OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO … · vi AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMAQ DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO

DOSE-FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA,

LAMIVUDINA E EFAVIRENZ

Keyla Emanuelle Ramos da Silva

RECIFE

2009




PROGRAMAQ DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS




Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito parcial para obtenção de Título de

Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de

Concentração: Produção e Controle de

Qualidade de Medicamentos.

Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

Co-Orientador: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de

Faria

Keyla Emanuelle Ramos da Silva

RECIFE

2009

Silva, Keyla Emanuelle Ramos da.

Obtenção tecnológica de comprimido revestido dose-fixa-combinada à base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz / Keyla Emanuelle Ramos da Silva. – Recife : O Autor, 2009.

Xvi + 102 folhas : il., fig. e tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2009.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Comprimidos. 2. Dose-fixa-combinada. 3. Anti-retroviral. 4. Validação. 5. Método analítico I. Título.

615.2 CDU (2.ed.) UFPE

615.1 CDD (21.ed.) CCS2009-158

ii




PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS




Banca Examinadora:

Membro Externo Titular Prof. Dr. Lívio César Cunha Nunes – Universidade Federal do Piauí

Membros Internos Titulares

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto - Universidade Federal de Pernambuco - Presidente

Profª Drª Maria do Carmo Alves de Lima – Universidade Federal de Pernambuco

Membros Suplentes

Externo: Prof. Dr. Fábio Santos de Souza – Universidade Federal da Paraíba

Interno: Prof. Dr. Dalci José Brondani – Universidade Federal de Pernambuco

iii


REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro

VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Dalci José Brondani

VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMAÊUTICAS

Profª Drª Beate Seagesser Santos

iv

v

A minha Mãe, com todo o amor do mundo.

vi

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal

de Pernambuco pela oportunidade de realização desta etapa da minha formação

acadêmica.

Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pelo

financiamento.

A meu orientador, Prof. Pedro José Rolim Neto, pela oportunidade concedida de poder

desfrutar de seus ensinamentos e de sua amizade, por me ensinar mais do que fazer

pesquisa, por colaborar no meu crescimento como gente.

A meu co-orientador, Prof. Antônio Rodolfo de Faria, pela oportunidade e contribuição

para meu crescimento profissional, minha eterna gratidão.

A Profª Drª Maria do Carmo Alves de Lima, por toda a ajuda e por me permitir utilizar

as instalações do seu Laboratório.

Aos amigos de equipe Jeckson Luiz da Silva, Mônica Felts de La Roca Soares e Lariza

Darlene Alves Santos, pelo empenho no desenvolvimento desse trabalho.

Ao Laboratório de Tecnologia de Medicamentos - LTM pela oportunidade de realizar

este trabalho e a todos os seus integrantes pela aprendizagem diária regada a muitas

risadas.

Ao Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos - LASOF, à Rafaella Passos

e a Leilane Santana, pela ajuda, companheirismo e amizade.

Aos amigos José Lamartine Soares Sobrinho, Mônica Felts de La Roca Soares e Lívio

César Cunha Nunes, pelos ensinamentos e apoio durante toda a jornada.

vii

A minha mãe Zélia Ramos de Sousa, que é o que tenho de mais precioso, pelos

ensinamentos, incentivo, confiança, amor e carinho dedicado a mim sempre.

A Tia Hortélia Vasconcelos, Vlademir Vasconcelos, Tia Elma Sousa e a meu irmão

Ramon Ramos pelas palavras de incentivo em todos os momentos A minha família, por

se fazerem presentes em todos os momentos.

A Romildo Johnson Pereira Diniz, Espedito Pereira do Nascimento Júnior, Maria

Gentil Pereira Diniz por estarem comigo sempre, meu muito obrigada.

A meus grandes amigos de infância, Adriane Borges Cabral, Myrtes Fabiana Pereira

Bezerra e Márcio Daniel Lima, por me acompanharem nessa longa jornada tão cheia de

encontros e desencontros, alegrias e tristezas, por me incentivarem sempre.

Aos amigos que colecionei durante toda a vida, obrigada por fazerem parte da minha

história.

A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

viii

A coisa mais bela que o homem pode experimentar é

o mistério. É esta a emoção fundamental que está na

raiz de toda ciência e arte. O homem que desconhece

esse encanto, incapaz de sentir admiração e

estupefação, esse já está, por assim dizer, morto e tem

os olhos extintos."

(Albert Einstein)

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIDS

HIV

FDA

LTM

LAFEPE

MS

DST

ITRN

ITRNN

CLAE

DFC

rpm

UV

ANVISA

IV

RMN 1H

RMN 13

C

OMS

LB

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

Vírus da Imunodeficiência Adquirida

Food Drug Administration

Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos

Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco

Ministério da Saúde

Doença sexualmente transmissíveis

Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos

Inibidores da transcriptase reversa não-análogos de

nucleosídeos

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Dose-fixa-combinada

Rotação por minuto

Ultravioleta

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Infravermelho

Ressonância Magnética Nuclear de 1H

Ressonância Magnética Nuclear de 13

C

Organização Mundial de Saúde

Lote de Bancada

x

LISTA DE SÍMBOLOS

%

°C

mg

g

mL

nm

M

porcentagem

graus Celsius

miligrama

grama

mililitro

nanômetro

Molar

Comprimento de onda

xi

LISTA DE FIGURAS

Artigo I

Figura 1: Estrutura química da Zidovudina .......................................................................... 14

Figura 2: Estrutura química da Lamivudina ......................................................................... 14

Figura 3: Estrutura química do Efavirenz ............................................................................ 16

Artigo II

Figura 1: Fluxograma do estudo de estresse: Hidrólise sob condições ácidas e básicas

(Fonte: Adaptado de: SINGH &BAKSHI, 2000). ................................................................ 33

Figura 2: Fluxograma do estudo de estresse: Oxidação (Fonte: Adaptado de: Singh &

Bakshi, 2000) ........................................................................................................................ 35

Figura 3: Fluxograma do estudo de estresse: Fotólise (Fonte: Adaptado de: Singh & Bakshi,

2000) ..................................................................................................................................... 37

Artigo III

Figura 1: Placa cromatográfica com padrão da Efavirenz e produtos de degradação. 1 -

Padrão de Efavirenz; 2 – Produtos formados pós Reação de Hidrolise Básica; 3 - Produtos

formados pós Reação de Hidrolise Básica, reação repetida em maior escala para

confirmação de confirmação dos produtos de degradação ................................................... 52

Figura 2: Estruturas químicas do efavirenz e possíveis produtos da hidrólise básica (I –

EFAVIRENZ; II – AMINO ÁLCOOL ; III – QUINOLINA).............................................. 52

Figura 3: Esquema da formação do amino álcool e quinolina ............................................. 53

Figura 4: Características físicas observadas dos produtos após hidrólise básica e separação

.............................................................................................................................................. 53

Figura 5: RMN1H do produto de degradação amino álcool ................................................. 54

Figura 6: RMN1H do produto de degradação quinolina ....................................................... 54

Figura 7: Estrutura química da Zidovudina .......................................................................... 55

Figura 8: Estrutura química da Timina ................................................................................. 56

Figura 9: Placa cromatográfica do padrão da Zidovudina antes e após hidrólise básica. 1-

Padrão de Zidovudina; 2 – Produtos de degradação formados após reação de Hidrólise

Básica ................................................................................................................................... 56

xii

Figura 10: Placa cromatográfica com padrão da Lamivudina e produtos de degradação,

respectivamente. 1 – Padrão de Lamivudina; 2 – Produtos de Degradação formados após

Hidrólise Básica .................................................................................................................... 57

Artigo IV

Figura 1. Estrutras químicas da zidovudina, lamivudina e efavirenz. .................................. 62

Figura 2. Varredura cromatográfica do padrão misto dos três fármacos, sem coluna

cromatográfica – Faixa ampliada de 180 a 320 nm. ............................................................. 66

Figura 3. Cromatogramas dos fármacos AZT, EFZ e 3TC (padrão de trabalho) isolados sob

as condições cromatográficas definidas. .............................................................................. 70

Figura 4. Cromatograma referente ao método analítico escolhido para quantificação do

AZT (40mg), 3TC (20mg) e EFZ (40mg). ........................................................................... 70

Figura 5. Cromatograma do placebo realizada com o método desenvolvido. ...................... 74

Artigo V

Figura 1: Estrutura molecular da zidovudina (AZT) ............................................................ 81

Figura 2: Estrutura molecular da lamivudina (3TC) ............................................................ 82

Figura 3: Estrutura molecular do efavirenz (EFZ) ............................................................... 83

xiii

LISTA DE TABELAS

Artigo II

Tabela 1 - Condições de estresse para a realização do estudo de degradação forçada......... 30

Artigo IV

Tabela 1: Condições cromatográficas dos métodos analíticos publicados ........................... 67

Tabela 2: Composição e fluxo da fase móvel padronizadas no método desenvolvido. ....... 69

Tabela 3: Validação: Parâmetro Robustez utilizando Anova fator único. ........................... 72

Tabela 4: Validação: Parâmetro Precisão Intermediária utilizando Anova fator duplo. ...... 73

Tabela 5: Validação: Parâmetro Exatidão utilizando Teste-t. .............................................. 74

Artigo V

Tabela 1: Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos ................................................ 84

Tabela 2: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima

zidovudina, (Northeast® lote: DY 070041) ......................................................................... 86


lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) ................................................................................ 86


efavirenz (Cristália®, lote: 1289/07) .................................................................................... 87

Tabela 5: Resultados do Controle físico-químico dos comprimidos obtidos ....................... 89

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 2

2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 5

2.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 5

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................... 5

Capítulo I ............................................................................................................................... 6

3 REVISÃO BIBLIOGRAFICA ..................................................................................... 6

3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral ................................................ 7

3.2 Artigo II. Modelos de Avaliação da Estabilidade de Fármacos e Medicamentos

para a Indústria Farmacêutica ....................................................................................... 22

Capítulo II ........................................................................................................................... 46

4 ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS FÁRMACOS ................................................ 46

4.1 Artigo III. Estudo de degradação dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e

Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas ................................................................... 47

Capítulo III .......................................................................................................................... 60

5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS .......... 60

5.1 Artigo IV. Determinação simultânea de zidovudina, lamivudina e efavirenz por

cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE ......................................................... 61

Capítulo IV .......................................................................................................................... 77

6 TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO DO COMPRIMIDO REVESTIDO DOSE-

FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA E EFAVIRENZ

.......................................................................................................................................... 77

6.1 Artigo V. Tecnologia de obtenção de comprimido revestido dose-fixa-combinada a

base de lamivudina, zidovudina e efavirenz ................................................................. 78

7 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 95

8 PERSPECTIVAS ......................................................................................................... 96

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................90

Anexos ............................................................................................................................ 100

xv

RESUMO

O acesso de pacientes infectados à terapia anti-retroviral é uma prioridade da saúde pública

mundial em países em desenvolvimento. A grande quantidade de fármacos já

disponibilizados para o tratamento da AIDS, viabiliza novas associações terapêuticas, o que

proporciona uma maior adesão ao tratamento, diminuindo o índice de mortalidade dos

pacientes infectados. Para tal finalidade tem-se desenvolvido anti-retrovirais em dose-fixa-

combinada. Esse tipo de associação proporciona uma maior adesão ao tratamento quando

comparada à administração dos medicamentos em separado. Este trabalho teve como

objetivos o estudo de estabilidade dos fármacos zidovudina, lamivudina e efavirenz, em

meios ácido e básico, a caracterização físico-química destas drogas, assim como o

desenvolvimento da forma farmacêutica como comprimido revestido dose-fixa-combinada.

Desenvolveu-se e validou-se também um método analítico de doseamento, por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), capaz de quantificar os três fármacos

presentes na forma farmacêutica simultaneamente. As matérias-primas dos três fármacos

apresentaram qualidade adequada e o método analítico desenvolvido e validado apresentou

resultados satisfatórios para todos os quesitos avaliados. Diante dos resultados alcançados,

pode-se garantir a obtenção da forma farmacêutica comprimido revestido dose-fixa-

combinada à base de zidovudina, lamivudina e efavirenz com qualidade e confiabilidade

comprovadas, requisitos fundamentais no desenvolvimento de um medicamento segundo as

Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPFC), preconizados pelo órgão regulatório

(ANVISA-MS).

Palavras-Chave: comprimidos, dose-fixa-combinada; anti-retroviral; validação; método

analítico; estabilidade

xvi

ABSTRACT

The access of infected patients to anti-retroviral therapy is a priority for global public health

in developing countries. A large amount of drugs already available for the treatment of

AIDS, makes possible new therapeutic associations, which provides a wide adherence to

treatment, reducing the mortality rate of infected patients. For this purpose, it has developed

anti-retrovirals in combined-fixed-dose. This type of association provides a wide adherence

to treatment when compared to administration of the drugs separately. This work aimed to

study the stability of drugs zidovudine, lamivudine and efavirenz on acid and basic

conditions, as well as physical-chemical characterization of these drugs and the

development of coated tablet form as combined-fixed-dose. Was also developed and

validated an analytical method of determination by high performance liquid

chromatography (HPLC) able to quantify the three drugs in the pharmaceutical form

simultaneously. The raw materials of the three drugs had an adequate quality and the

developed and validated analytical method showed satisfactory results for all items

evaluated. In view of the results achieved, we can ensure the preparation of the

pharmaceutical form coated tablet of zidovudine, lamivudine and efavirenz, on combined

fixed-dose with proven quality and reliability, the key requirements in developing a product

under Good Manufacturing Practices and Control (GMPC), recommended by the regulatory

body (ANVISA-MS).

Keywords: tablets, combined-fixed-dose, anti-retroviral, validation, analytical method,

stability

1

Introdução

2

1 INTRODUÇÃO

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente causador da Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS). As conseqüências clínicas da infecção por esse

vírus devem-se à sua capacidade em desarmar o sistema imune do hospedeiro, devido à

depressão dos linfócitos que expressam, superficialmente, o antígeno CD4-positivo (CD4+)

que em conjunto com alterações qualitativas e quantitativas do sistema imune leva à

susceptibilidade do organismo às infecções oportunistas (GOLDMAN & BENNET, 2001).

Segundo Nash e Elul (2006) 39,4 milhões de pessoas estavam vivendo com AIDS

até o final do ano de 2004 e a grande parte dessa população infectada reside nos paises em

desenvolvimento, visto que o acesso à prevenção primária e o diagnóstico são restritos e

muitas vezes inexistentes. A África subsaariana concentra cerca de 64% das infecções no

mundo, reduzindo a espectativa de vida nesses países de 62 para 47 anos.

Atualmente, a terapia padrão é conhecida como terapia anti-retroviral de alta

atividade (HAART), a qual combina pelo menos três fármacos, sendo dois inibidores da

transcripitase reversa análogos de nucleosídeo (ITRN) associados a um inibidor da

transcripitase reversa não-análogo de nucleosídeo (ITRNN) ou um inibidor de protease (IP)

(LAURENT et al, 2004; WISSENT et al, 2005).

A grande quantidade de fármacos já disponibilizados para terapia anti-retroviral,

resulta em um variado número de possíveis combinações, o que pode oferecer mais opções

de tratamento, levando-se em consideração a rápida resistência apresentada pelo vírus HIV

(NOTARI et al, 2006).

A política Nacional de AIDS do Ministério da Saúde, preconiza a obtenção

tecnológica de formas farmacêuticas DFC seguindo a orientação do Consenso de AIDS

2007-2008. O Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos vem contribuindo de forma

ímpar com o Programa Brasileiro, pois tem desenvolvido vários medicamentos para

empresas públicas.

O estudo de estabilidade dos fármacos mostra-se como uma tendência dentro do

planejamento para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica, já que investigação da

estabilidade intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de

adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente

3

melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando que o conhecimento do

comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da forma farmacêutica

desejada (REYNOLDS et al, 2002; AULTON, 2005).

Diante das novas exigências da ANVISA, com relação ao desenvolvimento e

validação do método indicativo de estabilidade, estes estudos passaram a ser o novo desafio

aos profissionais da área de desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Nosso grupo vem,

há alguns anos, desenvolvendo parcerias com laboratórios farmacêuticos para aplicação de

metodologias para estudo de estabilidade e ativos de origem natural e sintética, produtos

isolados, misturas de fármacos, bem como, produto acabado em diferentes formas

farmacêuticas em doenças negligenciadas e de alto custo, em monoterapia e em dose-fixa-

combinada.

Os medicamentos têm em sua composição, além dos princípios ativos, os excipientes

que não desenvolvem atividade farmacológica, porém possuem diversas funções técnicas. Sendo

assim, a determinação das propriedades físicas e químicas fundamentais das moléculas dos

fármacos e outras propriedades derivadas dos fármacos é vital ao processo de desenvolvimento

de uma forma farmacêutica. Estas informações ditam muitos dos eventos subseqüentes e das

abordagens no desenvolvimento da formulação, esta primeira etapa da pesquisa é conhecida

como pré-formulação (FLORENCE, ATTWOOD, 2003; WELLS, 2005).

Ao se desenvolver um método analítico deve-se realizar sua validação como método

prático de confiabilidade desejada e de baixo custo para a utilização na rotina industrial

farmacêutica. A validação de método analítico consiste na confirmação por exame e

fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado

uso pretendido são atendidos (ANVISA, 2003; BEDOR et al., 2004; SOARES SOBRINHO

et al., 2005; USP, 2006).

A realização deste projeto além de sentido científico tem um cunho social,

possibilitando a aquisição de medicamentos de qualidade e de baixo custo, pois o estudo

será realizado em parceria com a Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e o

Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE).

4

Objetivos

5

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolvimento da forma farmacêutica comprimido revestido e validação de

métodos analíticos para controle de qualidade da dose-fixa-combinada – Zidovudina +

Lamivudina + Efavirenz comprimido.

2.2 Objetivos Específicos

Estudo de estabilidade dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz, em

condições ácidas e básicas;

Caracterização Física e Química dos pós de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz;

Desenvolvimento e validação de método para doseamento do comprimido revestido à

base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz por meio da técnica de CLAE;

Desenvolvimento da forma farmacêutica comprimidos revestidos dose-fixa-

combinada.

6

Capítulo I

3 REVISÃO BIBLIOGRAFICA

3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral

Artigo a ser submetido


para a Indústria Farmacêutica

Artigo submetido à Latin American Journal of Pharmacy

7

3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral

Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Antônio Rodolfo de Faria

2, Pedro José Rolim Neto

1*

1- Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos – UFPE

2- Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos - UFPE

RESUMO

O acesso da população infectada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos

medicamentos anti-retrovirais nos países em desenvolvimento é uma prioridade de saúde

pública. Com o apoio de programas, organizações não-governamentais, e autoridades

nacionais, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem o ambicioso objetivo de tratar 3

milhões de pessoas infectadas pelo HIV com a terapia anti-retroviral de alta atividade.

Atualmente, encontram-se à disposição na rede de saúde 16 fármacos. A incorporação de

novos anti-retrovirais no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS) é definida após análises

técnicas realizadas por três comitês assessores, também responsáveis pelas recomendações

para o uso e monitoramento desses medicamentos. A resistência aos medicamentos

atualmente disponíveis tem contribuído para o aumento da pandemia da AIDS, enfatizando

a necessidade de desenvolvimento de novas estratégias preventivas que possam ser mais

efetivas contra o HIV.Os esforços atuais focalizam na simplificação dos esquemas

terapêuticos de modo a aumentar a aderência ao tratamento e o manejo dos efeitos

colaterais.

Palavras-Chave: Dose-fixa-combinada, AIDS, Terapia

_______________________

*Endereço para Correspondência: Laboratório de Tecnologia de Medicamentos – LTM.

Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof.

Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, Recife – PE. 50.740-521. Tel/Fax (81)3272-1373.

Email: [email protected]

8

Introdução

O acesso da população infectada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos

medicamentos anti-retrovirais nos países em desenvolvimento é uma prioridade de saúde

pública. Com o apoio de programas, organizações não-governamentais, e autoridades

nacionais, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem o ambicioso objetivo de tratar 3

milhões de pessoas infectadas pelo HIV com a terapia anti-retroviral de alta atividade

(LAURENTE et al., 2004).

A resistência aos medicamentos atualmente disponíveis tem contribuído para o

aumento da pandemia da AIDS, enfatizando a necessidade de desenvolvimento de novas

estratégias preventivas que possam ser mais efetivas contra o HIV e a necessidade de uma

vigilância quanto à resistência aos medicamentos (VERAS et al., 2007).

Os esforços atuais focalizam na simplificação dos esquemas terapêuticos de modo a

aumentar a aderência ao tratamento e o manejo dos efeitos colaterais (LANCELLOTTI;

GAGLIANI, 2005).

Materiais e Métodos

Utilizou-se para redação da revisão bibliográfica os bancos de dados eletrônicos

ScienceDirect, Scopus, Scirus, PubMed/Meddline e Bireme. Foram selecionados artigos

científicos publicados sobre a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida e os medicamentos

utilizados pra o tratamento da mesma. Os resultados da busca eletrônica foram expandidos

com busca entre as referências bibliográficas dos artigos selecionados.

Resultado e Discussão

AIDS

Aproximadamente 60% das doenças que atingem o homem são provocadas por

vírus, sendo em uma grande variedade de doenças crônicas e degenerativas. A luta contra

as infecções virais se faz de grande dificuldade, pois a replicação viral é um processo

9

intracelular, estando intimamente relacionada ao metabolismo das células infectadas.

(ANTUNES; TENURI, 2002; SOUZA; ALMEIDA, 2003).

A identificação do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e da Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) ocorreu a pouco mais de duas décadas, porém o

número de pessoas infectadas e doentes têm aumento vertiginosamente nesse curto período

de tempo (CANINI, et al; 2004). As conseqüências clínicas da infecção pelo HIV devem-

se à sua capacidade em desarmar o sistema imune do hospedeiro, devido à depleção dos

linfócitos que expressam, superficialmente, o antígeno CD4-positivo (CD4+). A redução

progressiva dos linfócitos CD4+ em conjunto com alterações qualitativas e quantitativas do

sistema imune leva à susceptibilidade do organismo às infecções oportunistas (GOLDMAN

& BENNET, 2001).

O período entre a aquisição do HIV e a manifestação da AIDS pode durar alguns

anos, porém, apesar de o indivíduo portador do vírus estar muitas vezes assintomático, pode

apresentar importantes transtornos na esfera psicossocial, a partir do momento em que fica

sabendo de seu diagnóstico. Alguns estudiosos têm discutido que as diversas alterações que

ocorrem no sistema nervoso dos clientes com HIV/aids, associadas com depressão e/ou

estresse podem influenciar a evolução da doença, e as alterações nos estados psíquicos e

sociais podem contribuir para aumentar a vulnerabilidade biológica (THOMPSON, NANNI

& LEVINE, 1996).

A infecção pelo HIV-1 cursa com amplo espectro de apresentações clínicas, desde a

fase aguda, que pode se manifestar como síndrome retroviral aguda, até fase avançada da

doença com as manifestações definidoras da síndrome da imunodeficiência. Em indivíduos

não-tratados, estima-se em que o tempo médio entre o contágio e o aparecimento da doença

seja de 10 anos.

A infecção aguda ou Síndrome Retroviral Aguda é caracterizada por uma doença

transitória sintomática, que ocorre logo após exposição ao HIV. Está associada à intensa

replicação viral e a uma resposta imunológica vírus específica. Após a transmissão do HIV-

1, manifestações clínicas podem ocorrer em cerca de 50 a 90% dos indivíduos. O início dos

sintomas ocorre entre duas a quatro semanas após a exposição, porém, já foi descrito em até

10 meses após a infecção primária. A duração dessa fase sintomática pode ser de sete a dez

dias e, raramente, até duas semanas. Os sintomas, quando ocorrem, incluem febre alta por

10

um ou dois dias, suores, linfoadenomegalia transitória, que se caracteriza pela presença de

nódulos indolores, esplenomegalia, fadiga, falta de apetite, depressão que pode durar

semanas ou até meses, entre outros (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

O diagnóstico clínico da infecção aguda pelo HIV, geralmente, passa despercebido

por seu caráter inespecífico ou pela ausência de sintomas. O clínico deve estar atento para

avaliar não só os dados do exame físico e as queixas, mas também a situação

epidemiológica, incluindo história de possível exposição de risco para o HIV, tais como

relações sexuais desprotegidas, utilização de drogas endovenosas e acidente com material

biológico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

Denomina-se fase assintomática o estágio em que a pessoa infectada não apresenta

qualquer sintoma. Esse período de latência do vírus é marcado pela forte interação entre o

sistema imune e as constantes e rápidas mutações do vírus. Durante essa fase, os vírus

amadurecem e morrem de forma equilibrada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).

A fase sintomática é a fase que se instalam doenças oportunistas, que são as

doenças que se desenvolvem em decorrência de uma alteração imunitária do hospedeiro,

devido à redução crítica de células T, tipo CD4, que chegam abaixo de 200 unidades por

mm³ de sangue. Adultos saudáveis possuem de 800 a 1200 unidades. Nessa fase, surgem os

sintomas típicos da AIDS, tais como: diarréia persistente, dores de cabeça, contrações

abdominais, febre, falta de coordenação, náuseas, vômitos, fadiga extrema, perda de peso e

câncer (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).

Quanto a Terapia Anti-retroviral

O advento dos anti-retrovirais, para o tratamento dos indivíduos com HIV/aids, vem

proporcionando aumento no tempo de sobrevida, porém, seu alto custo e inúmeros efeitos

colaterais associados à inexistência de cura para a doença têm direcionado investigações

sobre o impacto qualitativo dessa terapêutica na qualidade de vida (MERCK & CO, 2001;

HARDMAN E LIMBIRD; 2001). Acreditava-se que o avanço tecnológico poderia ser uma

solução concreta para os principais problemas relacionados às doenças crônicas, tornando a

mensuração da qualidade de vida uma tarefa inútil (SILVA et al, 2006).

11

O principal objetivo da terapia anti-retroviral é retardar a progressão da

imunodeficiência, possibilitando aumento do tempo e da qualidade de vida da pessoa

infectada.

Desde a descoberta do primeiro anti-retroviral, observa-se a evolução ocorrida no

tratamento anti-retroviral, decorrente dos avanços alcançados no conhecimento da infecção

pelo HIV. Este tratamento, cuja história teve início no uso de monoterapia com Zidovudina,

de 1994 a 1996, consolidou-se com a terapia dupla como padrão terapêutico e, a partir de

1996, com a terapia tríplice, de introdução dos inibidores da protease (BONOLO; GOMES;

GUIMARÃES, 2007).

O primeiro medicamento específico, a zidovudina (AZT), foi desenvolvido em 1989

(MARINS et. al 2002), seguido do ddI e ddC em 1993 e 1995 (BASSO 2002). Estudos

demonstraram que o AZT isoladamente não alterava o tempo de sobrevida do paciente,

exceto quando utilizado em conjunto com as quimioprofilaxias (BASSO 2002, MARINS

et. al 2002). Em 1995 foi demonstrado que a terapia dupla, o AZT combinado com os

outros medicamentos, era capaz de aumentar discretamente a sobrevida dos pacientes

(MARINS et. al 2002). Dessa forma, em razão dessas múltiplas combinações de vários

medicamentos e terapias, o manejo da AIDS sempre exigiu uma atualização constante dos

profissionais.

Apesar dos medicamentos promissores, com excelentes resultados clínicos,

pesquisadores, profissionais de saúde, representantes de governo e de organizações não

governamentais reunidos na XI Conferência Internacional de AIDS, realizada em

Vancouver, Canadá, entre os dias 7 e 12 de julho de 1996, já tinham como consenso que

esses benefícios só seriam alcançados pela adesão ao tratamento (BONOLO; GOMES;

GUIMARÃES, 2007).

Um dos problemas que leva ao uso incorreto dos anti-retrovirais e está relacionado

diretamente à falência terapêutica, facilitando a emergência de cepas do HIV resistentes aos

medicamentos existentes, é a grande quantidade de medicamentos em diferentes horas do

dia, levando ao uso incorreto dos anti-retrovirais (LIGNANI JÚNIOR; GRECO;

CARNEIRO, 2001; SOUZA; STORPIRTIS, 2004).

Para manter a carga viral indetectável por tempo mais longo e obter aumentos

significativos na contagem de linfócitos CD4+, a aderência aos medicamentos deve ser

12

superior a 90%, no entanto os estudos disponíveis sobre o tema demonstram que a taxa de

aderência aos anti-retrovirais varia entre 40% e 80%(LIGNANI JÚNIOR; GRECO;

CARNEIRO, 2001).

Após a introdução da terapia anti-retroviral de alta eficiência (HAART), observou-

se um queda considerável no número de mortes relacionadas ao vírus HIV e representa um

padrão de terapia para o tratamento da AIDS. O regime recomendado na HAART é

constituído por dois ITRNs associado com um IP ou ITRNN para aumentar a potência,

minimizar a toxicidade, e diminuir o risco de resistência. Para terapia inicial se recomenda

para terapia Preferencial a utilização de 2 ITRN + ITRNN e como terapia alternativa a

utilização de 2 ITRN + IP/r (MARIER et al., 2007).

A fim de melhorar a conveniência do tratamento, formulações multifármacos, na

forma de dose-fixa estão sendo amplamente promovidas como regime de 1ª linha em

programas de acesso ao tratamento anti-retroviral. Esta forma farmacêutica é de grande

interesse do Ministério da Saúde, pois objetiva a produção por laboratórios como o

LAFEPE, com experiência na produção de medicamentos anti-retrovirais, que possam

produzir e disponibilizar estes medicamentos ao Programa DST-AIDS a um menor custo

(FARIAS et al., 2006).

O termo dose fixa-combinada (DFC) refere-se a associações de classes variadas de

fármacos em diversas combinações, sendo que os regimes terapêuticos mais potentes são

aqueles que combinam dois fármacos ITRNs e um ITRNN associados numa única forma

farmacêutica. Dentre as vantagens dessa associação: baixo custo; eficácia e tolerabilidade

semelhantes a outros esquemas terapêuticos; melhor adesão ao tratamento; menor número

de comprimidos/cápsulas ingeridos (FARIAS et al., 2006).

Durante os últimos anos, a lamivudina foi comumente administrada com a

zidovudina, e este se tornou o padrão nucleosídico da terapêutica combinada, em que

combinações complexas com um IP ou um ITRNN foram avaliados (MARIER et al.,

2007).

Demonstrou-se que esquemas que utilizam 2 ITRN + ITRNN são, em geral, de

posologia mais simples o que provavelmente facilita a adesão ao tratamento. Quanto à

escolha dos ITRNN, o efavirenz continua sendo preferencial à nevirapina, exceto em

gestantes. Essa opção está fundamentada na sua elevada potência de supressão viral,

13

comprovada eficácia em longo prazo e ao menor risco de efeitos adversos sérios.

Adicionalmente, a longa meia-vida deste permite maior flexibilidade no horário de tomada

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

De acordo com o Consenso 2007-2008, o efavirenz, a lamivudina e a zidovudina são

os fármacos de primeira escolha para o tratamento inicial de pacientes portadores do HIV.

Logo estudos estão sendo realizados para que se possa obter uma dose-fixa-combinada

contendo esses três fármacos.

Quanto aos fármacos de Primeira Escolha

Inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa: Essa classe de fármacos é composta

por pró-drogas análogas de dideoxinucleosídeos que requerem fosforilação intracelular em

seu correspondente derivado trifosfato. O metabólito trifosfato então, compete com a

transcriptase reversa por agir como um substrato alternativo para a enzima, e uma vez que o

metabólito é incorporado à cadeia terminal do DNA em desenvolvimento, interrompe

analogamente desta (DE CLERCQ, 2004). Os fármacos desta classe impedem a infecção

aguda das células suscetíveis, mas exercem pouco efeito sobre as células infectadas

(GOODMAN E GILMAN, 2003).

Zidovudina

A Zidovudina, 3-azido-3-deoxitimidina (Figura 1), é semelhante à timidina

endógena, diferenciando apenas pela presença de um grupo azido (N3) no anel ribose ao

invés de hidroxila na posição 3. Ela apresenta-se neutra na faixa de pH, que varia de 3,5 a

5,5 e pKa igual a 9,8 (SOUZA; STORPIRTIS, 2004).

A rota sintética utilizada para sua produção foi a de Horwitz, sendo o primeiro

método de preparação industrial. Esta síntese tem como material de partida a Timina, tendo

sido realizada em seis etapas de síntese, tende este processo um rendimento global de 30%

(SOUZA; ALMEIDA, 2003).

14

Figura 1: Estrutura química da Zidovudina

Após penetrar nas células do hospedeiro, a zidovudina é fosforilada pela

timidinocinase em monofosfato; em seguida, pela timedilatocinase em difosfato; e, por fim,

pelo nucleosídio difosfatocinase em 5-trifosfato de zidovudina ativo (GOODMAN;

GILMAN, 2003). Este por sua vez, inibe a continuidade da cadeia do DNA viral, por

inibição da TR. Possui atividade contra o HIV 1 e o HIV 2 e apresenta-se na forma

farmacêutica sólida com dose diária de 600 mg (DE CLERCQ, 2004).

Lamivudina

A Lamivudina é uma citidina sintética, 2’-desoxi-3-tiacitidina (figura 2), com

configuração absoluta 2R, 5S não natural. Ela é uma didesoxipirimidina, em que o carbono

3’ do anel da ribose é substituído por enxofre. A 3TC é o enantiômero (-); o enantiômero

(+) possui maior toxicidade.

Figura 2: Estrutura química da Lamivudina

15

Apresenta-se como pó branco a branco-amarelado, com pKa igual a 4,3 (protonação

do grupo NH2). É facilmente solúvel em água, quando dissolvido neste, encontra-se

primariamente sob a forma não-ionizada. O pH da solução aquosa a 1% (p/V) é 6,9. Dados

da literatura afirmam que tanto em estado sólido quanto em solução aquosa ele possui

elevada estabilidade à luz e à temperatura. Possui faixa de fusão entre 176ºC e 178ºC.

(SOUZA; STORPIRTIS, 2004).

Penetra na célula por difusão passiva e sofre fosforilação em seu metabólito ativo, o

trifosfato de lamivudina, este compete com o trifosfato de desoxicitidina pela sua ligação

com a transcriptase reversa, e a incorporação ao DNA resulta em interrupção da cadeia. Ao

contrário a muitos análogos de nucleosídeos, a lamivudina desenvolve resistência

rapidamente (GOODMAN; GILMAN, 2003). Esse INTR também possui atividade contra o

HIV 1 e o HIV 2 e o HBV. Apresenta-se na forma farmacêutica sólida com dose diária de

300 mg (DE CLERCQ, 2004).

Inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa: são compostos sintéticos

clinicamente distintos, inibidores alostéricos não competitivos que diminui a razão da

incorporação do nucleotídeo e bloqueia a transcriptase reversapor meio de sua ligação

adjacente ao sítio ativo da enzima, induzindo a alteração na configuração deste local

(GOODMAN & GILMAN, 2003). Essa classe de drogas possui maior eficácia contra HIV-

1 do que contra HIV-2. São ativas no seu estado nativo, não requerendo fosforilação (DE

CLERQ, 1998).

Efavirenz

Correspondente à 1,4-diidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona (figura 3) apresenta-se como

cristal não higroscópico e apresenta descrito na literatura cinco polimorfos . Seu coeficiente

de partição octanol - água é de 5,4. Com solubilidade aquosa de 9,2 µg/mL (pH 8,7) a 25 °

C. Essa solubilidade aquosa pode ser aumentada num pH acima de 9, consistente com a

perda do próton sobre a amina do carbamato (MAURIN et al., 2002). Possui faixa de fusão

de 136,0°C-141,0 °C, sendo praticamente insolúvel em água, mas solúvel em metanol e

diclorometano. Possui características hidrofóbicas, baixa densidade e oferece grande

16

resistência a escoamento. A densidade aparente e compactado da matéria-prima é de

respectivamente 0,389 e 0,397g/mL (VIANA et al., 2006).

Difunde-se na célula, onde se liga em um local adjacente ao local ativo da

transcriptase reversa. Essa ligação produz uma alteração de configuração na enzima, que

inibe a sua função (GOODMAN; GILMAN, 2003). Apresenta-se na forma farmacêutica

sólida e sua dosagem diária é de 600 mg (DE CLERCQ, 2004).

Figura 3: Estrutura química do Efavirenz

Outras Classes de anti-retrovirais

Inibidores de Protease: Quando as células infectadas são expostas a inibidores de protease

do HIV, ocorre a produção de vírus imaturos que necessitam de nucleocapsídeo típico não

sendo infecciosos. Isso ocorre porque a clivagem de poliproteínas no processo final da

proteína viral é impedida (FARIAS et al, 2006).Dentre os inibidores de protease

podemoscitar: saquinavir (SQV), inidavir (IDV), ritonavir (r) (adjuvante farmacológico),

nelfinavir (NFV), lopinavir(LPV) e atazanavir (ATV).

Inibidores de Fusão: Em um esforço para tratar pacientes infectados pelo HIV que se

tornaram resistentes ou intolerantes a ITRs ou IPs, novas estratégias foram exploradas,

inclusive a inibição da entrada de HIV nas células hospedeiras (POMMIE, JOHNSON,

MARCHAND, 2005) A primeira etapa da entrada é a ligação do vírus à célula hospedeira

via interação entre a proteína gp120 no invólucro viral e CD4 na membrana da célula

hospedeira. A proteína gp120, na camada do vírus HIV, se liga ao co-receptor da

quimoquina CCR5 ou CXCR4, que permite à proteína gp41, existente na superfície viral,

17

se fundir com a membrana da célula hospedeira (MEANWELL & KADOW, 2003;

CASTAGNA et al, 2005). A enfuvirtida, que ataca a proteína gp41, é o único inibidor de

fusão atualmente disponível (LALEZARI et al, 2003). A enfuvirtida oferece o benefício de

um novo mecanismo de ação, mas apresenta limitações. A principal desvantagem da

enfuvirtida é sua formulação, já que é administrada apenas por injeção. Além disso, reações

no local da injeção têm sido notificadas na maioria dos pacientes.

Inibidores de Integrase: Os inibidores da integrase bloqueiam uma etapa irreversível no

ciclo de vida do HIV e suas ações são independentes dos subtipos de co-receptor

(POMMIE, JOHNSON, MARCHAND, 2005; HAZUDA, 2006) Não há análogo humano à

integrase e, portanto, os inibidores da integrase são específicos para o HIV (LATAILLADE

& KOZAL, 2006). Devido a essa especificidade, os inibidores da integrase não parecem

interferir na função celular normal em células não infectadas (POMMIE, JOHNSON,

MARCHAND, 2005). A inibição da integração protege o DNA hospedeiro da infecção ao

desativar o genoma viral e impedir a produção do vírus. Ao impedir a integração do DNA

do HIV ao DNA celular, as células podem ser protegidas de contribuir para o

desenvolvimento de novos reservatórios latentes de infecção (HAZUDA, 2006).

O raltegravir é (Isentress®) é indicado em combinação com outros agentes anti-

retrovirais para o tratamento de infecção por HIV-1 em pacientes que não responderam aos

esquemas com pelo menos um fármaco de cada uma das seguintes classes: IP, ITRNs,

ITRNNs.

Conclusão

O HAART reduziu substancialmente a morbidade e a mortalidade no mundo

desenvolvido, e estão em andamento iniciativas promissoras para levar tratamentos anti-

retrovirais para os países em desenvolvimento. Uma combinação de tratamentos potentes

agora é um padrão de tratamento em âmbito mundial.

O LAFEPE em parceria com o Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos

(LTM), vem contribuindo na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos anti-

retrovirais. Atualmente encontra-se em fase de obtenção tecnológica a forma farmacêutica

comprimido revestido, associando os fármacos indicados como de primeira escolha pelo

18

Consenso de AIDS 2007-2008 na forma dose-fixa-combinada em um único comprimido

com a seguinte associação: Lamivudina 150 mg, Zidovudina 300 mg e Efavirenz 300 mg.

Desta forma estamos contribuindo com a política Nacional de AIDS do Ministério da

Saúde, que garante tratamento adequado, universal e gratuito.

Referências Bibliográficas

BONOLO, P. F.; GOMES, R. R. F. M.; GUIMARÃES, M. D. C. Adesão à terapia anti-

retroviral (HIV/aids): fatores associados e medidas da adesão. Epidemiologia e Serviços

de Saúde, Brasília, v.16, n. 4, p. 261-278. 2007.

CANINI, S. R. M. S.; REIS, R. B.; PEREIRA, L.; GIR, E.; PELÁ, N. T. R. Qualidade de

vida de indivíduos com HIV/aids: uma revisão de literatura. Revista Latino-americana de

Enfermagem, v.12, n.6, p.940-5. 2004.

CASTAGNA, A.; BISWAS, P.; BERETTA, A.; LAZZARIN, A. The appealing story of

HIV entry inhibitors: from discovery of biological mechanisms to drug development.

Drugs, v.65, n.7, p. 879–904. 2005.

DE CLERCQ, E. Antiviral drugs in current clinical use. Journal of Clinical Virology, v.

30, p. 115–133. 2004.

FARIAS, S. R. Q.; LAVRA, Z. M. ; MEDEIROS, F. P. M.; ROLIM NETO, P. J. Uma

Nova Proposta Terapêutica para Tratamento da AIDS: da Monoterapia à dose-fixa-

combinada. Revista Brasileira de Farmácia, v. 87, p. 92-97. 2006.

FARIAS, S.R.Q. Desenvolvimento de comprimidos revestidos dose fixa-combinada –

estavudina, lamivudina e nevirapina para tratamento da AIDS. 2006. 82p. Dissertação

(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de

Pernambuco.

19

GOLDMAN, L.; BENNET, J. C. Cecil tratado de medicina interna, 21a ed., Guanabara

Koogan: Rio de Janeiro, 2001.

GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. G. (Colab.). As bases farmacológicas da terapêutica.

10.ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 2003. 1647 p.

HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E. Goodman & Gilman’s the pharmacological basis

of therapeutics, 10th ed., Mc. Graw-Hill: New York, 2001.

HAZUDA D. Inhibitors of human immunodeficiency virus type I integration. Current

Opinion in HIV and AIDS, v.1, p.212–217. 2006.

LALEZARI, J. P., HENRY, K., O’HEARN, M, et al. Enfuvirtide, an HIV-1 fusion

inhibitor, for drug-resistant HIV infection in North and South America. The New England

Journal of Medicine, v. 348, n.22, p. 2175–2185. 2003.

LANCELLOTTI, F. G.; GAGLIANI, L. H. Avaliação do perfil laboratorial, sócio

demográfico e evolução clínico terapêutico dos dez pacientes vivos mais antigos em

atendimento no centro de referência de AIDS Santos- SP- Brasil. Revista UNILUS Ensino

e Pesquisa, São Paulo, v. 2, p. 23-29. 2005.

LATAILLADE, M., KOZAL, M. J. The hunt for HIV-1 integrase inhibitors. AIDS Patient

Care STDS, v.20, n.7, p. 489–501. 2006.

LAURENT, C.; KOUANFACK, C.; KOULLA-SHIRO, S.; NKOUÉ, N.; BOURGEOIS,

A.; CALMY, A.; LACTUOCK, B.; NZEUSSEU, V.; MOUGNUTOU, R.; PEYTAVIN,

G.; LIÉGEOIS, F.; NERRIENET, E.; TARDY, M.; PEETERS, M.; ANDRIEUEX-

MEYER, I.; ZEKENG, L.; KAZATCHKINE, M.; MPOUDI-NGOLÉ, E.; DELAPORTE,

E. Lancet, v. 364, n. 29. 2004.

20

LIGNARI JÚNIORA, L.; GRECO, D. B.; CARNEIRO, M. Avaliação da aderência aos

anti-retrovirais em pacientes com infecção pelo HIV/Aids. Revista Saúde Pública, v.35, n.

6, p.495-501. 2001.

MARIER, J. F.; DIMARCO, M.; GUILBAUD, R.; DODARD, C.; MORELLI, G.;

TIPPABHOTLA, S. K.; SINGLA, A. K.; THUDI, N. R.; MONIF, T. Pharmacokinetics of

Lamivudine, Zidovudine, and Nevirapine Administered as a Fixed-Dose Combination

Formulation Versus Coadministration of the Individual Products. Journal of Clinical

Pharmacology, v. 47, p.1381-1389. 2007.

MAURIN, M. B.; ROWE, S. M.; BLOM, K.; PIERCE, M. E. Kinetics and Mechanism of

Hydrolysis of Efavirenz. Pharmaceutical Research, v. 19, n. 4, p. 517-521. 2002.

MEANWELL, N. A., KADOW, J. F. Inhibitors of the entry of HIV into host cells.

Current Opinion in Drug Discovery & Development, v.6, n.4, p.451–461. 2003.

MERCK & CO. INC. The Merck Index, 13nd ed., WhiteHouse Station: New Jersey,

2001.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa Nacional de DST e AIDS. Disponível em:

<http://www.aids.gov.br/data/Pages/LUMISF7202394PTBRIE.htm>. Acesso em: 27 dez.

2008.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Recomendações para terapia anti-retroviral em adultos e

adolescentes infectados pelo HIV 2007-2008. 2007p. , Brasília-DF, 2007.

POMMIER, Y., JOHNSON, A. A., MARCHAND, C. Integrase inhibitors to treat HIV/

AIDS. Nature Reviews Drug Discovery, v. 4, n. 3, p. 236–248. 2005.

SILVA, G. R.; LAGES, G. P.; PIANETTI, G. A.; NUNAN, E. A.; SOARES, C. D.

V.;CAMPOS, L. M. M. Determinação de Lamivudina, Estavudina e Nevirapina, em

http://www.aids.gov.br/data/Pages/LUMISF7202394PTBRIE.htm

21

Comprimidos, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Química Nova, v. 29, n. 6, p.

1159-1163. 2006.

SOUZA, J.; STORPIRTIS, S. Atividade anti-retroviral e propriedades farmacocinéticas da

associação entre lamivudina e zidovudina. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas,

São Paulo, v. 40, n. 1, p. 9-19. 2004.

SOUZA, M. V. N. S.; ALMEIDA, M. V. A. Drogas Anti-VIH: Passado, Presente e

Perspectivas Futuras. Química Nova, v. 26, n. 3, p. 366-372. 2003.

THOMPSON, S. C., NANNI, C., LEVINE, A. The stressors and stress of being HIV-

positive. Aids Care, n. 8, p. 5-14. 1996.

VERAS, N. M. C.; MORAES, D. S.; OLIVEIRA, C. P.; CERQUEIRA, D. M.; FINK, H. T.

K.; SILVA, R. R.; MARTINS, C. R. F. Resistência do vírus da imunodeficiência humana

tipo 1 aos inibidores de protease em amostragem do Laboratório Central de Saúde Pública

do Distrito Federal no ano de 2002. Comunicação em Ciências da Saúde, Brasília, v. 18,

n. 1, p. 25-31. 2007.

VIANA, O.S.; BENIGNO JÚNIOR, J.; SILVA, R.M.F.; MEDEIROS, F.P.M.;

GRANGEIRO JÚNIOR, S.; ALBUQUERQUE, M.M.; ROLIM NETO, P.J.

Desenvolvimento de formulações e tecnologia de obtenção de comprimidos revestidos de

efavirenz – terapia anti-HIV. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo,

v. 42, n. 4, p. 505-511. 2006.

22


para a Indústria Farmacêutica

Stability Models Assessing of Drugs and Drug Products for Pharmaceutical Industry

Silva, K.E.R.1, Alves, L.D.S.

1, Soares, M.F.R.

1, Passos, R.C.S.

2, Faria, A.R.

2, Rolim Neto,

P.J.1*.

1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, PE, Brasil.

2 Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos, Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, PE, Brasil.

*Autor correspondente: Pedro José Rolim Neto - Laboratório de Tecnologia Farmacêutica -

Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco, UFPE -

Av. Prof. Arthur de Sá s/n, Cidade Universitária – CEP 50740-521 - Recife – PE, Brasil -

Telefone: +55 - (81) 3272-1383 – email: [email protected]

Título Resumido: Estabilidade de Fármacos e Medicamentos

mailto:[email protected]

23

Resumo

O estudo de estabilidade de fármacos e medicamentos, descrito pela resolução RE nº1/05

ANVISA determina a quantificação dos produtos de degradação, assim como o método

analítico utilizado correspondente. Como consequência, gerou-se a publicação do Informe

Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos a serem realizados, nos

casos em que a impureza ou padrões dos produtos de degradação não estão disponíveis.

Diante das novas exigências, o delineamento do estudo torna-se uma das grandes

dificuldades de sua realização, desafiando profissionais da área de desenvolvimento de

produtos farmacêuticos.

Palavras-Chave: Estabilidade, Fármacos, Medicamentos, Produtos de degradação, Teste

de Estresse

Abstract

The study of stability of drugs and medicines, described by resolution RE 1 / 05 ANVISA

determines the quantification of degradation products, as well as the analytical method

concerned. As a consequence, the Technical Report 1 / 2008 was published, aiming to

clarify procedures to be performed in cases where impurity or patterns of degradation

products are not available. In the face of new requirements, the design of the study consists

in one of the difficulties of their implementation, bringing new challenges for professionals

on area of developing pharmaceutical products.

Keywords: Degradation products, Drugs, Medicines, Stability, Stress Test

24

Introdução

A estabilidade é definida como o tempo durante o qual a especialidade farmacêutica

ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém dentro dos limites

especificados e durante todo o período de estocagem e uso, as mesmas condições e

características que possuía quando da época de sua fabricação. Pode também ser definida

como o período de tempo compreendido entre o momento no qual o produto está sendo

fabricado àquela que sua potência está reduzida a não mais do que 10 %, desde que os

produtos de alteração estejam todos seguramente identificados e previamente reconhecidos

seus efeitos (Taborianski, 2003; Vehabovic et al., 2003; Stulzer & Silva, 2006).

A estabilidade dos produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais como

temperatura, umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto como

propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma

farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais

de embalagens (Brasil, 2005).

Com a finalidade de garantir a integridade química, física, microbiológica,

terapêutica e toxicológica do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites

especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo, são preconizados

estudos de estabilidade (Matthews, 1999; Lucas et al., 2004, Ansel et al. , 2007).

O estudo de estabilidade descrito pela RE nº1/2005 (ANVISA - Agência Nacional

de Vigilância Sanitária) possui como principal aplicabilidade a determinação do prazo de

validade do produto farmacêutico. Porém, também determina a quantificação dos produtos

de degradação e o método analítico correspondente, que resultou na publicação de um

25

Informe Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos nos casos em que a

impureza ou o padrão do produto de degradação não estão disponíveis. Estes

procedimentos envolvem a realização de testes de estresse sob condições variadas (Brasil,

2008).

A realização do teste de estresse, assim como o desenvolvimento do método

analítico para a identificação e quantificação dos produtos de degradação é de extrema

importância para as indústrias farmacêuticas, pois no momento do registro, pós-registro e

renovação, o estudo de estresse, acompanhado de sua análise crítica deverá ser

contemplada.

Diante do exposto, esse trabalho tem por objetivo trazer uma revisão atualizada

sobre estabilidade de medicamentos e fármacos, proporcionando atualização aos

profissionais da área, para as adequações que deverão ser estabelecidas a partir da

legislação vigente.

Estudo de Estabilidade e a Legislação Farmacêutica

A monitorização da estabilidade dos medicamentos é um dos métodos mais eficazes

para avaliação, previsão e prevenção de problemas relacionados à qualidade do produto

durante a validade. A segurança e a eficácia também podem ser avaliadas, através do

monitoramento da formação de produtos de degradação, que podem gerar perda de

atividade terapêutica ou toxicidade (Carvalho et al., 2005; Nóbrega et al., 2006).

Os estudos na fase de pré-formulação incluem a estabilidade no estado sólido do

fármaco isolado e a estabilidade na presença dos excipientes. Estas etapas são realizadas

26

para reduzir ou prevenir a ocorrência de deterioração devido à hidrólise, oxidação, entre

outros processos. Por sua vez, o estudo da estabilidade da formulação tem por finalidade

avaliar o comportamento dos medicamentos em função do tempo e a influência de uma

variedade de condições e fatores, sendo levado em consideração tanto o fármaco, quanto a

mistura de excipientes ou veículos utilizados, assim como a interação entre ambos, face às

condições as quais estão submetidos (Brasil, 2005; Mamede et al., 2006).

Para a realização desse estudo, as zonas climáticas constituem um dos importantes

fatores a serem considerados. Devido à grande variabilidade climática, o mundo foi

subdividido em zonas com diferentes especificações de temperatura e umidade, para

possibilitar a comercialização dos produtos em outras zonas climáticas (Carvalho et al.,

2005; Bott & Oliveira, 2007).

Para o procedimento dos ensaios de estabilidade realizados no Brasil, de zona

climática IV, as indústrias farmacêuticas seguem a RE nº 1/2005 da ANVISA que define

três estudos:

Estudo de Estabilidade Acelerada: estudo projetado para acelerar a degradação

química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em condições forçadas

de armazenamento. Os dados obtidos, juntamente com aqueles derivados dos

estudos de longa duração, são usados para avaliar efeitos químicos e físicos

prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o impacto de curtas

exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto, que

podem ocorrer durante o transporte.

Estudo de Estabilidade de Longa Duração: estudo projetado para verificação das

características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto

27

farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. Os

resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e

recomendar as condições de armazenamento.

Estudo de Estabilidade de Acompanhamento: estudo realizado para verificar que o

produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas, biológicas, e

microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de

longa duração.

Esses estudos são realizados em câmaras climáticas qualificadas de acordo com

normas internacionais, que proporcionam o controle de temperatura e umidade em seu

interior, projetados para serem utilizados continuamente, sem preocupação com falhas nos

instrumentos de controle (Nunes et al., 2007).

Para a avaliação dos estudos, as amostras são retiradas nos tempos determinados

pelo guia. São determinadas as seguintes análises: doseamento, quantificação de produtos

de degradação, dissolução e pH (quando aplicáveis) (Brasil, 2005).

O uso de métodos indicadores de estabilidade, seletivos aos princípios ativos e seus

produtos de degradação, tem sido altamente recomendados pela ANVISA para

acompanhamento de resultados provenientes de estudos de estabilidade de medicamentos

(Brasil, 2003; Brasil, 2005). No entanto, poucas monografias existentes em farmacopeias

incluem metodologias para análise de produtos de degradação, e poucos fabricantes

conhecem e desenvolvem metodologias validadas para detecção e quantificação desses

produtos. Para o desenvolvimento e validação de metodologias indicativas de estabilidade,

28

preconiza-se a realização de testes de estresse, para obtenção de padrões, para fim de

análise (Bakshi & Singh, 2002; Boudreau et al., 2004; Carvalho et al., 2005).

Teste de Estresse

O teste de estresse é definido como um teste de estabilidade para fármacos e

medicamentos sob condições extremas. Esse teste mostra-se como uma tendência dentro do

planejamento para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica, pois a investigação da

estabilidade intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de

adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente

melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando-se assim, que o

conhecimento do comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da

forma farmacêutica desejada (Reynolds et al., 2002; Aulton, 2005).

Um dos principais objetivos a serem atingidos através desse teste é demonstrar a

especificidade ao desenvolver um método indicativo de estabilidade, sobretudo quando

poucas informações estão disponíveis sobre os possíveis produtos de degradação. Estes

também fornecem informações sobre as rotas de degradação e dos produtos formados, que

poderiam ser produzidos durante o período de armazenamento (Reynolds et al., 2002).

A natureza do teste de estresse utilizado para o fármaco depende de suas

características intrínsecas e da forma farmacêutica a ser desenvolvida. Para o medicamento,

o planejamento do estudo deve ser baseado nas propriedades do fármaco e dos excipientes

utilizados na formulação, assim como nas condições de armazenamento. Neste caso, são

utilizadas condições mais severas do que as condições do estudo de estabilidade acelerado,

29

como estratégia para a fase de desenvolvimento da forma farmacêutica (Klick et al., 2005).

No entanto, tais exames podem não ser necessários, se for demonstrado que os produtos de

degradação não são formados sob condições de estudo de estabilidade acelerado ou de

longa duração (ICH, 2003).

Embora o conceito do estudo de degradação forçada não seja novo para a indústria

farmacêutica, o procedimento para sua realização não foi claramente definido pelo guia de

estabilidade do International Conference on Harmonisation (ICH), assim como por outros

órgãos regulatórios. Devido à falta dessas informações detalhadas, a realização do teste

sofre variações extremas nos procedimentos utilizados pelas companhias farmacêuticas

para a obtenção dos resultados, sendo observada a condução dos estudos sem respaldo

científico, levando a resultados muitas vezes duvidosos, principalmente quando são

aplicadas condições estremas em um curto intervalo de tempo (ICH, 2003; Alsante et al.,

2003; Klick et al., 2005).

No Brasil, a ANVISA, através do Informe Técnico nº 1, esclarece procedimentos a

serem seguidos, uma vez que a identificação e quantificação dos produtos de degradação já

eram exigidas no item 2.2.6 da RE nº 560/2002 e no item 2.8 da RE nº 398/2004 –

regulamentações específicas sobre estudos de estabilidade, vigentes à época, além dos

estudos de fotoestabilidade exigidos no item 2.6 da Resolução RE nº 398/2004, assim como

as recomendações para a sua realização no Anexo II da mesma. Já no item 2.9 do anexo da

RE n° 1, de 29/07/2005 - Guia para Realização dos Estudos de Estabilidade, já era

preconizada a realização do ensaio de identificação e quantificação de produtos de

degradação e método analítico correspondente no estudo de estabilidade, para todos os

produtos a serem registrados.

30

O item 2.1.2 da RE N°899 de 29/05/2003 – Guia de Validação de Métodos

Analíticos preconiza que “quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não

estiverem disponíveis, pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo

impurezas ou produtos de degradação com os resultados de um segundo procedimento bem

caracterizado” (por exemplo, metodologia farmacopéica ou outro procedimento validado)

(Brasil, 2003).

Este procedimento inclui a realização de testes sob condições de estresse

especificadas pela ANVISA (Tabela 1), que resultaram na apresentação da análise dos

produtos de degradação nos estudos de estabilidade acelerada e de longa duração com a

forma farmacêutica final.

Tabela 1 - Condições de estresse para a realização do estudo de degradação forçada

Aquecimento 60°C

Umidade 75% UR ou >

Solução Ácida 0,1 M HCl

Solução Básica 0,1 M NaOH

Solução Oxidativa 3% H2O2

Fotolítica UV-B fluorescente

Íons metálicos (opcional) 0,05M Fe 2+

ou Cu 2+

O objetivo dos testes realizados através deste procedimento, não é de degradar

totalmente o composto, mas promover uma degradação de pequena extensão (10-30%),

31

evitando-se a formação de compostos de degradação secundários. Sendo observada a

ausência total de degradação do composto após 10 dias, o fármaco deve ser considerado

estável. Se a degradação for inferior a 10%, devem-se aumentar as condições de estresse.

Contudo, a legislação vigente permite a utilização de publicações de literatura científica,

que possam vir a corroborar com os dados experimentais enviados, mas não com a

finalidade de substituir os dados referentes aos ensaios exigidos (Reynolds et al., 2002;

Brasil, 2008).

Um importante fator referente à identificação dos produtos de degradação está

relacionada à segurança dos medicamentos, pois pode ocorrer a formação de produtos

tóxicos e/ou a perda parcial ou total da atividade terapêutica do fármaco, sendo necessários

o isolamento e a caracterização das suas propriedades física e química, assegurando a

segurança biológica a partir da determinação dos níveis de segurança aceitáveis e de seus

limites de quantificação, com relação à posologia diária (Moriwaki et al., 2001).

Delineamento dos Testes de Estresse com Fármacos

O estudo de degradação forçada inclui os efeitos causados pela variação da

temperatura, umidade quando apropriado, oxidação, fotólise e suscetibilidade à hidrólise

por extensa variação dos valores de pH, que são condições típicas de degradação de

fármacos. Vários estudos vêm sendo realizados para a obtenção de produtos de degradação

de muitos fármacos utilizados na terapêutica, utilizando diferentes métodos de obtenção e

identificação (Kapoor et al., 2006; Kumar et al., 2008; Bedse et al., 2009).

32

Contudo, não existe um padrão na realização desses estudos. Na ausência de

procedimentos, dificuldades são enfrentadas pelos profissionais, ao decidir sobre as

condições de estresse a serem utilizadas para um novo fármaco. Alguns estudos, como o

realizado por Singh & Bakshi (2000), propõem um sistema de classificação para a

classificação de fármacos, tomando como base o comportamento da estabilidade de

fármaco diante de variações nas condições submetidas (Aulton, 2005).

Hidrólise

A água é considerada como um dos principais catalisadores em reações de

degradação. Muitos fármacos são considerados como instáveis nesse meio e necessitam de

intervenções durante a formulação e armazenamento, para que a eficácia e a estabilidade

dos fármacos e da forma farmacêutica final não sejam comprometidas. Para a avaliação da

instabilidade sob a condição de hidrólise, também deve ser levado em consideração o pH

do meio, pois íons hidrogênio e hidroxila podem acelerar ou retardar o processo de

degradação (Ansel et al., 2007).

Para realizar o estudo de estresse em condição de hidrólise ácida, utiliza-se

principalmente ácido clorídrico e para a hidrólise básica utiliza-se hidróxido de sódio,

sendo que, muitas variações são observadas no tempo e na temperatura de exposição de

fármacos para essa condição (Figura 1). Existem poucos relatos na literatura sobre a

hidrólise realizada em pH neutro, onde geralmente se utiliza água como agente de hidrólise.

Nessa condição, a taxa de decomposição é lenta, o que é compreensível, porque reações em

pH neutro são não-catalíticas e por isso podem ser necessários períodos muito longos sob

33

condições de temperatura extremas, para conseguir quantidades suficientes de produtos de

degradação (Singh & Bakshi, 2000).

As condições de estresse iniciais são realizadas, assumindo que o fármaco seja

instável, portanto, sujeito a receber condições mais amenas. Dependendo dos resultados

obtidos, aumenta-se ou diminui-se a concentração das condições de reação utilizada (Singh

& Bakshi, 2000).

Figura 1: Fluxograma do estudo de estresse: Hidrólise sob condições ácidas e

básicas (Fonte: Adaptado de: SINGH &BAKSHI, 2000).

34

Oxidação

A degradação oxidativa é uma das principais causas de instabilidade de fármacos,

dentre os mais conhecidos e estudados têm-se os esteróides, antibióticos, vitaminas, óleos e

gorduras. A oxidação envolve a remoção de um átomo eletropositivo, radical ou elétron, ou

a adição de um átomo eletronegativo ou radical. Muitas oxidações são reações em cadeia,

que procedem lentamente sob a influência do oxigênio molecular. Tal processo de reação é

referido como uma auto-oxidação (Florence & Attwood, 2003).

O peróxido de hidrogênio é utilizado para criar as condições de estresse empregadas

para o estudo de oxidação. Esse parece ser muito mais popular para o propósito que

qualquer outro agente oxidante. A concentração de peróxido utilizada varia entre 1% a 30%

(Figura 2).

A estabilização de fármacos frente a condições oxidativas envolve a observação de

um número de precauções durante a manufatura e estocagem. O oxigênio em recipientes

farmacêuticos deve ser substituído por nitrogênio ou dióxido de carbono; assim como o

contato com íons de metais pesados, que catalisam a oxidação, devem ser evitados e a

estocagem deve ser a temperaturas reduzidas (Florence & Attwood, 2003).

35

Figura 2: Fluxograma do estudo de estresse: Oxidação (Fonte: Adaptado de: Singh &

Bakshi, 2000)

Fotólise

A reação de fotólise é iniciada após absorção de radiação eletromagnética. A

maioria dos princípios ativos empregados na preparação de medicamentos apresenta

máximos de absorção na região do ultravioleta do espectro eletromagnético. A radiação

ultravioleta é muito energética e pode propiciar a clivagem de muitas ligações químicas,

ocorrendo a degradação da molécula. Desta forma, é importante conhecer a fotoestabilidade

36

das drogas utilizadas como medicamentos e os produtos formados devido à fotólise, além

de avaliar a toxicidade destes últimos (Moriwaki et al., 2001).

O estudo de fotoestabilidade é atualmente uma importante ferramenta para a

indicação de estabilidade de fármacos e formas farmacêuticas dentro da indústria.

Existe muita variação da maneira na qual o estresse de fotoestabilidade é realizado.

Os fármacos podem sofrer exposição a comprimentos de onda curtas ou longas dentro da

faixa de UV, ou luz fluorescente de iluminação que varia na faixa de (400-1580 foot

candles), sob temperatura ambiente (Figura 3). O período de exposição varia de algumas

horas a vários meses, dependendo da intensidade da fonte luminosa. Para saber se um

fármaco é sensível à fotólise ou não, depende da variação do comportamento de

decomposição observado. Os estudos de fotoestabilidade são feitos em fármacos na forma

sólida ou em solução (Singh & Bakshi, 2000).

Produtos farmacêuticos podem ser adequadamente protegidos da decomposição

induzida pela luz com o uso de recipientes de vidro colorido e estocagem no escuro. Vidros

de cor âmbar filtram luzes de comprimento de onda menores do que 470nm e oferecem

considerável proteção aos compostos sensíveis à luz ultravioleta. O revestimento de

comprimidos com um filme polimérico contendo absorventes de radiação ultravioleta tem

sido sugerido como um método adicional para proteção contra a luz (ICH, 1996; Florence

& Attwood, 2003).

37

Figura 3: Fluxograma do estudo de estresse: Fotólise (Fonte: Adaptado de: Singh & Bakshi,

2000)

Estabilidade Térmica

As técnicas termoanalíticas adquiriram importância crescente em todas as áreas de

conhecimento na química básica e aplicada. A utilização dessa metodologia foi favorecida

pela disponibilidade de instrumentos controlados por microprocessadores, capazes de

fornecer informações quanto ao comportamento térmico dos materiais de forma precisa e

num tempo relativamente curto (Wesolowski & Erecinska, 1998; Grangeioro Junior et al,

2006; Viana et al, 2008).

A análise térmica possibilita uma ampla faixa de aplicação para medidas de

propriedades físicas, como: estudo de reações químicas, avaliação da estabilidade térmica,

38

determinação da composição de materiais e desenvolvimento de metodologia analítica

(Faria et al., 2002).

Essas análises têm sido utilizadas na área farmacêutica como ferramenta útil para

avaliar rapidamente uma possível interação entre os componentes ativos e os excipientes

em estudos de compatibilidade na pré-formulação, além de avaliar a existência de

polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas, determinação de pureza

química, estudos de reações no estado sólido, análise de formas farmacêuticas sólidas e

controle de qualidade (Tomassetti et al., 2005; Alencar et al, 2006; Mamede et al, 2006;

Silva et al, 2009).

A caracterização físico-química do princípio ativo do medicamento é importante,

pois dessa forma, se estabelece a carta de identidade do produto, possibilitando sua

padronização e avaliação de pureza, tornando-o adequado para a realização do estudo de

pré-formulação (Alves et al., 2008).

Um dos principais fatores que devem ser avaliados no desenvolvimento de

formulações é o estudo da estabilidade. Estes estudos são realizados rotineiramente pela

indústria farmacêutica, porém, requerem longos períodos de armazenamento das amostras,

sob condições controladas de temperatura e umidade (Rodante et al., 2002). Embora não

substituam os estudos convencionais, as técnicas termoanalíticas mostram-se extremamente

úteis em estudos de estabilidade, possibilitando a escolha das formulações mais estáveis

com extrema rapidez, fator desejável especialmente para a indústria farmacêutica (Bazzo &

Silva, 2005).

39

Considerações Finais

A Comunidade Europeia e também os Estados Unidos contemplam formalmente a

pesquisa dos produtos de degradação desde a década de 80. Avaliando a evolução do tema

no Brasil, pode-se observar um traçado paralelo entre as três resoluções referentes à

estabilidade da ANVISA. Diante das novas exigências com relação ao desenvolvimento e

validação do método indicativo de estabilidade, as indústrias farmacêuticas e Centros de

Pesquisa & Desenvolvimento necessitam realizar testes de estresse, com o objetivo de

isolar, identificar e caracterizar os produtos de degradação obtidos através de condições

adversas variáveis. Contudo, devido à peculiaridade de cada fármaco e medicamento, o

delineamento do estudo torna-se uma das grandes dificuldades de sua realização, ao mesmo

tempo em que se coloca como desafio necessário aos profissionais da área de

desenvolvimento de produtos farmacêuticos.

Nosso grupo vem, há alguns anos, desenvolvendo parcerias com laboratórios

farmacêuticos para aplicação de metodologias para estudo de estabilidade e ativos de

origem natural e sintética, produtos isolados, misturas de fármacos, bem como, produto

acabado em diferentes formas farmacêuticas em doenças negligenciadas e de alto custo, em

monoterapia e em dose-fixa-combinada.

Referencias Bibliográficas

Alencar JRB, Bedor DCG, Medeiros FPM, Alencar JRB, Leite ACL, Brondani DJ,

Galembeck A, Macêdo R, Albuquerque MM, Rolim Neto PJ. Caracterização e

40

Propriedadess Térmicas do Ritonavir para Qualidade de Fornecedores. Acta Farm

Bonaerense. 2006; 25(2): 170-76.

Alves GMC, Rolim L.A, Rolim Neto, PJ, Leite AC, Brondani DJ, Medeiros FPM, Bieber

LW, Mendonça Júnior FJB. Purificação e caracterização da β-Lapachona e estudo de

estabilidade dos cristais em diferentes condições de armazenamento. Quim Nova. 2008;

31(2): 413-16.

Alsante K, Martin L, Baertschi SW. A Stress Testing Benchmarking Study. Pharmaceut

Technol. 2003; 27(2): 60–72.

Ansel, HC.; Popovich, NG., Allen-Jr, LV. Farmacotécnica: formas farmacêuticas &

sistemas de liberação de fármacos, 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2007, p 775.

Aulton ME. Pré-formulação farmacêutica. Delineamento de formas farmacêuticas, 2 ed.

Porto Alegre: Artmed, 2005, p. 677.

Bakshi M, Singh S. Development of Validated Stability-Indicating Assay Methods: Critical

Review. J Pharm Biomed Anal. 2002; 28: 1011– 40.

Bazzo GC, Silva MAS. Estudo termoanalítico de comprimidos revestidos contendo

captopril através de termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC).

Rev Bras Cienc Farm. 2005; 41 (3): 315-22.

41

Bedse G, Kumar V, Singh S. Study of forced decomposition behavior of lamivudine using

LC, LC–MS/TOF and MS. J Pharmaceut Biomed Anal. 2009; 49: 55-63.

Bott RF, Oliveira WP. Storage Conditions for Stability Testing of Pharmaceuticals in Hot

and Humid Regions. Drug Dev Ind Pharm. 2007; 33(4): 393-401

Boudreau SP, McElvain JS, Martin LD, Dowling T, Fields SM. Method Validation by

Phase of Development An Acceptable Analytical Practice. Pharmaceut Technol. 2004;

28(11): 54-66.

Brasil. Resolução nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos

analíticos e bioanalíticos. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Poder executivo,

Brasília, DF, D.O.U. 02 jun. 2003.

Brasil. Resolução nº 01, de 29 de julho de 2005. Guia para a Realização de Estudos de

Estabilidade. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Poder Executivo, Brasília, DF,

D.O.U. 01 ago. 2005.

Brasil, Informe Técnico nº 01, de 15 de julho de 2008 - Esclarecimento sobre o item 2.9 do

anexo da Resolução RE nº1 de 29/07/2005, que trata do Guia para Realização dos Estudos

de Estabilidade. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Poder Executivo, Brasília, DF,

D.O.U. 15 jul. 2008.

42

Carvalho JP, Santos AS, Sá AS, Teixeira CS, Nogueira MS. Estabilidade de medicamentos

no âmbito farmacológico. Rev Farm & Med. 2005; 34(6): 22-7.

Faria EA, Leles MIG, Ionashiro M, Zuppa TO. Estudo da Estabilidade Térmica de Óleos e

Gorduras Vegetais. Eclet Quim (Araraquara). 2002; 27: 111-19.

Florence AT, Attwood D. Princípios físico-químicos em farmácia, 3.ed. São Paulo: Edusp,

2003. p. 711.

Grangeiro Júnior S, Strattmann RR, Albuquerque MM, Araújo AAS, Matos JR, Rolim

Neto, PJ. In vitroEvaluation of Dissolution Profiles and Thermal Prperties of Some

Commercial Formulations of Nevirapine Tablets. Acta Farm Bonaerense. 2006; 25(1): 76-

82.

International Conference on Harmonisation. Guideline Stability Testing: Photostability

Testing of New Drug Substances and products. nov. 1996.

International Conference on Harmonisation. Guidance for Industry Q1A(R2) Stability

Testing of New Drug Substances and Products. nov, 2003.

Kapoor N, Khandavilli S, Panchagnula R. Simultaneous determination of lamivudine and

stavudine in antiretroviral fixed dose combinations by first derivative spectrophotometry

43

and high performance liquid chromatography. J Pharmaceut Biomed Anal. 2006; 41:761–

765.

Klick S, Muijselaar PG, Waterval J, Eichinger T, Korn C, Gerding TK, Debets AJ, De

Griend CS, Somsen GW, De Jong GJ. Towards a generic approach for stress testing of drug

substances and drug products. Pharmaceut Technol. 2005; 29(2): 48-66.

Kumara V, Malik S, Singh S. Polypill for the treatment of cardiovascular diseases Part 2.

LC–MS/TOF characterization of interaction/degradation products of atenolol/lisinopril and

aspirin, and mechanisms of formation thereof. J Pharmaceut Biomed Anal. 2008; 48: 619-

28.

Lucas TI, Bishara RH, Seevers RH. A Stability Program for the Distribution of Drug

Products. Pharmaceut Technol. 2004; 68-73.

Matthews, B.R. Regulatory aspects of stability testing in Europe. Drug Dev Ind Pharm.

1999; 25(7):831-856.

Mamede LC, Caetano BL, Rocha LA, Ferreira EM, Cestari A, Kfuri CR, Ciuffi KJ, Calefi

PS, Mello C, Cunha WR, Nassar EJ. Comportamento térmico de alguns fármacos e

medicamentos. Rev Ciênc Farm Básica Apl 2006; 27(2):151-55.

44

Moriwaki C, Brescansin EG, Hioka N, Maionchi F, Matioli G. Estudo da degradação do

fármaco Nabumetona por fotólise direta. Acta Scientiar. 2001; 23(3): 651-54.

Nóbrega IMF, Grangeiro Júnior S, Silva RMF, Rolim Neto PJ, Albuquerque MM. Estudo

de estabilidade de comprimidos de captopril 25 mg acondicionados em blister frente a

diferentes tipos de filmes moldáveis. Rev Bras Farm. 2006; 87(4): 128-31.

Nunes LCC, Soares Sobrinho JL, Lima AAN, Silva JL, Rolim Neto PJ. Câmara Climática:

estudo de caso. Rev Bras Farm. 2007; 88(3): 137-40.

Reynolds DW, Facchine KL, Mullaney FJ, Alsante KM, Hatajik TD, Michel MG.

Available Guidance and Best Practices for Conducting forced Degradation Studies.

Pharmaceut Technol. 2002; 26(2): 48-56.

Rodante F, Vecchio S, Catalani G, Tomassetti M. Compatibility between active

components of a commercial drug. Farmaco. 2002; 57: 833-43.

Silva RMF, Medeiros FPM, Nascimento TG, Macêdo RO, Rolim Neto PJ. Thermal

characterization of inidavir sulfate using TG, DSC and DSC-Photovisual. J Therm Anal

Cal. 2009; 95(3): 965-68.

Singh S, Bakshi M. Guidance on Conduct of Stress Tests to Determine Inherent Stability of

Drugs. Pharmaceut Technol. 2000; 24: 1-14.

45

Stulzer HK, Silva MA. Estudo de Estabilidade de Grânulos Revestidos e Comprimidos

contendo Captopril. Acta Farm Bonaerense. 2006; 25(4): 497-504.

Taborianski AM. Validação de métodos para análise e estudos de estabilidade de anti-

retrovirais em preparações farmacêuticas [Dissertação] São Paulo: Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, Universidade de São Paulo; 2003.

Tomassetti M, Catalani A, Rossi V, Vecchio S. Thermal analysis study of the interactions

between acetaminophen and excipients in solid dosage forms and in some binary mixtures.

J Pharm Biomed Anal. 2005; 37(5): 949-55.

Vehabovic M, Hadzovic S, Stambolic F, Hadzic A, Vranjes E, Haracic E. Stability of

ranitidine in injectable solutions. Int J Pharm. 2003; 256: 109–15

Viana OS, Araújo AAS, Simões RA, Soares JL, Matos CRS, Grangeiro Júnior S, Rolim

Neto PJ. Kinetic Analysis of the Thermal Decomposition of Efavirenz and Compatibility

Studies with Selected Excipients. Latin Americ J Pharm. 2008; 27(2): 211-16.

Wesolowski M, Erecinska J. Thermal analysis in quality assessment of rapeseed oils.

Thermochimi Acta. 1998; 323: 137-43.

46

Capítulo II

4 ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS FÁRMACOS


Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas

Artigo a ser elaborado após complementação dos resultados

47


Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas

Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Mônica Felts de La Roca Soares

1, Lariza Darlene

Santos Alves1, Rafaela C. S. Passos

2, Antônio Rodolfo de Faria


1

1-Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Farmácia – UFPE

2-Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos – UFPE

Resumo

Estabilidade pode também ser definida como o período de tempo compreendido

entre o momento no qual o produto está sendo fabricado àquele que sua potência está

reduzida de não mais do que 10 %, desde que os produtos de alteração estejam todos

seguramente identificados e previamente reconhecidos seus efeitos. Fatores ambientais

como temperatura, umidade e luz, e de outros relacionados ao próprio produto como

propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma

farmacêutica e sua composição, processo de fabricação entre outros, interferem com a

estabilidade da forma farmacêutica. Estudos de estabilidade são realizados com a finalidade

de garantir a integridade do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites

especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo.

Palavras-Chave: Estabilidade, hidrólise ácida, hidrólise básica, Zidovudina, Lamivudina,

Efavirenz

______________________

*Endereço para Correspondência: Laboratório de Tecnologia de Medicamentos – LTM.

Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof.

Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, Recife – PE. 50.740-521. Tel/Fax (81)3272-1373.

Email: [email protected]

48

1 Introdução

A realização de estudos de estresse de um dado fármaco pode auxiliar na

identificação de possíveis produtos de degradação, que podem por sua vez ajudar a

estabelecer as rotas degradativas, a estabilidade intrínseca da molécula do fármaco e no

desenvolvimento e validação dos procedimentos analíticos apropriados. A natureza do teste

de estresse dependerá das características individuais do fármaco e do tipo da forma

farmacêutica desenvolvida (SINGH, BAKSHI, 2000; ICH, 2006, 2003).

O objetivo principal de um estudo de estabilidade é a promoção de evidências

científicas de como a integridade do fármaco ou do produto farmacêutico varia em um certo

período de tempo sob diferentes fatores ambientais, como temperatura, umidade e luz, a fim

de se estabelecer um prazo de validade para o fármaco ou produto farmacêutico sob

recomendadas condições de armazenagem (ICH, 2003).

A Zidovudina (AZT), 3-ácido-3-dioxitimidina, foi a primeira droga utilizada na

terapêutica em 1987. Inicialmente foi utilizada na monoterapia, no entanto, atualmente

compõe o coquetel de tratamento da AIDS, como um das drogas inibidoras da trancripitase

reversa análogas de nucleosídeo (IRTN) de primeira escolha e o principal efeito adverso

associado ao AZT é a miolossupressão, particularmente anemia e neutropenia. (TURK,

2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

A Lamivudina (3TC), também um IRTN, é o único fármaco aprovado pelo FDA

que tem atividade contra o HIV e a hepatite B. A dose da lamivudina utilizada na

terapêutica é de 150 mg duas vezes ao dia, apresentando-se na forma farmacêutica

comprimido. Seu tempo de meia vida plasmática é de 3-6h (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2006).

O efavirenz é um inibidor da transcriptase reversa não análogo de nucleosídeo

utilizado como fármaco de primeira escolha da sua classe no tratamento da AIDS. O

governo brasileiro distribui comprimidos de efavirenz 600 mg (Stocrin ), gratuitamente,

através do Programa DST-AIDS (RIBEIRO et al, 2007).

49

2 Materiais e Métodos

2.1 Materiais

As matérias primas utilizadas neste estudo foram: zidovudina, (Northeast®, lote:

15180); lamivudina (Aurobindo®, lote: CLMC055034); efavirenz (Xiamem Mchem®,

lote: 050501); hidróxido de sódio (Vetec); ácido clorídrico (Vetec); acetato de etila

(Cinética); hexano (Cinética); ácido fosfomolíbdico (Aldrich); diclorometano (Cinética),

Sulfato de Sódio Anidro (Cinética), Sílica gel 200-400 mesh com indicador 254 nm,

clorofórmio deuterado.

2.2 Estudo de Degradação

Efavirenz

Hidrolise básica: solubilizou-se o efavirenz em 5 mL de metanol, em seguida adicionou-se

20 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M. Manteve-se a reação sob agitação constante a

uma temperatura controlada de 60°C por 24 horas. Após o termino da reação e resfriamento

da mesma, removeu-se o metanol, sob vácuo, em rotaevaporador. Em seguida, realizou-se

uma extração em funil de decantação, utilizando o solvente diclorometano (3 x 30 mL).

Reuniu-se as fases orgânicas e após secagem sob Na2SO4 anidro, removeu-se o solvente em

rotaevaporador.

Hidrolise ácida: solubilizou-se o efavirenz em 5 mL de metanol, em seguida adicionou-se

20 mL de ácido clorídrico (HCl) 0,1M.. Manteve-se a reação sob agitação constante a uma

temperatura controlada de 60°C por 24 horas. Após o termino da reação e resfriamento da

mesma, removeu-se o metanol, sob vácuo, em rotaevaporador. Em seguida, realizou-se uma

extração em funil de decantação, utilizando o solvente diclorometano (3 x 30 mL). Reuniu-

se as fases orgânicas e após secagem sob Na2SO4 anidro, removeu-se o solvente em

rotaevaporador.

50

Zidovudina

Hidrolise básica: solubilizou-se a zidovudina em 25 mL de NaOH 2,0 M. Manteve-se a

reação sob agitação constante a uma temperatura controlada de 80°C por 24 horas. Após o

termino da reação e resfriamento da mesma realizou-se uma neutralização utilizando-se

HCl 5 M. Ocorreu a precipitação dos produtos de degradação floculados, submeteu-se

então a solução a centrifugação de 2000 rpm por 4 minutos. Separou-se o sobrenadante

isolando-se o precipitado que apresentou-se gelatinoso.

Hidrolise ácida: solubilizou-se a zidovudina em 25 mL de HCl 1,0 M. Manteve-se a reação

sob agitação constante a uma temperatura controlada de 80°C por 24 horas. Após o termino

da reação e resfriamento da mesma realizou-se uma neutralização utilizando-se NaOH 5 M.

Ocorreu a precipitação dos produtos de degradação floculados, submeteu-se então a solução

a centrifugação de 2000 rpm por 4 minutos. Separou-se o sobrenadante isolando-se o

precipitado.

Lamivudina

Hidrolise básica: solubilizou-se a lamivudina em 25 mL de NaOH 1,0 M. Manteve-se a

reação sob refluxo sob agitação constante por 12 horas. Após o termino da reação, esperou-

se a solução esfriar e realizou-se uma extração em funil de decantação utilizando o solvente

acetato de etila (4 x 15 mL). As fases orgânicas foram reunidas, secas sob Na2SO4, anidro e

em seguida, removeu-se o solvente em rotaevaporador.

Hidrolise ácida: solubilizou-se a lamivudina em 25 mL de HCl 1,0 M. Manteve-se a reação

sob refluxo com agitação constante por 12 horas. Após o termino da reação, esperou-se a

solução esfriar e realizou-se uma extração em funil de decantação utilizando o solvente

acetato de etila (4 x 15 mL). As fases orgânicas foram reunidas, secas sob Na2SO4, anidro e

em seguida, removeu-se o solvente em rotaevaporador.

51

2.3 Obtenção de Produtos de Degradação

A deteção dos produtos formados nas reações de degradação foi realizada através de

cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando-se como reveladores UV (254 nm),

Ácido fosfomolídico e Ácido sulfúrico 10% em metanol.

A purificação e isolamento dos produtos de degradação foram realizados através de

cromatografia “flash”, em coluna.

Através de CCD pode-se ajustar a fase móvel eluente para o isolamento dos

produtos por cromatografia em coluna “flash”.

Efavirenz

A fase móvel eluente utilizada foi hexano: isopropanol (97:3)

Zidovudina

A fase móvel eluente utilizada foi hexano: acetato de etila: isopropanol (45:45:10)

Lamivudina

A fase móvel eluente utilizada foi acetato de etila

3 Resultados e Discussão

A cromatografia de camada delgada é, atualmente, vista como uma técnica

qualitativa confiável e sensível para a separação de misturas complexas em amostras de

estabilidade (AULTON, 2005). Utilizou-se este como método inicial na condução do

estudo, por apresentar-se como simples e econômica para a identificação qualitativa dos

produtos de degradação obtidos e da sensibilidade dos fármacos às condições de estresse

submetidas. Esses resultados preliminares auxiliarão na análise dos produtos através da

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), que definirá quantitativamente a

proporção do produto obtido e a separação destes para utilização como padrões nos estudos

de estabilidade com a forma farmacêutica pretendida.

52

Efavirenz

Após exposição do fármaco a uma temperatura de 60°C por 24 horas em NaOH

0,1M e em HCl 0,1M e posteriormente resfriada a -2ºC, verificou-se posteriormente através

de CCD a formação de dois produtos de degradação, visualizados através de UV (254nm)

(Figura 1), que possivelmente tratam-se de um amino álcool e a quinolina, produtos

anteriormente descrito na literatura (Figura 2) (Ribeiro et al., 2007). Os espectros de RMN

de 1H (Figuras 5 e 6) confirmam as estruturas do amino álcool (II) e da quinolina (III)

respectivamente.

Figura 1: Placa cromatográfica com padrão da Efavirenz e produtos de degradação. 1 -

Padrão de Efavirenz; 2 – Produtos formados pós Reação de Hidrolise Básica; 3 - Produtos

formados pós Reação de Hidrolise Básica, reação repetida em maior escala para

confirmação de confirmação dos produtos de degradação

Figura 2: Estruturas químicas do efavirenz e possíveis produtos da hidrólise básica (I –

EFAVIRENZ; II – AMINO ÁLCOOL ; III – QUINOLINA).

1 2 3

53

A formação do amino álcool (sólido amarelo pálido) e da quinolina (cristal branco

com odor característico), segundo Ribeiro et al., 2007, segue o seguinte esquema de

formação (Figura 3):

Figura 3: Esquema da formação do amino álcool e quinolina

A separação dos produtos de degradação por cromatografia em coluna “Flash” foi

um ponto crítico, devido aos Rf dos produtos serem muito próximos, sendo necessário o

ajuste fino dos eluentes utilizados para essa finalidade.

As características físicas dos cristais puderam ser visualizadas após separação dos

produtos e remoção do eluente, através do rotaevaporador (Figura 4).

Figura 4: Características físicas observadas dos produtos após hidrólise básica e separação

54

Figura 5: RMN1H do produto de degradação amino álcool

Figura 6: RMN1H do produto de degradação quinolina

55

Zidovudina

Foram seguidos os parâmetros descritos na literatura, a fim de tentar reproduzir as

metodologias existentes. No entanto, esses não apresentaram reprodutibilidade satisfatória

para identificação dos produtos pela técnica pretendida, uma vez que a Zidovudina (Figura

7) apresenta-se consideravelmente estável em meio básico, sendo necessárias condições

mais drásticas de estresse para que o percentual de degradação seja satisfatório para

visualização por CCD e isolamento por cromatografia em coluna “Flash”. Devido a essa

característica, realizou-se vários experimentos modificando-se a concentração da solução

de NaOH (ou HCl), a temperatura e o tempo de exposição ao estresse. As condições

otimizadas, no qual observou-se degradação satisfatória nas reações de hidrólise foram:

NaOH (ou HCl) 2,0M, temperatura de 80°C, durante um período de 24h.

Após a degradação, neutralizou-se o meio reacional, com o objetivo de retirar a

interferência do NaOH (ou HCl) na eluição do produto.

Figura 7: Estrutura química da Zidovudina

Segundo Dunge et al. (2004), o principal produto de degradação da Zidovudina é a

Timina (Figura 8), sendo sua cinética de degradação de primeira ordem.

56

Figura 8: Estrutura química da Timina

Através do estudo realizado, pode-se observar a formação de apenas um produto

após a hidrólise básica e hidrólise ácida. Este foi visualizado através de radiação UV (254

nm), fornecendo fortes indícios que se trata da timina inicialmente citada, já que esta possui

ligações insaturadas em ressonância que absorvam radiação UV nesse comprimento de

onda. No entanto, essa afirmação ainda não pode ser feita, já que o produto observado ainda

não foi identificado através de análises com RMN e IV, para a confirmação das

informações descritas na literatura.

A placa cromatográfica, revelada em UV, como o produto de degradação (Figura 9),

demonstra que apenas uma pequena parte da Zidovudina foi degradada, mostrando que esta

pode ser considerada relativamente estável em tanto em meio básico quanto em meio ácido.

Figura 9: Placa cromatográfica do padrão da Zidovudina antes e após hidrólise básica. 1-

Padrão de Zidovudina; 2 – Produtos de degradação formados após reação de Hidrólise

Básica

Os produtos de degradação observados por CCD já foram devidamente isolados

utilizando-se cromatografia em coluna “flash”. Os mesmos serão submetidos à análise de

RMN 1H, RMN

13C e IV para que possam ser identificados.

1 2

57

Lamivudina

As informações existentes na literatura foram insuficientes e inconsistentes para a

reprodução do método de identificação dos produtos de degradação após exposição à

hidrólise. O método utilizado para o estudo foi desenvolvido e otimizado para que a

degradação fosse satisfatória, para a identificação e separação dos produtos obtidos.

O fármaco foi submetido a um refluxo durante 12 horas em NaOH 1M e em HCl

1M, para que a degradação observada fosse satisfatória. Após a extração, utilizando-se

acetado de etila, aplicou-se o padrão da Lamivudina juntamente com a amostra obtida em

CCD. Observou-se a formação de três produtos de degradação, sendo um em maior e os

outros dois em menor proporção, através do da CCD (UV 254nm) (Figura 10).

Figura 10: Placa cromatográfica com padrão da Lamivudina e produtos de degradação,

respectivamente. 1 – Padrão de Lamivudina; 2 – Produtos de Degradação formados após

Hidrólise Básica

Os produtos de degradação observados por CCD já foram devidamente isolados,

utilizando-se cromatografia em coluna “flash”. Os mesmos serão submetidos à análise de

RMN1H, RMN

13C e IV para que possa identificá-los. Como não há precedentes na

literatura, relativo à identificação dos produtos de degradação, os mesmos só serão

identificados após as análises espectrométricas.

1 2

58

4 Conclusões

O método de CCD mostrou-se simples e eficaz para a identificação inicial dos

produtos de degradação obtidos. A identificação dos produtos da hidrólise básica e da

hidrólise ácida através da CCD, auxiliará no isolamento e quantificação dos produtos e da

degradação, que serão realizados através de Cromatografia de Líquida de Alta Eficiência

(CLAE).

O Efavirenz apresentou-se instável quando submetido a condições drásticas de pH

ácido e básico, sendo observada através de CCD a formação de dois produtos de

degradação (amino álcool e quinolina), que foram isolados e identificados, confirmando-se

assim o que estava descrito na literatura, relativo á hidrólise básica. Apesar do precedente

de degradação do Efavirenz descrito na literatura, para condições básicas, otimizamos o

processo, visto que uma metodologia alternativa mais eficiente foi desenvolvida, além do

que desenvolvemos uma metodologia para a degradação em meio ácido, que não havia

precedente.

A zidovudina apresentou-se estável quando submetida a condições drásticas de pH

ácido e básico, observando-se a formação de um produto de degradação através de CCD.

As análises espectrométricas ainda serão realizadas, no entanto provavelmente se trate da

timina, como já descrito na literatura.

A lamivudina apresentou-se instável nas condições que foi submetida, apresentando

três produtos de degradação formados, que serão identificados a posteriore. A única

referência de degradação da lamivudina, descrita na literatura, não foi reprodutível, sendo

que as condições empregadas nesse trabalho foram satisfatórias e reprodutíveis.

5 Referências Bibliográficas

DUNGE, A.; CHAKRABORTI A. K.; SINGH, S. Mechanistic explanation to the variable

degradation behavior of stavudine and zidovudine under hydrolytic, oxidative and

photolytic conditions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Amsterdã, v.

35, p. 965-970, 2004.

59

INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION Guidance for Industry

Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products. nov, 2003

INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION. Guidance for Industry

Q3B(R2) Impurities in New Drug Products. jul, 2006.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Recomendações para terapia Anti-retroviral em adultos e

adolescentes infectados pelo HIV 2006. Brasília, 2006.

RIBEIRO, J.A.A; CAMPOS, L.M.M; ALVES, R.J; LAGES, G.P; PIANETTI, G.A.

Efavirenz related compounds preparation by hydrolysis procedure: Setting reference

standards for chromatographic purity analysis. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis. v. 43, p 298-303. 2007.

SINGH, S.; BAKSHI, M. Guidance of Conduct of Stress Tests to Determine Inherent

Stabolity of Drugs. Pharmaceutical Technology On-line, p. 1-14, abr. 2000

TURK, G.; MORONI, G.; PAMPURO, S.; BRIÑÓN, M. C.; SALOMÓN, H.

Antiretroviral activity and cytotoxicity of novel zidovudine (AZT) derivatives and the

relation to their chemical structure. International Journal of Antimicrobial Agents. n. 20,

p. 282-288. 2002.

60

Capítulo III

5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS


cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE

Artigo submetido à Revista Química Nova

61


cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE

Simultaneous determination of zidovudine, lamivudine and efavirenz by high-

performance liquid chromatography – HPLC

Keyla Emanuelle Ramos da Silva e Pedro José Rolim Neto*

Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos - LTM. Departamento de Ciências

Farmacêuticas. Universidade Federal de Pernambuco - UFPE. Rua Arthur de Sá, s/n.

Cidade Universitária, 50740-521. Recife – PE, Brasil.

Monica Felts de La Roca Soares e José Lamartine Soares Sobrinho

Núcleo de Tecnologia Farmacêutica - NTF. Universidade Federal do Piauí - UFPI. Campus

Universitário Ministro Petrônio Portella, s/n, Ininga, 64.049-550. Teresina – PI, Brasil.

Antônio Rodolfo de Faria

Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos – LASOF. Departamento de

Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal de Pernambuco - UFPE. Rua Arthur de Sá,

s/n. Cidade Universitária, 50740-521. Recife – PE, Brasil.

Abstract

An accurate, sensitive and specific reversed-phase high-performance liquid

chromatography assay for the simultaneous quantitative determination of the nucleoside

reverse transcriptase inhibitors zidovudine and lamivudine with the non-nucleoside reverse

transcriptase inhibitor efavirenz in tablets is described. The HPLC method involve a C18-

250 mm column, λ 248 nm and gradient mobile phase composed by acetonitrile and water

in a 14 minutes run. The method was validated per ICH guidelines.

Keywords: Zidovudine, Lamivudine, Efavirenz, Method, DFC.

*Autor de correspondência: [email protected]

62

1 Introdução

A introdução da terapia combinada tem reduzido a morbidade e mortalidade de

pacientes infectados pelo vírus da imuno-deficiência humana (HIV). Fármaco de várias

classes farmacológicas e com mecanismos de ação em diferentes etapas da replicação viral

têm sido associados na forma de dose-fixa-combinada (DFC).1,2

O atual regime terapêutico

de primeira escolha associa dois inibidores da transcriptase reversa análogos de

nucleosídeos (ITRN), zidovudina (AZT) e lamivudina (3TC) a um não análogo, efavirenz

(EFZ) (Figura 1).3

Figura 1. Estrutras químicas da zidovudina, lamivudina e efavirenz.

A cromatografia líquida de alta eficiência é a técnica analítica mais empregada para

a pesquisa e quantificação de fármacos antiretrovirais. Na literatura encontram-se métodos

analíticos aplicados a quantificação da zidovudina4, lamivudina

5, efavirenz

6; associações

que não são mais as alternativas de primeira escolha, como lamivudina, estavudina e

nevirapina7,8

,

zidovudina, lamivudina e nevirapina1

e associações acadêmicas como

zalcitabina, lamivudina, didanosina, estavudina, zidovudina, abacavir e nevirapina9; assim

como métodos analíticos aplicados à amostras biológicas de efavirenz10

, lamivudina11

, e

associações de zidovudina e lamivudina12

, lamivudina, estavudina e nevirapina13

.

A produção de uma nova formulação DFC deve estar de acordo com as publicações

do Consenso do Ministério da Saúde3, e toda nova alternativa terapêutica, exige o

desenvolvimento e a validação de um novo método analítico que atenda às especificações

63

dos órgãos reguladores, haja vista a ausência de métodos publicados na literatura científica

e em compêndios oficiais pata a quantificação destes fármacos associados.1

Este estudo descreve o desenvolvimento e validação de um método analítico inédito

por cromatografia líquida de alta eficiência para a detecção e quantificação simultânea da

zidovudina, lamivudina e efavirenz em comprimidos DFC, atendendo às exigências do

Guia de validação de métodos analíticos do International Conference on Harmonisation of

Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).14

2 Parte Experimental

2.1 Materiais

Comprimidos desenvolvidos pelo Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos –

LTM, da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, contendo 300 mg de zidovudina

(Northeast® lote: DY 070041, Teor 97,88%), 300 mg de efavirenz (Cristália®, lote:

1289/07, Teor 98,00%), e 150 mg de lamivudina (Hangzhou® lote: 071208, Teor

100,00%).

Padrões de trabalho

Para o desenvolvimento e validação do método analítico foram utilizados padrões

de trabalho de zidovudina (Ítaca®, lote HVZ0210304, teor 100,00%), efavirenz (Xiamem

Mchem®, lote 050501, teor 98,32%) e lamivudina (Northeast®, lote 00019, teor 100,47%).

Excipientes

Estearato de Magnésio (Blanver ); Dióxido de Silício Coloidal (Henkel );

Croscarmelose Sódica (Rellance Celulose ) e Polivinilpirrolidona (Xiamem ).

Reagentes

Acetonitrila grau HPLC (J.T. Baker®) e água ultra purificada obtida por Milli-Q

Millipore®, sal fosfato de sódio monohidratado (Vetec®), ácido ortofosfórico (J.T.

Baker®).

64

Equipamentos e condições cromatográficas.

Cromatógrafo líquido de alta eficiência HP/Agilent® 1100 equipado com bomba

quartenária série G1311A, autoinjetor série G1367A, detector DAD (arranjo de diodos)

série G1315A, forno para coluna e degaseificador série G1322A. As colunas utilizadas

neste estudo foram Shim-pack® VP-ODS, 150 x 4,6 mm, ø 10 µm e Phenomenex® 250 x

4,6 mm, ø 5 µm, mantidas a 30°C. A fase móvel foi definida ao longo do desenvolvimento

do método analítico, sendo utilizado acetonitrila, água, tampão fosfato em diferentes

proporções, assim como diferentes regimes de eluição (isocrático e gradiente) e variações

do fluxo da fase móvel.

2.2 Método

Desenvolvimento do método analítico

O desenvolvimento do método teve início com a realização de uma varredura

cromatográfica de 180 a 800 nm, com o auxílio do detector de arranjo de iodo, do padrão

misto contendo os três fármacos, objetivando-se identificar o comprimento de onda no qual

três fármacos apresentassem valores máximos de absorvâncias. Esta varredura foi realizada

com a injeção da amostra no sistema sem a fase estacionária.

Após realização de pesquisas referente a métodos de analises para quantificação de

antiretrovitais, já descritos em farmacopéias15,16

e em artigos científicos publicados,4-13

foram testados variações, avaliando-se os seguintes parâmetros: fase estacionária, coluna

C18 150 x 4,6 mm, ø 10 µm e C18 250 x 4,6 mm, ø 5 µm; fase móvel: variação da fase

aquosa por água grau HPLC, solução tampão fosfato de potássio 0.05 M, pH 3, ajustado

com ácido fosfórico 85%, e variação do sistema de isocrático em diferentes proporções para

o sistema gradiente.

A partir dos cromatogramas obtidos, avaliou-se a adequação do sistema

cromatográfico através dos parâmetros: número de pratos teóricos, fator de assimetria e

resolução entre os picos.

Preparação das amostras

Os comprimidos revestidos DFC foram pesados, triturados e pulverizados. O

equivalente a 12,50 mg de 3TC, 25 mg de AZT e 25 mg de EFZ foi pesado analiticamente,

65

transferido para balão volumétrico de 25 mL, diluído em fase móvel acetonitrila:água

(50:50) e sonicado por 10 minutos. As amostras foram aferidas e filtradas em papel de filtro

faixa-preta. Do filtrado, retirou-se alíquota volumétrica e diluiu-se com fase móvel até

obtenção da concentração final de 20, 40 e 40 μg/mL de 3TC, AZT e EFZ,

respectivamente. As soluções obtidas foram filtradas em unidades filtrantes de 0,45 μm e

analisadas por CLAE. Foram preparadas amostras em quintuplicata.

Validação do método analítico

Parâmetros Avaliados

O método proposto foi validado seguindo os parâmetros de linearidade, robustez,

precisão, exatidão e especificidade de cada princípio ativo, especificados no guia do ICH.14

A linearidade do método foi verificada a partir da análise de três curvas autênticas

do padrão misto nas concentrações de 10; 16; 20; 24 e 30 μg/mL para 3TC; 20; 32; 40; 48 e

60 μg/mL para AZT e 20; 32; 40; 48 e 60 μg/mL para EFZ. Os resultados obtidos foram

tratados estatisticamente, por cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos

quadrados.

No parâmetro robustez foi analisada a possível influência de pequenas variações

ocasionadas pela alteração na vazão da fase móvel nos primeiros 4,5 minutos (0,99; 1,00 e

1,01 mL/min), na temperatura do forno (28, 30 e 32º C) e no tempo de sonicação da

preparação das amostras (08, 10 e 12 min).

A especificidade/seletividade do método foi determinada pela análise do placebo

dos comprimidos contendo polivinilpirrolidona, croscarmelose sódica, dióxido de silício

coloidal e estearato de magnésio.

A precisão foi avaliada em dois níveis: repetitividade (precisão intra-corrida) e

precisão intermediária (precisão inter-corridas). Para a repetitividade, replicatas de 6

determinações a 100% da concentração teste dos fármacos associados foram analisadas. Já

para precisão intermediária, as quintuplicatas foram analisadas em dias diferentes e por

analistas diferentes. Para avaliar a exatidão do método, amostras em concentrações

conhecidas equivalentes a 80, 100 e 120% da concentração teórica analisada para cada

fármaco foram testadas, as quais correspondem às concentrações mínima, média e máxima,

respectivamente.

66

3 Resultados e Discussão

3.1 Desenvolvimento do método analítico

Foi realizado um levantamento de métodos que utilizaram as moléculas envolvidas

no estudo com finalidade comparativa ao método desenvolvido (Tabela 1). A varredura

cromatográfica realizada apontou como melhor comprimento de onda 201 nm, seguido de

248 nm, sendo o primeiro comprimento muito próximo a região do visível e por

conseqüência apresentando diversas instabilidades de leitura, adotou-se então o

comprimento de onda de 248 nm (Figura 2).

Figura 2. Varredura cromatográfica do padrão misto dos três fármacos, sem coluna

cromatográfica – Faixa ampliada de 180 a 320 nm.

67

Tabela 1: Condições cromatográficas dos métodos analíticos publicados.

Métodos Fase móvel Sistema

Tempo de

retenção/

corrida

(minutos)

Fluxo

da FM

(mL/min)

Fase Estacionária °C

Forno

Vol.

injeção

(µL)

Detector λ N° Ref.

Artigo

Méto

do

s co

m M

atr

iz n

ão B

ioló

gic

a

EFZ + Impurezas

A: Água acidificada - 0.05% (ác. Trifluoroacético)/ Metanol – (90:10)

B: Água acidificada - 0.05% (ác. Trifluoroacético)/ Metanol – (10:90)

Gradiente

NI

Total: 40 1.5

Zorbax SB-CN, 150 x

4,6 mm 40 35 UV 250 6

AZT Tampão pH 4,5 (ác. acético)/Metanol

(77:23) Isocrático

AZT: 12

Total: 20 1

C18, 250 × 4.6 mm ø

5µm NI 10 DAD 265 4

3TC Acetato de amônio/Metanol (440:60) - pH

5,5 Isocrático NI 1 C18, 125 mm 35°C 20 UV 270 5

3TC + D4T+ NVP

A: Tampão acetato 10 mM pH 3,5 (ác. acético glacial)/Metanol (80:20)

B: Acetonitrila/Álcool isopropílico (50:50)

Gradiente

3TC: 5,9 D4T:

8,8

NVP: 14.2 Total: 25

0.6 C18, 250 mm NI 10 UV 270 7

3TC +AZT + NRP Tampão fosfato de potássio

0,05 M pH 3,0/Acetonitrila (60:40) Isocrático

3TC: 2,4 AZT: 3,4 NVP: 4,8

Total: 7,0

1.0 C18, 250 x 4,6 mm, ø

10 µm 30 10 UV 270 1

Méto

do

s co

m

Ma

triz

Bio

lóg

ica

3TC + D4T +NVP Água acidificada – 0,5% de ác. acético

glacial/Acetonitrila (20:80) Isocrática

NI

Total: 4,5 0.4

C18, 150 ×3.9mm, ø 5

µm 25 5 MS/MS NA 13

EFZ Tampão fosfato 10 mM pH 2,4 (1N

HCl)/Acetonitrila (55:45) Isocrátioco

EFZ: NI

Total: 10 2.4

C18, 150 ×4.6mm, ø 5

µm NI 20 UV 245 10

Méto

do

Dese

mvo

lvid

o

AZT + 3TC +EFZ

A: Acetonitrila/Água (50:50)

B: Acetonitrila/Água (70:30) C: Acetonitrila/Água (75:25)

Gradiente

AZT: 2,84

3TC: 2,28

EFZ: 8,30

Total: 14

A: 1.0

B e C: 1.5

C18, 250x 4,6 mm

ø 5 µm 30 10

DAD 248 NA

68

Devido a diferença das características físico-químicas das moléculas envolvidas

(Figura 1) dificilmente seria possível a separação cromatográfica e detecção das mesmas

por meio do detector de DAD, utilizando um sistema isocrático no método pretendido.

Trabalhos anteriormente publicados envolvendo determinações simultâneas de fármacos

pela técnica de cromatografia líquida, usando o detector DAD, utilizam em sua grande

maioria o sistema de eluição da fase móvel gradiente.6,7

Ao mesmo tempo também são

observados a utilização de sistemas de eluição isocráticos, quando o objetivo da análise são

moléculas de características semelhantes,1,13

onde outras variáveis como interação fase

estacionária-fármaco, fluxo da fase móvel e sua composição podem agir de forma efetiva

na separação dos compostos, além de ser empregado para determinação simples dos

fármacos em questão.4,10

A diferença da polaridade referente aos sistemas eluentes utilizados para a

determinação do EFZ,6,10

de natureza preponderante orgânica, em comparação ao

encontrado em sistemas eluentes para a determinação do 3TC e AZT, de natureza

preponderante aquosa,1,4

(Tabela 1) comprova que a associação de três moléculas de

composição heterogênea, para ter-se um método eficaz e com uma duração razoável de

análise, deve-se utilizar o sistema gradiente para tal finalidade.

As condições para o método cromatográfico foram primeiramente estabelecidas

com o padrão misto de 3TC, AZT e EFZ e, após otimização dos parâmetros, foram

aplicadas para o doseamento do comprimido DFC.

Por apresentar os três picos simétricos, com boa resolução entre eles e áreas bem

definidas, a fase estacionária escolhida para o doseamento foi a coluna C18

(Phenomenex®). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os resultados

obtidos com a fase aquosa água grau HPLC e tampão fosfato, optando-se por se trabalhar

com apenas água como a fase aquosa. Sob as condições experimentais verificadas (Tabela

2), o método foi o escolhido por apresentar melhor resolução entre os picos, condições

ideais para conservação da coluna e tempos de retenção de 2,28 min para 3TC; 2,84 min

para AZT e 8,30 min para EFZ, adequado a rotina de análise para aprovação ou liberação

do produto na indústria farmacêutica. A temperatura selecionada foi de 30ºC por ser

percebida durante as análises como a que apresenta maior facilidade de estabilização para o

forno do cromatógrafo. O volume de injeção foi de 10 μL. Os fármacos foram injetados

69

isoladamente em tal condição cromatográfica (Figura 3) e associados (Figura 4),

verificando a semelhança referente aos tempos de retenção dos princípios-ativos.

Tabela 2: Composição e fluxo da fase móvel padronizadas no método desenvolvido.

Tempo (min) de corrida

Solvente A

Acetonitrila%

Solvente B

Água %

Fluxo da FM

(mL/min)

0,01

3,00

4,5

50

50

70

50

50

30

1,0

1,0

1,5

5,00

10,00

11,00

75

75

50

25

25

50

1,5

1,5

1,0

14,00 50 50 1,0

70

Figura 3. Cromatogramas dos fármacos AZT, EFZ e 3TC (padrão de trabalho) isolados sob

as condições cromatográficas definidas.

Figura 4. Cromatograma referente ao método analítico escolhido para quantificação do

AZT (40mg), 3TC (20mg) e EFZ (40mg).

71

A performance do sistema cromatográfico escolhido foi avaliada de acordo com os

parâmetros: resolução entre os picos, fator de assimetria, além de número de pratos. A

resolução entre os picos mede a qualidade da separação entre eles: quanto mais distantes,

melhor a separação e mais segura é a quantificação. Os valores da resolução entre os picos

3TC e AZT foi de 3,39 e entre AZT e EFZ 33,4 sendo superiores a 2,00, indicando

separação eficaz entre os mesmos.1 Além do fator de resolução verificou-se por meio do

DAD a pureza dos picos individualmente, comprovando a não co-eluição dos picos

referentes aos 3 fármacos. O fator de assimetria obtido foi de 1,40 para 3TC; 1,38 para

AZT e 1,45 para EFZ, apresentando, portanto, valores inferiores a 1,5, descrito na literatura

como aceitável para amostras de interesse.17

O número de pratos teóricos diz respeito à

eficiência da coluna, devendo ser superior a 2000,4,18

os resultados obtidos foram 5776,42;

5748,28; 2792,71 para 3TC, AZT e EFZ, respectivamente.

3.2 Validação do método analítico

Os resultados obtidos da avaliação dos parâmetros foram tratados estatisticamente

por Análise de Variância (ANOVA) one-way e teste t de Student,13

com nível de

significância de 95%.

Robustez

Um método robusto tem a habilidade de fornecer resultados inalterados quando

sujeito a pequenas mudanças19

. Para todas as modificações analisadas na robustez, variação

da vazão da fase móvel, tempo de sonicação das amostras, variação da temperatura do

forno cromatográfico, os resultados obtidos apresentaram desvio padrão relativo inferior a

2,0%, a partir de amostras analisadas em quintuplicata. Pela análise estatística dos

resultados, foi verificado que os valores obtidos para os F calculados foram inferiores ao do

F tabelado, determinando com 95% de confiança que o método é robusto para estas

variáveis testadas (Tabela 3).

72

Tabela 3: Validação: Parâmetro Robustez utilizando ANOVA fator único.

Análise

Estatística

Lamivudina

(20µg/mL)

Zidovudina

(40µg/mL)

Efavirenz

(40µg/mL)

Variação do Fluxo da Fase Móvel (mL/min)

0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1

Média 19,70 20,80 19,96 40,83 41,1 40,73 40,73 40,30 40,07

DPR (%) 0,31 0,07 0,26 0,36 0,81 0,50 0,16 0,31 0,20

F cal 4,606 0,193 1,522

F tab 5,143

Tempo de Sonicação da Amostra (min)

8 10 12 8 10 12 8 10 12

Média 19,93 20,47 20,70 40,83 40,74 41,3 40,76 40,11 40,55

DPR (%) 0,10 0,16 0,19 0,16 0,18 0,07 0,54 0,86 0,09

F cal 3,044 1,930 0,656

F tab 5,143

Temperatura do Forno da Coluna (°C)

28 30 32 28 30 32 28 30 32

Média 21,02 21,33 20,43 40,43 40,47 40,72 40,33 40,10 40,97

DPR (%) 0,37 0,36 0,09 0,18 0,21 0,21 0,42 0,43 0,71

F cal 2,259 0,372 1,175

F tab 5,143

Linearidade

O método também se mostrou linear, para a faixa de variação entre 50 a 150%,

conforme as equações da reta do 3TC, onde y = 33,69925x – 5,27723, do AZT onde y =

19,88996x – 7,14878 e do EFZ onde y = 35,75349x – 3,31668; no entanto, seguindo a

análise de variância, tem-se que o R2 máximo explicável é de 0,9988, 0,9990 e 0,9991

respectivamente. Houve uma regressão estatisticamente significativa e sem falta de ajuste,

proporcionando uma curva linear.

A linearidade de um método demonstra que os resultados obtidos são diretamente

proporcionais à concentração do fármaco na amostra, dentro de um intervalo especificado.

As áreas obtidas no intervalo de variação analisado demonstraram que não há falta de ajuste

no modelo proposto, visto que os resíduos não apresentaram anormalidade na sua

distribuição, considerando os três parâmetros em estudo.

73

Precisão e exatidão

O método apresentou-se preciso nos dois níveis analisados. Na repetitividade, as

seis amostras autênticas com concentração de 100%, apresentaram desvio padrão relativo

(DPR) de 0,47 para o 3TC, 1,20 para o AZT e 0,69 para o EFZ, sendo estes inferiores a 2%.

Para a precisão intermediária (Tabela 4), os resultados entre dias e analistas diferentes não

evidenciaram diferença estatisticamente significativa entre analistas e dias, empregando-se

Anova fator duplo. Todos os resultados se mostraram inferiores ao f tabelado, confirmando

com 95% de confiança que o método é preciso, por não apresentar diferenças

estatisticamente significativas entre analistas e entre dias.

Na exatidão, os resultados para o t calculado referente à concentração mínima

considerada de 80% para a concentração média de 100%, e para a concentração máxima

referente a 120% estão descritos na Tabela 5. Estes resultados quando comparados com o t

tabelado de 4,303 com 95% de confiança se apresentaram inferiores, demonstrando que o

método desenvolvido é exato, já que não foram evidenciadas diferenças estatisticamente

significativas entre os valores obtidos e os esperados.

Tabela 4: Validação: Parâmetro Precisão Intermediária utilizando ANOVA fator duplo.

F c

alc

ula

do

3TC AZT EFZ F Tabelado

Entre Analistas 0,978 2,213 2,351 5,143

Entre Dias 2,88 1,321 2,125 5,987

Entre Dias e Analistas 0,921 1,609 0,961 5,143

74

Tabela 5: Validação: Parâmetro Exatidão utilizando Teste-t.

Concentração Fármaco T Calculado T Tabelado

3TC

0,337

80% AZT

EFZ

3TC

3,55 100% AZT 4,303

EFZ

3TC

0,640

120% AZT

EFZ

Especificidade

O método proposto demonstrou ser seletivo e específico, não sendo afetado pelos

excipientes utilizados no processo de fabricação do comprimido revestido, o que pôde ser

confirmado pela ausência de absorvâncias nos tempos de retenção dos picos referentes aos

três fármacos (Figura 5). Pode-se também notar que os fármacos possuem tempos de

retenção distintos como verificado nos cromatogramas da Figura 3, onde se observa a

detecção das moléculas isoladas.

Figura 5. Cromatograma do placebo realizada com o método desenvolvido.

75

4 Conclusão

O método descrito neste trabalho foi desenvolvido a fim de se disponibilizar um

procedimento analítico para quantificação desta associação de fármacos antiretrovirais em

comprimidos dose-fixa-combinada, haja vista a inexistência de métodos descritos seja em

compêndios oficiais seja em trabalhos científicos, destinados a este doseamento. É um

método simples e de baixo custo, levando-se em consideração a heterogeneidade dos

fármacos envolvidos, apresentando confiabilidade e segurança necessárias em

procedimentos analíticos. Os parâmetros verificados garantiram que ele é robusto, exato,

preciso e específico para a quantificação da forma farmacêutica contendo a associação de

lamivudina, zidovudina e efavirenz.

Agradecimentos: A CAPES, CNPq, FINEP, LAFEPE e Sinc do Brasil pela parceria no

projeto.

5 Referências Bibliográficas

1. Lavra, Z. M. M.; Silva, R. M. F.; Medeiros, F. P. M.; Rolim-Neto, P. J.; Quim.

Nova. 2008, 31(5), 969.

2. Cunico, W.; Gomes, C. R. B.; Vellasco-Júnior, W. T.; Quim. Nova, 2008, 31(8),

2111.

3. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Programa Nacional de

DST e Aids. Recomendações para terapia anti-retroviral em adultos e adolescentes

infectados pelo HIV 2007/2008. 2007, 207p.

4. Dunge, A.; Sharda, N.; Singh B.; Singh, S.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, 37,

1109.

5. Monteiro, D. B.; Braga, J. M. F.; Albuquerque, M. M.; Stattmann, R.; Silva, K. E.

R.; Rolim-Neto, P. J.; Rev. Bras. Farm. 2006, 87(4), 120.

6. Montgomery, E. R.; Edmanson, A. L.; Cook, S. C.; Hovsepian, P. K.; J. Pharm.

Biomed. Anal. 2001, 25, 267.

76

7. Kapoor, N.; Khandavilli, S.; Panchagnula, R.; Anal. Chim. Acta. 2006, 570, 41.

8. Sarkar, M.; Khandavilli, S.; Panchagnula, R.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol.

Biomed. Life Sci. 2006, 830, 349.

9. Rezk, N. L.; Tidwell, R. R.; Kashuba, A. D. M.; J. Chromatogr. B: Anal. Technol.

Biomed. Life Sci. 2003, 791, 137.

10. Ramachandran, G.; Kumar, A. K. H.; Swaminathan, S.; Venkatesan, P.;

Kumaraswami, V.; Greenblatt, D. J.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed.

Life Sci. 2006, 835, 131.

11. Kano, E. K.; Serra, C. H. R.; Koono, E. E. M.; Andrade, S. S.; Porta, V.; Int. J.

Pharm. 2005, 297, 73.

12. Kenney, K. B.; Wring, S. A.; Carr, R. M.; Wells, G. N.; Dunn, J. A.; J. Pharm.

Biomed. Anal. 2000, 22, 967.

13. Mistri, H. N.; Jangid, A. G.; Pudage, A.; Gomes, N.; Sanyal, M.; Shrivastav, P. J.

Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 853, 320.

14. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use - ICH. Q2(R1): Validation of

Analytical Procedures: Text and Methodology. 2005, 13p.

15. Farmacopéia Brasileira, IV ed., Atheneu: São Paulo, 2003.

16. United States Pharmacopeia, 29th

ed. United States Pharmacopeia Convention:

Rockville, 2006.

17. Snyder, L. R.; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L.; Practical HPLC Method Development,

2nd

ed., John Wiley & Sons: New York, 1997.

18. Kedor-Hackmann, E. R. M.; Prado, M. S. A.; Steppe, M.; Santoro, M. I. R. M.; Rev.

Bras. de Farmácia. 2002, 83, 69.

19. Silva, A. L. M.; Soares-Sobrinho, J. L.; Rolim-Neto, P. J.; Silva, R. M. F.;

Medeiros, F. P. M.; Lima, L. G. Quim. Nova. 2007, 30(5), 1163.

77

Capítulo IV

6 TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO DO COMPRIMIDO REVESTIDO DOSE-FIXA-

COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA E EFAVIRENZ


base de lamivudina, zidovudina e efavirenz

Artigo a ser submetido

78


base de lamivudina, zidovudina e efavirenz

Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Mônica Felts de La Roca Soares

1, Jeckson Luis da

Silva1, Antônio Rodolfo de Faria


1*

1- Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Farmácia – UFPE, Av.

Prof. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária – CEP: 50.740-020, Recife-PE

2 - Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos, Departamento de Farmácia –

UFPE, Av. Prof. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária – CEP: 50.740-020, Recife-PE

Resumo

A terapia anti-retroviral altamente ativa pode suprimir a replicação viral e prolongar a

vida do paciente. Formulações multi-fármacos com dose fixa vêm sendo utilizadas para reduzir

o número de vezes que o medicamento é administrado e aumentam a conveniência do

tratamento. De acordo com o Consenso de AIDS 2007-2008, publicado pelo Ministério da

Saúde, os fármacos de primeira escolha para o tratamento da AIDS hoje são a Zidovudina, a

Lamivudina e o Efavirenz. A escolha de uma formulação adequada é essencial ao

desenvolvimento dos comprimidos e para garantir melhor disponibilização no trata

gastrointestinal, de forma a alcançar a biodisponibilidade e o efeito terapêutico desejado. Nesse

trabalho, apresentamos de forma lógica, o desenvolvimento tecnológico de comprimidos

revestidos dose-fixa-combinada a base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz levando em

consideração as características físicas e físico-químicas desses fármacos. Os núcleos foram

obtidos utilizando-se a técnica de granulação por via úmida e os parâmetros adotados seguiram

as especificações farmacopéicas oficiais e a determinação quantitativa foi realizada mediante

métodos analíticos desenvolvidos e validados.

Palavras-Chave: Comprimido, dose-fixa-combinada, AIDS

*Email: [email protected]

79

1 Introdução

A terapia anti-retroviral altamente ativa pode suprimir a replicação viral e prolongar

a vida do paciente. No entanto pode falhar, por várias razões, incluindo a aderência não

satisfatória ao tratamento, potencial insuficiente do fármaco, desenvolvimento de

resistência, fatores celulares e farmacocinéticos e quantidades de fármacos a serem

administrados (BACK & KHOO, 2003).

A máxima supressão viral por maior tempo possível é a principal meta da terapia

anti-retroviral. Para isso, substituiu-se a monoterapia pela terapia combinada, ou seja,

administra-se mais de um fármaco ao mesmo tempo. Recomenda-se que esta terapia

combinada seja composta por dois inibidores da transcriptase reversa análogos de

nucleosídeo (ITRN) associados a um inibidor da transcriptase reversa não-análogo de

nucleosídeo (ITRNN) ou um inibidor de protease (IP) (LAVRA et al, 2008; FARIAS et al,

2006).

Formulações multi-fármacos com dose fixada reduzem o número de vezes que o

medicamento é administrado e aumentam a conveniência do tratamento. No entanto a terapia

anti-retroviral é uma área complexa, sujeita a constantes mudanças. As recomendações deverão

ser vistas periodicamente, com o objetivo de incorporar novos conhecimentos gerados pelos

ensaios clínicos (GULICK, 2003).

De acordo com o Consenso de AIDS 2007-2008, os fármacos de primeira escolha para o

tratamento da AIDS hoje são a Zidovudina, a Lamivudina e o Efavirenz.

Os inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos foram a primeira

classe de drogas utilizada como anti-retrovirais. A Zidovudina (AZT), 3-ácido-3-

dioxitimidina, foi a primeira droga utilizada na clínica em 1987. Inicialmente foi utilizada

na monoterapia, no entanto atualmente, compõe o coquetel de AIDS como um das drogas

IRTN de primeira escolha. Seu tempo de meia-vida plasmática é de 1,1 h e sua dosagem é

de 300 mg duas vezes ao dia com restrições alimentares. O principal efeito adverso

associado ao AZT é a mielossupressão, particularmente anemia e neutropenia. Atualmente

a zidovudina encontra-se disponibilizada no mercado na forma farmacêutica cápsula de 100

mg e xarpoe 10 mg/mL (TURK, 2002; LAFEPE, 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

A Lamivudina (3TC), também um IRTN, é o único fármaco aprovado pelo FDA

que tem atividade contra o HIV e a hepatite B. A dose da lamivudina utilizada na

80

terapêutica é de 150 mg duas vezes ao dia, apresentando-se na forma farmacêutica

comprimido revestido. Seu tempo de meia vida plasmática 3-6h (MONTEIRO et al, 2006;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Encontra-se disponibilizado no mercado uma formulação que associa zidovudina

300 mg e lamivudina 150 mg (Combivir ), com posologia de duas vezes ao dia, sem

restrições alimentares (KENNEY et al, 2000).

O Efavirenz (EFV) foi o terceiro IRTNN a ser liberado (1998) e é a fármaco de

primeira escolha dessa classe de medicamentos. O governo brasileiro distribui comprimidos

de efavirenz 600 mg (Stocrin ) gratuitamente através do Programa DST-AIDS (RIBEIRO

et al, 2007). Seu tempo de meia vida é de 40-55 h. Recentemente o governo brasileiro

licenciou compulsoriamente a patente desse medicamento, permitindo assim que novas

DFC sejam desenvolvidas no país (VIANA et al, 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).

Com o desenvolvimento e a produção de um comprimido, pretende-se a administração

oral de uma quantidade correta de fármaco com sua integridade química protegida de modo

adequado durante o intervalo de tempo e no local desejado. Portanto, o objetivo do presente

estudo será a obtenção de núcleos dose-fixa-combinada, utilizando-se da técnica de granulação

por via úmida e os parâmetros adotados seguirão as especificações farmacopéicas oficiais e a

determinação quantitativa será realizada mediante métodos analíticos desenvolvidos e validados.

2 Metodologia

2.1 Controle de Qualidade Físico-Químico

Antes do desenvolvimento de qualquer forma farmacêutica, é essencial que as

propriedades físicas e químicas da molécula do fármaco e outras propriedades do fármaco

em pó sejam determinadas. As informações obtidas nesta etapa, conhecida como pré-

formulação, são imprescindíveis no desenvolvimento da nova formulação (AULTON,

2005).

O objetivo deste item foi caracterizar os antiretrovirais zidovudina, lamivudina e

efavirenz, realizando as análises de controle de qualidade físico-químicas de acordo com os

métodos descritos na Farmacopéia Brasileira 4ª edição.

81

2.1.1 Matérias-primas

As matérias – primas utilizadas neste estudo foram: zidovudina, (Northeast® lote:

DY 070041); lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) e efavirenz (Cristália®, lote:

1289/07). A caracterização baseou-se nos métodos analíticos descritos na Farmacopéia

Brasileira, 4ª edição, 1988, 2001 e 2002.

2.1.2 Padrões de trabalho

Zidovudina (Ítaca® lote HVZ0210304 – teor 100,0%), lamivudina (Northeast® lote

00019 – teor 100,47%) e efavirenz (Xiamem Mchem® lote 050501 – teor 98,32%).

Zidovudina

Figura 1: Estrutura molecular da zidovudina (AZT)

A zidovudina apresentou-se na forma de pó branco ou acastanhado, possui massa e

fórmula molecular equivalente a 267,2 g/mol e C10H13N5O4, respectivamente. Funde-se a

aproximadamente 124 ºC, sendo levemente solúvel em água e solúvel em etanol.

Na verificação da descrição, foi realizada sua análise macroscópica e avaliada a

solubilidade. Foram avaliadas também as constantes físico-químicas referentes ao ponto de

fusão e poder rotatório. O ponto de fusão foi determinado por método capilar no

fusiômetro, já para o poder rotatório utilizou-se o polarímetro com uma solução a 1 %

(m/v) em etanol. O conteúdo de água foi determinado em 1 g da amostra utilizando um

82

analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena, a uma temperatura

entre 100 ºC - 105 ºC.

Todos os ensaios foram realizados com auxílio da balança analítica e de vidrarias

graduadas e/ou volumétricas.

O doseamento foi realizado por dois métodos: espectrofotométrico, desenvolvido e

validado pelo LAFEPE (RV 024, LAFEPE, 2003), e por cromatografia líquida de alta

eficiência. Na quantificação pelo método espectrofotométrico foi analisada uma solução

aquosa a 0,01 mg/mL num comprimento de onda de 268 nm. Pelo método cromatográfico

uma solução a 0,2 mg/mL em fase móvel foi analisada nas seguintes condições

cromatográficas: coluna C18 (LiChrospher ®), 250 x 4,6 mm, partícula 5 μm; detector UV

(λ = 265 nm); fase móvel metanol grau HPLC e água ultrapurificada numa proporção de

20:80; fluxo de 1,2 mL/min e volume de injeção de 10 µL. Para os dois métodos foram

preparadas e analisadas soluções padrões nas mesmas condições.

Lamivudina

Figura 2: Estrutura molecular da lamivudina (3TC)

A lamivudina apresenta-se na forma de pó cristalino branco a branco-amarelado,

com massa e fórmula molecular equivalente a 229,26 g/mol e C8H11N3O3S,

respectivamente. Funde-se num intervalo entre 176 ºC – 178 ºC.

A verificação da sua solubilidade foi realizada em água purificada, metanol, etanol,

acetona, ácido clorídrico 0,1 M e hidróxido de sódio 0,1 M. O poder rotatório específico foi

determinado em polarímetro, com uma solução metanólica a 0,8 % (m/v) e o ponto de

83

fusão pelo método capilar em fusiômetro. O teor de água foi verificado pelo método Karl-

Fischer. O resíduo por incineração foi determinado em condições semelhantes à

zidovudina.

O doseamento da amostra foi realizado pelos métodos espectrofotométrico e

cromatográfico. Por espectrofotometria uma solução aquosa de lamivudina a 0,0015 %

(p/v) foi preparada e lida em detector UV (λ = 270 nm). Para análise por cromatografia, as

condições cromatográficas utilizadas foram as seguintes: coluna C 8 (Microbondapack®),

250 x 4,6 mm, 5 μm; detector UV (λ = 277 nm); fase móvel com tampão acetato pH 3,8 e

metanol (95:5); fluxo 1 mL/min e volume de injeção de 10 µL.

Efavirenz

Figura 3: Estrutura molecular do efavirenz (EFZ)

O efavirenz é representado pela fórmula molecular C14H9ClF3NO2 e possui massa

molecular 315,68 g/mol. Caracteriza-se como pó cristalino branco ou levemente amarelado.

Apresenta-se solúvel em metanol e diclorometano e praticamente insolúvel em água. A

faixa de fusão entre 136,0ºC – 141,0ºC foi verificada pelo método capilar em fusiômetro.

O teste de perda por dessecação foi determinado em 1 g da amostra, utilizando

analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena a 105 °C. O

doseamento foi realizado por cromatografia líquida de alta eficiência, tendo como fase

estacionária a coluna cromatográfica C18 (LiChrospher ®), 250 x 4,6 mm, partícula 5 μm

detector UV (λ = 252 nm); fase móvel com tampão e acetonitrila e água acidificada com

ácido orto-fosfórico; fluxo 1,0 mL/min e volume de injeção de 20 µL.

84

2.2 Desenvolvimento de comprimidos revestidos dose-fixa-combinada

2.2.1 Materiais

Levando-se em consideração as características físicas e físico-químicas dos pós de

lamivudina, zidovudina e efavirenz, foi realizada uma planificação quali-quantitativa de

excipientes.

As matérias-primas com seus respectivos fornecedores foram: zidovudina,

(Northeast® lote: DY 070041); lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) e efavirenz

(Cristália®, lote: 1289/07), Estearato de Magnésio (Blanver ); Dióxido de Silício Coloidal

(Henkel ); Croscarmelose (Rellance celulose ); Polivinilpirrolidona (Xiamem ). Os

equipamentos utilizados no processo de obtenção dos comprimidos foram: misturador em

“V” (Lawes ); Granulador oscilante (Fabbe-Primar ); Estufa industrial (Imarvil );

Compressora rotativa de 16 punções (Newberger ); Drageadeira convencional.

Baseando-se em uma planificação qualitativa e quantitativa de excipientes, foram

manipulados 4 (quatro) lotes de bancada (LB) contendo 300 g de massa de pós, os quais

estão descritos na tabela 1. Os lotes de bancada foram calculados para obtenção de

comprimidos com 800 mg de peso médio.

Tabela 1: Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos

Componente LBI % LBII

%

LBIII

%

LBIV

%

Função

ETAPA I

Lamivudina 19,23 19,23 19,2 19,2 Principio ativo

Zidovudina 38,46 38,46 38,4 38,4 Principio ativo

Efavirenz 38,46 38,46 38,4 38,4 Principio ativo

Croscarmelose Sódica 2,85 2,85 1,5 1,0 Desintegrante

Polivinilpirrolidona ----- ----- ----- 0,5 Agregante

Solução hidro-

alcoolica (1:1)

100

(gotejado)

100

(total)

100 100

ETAPA II

Estearato de Magnésio 1,0 1,0 1,0 1,0 Lubrificante

Dióxido de Silício

Coloidal

---- ---- 0,5 0,5 Desumidificante

Croscarmelose Sódica ---- ---- 1,0 1,0 Desintegrante

TOTAL 100 100 100 100

85

2.2.2 Técnica de Obtenção de Comprimidos

Com a finalidade de melhorar as características reológicas dos fármacos, requisito

necessário para alcançar o escoamento adequado durante a alimentação da máquina

compressora e no enchimento das matrizes de compressão (PRESCOTT & BARNM,

2000), todos os lotes de bancada foram obtidos utilizando-se a técnica de granulação por

via úmida. (MONTEIRO, 2000).

Foi produzido um granulado dos princípios ativos (Lamivudina, Zidovudina e

Efavirenz) – ETAPA I. A etapa de molhagem mostrou-se um ponto crítico do processo.

Mudou-se a forma de molhagem (vertendo a solução molhante aos poucos e toda de uma

vez) durante o processo a fim de obter-se uma massa coesiva. Após a passagem pelo

granulador oscilante, a massa foi submetida à secagem em estufa industrial (50°C por 1

hora e 30 min).

Na ETAPA II, o granulado seco foi calibrado, em seguida misturado com os demais

excipientes e submetido à compressão. Foram utilizados punções oblongos de 17 mm, na

obtenção dos lotes de bancada, de forma a se obter uma melhor homogeneidade da massa

de adjuvantes no comprimido, já que o aporte de fármacos no mesmo é muito alto.

A mudança realizada nos lotes de bancada I e II foi no processo, a forma com que a

massa foi molhada nos dois lotes foi diferente.

Os núcleos obtidos foram submetidos aos testes físico-químicos (Peso médio,

uniformidade de peso, dureza, friabilidade, desintegração, dissolução e doseamento).

O revestimento por película realizado utilizou-se o Opadry Y-1-7000 como

polímero disperso em sistema aquoso. O lote de bancada submetido aos testes de

revestimento foi o LB IV. Todos os parâmetros definidos para o processo de revestimento

foram controlados: temperatura de secagem (35 2°C), rotação da drageadeira (20 rpm),

distância da pistola de aspersão para o leito dos comprimidos (20 cm), pressão da bomba de

pulverização (3 Bar). A eficiência do revestimento foi avaliada pelas características

macroscópicas e pelo ganho de peso alcançado após o processo.

86

3 RESULTADO E DISCUSSÃO

3.1 Controle de qualidade físico-químico

Os resultados das matérias-primas dos fornecedores testados estão descritos nas

tabelas 2, 3 e 4.

Tabela 2: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da

matéria-prima zidovudina, (Northeast® lote: DY 070041)

Parâmetros Especificações (Farmacopéia Brasileira) Resultado

Caracteres físicos Pó branco ou acastanhado De acordo

Doseamento (CLAE) 98,0 a 102,0% 101,01%

Doseamento (espectrofotometria) 98,0 a 102,0% 100,79%

Perda por dessecação Máximo 1,0% 0,55%

Poder rotatório

Ponto de fusão

+ 60,5° a + 63,0° a 25°C

Aproximadamente 124°C

+ 61,5°

123°C

Solubilidade Levemente solúvel em água

Solúvel em etanol

De acordo

De acordo


lamivudina (Hangzhou® lote: 071208)

Parâmetros Especificações Resultado

Caracteres físicos Pó cristalino branco a branco-amarelado De acordo

Solubilidade Facilmente solúvel em água

Ligeiramente solúvel em metanol e

etanol

Insolúvel em acetona

Facilmente solúvel em HCl 0,1 M e

NaOH 0,1 M

De acordo

De acordo

De acordo

De acordo

Perda por dessecação Máximo 2,0 % (por Karl Fischer) 0,4%

Doseamento (espectrofotometria) 98,0 a 102,0% 100%


Faixa de fusão 176°C a 178°C 177,5 °C

Poder rotatório (25°C) -135° a –146° a 25 °C - 143,5 0º

87


efavirenz (Cristália®, lote: 1289/07)

Parâmetros Especificações (Farmacopéia Brasileira) Resultado

Caracteres físicos Pó cristalino,branco ou levemente

amarelado, inodoro

De acordo

Solubilidade Bastante solúvel em metanol e

diclorometano, insolúvel em água

De acordo

De acordo

Perda por dessecação Não mais que 1,5% 1,36%


Ponto de fusão 136-141°C 136°C

Poder rotatório -86,0° a –98,0° 25°C -86,0°

A verificação das características físicas (aparência, odor, pH da solução saturada e

ponto de fusão) é a primeira etapa na análise da qualidade das matérias-primas (AULTON,

2005). De acordo com as especificações para os três fármacos em estudos, descritos nas

tabelas acima, todos estavam em conformidade com os aspectos físicos específicos para

cada ativo. No entanto, sabe-se que a determinação do aspecto macroscópico sozinho não é

capaz de garantir a qualidade de qualquer substância farmacêutica, sendo necessário a

realização de testes analíticos adicionais que confirmem suas características e integridade.

A análise do teor de água, para zidovudina, seguiu o princípio termogravimétrico no

qual após o aquecimento, ocorre uma redução no peso inicial da substância em análise,

devido à volatilização da água (GENNARO, 2004). O equipamento utilizado foi o

analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena, sendo esta

responsável pelo aquecimento. Já para a lamivudina e para o efavirenz utilizou-se o método

titulométrico de Karl Fischer. Os três princípios ativos apresentaram teor de água dentro do

especificado.

A determinação do ponto de fusão corresponde a temperatura na qual a substância

em análise encontra-se totalmente fundida (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988) e

muitas vezes uma redução nesta constante pode caracterizar alteração na pureza ou

polimorfismo. Os três ativos apresentaram resultados em conformidade com as

especificações.

A determinação do poder rotatório é utilizada para estabelecer a identidade e a

pureza da substância, representando a sua capacidade de desviar o plano de luz polarizada

(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988). De acordo com o resultado obtido, AZT

88

apresenta-se como uma substância dextrógira, EFZ e 3TC levógiras, estando em

conformidade com as respectivas especificações.

Para quantificação do AZT e 3TC, foram utilizados dois métodos. O

cromatográfico, que por ser mais seletivo e específico detectaria a presença de possíveis

impurezas e substâncias de degradação. No entanto este tipo de análise requer maior tempo

e custo mais elevado, desde a preparação das amostras até a obtenção dos resultados. Como

alternativa, para redução do custo e tempo de análise, utilizou-se método

espectrofotométrico, que para 3TC já é farmacopéico e para AZT foi desenvolvido e

validado pelo LAFEPE®, agilizando o processo analítico de rotina. O teor dos fármacos,

por ambos os métodos, apresentavam-se dentro do limite especificado. O teor da efavirenz

determinado por CLAE também se apresentou dentro do limite especificado.

Através das análises físico-químicas realizadas foi possível verificar e garantir que a

matéria-prima utilizada no processo de desenvolvimento farmacotécnico industrial dos

comprimidos revestidos dose-fixa-combinada de zidovudina, lamivudina e efavirenz

apresentavam a qualidade requerida para produtos farmacêuticos. Além disso, a

caracterização dos ativos foi o passo inicial para o processo de qualificação de fornecedores

exigidos pela RDC n° 210, de 04 de Agosto de 2003 (ANVISA).

3.2 Desenvolvimento de comprimidos revestidos dose-fixa-combinada

Com base nas características físicas dos fármacos, já descritas na literatura e a

experiência do grupo no desenvolvimento de medicamentos anti-AIDS, a obtenção desse

comprimido pelo processo de Compressão Direta não foi possível ser realizada, sendo

necessário recorrer ao processo de Granulação por Via Úmida (LAVRA, 2006; FARIAS,

2006; VIANA, 2005).

Durante o processo de granulação por via úmida, a etapa de malaxagem mostrou-se

a mais crítica do processo de obtenção do comprimido de dose-fixa-combinada. Diferente

da maioria das granulações por via úmida, nesta a etapa de molhagem realizou-se vertendo

toda solução molhante de uma só vez na mistura de pós, pois observou-se que quando esta

molhagem é realizada aos poucos a massa apresenta-se muito seca. E em decorrência das

características apresentadas pelo fármaco efavirenz o volume da solução molhante é

89

limitado, pois se esse limite for excedido a massa toma rapidamente o aspecto de resina e

torna-se muito pegajosa, dificultando a etapa de granulação. O controle do volume de

molhagem e a modificação na forma de molhar a massa de pós possibilitaram a obtenção de

um granulado mais adequado para obtenção dos comprimidos.

Foram adotados parâmetros farmacopéicos para avaliação dos núcleos

comprimidos, os resultados estão descritos na tabela 5.

Tabela 5: Resultados do Controle físico-químico dos comprimidos obtidos

PARÂMETROS ESPECIFICAÇÃO LBI LBII LBIII LBIV

Peso Médio (mg) 800 mg 5% 780 794 799 801

Dureza (Kgf/cm2) > 8,0 6,8 9,5 14,1 13,2

Friabilidade (%) < 1,00 0,740 0,221 0,113 0,124

Desintegração (min) < 30 2,0 5,0 3,4 2,24

Teor (%) Entre 90 – 110

Efavirenz

Lamivudina

Zidovudina

90,4

98,3

96,7

90,5

98,6

96,5

93,1

98,7

97,96

95,5

99,29

97,88

Com base nos dados apresentados na tabela 5, observa-se que o lote de banca LB I

foi reprovado no parâmetro dureza, atribui-se esse fato ao processo de malaxagem, onde se

verteu a solução molhante aos poucos e pode-se observar que a massa apresentou aspecto

seco, o que dificultou a granulação e a compressão.

Otimizou-se o processo realizando a molhagem dos pós de maneira diferente,

verteu-se toda a solução molhante de uma só vez e foi observada uma melhora

significativa, obtendo-se um granulado com qualidade superior ao lote anterior e um

processo de compressão mais fácil, obtendo assim núcleos com dureza satisfatória.

Afim de facilitar o escoamento do granulado no momento da compressão adicionou-

se ao LBIII dióxido de silício coloidal. No entanto mesmo com a modificação no processo,

ainda observava-se a massa com aspecto seco. Então no LB IV, adicionou-se a formulação

PVP –K30, onde observou-se uma massa úmida mais uniforme.

Por apresentar melhores resultados e superfície mais homogênea e bem definida, o

lote de bancada LBIV foi submetida ao processo de revestimento. O revestimento utilizado

sistema aquoso – Opadry Y-1-7000 disperso em água, demonstrou-se simples e prático. A

90

disposição do polímero na superfície dos comprimidos foi homogênea e uniforme, sem

presença de falhas. O ganho de peso dos comprimidos revestidos, em relação aos núcleos

foi de 2,12%, dentro do recomendado para revestimento utilizando película, que é entre 2-

3%.

4 CONCLUSÕES

Todos os comprimidos obtidos das 4 (quatro) formulações testadas, apresentaram

resultados dentro das especificações farmacopéicas, exceto o LB I que apresentou dureza

abaixo do especificado. O lote de bancada LBIV obteve os melhores resultados, com

homogeneidade de conteúdo, peso e superfície bem definida, lisa e uniforme, o que

facilitou o processo de revestimento. O revestimento aquoso vem se demonstrando como

uma alternativa em relação ao revestimento orgânico, uma vez que se torna simples, rápido

e não há risco de impurezas residuais de solventes orgânicos. No entanto, serão necessários

mais estudos para avaliação da influência do tipo de sistema de dispersão utilizado

(orgânico ou aquoso) no processo de dissolução do comprimido dose-fixa-combinada, uma

vez que um dos fármacos presente na formulação (efavirenz) possui baixa solubilidade em

água, levando a problemas de disponibilidade do fármaco no meio.

É de grande interesse para o Programa DST-AIDS, do Ministério da Saúde-Brasil a

forma farmacêutica desenvolvida, comprimidos revestidos de dose-fixa-combinada, visto

que este projeto recebeu financiamento da FINEP para obtenção do medicamento que será

distribuído no referido Programa.

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AULTON, M. E. Delineamento de Formas Farmacêuticas. 2ª ed. Porto Alegre: Artmed,

p. 444-448, 2005.

BACK, D.J.; KHOO S.H. The role of clinical pharmacology in optimizing antiretroviral

therapy. British Journal of Clinical Pharmacology, v. 55, p. 473-476. 2003.

91

BRASIL, Resolução RDC n° 210, de 04 de Agosto de 2003 (DOU 14/08/03) -

Regulamento Técnico das Boas Práticas para a Fabricação de Medicamentos -

Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA .

FARIAS, S.R.Q.; LAVRA, Z.M. ; MEDEIROS, F. P. M.; ROLIM NETO, P. J. Uma Nova

Proposta Terapêutica para Tratamento da AIDS: da Monoterapia à Dose Fixa Combinada.

Revista Brasileira de Farmácia, v. 87, p. 92-97, 2006.

FARIAS, S.R.Q Desenvolvimento de Comprimidos Dose Fixa-Combinada Estavudina

40 mg + Lamivudina 150 mg + Nevirapina 200 mg para Tratamento de AIDS.

(Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco-UFPE, Recife. 2006.

FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 4ªed. São Paulo: Atheneu editora, 1988, parte I.

GENNARO, A. R. R. A Ciência e a Prática da Farmácia. 20ªed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, p.502 -503, 2004.

GULICK, R.M. New antiretroviral drugs. European Society of Clinical Microbiology

and Infectious Diseases, v. 9, p. 186-193. 2003.

KENNEY, K. B.; WRING, S. A.; CARR, R. M.; WELLS,G. N.; DUNN, J. A.

Simultaneous determination of zidovudine and lamivudine in human serum using HPLC

with tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.

22, p. 967–983, 2000.

LAFEPE. Memento Terapêutico. Recife: CEPE. 436p, 2006.

LAVRA, Z. M. M. Obtenção Tecnológica de Antiretroviral Dose-Fixa-Combinada à

base de Zidovudina, Lamivudina e Nevirapina. (Programa de Pós-graduação em

92

Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de

Pernambuco-UFPE, Recife. 2006.

LAVRA, Z. M. M; ROLIM NETO, P. J; SILVA, R. M. F.; MEDEIROS, F. P. M.

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para determinação simultânea de

lamivudina, zidovudina e nevirapina em comprimidos dose-fixa combinada por

cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, v. 31, n. 5, p. 969-974. 2008.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa Nacional de DST e AIDS. Disponível em:

<http://www.aids.gov.br/data/Pages/LUMISF7202394PTBRIE.htm>. Acesso em: 27 dez.

2008

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Recomendações para terapia Anti-retroviral em adultos e

adolescentes infectados pelo HIV 2006. Brasília, 2006.

MONTEIRO, D. B.; BRAGA, J. M. F.; ALBUQUERQUE, M. M.; STRATTMANN, R.;

SILVA, K. E. R.; ROLIM NETO, P. J. Desenvolvimento e validação do método analítico

de doseamento da matéria-prima lamivudina por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

Revista Brasileira de Farmácia, v.87, n. 4, p. 120-123. 2006.

MONTEIRO, V. C. S. Tecnologia de Obtenção de Anti-Retroviral à Base de Mesilato

de Nelfinavir. Dissertação (Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas).

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco-UFPE, Recife.

2005.

PRESCOTT, J. K.; BARNUM, R. Sobre a Fluidez de Pós. Pharmaceutical Technology,

dezembro, p. 16-30. 2000.

RIBEIRO, J. A. A.; CAMPOS, L. M. M.; ALVES, R. J.; LAGES, G. P.; PIANETTI, G. A.

Efavirenz related compounds preparation by hydrolysis procedure: Setting reference

http://www.aids.gov.br/data/Pages/LUMISF7202394PTBRIE.htm

93

standards for chromatographic purity analysis. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, v. 43, p. 298–303. 2007.

TURK, G.; MORONI, G.; PAMPURO, S.; BRIÑÓN, M. C.; SALOMÓN, H.

Antiretroviral activity and cytotoxicity of novel zidovudine (AZT) derivatives and the

relation to their chemical structure. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 20,

p. 282-288. 2002.

UNITED STATES PHARMACOPEIA CONVENTION. US Pharmacopeia 29, Validation

of Compendial Methods <1225>, Rockville, 2006.

VIANA, O.S. Desenvolvimento Tecnológico de Comprimidos Revestidos de

Lioberação Imediata e Modificada de Efavirenz-Anti-Retroviral (Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco-UFPE, Recife. 2005.

VIANA, O. S.; BENIGNO JUNIOR, J.; SILVA, R. M. F.; MEDEIROS, F. P. M.;

GRANGEIRO JUNIOR, S.; ALBUQUERQUE, M. M.; ROLIM NETO, P. J.

Desenvolvimento de formulações e tecnologia de comprimidos revestidos de efavirenz-

terapia anti-HIV. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n.4, p. 505-511.

2006.

94

Conclusões e Perspectivas

95

7 CONCLUSÕES

I - As matérias-primas analisadas apresentaram qualidade satisfatória e foram consideradas

adequadas para serem submetidas ao processo produtivo, uma vez que se apresentam

dentro das especificações estabelecidas de controle de qualidade.

II - As metodologias de degradação foram desenvolvidas e otimizadas. Evidenciou-se por

CCD os produtos de degradação formados quando os fármacos são submetidos às

hidrólises básica e ácida, os mesmos foram isolados por Cromatografia em Coluna “Flash”

e preparados para serem submetidos às Técnicas de RMN 1H, RMN

13C e IV.

III - O método analítico de quantificação desenvolvido por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência apresentou resultados satisfatórios para todos os quesitos avaliados por meio de

processo da validação.

IV - Diante dos resultados alcançados, pode-se garantir a obtenção da forma farmacêutica

comprimido revestido dose-fixa-combinada à base de zidovudina 300 mg, lamivudina 150

mg e efavirenz 300 mg com qualidade e confiabilidade, requisitos fundamentais no

desenvolvimento de um medicamento segundo as Boas Práticas de Fabricação e Controle

(BPFC), preconizados pelo órgão regulatório (ANVISA-MS).

96

8 PERSPECTIVAS

Realização do estudo de estabilidade utilizando as outras formas de estresse:

oxidação, fotólise e hidrólise neutra;

Realização do estudo de estabilidade dos fármacos associados;

Determinação da cinética de degradação dos fármacos;

Transposição de escala para produção industrial do comprimido desenvolvido;

Estudo de estabilidade da forma farmacêutica comprimido revestido, segundo a RE

01/2005 - ANVISA;

Estudos de Bioequivalência para os comprimidos revestidos;

Validação do método de dissolução para os comprimidos revestidos dose-fixa-

combinada.

97

Referências Bibliográficas

98

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

AULTON M.E. Pré-formulação farmacêutica. Delineamento de formas farmacêuticas. 2

ed. Porto Alegre: Artmed,. p. 677. 2005.

ANVISA, Resolução nº 899, de 29 de Maio de 2003. Agência Nacional de Vigilância

Sanitária, Poder Executivo, Brasília, DF, D.O.U. de 02 de jun de 2003.

BEDOR, D. C. G.; SOARES SOBRINHO, J. L; GRANJEIRO JÚNIOR; S.; ROLIM

NETO, P. J. Validação de Método Analítico. Controle de Contaminação, n. 68, p. 32-6.

2004.

FLORENCE, A. T.; ATTWOOD, D. Princípios Físicos-Químicos em Farmácia. São

Paulo: Editora da Universidade de São Paulo; 732 p., 2003

GOLDMAN, L.; BENNET, J. C.; Cecil tratado de medicina interna, 21a ed.,Guanabara

Koogan: Rio de Janeiro, 2001

LAURENT, C.; KOUANFACK, C.; KOULLA-SHIRO, S.; NKOUÉ, N.; BOURGEOIS,

A.; CALMY, A.; LACTUOCK,B.; NZEUSSEU, V.; MOUGNUTOU,R.; PEYTAVIN, G.

Effectiveness and safety of a generic fixed-dose combination of nevirapine, stavudine, and

lamivudine in HIV-1-infected adults in Cameroon: open-label multicentre trial. The

Lance, v. 364, p. 29-34. 2005.

NASH, D. & ELUL, B. The impact of HIV on cities in the era of treatment: A global

perspective. Techology in Society. n. 28, p. 195-223. 2006.

NOTARI, S.; BOCEDI, A.; IPPOLITO, G.; NARCISO, P.; PUCILLO, L. P.; TOSSINI, G.;

DONNORSO, R. P.; GASPARRINI, F.; ASCENZI, P. Simultaneous determination of 16

anti-HIV drugs in human plasma by high-performance liquid chromatography. Journal of

Chromatography B. v. 831, p.258-266. 2006.

99

REYNOLDS, D. W., FACCHINE, K. L., MULLANEY, J. F., ALSANTE, K. M.,

HATAJIK, T. D.,MOTTO, M. G. Available Guidance and Best Practices for Conducting

forced Degradation Studies. Pharmaceutical Technology, p.48 -56. 2002.

SOARES SOBRINHO, J. L.; NUNES, L. C. C.; ROCA, M. F.; GRANJEIRO JUNIOR, S.;

ROLIM NETO, P. J. Validação de Metodologias Analíticas no Mercado Farmacêutico:

Caso Paracetamol. Controle de Contaminação, n. 73, p. 35-41. 2005.

UNITED STATES PHARMACOPEIA CONVENTION; US Pharmacopeia 29,

Validation of Compendial Methods <1225>, Rockville, 2006.

WELLS J. Pré-formulação farmacêutica. In: Aulton ME, editor. Delineamento de Formas

Farmacêuticas. 2ª ed. Poto Alegre: Artmed; p.124-48, 2005.

WISSENT, V-V. et al. Simultaneous determination of the HIV nucleoside analogue reverse

transcriptase inhibitors lamivudine, didanosine, stavudine, zidovudine and abacavir in

human plasma by reversed phase high performance liquid chromatography. Journal of

Chromatography B, v. 816, p.121-129. 2005.

100

Anexos

Documents

OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO … · vi AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade