O papel do sistema de resistência guarda na interação gene-a-gene em plantas

O Papel do Sistema de Resistência guarda na interação Gene a Gene em Plantas – 189

RAPP – Volume 17, 2009

O PAPEL DO SISTEMA DE RESISTÊNCIA GUARDA NA INTERAÇÃO GENE A GENE EM

PLANTAS

Roberto Lanna Filho1 & Mário Lúcio Vilela de Resende1

1Universidade Federal de Lavras, Departamento de Fitopatologia, CP 3037, CEP 37200-000, Lavras-MG – [email protected]

RESUMO

As plantas apresentam uma rica fonte de aminoácidos e açucares, sendo alvo atrativo da ação de diversos microrganismos. No entanto, as mesmas possuem um elaborado sistema de defesa contra patógenos, conferindo resistência ao ataque destes. Em contra partida, patógenos possuem um arsenal de mecanismos de invasão para driblar as defesas da planta. Assim, as interações entre planta-patógeno culminam no processo co-evolutivo, em que há uma constante mudança nos mecanismos de ataque e defesa. Notadamente, acreditava-se que o reconhecimento eliciador-receptor no contexto da interação gene-a-gene somente dava-se diretamente, desencadeando a resposta de defesa da planta. Entretanto, recentes pesquisas Mol.es têm mostrado que plantas apresentam mecanismos de defesa de reconhecimento indireto contra patógenos. Estes, mediado por proteínas-guarda que desempenham importante papel na percepção da invasão de patógenos, bem como, no impedimento dos mesmos. Assim, mantendo-se em constante vigilância no sistema de defesa inato da planta. Neste contexto, esta revisão tem a proposição de levantar as recentes pesquisas no estudo dos mecanismos de defesa em plantas, com destaque para as proteínas-guarda.

SUMMARY

THE ROLE OF GUARDING RESISTANCE IN THE GENE FOR GENE INTERACTION IN PLANTS

The plants present a rich source of amino acids and sugars, being

target attractive of the action of several microorganisms. However, they present an elaborated defense system against pathogens, conferring resistance to their attack. In against departure, pathogens possess an armory of invasion mechanisms to dribble the defenses of the plant. Thereby, the plant-pathogen

mailto:[email protected]

190 – Roberto Lanna Filho & Lúcio Vilela de Resende


interactions culminate in the co-evolutionary process, in that there is a constant change in the of mechanisms attack and defense. Notably, it was believed that the recognition elicitor-receptor in the context of the gene-to-gene interaction was only given directly, triggering the plant defense response of the plant. However, recent Mol. Res.es have been showing that plants present mechanisms of defense of indirect recognition against pathogens. These, mediated by proteins-guard that play important role in the perception of the invasion of pathogens, as well as, in the prevention of them. Thus, staying in constant surveillance in the innate defense system of the plant. In this context, this Rev. has the proposition of raising the recent Res.es in the study of the defense mechanisms in plants, focusing on the proteins-guard.

INTRODUÇÃO A idéia de que plantas podem detectar patógenos por mecanismos

indiretos de defesa é relativamente recente (Van Der Biezen & Jones, 1998a) e vai contra o dogma central da patologia de plantas, que tem perpetuado a décadas. Este dogma postula que plantas detectam patógenos usando receptores que diretamente ligam-se a eliciadores Mol.es derivados do patógeno (Gabriel & Rolfe, 1990). Esse modelo eliciador-receptor foi caracterizado baseado em diversos trabalhos no âmbito da genética clássica executados por Harold Henry Flor (1942, 1956, 1971). Flor, estudando o patossistema linho (Linum usitatissimum L.) versus ferrugem do linho (Melampsora lini), observou que a diferença entre as variedades de linho resistentes para aquelas susceptíveis a isolados específicos de M. lini estavam na presença de um único gene dominante de resistência (R). Igualmente, o mesmo percebeu que a diferença entre isolados de M. lini que foram avirulentos, versus aqueles virulentos em específicas variedades de linho, estava na presença de um único gene dominante de avirulência (Avr). Assim, a resistência foi observada somente quando o produto específico do gene R na planta combinava-se com o produto do gene Avr correspondente no patógeno. Com base em suas análises genéticas, Flor comparou igualmente a interação planta-patógeno com a interação antígeno-anticorpo em mamíferos, e postulou que, para cada gene de resistência (R) presente na planta, há um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Notadamente, a interação gene-a-gene foi descrita subsequentemente em inúmeros patossistemas, tanto para plantas cultivadas e selvagens. No contexto desta interação há mecanismos de reconhecimento planta-patógeno ainda obscuros, mas que aparentemente estão sendo elucidado em diversos trabalhos, como o sistema guarda que será um dos enfoques desta revisão.



ASPECTOS GERAIS DA RESISTÊNCIA EM PLANTAS Apesar dos avanços substanciais nas estratégias de manejo de

doenças em plantas, muitas perdas ainda são ocasionadas devido à ocorrência de fitomoléstias. Neste contexto, muito se têm feito para o entendimento dos mecanismos de resistência inato em plantas, que desencadeiam múltiplos componentes de respostas de defesa a invasão de patógenos (Luderer et al., 2001; De Wit, 2002; Van Der Hoorn et al., 2002; Mcdowell & Woffenden, 2003; Innes, 2004;). Estes múltiplos componentes de resposta requerem um compromisso substancial de recursos, incluindo abrangente reprogramação genética e redistribuição de metabólitos (Somssich & Hahlbrock, 1998). Assim, as respostas de defesa são conservadas sob estreito controle genético e são ativadas somente se a planta detecta um invasor em potencial.

As plantas não apresentam células memória contra agentes patogênicos, então, as células automaticamente mantêm constante vigilância contra patógenos, pela grande expressão ordenada de genes R (Dangl & Jones, 2001; Jones, 2001). Os genes R codificam putativos receptores que respondem a produtos dos genes Avr, expressados pelos patógenos durante a infecção. Em muitos casos, a transferência de um único gene de resistência (R) dentro de uma espécie de planta, pode fornecer resistência completa a um ou mais isolados de um patógeno em particular. Isso confirma o uso por décadas de genes R em programas convencionais de melhoramento de plantas (Pink, 2002). Outro aspecto a ressaltar, é a exploração de fenótipos elite e variabilidade natural de lócus R que vêm sendo estudado por geneticistas Mol.es, com o intuito de clonar os genes R e investigar seu modo de ação Mol..

Os genes R, que mediam a expressão da resposta de defesa em plantas, apresentam diversas características no controle de enfermidades. Desta maneira, quando os mesmos são induzidos no momento certo, as respostas de defesa atuam conjuntamente com o intuito de, eficientemente, impedir a invasão do patógeno, proporcionando o mínimo de dano à planta. Assim, não seria necessária qualquer intervenção do agricultor com o uso de agroquímicos, não causando deste modo, efeitos danosos ao meio ambiente. Infelizmente, os genes R, na maioria das vezes, são suplantados pela co-evolução dos patógenos (Dangl & Jones, 2001). E em alguns casos, muitos genes R reconhecem somente um número limitado de isolados patogênicos e, consequentemente, não fornecem o amplo espectro de resistência. Além disso, a inserção de genes R dentro de cultivares elite, pelo programa de melhoramento genético convencional, consiste em um processo moroso.



Entretanto, recentes percepções em nível Mol. da função de proteínas R e o caminho de transdução do sinal downstream, podem fornecer estratégias para remediar estas deficiências. Para tal, recentes avanços têm ocorrido para o entendimento básico da resistência dependente dos genes R, e muito tem sido elucidado sobre os mecanismos naturais de resistência em plantas. Assim, abrindo possibilidades futuras para usar esta base de conhecimento em muitas perguntas ainda sem respostas. Certamente, com o intuito de obter plantas de importância econômica resistentes contra patógenos, e que esta resistência apresente maior durabilidade.

PRODUTOS DOS GENES R Mesmo com os diversos estudos realizados por Flor (1942, 1947,

1955, 1956, 1971), ainda pairavam no ar muitas dúvidas sobre a interação gene-a-gene. Assim, muitos estudos foram realizados posteriores ao mesmo, a fim de elucidar e corroborar a mesma teoria em outros patossistemas. Neste contexto, uma, das muitas perguntas frequentes era, como os produtos dos genes R desempenhavam as suas funções? Desta forma, constatou-se que as proteínas codificadas pelos genes R, operavam utilizando uma gama limitada de mecanismos bioquímicos. E estas são preditas desempenharem duas funções básicas: reconhecerem os produtos dos genes Avr correspondentes e, após o reconhecimento, ativar os mecanismos de sinalização para um rápido disparo das várias respostas de defesa da planta (Hammond-Kosack & Jones, 2002).

Em relação à interação física, duas proteínas R, Pto do tomateiro e Pi-ta do arroz, já foram comprovadas interagindo com proteínas efetoras do patógeno, AvrPto e AvrPi-ta, respectivamente (Luderer et al., 2001). No entanto, é sabido que o reconhecimento AvrPto-Pto, propicia a sinalização de outras proteínas de defesa (ditas guardas) (Hammond-Kosack & Jones, 2002), que serão tratadas mais a frente nesta revisão. A existência dessas ligações físicas não é uma regra, haja vista a interação indireta que ocorre com as proteínas Cf-9 e Avr9, no patossistema Cladosporium fulvum versus tomate (Luderer et al., 2001). Havendo então, a existência de outras interações que possibilitem o reconhecimento de moléculas efetoras do patógeno, no contexto da interação gene-a-gene (Schneider, 2002).

Para maior entendimento dessas interações, entre proteínas R e Avr, muitos genes R conferindo resistência a uma série de patógenos já foram clonados. Assim, a grande maioria desses genes pertencem a classe NBS-LRR (Figura 1) (Hammond-Kosack & Jones, 2002), que costumam ser divididos nas subclasses TRI-NBS-LRR e CC-NBS-LRR (Ellis et al., 2000). No



entanto, alguns genes NBS-LRR não apresentam motivos TIR ou CC/LZ, mas a sua maioria se enquadra em uma das seis classes/subclasses dos genes de resistência em plantas. As classes/subclasses são: 1) TRI-NBS-LRR: codificam proteínas citoplasmáticas com sítios de ligação a nucleotídeos (NBS), regiões ricas em repetições leucina (LRR) e o domínio TIR (homologo ao domínio “Toll” de Drosophila, com receptor interleucina-1) de mamíferos. Como genes importantes incluídos nesta subclasse estão os genes N do fumo, L6 do linho, RPS4, RPP1 e RPP5 de Arabidopsis; 2) CC-NBS-LRR: codificam proteínas citoplasmáticas com LRR, NBS e uma espiral enrolada (CC) ou zíper de leucina (LZ), entre o N-terminal e o domínio NBS. Pertencentes a essa subclasse estão os genes RPS2 e RPM1 de Arabidopsis, Rx e Gpa2 da batata, Prf, Sw5 e Mi do tomateiro e Mla da cevada; 3) LRR quinase: codificam proteínas com receptores LRR extracelulares, domínios transmenbrânicos (TM) e domínio quinase (serina/treonina) citoplámatica. Nesta subclasse encontra-se o gene Xa21 de arroz, este gene é considerado o mais evoluído por conter o receptor LRR (extracelular) e um domínio quinase (citoplasmático); 4) eLRR: codificam proteínas com LRR extracelular e transmembrânico. Nesta classe estão os genes Cf-9, Cf-4, Cf-2 e Cf-5 do tomate e Vf da macieira; 5) Pto: codifica proteína quinase (serina/treonina) citoplasmática. O único membro desta subclasse é o gene Pto e 6) AS-CC: codificam proteínas com uma ancora sinal (AS) para inserção na membrana e o domínio do tipo espiral enrolada (CC). Compondo esta subclasse encontra-se os genes RPW8.1 e RPW8.2 de Arabidopsis.

IMUNIDADE INATA

Para que a planta possa apresentar resposta de defesa efetiva contra

patógenos, como supramencionado, a mesma tem que apresentar genes R que codifiquem proteínas para o reconhecimento do produto do gene Avr do patógeno. No tocante a interação entre vírus-planta, alguns constituintes protéicos da partícula viral podem funcionar como moléculas eliciadoras, como a proteína da capa (CP), a replicase (Rep) e a proteína de movimento (MP) (Hammond-Kosack & Jones, 2002; Soosaar et al., 2005). Na interação compatível planta-patógeno a molécula eliciadora do patógeno não é reconhecida pelo produto do gene R da planta, levando ao desenvolvimento da doença (Figura 2a). No caso de haver uma interação incompatível, o produto do gene Avr do patógeno é reconhecido pelo produto do gene R da planta, provocando uma cascata de reações de defesa (Figura 2b). Em outro aspecto, o produto do gene Avr tem como alvo uma proteína do hospedeiro, que sinaliza para o reconhecimento do produto do gene R, caracterizando o sistema guarda de defesa em plantas (Figura 2c).



Figura 1: Representação esquemática dos domínios preditos de proteínas R que conferem resistência específica a patógenos (adaptado de Hammond-Kosack & Parker, 2003). RRS1, resistência a Ralstonia solanacearum 1; L6, resistência a ferrugem do linho 6; RPP5, resistência a Peronospora parasitica; RPM1, resistência a Pseudomonas syringae pv. maculicola expressando AvrRPM1 ou AvrB; BS2, resistência a Xanthomonas vesicatoria 2; Cf-2, 4, 5, 9, resistência a Cladosporium fulvum raças 2, 4, 5 e 9; Pto, resistência a P. syringae pv. tomato; PSB1 resistência a P. syringae pv. phaseolicola expressando AvrPhB; Xa21, resistência a X. oryzae pv. oryzae. As duas proteínas Ve diferem ligeiramente em suas estruturas. Ve1 contém um domínio CC no N-terminal, mas não contem a seqüência PEST no C-terminal, enquanto a proteína Ve2 não apresenta o domínio CC no N-terminal, mas contém uma proteína PEST no C-terminal. O domínio de proteína que não tem homologia significativa com proteínas conhecidas é indicado com hexágono 1. As siglas ECS, NLS e PEST significam: sinal de endocitose, seqüência de localização nuclear e seqüência do tipo Pro-Glu-Ser-Thr.



A imunidade inata é um rápido mecanismo de defesa do hospedeiro, o qual reconhece o produto do patógeno por ligação específica ao receptor citoplasmático ou, ao receptor tipo Toll (TLR). Os TLRs reconhecem padrões conservados de proteínas, lipoproteínas, dsRNAs, ou resíduos C e G não metilados no DNA. Estes traços característicos são frequentemente referidos como padrões Mol.es associados à patógenos (PAMPs) (Soosaar et al., 2005).

A primeira linha de defesa, na maioria das respostas de resistência mediada por genes R, é a reação de hipersensibilidade (HR). A HR inclui a morte celular programada (PCD), que ocorre no sítio de infecção e manifesta-se como uma discreta lesão necrótica. Em se tratando de vírus, o mesmo geralmente fica confinado na lesão, pois as células rapidamente cercam-no evitando que o mesmo se espalhe para tecidos adjacentes sadios. A segunda linha de resistência mediada por genes R é a resistência sistêmica adquirida (SAR). Após a infecção pelo patógeno a SAR é disparada, sendo caracterizada pelo aumento local e sistêmico do nível endógeno do ácido salicílico (AS), apresentando resistência a um amplo espectro de patógenos (Malamy et al., 1990; Metraux et al., 1990; Sticher et al., 1997; Soosaar et al., 2005;). Outra resposta sistêmica de defesa contra patógenos, pode ocorrer pela resistência sistêmica induzida (ISR), mediada pelo ácido jasmônico (AJ) e etileno (ET). Estes podem acumular-se tanto localmente ou mediar informações a longas distâncias (Van Loon et al., 1998).

Na resposta local que culmina em HR, também são encontradas espécies ativas de oxigênio (EAO’s) ou ROS, que são peróxido de hidrogênio (H O ), superóxido (O ) e hidroxila livre (OH ), bem como, óxido nítrico (NO) (Baker & Orlandi, 1995; Mehdy et al., 1996; Lamb & Dixon, 1997; Neill et al., 2003; Delledonne, 2005; Gabaldón et al., 2005; Neill, 2005; Wang & Higgins, 2006).

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A HIPÓTESE GUARDA A hipótese guarda originalmente proposta por Van Der Biezen &

Jones (1998b) postula que, as proteínas R (ditas guarda) são ativadas indiretamente, pela interação direta da proteína Avr (efetora) do patógeno, com uma proteína alvo do hospedeiro. Isso é possível, pois, o patógeno causa modificações na estrutura quaternária da proteína do hospedeiro que, consequentemente, são detectadas pelas proteínas-guarda, oriundas do gene R. Isto inicia uma cascata de sinalização, culminando na resposta de defesa da planta (Van Der Biezen & Jones, 1998b). Notadamente, a interação Avr-R pode ocorrer tanto diretamente quanto indiretamente em resposta a invasão do patógeno (Figura 3).



Figura 2: Interações entre proteínas Avr do patógeno e proteínas R da planta

(adaptado de McDowell & Woffenden, 2003). Um patógeno hipotético (retângulo) causa o ataque na célula da planta e então são codificadas uma série de proteínas de virulência. Estas proteínas são translocadas dentro da célula via sistema secretório tipo III (bactéria) (Nimchuk et al., 2001) ou outros mecanismos não conhecidos (Fungos e oomycetos). Uma vez dentro, elas alvejam proteínas que controlam as respostas de defesa, metabolismo ou outros processos na planta que afetam a virulência do patógeno. (a) Nesta figura, a célula da planta não expressa uma proteína R que é capaz de reconhecer algumas proteínas de virulência. Assim, a planta não pode detectar eficientemente o patógeno e as defesas são, na melhor das hipóteses, fracamente induzidas. A doença então resulta da ação coletiva das proteínas de virulência. (b) Esta figura mostra o clássico reconhecimento eliciador-receptor, em que uma proteína R diretamente liga-se a uma proteína Avr. Este evento de reconhecimento ativa uma complexa rede de transdução de sinal, que em cascata, dispara as respostas de defesa. (c) Esta ultima figura mostra o sistema guarda, pois a proteína R (guarda) detecta a modificação da proteína do hospedeiro, formando um complexo contra o ataque desta.



Atualmente, a evidência mais convincente do sistema guarda foi encontrada no patossistema Arabidopsis thaliana versus Pseudomonas syringae pv. tomato. A RIN4 foi identificada como uma proteína celular requerida na resistência de plantas de Arabidopsis à P. syringae pv. tomato. Esta resistência é mediada pela proteína-guarda RPM1. A fitobactéria, para sucesso da infecção, secreta proteínas efetoras (AvrB, AvrRpm1 e AvrRpt2) através do sistema secretório tipo III (TTSS) (Axtell & Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2003). No entanto, a RIN4, alvo direto das proteínas efetoras, modifica-se conformacionalmente sinalizando para a ativação da proteína-guarda RPM1. Assim, ocorre o disparo da resposta de defesa contra a invasão da fitobactéria nos tecidos. Neste patossistema, também ocorre a clivagem da quinase PBS1 pela protease de cisteína (AvrPphB) da fitobactéria, que resulta na ativação da resistência mediada pela proteína-guarda RPS5 (Shao et al., 2003).

No tocante a vírus, as interações que envolvem as proteínas TCV do Turnip crinkle virus (TCV) e HRT de A. thaliana, também levam a sustentação do sistema guarda. Neste contexto, a proteína TCV é o determinante Avr para a resposta de defesa mediada pela proteína HRT, quando aquela interage com o fator de transcrição TIP, do hospedeiro (Ren et al., 2000; Soosaar et al., 2005). A interação TCV-TIP acarreta na inibição do sinal de localização nuclear da TIP (Belkhadir et al., 2004; Innes, 2004; Ren et al., 2005). Isso ocasiona um desbalanço da TIP no citoplasma, haja vista que a sua expressão é altamente dependente da interação com outros fatores de transcrição no núcleo. Esse desbalanço sinaliza para a ativação da proteína-guarda HRT, que dispara a resposta de defesa contra a invasão do vírus TCV. Interessantemente, neste sistema, não há interação entre a TIP e HRT para que haja a resposta de defesa. Mas, sim, da percepção da concentração da TIP no citoplasma.

O estudo do sistema guarda de defesa nos traz a luz do entendimento de como plantas podem superar a evolução do patógeno. Pois conta com um complexo mecanismo de percepção de sinais, não havendo a interação direta entre proteínas R e Avr. Neste contexto, a mesma proteína-guarda (R) poderia reconhecer a presença de múltiplas proteínas Avr, interagindo com proteínas do hospedeiro. Isto é verdade para a proteína-guarda RPM1, a qual é ativada pelas proteínas AvrB e AvrRpm1 em interação com RIN4 (Mackey et al., 2002). Este paradigma pode também constituir-se uma verdade para outras proteínas R, e poderia explicar o inesperado número reduzido de genes R na seqüência genômica de A. thaliana (Mackey et al., 2003; Meyers et al., 2003). Há aproximadamente 200 tipos de sequências de genes R no genoma de 120 Mp, que conferem resistência a diversos patógenos (Meyers et al., 2003).



Figura 3: Representação esquemática do sistema guarda em resposta ao ataque de um patógeno hipotético (representado pelo retângulo). (a) A proteína-guarda do hospedeiro é posicionada para ser alvo direto da proteína Avr, que interagem dinamicamente sinalizando para a ligação da proteína-guarda R e outras proteínas. (b) A proteína-guarda (R) é alvo direto da proteína Avr, no entanto, o disparo da resposta de defesa é dependente de proteínas do hospedeiro.



Além disso, este modelo esclarece a divergência funcional das proteínas R estruturalmente similares. No entanto, até o momento a hipótese guarda não comprova a função de virulência das proteínas guardas do hospedeiro (Soosaar et al., 2005).

SISTEMA GUARDA INATO EM TOMATE No complexo de defesa de plantas contra a ação de patógenos, há

várias estruturas preditas de proteínas R que exercem sinalização imediata na transdução de sinais (Hammond-Kosack & Jones, 2002; Mcdowell & Woffenden, 2003; Innes, 2004; Soosaar et al., 2005; Sacristán & García-Arenal, 2008). Desta forma, uma importante proteína que promove o reconhecimento à invasão de fitobactérias do gênero Pseudomonas é conhecida como Pto, uma proteína quinase (Pedley & Martin, 2003). A mesma faz parte do sistema de defesa inato em tomateiro (Solanum lycopersicum L.) e interage diretamente com as proteínas efetoras AvrPto e AvrPtoB de P. syringae pv. tomato (Scofield et al., 1996; Tang et al., 1996; Martin et al., 2003; Wu et al., 2004; Mucyn et al., 2006;). A fitobactéria ao entrar em contato com a planta inicia o processo de penetração-infecção, que envolve a direta liberação das proteínas efetoras no citoplasma celular, através do sistema secretório tipo III (TTSS) (Barinaga, 1996; Galan & Collmer, 1999; Hammond-Kosack & Jones, 2002; Mucyn et al., 2006; Lin e Martin, 2007). Em seguida, a proteína Pto interage fisicamente com a molécula efetora, mas não sinaliza para o início da resposta de defesa. Isso ocorre porque a proteína Pto é dependente da proteína Prf para iniciar a resposta contra o invasor (Figura 4) (Salmeron et al., 1996: Martin et al., 2003; Belkhadir et al., 2004). Notadamente, o gene Prf codifica uma proteína com similaridade as grandes classes de proteínas R (Salmeron et al., 1996; Martin et al., 2003), apresentando em sua estrutura as regiões LZ, NBS e LRR (LZ-NBS-LRR), com um sítio de ligação a proteínas na interleucina 8 (IL-8) (Salmeron et al., 1996; Van Der Biezen & Jones, 1998a; Martin et al., 2003; Pedley & Martin, 2003).

Em se tratando da proteína Prf, muitos pesquisadores ainda questionam qual o seu verdadeiro papel. Conceitualmente, é possível que a Prf atue em complexação com Pto ou, atue downstream como parte da rota de sinalização (Pedley & Martin, 2003). Para tal, três linhas de evidencias sugerem que a Prf atue no inicio da rota da Pto. Primeiro, a superexpressão do gene Prf leva ao aumento da resistência a Pseudomonas e a outros patógenos (Oldroyd & Staskawicz, 1998; Tobias et al., 1999), mas essa resistência requer a Pto. Segundo, a superexpressão do gene Pto leva ao aumento da resistência, mas também requer a Prf (Tang et al., 1999; Xiao et al., 2003).



Terceiro, uma compreensiva expressão do gene traça estudos completos da identificação de 400 genes que são diferentemente expressados na interação Pto-AvrPto, e a modificação da expressão destes genes (> 90%) requer ambas Pto e Prf (Mysore et al., 2002). Com base nestas observações, e na similaridade da Prf frente a outras proteínas R que apresentam papel no reconhecimento do patógeno, a Prf muito provavelmente participa em uma complexa interação com Pto (Pedley & Martin, 2003). E consistentemente, com os passos iniciais downstream da Pto, havendo necessidade desta para sua ativação.

As observações supramencionadas sugerem uma estreita relação entre as proteínas Pto e Prf no controle da sinalização da resposta de defesa. Neste contexto, o evento de reconhecimento que ocorre entre AvrPto ou AvrPtoB e Pto-Prf parece ser dirigida preferencialmente pelo patógeno do que pelo hospedeiro (Pedley e Martin, 2003; Mucyn et al., 2006). Isso é similar ao sistema guarda (Van Der Biezen e Jones, 1998b; Belkhadir et al., 2004), em que proteínas NBS-LRR detectam uma proteína alvo do hospedeiro que é alterada pela interação com moléculas efetoras do patógeno. Entretanto, a Prf não é uma clássica proteína-guarda, pois ela está presente em formas idênticas em cultivares suscetíveis e resistentes de tomate (Mucyn et al., 2006).

Diversas proteínas presentes na planta que podem interagir com a proteína Pto foram identificadas via sistema de dois híbridos em leveduras (Hammond-Kosack & Jones, 2002; Pedley & Martin, 2003). Todavia, somente quatro proteínas estão sendo investigadas, sendo uma quinase (Pti1) e três fatores de transcrição (Pti4, Pti5 e Pti6) (Hammond-Kosack & Jones, 2002; Martin et al., 2003). A Pti1 autofosforila in vitro os resíduos serina e treonina (Zhou et al., 1995) via mecanismos intraMol. (Sessa et al., 1998). Mas não realiza a fosforilação da Pto, sugerindo que ela provavelmente funcione downstream a Pto, in vivo. A interação física Pto-Pti1 necessita de fosforilação, como exemplo, substituições no maior sítio de fosforilação (T233) da Pti1 ou mutações que eliminaram a atividade da proteína quinase Pto interromperam a interação Pto-Pti1 (Sessa et al., 2000). Algumas observações hipotetizam a verdadeira função desta proteína (Zhou et al., 1995; Bogdanove & Martin, 2000; Mysore et al., 2002). No entanto, ainda são necessários maiores estudos, talvez utilizando aproximações da genética reversa.

Em relação aos três fatores de transcrição (TFs) Pti4, Pti5 e Pti6, os mesmos apresentam seqüências similares para fatores responsivos a etileno (ERFs) (Zhou et al., 1997). Semelhante aos ERFs, os TFs se ligam a um elemento cis, conhecido como GCC-box, que está presente em muitos genes de proteínas-PR (Zhou et al., 1997). Atualmente, não se sabe ao certo se os TFs apresentam papeis similares ou distintos na ativação de genes de defesa na resistência mediada por Pto, mas diversas observações vêm sendo



discutidas. Primeiro, o padrão da expressão dos TFs varia com respeito ao tipo de tecido e estádio de desenvolvimento. Por exemplo, somente o transcrito Pti4 é detectado em frutos vermelhos, que correlaciona com o fato que o mesmo é induzido por etileno, enquanto que Pti5/6 não são transcritos (Gu et al., 2000). Segundo, estes genes também parecem ser diferentemente expressados em resposta a patógenos. Ambos Pti4 e Pti5 são induzidos em folhas de tomate inoculados com isolados virulentos de Pseudomonas, enquanto que a expressão de Pti5 é aumentada especialmente em folhas contendo Pto inoculadas com um isolado avirulento de Pseudomonas, expressando AvrPto (Thara et al., 1999). Terceiro, a expressão dos Pti4, Pti5 ou Pti6 em plantas de Arabidopisis leva a ativação de grupos distintos de genes PR (Gu et al., 2002; Belkhadir et al., 2004; Innes, 2004). Assim, conjuminando esses dados, os mesmos indicam que Pti4/5/6 funcionam via mecanismo similar, mas apresentam distintos papeis na resposta de defesa.

Em plantios de tomate, para o controle de alguns insetos, utiliza-se o produto Fenthion (Lebaycid®). No entanto, este inseticida estava promovendo a HR em plantas de tomate. Interessantemente, a proximidade entre a sensibilidade ao fenthion e a resistência a mancha bacteriana pequena, foi fornecida pela caracterização da região Pto (Martin et al., 1994). O gene Pto pertence a uma família multigênica de ligantes e mostram 87% de similaridade sequencial para um segundo gene de proteína quinase, chamada Fen. O mesmo confere sensibilidade para o inseticida Fenthion, resultando em um tipo de morte celular programada (PDC) (Hammond-Kosack & Jones, 2002; Mackey et al., 2003; Pedley & Martin, 2003). Notadamente, as proteínas codificadas pelos genes Pto e Fen foram útil para o desenvolvimento de quimeras Pto-Fen em ordenada identificação das regiões da Pto envolvidas no reconhecimento AvrPto (Frederick et al., 1998).

SISTEMA GUARDA EM ARABIDOPSIS

No contexto do sistema guarda, plantas de Arabidopsis thaliana

apresentam resistência ao patógeno Pseudomonas syringae, que através do TTSS libera as três proteínas efetoras AvrB, AvrRpm1 e AvrRpt2 no citoplasma celular da planta (De Wit, 2002; Mackey et al., 2003; Innes, 2004;). Notadamente, o alvo dessas moléculas efetoras é a proteína do hospedeiro RIN4, que interage fisicamente com a proteína RPM1, uma proteína R (Mackey et al., 2002; Axtell & Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2003). Esta, por sua vez, desempenha o importante papel no reconhecimento da interação AvrB-RIN4 ou AvrRpm1-RIN4, iniciando o disparo da resposta de defesa contra a ação da fitobactéria (Innes, 2004).



Figura 4: Modelo da potencial rota de sinalização da resistência mediada por Pto em tomate. A proteína-guarda Prf está envolvida no reconhecimento do complexo AvrPto-Pto, para que haja o início da resposta de defesa envolvendo a ativação dos fatores de transcrição (Pti4, Pti5 e Pti6) e da proteína Pti1. Assim, ocasionando a expressão de proteínas relacionadas à patogênese (PRPs).



Assim, de acordo com o sistema guarda, a proteína RPM1 seria a proteína-guarda e a proteína RIN4 o alvo das proteínas efetoras do TTSS (Figura 5) (De Wit, 2002; Mackey et al., 2002; Mackey et al., 2003; Belkhadir et al., 2004).

A proteína AvrRpt2, interessantemente, atua postranscrionalmente na eliminação da RIN4, sendo uma protease de cisteína (Belkhadir et al., 2004). Com a perda da RIN4 ocorre a ativação de outra proteína R envolvida no complexo de defesa, a RPS2 (Axtell & Staskawicz, 2003; Innes, 2004). Isso mostra que o reconhecimento da AvrRpt2 é mediada pela RPS2, e não por RPM1. Mas, a RPS2 também atua fisicamente com RIN4, sugerindo que esta é protegida por pelo menos duas proteínas R diferentes (Belkhadir et al., 2004; Innes, 2004).

Embora muitas coisas tenham sido elucidadas neste complexo de defesa, ainda é obscuro como as proteínas efetoras do TTSS induzem mudanças em RIN4, ou mesmo porque esta é alvo (Innes, 2004). Outra dúvida que ainda persiste é, como a RIN4 ativa as modificações nas proteínas RPM1 e RPS2? Assim, muitas pesquisas devem ser realizadas para maior elucidação das rotas de sinalização do sistema guarda em A. thaliana.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Muitos progressos foram alcançados nos últimos anos para o

entendimento do sistema imune em plantas contra a ação de patógenos. No entanto, há muito a ser elucidado para se chegar a uma inferência de como as interações proteína-proteína podem desencadear a resposta de defesa em plantas. Especialmente no sistema guarda, existem grandes lacunas para serem preenchidas. Adicionalmente, a ampliação do entendimento do balanço da resistência, mediada por proteínas-guarda, pode nos levar a predizer como plantas conseguem co-evoluir com as mudanças na variabilidade genética dos patógenos e quais são os fatores envolvidos nesse processo.

Outro aspecto relevante, é que o sistema guarda pode significativamente impor limites no emprego de genes R em culturas transgênicas. Pois, mesmo que a maioria das proteínas R pertença a famílias conservadas, suas funções podem depender dos alvos de virulência, que não são necessariamente conservados em diferentes espécies de plantas. Pensando-se desta maneira, isso diminui o potencial de uso de uma única espécie de planta ‘modelo’, como uma fonte natural ou artificial de genes R para introduzir resistência em outras espécies de plantas. Consequentemente, a identificação de alvos de virulência é tão crucial quanto à identificação de



genes R para aproximações transgênicas da melhor resistência à doença em culturas.

Por fim, o sistema guarda aponta novas diretrizes nas pesquisas da interação gene-a-gene. Pois, após a clonagem de um grande número de genes R durante a década passada, a identificação de alvos de virulência de fatores Avr é um novo desafio para o futuro. Desta forma, (bio)ensaios sensíveis para avaliar o papel dos fatores de virulência serão desenvolvidos e uma combinação de diferentes aproximações bioquímicas e genéticas permitirão mostrar o reconhecimento de mecanismos mediados por proteínas-guarda (R) para esclarecimento de muitas dúvidas.

Figura 5: Modelo adaptado de De Wit (2002), em que representa o sistema

guarda em A. thaliana. O mesmo mostra comparativamente a resistência e suscetibilidade à P. syringae. A proteína de resistência (R) é a RPM1, e as proteína de avirulência são AvrB e AvrRpm1, mas aqui somente representadas como Avr. A proteína RIN4 em contato com as proteínas efetoras fosforila (circulo P) e aumenta a regulação da sua concentração e sua atividade como um regulador negativo da resistência basal da planta. a) Em plantas suscetíveis, o baixo grau de defesa da planta resulta no alastre da fitobactéria. b) As plantas resistentes fazem uso da proteína-guarda RPM1 para a percepção da interação Avr-RIN4, desencadeando para a reação de hipersensibilidade que previne o alastre da fitobactéria.



LITERATURA CITADA

AXTELL, M.J. & STASKAWICZ, B.J. 2003. Initiation of RPS2-specified disease resistance in Arabidopsis is coupled to the AvrRpt2-directed elimination of RIN4. Cell 112: 369-77.

BAKER, M.A. & ORLANDI, E.W. 1995. Active oxygen in plant pathogenesis Ann. Rev. of Phytopathol. 33:299-321.

BARINAGA, M. 1996. A shared strategy for virulence. Sci. 272:1261-3.

BELKHADIR, Y., SUBRAMANIAM, R. & DANGL, J.L. 2004. Plant disease resistance protein signaling: NBS-LRR proteins and their partners. Curr. Opinion in Plant Biol. 7:391-9.

BOGDANOVE, A.J. & MARTIN, G.B. 2000. AvrPto dependent Pto-interacting proteins and AvrPto-interacting proteins in tomato. Procec. of Nat. Acad. of Sci. 97:8836-40.

DANGL, J.L. & JONES, J.D.G. 2001. Plant pathogens and integrated defense responses to infection. Nature 411: 826-33.

DE WIT, P.J.G.M. 2002. On guard. Nature 416:801-3.

DELLEDONNE, M. 2005. N. O news is good for news plants. Curr. Opinion in Plant Biol. 8:390-6.

ELLIS, J., DODDS, P. & PRYOR, T. 2000. Structure, function and evolution of plant disease resistance genes. Curr. Opinion in Plant Biol. 3:278-84.

FLOR, H.H. 1956. The complementary genic systems in flax and flax rust. Adv. in Genetics 8:29-54.

FLOR, H.H. 1971. Corrent status of the gene-for-gene concept. Ann. Rev. of Phytopathol. 9:275-96.

FLOR, H.H. 1955. Host-parasite interaction in flax rust-its genetics and other implications. Phytopathol. 45:680-85.

FLOR, H.H. 1942. Inheritance of pathogenicity in Melampsora lini Phytopathol. 32:653-69.

FLOR, H.H. 1947. Inheritance of reaction to rust in flax. J. of Agr. Res. 74:241-62

FREDERICK, R.D., THILMONY, R.L., SESSA, G. & MARTIN, G.B. 1998.



Recognition specificity for the bacterial avirulence proteinAvrPto is determined by Thr-204 in the activation loop of the tomato Pto kinase. Mol. Cell 2: 241-5.

GABALDÓN, C., ROS-GÓMEZ, L.V., PEDREÑO, M.A. & ROS-BARCELÓ, A. 2005. Nitric oxide production by the differentiating xylem of Zinnia elegans. New Phytologist 165: 121-30.

GABRIEL, D.W. & ROLFE, B.G. 1990. Working models of specific recognition in plant-microbe interactions. Ann. Rev. of Phytopathol. 28: 365-91.

GALAN, J.E. & COLLMER, A. 1999. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Sci. 284: 1322-8.

GU, Y.Q., WILDERMUTH, M.C., CHAKRAVARTHY, S., LOH, Y.T., YANG, C., HEA, X., HANA, Y. & MARTIN, G.B. 2002. Tomato transcription factors Pti4, Pti5, and Pti6 activate defense responses when expressed in Arabidopsis. The Plant Cell 14: 817-31.

GU, Y.Q., YANG, C., THARA, V.K., ZHOU, J. & MARTIN, G.B. 2000. Pti4 is induced by ethylene and salicylic acid, and its product is phosphorylated by the Pto kinase. Plant Cell 12: 771-85.

HAMMOND-KOSACK, K.E. & JONES, J.D.G. 2002. Responses to plant pathogens. In: BUCHANAN, B.B., GRUISSEM, W., JONES, R.L., editors.(Ed) Biochemistry and Mol. Biol. of Plants. Rockville: ASPP. 1102-56.

INNES, R.W. 2004. Guarding the goods. new insights into the central alarm system of plants. Plant Physiology 135: 695-701.

JONES, J.D. 2001. Putting knowledge of plant disease resistance genes to work. Plant Biol. 4: 281-7.

LAMB, C. & DIXON, R. 1997. The oxidative burst in plant resistance. Ann. Rev. Plant Physiology and Plant Mol. Biol. 48: 251-75.

LIN, N.C. & MARTIN, G.B. 2007. Pto- and Prf-mediated recognition of AvrPto and AvrPtoB restricts the ability of diverse Pseudomonas syringae pathovars to Infect tomato. Mol. Plant-Microbe Interactions 20(7):806–15.

LUDERER, R. et al. 2001. No evidence for binding between resistance gene product Cf-9 of tomato and avirulence gene product AVR9 of Cladosporium fulvum. Mol. Plant-Microbe Interactions 14(7):867–76.

MACKEY, D., BELKHADIR, Y., ALONSO, J.M., ECKER, J.R. &



DANGL, J.L. 2003. Arabidopsis RIN4 is a target of the type III virulence effector AvrRpt2 and modulates RPS2-mediated resistance. Cell 112:379-89.

MACKEY, D., HOLT, B.F., WIIG, A. & DANGL, J.L. 2002. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell 108: 743-54.

MALAMY, J., CARR, J.P., KLESSIG, D.F. & RASKIN, I. 1990. Salicylic acid a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Sci. 250: 1002-4.

MARTIN, G.B., BOGDANOVE, A.J. & SESSA, G. 2003. Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Ann. Rev. of Biol. 54:23-61.

MARTIN, G.B., FRARY, A., WU, T., BROMMONSCHENKEL, S., CHUNWONGSE, J., EARLE, E.D. & TANKSLEY, S.D. 1994. A member of the tomato Pto gene family confers sensitivity to fenthion resulting in rapid cell death. The Plant Cell 6: 1543-52.

MCDOWELL, J.M. & WOFFENDEN, B.J. 2003. Plant disease resistance genes: recent insights and potential applications. Trends in Biotech. 21(4):178-83.

MEHDY, M.C., SHARMA, Y.K., SATHASIVAN, K. & BAYS, N.W. 1996. The role of activated oxygen species in plant disease resistance. Physiologia Plantarum 98:365-74.

METRAUX, J.P., SIGNER, H., RYALS, J., WARD, E., WYSS BENZ, M., GAUDIN, J., RASCHDORF, K., SCHMID, E., BLUM, W. & INVERARDI, B. 1990. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber. Sci. 250 (4983): 1004-6.

MEYERS, B.C., KOZIK, A., GRIEGO, A., KUANG, H. & MICHELMORE, R.W. 2003. Genome-wide analysis of NBS-LRR encoding genes in Arabidopsis. Plant Cell 15: 809-34.

MUCYN, T.S., CLEMENTE, A., ANDRIOTIS, V.M.E., BALMUTH, A.L., OLDROYD, G.E.D., STASKAWICZ, B.J. & RATHJENA, J.P. 2006. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. The Plant Cell 18: 2792–806.

MYSORE, K.S., CRASTA, O.R., TUORI, R.P., FOLKERTS, O., SWIRSKY, P.B. & MARTIN, G.B. 2002. Comprehensive transcript profiling of Pto- and Prf-mediated host defense responses to infection by Pseudomonas syringae pv. tomato. The Plant J. 32: 299-15.



NEILL, S.J. 2005. NO way to die-nitric oxide, programmed cell death and xylogenesis. New Phytologist 165:5-7.

NEILL, S.J., DESIKAN, R. & HANCOCK, J.T. 2003. Nitric oxide signalling in plants. New Phytologist 159:11-3.

OLDROYD, G.E.D. & STASKAWICZ, B.J. 1998. Genetically engineered broad-spectrum disease resistance in tomato. Procec. of the Nat. Acad. of Sci. 95:10300-5.

PEDLEY, K.F. & MARTIN, G.B. 2003. Mol. basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Ann. Rev. of Phytopathol. 41:215-43.

PINK, D.A.C. 2002. Strategies using genes for non-durable resistance. Euphytica 1:227-36.

REN, T., QU, F. & MORRIS, T.J. 2000. HRT gene function requires interaction between a NAC protein and viral capsid protein to confer resistance to turnip crinkle virus. Plant Cell 12:1917-26.

REN, T., QU, F. & MORRIS, T.J. 2005. The nuclear localization of the Arabidopsis transcription factor TIP is blocked by its interaction with the coat protein of Turnip crinkle virus. Virology 331:316-24.

SACRISTÁN, S. & GARCÍA-ARENAL, F. 2008. The evolution of virulence and pathogenicity in plant pathogen populations. Mol. Plant Pathology 3 (9): 369-84.

SALMERON, J.M., OLDROYD, G.E.D., ROMMENS, C.M.T., SCOFIELD, S.R., KIM, H.S., LAVELLE, D.T., DAHLBECK, D. & STASKAWICZ, B.J. 1996. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell 86:123-33.

SCHNEIDER, D.S. 2002. Plant immunity and film noir: what gumshoe detectives can teach us about plant-pathogen interactions. Cell 109:537-40.

SESSA, G., D’ASCENZO, M., LOH, Y.T. & MARTIN, G.B. 1998. Biochemical properties of two protein kinases involved in disease resistance signaling in tomato. J. of Biol. Chem. 273:15860-5.

SESSA, G., D’ASCENZO, M. & MARTIN, G.B. 2000. The major site of the Pti1 kinase phosphorylated by the Pto kinase is located in the activation domain and is required for Pto-Pti1 physical interaction. European J. of Biochemistry 267:171-8.



SHAO, F., GOLSTEIN, C., ADE, J., STOUTEMYER, M., DIXON, J.E. & INNES, R.W. 2003. Cleavage of Arabidopsis PBS1 by a bacterial type III effector Sci. 301:1230-3.

SOMSSICH, I.E. & HAHLBROCK, K. 1998. Pathogen defence in plants a paradigm of biological complexity. Trends in Biotechnol. 3:86-90.

SOOSAAR, J.L.M., BURCH-SMITH, T.M. & DINESH-KUMAR, S.P. 2005. Mechanisms of plant resistance to viruses. Nature 3:789-198.

STICHER, L., MAUCH-MANI, B. & METRAUX, J.P. 1997. Systemic acquired resistance. Ann. Rev. of Phytopathol. 35: 235-70.

TANG, X., XIE, M., KIM, Y.J., ZHOU, J., KLESSIG, D.F. & MARTIN, G.B. 1999. Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11:15-30.

THARA, V.K., TANG, X., GU, Y.Q., MARTIN, G.B. & ZHOU, J.M.P.J. 1999. Pseudomonas syringae pv tomato induces the expression of tomato EREBP-like genes Pti4 and Pti5 independent of ethylene, salicylate and jasmonate. The Plant J. 20: 475-83.

TOBIAS, C.M., OLDROYD, G.E.D., CHANG, J.H. & STASKAWICZ, B.J. 1999. Plants expressing the Pto disease resistance gene confer resistance to recombinant PVX containing the avirulence gene AvrPto. The Plant J. 17: 41-50.

VAN DER BIEZEN, E.A. & JONES, J.D. 1998. Plant disease resistance proteins and the gene-for-gene concept. Trends in Biochem. Sci. 23:454-6.

VAN DER BIEZEN, E.A. & JONES, J.D.G. 1998. The NB-ARC domain: a novel signalling motif shared by plant resistance gene products and regulators of cell death in animals. Curr. Opinion in Plant Biol. 8(7):226-7.

VAN DER HOORN, R.A.L., DE WIT, P.J.G.M. & JOOSTEN, M.H.A.J. 2002. Balancing selection favors guarding resistance proteins. Trends in Plant Sci. 7(2):67-71.

VAN LOON, L.C., BAKKER, P., PIETERSE, C.M.J., VAN LOON, L.C., DUFFY, B., ROSENBERGER, U. & DEFAGO, G. 1998. Induction and expression of PGPR-mediated induced resistance against pathogens. Mol. approaches in biological control 21(9): 103-10.

WANG, J. & HIGGINS, V.J. 2006. Nitric oxide modulates H2O2- mediated defenses in the Colletotrichum coccodes-tomato interaction. Physiol. and Mol. Plant Pathol. 67:131-7.



WU, A.J., ANDRIOTIS, V.M.E., DURRANT, M.C. & RATHJEN, J.P. 2004. A pach of surface-exposed residues mediates negative regulation of immune signaling by tomato Pto kinase. Plant Cell 16: 2809-21.

XIAO, F., LU, M., LI, J., ZHAO, T., YI, S.Y., THARA, V.K., TANG, X. & ZHOU, J.M. 2003. Pto mutants differentially activate Prf-dependent, avrPto-independent resistance and gene-for-gene resistance. Plant Physiology 131: 1239-49.

ZHOU, J.M., LOH, Y.T., BRESSAN, R.A. & MARTIN, G.B. 1995. The tomato gene Pti1 encodes a serine-threonine kinase that is phosphorylated by Pto and is involved in the hypersensitive response. Cell 83:925-35.

ZHOU, J.M., TANG, X. & MARTIN, G.B. 1997. The Pto kinase conferring resistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins that bind a cis-element of pathogenesis-related genes. The EMBO J. 16:3207-18.

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O papel do sistema de resistência guarda na interação gene-a-gene em plantas