O desenvolvimento da tecnologia de células animais. (Tab. 1.1)

Vantagens da Cultura de Células.

- Controlo do ambiente Físico-QuímicoA) PHB) TemperaturaC) Pressão osmóticaD) O2 e CO2E) Suplementos do meio de cultura

- Caracterização e homogeneidade da amostra

- Economiaa)menores quantidades de amostra para testesb)experimentação animal pode ser evitada

Desvantagens. Principais diferenças in vitro.

- Especializaçãoa) Técnicas de cultura assépticas e complexasb) Total compreensão do sistema =>

=> dignóstico capaz de problemas quando eles surgem

- Quantidade

- Máximo por batch:a) 2-3 pessoas -> 1-10 gr célulasb) > 5 pessoas -> 10-100 gr célulasc) Industria -> > 100 gr células

Desvantagens. Principais diferenças in vitro.

- Dediferenciação e Selecçãoa) perca de características fenotípicas => sobrecrescimento de células indiferenciadas

b) desenvolvimento de meio sem serum

- Origem das célulasa) perca de propriedades características => dificuldade de relacionar as células com o tecido de onde foram derivadas

- Instabilidadea) instabilidade na constituição cromossómica

Tipos de culturas de células

Tipos de culturas de células

Formação de uma linha celular apartir de explantes primários:- um aumento do numero total de células ao longo de váriasgerações-células ou linhas celulares com uma capacidade similar deelevado crescimento irão predominar- isto vai resultar num grau de uniformidade na população celular

Biologia da célula em cultura.

- O ambiente de cultura

- In vitro: proliferação de células e não in vivo;- redução de interacções célula-célula e célula-matriz;- redução da heterogeneidade e arquitectura tridimensional;- Implica a adição no meio de cultura de hormonas, nutrientes, substracto, etc.

Evolução das linhas celulares (Fig. 2.1)

Biologia da célula em cultura.

- Adesão celular

A maioria das células de tecidos sólidos crescem sob a forma demonocamadas aderentes a um suporte sólido. Este é necessáriopara que elas comecem a proliferar.Adesão celular mediada por receptores celulares de superficie amoléculas na matriz extracelular (secretadas pelas celulas) =>plástico ou vidro préviamente condicionado pode ser utilizado comosuperficie para adesão celular.

- Classes de proteinas envolvidas em adesão celular:- CAM’s, Ca2+ independentes;- Caderinas, Ca2+ dependentes.

Iniciação da cultura (Tab. 2.1)

- Desenvolvimento de linhas celulares continuas (Fig.2.2)Capacidade de crescimento continuo em cultura vs. numero limitado degerações;Alteração em cultura que origina uma linha celular continua –“transformação in vitro”

- Transformação – implica uma alteração nas caracteristicas decrescimento (aderência, contacto, densidade);

- Imortalização – aquisição de um tempo de vida infinito;

- Desdiferenciação (Fig.2.3)Células diferenciadas perdem as suas caracteristicas in vitro: porquecélulas indiferenciadas da mesma linhagem sobrecrescem célulasterminalmente diferenciadas com reduzida capacidade de proliferação; aausencia de indutores apropriados causa readaptação.

- O que é uma célula em cultura?Uma célula em equilibrio entre celulas estaminais multipotentes, célulasprecursoras indiferenciadas mas cometidas e células maduras ediferenciadas, e o equilibrio pode mudar de acordo com condicões doambiente de cultura.A identidade de uma célula em cultura não é apenas definida pela sualinhagem in vivo mas também pela sua posição nessa linhagem.

- Ambiente funcional

Condições de cultura têm sido adaptadas para para

satisfazer dois requisitos principais:

- produção de células por proliferação continua;

- preservação de funções especializadas.

•ambiente de cultura: Substrato, Fase de Gás, Meio eTemperatura.

•O substratoVidro; plásticos descartáveis: poliestireno (hidrofóbico, logo tem deser tratado para aderência), cloreto de polivinil (PVC), policarbonato,etileno de politetrafluor (PTFE), teflon, etc.

Substratos permeáveis: tamanhos, materia, porosidade.

Matrizes sintéticas: para estudos de interacção com matriz (Matrigel,Natrigel, Colagénio, etc).

Metabolism/Toxicology Studies Invasion AssaysCell Growth and Differentiation

Revestimento da superfície de cultura com colagénio, gelatina.Em certos casos este revestimento com camadas “inertes” nãoe´suficiente de modo que é necessário utilizar uma monacamada celularpara providenciar a matriz correcta (feeder) para a manutenção de certascélulas especializadas – fibroblastos são utilizados facilitar e aumentar ocrescimento de outros tipos celulares a baixas densidades.

Matrizes tridimensionais- evitam a perca da arquitectura do tecido einteracções celulares.

Factores a considerar para a escolha dos recipientes de cultura:A quantidade de células; cultura em suspensão ou monocamada; culturaventilada ou selada; o tipo de amostragem e análise a ser feita; custo(Tab. 3.1).

(Tab. 3.1)

Filter caps for continuous ventingThe caps are fitted with a hydrophobicfilter to ensure consistent gas exchange

"Y" mark indicating "vent"Any of the legs pointing verticallyupwards indicates that the cap is invent position

http://www.nuncbrand.com/page/en/1230.aspx

A fase de gás

Os principais constituintes são O2 e CO2. Certas culturas de orgãosrequerem até 95% O2. A profundidade do meio de cultura podeinfluenciar a taxa de difusão do O2 para as células => manter 2-5mm.

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- (1) ) (Tab. 3.2)

NaHCO3 Na+ + HCO3- (2) NaOH + H2CO3 NaHCO3 + H2O Na+

+ HCO3- + H2O (3)

Meios e suplementos

Tentativa de obter meios bem definidos capazes de manter ocrescimento celular, para substituir os “meios naturais” tais comoextracto de embrião, hidrolisados de proteína, etc. Tentativa de iliminar osoro do meio; demorado e esta definição é muito específica de cada tipode culturas.

Proprieddades físicas

pH- maioria das células crescem melhor a pH 7.4; alguns fibroblastospH 7.4-7.7; células transformadas pH 7.0-7.4. Fenol vermelho: pH 7.8– púrpura

pH 7.6 – rosapH 7.4 – vermelhopH 7.0 – laranjapH 6.5 – amarelopH 6.0 – limão

Soro

Os soros mais comuns são os de vitelo, feto de bovino, cavalo ehumano.

Proteínas, sendo os principais constituintes do soro, a sua função invitro permanece obscura; albumina, fibronectina, a2-macroglobulina.

Polipéptidos, PDGF, TGF-b, etc; hormonas, GH, IGF, etc; nutrientes,como aminoácidos, glucose, lipidos, ácido oleico, etanolanina, etc;

minerais, selénio, cobre, zinco, ferro; inibidores, podem ser inactivadospor aquecimento.