(12) PEDIDO INTERNACIONAL PUBLICADO SOB O TRATADO DE COOPERAÇÃO EM MATÉRIA DE PATENTES(PCT)

(19) Organização Mundial daPropriedade IntelectualSecretaria Internacional - - ,

) Número de Publicação Internacional(43) Data de Publicação Internacional ' ' WO 2012/149622 Al

8 de Novembro de 2012 (08.11.2012) W P O I P C T

(51) Classificação Internacional de Patentes : Almeida, 521, Apto 202, Bairro Santo Antônio, BeloA61K 49/00 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) Horizonte, MG (BR). SEYFFERT, Núbia [BR/BR]; RuaA61K 39/35 (2006.01) C12Q 1/00 (2006.01) Alameda dos Coqueiros, 690, Apto 12, Bairro São Luiz,A61K 39/05 (2006.01) C12R 1/15 (2006.01) Belo Horizonte, MG (BR). ALVES DORELLA,G01N 33/483 (2006.01) Fernanda [BR/BR]; Rua dos Bandolins, 215, Apto 602,

Bairro Conjunto Califórinia I, Belo Horizonte, MG (BR).(21) Número do Pedido Internacional SILA DE ALMEIDA, Sintia [BR/BR]; Rua das

PCT/BR20 12/000 134 Bnadeiras, 32 1, Bairro Indaiá, Cep:3 1270-090 Belo(22) Data do Depósito Internacional : Horizonte, MG (BR). MYIOSHI, Anderson [BR/BR];

2 de Maio de 2012 (02.05.2012) Rua Hélio de Senna Figueiredo, 112, Apto 101, BairroSerrano, Cep:30882-600 Belo Horizonte, MG (BR).

(25) Língua de Depósito Internacional : Português GUIMARÃES GOUVEIA, Aurora Maria [BR/BR]; Rua

(26) Língua de Publicação : Português Dr. Alípio Goulart, 136, Bairro Serra, Belo Horizonte, MG(BR).

(30) Dados Relativos à Prioridade :PI1 102202-7 2 de Maio de 201 1 (02.05.201 1) BR (74) Mandatário : DE CASTRO LEITE GORI, Ana Luiza;

Avenida Antônio Carlos, 6627, Unidade Administrativa II,(71) Requerente (para todos os Estados designados, exceto 2o andar, sala 2008, Cep: 31270-901 Belo Horizonte, MG

US) : UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS (BR).GERAIS - UFMG [BR/BR]; Avenida Antônio Carlos,6627, Unidade Administrativa II, 2o andar, sala 2013, (81) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos

Cep:3 1270-901 Belo Horizonte, MG (BR). os tipos de proteção nacional existentes) : AE, AG, AL,AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY,

(72) Inventores; e BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM,(75) Inventores/Requerentes (para US unicamente) : DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT,

ARISTON DE CARVALHO AZEVEDO, Vasco HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP,[BR/BR]; Rua Padre Leopoldo Mertens, Bairro São KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD,Francisco, Cep:3 1255-200 Belo Horizonte, MG (BR). DE ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI,SÁ GUIMARÃES, Alessandro [BR/BR]; Rua Santos, 80, NO, NZ, OM, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW,Apto 302, Bairro Jardim América, Cep:30460-700 Belo SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM,Horizonte, MG (BR). AZEVEDO ANTUNES DE TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM,OLIVEIRA, Camila [BR/BR]; Rua Guilherme de ZW.

(Continua na página seguinte)

(54) Title : SKIN TEST FOR DIAGNOSING SUBCLINICAL CASEOUS LYMPHADENITIS IN GOATS AND SHEEP

(54) Título TESTE DE PELE PARA DIAGNÓSTICO DA LINFADENITE CASEOSA SUBCLÍNICA EM CAPRINOS EOVINOS

FIGURA 1

(57) Abstract : The present invention describes a skin test characterised in that it comprises protein antigens secreted byCorynebacterium pseudotuberculosis for diagnosing subclinical caseous lymphadenitis in goats and sheep. This test allows goatsand sheep to be tested positive on the farm for caseous lymphadenitis (CL), assisting in combating the infection, since the test can beperformed by field veterinarians.

(57) Resumo : A presente invenção descreve teste de pele caracterizado por compreender antígenos protéicos secretados deCorynebacterium pseudotuberculosis para diagnóstico da Iinfadenite caseosa subclínica em caprinos e ovinos. Este teste permite aavaliação de caprinos e ovinos em nível de fazenda quanto à positividade para Iinfadenite caseosa (LC), favorecendo controle dainfecção, visto que pode ser realizado por médicos veterinários atuantes no campo.

wo 2012/149622 Al I I II II I «III I I I I I l llll ll l l l llll II I II

(84) Estados Designados (sem indicação contrária, para RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, Cl,todos os tipos de proteção regional existentes) : ARIPO CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).(BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL,

Publicado:SZ, TZ, UG, ZM, ZW), Eurasiático (AM, AZ, BY, KG,KZ, RU, TJ, TM), Europeu (AL, AT, BE, BG, CH, CY, — com relatório de pesquisa internacional (Art. 21(3))CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS,ΓΓ , LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO,

"Teste de pele para diagnóstico da linfadenite caseosa subclínica em

caprinos e ovinos"

A presente invenção descreve teste de pele caracterizado por

compreender antígenos protéicos secretados de Corynebacterium

pseudotuberculosis para diagnóstico da linfadenite caseosa subclínica em

caprinos e ovinos. Este teste permite a avaliação de caprinos e ovinos em nível

de fazenda quanto à positividade para linfadenite caseosa (LC), favorecendo

controle da infecção, visto que pode ser realizado por médicos veterinários

atuantes no campo.

A LC é uma doença crónica causada por bactérias da espécie

Corynebacterium pseudotuberculosis, que acomete principalmente pequenos

ruminantes e é responsável por perdas económicas significativas relacionadas

à redução da produtividade e eficiência reprodutiva dos animais infectados

(Arsenault, J.O.; Girard, C ; Dubreuil, P.; Daignault, D. O.; Galarneau, J.-R.;

Boisclair, J., Simard, C ; Bélanger, D. Prevalence of and carcass condemnation

from maedi-visna, paratuberculosis and caseous lymphadenitis in culled sheep

from Quebec, Canada, Prev. Vet. Med., v. 59 , p. 67-81 , 2003; Dorella, F.A.;

Pacheco, L.G.C.; Oliveira, S.C; Miyoshi, A.; Azevedo, V. Corynebacterium

pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties, pathogenesis and

molecular studies of virulence, Vet. Res., v. 37, p. 201-21 8, 2006). Essa

enfermidade é prevalente em países como Austrália, Nova Zelândia, África do

Sul, Estados Unidos, Canadá e Brasil, onde existe intensa atividade de ovino e

caprinocultura (Guimarães, A.S., Carmo, F.B. Pauletti, R.B. Seyffert, N.,

Ribeiro, D., Lage, A.P. Heinemann, M.B. Miyoshi, A., Azevedo, V . Gouveia,

A.M.G. Caseous Lymphadenitis: Epidemioiogy, Diagnosis, and Control, The

IIOAB Journal, v. 2 , p. 33-43, 201 1) . Poucos são os trabalhos de

soroprevalência de linfadenite caseosa no Brasil, porém altas prevalências já

foram detectadas em alguns estados. Em Minas Gerais foram detectadas

75,8% de prevalência em ovinos e 95,9% de rebanhos positivos (Guimarães,

A.S. Seyffert, N., Bastos, B.L. Portela, R.W.D. Meyer, R., Carmo, F.B., Cruz,

J.C.M.. McCulloch, J.A., Lage, A.P. Heinemann, M.B., Miyoshi, A., Azevedo, V.

Gouveia, A.M.G. Caseous lymphadenitis in sheep flocks of the state of Minas

Gerais, Brazil: Prevalence and management surveys, Small Ruminant

Research v. 87, p. 86-91 , 2009). Em caprinos foi detectada prevalência animal

de 78,9% e 98% de rebanhos positivos (Seyffert, N., Guimarães, A.S.

Pacheco, LG.C. Portela, R.W. Bastos, B.L, Dorella, F.A., Heinemann, M.B.,

Lage, A.P., Gouveia, A.M.G., Meyer, R., Miyoshi, A., Azevedo, V. High

seroprevalence of caseous lymphadenitis in Brazilian goat herds

revealed by Corynebacterium pseudotuberculosis secreted proteins-based

ELISA, Research in Veterinary Science, v. 88, p. 50-55, 2010).

Alguns ensaios de diagnósticos para a LC foram testados, porém

apresentaram resultados pouco satisfatórios. Além de necessitarem da coleta

das amostras nas propriedades, demandando tempo para serem realizados, o

custo é alto e os testes necessitam de mão-de-obra especializada (Dercksen,

D.P., Brinkhof, J.M.A., Dekker-Nooren, T., Van Maanen, K., Bode, C.F., Baird,

G., Kamp, E.M. A comparison of four serological tests for the diagnosis of

caseous lymphadenitis in sheep and goats, Vet. Microbiol. 75, 167-1 75, 2000;

Williamson, L.H. Caseous lymphadenitis in small ruminants, Vet. Clin. North

Am. Food Anim. Pract., v. 17, p. 359-371 , 2001 ; Menzies, P.I.; Hwang, T.-l.;

Prescott, J.F. Comparison of an interferon-gamma to a phospholipase D

enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Corynebacterium

pseudotuberculosis infection in experimentally infected goats, Vet. Microbiol., v.

100, p.129-137, 2004; Dorella, F. A.; Pacheco, L. G. C ; Oliveira, S. C ; Myoshi,

A.; Azevedo, V . Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology,

biochemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence.

Veterinary Research, v. 37, n . 2, p. 201 -21 8 , 2006.).

Encontra-se na literatura uma metodologia, baseada em uma reação de

PCR multiplex (mPCR), para detecção mais rápida e eficiente de C.

pseudotuberculosis em amostras clínicas de animais portadores de LC

(Pacheco, LG.C, Pena, R.R., Castro, T.L.P., Dorella, F.A., Bahia, R.C.,

Carminati, R., Frota, M.N.L, Oliveira, S.C., Meyer, R., Alves, F.S.F., Miyoshi,

A., AZEVEDO, V. Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium

pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this

Pathogen in Clinicai Samples. J . Med. Microbiol., v. 56, p. 480-486, 2007).

Através da utilização da mPCR associada a um método de extração de DNA

bacteriano diretamente de material purulento, consegue-se detectar C.

pseudotuberculosis mais rapidamente e de maneira tão específica quanto seria

feito utilizando-se cultura bacteriológica e identificação bioquímica de isolados,

que é atualmente o padrão-ouro para o diagnóstico da LC. Porém, pesar da

alta sensibilidade e especificidade, esta técnica laboratorial demanda material

de alto custo e pessoal capacitado para sua execução.

A inexistência de um diagnóstico satisfatório para LC, principalmente na

fase subclínica da enfermidade, compromete o manejo eficaz dos animais e

contribui para a disseminação da doença. O diagnóstico ideal para prevenir a

proliferação da enfermidade em um rebanho deveria ser sensível e específico o

suficiente para detecção da infecção em fase inicial e de fácil aplicação em

animais de campo. Com este propósito, um teste de pele foi desenvolvido para

uso em caprinos, utilizando Fosfolipase D (PLD) de C. pseudotuberculosis,

porém as reações foram observadas somente após um período de 10 dias

(Alves, F. S. F.; Olander, H. Uso de Vacina Toxóide no Controle da Linfadenite

Caseosa em Caprinos. Journal of Veterinary Sciencen. v.5, n.1 , p. 69-74,

1999). Anteriormente já havia sido realizado um teste de pele utilizando células

bacterianas fragmentadas, e os resultados foram semelhantes (Brown, C.C.;

Olander, H.J.; Biberstein, E.L.; Morse, S.M. Use of a toxoid vaccine to protect

goats against intradermal challenge exposure to Corynebacterium

pseudotuberculosis, Am. J. Vet. Res., v. 47, p. 1116-1 119 , 1986).

O teste de pele é um método de diagnóstico utilizado para verificar

infecções causadas por microrganismos intracelulares facultativos com

imunidade mediada por células. Esse teste demonstrou melhor eficiência no

diagnóstico da tuberculose bovina quando realizado com as proteínas

recombinantes ESAT6 e CFP1 0 de Mycobacterium bovis do que o teste de

pele tradicional que utiliza células bacterianas fragmentadas (Aagaard, C ;

Govaerts, M.; Meikle, V.; Vallecillo, A. J.; Gutierrez-Pabello, J. A.; Suarez-

Gu" Emes, F.; Mcnair, J.; Cataldi, A.; Espitia.C; Andersen, P.; Pollock, J . M.

Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovis in Herds

with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis: ESAT6-CFP10 Mixture

Shows Optimal Sensitivity and Specificity. J . Clin. Microbiol., v. 44, p. 4326-

4335, 2006).

Os fatores de virulência, genes e proteínas de C. pseudotuberculosis

como: PLD, lipídeos tóxicos da parede celular, genes fag A, B, C e D,

envolvidos com a absorção de ferro, a proteína do choque térmico Hsp60 e a

protease CP40, já foram identificados e testados em diferentes experimentos.

(Lipsky, B.A.; Goldberger, A.C.; Tompkins, L.S.; Plorde, J.J. Infections Caused

By Nondiphtheria Corynebacteria, Rev. Infect. Dis., v. 4, p. 1220-1 235, 1982; ,

Hodgson, A.L.M.; Krywult, J.; Comer, LA.; Rothel, J.S.; Radford, A.J. Rational

attenuation of Corynebacterium pseudotuberculosis: potential cheesy gland

vaccine and live delivery vehicle, Infect. Immun., v. 60, p.2900-2905, 1992;

Carne, H.R.; Onon, E.O. Action of Corynebacterium ovis exotoxin on

endothelial cells of blood vessels, Nature, v. 271 , p. 246-248. 1978; Hard, G.C.

Examination by electron microscopy of the interaction between peritoneal

phagocytes and Corynebacterium ovis, J . Med. Microbiol., v. 5, p. 483-491 ,

1972; Billington, S.J.; Esmay, P.A.; Songer, J.G.; Jost, B.H. Identification and

role in virulence of putative iron acquisition genes from Corynebacterium

pseudotuberculosis, FEMS Microbiol. Lett., v. 208, p. 41-45, 2002; Wilson,

M.J.; Brandon, M.R.; Walker, J. Molecular and biochemical characterization of a

protective 40-kilodalton antigen from Corynebacterium pseudotuberculosis,

Infect. Immun., v. 63, p. 206-21 1, 1995). Além disto, alguns pesquisadores

analisaram e caracterizaram proteínas solúveis e insolúveis de C.

pseudotuberculosis que apresentavam potencial imunodominante (Merchant,

I.A.; Packer, R.A. The Genus Corynebacterium, in: Merchant I.A., Packer R.A.

(Eds.), Veterinary bacteriology and virology, The lowa State University Press,

lowa, p. 425-440. 1967).

Além desses, outros componentes imunogênicos secretados-excretados

foram descritos usando a técnica de imunoblot, detectados com o uso de soro

caprino infectado, podendo ser úteis como componentes vacinais e de

diagnóstico (Paule, B.J.A.; Meyer, R.; Moura-Costa, L.F.; Bahia, C.R.;

Carminati, R.; Régis, L.F.; Vale, V.L.C.; Freire, S.M.; Nascimento, I.; Schaer, R.;

Azevedo, V. Three-phase partitioning as an efficient method for

extraction/concentration of immunoreactive excreted-secreted proteins of

Corynebacterium pseudotuberculosis, Protein Expr. Purif., v. 34, p. 3 11-166.

2004; Paule, B.J.A. Estudos de antígenos de Corynebacterium

pseudotuberculosis e de suas interações com o hospedeiro caprino. 2003.

138p. Tese, Doutorado em Imunologia, Instituto de Ciências da saúde da

UFBA). Seyffert obteve seis proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis

que tiveram antigenicidade avaliadas, porem não foram testadas em nível de

campo em caprinos e ovinos (Seyffert, N. 2009. Isolamento, identificação e

análise molecular do gene cpsec39 codificador de uma proteína exclusiva de

Corynebacterium pseudotuberculosis: perspectivas no desenvolvimento de

métodos profiláticos para o controle da linfadenite caseosa. 97pp. Tese de

Mestrado do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais).

Langenegger e colaboradores (Langenegger, C.H.; Langenegger, J.;

Costa, S.G - Alérgeno para o diagnóstico da linfadenite caseosa em caprinos,

Pesquisa Veterinária Brasileira, v.7, n.2, p.27-32, 1987) trabalharam com

alérgeno para o diagnóstico da linfadenite caseosa em caprinos através da

inoculação de 0,1 ml de linfadenina, nas concentrações de 0,25 e 0,1 2 mg/mL,

por via intradérmica na região da omoplata de caprinos. Qs animais portadores

da doença desenvolveram reações alérgicas locais, com maior intensidade

após 48 horas e com aumento da espessura da dobra da pele variando entre

1,6 a 12,2 mm. É importante ressaltar que o protocolo de obtenção das

proteínas utilizado nesse trabalho (linfadenina) foi diferente do proposto no

presente pedido de patente, a secretina. O meio de cultivo utilizado foi caldo de

soja tríptica, o produto final era constituído de proteínas bacterianas

hidrossolúveis, autoclavadas e precipitadas por ácido tricloroacético, enquanto

a secretina é constituída apenas de proteínas secretadas pela

Corynebacterium pseudotuberculosis. Além disto, a massa bacteriana da

linfadenina foi diluída em fosfato de sódio e depois diluída em solução

conservadora constituída de glicerina, fenol e tampão fosfato enquanto que a

secretina é diluída em solução TrisHCI, totalmente inócua para caprinos

conforme testes de campo.

O documento de patente RU2053295, "Strain of bacterium

corynebacterium pseudotuberculosis used as reference one and for preparing

diagnostic preparations at caseous lymphadenitis", descreve o uso de uma

cepa de Corynebacterium pseudotuberculosis para identificação de linfadenite

caseosa em caprinos por diagnóstico sorológico, alérgico e bacteriológico. Os

resultados para diagnóstico alérgico são obtidos 24 h após inoculo intracutâneo

do alérgeno na região subcaudal de caprinos. Porém, o alérgeno utilizado

neste documento difere da secretina, utilizada na presente invenção.

No estado da técnica não existe produto padronizado de proteínas totais

secretadas de Corynebacterium pseudotuberculosis para utilização em teste de

pele. A presente invenção permite diagnóstico da linfadenite caseosa no prazo

de 24-72 h, semelhante ao diagnóstico de tuberculose bovina através de teste

de pele. Além disso, a presente invenção possibilitará padronizar valores do

teste para classificação dos animais, positivos ou negativos, para linfadenite

caseosa, fundamentais para espécies ovinas e caprinas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURA 1 - Aferição da espessura da pele com cutímetro de animais da raça

Saanen, machos, com aproximadamente 6 meses de idade, anterior à

inoculação da secretina, ambos do grupo B (artificialmente infectados)

FIGURA 2 - Aferição da espessura da pele com cutímetro dos animais da raça

Saanen, machos, com aproximadamente 6 meses de idade, 24 h após a

inoculação da secretina, ambos do grupo B (artificialmente infectados)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

O desenvolvimento da presente tecnologia envolveu os seguintes

passos: (1) obtenção da secretina de C. pseudotuberculosis não submetido a

nenhum tipo de stress, através da técnica de fracionamento em três fases, (2)

avaliação da antigenicidade das proteínas obtidas utilizando soros de caprinos

e ovinos em diferentes estágios da infecção por C. pseudotuberculosis, (3)

desenvolvimento do teste de pele em caprinos e ovinos infectados por C.

pseudotuberculosis, (4) determinação dos parâmetros de classificação dos

animais testados no teste de pele em negativos, inconclusivos e positivos.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, de forma não

limitante, através dos exemplos que se seguem:

EXEMPLO 1 - Obtenção da secretina

A cepa bacteriana MIC 6 de C. pseudotuberculosis biovar ovis foi

cultivada a 37°C em meio "Infusão Cérebro-Coração" (BHI) conforme Pacheco

e colaboradores (Pacheco, L.G.; Pena, R.R.; Castro, T.L; Dorella, F.A.; Bahia,

R.C.; Carminati, R.; Frota, M.N.,; Oliveira, S.C.; Meyer, R.; Alves, F.S.; Miyoshi,

A.; Azevedo, V.. Multiplex PCR assay for Identification of Corynebacterium

pseudotuberculosis from pure cultures and for rapid detection of this pathogen

in clinicai samples. J Med Microbiol. v. 56, pp. 480-486, 2007.e Pacheco, L.G.;

Slade S.E.; Seyffert N.; Santos, A.R.; Castro, T.L; Silva, W.M.; Santos, A.V.;

Santos, S.G.; Farias, LM.; Carvalho, M.A.; Pimenta, A.M.; Meyer, R.; Silva, A.;

Scrivens, J.H.; Oliveira, S.C.; Miyoshi, A.; Dowson, C.G.; Azevedo, V. A

combined approach for comparative exoproteome analysis of Corynebacterium

pseudotuberculosis. BMC Microbiol., v.1 1- 2; p. 1-14. 201 1).

A secretina foi obtida através da técnica de fracionamento em três fases

(TPP), segundo Paule e colaboradores (Paule, B.J.; Meyer, R.; Moura-Costa,

L.F.; Bahia, R.C.; Carminati, R.; Régis, L.F.; Vale, V.L; Freire, S.M.;

Nascimento, I.; Schaer, R.; Azevedo, V. Three-phase partitioning as an efficient

method for extraction/concentration of immunoreactive excreted-secreted

proteins of Corynebacterium pseudotuberculosis. Protein Expr Purif., v. 34, p.

3 11-316, 2004).

Pré-culturas overnight (~ 2-1 8hrs) da linhagem de C.

pseudotuberculosis MIC 6 foram re-inoculadas ( 1 :200) em meio BHI (Infusão

de cérebro de bezerro, infusão de coração bovino, peptona, dextrose, cloreto

sódio e fostato dissódico) pré-aquecido a 37°C, e incubadas por adicionais 24

h , 500 ml_, até atingirem o início da fase exponencial de crescimento (D0 54onm

= -0.3-0.4, LabSystems iEMS Absorbance Plate Reader).

As culturas foram centrifugadas por 20 minutos a 4000 rpm para baixar

as células e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. As

amostras foram filtradas em filtros de 0.22 µιτι e em seguida foram adicionados

sulfato de amónio na concentração de 30% (p/v) e n-butanol no mesmo volume

do sobrenadante, o pH da mistura ajustado para 4.0. A solução misturada foi

incubada à temperatura ambiente por uma hora e centrifugada a .350 X g por

10 minutos para a separação em três fases. A precipitação interfacial foi

coletada e dissolvida em 1 ml_ de Tris 20 mM (pH 7.4) acrescido de coquetel

inibidor de proteases (Sigma) na proporção de 1 µ Ι para 00 µ Ι do produto final

obtido (Paule et al, 2004). O extrato protéico então foi submetido a diafiltração

com colunas Amicon, fator de exclusão de 5 kDa (Millipore).

EXEMPLO 2 - Testes de antigenicidade da secretina

As amostras sorológicas de caprinos e ovinos compreenderam os

seguintes grupos: animais não infectados (controle negativo); animais

vacinados (artificialmente infectados) e animais em diferentes estágios da

infecção natural por C. pseudotuberculosis.

A imunogenicidade das proteínas foi avaliada através de ELISA

(Enzime-linked immunossorbent assay) indireto no qual as mesmas foram

utilizadas como antígeno, de acordo com Carminati e colaboradores (Carminati,

R.; Bahia, R.; Moura-Costa, L . F.; Paule, B.J.A.; Vale, V. L ; Régis, L ; Freire,

S.M.; Nascimento, I.; Schaer, R.; Meyer, R. Determinação da sensibilidade e

da especificidade de um teste de ELISA indireto para o diagnóstico de

linfadenite caseosa em caprinos. R. Ci. Méd. Biol., v. 2, p. 88-93, 2003).

Microplacas de poliestireno de 96 cavidades (Nunc-ImmunoTM Plate

PolySorpTM Surface, NUNCTM Brand Products) foram sensibilizadas com as

proteínas a 4o C, overnight, diluídas em tampão carbonato bicarbonato pH 9,8.

As placas foram lavadas 3 vezes com tampão salino fosfato pH 8,0 acrescido

de Tween 20 0,05% (PBS-T) e bloqueadas com caseína 0,25% por 1h a 37° C.

Após mais 3 lavagens com PBS-T, os soros dos animais mencionados no item

anterior foram diluídos em PBS-T e adicionados às placas. As amostras foram

incubadas por 1 h a 37° C e, após nova lavagem das placas, foi adicionado o

soro anti-imunoglobulina de caprinos ou ovinos conjugado com peroxidase

(Sigma) diluído em PBS-T, incubando-se por mais h a 37° C. Após 5 lavagens

com PBS-T, o substrato ELISA-OPD Peroxidase (Sigma) foi adicionado e a

placa incubada por 15 minutos à temperatura ambiente em local escuro. A

leitura da densidade óptica foi realizada a 450 nm em leitor de ELISA Multiskan

MCC/340 (Titertek).

As amostras de soro de cada animal foram avaliadas em triplicata no

teste de ELISA segundo Carminatti et al, 2003 (Renato Carminati, Robson

Bahia, Lília Ferreira de Moura Costa, Bruno Jean Adrien Paule, Vera Lúcia

Vale, Lia Régis, Songeli Menezes Freire, Ivana Nascimento, Robert Schaer,

Roberto Meyer, Determinação da sensibilidade e da especificidade de um teste

de ELISA indireto para o diagnóstico de linfadenite caseosa em caprinos. R. C

Méd. Biol., 2, 1, 88-93, 2003).

EXEMPLO 3 - Sequenciamento das proteínas presentes na secretina

O sequenciamento das proteínas foi realizado segundo Pacheco e

colaboradores (Pacheco, L.G.C, Susan e Slade, Seyffert, N., Santos, A.R

Castro, T.L.P., Silva, W.M., Santos, A.V., Santos, S.G., Farias, LM., Carvalho,

M.A.R., Pimenta, A.M.C., Meyer, R., Silva, A., Scrivens, J.H Oliveira, S.C.,

Miyoshi, A., Dowson, C.G., Azevedo, V. A combined approach for comparative

exoproteome analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis. Pacheco et al.

BMC Microbiology 20 1, 11:1 2). A Tabela 1 lista as proteínas sequenciadas de

Corynebacterium pseudotuberculosis a partir da secretina.

Tabela 1 - Proteínas sequenciadas a partir da secretina de

Corynebacterium pseudotuberculosis

SEQIdentidade da proteína Número de acesso

ID N

Conserved hypothetical protein1. [Corynebacterium pseudotuberculosis gi|302329728|gb|ADL1 9922. 11

1002]

Putative membrane protein2. [Corynebacterium pseudotuberculosis gi|302331646|gb|ADL21 840.

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330576|gb|ADL20770.1 1002]

Cell-surface hemin receptor

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 647|gb|ADL2 841 .

1002]

Putative cytochrome c oxidase subunit

2 [Corynebacterium >gi|302331 108|gb|ADL21 302.1

pseudotuberculosis 1002]

Putative cell-surface hemin receptor

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 144|gb|ADL21 338.1

1002]

Putative membrane protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330157|gb|ADL20351 . 1 |1002]

Conserved hypothetical protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330855|gb|ADL21 049.1 11002]

NLP/P60 protein [Corynebacterium>gi|302331 099|gb|ADL21 293.1

pseudotuberculosis 1002]

Trehalose corynomycolyl transferase

C [Corynebacterium >gi|302331 6 8|gb|ADL21 8 12 . 1pseudotuberculosis 1002]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302206205|gb|ADL1 0547. 1

C231]

Putative HtaA Family protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302331 143|gb|ADL21 337. 11002]

Putative NPIJP60 family secreted

protein [Corynebacterium >gi|302331 100|gb|ADL21 294. 11pseudotubercuiosis 1002]

Substrate-binding protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302331 720|gb|ADL21 14.1

1002]

Hypothetical protein CpC231_0129

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205284|gb|ADL09626.1

C231]

Putative transglycosylase

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302330293|gb|ADL20487.1

1002]

Penicillin-binding protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302331696|gb|ADL21 890.

1002]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302330094|gb|ADL20288.1

1002]

Putative surface-anchored protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 7 17|gb|ADL21 9 11.1

002]

Conserved hypothetical protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330028|gb|ADL20222.1 11002]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 731 |gb|ADL21 925.1 11002]

Poly(3-hydroxybutyrate)

depolymerase [Corynebacterium >gi|302330594|gb|ADL20788.1

pseudotuberculosis 1002]

Putative membrane protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 081 |gb|ADL21 275. 11002]

Cell-surface hemin receptor

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|3023301 53|gb|ADL20347. 1

1002]

Putative efflux system protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 553|gb|ADL21 747. 111002]

putative phosphatase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205522|gb|ADL09864.1

C231]

Putative surface-anchored membrane

protein [Corynebacterium >gi|302329880|gb|ADL20074.1

pseudotuberculosis 1002]

resuscitation-promoting factor RpfB

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330380|gb|ADL20574.1

1002]

Putative secreted hydrolase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330235|gb|ADL20429.1

1002]

Trehalose corynomycolyl transferase

B [Corynebacterium >gi|302331 620|gb|ADL21 8 4 .

pseudotuberculosis 1002]

Putative secreted hydrolase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329940|gb|ADL20134.1 |

1002]

surface layer protein A

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329946|gb|ADL201 40.1

1002]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 520|gb|ADL21 7 4.1

1002]

Corynomycolyl transferase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 4 16|gb|ADL21 0 .

1002]

Sialidase precursor [Corynebacterium>gi|302330093|gb|ADL20287.1

pseudotuberculosis 1002]1

Putative trypsin-like serine protease

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330459|gb|ADL20653.1

1002]

Putative peptide transport system

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330456|gb|ADL20650.1

002]

Putative twin-arginine translocation

pathway signal protein>gi|302330314|gb|ADL20508.1

[Corynebacterium pseudotuberculosis1

1002]

Putative peptidoglycan recognition

protein [Corynebacterium >gi|302331 634|gb|ADL21 828.1

pseudotuberculosis 1002]

Peptidase, S8A (subtilisin) familyprotein [Corynebacterium >gi|302331305|gb|ADL21 499.1pseudotuberculosis 1002]

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329734|gb|ADL1 9928.1

1002]

Hemin receptor precursor

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330154|gb|ADL20348.1 |

1002]

metalloendopeptidase-like membrane

protein [Corynebacterium >gi|302330342|gb|ADL20536.1 1pseudotuberculosis 1002]

Putative serine protease

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330361 |gb|ADL20555.11002]

putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330272|gb|ADL20466.1 11002]

Lipoprotein LpqE [Corynebacterium>gi|302331 434|gb|ADL21 628.pseudotuberculosis 1002]

1

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329903|gb|ADL20097.1

1002]

Putative lysozyme precursor

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329779|gb|ADL1 9973. 1

1002]

putative phosphatase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205522|gb|ADL09864.1

C231]

putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330462|gb|ADL20656.11002]

Putative secretory lipase[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 473|gb|ADL21 667. 111002]

putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330261 |gb|ADL20455.11002]

Putative amino deoxychorismate lyase[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330834|gb|ADL21 028.11002]

Putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 045|gb|ADL21 239. 1

002]

ABC superfamily ATP binding cassettetransporter, binding protein

>gi|302330024|gb|ADL2021 8.1[Corynebacterium pseudotuberculosis1002]

Co-chaperonin GroES

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|3023301 24|gb|ADL2031 8.1

1002]

phosphoglyceromutase[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329967|gb|ADL201 6 1 . 1

002]

Elongation factor Tu [Corynebacterium>gi|302330046|gb|ADL20240.1

pseudotuberculosis 1002]

elongation factor Ts [Corynebacterium>gi|302330993|gb|ADL21 187.1

pseudotuberculosis 1002]

transcription elongation factor GreA[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30233041 8|gb|ADL2061 2 .11002]

Conserved hypothetical protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330028|gb|ADL20222.11002]

Thiol peroxidase [Corynebacterium>gi|302330853|gb|ADL21047.1 |

pseudotuberculosis 1002]

Phosphoglycerate kinase[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330796|gb|ADL20990.11002]

Triosephosphate isomerase[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330795|gb|ADL20989.11002]

Conserved hypothetical protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 148|gb|ADL21 342. 11002]

Putative Phosphocarrier protein HPr[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330920|gb|ADL21 114.11002]

Putative inhibitor of ODH activity[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330687|gb|ADL20881 . 1

002]

Putative methylmalonyl-CoAepimerase [Corynebacterium >gi|302330545|gb|ADL20739.1pseudotuberculosis 1002]

Putative lipoprotein [Corynebacterium>gi|302329778|gb|ADL1 9972.

pseudotuberculosis 002]

Hypothetical protein CpC231_1 797[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30220691 |gb|ADL1 53.C231]

Phospholipase D precursor (PLD)

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205182|gb|ADL09524.1 |

C231]

Serine proteinase precursor[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206997|gb|ADL1 1339.1C231]

Hypothetical protein CpC231_0514[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205659|gb|ADL1 0001 . 1 1C231]

Putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205529|gb|ADL09871 . 1

C231]

Putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206042|gb|ADL1 0384.1 1C231]

Hypothetical protein CpC231_1 756[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206871 |gb|ADL1 2 13.1C231]

Putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 343|gb|ADL21 537.1002]

Putative secreted protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206147|gb|ADL1 0489.1C231]

Secreted penicillin-binding protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205190|gb|ADL09532.1 |C231]

Putative DsbG protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 361 |gb|ADL21 555.11002]

Putative surface-anchored protein(fimbríal subunit) [Corynebacterium >gi|302207002|gb|ADL1 1344.1pseudotuberculosis C231]

Putative penicillin-binding secretedprotein [Corynebacterium >gi|302205355|gb|ADL09697.1pseudotuberculosis C231]

Putative membrane anchored protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206996|gb|ADL1 1338.1C231]

Conserved hypothetical protein[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206984|gb|ADL1 1326. 1C231]

Transcriptional regulator[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205648|gb|ADL09990.1C231]

Putative serine/threonine proteinkinase [Corynebacterium >gi|302206538|gb|ADL1 0880.1 1pseudotuberculosis C231]

Putative extracellular solute-bindingprotein [Corynebacterium >gi|30220551 0|gb|ADL09852.1pseudotuberculosis C231]

maltotriose-binding protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205530|gb|ADL09872.1

C231]

Putative zinc metallopeptidase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206284|gb|ADL1 0626.1

C231]

Putative iron transport system binding

(secreted) protein [Corynebacterium >gi|3022061 18|gb|ADL1 0460. 1|

pseudotuberculosis C231]

Glycerophosphoryl diesterphosphodiesterase [Corynebacterium >gi|302207068|gb| ADL1 4 10.1pseudotuberculosis C231]

Hypothetical protein CpC231_1 87

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206321 |gb|ADL1 0663.1 1C231]

Iron siderophore binding protein-FagD

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205186|gb|ADL09528.1 |

C231]

Hypothetical protein CpC231_0022

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205179|gb|ADL09521 .1 |

C231]

FHA-domain-containing protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205193|gb|ADL09535.1 |

C231]

Conserved hypothetical protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205253|gb|ADL09595.1

C231]

Conserved hypothetical protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205266|gb|ADL09608.1

C231]

Hypothetical protein CpC231_01 15

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205271 |gb|ADL09613.1

C231]

Putative Sdr-family related adhesin

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205321 |gb|ADL09663.1

C231]

Iron (Fe3+) ABC superfamily ATP

binding cassette transporter, binding>gi|302205338|gb|ADL09680.1

protein [Corynebacterium

pseudotuberculosis C231]

Two-component sensor protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205341 |gb|ADL09683.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205349|gb|ADL09691 . 1

C231]

Putative secreted phosphohydrolase

protein [Corynebacterium >gi|302205353|gb|ADL09695.1 1pseudotuberculosis C231]

Thiol-disulfide isomerase, secreted

protein [Corynebacterium >gi|302205363|gb|ADL09705.1

pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205376|gb|ADL0971 8.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205404|gb|ADL09746.1 1C231]

Putative secreted protein with DSBA-

like thioredoxin domain>gi|302205424|gb|ADL09766.1

[Corynebacterium pseudotuberculosis

C231]

Uroporphyrinogen decarboxylase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205434|gb|ADL09776.1

C231]

Putative secreted conserved protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205447|gb|ADL09789.1 1C231]

Putative secreted amino acid

hydrolase [Corynebacterium >gi|302205521 |gb|ADL09863.1 1pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205566|gb|ADL09908.1

C231]

NPL/P60-family secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30220561 5|gb|ADL09957.

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205684|gb|ADL1 0026.1

C231]

PDZ domain family, secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205697|gb|ADL1 0039. 11C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30220571 4|gb|ADL1 0056. 1

C231]

putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205720|gb|ADL1 0062.1

C231]

Hypothetical protein CpC231_ 0593

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205736|gb|ADL1 0078.1

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205740|gb|ADL1 0082. 1

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205806|gb|ADL1 0 48.1

C231]

resuscitation-promoting factor

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205821 |gb|ADL1 0 163.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205826|gb|ADL10168.1 |

C231]

Putative 2-nitropropane dioxygenase

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205838|gb|ADL1 0 180.1

C231]

Putative LpqU family protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205852|gb|ADL10194.1 |

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205859|gb|ADL1 0201 . 1C231]

putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302205965|gb|ADL1 0307.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302206032|gb|ADL1 0374.1

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotubercuiosis >gi|302206052|gb|ADL1 0394.1

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206135|gb|ADL1 0477.1

C231]

Putative SPFH domain, band 7

integral membrane protein>gi|302206200|gb|ADL1 0542.1

[Corynebacterium pseudotuberculosis

C231]

NADPH-dependent FMN reductase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206289|gb|ADL1 063 .1

C231]

NADPH-dependent FMN reductase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206366|gb|ADL1 0708. 1|

C231]

Putative penicillin-binding protein 2

(PBP-2) [Corynebacterium >gi|302206428|gb|ADL1 0770.1

pseudotuberculosis C231]

M23 peptidase domain-containing

protein [Corynebacterium >gi|302206439|gb|ADL1 0781 .1

pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206473|gb|ADL1 081 5.1

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206506|gb|ADL1 0848. 1

C231]

cell division protein FtsQ

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30220651 7|gb|ADL1 0859.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206603|gb|ADL1 0945.1

C231]

Putative guanyl-specific ribonuclease

Sa3 [Corynebacterium >gi|302206633|gb|ADL1 0975.1 1pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206772|gb|ADL1 4 . 1C231]

Hypothetical protein CpC231_1 762

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206877|gb|ADL1 12 19.1

C231]

D-Ala-D-Ala carboxypeptidase 3 (S1 3)

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206901 |gb|ADL1 1243.1

C231]

Multisubunit Na+/H+ antiporter,

subunit E [Corynebacterium >gi|302206921 |gb|ADL1 1263.1

pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206926|gb|ADL1 1268.1

C231]

Thiol-disulfide oxidoreductase resA

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206950|gb|ADL1 1292.1 1C231]

Cytochrome c-552 [Corynebacterium>gi|302206954|gb|ADL1 1296.1

pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206971 |gb|ADL1 3 3.1

C231]

DedA family protein [Corynebacterium>gi|302207052|gb|ADL1 1394.1

pseudotuberculosis C231]1

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302207079|gb|ADL1 142 .1

C231]

ABC-type dipeptide/oligopeptide/nickel

transport system, secreted component>gi|302207165|gb|ADL1 1507.1

[Corynebacterium pseudotuberculosis

C231]

Phytoene Dehydrogenase

(Desaturase) [Corynebacterium >gi|3022071 8 1 |gb|ADL1 1523.1 1pseudotuberculosis C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205906|gb|ADL1 0248.1

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205923|gb|ADL1 0265.1 1C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302205955|gb|ADL1 0297. 1|

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206027|gb|ADL1 0369.1

C231]

Putative amino deoxychorismate lyase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206277|gb|ADL1 06 9 .

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206398|gb|ADL1 0740.1 1C231]

NLP/P60 family protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206545|gb|ADL1 0887.1 1C231]

Metal-dependent hydrolase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206778|gb|ADL1 20.1 1C231]

Flagellar hook protein flgE

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206869|gb|ADL1 12 11. 1

C231]

Putative secretory lipase

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206906|gb|ADL1 248.1

C231]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|30220691 7|gb|ADL1 1259.1 1C231]

Hypothetical protein CpC231_1 862

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206975|gb|ADL1 3 7.1

C231]

Hypothetical protein CpC231_1 880

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302206992|gb|ADL1 1334.1

C231]

Hypothetical protein CpC231_1 899

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302207009|gb|ADL1 1351 .1 1C231]

iron siderophore binding protein-FagD

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302329745|gb|ADL1 9939.11002]

Putative secreted penicillin-binding

protein [Corynebacterium >gi|302329749|gb|ADL1 9943.1 1pseudotuberculosis 1002]

Zn2+ ABC superfamily ATP binding

cassette transporter, binding protein>gi|302329825|gb|ADL2001 9 .

[Corynebacterium pseudotuberculosis1

1002]

Putative secreted protein with LPxTG

motif [Corynebacterium >gi|302329874|gb|ADL20068.1 1pseudotuberculosis 1002]

Putative penicillin-binding secreted

protein [Corynebacterium >gi|302329909|gb|ADL201 03.1 1pseudotuberculosis 1002]

Hypothetical protein Cp1 002_0376

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330083|gb|ADL20277.1

1002]

putative peptidoglycan synthesis

related protein [Corynebacterium >gi|302330165|gb|ADL20359.1 1pseudotuberculosis 1002]

Putative secreted protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330479|gb|ADL20673.1 11002]

Putative secreted protein - Ycel

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330704|gb|ADL20898.1

1002]

Putative DsbG protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 361 |gb|ADL21 555.1 11002]

Putative membrane anchored protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 558|gb|ADL21 752.1 11002]

Glycosyl hydrolase family protein

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 559|gb|ADL21 753.1 11002]

Putative conserved integral membrane

protein [Corynebacterium >gi|302331 759|gb|ADL21 953. 11pseudotuberculosis 1002]

Elongation factor P [Corynebacterium>gi|302330827|gb|ADL21 021 .

pseudotuberculosis 1002]1

Hypothetical protein Cp1 002_1 841

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 509|gb|ADL21 703. 11002]

Hypothetical protein Cp1 002_1 840

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331508|gb|ADL21 702.1

1002]

Chaperone protein DnaK

[Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 563|gb|ADL21 757.1 11002]

chaperonin GroEL [Corynebacterium>gi|302331 479|gb|ADL21 673.1

pseudotuberculosis 1002]1

Enolase [Corynebacterium>gi|30233041 1|gb|ADL20605.1

pseudotuberculosis 1002]

Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (GAPDH)184. >gi|302330797|gb|ADL20991 . 1

[Corynebacterium pseudotuberculosis1

1002]

ABC-type transporter

185. [Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330197|gb|ADL20391 . 1 |

1002]

Carbonate dehydratase

186. [Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302330283|gb|ADL20477.1

1002]

Manganese superoxide dismutase

187. [Corynebacterium pseudotuberculosis >gi|302331 655|gb|ADL21 849.1 11002]

EXEMPLO 4 - Protocolo de infecção

Os animais utilizados nos experimentos de Teste de Pele eram todos

machos, três da raça Boer, quatro da raça Alpino e dezesseis Saanen. Estes

animais foram artificialmente infectados com amostra de Corynebacterium

pseudotuberculosis linhagem MIC 6 .

Os animais foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (A e B). O grupo

A com 11 animais: 2 fizeram parte do grupo controle e 9 animais foram

desafiados com cepa MIC 6 ( 106 bactérias por dose). O grupo B com 12

animais: 2 no grupo controle e 10 animais foram desafiados com cepa MIC 6

( 06 bactérias por dose).

Antes da infecção, os animais tiveram o soro testado através de ELISA

indireto. Todos foram negativos para LC.

Os resultados sorológicos preliminares (ELISA), antes da infecção, estão

registrados nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2 - Teste de Elisa indireto do soro dos animais do grupo A antes da

aplicação do teste de pele.

Tabela 3 - Teste de Elisa indireto do soro dos animais do grupo B antes da

aplicação do teste de pele

5 No grupo A , 4 animais receberam a primeira dose de Corynebacterium

pseudotuberculosis ( 106 bactérias), cepa MIC 6 , por via subcutânea, na região

do omoplata. Já no grupo B, 5 animais receberam a mesma dose de

Corynebacterium pseudotuberculosis cepa MIC 6.

EXEMPLO 5 - Avaliação da eficácia do teste de pele em caprinos e ovinos

í o Os animais foram submetidos ao exame clínico, com avaliação do

estado geral, coloração de mucosas conjuntivais e funções vitais (temperatura

corporal, frequência cardíaca, frequência respiratória e movimentos ruminais).

A aplicação do teste cervical simples (TCS) foi realizada após o exame

detalhado de cada animal.

15 O teste de pele foi aplicado via intradérmica, na concentração de 0,1

mg/mL de secretina, em dose de 0,1 mL na região omoplata, em área

previamente depilada de cerca de 4x4 cm. Após foi realizada a mensuração da

espessura da pele feita com cutímetro Hauptner. O alérgeno foi inoculado no

centro da área depilada com seringa de tuberculina Hauptner.

A primeira leitura foi feita antes da inoculação. As demais mensurações

da pele e avaliação do edema e dor local foram realizadas a cada 24 h nos dez

dias subsequentes, sempre pelo mesmo profissional para evitar variações

individuais de aferição. As Figuras 1 e 2 exemplificam os resultados obtidos

para dois animais do grupo B, 24 h após inoculação.

Ausência de reação ou aumento da espessura da dobra da pele (AEP)

até 1,0 mm foi considerada negativa, reações com AEP entre 1,0 e 3,8 mm

foram consideradas inconclusivas e reações iguais ou superiores a 3,9 mm

foram consideradas positivas (Paulo Eduardo Gomes da Silva, Sônia Regina

Pinheiro, Marta Lizandra do Rego Leal, Heloísa Godói Bertagnom, Pedro

Moacyr Pinto Coelho Motta, Idercio Luiz Sinhorini, Silvio Arruda Vasconcellos,

Fernando José Benesi, Ciência Rural, v. 36, n . 3, p. 880-886, 2006).

Inicialmente utilizou-se para o teste de pele a dose de I mg/mL, com

base em protocolo do Ministério da Agricultura e Abastecimento (MAPA)

(http://www.agricultura.gov.br/), com aplicação de 0,1 mL por animal, via

subcutânea, como utilizado para bovinos no diagnóstico da tuberculina bovina.

Os resultados foram promissores, com respostas detectáveis com 24h, com

picos com 48-72 h. Diante desses resultados, novos testes foram realizados e

a dose inicial foi diminuída gradativamente com objetivo de obter a menor dose

eficaz. Os resultados estão apresentados na Tabela 4 . A menor dose eficaz foi

de 0,1 mg/mL

Tabela 4 - Espessura da dobra da pele (AEP), em mm, 24h após a inoculação

de 0,1 mL da solução de secretina por via subcutânea, na região da omoplata

em quatro animais. As diferentes concentrações foram utilizadas com objetivo

de se detectar a menor dose eficaz.

EXEMPLO 6 - Avaliação da dessensibilização dos animais testados

Dentre os animais testados na Tabela 4 , dois foram retestados 62 dias

após a primeira aplicação do Teste de Pele, com objetivo de avaliar o período

de dessensibilização. O resultado foi positivo ao segundo teste, ou seja, os

animais estavam dessensibilizados em relação à secretina inoculada

anteriormente.

Novos testes foram realizados com período ainda menor, 42 dias após o

primeiro teste, com animais 7, 1, 9 e 4 e os resultados também foram positivos.

Nesse período houve reação cutânea, ou seja, os animais já estavam

dessensibilizados.

Outros testes serão necessários para confirmar o período exato no qual

os animais estarão aptos a receber segunda dose da secretina, porém fica

evidente que esse período em caprinos é menor do que em bovinos (60 dias).

REIVINDICAÇÕES

1) TESTE DE PELE, caracterizado por compreender antígenos protéicos

secretados-excretados de Corynebacterium pseudotuberculosis e

excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2) TESTE DE PELE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos

antígenos protéicos serem obtidos a partir de C. pseudotuberculosis não

submetida a nenhum tipo de stress, através da técnica de fracionamento

em três fases.

3) TESTE DE PELE, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado

pelos antígenos protéicos serem selecionados preferencialmente do

grupo que compreende as proteínas identificadas pelas SEQ ID N° 1 a

187.

4) TESTE DE PELE, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado

por compreender ao menos uma das proteínas identificadas pelas SEQ

D N° 1 a 187, ou seus epítopos correspondentes.

5) TESTE DE PELE, caracterizado por compreender os passos a seguir:

A. Obtenção dos antígenos protéicos, de acordo com as

reivindicações 1 a 4 ;

B. Aplicação dos antígenos protéicos por via intradérmica, na

concentração de 0,1 mg/mL a 1mg/mL de proteínas secretadas,

em dose de 0,1 mL, na região omoplata, em área previamente

depilada, após a mensuração da espessura da pele feita com

cutímetro Hauptner;

C. Mensuração da pele e avaliação do edema e dor local entre 24 e

72 h .

D. Classificação dos animais como se segue:

I. Ausência de reação ou aumento da espessura da dobra da

pele (AEP) até 1,0 centímetro: negativo;

II. Reações com AEP entre 1,0 e 3,8 mm: inconclusivos;

III. Reações com AEP igual ou superior a 3,9: positivos.

6) TESTE DE PELE, de acordo com as reivindicações 1 a 5 , caracterizado

por ser para diagnóstico da linfadenite caseosa subclínica em caprinos e

ovinos.

A . CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER

A61 K49/00 (2006.01 ), A61 K39/35 (2006.01 ), A61 K39/05 (2006.01 ) , G01 N33/483 (2006.01 ), C 12N1/20 (2006.01 ),C 12Q1/00 (2006.01 ), C 12R1/1 5 (2006.01 )According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC

B . FIELDS SEARCHED

Minimum documentation searched (classification s stem followed by classification. symbols)

A61 K49, A61 k39, C 12N1

Docunientation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in he fields searched

Portal Capes (database Banco de Teses e Domínio Público)

Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)

Dialog (Database WPI b351 , CAS b399, Embáse b73, Biosis b5, thesis &dissertations b35), Epodoc, Pubmed

C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

Y RU 2053295 C l (O S IJ G . VETERTNARNYJ I [RU]) 1-427 January 1996 (1996-01-27) abstract

Y RU 205 1966 C l (OMSKIJ G VETERINARNYJ I [RU]) 1-4

10 January 1996 (1996-01-10) abstract

Y RU 205 1965 C l (O S IJ VETERINARNYJ [RU]) 1-4

10 January 1996 (1996-01-10) abstract

Y RU 205 1964 C l (OMS J G VETERINARNYJ I [RU]) 1-4

10 January 1996 (1996-01-10) abstract

Further documents are listed in the continuation of Box C. | | See patent family annex.

Special categories of cited documents: "T" .later document published after the international filing date or priorityΆ " document defining the general state of the artwhich is not considered date and not in conflict with the application but cited to understand

to be of particular relevance the principie or theory underlying the invention

" earlier application or patent but published on or after the international "X" document of particular relevance; tlie claimed invention cannot befiling date considered novel or cannot be considered to involve an inventive

'L" document which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document is taken alonecited to establish the publication date of another citation or otherspecial reason (as specified) "Y document of particular relevance; the claimed invention cannot be

considered to involve an inventive step when the document isΌ " document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other combined with one or more other such documents, such combination

means being obvious to a person skilled in the art'P" document published prior to the international filing date but later than "&" document member of the sarhe patent family

the priority date claimed

Date of the actual completion of the international search Date of mailing of the international search report

Name and mailing address of the ISA Authorized officer

Facsimile No. Telephone No.

Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)

.

PCT/BR20 12/0001 34

C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate of the relevant passages Relevant to c aim No.

Y Tsuey-Ying PHD thesis I 84 Caseous lymphadenitis in small ruminants:clinicai, pathological, and immunological responses to C ry neb cteriupseudotuberculosis and to fractions and toxins fro the microorganism.Volume 4505B of Dissertations Abstracts International PAGE I396 I24 - 4PÀGES- resumo

Y Brown CC, Olander HJ; Biberstein EL; Morse SM, I 86 use of a to oidvaccine to protect goats against intradermal challenge exposure toCorynebacterium-pseudotuberculosis. American Journal of Veterinary .Research 47 ( 5 ) : p 1116- 11 - resumo

I - 4Langenegger HC, Langenegger J, Guedes Costa S, 1987 Alérgeno para odiagnóstico da Linfadenite Caseosa em caprinos. Pesq Vet Bras. 7(2): 27-32 -documento inteiro

1 - 4Langenegger HC, Langenegger J, SchererOP, 99 1 Prevalência e Diagnósticocomparativo da Linfadenite caseosa em caprinos do estado do' Rio de JaneiroPesq Vet Bras. 11( 1/2): 3 1-34 - documento inteiro

1 - 4X Paule BJ, Meyer R, Moura-Costa LF, Bahia RC, Carminati R, Régis LF, Vale

VL, Freire SM, Nascimento I, Schaer R, Azevedo V, 2004 Three-phasepartitioning as an efficient method for extraction/concentration ofimmunoreactive excreted proteins of Corynebacterium pseudotuberculosisProtein Expr. Purif 34(2): 1-3 6 - documento inteiro 1 - 4

Pacheco LG, Slade SE, Seyffert N, Santos AR, CastroTL, silva M, SantosAV, Santos SG, Farias LM, Carvalho MA, Pimenta AM, Meyer R, Silva A, 'Scrivens JH, Oliveira SC, Miyoshi A, Dowson CG, Azevedo V. 20 11Acombined approach for comparatíve exoproteome analysis ofCorynebacterium pseudotuberculosis. BMC Microbiol 11; 12 - documentointeiro publicdo em 17-0 1-20 11

1 - 4

Núbia Seyffert, Identificação e análise molecular do gene cpsec39 codificadorX

de uma proteína exclusiva de Corineb cter n pseudotuberculosis:perspectivas no desenvolvimento de métodos profiláticos para o controle dalinfadenite caseosa. v. 102p. Tese de Doutorado UFMG - Bibliotecadepositária: 1CB e Central Resumo publicado no Banco.de Teses da Capes -resumo do documento publicdo em 1- 2-2009

- 4

Gomes da ;Silva PE, PinheiroSR, Leal MLR, Bertagnon HG, Morta PMPC,Y S n orini IL, Vasconcellos SA, Benesi FJ 2006 Teste de tuberculinização em

caprinos (Capra hircus) experimentalmente sensibi lizados. Ciência Rural36(3): 880-886 - documento inteiro 1 - 4

Form PCT/ISA/210 (continuation of second s eet) (July 2009)

.

PCT/BR20 12/0001 34

Box No. II Observations here certain claims were found unsearchable (Continuation of item 2 of first sheet)

This intemational search report has not been established in respect of certain claims under Articlé 17(2)(a) .for the following

1. | Claims Nos.:because they relate to subject matter not required to be searched by this Authority, namely:

Essas reivindicações visam a proteção de um método de diagnóstico que se baseia naobservação/mensúração de uma reação alérgica diretamente na pele do animal.

2. Claims Nos.:because they relate to parts of the intemational application that do not comply with the prescribed requirements to such anextent that no meaningful intemational search can be carried out, specifically:

3. □ Claims Nos.:because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).

Box No. Ι Π Observations where unity of invention is lacking (Continuation of item 3 of first sheet)

This Intemational Searching Authority found multiple inventions in this intemational application, s follows:

Essas reivindicações visam a proteção de um método de diagnóstico que se baseia naobservação/mensúração de uma reação alérgica diretamente na pele do animal.

□ As ali required additional search fees were timely paid by the applicant, this intemational search report covers ali searchableclaims.

□ As ali searchable claims could be searched without effort justifying additional fees, this Authority did not invite payment ofadditional fees.

□ As only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this intemational search report coversonly those claims for which fees were paid, specifically claims Nos.:

No required additional search fees were timely paid by the applicant. Consequently, this intemational search report isrestricted to the invention first mentioned in the claims; it is covered by claims Nos.:

The additional search fees were accompanied by the applicanfs protest and, where applicable, the

□ payment of a protest fee.

The additional search fees were accompanied by the applicanfs protest but the applicable protest

□ fee was not paid within the time lirnit specified in the invitation.

No protest accompanied the payment of additional search fees.

Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (2)) (July 2009)

.Information on patent family members

PCT/BR20 12/0001 34

R U 2053295 27/0 1/96

R U 205 1966 10/0 1/96

R U 205 1965 10/0 1/96R U 205 1964 10/0 1/96

Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (July 2009)

A . CLASSIFICAÇÃO D O OBJ ETO ,

A61 K49/00 (2006.01 ), A6 K39/35 (2006.01 ), A61 K39/05 (2006.01 ) , G01 N33/483 (2006.01 ), C 12N1/20 (2006.01 ),C 12Q1/00 (2006.01 ), C 12R1/1 5 (2006.01 )

De acordo com a Classificação Internacional de Patentes (IPC) ou conforme a classificação nacional e IPC

B . DOM ÍNIOS ABRANGIDOS PELA PESQUISA

Documentação mínima pesquisada (sistema de classificação seguido pelo símbolo da classificação)

A61 K49, A61 k39, C 12N1

Documentação adicional pesquisada, além da mínima, na medida em que tais documentos estão incluídos nos domínios pesquisados

Portal Capes (database Banco de Teses e Domínio Público)

Base de dados eletrônica consultada durante a pesquisa internacional (nome da base de dados e, se necessário, termos usados na pesquisa)

Dialog (Database WPI b351 , CAS b399, Embase b73, Biosis b5, thesis &dissertations b35), Epodoc, Pubmed

C . DOCUM ENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES

Relevante para asCategoria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se ap ropriado

reivindicações N °

Y RU 2053295 C (OMSKIJ G .VETERJNARNYJ [RU]) 1-4

27 janeiro 996 ( 1996-0 1-27) abstract

Y . RU 205 1966 C 1(OMSKIJ G VETERJNARNYJ I [RU]) 1-4

0 janeiro 1 96 (1996-01-10) abstract

Y RU 205 1965 C (OMSKIJO VETER1NARNYJ [ [RU]) 1-410 janeiro 1996 (1996-01-10) abstract

Y RU 205 1964 C l (OMSKJJ G V ETER AR Y J [RU]) 1-4

10 janeiro 1996 (1996-01-10) abstract

[Hl Documentos adicionais estão listados na continuação do quadro ,C (Hl Ver o anexo de famílias das patentes

• Categonas especiais dos documenlos cilados' " fdocumento publicado depois da da a de depósito internacional, ou de

" A"documcnto que define o estado geral da técnica, mas âo é considerado de pnondade c que n o conflila co o deposito, porém citado para entender o

particular relevância pnncípio ou teoria na qual se baseia a invenção

" E" pedido ou palcnle ai n or , mas publicada após ou na data do depósito " X" documento de particular relevância, a invenção reivindicada nâo pode ser

internacional considerada nova e não pode ser considerada envolver um atividade

" L " documento que pode lançar duvida na(s) reiv.indicaçâo(ôes)de prioridade ou inventiva quandeo documenlo é considerado isoladamente

na qual e citado para detenmnar a data de outra citação ou por outra razão " Y documento de particular relevância, a invenção reivindicada não pode ser

especial c nstderada envol er a v idade inventiva qua do o docu e e combinado

" O" documento referente a uma di vu l ç o oraJ, uso, exibição ou por outros meios comum outro documento ou a s de um, ta) combinação sendo óbvia para

• um t c co no assunto." P" documenlo publicado a tes do deposito internacional, porém posterior a data

de pnondadc reivindicada &." documento membto da mesma irt l a de patentes

Data da conclusão da pesquisa internacional ' Data do envio do re ató r i de Besqwsa.Lnternacional:

13/06/2012

Nome e endereço postal da ISA/BR Funcionário autorizado

m INSTITUTO NACIONAL DAPROPRIEDADE INDUSTRIAL

M Rua Sao Benio n 1, 17» andar Karla Consort Ribeirocep: 20090-010, Centro · Rio de Janeiro/RJ

N° de fax : +55 2 1 3037-3663 N° de telefone: +55 2 1 3037-41 69

Formulário PCT/IS A/2 0 (segunda página) (Julho 2009)

RELAT RIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°

PCT/BR201 2/0001 4

C DOCU M ENTOS CONSIDERADOS RELEVANT ES

Relevante para asCategoria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se ap ropriado

ca es

Y Tsuey-Ying PHD thesis I 84 Caseous lymphadenitis in small rum inants:clinicai, pathological, and immunological responses to Corynebacteriumpseudotuberculosis and to fractions and toxins from the microorganism.Volume 4505B of Dissertations Abstracts International PAGE 96 I24 - 4PÀGES- resumo

Y Brown CC, Olander HJ; Biberstein EL; Morse SM, I 86 use of a toxoidvaccine to protect goats against intradermal chailenge exposure toCorynebacterium-pseudotuberculosis. American Journal of Veterinary .Research 47 ( 5 ) : p 1116- 1 9 - resumo

I - 4X Langenegger HC, Langenegger J, Guedes Costa S, I987 Alérgeno para o

diagnóstico da Linfadenite Caseosa em caprinos. Pesq Vet Bras. 7(2): 27-32documento inteiro

- 4Langenegger HC, Langenegger J, SchererOP, 99 1 Prevalência e Diagnóstico

X comparativo da Linfadenite caseosa em caprinos do estado do' Rio de JaneiroPesq Vet Bras. l l ( l /2): 3 1-34 - documento inteiro

1 - 4X Paule BJ, Meyer R, Moura-Costa LF, Bahia RC, Carm inati R, Régis LF, Vale

VL, Freire SM, Nascimento I, Schaer R, Azevedo V, 2004 Three-phasepartitioning as an efficient method for extraction/concentration ofimmunoreactive excreted proteins of Corynebacterium pseudotuberculosisProtein Expr. Purif 34(2): 3 11-3 16 - documento inteiro 1 - 4

X Pacheco LG, Slade SE, Seyffert N, Santos AR, CastroTL, silva WM, SantosAV, Santos SG, Farias LM, Carvalho MA, Pimenta AM, Meyer R, Silva A,Scrivens JH, Oliveira SC, Miyoshi A, Dowson CG, Azevedo V. 20 1Acombined approach for comparative exoproteome analysis ofCoiynebacteríum pseudotuberculosis. BMC Microbiol 1 2 - documentointeiro publ icdo em 7-0 1-20 1

1 - 4

Nubia Seyffert, Identificação e análise molecular do gene cpsec39 codificadorX de uma proteína exclusiva de Corinebacteriiçn pseudotuberculosis:

perspectivas no desenvolvimento de métodos profiláticos para o controle dalinfadenite caseosa. Iv. 102p. Tese de Doutorado UFMG - Bibliotecadepositária: 1CB e Central Resumo publicado no Banco.de Teses da Capes -resumo d documento publicdo em 0 - 2-2009

l - 4

Gomes da ;Silva PE, PinheiroSR, Leal MLR, Bertagnon HG, Motta PMPC,Y Sinhorini IL, Vasconcellos SA, Benesi FJ 2006 Teste de tuberculínização em

caprinos (Capra hircus) experimentalmente sensibilizados Ciência Rural36(3): 880-886 - documento inteiro 1 - 4

Formulário PCT ISA 10 (continuação da segunda página) (Julho 2009)

ep n ernac ona

PCT/BR20 12/0001 34

Observações quando certas reivindicações não puderam ser objeto de pesquis a (Continuação do ponto 2 daQuadro □

primeira página)

Este relatório de pesquisa internacional nâo foi formulado em relação a certas reivindicações, sob Artigo 7 ,2). a), pelas seguintesrazões:

I . [Hl Reivindicações:

porque estas se referem a matéria na qual esta Autoridade não está obrigada a realizar a pesquisa, a saber:

Essas reivindicações visam a proteção de um método de. diagnóstico que se baseia naobservação/mensúração de uma reaçáo alérgica diretamente na pele do animal.

2 . Ξ Reivindicações:

porque estas se referem a partes do pedido internacional que nâo estão de acordo com os requisitos estabelecidos, de talforma que não foi possível realizar uma pesquisa significativa, especificamente:

Essas reivindicações visam a proteção de um método de diagnóstico que se baseia naobservação/mensúração de uma reação alérgica diretamente na pele do animal.

3 . Reivindicações:

porque estas são reivindicações dependentes e não estão redigidas de acordo com os parágrafos segundo e terceiro daRegra 6 . a).

Quadro Ι Observações por falta de unidade de invenção (Continuação do ponto 3 da primeira página)

Esta Autoridade de pesquisa internacional encontrou múltiplas invenções neste depósito internacional, a saber:

1. co o todas as taxas requeridas para pesquisas adicionais foram pagas pelo depositante dentro do prazo, este relatório depesquisa cobre todas as reivindicações pesquisáveis.

2 . como i pesquisa em todas as reivindicações pesquisáveis pode ser feita sem esforço que justifique pagamento adicional.esta Autoridade não solicitou o pagamento de taxas adicionais.

3 . como somente algumas das taxas requeridas para pesquisas adicionais foram pagas pelo depositante dentro do prazo, este

relatório de pesquisa internacional cobre somente aquelas reivindicações cujas taxas foram pagas, especificamente as

reivindicações: <

4 . as taxas de pesquisas adicionais requeridas não foram pagas dentro do prazo pelo depositante. Consequentemente, esterelatório de pesquisa internacional se limita à invenção mencionada primeiramente nas reivindicações, na qual é cobertapelas reivindicações:

as laxas adicionais pará pesquisas foram acompanhadas pela reclamação dodepositante e, se for o caso, pelo pagamento da taxa de reclamação.

as taxas adicionais para pesquisa foram acompanhadas pela reclamação dodepositante mas a taxa de reclamação não foi paga dentro do prazo especificadopela solicitação.

o pagamento de pesquisas adicionais não acompanha nenhuma reclamação

Formulário PCT SA 2 I0 (continuação da primeira págtna(2)) (Julho 2009)

Informação relaliva a membros da família da patentesPCT/BR20 12/0001 34

Documentos de patenteData de pu blicação M mbro(s) da família de paten tes Data de pu bl icação

citados no, re latório de pesquisa

RU 2053295 27/0 1 96RU 205 1966 10/0 1/96RU 205 1965 10/0 /96RU 205 1964 10/0 1/96

Formulário PCT/lSA/2 0 (anexo da família de patentes) (Julho 2009)