
ARIAS, 2014; RYOU; COEN, 2009).
A resistência à tetraciclina nos enterococos é resultante de múltiplos
genes que mediam tanto produção de bomba de efluxos como também protetores
ribossomais (GUZMAN PRIETO et al., 2016). As bombas de efluxo mais comuns
desse gênero são codificadas pelos genes tetL e tetK, eles são plasmidiais e
codificam uma proteína transmembrânica que conferem resistência à tetraciclina,
mas não à minociclina (CHOPRA; ROBERTS, 2001). Os genes das proteínas
protetoras ribossomais são tetM, tetO e tetS, sendo esses transferíveis por
transposons, e conferem resistência tanto à doxiciclina, à minociclina como também
à tetraciclina (BENTORCHA; DE CESPÉDÈS; HORAUD, 1991; MILLER; MUNITA;
ARIAS, 2014; PEPPER et al., 1987).
31
2.3.3 Resistência às quinolonas
A classe das quinolonas constitui um importante grupo, elas são agentes
de amplo espectro que atuam inibindo a topoisomerase II (DNA girase) e
topoisomerase IV, sendo essas responsáveis pelo início da transcrição do DNA
(MILLER; MUNITA; ARIAS, 2014; RYOU; COEN, 2009). Esses fármacos podem
apresentar ação bacteriostática em baixa concentração, no entanto, em altos níveis,
elas convertem rapidamente as topoisomerases e ocasionam a lesão do DNA e a
morte celular. As quinolonas mais conhecidas são o ácido nalidíxido, a
ciprofloxacina, a ofloxacina, a levofloxacina como também as fluroquinolonas.
O enterococos possui baixo nível de resistência intrínseca as quinolonas,
no entanto resistência a altas concentrações ocorre através da aquisição de alguns
genes (MILLER; MUNITA; ARIAS, 2014). Mutação nos genes gyrA e parC já foram
descritos como causadores dessa modificação no fenótipo, isso resulta na alteração
da região de determinante da resistência as quinolonas, levando a diminuição da
afinidade do sítio alvo com o fármaco (LÓPEZ et al., 2011; RICE, 2012). Outro
mecanismo já reportado é a produção de bomba de efluxo (MILLER; MUNITA;
ARIAS, 2014; RICE, 2012). O último mecanismo é a produção de enzimas sendo um
exemplo delas codificadas pelo gene qnr, presentes na porção plasmidial do
genoma (ARSÈNE; LECLERCQ, 2007).
2.3.4 Resistência aos macrolídeos
Os antibióticos da classe dos macrolídeos estão inseridos nesse grupo
por apresentarem anéis lactona fixados a desoxiaçúcares. Eles possuem ação
bacteriostática que agem inibindo a síntese proteica pelo bloqueio da translocação
tendo como sítio alvo o rRNA 23S, subunidade 50S (RYOU; COEN, 2009). O seu
agente mais conhecido é a eritromicina. Juntamente com a licosamida e
estreptogramina, os macrolídeos constituem uma terapia alternativa nos casos de
infecções insidiosas por Enterococcus. Contudo o uso da classe como medicamento
não é fácil em virtude da crescente taxa de bactérias resistentes, sendo estas,
normalmente, decorrente de genes plasmidiais.
32
A resistência adquirida nas bactérias Gram positivas ocorre por três
mecanismos principais. A alteração pontual do sítio alvo é um deles, acontece na
subunidade 23S do rRNA, conferindo, assim, resistência cruzada tanto aos
macrolídeos como a licosamidas e estreptogramina. Outro mecanismo são as
bombas de efluxos que resultam na diminuição intracelular da concentração do
agente, alguns genes podem estar envolvidos como os genes mefA, mefE, mreA –
associados à resistência aos macrolídeos – e msrA – associado à resistência aos
macrolídeos e estreptogramina. O terceiro é por inativação enzimática que constitui
o mecanismo mais comum em Gram positivos, tem o objetivo de metilar o ribossomo
resultando na diminuição da afinidade ao agente, um exemplo é a metilase
decodificada pelo gene erm, reportada em Enterococcus (PORTILLO et al., 2000;
RYOU; COEN, 2009).
2.3.5 Resistência aos aminoglicosídios
O aminoglicosídio é uma classe farmacológica com propriedades
bactericidas caracterizada por apresentar um grupo amino e um grupo glicosídio.
Fármacos dessa classe agem na subunidade ribossomal ligando-se ao rRNA 16S da
subunidade 30S resultando na inibição da síntese proteica. Em baixas
concentrações, induzem a leitura incorreta do mRNA durante o alongamento por
ligação incorreta do anticódon de tRNA levando a produção de proteínas aberrantes
(DAVIS, 1987; KRAUSE et al., 2016). Em altas concentrações, o agente causa a
inibição completa da síntese de proteínas. De acordo com o modelo de Davis do
mecanismo de ação do aminoglicosídio, tanto em baixa como alta concentrações
resulta na morte celular, diferente dos outros inibidores da síntese proteica (DAVIS,
1987).
Essa classe inclui fármacos amplamente utilizados como estreptomicina,
gentamicina, amicacina, tobramicina, neomicina entre outros. Os mais utilizados em
virtude da sua baixa toxicidade são gentamicina, amicacina e tobramicina.
O gênero Enterococcus possui resistência inerente à baixos
concentrações dessa classe farmacológica em decorrência da absorção ineficiente
do agente por permeabilidade reduzida da membrana celular. Por esse motivo que
essa classe sempre é utilizada em sinergismos com inibidores da síntese da parede
33
celular, como os β-lactâmicos ou os glicopeptídios, com o intuito de aumentar a
permeabilidade da membrana (GILMORE; SHEPARD, 2002; MOELLERING;
WENNERSTEN; WEINBERG, 1971; ZARRILLI et al., 2005). A espécie E. faecium
apresenta resistência a concentrações moderadas de aminoglicosídios por produção
cromossomial da enzima 6’-acetiltransferase (AAC-6’) (COSTA et al., 1993; TOP;
WILLEMS; BONTEN, 2008). A resistência à altas concentrações a esses fármacos
ocorrem por aquisição plasmidial de genes que conferem a produção de enzimas
modificadoras dos aminoglicosídios, sendo estas a AAC-6’ ou a enzima 2-
fosfotransferase (APH-2”) (GILMORE; SHEPARD, 2002; LECLERCQ et al., 1992).
Na rotina laboratorial, para averiguação da resistência à classe dos
aminoglicosídios, de acordo com os CLSI os únicos fármacos testados são a
gentamicina e estreptomicina, pois eles agem como marcadores para os agentes da
classe (KOLAR et al., 2006). Cepas que apresentam resistência à gentamicina são
consideradas resistentes os demais fármacos da classe, com exceção da
estreptomicina. Resultados e interpretações para os testes de susceptibilidade aos
aminoglicosídios estão sumarizados na tabela 2.
Tabela 2: Antibióticos para avaliação do fenótipo da resistência à níveis elevados de aminoglicosídios (HLAR).
GEN (120 µg) EST (300 µg) Interpretação
Sensível Sensível Cepa não apresenta HLAR.
Sensível Resistente HLAR para estreptomicina, sensível para os
demais.
Resistente Resistente HLAR à todos os da classe.
Resistente Sensível HLAR à todos da classe, exceto à
estreptomicina.
HLAR – High-level aminoglycosides resistance (resistência a altos níveis de aminoglicosídeos). Adaptado de Kolar e colaboradores, (2006).
2.3.6 Resistência aos glicopepitídios
A classe dos glicopeptídios apresenta ação bactericida contra as
bactérias Gram positivas, principalmente em infecções por S. aureus, Enterococcus
34
spp. e Clostridium difficile (BINDA; MARINELLI; MARCONE, 2014). Esses fármacos
agem através do impedimento da síntese da parece celular bacteriana, ligando-se à
extremidade terminal D-Ala-D-Ala da cadeia lateral da unidade de monômeros de
mureína. Ele sequestra o substrato da transpeptidação e transglicosilação e
interrompe a formação do peptídeoglicano, desestabilizando a integridade da parede
e ocasionando a morte celular por lise osmótica (BINDA; MARINELLI; MARCONE,
2014; COURVALIN, 2006). A vancomicina e a teicoplanina pertencem a primeira
geração dessa classe. Em decorrência da toxicidade, principalmente da
nefrotoxidade, em via de regra, são utilizados somente em casos de infecções com
micro-organismos resistentes à outras classes (KASMAR; HOOPER, 2009).
Tanto a teicoplanina como a vancomicina possuem uma ação semelhante
contra as Gram-positivas, contudo a teicoplanina apresenta um potencial melhor
quando administrado em isolados do gênero Staphylococcus, Streptococcus e
Enterococcus (CYNAMON; GRANATO, 1982). A diferença básica, entre os dois
fármacos, aparenta estar relacionado a conformação do agente. A teicoplanina é um
lipoglicopeptídio enquanto a vancomicina é um composto glicopeptídio não lipídico,
desse modo, a teicoplanina tem a capacidade de ancorar a membrana celular, já o
outro é distribuído amplamente nas camadas dos peptídoglicanos (BEAUREGARD
et al., 1995; BINDA; MARINELLI; MARCONE, 2014; WESTWELL; GERHARD;
WILLIAMS, 1995). Além disso, diversas outras hipóteses estão associadas a
diferença entre as duas. Foi visto que a vancomicina ativa genes regulatórios
(sensor quinase VanS) associados a expressão de genes de resistência à
vancomicina e não à teicoplanina, e mutações nesses genes regulatórios podem
acarretar na resistência à teicoplanina (ARTHUR et al., 1997; BAPTISTA et al.,
1996, 1999; BINDA; MARINELLI; MARCONE, 2014; EVERS; COURVALIN, 1996).
A resistência do enterococos a essa classe farmacológica ocorre pela
alteração no sítio alvo. O D-Ala é modificado para o D-Lactato (D-Lac) ou D-Serina
(D-Ser) dependendo do gene de resistência presente genoma bacteriano. Essa
modificação altera a região terminal da cadeia lateral ocasionado a diminuição da
afinidade entre o complexo antibiótico-percursor por quebra de uma ligação de
hidrogênio da interação (COURVALIN, 2006). Diversos genes já foram descritos
associados a resistência aos glicopeptídios, sendo eles vanA, vanB, vanC, vanD,
vanE, vanG, vanL, vanM e vanN. Contudo, somente dois desses (vanA e vanB)
35
apresentam um impacto clínico importante por sua grande disseminação no
ambiente hospitalar, além de serem associados a transferência inter e intra-espécies
(CATTOIR; LECLERCQ, 2013; GUZMAN PRIETO et al., 2016).
Dos diversos genes já descritos associados a essa resistência, diferem
fenotípica e geneticamente. Basicamente suas alterações estão relacionadas a
enzima ligase produzida, o grau de resistência à vancomicina, a indução da
expressão pela teicoplanina e o arranjo estrutural dos genes (GILMORE et al., 2014;
MURRAY, 1998). As características dos três principais operons estão sumarizados
na tabela 3 e sua estrutura genética pode ser observada na figura 1.
Tabela 3: Características dos principais operons van.
VanA VanB VanC
Operon vanA vanB vanC
Localização Plasmídio (Tn1546) Plasmídio (Tn1547) Cromossomo
Expressão Induzível Induzível Constitutiva
Vancomicina Resistente Resistente Resistente
Teicoplanina Resistente Sensível Sensível
Ligase D-Lac D-Lac D-Ser
Figura 1: Organização genética dos três principais operons van (VanA, VanB, VanC), onde as setas indicam a direção da transcrição. Setas verdes: genes de regulação; setas vermelhas: genes de resistência; setas laranjas: genes acessórios.
36
Os operons Van apresentam um módulo regulador, responsável por
detectar a presença dos glicopeptídios e, através de um sistema de transdução de
sinal, ativar a expressão do gene de resistência; produz enzimas precursoras de
modificadores de peptídeosglicanos; e D, D-carboxipeptidases que cliva o peptídeo
naturalmente sintetizado pela maquinaria da célula (GILMORE et al., 2014).
O fenótipo VanA é caracterizado por conferir um alto nível de resistência à
vancomicina como também à teicoplanina. O seu operon é normalmente codificado
em transposons (Tn1546, geralmente), que possui sete regiões de leitura aberta
(Figura 1) e dois promotores. Ele apresenta uma região reguladora com dois
componentes: VanR que age regulando a resposta e o VanS (sensor quinase). A
indução da expressão da resistência é ocasionada pela presença do glicopeptídio,
ele é reconhecido pela proteína transmenbrânica codificada pelo vanS, o qual
fosforila a região reguladora vanR. A etapa seguinte após a indução da resistência é
a codificação de uma desidrogenase pela região vanH que permite a produção da D-
Lac a partir do piruvato. O gene vanA produz uma ligase que permite a adição do D-
Lac produzido ao D-Ala. Contudo, antes dessa ligação, as regiões VanX e VanY
produzem peptidases que agem clivando o peptídeo terminal (D-Ala). A região vanZ
codifica uma proteína que não teve sua função elucidada até o momento, no entanto
aparenta estar ligada a resistência à teicoplanina (ELIOPOULOS; GOLD, 2001;
MILLER; MUNITA; ARIAS, 2014; ZIRAKZADEH; PATEL, 2006).
Isolados com o fenótipo VanB demostra normalmente resistência
moderada até alta à vancomicina, contudo não é induzido por teicoplanina.
Geralmente esse operon está contido em transposons (Tn1547), contudo podem
aparecer em plasmídeo ou mesmo no cromossoma. A sua organização genética é
bem similar ao VanA, no entanto apresentam alguns diferença (figura 1). Uma delas
é que o VanB possui o genes acessório homólogo ao VanZ, o VanW – seu papel
também não foi totalmente elucidado (GILMORE et al., 2014; MILLER; MUNITA;
ARIAS, 2014). Diferentemente dos outros dois, o VanC é cromossomial e sua
principal diferença é o peptidoglicano produzido, em vez de produzir D-lac como os
demais, ele expressa a D-ser (Tabela 3) (CATTOIR; LECLERCQ, 2013; GILMORE
et al., 2014; LECLERCQ et al., 1992).
37
2.4 DISSEMINAÇÃO CLONAL DO Enterococcus RESISTENTE À
VANCOMICINA
As técnicas de tipagem molecular foram criadas para identificar os
padrões genético dos isolados que circulam e auxiliar no entendimento da sua forma
de dispersão e transmissão. Desse modo, a análise do genoma bacteriano é
recomendada para comensurar o grau de similaridade entre os isolados estudados
e, desse modo, detectar precocemente a sua capacidade epidêmica. Diversas
técnicas são utilizadas para essas avaliações, sendo consideradas padrões ouro a
Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE) e a Tipagem por Sequenciamento de
Multilocus (MLST) (WERNER, 2013).
A PFGE consiste na análise completa do genoma bacteriano por
fragmentação enzimática e formação de bandas, denominadas pulsotipos, por uma
eletroforese em campo pulsado (RANJBAR et al., 2014). Esse é uma técnica
excelente para análise local de surtos e dispersões clonais. Contudo, quando o
estudo sugere uma avaliação global ou que apresente um grande espaço de tempo
entre os isolados, a técnica mais apropriada é o MLST. Essa técnica utiliza-se do
sequenciamento de sete regiões extremante conservadas do genoma
(housekeeping) e a tipagem é realizada através da identificação de pequenos snips
desses locus, sendo denominados números para cada um dos locus analisados. A
sequência de diferentes locus formam os Sequence Types (ST) e a junção desses
podem formar Complexos Clonais (CC) (RANJBAR et al., 2014; WERNER, 2013).
Para cada espécie do enterococos são utilizadas diferentes regiões conservadas e,
como consequência, formam ST e CC sem relações entre as espécies.
Normalmente, as cepas de ERV apresentam um perfil policlonal, contudo,
quando associados a surtos hospitalares ou a dispersões clonais o enterococos
possui algumas linhagens genéticas predominantes, dependendo da espécie. Para o
E. faecalis, a linhagens que mais estão associadas ao ambiente hospitalar são as
pertencentes aos complexos clonais CC2, CC9, CC4 e CC87 (ALMEIDA et al., 2014;
LEAVIS; BONTEN; WILLEMS, 2006; RUIZ-GARBAJOSA et al., 2006;
SACRAMENTO et al., 2017; SANTOS et al., 2017). Já em relação a espécie E.
feacium a linhagem genética mais prevalente é a anteriormente conhecida como
CC17. Atualmente já é sabido que esse CC17 do E. faecium é composto por
38
diferentes linhagem e origem e, desse modo, não podem ser mais sumarizados em
um único CC, eles devem ser denominados de acordo com a linhagem. Sendo
assim, as mais prevalente são as linhagem genéticas ST18, ST17 e ST78 (FREITAS
et al., 2013; GUZMAN PRIETO et al., 2016).
39
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar geneticamente cepas de Enterococcus sp. resistentes à
vancomicina e relacionar a uma possível dispersão clonal na cidade do Natal, Rio
Grande do Norte.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Confirmar geneticamente os isolados de Enterococcus à nível de
espécie pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR);
• Verificar o perfil de susceptibilidade aos antibióticos utilizados na rotina
clínica para o tratamento de infecções enterocócicas;
• Detectar por metodologia de PCR, determinantes genéticos envolvidos
na resistência à vancomicina;
• Identificar por metodologia de PCR, genes envolvidos na expressão da
virulência das cepas;
• Traçar o perfil clonal das amostras de Enterococcus pela metodologia
de tipagem molecular por PFGE;
• Avaliar o perfil clonal mais prevalente das amostras de Enterococcus
pela metodologia de tipagem por MLST.
40
4 METODOLOGIA
4.1 TIPO DE PESQUISA
Essa pesquisa trata-se de um estudo transversal e descritivo, na qual foi
realizado a caracterização molecular de cepas de Enterococcus sp. resistentes à
vancomicina isoladas a partir de hospitais da cidade do Natal, Rio Grande do Norte.
4.2 AMOSTRA
Nesse estudo foram utilizadas amostras de ERV provenientes de cultura
de vigilância (swab perianal) e outros espécimes clínicos (urina, ponta de cateter,
fragmento de osso, secreção ocular e secreção de úlcera) isolados em diversos
hospitais da cidade do Natal, Rio Grande do Norte. As amostras biológicas foram
coletadas no período de janeiro de 2015 a dezembro de 2016 por solicitação médica
e encaminhadas a um Laboratório de Análises Clínicas para a realização do
diagnóstico laboratorial. Os isolados bacterianos foram cedidos à pesquisa após a
anuência do Laboratório de Análises Clínicas responsável pelo processamento das
amostras biológicas e o parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CAAE:
80922617.0.0000.5537, Nº: 2.512.300; Apêndice A/Anexo A). O estudo teve acesso
somente aos dados sobre as amostras que estavam no sistema do Laboratório de
Análises Clínicas, não foi possível a obtenção das informações sobre os paciente
nos hospitais de origem.
As cepas bacterianas encontram-se armazenadas em biorrepositório
(Apêndice B) no Laboratório de Bacteriologia Médica (LaBMed) no Departamento de
Microbiologia e Parasitologia sob o gerenciamento da professora Maria Celeste
Nunes de Melo. As amostras foram armazenadas em leite enriquecido com glicerol
10% e congeladas a -20°C no LaBMed.
4.3 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS BACTERIANOS
41
Os isolados bacterianos chegaram ao LaBMed identificados como
Enterococcus resistentes à vancomicina através do sistema automatizado VITEK® 2
(bioMériuex, França). No LaBMed tiveram sua identificação confirmada por testes
laboratoriais convencionais como a coloração de Gram, a prova da catalase, o
semeio em ágar bile-esculina e o semeio em meio com suplementação de NaCl
(Newprov, Brasil). Além disso, foi realizado semeio em meios de cultura seletivos e
diferencial para enterococos: o cromogênico chromID® VRE (bioMériuex, França) e o
ágar Slanetz Bartley com cloreto de trifeniltetrazólio (Liofilchem, Itália). A
identificação molecular das espécies E. faecalis e E. faecium foi realizada pela
técnica da PCR utilizando primers específicos (Tabela 4) (DUTKA-MALEN; EVERS;
COURVALIN, 1995; JACKSON; FEDORKA-CRAY; BARRETT, 2004). A etapa da
caracterização genética das espécies foi realizada no Laboratório de Microbiologia
da Faculdade de Farmácia da Universidade de Porto, em Portugal.
Tabela 4: Primers utilizados para confirmação da espécie dos isolados de Enterococcus.
Gene e espécie
Sequência (5’ para 3’) Tamanho
do produto (pb)
Referência
sodA (E. faecalis)
E1: ACTTATGTGACTAACTTAACC E2: TAATGGTGAATCTTGGTTTGG
360 (JACKSON;
FEDORKA-CRAY; BARRETT, 2004)
ddl (E. faecium)
F1: TAGAGACATTGAATATGCC F2: TCGAATGTGCTACAATC
550
(DUTKA-MALEN; EVERS;
COURVALIN, 1995)
pb: pares de base.
A PCR singleplex foi feita em volume final de 25 µL contendo: 10 µL de
água ultrapura, 12,5 µL de NZYTaq II 2x Green Master Mix (NZYtech, Portugal) e
0,25 µM do primer forward e do reverse e, por fim, 2 µL da suspensão bacteriana.
Foi utilizado o termociclador T100® (BioRad, Estados Unidos).
O protocolo de amplificação descrito por DUTKA-MALEN, EVERS E
COURVALIN (1995) foi utilizado para a determinação das espécies E. faecium (ddl):
1 ciclo de 94°C por 15 minutos para extração do DNA, posteriormente 30 ciclos de
42
94°C por 30 segundos, 54°C por 30 segundos e 72 °C por 30 segundos e, por fim,
foi submetido a uma extensão final a 72 °C por 10 minutos. Para a determinação da
espécie E. faecalis (sodA), foi utilizado o protocolo descrito por JACKSON;
FEDORKA-CRAY; BARRETT (2004): inicialmente 94°C por 15 minutos para
extração do DNA, posteriormente 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30
segundos e 72 °C por 30 segundos e, por fim, 72 °C por 10 minutos.
Após a amplificação dos fragmentos os produtos da PCR foram aplicados
em gel de agarose a 1% com SYBR® safe (Thermo Fisher, Estados Unidos). O
marcador de peso molecular de 100pb NZYDNA ladder VI (NZYtech, Portugal) foi
aplicado no gel e a corrida de eletroforese foi realizada a 100V por 30 minutos em
solução tampão TBE 0,5X (0,05M Tris; 0,05M ácido bórico; 0,5mM EDTA Na2). E por
fim, o resultado foi fotografado com o auxílio do fotodocumentador Gel Doc® XR+
(BioRad, Estados Unidos).
4.4 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Para avaliação do perfil da susceptibilidade aos antimicrobiano foi
empregada a técnica qualitativa de disco-difusão de acordo com as normas do CLSI
(CLSI, 2018). Os antimicrobianos testados foram: ampicilina (10 μg), ciprofloxacina
(05 μg), tetraciclina (30 μg), linezolida (30 μg), cloranfenicol (30 μg), vancomicina (30
μg), teicoplanina (30 μg), eritromicina (15 μg) e gentamicina (120 μg) e
estreptomicina (300 μg) (DME, Brasil).
Os halos de inibição foram interpretados utilizando também os pontos de
corte do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST,
2018) e do Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BRCAST,
2018). Para avaliação por essas normas foram empregados os mesmos antibióticos,
contudo, alguns foram retestados em concentrações diferentes, sendo eles:
ampicilina (2 μg), linezolida (10 μg), vancomicina (5 μg) e gentamicina (30 μg)
(Oxoid, Estados Unidos).
A partir de um crescimento recente em meio de cultura não seletivo, ágar
Brain Heart Infusion (BHI), foram suspendidos inóculos bacterianos em solução de
salina estéril 0,9%, até a turbidez 0,5 da escala de McFarland. Com auxílio de um
swab estéril, a suspensão foi semeada em meio ágar Müeller Hinton II (Becton
43
Dickinson, Estados Unidos). Posteriormente, os discos impregnados com os
antibióticos foram distribuídos na superfície do meio. A leitura dos halos de inibição
e, posteriori, interpretação dos resultados foi realizado após a incubação das placas
por 16-18 horas a 37±1ºC.
As amostras de referência, recomendadas pelo CLSI (2018) foram
utilizadas como controles desse teste, foram elas: E. faecalis (ATCC 29212), E.
faecalis (ATCC 51299) e S. aureus (ATCC 25923).
4.5 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
Em relação aos antimicrobianos vancomicina e teicoplanina foram
pesquisadas as Concentração Inibitória Mínima (CIM), utilizando a técnica da fita
contendo gradiente do fármaco e a técnica de diluição em ágar, de acordo com o
recomendado pelo CLSI (CLSI, 2018), o qual preconiza a utilização desses métodos
de avaliação da CIM para esses dois antibióticos em questão.
Para o antibiótico vancomicina foi realizado o CIM por MIC Strip Test com
vancomicina em gradiente de 0,016 µg/ml a 256 µg/ml (Liofilchem, Itália). Utilizando
de cultura recente em ágar BHI, o teste foi realizado semelhante ao experimento por
metodologia de disco-difusão descrito no item 4.4. A leitura foi realizada após 18-24
horas de incubação. O E. faecalis ATCC 29212 foi utilizado como controle para a
realização do teste.
O CIM para teicoplanina (União Química, Brasil) foi realizado por diluição
em ágar. As concentrações testadas graduaram de 1 µg/ml a 256 µg/ml, sendo a
solução inicial obtida da solução estoque 133,33 mg/ml. As diluições seriadas foram
realizadas como preconizado pelo CLSI (2018), em cada placa a diluição do fármaco
em relação ao meio ágar Müller Hinton foi de 1:10. As placas com o fármaco e a
placa controle (sem o fármaco) foram identificadas e divididas e, com o auxílio de
uma pipeta, foi inoculado 5 µL a suspensão bacteriana 0,5 na escala de McFarland,
com posterior diluição de 1:10. Leitura e interpretação foram realizadas após
incubação por 18-24 horas a 37±1ºC.
44
4.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA RESISTÊNCIA
A caracterização molecular da resistência à vancomicina foi realizada pela
pesquisa dos operon vanA e vanB através PCR, utilizando os seguintes primers
específicos sumarizado na tabela 5.
Tabela 5: Primers utilizados para avaliar a resistência à vancomicina
Gene Sequência (5’ para 3’) Tamanho do produto (pb)
Referência
vanA A1: GGGAAAACGACAATTGC A2: GTACAATGCGGCCGTTA
732 (DUTKA-MALEN;
EVERS; COURVALIN, 1995)
vanB B1: ACGGAATGGGAAGCCGA B2: TGCACCCGATTTCGTTC
635 (DUTKA-MALEN;
EVERS; COURVALIN, 1995)
pb: pares de bases.
A PCR singleplex foi feita em volume final de 25 µL contendo: 22 µL de
SuperMix PCR (Invitrogen, Estados Unidos) e 1 µL do primer forward e reverse e,
por fim, 2 µL da suspensão bacteriana. Foi utilizado o termociclador T100® (BioRad,
Estados Unidos).
O protocolo de amplificação descrito por DUTKA-MALEN, EVERS E
COURVALIN (1995) foi utilizado para a determinação dos genes de resistência: 1
ciclo de 94°C por 15 minutos para extração do DNA e, posteriormente, 30 ciclos de
94°C por 60 segundos, 55°C por 60 segundos e 72 °C por 60 segundos, por fim, foi
submetido a 1 ciclo de 72 °C por 10 minutos.
Após a amplificação dos fragmentos os produtos da PCR foram aplicados
em gel de agarose a 1% com brometo de etídio (0,04 µL/mL). O marcador de peso
molecular de 100pb DNA ladder (New England Biolabs, Estados Unidos) foi aplicado
no gel e a corrida de eletroforese foi realizada a 100V por 30 minutos em solução
tampão TBE 0,5X (0,05M Tris; 0,05M ácido bórico; 0,5mM EDTA Na2). E por fim,
visualizados e fotografados com auxílio do transiluminador UVIpure (Uvitec, Reino
Unido).
45
4.7 PESQUISA DE GENES DE VIRULÊNCIA
A pesquisa dos genes relacionados com expressão dos fatores de
virulência esp, cylA, gelE e asa1 foi realizada por técnica da PCR utilizando primers
específicos (VANKERCKHOVEN et al., 2004). Os primers estão sumarizados na
tabela 6. Etapa realizada no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Farmácia
da Universidade de Porto, em Portugal.
Tabela 6: Primers para pesquisa dos genes de virulência esp, cylA, gelE e asa1.
Gene Sequência (5’ para 3’)
Tamanho do
produto (pb)
Referência
esp (Proteína de superfície de Enterococcus)
ESP14F:AGATTTCATCTTTGATTCTTGG ESP12R:AATTGATTCTTTAGCATCTGG
510 (VANKERCKHOVEN
et al., 2004)
cylA (Citolisina)
CYTI: ACTCGGGGATTGATAGGC CYTIIb: GCTGCTAAAGCTGCGCTT
688 VANKERCKHOVEN
et al., 2004)
gelE (Gelatinase)
GEL11: TATGACAATGCTTTTTGGGAT GEL12: AGATGCACCCGAAATAATATA
213 VANKERCKHOVEN
et al., 2004)
asa1 (Substância de agregação)
ASA11: GCACGCTATTACGAACTATGA ASA12: TAAGAAAGAACATCACCACGA
375 VANKERCKHOVEN
et al., 2004)
pb: pares de bases.
Foi utilizado o protocolo de amplificação descrito por VANKERCKHOVEN
et al. (2004) para a determinação dos genes de virulência: 1 ciclo de 94°C por 15
minutos para extração do DNA e, posteriormente, 30 ciclos de 94°C por 60
segundos, 56°C por 60 segundos e 72 °C por 60 segundos e, por fim, foi submetido
a uma extensão final a 72 °C por 10 minutos.
Os componentes da PCR singleplex, a corrida da eletroforese, como
também a revelação do gel de agarose foram realizados como descrito no item 4.3.
46
4.8 TIPAGEM MOLECULAR DAS CEPAS DE Enterococcus
As cepas foram analisadas quanto a relação genética entre si através da
técnica de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), com a utilização da enzima de
restrição SmaI, de acordo com as recomendações de Teixeira et al. (TEIXEIRA et
al., 1997), e analisadas por critério de Tenover (TENOVER et al., 1995).
A partir de crescimento recente de uma única colônia bacteriana, em 2 mL
de caldo BHI, foram preparadas suspensões bacterianas em 500 µL de tampão PIV
(1M NaCl, 10mM Tris, pH 7,6), após a retirada do caldo BHI por centrifugação 4.000
rpm por 5 minutos. Igual volume (500 µL) de agarose de baixo ponto de fusão
(Promega, Estados Unidos) a 2% foi adicionado à suspensão, homogeneizado e
imediatamente inserido nos moldes dos plugs, para a confecção dos discos. Em
seguida esses plugs foram tratados com enzimas para obtenção do genoma
bacteriano. Eles foram incubados em solução lise com tampão EC (6mM Tris, pH
7,6; 1M NaCl; 100mM EDTA Na2; 0,2% Disoxicolato de sódio, 0,5% Lauril
sarcosinato) com 1 mg/mL de lisozima, 5 U/mL de mutanolisina e 0,5% BRIJ®
(Sigma, Estados Unidos) por 18-24 horas a 37±1°C sob agitação leve.
Posteriormente, essa solução lise foi substituída pelo tampão ESP (0,5mM EDTA
Na2, pH 8; 1% Lauril Sarcosinato) com 1mg/mL de proteinase K (Sigma, Estados
Unidos) com incubação por 18-24 horas a 50°C, em banho-maria. Somente então,
os discos foram submetidos a lavagem com tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 0,1
mM EDTA Na2) com agitação leve, sendo duas, por 2 horas e outras duas, por 1
hora. Após as quatro lavagens, iniciou-se a restrição enzimática do genoma
bacteriano. Os discos foram incubados por 30 minutos em 100 µL do tampão
específico da enzima Smal (Sigma, Estados Unidos) diluída (1:10) em água
ultrapura. Após a incubação inicial, o tampão foi retirado e adicionado o tampão
diluído com água e com a enzima SmaI (10U/µL) por 18-24 horas a 20-25°C. Após a
restrição enzimática os plugs foram inseridos em gel de agarose de baixo ponto de
fusão a 1,2% em TBE 0,5X. Foi utilizado na corrida o marcador de peso molecular
de Lambda Ladder PFGE Marker (New Englad Biolabs, Estados Unidos). A corrida
da eletroforese foi realizada em campo elétrico pulsado - CHEF DR II Variable Angle
System (BioRad. Estados Unidos) por 22 horas a 12°C com pulso inicial de 5
segundos e final de 35 segundos, ângulo 120° e 6V/cm. Os géis foram corados com
47
0,04 µl/mL de brometo de etídio por 1 hora, em seguida visualizados e fotografados
com auxílio do transiluminador UVIpure (Uvitec, Reino Unido).
4.9 ANÁLISE POR SEQUENCIAMENTO DE MULTILOCUS
Os pulsotipos mais prevalentes encontrados após análise da técnica de
PFGE foram submetidos à técnica de tipagem por Sequenciamento de Multilocus
(MLST). Foram utilizadas as seguintes sequências de amplificação (somente foi
realizado a amplificação para a espécie E. faecalis) sumarizados na tabela 7 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006). Essa etapa foi realizada no Laboratório de Microbiologia
da Faculdade de Farmácia da Universidade de Porto, em Portugal.
Tabela 7: Primers utilizados na análise do MLST.
Gene Sequência (5’ para 3’) Tamanho do produto (pb)
Referência
gdh
gdh-1 GGCGCACTAAAAGATATGGT gdh-2 CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA
530 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
gyd
gyd-1 CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC gyd-2 CATTTCGTTGTCATACCAAGC
395 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
pstS pstS-1 CGGAACAGGACTTTCGC pstS-2 ATTTACATCACGTTCTACTTGC
583 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
gki gki-1 GATTTTGTGGGAATTGGTATGG gki-2 ACCATTAAAGCAAAATGATCGC
438 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
aroE
aroE-1 TGGAAAACTTTACGGAGACAGC aroE-2 GTCCTGTCCATTGTTCAAAAGC
459 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
48
xpt
xpt -1 AAAATGATGGCCGTGTATTAGG xpt-2 AACGTCACCGTTCCTTCACTTA
456 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
yiqL yiqL-1 CAGCTTAAGTCAAGTAAGTGCCG yiqL-2 GAATATCCCTTCTGCTTGTGCT
436 (RUIZ-
GARBAJOSA et al., 2006)
pb: pares de bases.
Foi utilizado o protocolo de amplificação dos genes para o MLST descrito
por RUIZ-GARBAJOSA et al. (2006). Sendo as condições da ciclo da PCR:
desnaturação inicial a 94°C por 15 minutos para extração do DNA e, posteriormente,
30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 51°C por 30 segundos e 72 °C por 30 segundos
e, por fim, foi submetido a uma extensão final a 72 °C por 10 minutos. As
amplificações foram verificadas por eletroforese como já descrito no item 4.3.
Antes do envio para o sequenciamento, os produtos das amplificações
foram purificados pelo kit NZYGelpure (NZYtech, Portugal). O volume completo da
reação da PCR foi transferido para um microtubo de 1,5 ml e adicionado 5 volumes
do tampão e homogeneizado. A solução foi adicionada a uma coluna NYZtech e
centrifugada por 1 minuto e descartado o filtrado. 600 µL do tampão de lavagem foi
adicionado a coluna e centrifugada por 1 minuto, sendo descartado o líquido filtrado.
Foi inserido o tampão de eluição e incubado a temperatura ambiente por 1 minuto,
posteriormente centrifugado a 10.000-15.000 rpm por 1 minuto. Novamente, a
eletroforese como descrita no item 4.3 foi performada com 2 µL para verificar a
qualidade da purificação. Os produtos já purificados foram sequenciados pela
empresa Eurofins Genomics, na Alemanha.
Após o sequenciamento, a qualidade das sequências foi avaliada pelo
software Chromas (Technelysium, Austrália) e, posteriormente, foram inseridas no
banco de dados pubMLST E. faecalis (pubmlst.org), onde foi verificado os snips e
adotado numerações para os alelos e para os ST das sequências.
49
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Foram caracterizadas 62 cepas de ERV de seis hospitais diferentes
públicos (A, B, C e E) e privados (D e F), coletados em um período de dois anos,
janeiro de 2015 a dezembro 2016, na cidade do Natal. As 62 cepas de ERV foram
provenientes de 51 pacientes, os quais em 11 destes, foram coletados material
biológico duas a três vezes. A distribuição dos isolados de acordo com a instituição
de origem está representado na tabela 8.
O maior percentual de isolados foi proveniente do hospital A (40,3%;
25/62) seguido pelo hospital C (21,0%; 13/62) e hospital B (19,4%; 12/62), os
demais hospitais (D-F) somaram 19,4% dos isolados. Dentre os ERV pesquisados,
98,4% eram pertencentes à espécie E. faecalis (61/62) e somente 1 isolado (1,6%)
foi identificada como E. faecium (Tabela 8, Figura 2).
Tabela 8: Distribuição dos ERV em relação ao hospital de origem e as espécies identificadas.
Cultura de vigilânciaa Outros espécimes clínicosb Total
(N=56) (N=6) (N=62)
n % n % n %
Hospitais
A 24 42.9% 1 16.7% 25 40.3%
B 10 17.9% 2 33.3% 12 19.4%
C 12 21.4% 1 16.7% 13 21.0%
D 3 5.4% 1 16.7% 4 6.5%
E 3 5.4% - - 3 4.8%
F 2 3.6% 1 16.7% 3 4.8%
OD 2 3.6% - - 2 3.2%
Espécies
E. faecalis 55 98.2% 6 100.0% 61 98.4%
E. faecium 1 100.0% - - 1 1.6% a:isolados de swab perianal; b:isolados de urina, ponta de cateter, fragmento de osso, secreção ocular e secreção de úlcera N: número de isolados testados; n: valor absoluto de resistentes; %: valor percentual de resistência; OD: origem desconhecida; -: nenhum isolado.
50
Figura 2: Produto da PCR para os genes sodA, específico para a espécie E. faecalis e ddl, específico para a espécie E. faecium.
PM: Padrão de peso molecular (100pb); A: Controle positivo da espécie E. faecalis, gene sodA (360 pb); B: controle positivo da espécie E. faecium, gene ddl (550 pb).
As amostras foram isoladas de swab perianal (90,3%; 59/62), urina (3,2%
2/62), ponta de cateter (1,6% 1/62), fragmento de osso (1,6% 1/62), secreção ocular
(1,6% 1/62) e secreção de úlcera (1,6% 1/62). As culturas de vigilância foram todas
coletadas no momento de admissão do paciente, quando procedia de outras
instituições de saúde. Dois pacientes apresentaram cultura positiva para ERV tanto
do material biológico coletado (fragmento de osso e ponta de cateter) quanto na
cultura de vigilância.
5.2 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Todos os ERV pesquisados foram resistentes a quatro classes diferentes
de antibióticos (quinolona, tetraciclina, macrolídeo e glicopeptídios). Com relação à
classe dos aminoglicosídeos, 88,7% (55/62) e 40,3% (25/62) apresentaram
resistência a elevadas concentrações de gentamicina e estreptomicina,
respectivamente. Todos os isolados foram sensíveis à linezolida e ao cloranfenicol
(62/62; 100%). Somente a espécie E. faecium demostrou resistência à ampicilina
(1/62; 1,5%) (Gráfico 1).
51
Gráfico 1: Perfil de resistência em porcentagem dos isolados de Enterococcus aos antimicrobianos testados.
N: número de isolados testados; HLAR: High-Level Aminoglycoside Resistance.
Dos 62 ERV triados com relação a susceptibilidade aos aminoglicosídios
(gentamicina de 30 µg, gentamicina de 120 µg, estreptomicina de 300 µg), 38,7%
(24/62) apresentaram resistência a altas concentrações tanto para a estreptomicina
(300 µg) quanto para a gentamicina (120 µg) e 50% (31/62) foram resistentes
somente à gentamicina (120 µg). No entanto, 1,6% (1/62) do total dos ERV foram
resistentes unicamente à estreptomicina (300 µg). Dos 57 isolados que foram triados
para a resistência à gentamicina 30 µg, seis não apresentaram resistência nem a
estreptomicina e nem a gentamicina de alta concentração, não possuindo assim o
fenótipo HLRA (Tabela 9).
100.0%
1.6%
100.0%
100.0%
98.4%
88.7%
40.3%
100.0%
100.0%
0.0% 20.0% 40.0% 60.0% 80.0% 100.0%
Ciprofloxacina
Ampicilina
Tetraciclina
Linezolida
Cloranfenicol
Eritromicina
Gentamicina
Gentamicina (HLRA)
Estreptomicina (HLRA)
Vancomicina
Teicoplanina
Isolados (N=62)
52
Tabela 9: Perfil de susceptibilidade para o teste do fenótipo de resistência a níveis elevados de aminoglicosídios.
Cultura de vigilância
(N=56)
Outros espécimes
clínicos (N=6)
Total de ERV (N=62)
n % n % n %
Gena (120 µg) 27 48,2% 4 66,7% 31 50,0%
Estb (300 µg) 1 1,8% - - 1 1,6%
Gen/Estc (120/300 µg) 22 39,3% 2 33,3% 24 38,7%
Não HLRAd 6 10,7% - - 6 9,7%
a. Amostras resistentes somente à gentamicina; b. Amostras resistentes somente à estreptomicina; c. Amostras resistentes tanto à gentamicina quanto à estreptomicina; d. Amostras sensíveis tanto à gentamicina quanto à estreptomicina. Gen: Gentamicina; Est: Estreptomicina; HLAR: High-Level Aminoglycoside Resistance; N: número de isolados testados; n: valor absoluto de resistentes; %: valor percentual de resistência; -: nenhum isolado.
5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
Todas os isolados foram resistentes à vancomicina, segundo o ponto de
corte do CLSI (2018) que determina uma CIM ≥ 8 µg/mL para o fenótipo de
resistência. A CIM para vancomicina variou de 16 ≥ 256 µg/mL. Dos isolados, 63,1%
(41/62) apresentam a CIM ≥ 256 µg/mL. Para o glicopeptídio teicoplanina o CLSI
(2018) determina um ponto de corte ≥ 16 µg/mL para o fenótipo de resistência, no
entanto de acordo com EUCAST/BRCAST, 2018 o ponto de corte reduz para > 2
µg/mL. De acordo com CLSI, 58,1% (36/62) dos isolados foram resistentes à
teicoplanina com CIM ≥ 16 µg/mL. Contudo, de acordo com o EUCAST/BRCAST,
98,4% (61/62) das amostras foram resistentes à teicoplanina (> 2 µg/mL). A CIM
para a teicoplanina dos isolados analisados variou de 2 até 64 µg/mL.
5.4 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA RESISTÊNCIA
Todos os ERV que foram pesquisados amplificaram o gene vanA na PCR.
Nenhum isolado apresentou o gene vanB (Figura 3).
53
Figura 3: Gel demonstrando os amplicons vanA e vanB, determinantes de resistência à vancomicina.
PM: Padrão de peso molecular (100pb); A: controle positivo do gene vanA (732 pb); B: controle positivo do gene vanB (635 pb); C-E: Isolados de ERV.
5.5 PESQUISA DE GENES DE VIRULÊNCIA
A pesquisa dos determinantes da virulência foi realizada nos isolados da
espécie E. faecalis. O gel representativo da amplificação da PCR para os genes de
virulência está apresentado na figura 4.
Os genes de virulência mais prevalentes nos isolados analisados foram
os genes para a gelatinase (gelE) (98,4%; 60/61) e a substância agregativa (asa1)
(100%; 61/61). 9,8% (6/61) dos isolados apresentaram o gene esp (proteína de
superfície do Enterococos) e somente 16,4% (10/61) possuíram o gene para a
citolisina (cylA) (Gráfico 2).
Figura 4: Gel representando os amplicons para os genes de virulência pesquisados (cylA, gelE, asa1 e esp), pela técnica de PCR.
PM: Padrão de peso molecular (100pb); A: controle positivo do gene cylA (688 pb); B: controle positivo do gene gelE (213 pb); C: controle positivo do gene esp (510 pb); D: controle positivo do gene asa1 (375 pb);
54
Gráfico 2: Distribuição dos determinantes da virulência pesquisados.
gelE: gene da gelatinase; asa1: gene da substância agregativa; cylA: gene da
citolisina; esp: gene da proteína da superfície do enterococos.
A maior prevalência dos genótipos de virulência foi o asa+gel (82,0%;
50/61). Os demais genótipos apresentaram frequências menores: asa+gel+cyl com
8,2% (5/61), asa+gel+cyl+esp também com 8,2% (5/61) e gel com 1,6% (1/61)
(Tabela 10).
Tabela 10: Distribuição do genótipo de virulência para a espécie E. faecalis.
Isolados (N=61)
n %
gel 1 1.6%
asa+gel 50 82.0%
asa+gel+cyl 5 8.2%
asa+gel+cyl+esp 5 8.2%
gel: gelatinase; asa: substância agregativa; cyl: citolisina; esp: proteína da superfície do enterococos; N: número de isolados testados; n: valor absoluto de isolados testados; %: valor percentual de testados; -: nenhum paciente.
9.8%
16.4%
100.0%
98.4%
0.0% 20.0% 40.0% 60.0% 80.0% 100.0%
esp
cylA
asa1
gelE
Isolados (N=61)
55
5.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL CLONAL POR TIPAGEM MOLECULAR
A tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsado
(PFGE) foi utilizada apenas para a espécie E. faecalis. O único isolado de E.
faecium não foi avaliado por essa técnica. Foi observado somente dois perfis
diferentes denominados A e B (Figura 5). A distribuição entre os clones foi
semelhante, o cluster A foi levemente mais predominante entre os isolados com
50,8% (31/61) em comparação ao B com 49,2% (30/61) (Tabela 11).
Quando comparado entre os mesmos hospitais ou o genótipo de
virulência, a distribuição dos clones A e B apresentou uma leve diferença, sem
grandes alterações entre as suas porcentagens. A maior diferença entre eles foi em
relação a virulência. Nenhum dos isolados do clone A apresentou somente o gene
gelE, como também nenhum dos do clone B demostrou o genótipo asa+gel+cyl.
Além do mais, somente um isolado do clone B foi positiva para o gene cylA, por
outro lado nove dos 31 isolados de outro perfil clonal apresentaram esse gene.
56
Figura 5: Gel com os perfis de PFGE. A: isolados do clone A; B: isolados do clone B; Seta azul: controle do clone A (Ef.71); Seta vende: controle do clone B (Ef.24).
A.
B.
2
57
Tabela 11: Distribuição dos perfis PFGE da espécie E. faecalis com relação ao hospital de origem e determinantes de virulência.
Clone A (N=31) Clone B (N=30) Total (N=61)
n % n % n %
Hospital
A 14 45.2% 11 36.7% 25 41.0%
B 5 16.1% 7 23.3% 12 19.7%
C 6 19.4% 6 20.0% 12 19.7%
D 3 9.7% 1 3.3% 4 6.6%
E 1 3.2% 2 6.7% 3 4.9%
F 2 6.5% 1 3.3% 3 4.9%
OD - - 2 6.7% 2 3.3%
Virulência
gel - - 1 3.3% 1 1.6%
asa+gel 22 71.0% 28 90.3% 50 82.0%
asa+gel+cyl 5 16.1% - - 5 8.2%
asa+gel+cyl+esp 4 12.9% 1 3.3% 5 8.2%
gel: gelatinase; asa: substância agregativa; cyl: citolisina; esp: proteína da superfície do enterococos; N: número de isolados; n: valor absoluto dos isolados; %: valor percentual dos isolados; OD: origem desconhecida; -: nenhum isolado.
A análise por metodologia de sequenciamento de multilocus (MLST) dos
dois perfis clonais, encontrado por intermédio da corrida do PFGE, constatou que o
clone A pertencia ao ST525, enquanto o clone B ao ST6. Os dois ST encontrado
fazem parte do complexo clonal CC2. A Sumarização dos locus e ST observados
após a análise do sequenciamento está demostrando na tabela 12.
58
Tabela 12: Perfil alélico encontrado após o sequenciamento por MLST e a análise dos locus dos isolados
Clone Locus
ST gdh gyd pstS gki aroE xpt yqiL
A 12 7 3 32 6 26 5 525
B 12 7 3 7 6 1 5 6
ST: Sequence Type.
59
6 DISCUSSÃO
Sendo um dos principais agentes causadores das IRAS, além de serem
considerados importante reservatório de genes tanto de resistência como de
virulência, o ERV vem emergindo nas últimas décadas como um dos principais
patógenos oportunistas, resultantes de propagação clonal e ocasionando surtos em
instituições de saúde. Anteriormente a essa pesquisa, em 2012, foi realizado um
estudo com 117 isolados de Enterococcus provenientes de quadros infeciosos de
quatro instituições de saúde da cidade do Natal (COSTA, 2012). Essas cepas foram
obtidas de diferentes sítios como urina, secreções, cateter e dreno, tanto de
pacientes internados quanto de ambulatorial. No entanto, nenhum isolado foi
proveniente de cultura de vigilância. Nesse estudo, foi observado que os
Enterococcus apresentaram alta sensibilidade aos antimicrobianos, incluindo aos
glicopeptídios. 86,3% foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e somente
uma cepa foi identificada como ERV, pertencente a espécie E. faecium e abrigando
o gene vanA. Ademais foi demostrado, que diferentemente do que era descrito em
outras regiões, as infecções enterocócicas, na região de Natal, permaneciam com
um perfil de sensibilidade aos antibióticos bastante elevada (COSTA, 2012).
Diferente do estudo realizado por Costa (2012), essa pesquisa demostrou
uma ocorrência muito elevada do ERV, revelando uma emergência dessa linhagem
na cidade do Natal. Nessa pesquisa também foi observado uma ocorrência maior da
espécie E. faecalis. Esse dado está em acordo com estudos mais antigos, os quais
demostravam que, divergentemente do que é encontrado nos EUA e na Europa, o
Brasil apresentava uma maior prevalência da resistência à vancomicina nos isolados
de Enterococcus da espécie E. faecalis (BENDER et al., 2009; CAIAFFA FILHO et
al., 2003; ROSSI, 2011). Contudo, com o passar dos anos, a epidemiologia brasileira
das infecções enterocócicas vem sofrendo mudanças, tornando-se mais semelhante
à das demais regiões do mundo. SACRAMENTO e colaboradores (2017)
observaram, em um estudo retrospectivo, de 18 anos, com isolados do sudeste
brasileiro, a emergência de casos e surtos por E. faecium.
Quase a totalidade dos isolados de ERV, desse estudo, foi proveniente de
cultura de vigilância. Estudos brasileiros já demostraram que infecção por ERV ainda
possuem baixa prevalência, contudo são registrados, em todo o país, altos índices
60
de isolamento a partir da pesquisa da colonização intestinal, pelas culturas de
vigilância através de swab anal ou perianal (FURTADO et al., 2005; RIBAS et al.,
2007). FURTADO e colaboradores (2005) observaram uma prevalência de 32,6% de
pacientes colonizados por ERV nas UTI de um hospital em São Paulo, e que alguns
fatores estavam intimamente associados a alta taxa de colonização, como a
hospitalização prévia, as infeções hospitalares, o tempo de estadia no hospital e nas
UTI e o período de tratamento antimicrobiano. Além disso, a colonização por ERV
também são encontrados em outros tipos de unidades de cuidados à saúde (BADEN
et al., 2001; FREITAS et al., 2018; NUCLEO et al., 2018).Um paciente dessa
pesquisa, o qual foi positivo para a cultura de vigilância por swab perianal,
desenvolveu infecção por ERV, provavelmente em virtude da colonização por esse
micro-organismo. Este paciente possuía ulcera de pé diabético de calcâneo e
apresentou o micro-organismo em cultura de fragmento de osso. Sendo assim,
mesmo a taxa de infecção sendo baixa, a colonização por ERV é considerada um
fator primordial para o desenvolvimento da infecção, pois a partir desse nicho
biológico eles são capazes de penetrar na corrente sanguínea ou mesmo persistir
por longos períodos (UBEDA et al., 2010).
Tanto a colonização como a contaminação do ambiente são considerados
excelentes reservatórios e estão associadas às formas de disseminação desse
micro-organismo. Além disso, pacientes alojados em quartos ou enfermarias com
contaminação por ERV apresentam alta possibilidade de desenvolver infecções
decorrentes desses micro-organismos (DREES et al., 2008). Desse modo, a
pesquisa da colonização dos pacientes pela cultura de vigilância é uma importante
forma de controle das IRAS e auxilia no monitoramento de surtos e dispersões
silenciosas dos micro-organismos, como também mapeia áreas de riscos e verifica a
eficácia dos protocolos de intervenção (PITTET et al., 2008).
Nos EUA, em consequência do aumento das taxas de colonização e
infecção pelo ERV no país, em 1995, o Hospital Infection Control Practices Advisory
Commitee publicou uma lista de recomendações para prevenir a disseminação
desse micro-organismo (LARSON et al., 1995). Igualmente, o Brasil sancionou a Lei
nº 9.431 de 6 de janeiro de 1997 e a Portaria nº 2616, de 12 de maio de 1998 as
quais decretavam a obrigatoriedade dos hospitais a manutenção do Programa de
Controle de Infecções Hospitalares, além da constituição das Comissões de
61
Controle de Infecções Hospitalares (CCIH) (BRASIL, 1997, 1998). Entre as
orientações incluem o controle rigoroso do uso do antibiótico vancomicina, a
pesquisa ativa da colonização por cultura de vigilância, a detecção precoce nas
amostras clínicas, o isolamento do paciente com a cultura positiva, a higiene das
mãos, o uso de luvas e capotes, a desinfecção do ambiente e a capacitação dos
profissionais de saúde (BRASIL, 2007; LARSON et al., 1995).
Cada hospital tem a autonomia para adotar as recomendações de acordo
com a realidade econômica e epidemiológica da instituição. De acordo com as
CCIH dos hospitais pesquisados nesse estudo, no momento da admissão do
paciente proveniente de outra instituição de saúde é realizado a pesquisa de
colonização por MMR. Por conseguinte, todos os isolados de cultura de vigilância
desse estudo foram coletados no momento da admissão do paciente. Desse modo,
as formas de dispersões dessas cepas entre os pacientes não puderam ser
verificadas.
Já é sabido que isolados de ERV apresentam outras resistências
concomitante aos glicopeptídios (CETINKAYA; FALK; MAYHALL, 2000). Os isolados
pesquisadas demostraram inefetividade in vitro dos antibióticos das classes dos
macrolídeos, quinolonas, tetraciclina além dos glicopeptídios. Com relação à
resistência a altos níveis de aminoglicosídeos, um percentual bastante elevado
(84,6%) apresentou resistência a pelo menos um dos aminoglicosídeos testados.
Perfis de resistência semelhantes são encontrados em outros ERV analisados pelo
mundo (AKPAKA et al., 2017; AKPAKA; KISSOON; JAYARATNE, 2016; VILELA et
al., 2006). A resistência a altos níveis de gentamicina, descrito nesse estudo,
também foi encontrado por MONDINO e colaboradores (2003), o qual descreveu
43,4% de resistência dos isolados culturas de vigilância. No entanto, as resistências
somente à estreptomicina, desse estudo, foram mais baixas dos que normalmente
são observados nesses isolados de ERV.
A resistência aos aminoglicosídios, principalmente a resistência à
gentamicina, já foi observada sendo mais associadas a cepas adaptadas ao
ambiente hospitalar (MONDINO et al., 2003). Além disso, a emergência do ERV tem
surgido em paralelo com o aumento da resistência tanto à penicilina como aos
aminoglicosídios. Essa classe de antibióticos, juntamente com as penicilinas, é
utilizada no tratamento de bacteremias e endocardites graves. Desse modo, a
62
importância da pesquisa dessa resistência está relacionada a limitação do
tratamento, pois a resistência resulta na perda do sinergismo farmacológico
(GILMORE; SHEPARD, 2002).
O único isolado resistente a ampicilina pertence a espécie E. faecium.
Fato que já era esperado, tendo em vista que cepas de ERV dessa espécie
apresentam naturalmente resistência aos β-lactâmicos. Todos os isolados do E.
faecalis foram sensíveis à ampicilina. Outros estudos também descreveram
resultados similares (GORDTS et al., 1995; PEREIRA et al., 2010).
Por outro lado, todas as cepas analisadas mostraram-se sensíveis à
linezolida e ao cloranfenicol. De modo geral, a resistência à linezolida ainda é
incomum, contudo por terapia farmacológica inadequada, já foi reportado casos de
disseminação de clones resistentes no Brasil (VILELA et al., 2006) e no mundo
(NTOKOU et al., 2012). Contudo, a sensibilidade ao fármaco cloranfenicol é
extremante elevada quando comparada a outros estudos brasileiros, talvez em
decorrência da baixa utilização desse medicamento nos hospitais pesquisados
(MONDINO et al., 2003; VILELA et al., 2006).
A característica básica dos isolados que apresentam resistência à
vancomicina é a resistência concomitante à teicoplanina. O fato é determinado pelo
tipo de operon presente no genoma do enterococo. Desse modo, a susceptibilidade
a esses dois antibióticos foi analisada. Todas as cepas mostraram-se resistentes às
duas drogas, quando avaliadas pelas técnicas do disco-difusão. Todavia, ao
determinar a CIM para o antibiótico teicoplanina, somente 58,1%, de acordo com o
ponto de corte do CLSI (2018), se mostraram resistentes. Porém quando avaliadas
pelo ponto de corte do EUCAST/BRCAST (2018) esse percentual aumentou para
98,4%. Como preconizado, o teste de disco difusão foi utilizado somente como um
indicativo inicial da resistência (BRCAST, 2018; CLSI, 2018; EUCAST, 2018).
Todas as cepas analisadas foram positivas para o gene vanA,
demonstrando assim, que vários isolados apresentavam incongruência entre o
fenótipo e o genótipo apresentado. Esse tipo de incompatibilidade já foi reportado
em vários lugares do mundo, como também no Brasil (HASHIMOTO, 2000;
HENRIQUE et al., 2008; LAUDERDALE et al., 2002; LEE et al., 2004; ZANELLA et
al., 2006). Essa mesma alteração foi observada no único isolado de ERV reportado
por COSTA (2012), o qual apresentava resistência intermediária à teicoplanina e
63
resistência completa à vancomicina, com o gene vanA. Estudos sugerem que essa
divergência entre o fenótipo e o genótipo ocorre em resultado a deleções na região
terminal do transposon Tn1546, o qual abriga o operon vanA, podendo ser por
mutações na região regulatório (vanS) ou mesmo por rearranjo do operon vanA com
alterações na porção dos genes acessórios (vanX, vanY e vanZ) (HASHIMOTO,
2000; HENRIQUE et al., 2008; LEE et al., 2004). É bem documentado que esse
operon vanA é o mais prevalente tanto em isolados brasileiros como em outras
partes do mundo (CAIAFFA FILHO et al., 2003; DESHPANDE et al., 2007; NOVAIS
et al., 2008; SACRAMENTO et al., 2016; VAN HAL et al., 2016; VILELA et al., 2006;
ZANELLA et al., 2003).
Os fatores de virulência apresentam papel importante na colonização,
permanência, invasão tecidual e evasão do sistema imune, por consequência
entender os padrões dos genótipos de virulência nos isolados de ERV auxilia na
compreensão da epidemiologia das infecções por esses micro-organismos. Os
fatores de virulência mais comuns desse gênero diferem entre as espécies de
Enterococcus. Em virtude da grande diferença entre os números dos isolados, foram
pesquisados somente os genes de virulência para a E. faecalis. Foi observado a
prevalência da presença da Gel, Esp, Asa e Cyl que já foram descritos como
capazes de influenciar a relação parasito hospedeiro (COBURN; GILMORE, 2003;
KRISTICH et al., 2004; SHANKAR et al., 1999). Os genes de virulência mais
prevalentes encontrados foram o de produção da gelatinase e o da substância de
agregação, os quais estavam presentes em quase totalidade dos isolados. Esses
dados demostraram que as cepas pesquisadas são menos virulentas do que a
grande maioria dos isolados reportados, os quais demostram altos índices de
positividade para os genes produtores de Esp, Asa, Cyl e Gel (CAMARGO et al.,
2008; COMERLATO et al., 2013; LIU et al., 2011). Quando comparado a
caracterização dos Enterococcus realizada há sete anos com isolados da região de
Natal, foi observado uma maior prevalência do gene gelE, semelhante aos nossos,
contudo, em relação a frequência de esp e cylA foram relatados com uma
porcentagem maior que o encontrado no nosso estudo, enquanto o asa1 possuía um
baixo índice (COSTA, 2012).
Diferentemente do observado nesse estudo, pesquisa realizada em
Londrina, observou que mais da metade das amostras pesquisadas foram positivas
64
para Esp, e somente cerca de 36% e 43% para Asa e Gel, respectivamente
(MARQUES; SUZART, 2004). COMERLATO e colaboradores (2013) observaram
que isolados de ERV de E. faecalis apresentaram altos índices de positividade para
os genes associados a formação de biofilme (asa, esp, gel), sendo a gel com maior
prevalência (95%), seguido por esp (80%) e asa (65%). Além dos mais, vale
ressaltar que já foi demostrado a correlação entre a presença do gene esp e gel com
a habilidade de produzir biofilme em clones epidêmicos. (ARCIOLA et al., 2008).
A utilização dos métodos moleculares de tipagens vem colaborando para
o esclarecimento da etiologia dos isolados de ERV, além de ser uma importante
ferramenta para a elucidação dos padrões de disseminação desses patógenos.
Diversos estudos já relataram surtos e dispersões por clones geneticamente
relacionados de ERV. Além disso, clones relacionados geneticamente foram
reportados sugerindo transmissão cruzada entre diferentes hospitais, que podem
esta associados a transferência do paciente entre as instituições de saúde ou
através dos profissionais de saúde (MORETTI et al., 2004; PARK et al., 2012;
PEREIRA et al., 2010). Além dos mais, estudo moleculares já constataram padrões
de colonização persistente. BADEN e colaboradores (2001), verificaram a
colonização prolongada de ERV por mais de um ano em pacientes de uma casa de
repouso.
Nesse estudo, foi observado, através da metodologia tipagem molecular
por PFGE, que os isolados pesquisados pertenciam apenas a dois perfis clonais,
denominados clones A e B. O clone A, levemente mais prevalente que o clone B.
Os dois clones encontram-se distribuídos entre os pacientes de todos os hospitais
pesquisados. No entanto, o clone A apresentou mais fatores de virulência quando
comparado ao clone B.
Estudos já demostraram que a transmissão clonal pode estar associada a
presença de alguns tipos de resistência. Já foram relatados surtos por ERV
produtores de β-lactamases e por enterococos com fenótipo de HLRA,
principalmente com resistência à gentamicina (ANTALEK et al., 1995; CLARK et al.,
1993; HANDWERGER et al., 1993; MARKOWITZ et al., 1991; MONDINO et al.,
2003; MURRAY et al., 1992; ZERVOS et al., 1987). No entanto, nenhuma correlação
entre o perfil de resistência e o clone mais prevalente foi observado no estudo.
65
Adicionalmente, a tipagem por MLST foi desenvolvida com intuito de ser
utilizada em investigações mais global e de longo prazo. Através dessa técnica
foram identificados dois ST (Sequence Type) diferentes. O clone A pertence ao
ST525, enquanto o clone B ao ST6. Esses dois ST representam cepas epidêmicas
extremamente bem adaptadas as pressões do ambiente hospitalar e com grande
capacidade de persistir nesse tipo de ambiente. O ST6 vem sendo descrito por todo
o mundo (ALONSO et al., 2017; FREITAS et al., 2009; KUCH et al., 2012; LÓPEZ et
al., 2012; RUIZ-GARBAJOSA et al., 2006; SANTOS et al., 2017). Por outro lado, o
ST525 foi unicamente reportado no Brasil (ALMEIDA et al., 2014; SANTOS et al.,
2017). No estudo de ALMEIDA e colaboradores (2014) foi reportado o primeiro
isolamento do ST525, sendo esses isolados resistentes a vários antibióticos,
inclusive à linezolida. Entretanto, SANTOS e colaboradores (2017) isolaram cepas
apresentando esse ST com o fenótipo de resistência semelhante ao observado no
nesse estudo. Essa pesquisa apresenta o primeiro relato que observa esse ST no
nordeste brasileiro.
De acordo com o database pubMLST, as diferenças básicas entre os dois
ST são unicamente em dois alelos, o gki e o xpt. Para o gki são somente quatro
alterações na sequência o que modificou do alelo 7 para o alelo 32. As diferenças
foram nas regiões: 57 (citosina para timina), 141 (guanina para adenina), 220
(adenina para guanina) e 438 (citosina para timina). Desse modo, os dois
apresentando uma similaridade de 99,09%. Já o locus xpt houve somente uma
alteração na sequência, do alelo 1 para 26, em um aminoácido na região 15, uma
guanina foi trocada por uma adenina.
Os dois ST são incluídos ao complexo clonal CC2 juntamente com o ST2
e ST51. Além disso, conjuntamente com o CC9 e CC4, são os tipos moleculares
mais prevalentes em amostras tanto de infecção como de colonização no Brasil
(RUIZ-GARBAJOSA et al., 2006; SACRAMENTO et al., 2017; SANTOS et al., 2017).
RUIZ-GARBAJOSA e colaboradores (2006), utilizando-se de 110 isolados de E.
faecalis de diferentes regiões do mundo para tipagem por MLST, observou
complexos genéticos adaptados ao ambiente hospitalar e entre os maiores
complexos encontrava-se o CC2. Outras análises genéticas do E. faecalis
revelaram que a resistência adquirida aos antibióticos mais prevalentes foram nas
66
linhagem genéticas CC2, além de ser encontrado quase que unicamente
proveniente de amostras hospitalares (KUCH et al., 2012; MCBRIDE et al., 2007).
Como observado, o estudo ilustra a relevância da vigilância
epidemiológica nas instituições de saúde com o intuito de identificar, monitorar e
controlar a disseminação desses micro-organismos no ambiente hospitalar. Além
disso, a presença ERV no trato gastrointestinal demonstra a existência de um
grande reservatório dessas bactérias. Sendo assim, surtos tornam-se difíceis de
controlar após a sua introdução nos hospitais, tendo em vista a colonização dos
pacientes. Além do mais, contaminação do ambiente e da equipe assistencial
também estão intimamente relacionados com a dispersão desses organismos e a
dificuldade na erradicação do mesmo.
A realização de programas de vigilância para MMR são imprescindíveis
para detectar os portadores e implementar as medidas de controle. Por não haver
concordância entre os protocolos de descolonização do paciente ERV positivo, a
metodologia recomendada para esses casos e adotado pelos hospitais pesquisados
são a prevenção de contato, a higiene das mãos, o uso de aventais e de luvas, além
da descontaminação do ambiente e do material utilizado. Como também, o uso
prudente dos antibióticos no tratamento. Desse modo, é possível diminuir a
prevalência de casos por ERV (BRASIL, 2007, 2009).
Embora a forma que ocorreu essa disseminação e emergência desse
micro-organismo, pelos pacientes e hospitais da cidade do Natal, ainda permaneça
incerta, com necessidades de mais esclarecimentos, a dispersão inter-hospitalar
durante um período prolongado de tempo destaca a necessidade de medidas de
melhoria na higiene e na melhor administração da terapia antimicrobiana com intuito
de conter esse cenário de potencial epidemia de infecção por ERV.
67
7 CONCLUSÃO
Essa pesquisa permitiu concluir que:
• A espécie E. faecalis é a mais prevalente nos hospitais pesquisados;
• Os ERV apresentaram multirresistência, com resistência a pelo menos
quatro classes diferentes (glicopeptídio, macrolídeo, tetraciclina e
quinolonas) de antimicrobianos utilizados na rotina clínica;
• Ocorreu uma alta prevalência de isolados ERV apresentando o fenótipo
HLRA.
• A elevada susceptibilidade observada à linezolida sugere que essa
droga pode ser utilizada como opção viável para o tratamento de
infecções enterocócicas;
• Todos os ERV pertencem ao genótipo vanA;
• Todos os ERV apresentaram pelo menos um fator de virulência, sendo
os genes gelE (gelatinase) e asa1 (substância agregativa) os mais
prevalentes;
• A tipagem com PFGE evidenciou uma disseminação de dois clones (A
e B), que possivelmente dispersaram igualmente pelos hospitais da
cidade do Natal;
• A tipagem por MLST demostrou que os clones A e B pertencem aos
ST6 e ST525, do complexo clonal CC2. O primeiro, associado a infecções
humanas em hospitais de todo mundo e o segundo, epidêmico no Brasil.
68
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87
APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa: intitulado Caracterização
fenotípica e molecular de cepas de Enterococcus sp. resistentes à
vancomicina (VRE) relacionadas a um surto na cidade do Natal-RN, que tem
como pesquisador, Emília Sousa de Oliveira.
Pedimos a sua autorização para o depósito, o armazenamento, a utilização e
descarte do material biológico humano: cepas bacterianas de Enterococcus sp. -
isolados de cultura de vigilância, cultura de fragmento de osso, cultura de urina,
cultura de ponta de cateter, cultura de secreção de úlcera ou cultura de secreção
ocular. A utilização do seu material biológico está vinculada somente a este projeto
de pesquisa ou se você concordar em outros futuros. Nesta pesquisa pretendemos
caracterizar as bactérias da espécie Enterococcus que são resistentes ao antibiótico
vancomicina que estão relacionadas a um surto infeccioso na cidade do Natal/RN. O
motivo que nos leva a fazer este estudo é que a melhoria do conhecimento e
entendimento sobre esses microrganismos pode resultar em um melhor controle e
prevenção dessas infecções na nossa cidade.
Para esta pesquisa adotaremos os seguintes procedimentos: as bactérias
isoladas serão testadas para averiguar a resistência aos antibióticos que são
utilizados nos hospitais, além disso testaremos quais são os genes encontrados que
resultam na falha ao tratamento ao antibiótico vancomicina e também analisaremos
a semelhança genética entre as bactérias coletadas. Todo o material testado será
armazenado em freezer à -20°C para conservação e a destruição será por vapor de
água em alta temperatura e pressão.
Os riscos envolvidos na pesquisa serão mínimos, todos os recursos serão
utilizados para garantir o seu anonimato nessa pesquisa. Os materiais serão
nomeados somente por numeração para quem não haja identificação. A pesquisa
contribuirá para um entendimento das infecções relacionadas ao Enterococcus na
Rubrica do pesquisador: ____________ Rubrica do participante:____________
88
região metropolitana de Natal, e dessa forma, podermos fornecer dados para o
tratamento dessas infecções e para a prevenção das doenças.
Durante todo o período da pesquisa você poderá tirar suas dúvidas ligando
para Emília, telefone: (84) 98743-1008, ou para Profa Maria Celeste, telefone: (84)
98826-4688.
Você tem o direito de se recusar a participar ou retirar seu consentimento, em
qualquer fase da pesquisa, sem nenhum prejuízo para você.
Os dados que você irá nos fornecer serão confidenciais e serão divulgados
apenas em congressos ou publicações científicas, não havendo divulgação de
nenhum dado que possa lhe identificar. Esses dados serão guardados pelo
pesquisador responsável por essa pesquisa por um período de 5 anos na sala Profa
Maria Celeste Nunes de Melo do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte e após esse tempo serão destruídos.
Os pesquisadores tratarão a sua identidade com padrões profissionais de sigilo,
atendendo a legislação brasileira (Resoluções Nº 466/12; 441/11 e a Portaria 2.201
do Conselho Nacional de Saúde e suas complementares), utilizando as informações
somente para fins acadêmicos e científicos.
Se você tiver algum gasto pela sua participação nessa pesquisa, ele será
assumido pelo pesquisador e reembolsado para você. Se você sofrer algum dano
comprovadamente decorrente desta pesquisa, você será indenizado.
Qualquer dúvida sobre a ética dessa pesquisa você deverá ligar para o
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
telefone 3215-3135.
Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra
com o pesquisador responsável Profa Maria Celeste Nunes de Melo.
Rubrica do pesquisador: ____________ Rubrica do participante:____________
89
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu, _____________________________________________, portador do documento de
Identidade ____________________ fui informado (a) dos objetivos, métodos, riscos e benefícios da
pesquisa Caracterização fenotípica e molecular de cepas de Enterococcus sp. resistentes à
vancomicina (VRE) relacionadas a um surto na cidade do Natal-RN, de maneira clara e detalhada
e esclareci minhas dúvidas. Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informações e
modificar minha decisão de participar se assim o desejar.
( ) Concordo que o meu material biológico seja utilizado somente para esta pesquisa.
( ) Concordo que o meu material biológico possa ser utilizado em outras pesquisas, mas serei
comunicado pelo pesquisador novamente e assinarei outro termo de consentimento livre e
esclarecido que explique para que será utilizado o material.
Natal, _____ de _______________de ______
Assinatura do participante da pesquisa
Declaração do pesquisador responsável
Como pesquisador responsável pelo estudo Caracterização fenotípica e molecular de
cepas de Enterococcus sp. resistentes à vancomicina (VRE) relacionadas a um surto na cidade
do Natal-RN, declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos
metodologicamente e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo,
assim como manter sigilo e confidencialidade sobre a identidade do mesmo.
Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido estarei
infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde
– CNS, que regulamenta as pesquisas envolvendo o ser humano.
Natal _____ de _______________de ______
Assinatura do pesquisador responsável
Impressão datiloscópica do
participante
90
APÊNDICE B
91
92
ANEXO A
93
94
95
96
97
98
99
