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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
ÓLEOS ESSENCIAIS E SEUS CONSTITUINTES PARA O
CONTROLE DE Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger:
VIAS DE EXPOSIÇÃO E RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS
ABRAÃO ALMEIDA SANTOS
2016
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
ABRAÃO ALMEIDA SANTOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E SEUS CONSTITUINTES PARA O CONTROLE DE
Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger: VIAS DE EXPOSIÇÃO E RESPOSTAS
COMPORTAMENTAIS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do
título de “Mestre em Ciências”.
Orientador
Prof. Dr. Leandro Bacci
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2016
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237o
Santos, Abraão Almeida.
Óleos essenciais e seus constituintes para o controle de
Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger: vias de exposição e
respostas comportamentais / Abraão Almeida Santos; orientador
Leandro Bacci. – São Cristóvão, 2016.
57 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Agricultura e Biodiversidade)–
Universidade Federal de Sergipe, 2016.
1. Essências e óleos essenciais. 2. Inseticidas. 3. Térmita. 4.
Pragas. I. Bacci, Leandro, orient. II. Título.
CDU 665.52/.54
ABRAÃO ALMEIDA SANTOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E SEUS CONSTITUINTES PARA O CONTROLE DE
Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger: VIAS DE EXPOSIÇÃO E RESPOSTAS
COMPORTAMENTAIS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do
título de “Mestre em Ciências”.
APROVADA em: 25 de Julho de 2016.
Prof. Dr. Marcelo da Costa Mendonça
UNIT
Prof. Dr. Paulo Fellipe Cristaldo
UFS
Prof. Dr. Leandro Bacci
UFS
(Orientador)
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
A todos que se dedicam na construção da educação em nosso país.
Dedico
AGRADECIMENTOS
Ao eterno pelo amor e esperança.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos.
A Universidade Federal de Sergipe (UFS), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do
Estado de Sergipe (FAPITEC) pelos auxílios financeiros.
Ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e Biodiversidade (PPGAGRI) pela
oportunidade de cursar o mestrado. Agradeço a coordenação, a equipe da secretaria e a todo
corpo docente.
À banca examinadora pela grande contribuição a esta dissertação.
Ao meu orientador Prof. Dr. Leandro Bacci pela amizade, convivência, ensinamentos,
correções e dedicação desde o meu primeiro período da graduação, muito obrigado por tudo! A
Prof. Drª. Ana Paula Albano Araújo por todo auxílio em minha formação acadêmica.
Ao Prof. Dr. Reginaldo Constantino (UnB) pela identificação da espécie Cryptotermes
brevis. Ao Herbário do Departamento de Biologia (UFS) pela identificação da espécie
Aristolochia trilobata.
Aos meus pais (Francisco e Marilene), a minha irmã (Maiume), a pequena Luisa e ao
Ricardo. Vocês são a melhor parte de mim! A todos os meus avós, tios (as) e primos (as).
A todos que compõem o laboratório Clínica Fitossanitária (UFS) pelos anos de
companheirismo e infinitos cafés! Agradeço ao Alisson, Ana Paula, Anderson, Ângela, Emile,
Lucas, Ruan, Victor e Wallace. Aos que passaram por aqui: Elânia, Fabiana, Felipe, Janaína e
Roseane. Aos amigos da graduação que continuaram nessa jornada: Alexandre, Ane Caroline,
Bia e Morgana - Obrigado por todo carinho e atenção! Ao Carlisson e a Bruna pelo carinho e
momentos de descontração.
Aos amigos por todo apoio nessa jornada! Vocês são essenciais, estando perto ou longe,
muito obrigado!
Ao Grupo de Pesquisa em Plantas Medicinais, Aromáticas e Condimentares (UFS).
Aos moradores do município de Pirambu –SE pelo auxílio na coleta do “milone”.
Agradeço a todos que gentilmente cederam suas peças de madeira para a retirada do
Cryptotermes.
Ao Prof. Dr. Marcelo Picanço e a todos seus estagiários do Laboratório de Manejo
Integrado de Pragas da Universidade Federal de Viçosa (UFV) pelo acolhimento no último
semestre do mestrado. Agradeço, em especial, a Arthur, Clébson, Elizeu, Iza, Júlia, Larine,
Miriam, Polyanna e Thiago.
Ao Programa de Mobilidade Acadêmica (PROCAD) pelos recursos para realização do
intercâmbio para UFV.
Agradeço por todo aprendizado que obtive nessa instituição de ensino. Essa
oportunidade me permitiu enxergar além do espaço onde nasci e cresci, e me fazem acreditar
que a educação é o principal caminho para mudança do meio onde estamos inseridos. Eu estou
apenas no início de uma longa jornada, mas aqui os meus primeiros passos foram dados.
Por fim, esta dissertação é fruto de um sonho individual executado coletivamente. Muito
obrigado a todos!
BIOGRAFIA
ABRAÃO ALMEIDA SANTOS, filho de Francisco Carlos Rocha Santos e Marilene
Conceição Almeida Santos, nasceu no dia 10 de outubro de 1991 em Itagibá – Bahia – Brasil.
No ano de 2008 formou-se técnico em agropecuária na Escola Agrotécnica Federal de
São Cristóvão (atual Instituto Federal de Sergipe). Em 2009 estagiou por sete meses no
Complexo Agroindustrial Taquari (Capela – Sergipe), ingressando no curso de Engenharia
Agronômica da Universidade Federal de Sergipe em 2010.
Durante a gradução foi bolsista de iniciação científica, inovação tecnológica e extensão
na área de entomologia, sob a orientação do professor Dr. Leandro Bacci. Em agosto de 2014
ingressou no curso de mestrado em Agricultura e Biodiversidade, defendendo sua dissertação
em julho de 2016. Nesse mesmo mês foi aprovado para o doutorado em Fitotecnia na
Universidade Federal de Viçosa.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... ii
RESUMO ......................................................................................................................... iii
ABSTRACT .................................................................................................................... iv
1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 5
2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 6
2.1. Aspectos gerais da biologia dos cupins ................................................................. 6
2.1.1. Kalotermitidae ................................................................................................. 7
2.1.2. Termitidae ........................................................................................................ 7
2.2. Status praga dos cupins .......................................................................................... 7
2.2.1. Cryptotermes brevis (Kalotermitidae) ............................................................. 8
2.2.2. Nasutitermes corniger (Termitidae) ............................................................... 8
2.3. Controle convencional dos cupins ......................................................................... 9
2.4. Óleos essenciais: alternativa para o manejo de cupins-praga................................ 9
2.5. Composição química dos óleos essenciais: terpenos ............................................ 10
2.6. Lippia sidoides (Verbenaceae) .............................................................................. 10
2.7. Gênero Aristolochia (Aristolochiaceae) ................................................................ 10
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 12
4.ARTIGO 1: VIAS DE EXPOSIÇÃO E EFEITOS SUBLETAIS DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Lippia sidoides E SEUS CONSTITUINTES A Cryptotermes brevis . 17
Resumo ............................................................................................................................. 17
Abstract ............................................................................................................................. 18
4.1. Introdução ................................................................................................................. 19
4.2. Material e Métodos ............................................................................................... 20
4.3. Resultados ............................................................................................................ 23
4.4. Discussão ............................................................................................................... 24
4.5. Conclusão .............................................................................................................. 26
4.6. Referências Bibliográficas .................................................................................... 27
Figuras e Tabelas ......................................................................................................... 30
5 ARTIGO 2: POTENCIAL INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia
trilobata E SEUS CONSTITUINTES CONTRA Nasutitermes corniger ........................ 38
Resumo ......................................................................................................................... 38
Abstract ........................................................................................................................ 39
5.1. Introdução ................................................................................................................. 40
5.2. Material e Métodos ............................................................................................... 41
5.3. Resultados ............................................................................................................ 44
5.4. Discussão .............................................................................................................. 44
5.5. Conclusão .............................................................................................................. 46
5.6. Referências Bibliográficas .................................................................................... 47
Figuras e Tabelas .......................................................................................................... 51
6. CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................................. 57
i
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
4.1 Constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia sidoides: (1) timol,
(2)ρ-cimeno e (3) trans-cariofileno ................................................................ 31
4.2 Curvas de sobrevivência e tempo letal médio (TL50) para Cryptotermes brevis
expostos ao óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários
por (A) aplicação tópica e (B) fumigação. ...................................................... 33
4.3 Comportamentos individuais de pseudergates de Cryptotermes brevis
expostos ao óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários
* indicam diferenças significativas em relação ao controle pelo teste de
Kruskal-Wallis a p < 0,05. Barras indicam os valores mínimo e máximo das
observações e ---- a média. ............................................................................. 34
4.4 Comportamentos coletivos de pseudergates de Cryptotermes brevis expostos
ao óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários *
indicam diferenças significativas em relação ao controle pelo teste de Kruskal-
Wallis a p < 0,05. Barras indicam os valores mínimo e máximo das
observações e ---- a média. ............................................................................. 35
4.5 (A) Distância percorrida e (B) velocidade de caminhamento (± erro padrão)
durante 10min de exposição individual e coletiva de pseudergates de
Cryptotermes brevis em arenas de papel filtro (9 cm de diâmetro) tratadas com o
óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários. * indicam
diferenças significativas dos tratamentos em relação ao controle pelo teste de
Dunnett a p <0,05... .......................................................................................... 36
4.5 Tempo de permanência (%) (± erro padrão) que pseudergates de Cryptotermes
brevis expostos por contato de forma (A) individual e (B) coletiva ao óleo
essencial de Lippia sidoides e seus constituintes majoritários permaneceram em
cada lado de arenas com chance de escolha. * indicam diferenças significativas
entre o tempo de permanência em cada área pelo teste de Fisher LSD a p < 0,05
........................................................................................................................ 36
5.1 Constituintes majoritários do óleo essencial de Aristolochia trilobata: (1) ρ-
cimeno, (2) limoneno, (3) linalol e (4) acetato de sulcatila... ......................... 52
5.2 Curvas de sobrevivência e tempos letais (TL50) do óleo essencial de
Aristolochia trilobata e seus constituintes para Nasutitermes corniger ao
longo de 48 de exposição por via de aplicação tópica. (Log Rank χ2 311,4;
GL = 5; P < 0,001)... ....................................................................................... 54
5.3 Tempo de permanência (%) de operários e soldados (± erro padrão) de
Nasutitermes corniger em arenas parcialmente tratadas com o óleo essencial de
Aristolochia trilobata e seus constituintes por 10 minutos de exposição. * indicam
diferenças significativas entre o tempo de permanência de cada lado da arena pelo
teste de Fisher LSD a p < 0,05... ....................................................................... 55
5.4 Trilhas representativas do movimento de operários (vermelho) e soldados (cinza)
de Nasutitermes corniger expostos ao óleo essencial de Aristolochia trilobata e
seus constituintes por 10 minutos em arenas parcialmente tratadas. O lado direito
da arena compreende a área tratada... ............................................................... 56
ii
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
4.1 Composição química do óleo essencial de Lippia sidoides analisado por CG-
EM e CG-DIC. ................................................................................................ 30
4.2 Toxicidade do óleo essencial de Lippia sidoides e seus constituintes sobre
Cryptotermes brevis em duas vias de exposição. ........................................... 32
5.1 Composição química do óleo essencial de Aristolochia trilobata (CG-EM e
CG-DIC). ........................................................................................................ 51
5.2 Doses letais do óleo essencial de Aristolochia trilobata e seus constituintes
para causar a mortalidade em 50 e 90% (±IC95%) da população de
Nasutitermes corniger após 48 horas de exposição por via de aplicação tópica
........................................................................................................................ 53
iv
RESUMO
SANTOS, Abraão Almeida. Óleos essenciais e seus constituintes para o controle de
Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger: vias de exposição e respostas
comportamentais. São Cristóvão: UFS, 2016. 58p. (Dissertação– Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade).*
Os cupins desempenham importantes papéis ecológicos nos ecossistemas terrestres
contribuindo positivamente para a manutenção desses sistemas naturais. Porém, apesar desta
importância, algumas espécies são consideradas pragas em ambientes urbanos e em cultivos
agrícolas e florestais. Nas áreas urbanas, as espécies Cryptotermes brevis (Kalotermitidae) e
Nasutitermes corniger (Termitidae) são destaque pelo seu ataque a estruturas e peças de
madeira, danificando estes materiais. O uso de inseticidas convencionais é o principal método
de controle destas pragas. Porém, os efeitos adversos da utilização destes produtos e a demanda
por outros com menor risco toxicológico tem motivado a realização de pesquisas com produtos
naturais. Assim, neste trabalho, avaliamos os efeitos letais e subletais dos óleos essenciais de
Aristolochia trilobata (Aristolochiaceae) e Lippia sidoides (Verbenaceae), e seus constituintes
majoritários sobre N. corniger e C. brevis, respectivamente. Os óleos essenciais e seus
constituintes foram tóxicos a N. corniger e C. brevis. Estes tratamentos alteraram os
comportamentos e o caminhamento dos cupins, além de apresentar efeito repelente. A partir
destes resultados temos fortes evidências que os óleos essenciais de A. trilobata e L. sidoides,
e seus constituintes majoritários poderão ser utilizados em estratégias de controle de forma
substitutiva e/ou complementar de N. corniger e C. brevis.
Palavras-chave: inseticidas botânicos, Isoptera, terpenos, comportamento animal.
___________________
* Comitê Orientador: Leandro Bacci – UFS (Orientador), Ana Paula Albano Araújo – UFS.
v
ABSTRACT
SANTOS, Abraão Almeida. Essential oils and its constituents for the control of Cryptotermes
brevis and Nasutitermes corniger: routes of exposure and behavioral responses. São Cristóvão:
UFS, 2016. 79p. (Master of Science in Agriculture and Biodiversity).*
Termites display a key role in the terrestrial ecological ecosystems by positively contributing
to maintenance of these ecosystems. However, despite this importance, some species are known
as urban, forests, and agriculture pests. At urban areas, Cryptotermes brevis (Kalotermitidae)
and Nasutitermes corniger (Termitidae: Nasutitermitinae) species are because of its attack to
structure and wood pieces, causing a high damage to those materials. The use of conventional
insecticide is the main control method for these pests. However, the adverse effects in the use
of these products, and the demand for others with lower toxicological risks have been
motivating the realization of research with natural products. Thus, in this study, we evaluate the
lethal, and sub lethal effects of Aristolochia trilobata (Aristolochiaceae) and Lippia sidoides
(Verbenaceae) essential oils, and their major compounds under N. corniger and C. brevis,
respectively. The essential oils and its compounds were toxic to N. corniger and C. brevis.
These treatments reduced the behaviour and walking of termites, as well showed repellent
effect. From these results, we have strongly evidences that A. trilobata and L. sidoides, as well
as their constituints could be used in control strategies, on a substitute and/or complimentary
way, of N. corniger and C. brevis.
Key-words: botanical insecticides, Isoptera, terpenes, animal behavior.
___________________
* Supervising Committee: Leandro Bacci – UFS (Orientador), Ana Paula Albano Araújo – UFS.
5
1. INTRODUÇÃO GERAL
Os cupins são importantes organismos pragas no ambiente agrícola e urbano. Entre os
diversos métodos para o seu controle, o químico é o mais habitual. Os inseticidas empregados
para o controle dos cupins são eficientes, mas os efeitos adversos causados pela sua aplicação
indiscriminada têm gerado uma demanda por novos produtos com menor risco toxicológico aos
organismos não alvos e ao ambiente de exposição.
Os óleos essenciais, produzidos pelo metabolismo secundário das plantas, bem como
seus constituintes têm sido avaliados como uma altenativa substitutiva e/ou complementar para
o controle de insetos pragas. Neste contexto, devido a importância dos cupins nos ambientes
urbanos, os problemas ocasionados pelos inseticidas utilizados e a carência de estudos sobre
formas alternativas de controle para estes insetos, é importante dispor de novas moléculas para
o seu controle.
Assim, nesta dissertação, avaliamos a toxicidade e os efeitos subletais de dois óleos
essenciais e seis constituintes para duas espécies de cupins-praga.
No primeiro capítulo, determinamos a toxicidade do óleo essencial de Lippia sidoides e
seus constituintes majoritários sobre o cupim de madeira seca Cryptotermes brevis. Neste
estudo nós avaliamos a toxicidade destes compostos em duas vias de exposição (tópica e
fumigação), determinamos o tempo letal para causar mortalidade em 50% da população
estudada e observamos os comportamentos e o caminhamento dos cupins em função da
aplicação do óleo essencial de L. sidoides e seus majoritários.
Já no segundo capítulo, avaliamos a toxicidade do óleo essencial de Aristolochia
trilobata e seus constituintes majoritários sobre o cupim arborícola Nasutitermes corniger.
Além das doses e tempos letais, determinamos como as castas que atuam no forrageamento
(operários) e defesa da colônia (soldados) respondem à aplicação desses tratamentos em arenas
parcialmente tratadas.
Esperamos que as informações geradas neste estudo possam contribuir para o manejo
de cupins-praga em ambientes urbanos a partir do emprego dos óleos essenciais e seus
constituintes de forma substitutiva e complementar.
6
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Aspectos gerais da biologia dos cupins
Os cupins são insetos sociais pertencentes à ordem Blattodea infraordem Termitoidea,
contendo aproximadamente 3000 espécies descritas (KRISHNA et al., 2013). Nove famílias
compõem a infraordem Termitoidea: Mastotermitidae, Hodotermitidae, Archotermopsidae,
Hodotermitidae, Stolotermitidae, Kalotermitidae, Stylotermitidae, Rhinotermitidae,
Serritermitidae e Termitidae (ENGEL; GRIMALDI; KRISHNA, 2009; KRISHNA et al.,
2013). As oito primeiras famílias compreendem as espécies as mais basais (próximas ao
ancestral), enquanto que a família Termitidae, as espécies mais derivadas.
Cupins são considerados insetos verdadeiramente sociais, onde os indivíduos vivem em
colônias organizadas em castas (KORB, 2005). Este sistema de castas resulta em uma divisão
de trabalho, onde cada indivíduo possui uma função específica na colônia. O casal real (rei e
rainha) são os únicos indivíduos reprodutores, mas podem ser substituídos por reprodutores
secundários (neotênicos) (COSTA-LEONARDO, 2002). Já os operários forrageiam em busca
do recurso alimentar, cuidam dos indivíduos imaturos e alimentam as demais castas (soldados
e casal real) através do comportamento de trofolaxia (COSTA-LEONARDO, 2002). Os
soldados, por sua vez, possuem modificações na sua morfologia que permitem a defesa da
colônia de forma física e/ou química (ŠOBOTNÍK; JIROŠOVÁ; HANUS, 2010).
O número de indivíduos nas colônias de cupins é variável em função do recurso
alimentar utilizado. Por exemplo, espécies que utilizam o próprio ninho como fonte de alimento,
denominado de peça única (one piece), contém no máximo 1000 indivíduos (ex.: Cryptotermes
brevis) (COSTA-LEONARDO, 2002). Já nas espécies em que o recurso alimentar distingue-se
do ninho, denominados de peças múltiplas (multiple piece), o número de indivíduos pode
chegar a 900.000 (ex.: Nasutitermes corniger) (THORNE, 1984).
A comunicação entre os indivíduos das colônias de cupins ocorre de forma diversificada
e envolve sinalizações químicas e físicas. De forma química, os semioquímicos permitem aos
cupins identificar o ataque à colônia (ex. feromônio de alarme) (CRISTALDO et al., 2015) e
trilhas para o recurso alimentar (ex.: feromônio de trilha) (COSTA-LEONARDO; CASARIN;
LIMA, 2009). Já a presença de hidrocarbonetos na cutícula dos cupins é uma importante forma
de reconhecimento de indivíduos de mesma colônia (HAVERTY et al., 2005). Este
reconhecimento ocorre através do comportamento de antenação e impede a ação de parasitas
(COSTA-LEONARDO; CASARIN; LIMA, 2009; ŠOBOTNÍK; JIROŠOVÁ; HANUS, 2010).
De forma física vibrações corporais e batidas de cabeça sob o solo, por exemplo, são utilizadas
para sinalizações de alarme atuando de forma conjunta com o feromônio liberado na colônia
para tal processo (CRISTALDO et al., 2015; DELATTRE et al., 2015).
Os cupins apresentam estratégias ativas e passivas para se defender dos possíveis
predadores e parasitas (ŠOBOTNÍK; JIROŠOVÁ; HANUS, 2010). As estratégias ativas são
representadas pelas modificações morfológicas e químicas na casta dos soldados e a sinalização
de alarme liberada para a colônia. A cooperação dos operários na reconstrução do ninho
também é uma importante estratégia ativa de defesa (CRISTALDO et al., 2015; SANTOS;
COSTA-LEONARDO, 2006; ŠOBOTNÍK; JIROŠOVÁ; HANUS, 2010). O forrageamento a
partir de túneis protege os cupins de possíveis predadores, constituindo assim em um elemento
passivo de defesa (NOIROT; DARLIGTON, 2000).
A alimentação dos cupins é baseada no consumo da celulose em diferentes gradientes
de decomposição (LIMA; COSTA-LEONARDO, 2007). Em razão desse hábito alimentar, os
cupins desempenham importante papel nos ecossistemas terrestres como a criação de núcleos
de vegetação (BONACHELA et al., 2015) e decomposição da madeira em ambientes naturais
(ULYSHEN, 2016). Além do que, pela sua eficiente digestão da celulose, eles também são
utilizados como modelos enzimáticos para hidrólise desses recursos (LUCENA et al., 2011).
7
2.1.1 Kalotermitidae Os cupins da família Kalotermitidae, também conhecidos como cupins de madeira seca,
vivem em colônias pouco numerosas (< 1000 indivíduos) formadas internamente em peças de
madeira com umidade inferior a 30% (COSTA-LEONARDO, 2002; KORB; SCHMIDINGER,
2004). Suas castas são representadas pelo casal real, pseudergates, soldados e reprodutores
secundários (alados e neotênicos) (COSTA-LEONARDO, 2002). O casal real tem função
exclusiva de reprodução da colônia. Os pseudergates (falsos operários) são assim denominados
por serem totipotentes. Essa totipotência permite a estes indivíduos se desenvolver em soldados
e neotênicos (KORB; SCHNEIDER, 2007). Tal fato ocorre porque os pseudergates podem
realizar as três formas de mudas: i) progressivas – desenvolvimento gradual até a fase adulta;
ii) estacionárias – mudas sem modificações no tamanho do corpo e/ou na sua morfologia; e iii)
regressivas – mudas com decréscimos no tamanho do corpo e/ou na sua morfologia (KORB;
HOFFMANN; HARTFELDER, 2009). Os soldados dessa família possuem uma cabeça com
formato fragmótico, o que lhes permite fechar a entrada do ninho. Por esta característica eles
são conhecidos como ‘cupins tampas vivas’ (COSTA-LEONARDO, 2002). Já os indivíduos
alados (reprodutores) são formados quando as colônias alcançam longo tempo de nidificação
ou quando o recurso alimentar se torna escasso (KORB; SCHMIDINGER, 2004). Porém, esses
reprodutores secundários permanecem na colônia até o período da revoada. Entre as espécies
contidas nesta família as do gênero Cryptotermes são destaque pelo potencial praga nos
ambientes urbanos (SCHEFFRAHN et al., 2009).
2.1.2 Termitidae
A família Termitidae abriga aproximadamente 1900 espécies de cupins. Esta é a família
mais numerosa dentro da infraordem Termitoidea (KRISHNA et al., 2013). Suas castas são
compostas pelo casal real, operários, soldados e reprodutores secundários. Diferentemente da
família Kalotermitidae, os operários de Termitidae são verdadeiros operários. Eles são estéreis
e tem como função a busca do recurso alimentar e alimentação das demais castas. Os soldados
dessa família possuem uma cabeça em formato de naso, e realizam a defesa da colônia através
de substância químicas (ex. terpenos) produzidas pela glândula frontal (SANTOS; COSTA-
LEONARDO, 2006; ŠOBOTNÍK; JIROŠOVÁ; HANUS, 2010). As colônias da família
Termitidae são numerosas podendo conter até 900.000 indivíduos. Assim, por este aspecto os
cupins desta família, especialmente do gênero Nasutitermes tem sido considerado uma
importante praga nos ambientes urbanos (SCHEFFRAHN et al., 2014).
2.2 Status praga dos cupins
Devido ao hábito alimentar dos cupins ser baseado em recursos celulósicos, estes são
relatados como pragas nos ambientes agrícolas e urbanos. Esta mudança de status está associada
à substituição dos ambientes naturais por culturas agrícolas, florestais e construções urbanas
(CONSTANTINO, 2002). Entre as nove famílias descritas na infraordem Termitoidea, cinco
possuem relato de espécies pragas, sendo estas: Rhinotermitidae, Termitidae, Hodotermitidae,
Mastotermitidae e Kalotermitidae (RUST; SU, 2012). Na América do Sul cerca de 77 espécies
de cupins são relatadas como pragas sendo que entre estas 40 são pragas estruturais
(CONSTANTINO, 2002).
Nos últimos anos, os cupins-praga têm despertado a atenção para o seu controle nos
ambientes urbanos devido aos danos irreversíveis causado pelo seu ataque a estruturas e peças
de madeira. Em prédios históricos, como museus e bibliotecas, a presença deste grupo de praga
pode significar uma perda não apenas material, mas também imaterial dos acervos
(ALBUQUERQUE et al., 2012).
A situação de controle dos cupins se complica porque não existem níveis de dano
econômico para as espécies. Este nível de dano relaciona à densidade populacional na qual o
prejuízo causado pelo inseto excede o custo de seu controle, sendo esta estimativa uma
importante ferramenta para a implementação do manejo integrado (RUST; SU, 2012). A
8
dificuldade em estabelecer estes níveis para os cupins ocorre porque os custos em razão do dano
causado pelas espécies, bem como os riscos à saúde e ao ambiente pelos métodos de controle
utilizados são difíceis de serem estimados (RUST; SU, 2012). Isto pode explicar a ausência de
estimativas para os prejuízos causados pelas espécies de cupins e a importância de cada uma
em relação ao status praga (CONSTANTINO, 2002; RUST; SU, 2012). E a utilização
indiscriminada de inseticidas, pois o nível de controle para este inseto é baseado apenas na sua
presença.
2.2.1 Cryptotermes brevis (Kalotermitidae)
Cryptotermes brevis é uma espécie originária dos desertos costeiros do Chile e Peru
(SCHEFFRAHN et al., 2009). Suas colônias ocorrem internamente em madeira seca e sua
infestação apenas é percebida quando os grânulos fecais são excretados dessas estruturas, sendo
estes grânulos utilizados para fechar galerias inativas (COSTA-LEONARDO, 2002).
As colônias de C. brevis são pouco numerosas podendo chegar até 1000 indivíduos ao
longo de dez anos (COSTA-LEONARDO, 2002). Suas castas são compostas por reprodutores
(rei, rainha e neotênicos), soldados e pseudergates. Os reprodutores alados têm dois pares de
asas membranosas e suas antenas possuem um comprimento de 6 mm contendo de 16 a 18
segmentos. Já os soldados possuem antenas com 13 segmentos e o comprimento do seu corpo
varia de 4-5 mm. Esta casta defende a colônia através da sua cabeça que tem um formato
fragmótica permitindo fechar a entrada do ninho. Por este fato, os soldados de C. brevis são
conhecidos como “cupins tampas vivas” (COSTA-LEONARDO, 2002).
Os pseudergates de C. brevis são assim denominados por terem comportamento
funcional como operários. Esta casta é responsável pela alimentação de toda a colônia, retirando
o recurso alimentar através da escavação de galerias dentro do próprio ninho (COSTA-
LEONARDO, 2002). Os pseudergates de C. brevis são totipotentes e podem se desenvolver
em soldados e reprodutores de substituição (neotênicos) (KORB; SCHNEIDER, 2007). Essa
flexibilidade de desenvolvimento ocorre porque os pseudergates podem realizar três tipos de
mudas, sendo estas: i) progressivas – desenvolvimento gradual até a fase adulta; ii) estacionárias
– mudas sem modificações no tamanho do corpo e/ou na sua morfologia; e iii) regressivas –
mudas com decréscimos no tamanho do corpo e/ou na sua morfologia (KORB; HOFFMANN;
HARTFELDER, 2009).
Por formar suas colônias internamente em estruturas de madeira, e devido à alta taxa de
dispersão através do comércio mundial da madeira, C. brevis é classificada como praga
cosmopolita, ocorrendo principalmente em regiões neotropicais (SCHEFFRAHN et al., 2009).
O ataque dessa espécie a estruturas e peças históricas é um fator preocupante pois além do dano
material, a perda pelo dano imaterial é irreversível (ALBUQUERQUE et al., 2012).
2.2.2 Nasutitermes corniger (Termitidae)
Nasutitermes corniger é uma espécie nativa da América Central e do Sul
(CONSTANTINO, 2002), no entanto, sua ocorrência, já foi relatada nos Estados Unidos
(SCHEFFRAHN et al., 2002), Nova Guiné (SCHEFFRAHN et al., 2005) e Bahamas
(SCHEFFRAHN et al., 2006). As colônias desta espécie são numerosas contendo de 50.000 a
900.000 indivíduos (THORNE, 1984).
As castas de N. corniger são compostas por reprodutores (rei, rainha e alados), soldados
e operários. Os reprodutores alados medem cerca de 9 cm e são produzidos todos os anos pelas
colônias quando estão maduras. O rei e a rainha ocorrem em números variáveis nas colônias
(poligenia e poliandria) (COSTA-LEONARDO, 2002). A rainha das espécies de Nasutitermes
possuem um abdômen do tipo fisiogástrico, sendo constatada uma correlação positiva entre o
seu tamanho e a produção de ovos (BUSCHINI; LEONARDO, 1999).
Os soldados, responsáveis pela defesa, constituem 20% das colônias de N. corniger
(THORNE, 1984). Suas cabeças possuem uma modificação morfológica e apresentam um
formato arredondado com a ponta proeminente denominada de naso. Dentro da cabeça dos
9
soldados existe uma glândula frontal que produz substâncias químicas (ex.: terpenos) utilizadas
para a defesa (SANTOS; COSTA-LEONARDO, 2006). Em espécies de Nasutitermes os
soldados também podem atuar na busca e localização do recurso alimentar (ALMEIDA et al.,
2016). A casta de operários, presentes em maior proporção que a casta dos soldados, são
responsáveis pelos cuidados com as fases jovens, alimentação das demais castas e
forrageamento (COSTA-LEONARDO, 2002).
Devido à perda e alteração dos ambientes naturais N. corniger tem se tornado uma
importante praga, principalmente em ambientes urbanos. Nesses ambientes a espécie é
considerada uma praga voraz pela diversidade e abundância de enzimas no aparelho digestivo
dos operários e soldados (LIMA et al., 2014).
2.3 Controle convencional de cupins
As primeiras formas de controle dos cupins consistiam na utilização de iscas-armadilhas
seguidas de aplicação de inseticidas formulados em pó, e através do emprego de barreiras
químicas no solo com inseticidas organofosforados e organoclorados (CROPPER et al., 1992).
Atualmente existe uma diversidade de estratégias para o controle de cupins nos ambientes
agrícolas e urbanos.
A resistência de diversas espécies de madeiras tem sido avaliada para seleção e
adequação do material a indústria dos móveis (GONÇALVES; OLIVEIRA, 2006; RIBEIRO et
al., 2014). Outros estudos demonstraram que a imersão das peças infestadas em água a alta
temperatura, congelamento, aquecimento controlado e o emprego de micro-ondas resultam na
eliminação das colônias (QUERNER, 2015; WOODROW; GRACE, 1998). A remoção de
túneis e ninhos mecanicamente é utilizada como uma estratégia de controle. No entanto, a
remoção dessas estruturas não elimina a praga e por outro lado podem favorecer a dispersão
dos alados (COSTA-LEONARDO, 2002).
A utilização de inseticidas, seja por injeção direta sobre o material atacado e em galerias
e de forma preventiva à colonização (SCHEFFRAHN et al., 2001; WOODROW; GRACE;
OSHIRO, 2006; WOODROW; GRACE, 2007), ou pela utilização de agentes fumigantes (ex.:
dióxido de carbono, fluoreto de sulfurilo e fosfina) em ambientes fechados (VERMA;
SHARMA; PRASAD, 2009), tem demonstrado eficiência no controle desses insetos, sendo a
sua principal forma de controle. O emprego de iscas inseticidas, principalmente para os cupins
de solo, também são usadas no controle das espécies (EVANS; IQBAL, 2015). Neste contexto
de controle, acredita-se que atualmente sejam gastos em torno de 40 bilhões de dólares por ano
(RUST; SU, 2012).
Como a forma química se tornou a principal forma de controle dos cupins, sua excessiva
utilização de forma indiscriminada tem resultado em diversos problemas como lenta
degradação, contaminação de residências, transferência de toxinas de áreas tratadas para não-
tratadas, e inclusive danos sobre as peças históricas (HOAG, 2004; QUERNER, 2015;
SCHUMMER et al., 2010; VERMA; SHARMA; PRASAD, 2009).
Assim, embora o uso de inseticidas convencionais seja eficaz no controle dos cupins,
seus efeitos adversos sobre organismos não alvos e ao ambiente, implica na necessidade de
utilização de novos inseticidas que sejam ambientalmente seguros e de baixo risco toxicológico
para espécies não alvos (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012).
2.4 Óleos essenciais: alternativa para manejo de cupins-praga
As substâncias botânicas, por muito tempo, foram os principais compostos utilizados
para o controle de pragas. Porém, com o surgimento dos inseticidas organofosforados,
organoclorados e carbamatos, reduziu-se a utilização desses compostos (ISMAN;
GRIENEISEN, 2014). No entanto, a partir das discussões sobre os riscos provenientes do uso
indiscriminado destes pesticidas e da descoberta do potencial inseticida das sementes de
Azadirachta indica, houve um aumento no número de estudos e na utilização dos compostos
botânicos (ISMAN, 2006).
10
É recomendado que os produtos a serem utilizados no manjo de cupins-praga devem ser
de baixa persistência e toxicidade a organismos não-alvos (SU; SCHEFFRAHN, 1998). Neste
contexto, óleos essenciais têm sido apontados como substâncias alternativas para o manejo dos
cupins-praga (BACCI et al., 2015).
Os óleos essenciais são constituídos por uma mistura de substâncias envolvendo álcoois,
terpenos, compostos nitrogenados e oxigenados (ISMAN, 2006). Seu potencial inseticida tem
sido demonstrado para diversas espécies de cupins como: Amitermes cf. amifer e
Microcerotermes indistinctus (BACCI et al., 2015), Cryptotermes brevis (SBEGHEN-LOSS et
al., 2011), Coptotermes formosanus (CHENG et al., 2014), Coptotermes gestroi; Coptotermes
curvignathus (ABDULLAH et al., 2015), Nasutitermes corniger (LIMA et al., 2013) e
Reticulitermes speratus (SEO et al., 2014).
2.5 Composição química dos óleos essenciais: terpenos
A ação biológica dos óleos essenciais é atribuída aos compostos presentes em maiores
percentuais, denominados de majoritários. Porém, sabe-se que efeitos sinergistas, antagonistas
e ou de aditismo podem ocorrer entre os seus constituintes (TAK; JOVEL; ISMAN, 2015).
Dentro da diversidade química dos compostos presentes nos óleos essenciais (ex.:
álcoois, compostos nitrogenados, entre outros), os terpenos são os constituintes mais comuns
(ISMAN, 2006). Esse grupo é formado pela fusão de unidades de isoprenos (C5H8)n e de acordo
com o número dessas unidades, são classificados em monoterpenos (10 C), sesquiterpenos (15
C), diterpenos (20 C) e triterpenos (30 C) (TAIZ; ZEIGER, 2013). A toxicidade desta classe de
compostos tem sido frequentemente avaliada sobre diversos organismos pragas como ácaros,
insetos e nematóides (ARAÚJO et al., 2012; FARIA et al., 2013; PEIXOTO et al., 2015).
Assim, os terpenos presentes nos óleos essenciais podem ser uma alternativa para o controle de
cupins-praga.
2.6 Lippia sidoides (Verbenaceae)
O alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham. Verbenaceae) é uma planta nativa do bioma
da Caatinga com hábito de crescimento arbustivo e ciclo perene (LORENZI; MATOS, 2002).
O óleo essencial extraído de suas folhas é rico em compostos terpênicos, principalmente mono
e sesquiterpenos, com rendimento variando de 1,8 a 6,8% (FARIAS-JUNIOR et al., 2012;
FUNARI et al., 2012; LIMA et al., 2011).
Essas variações de rendimento e composição química decorrem devido à influência de
fatores bióticos (ex.: cultivar, partes extraídas, época de colheita) e abióticos (ex.: método de
extração, origem da planta) (FIGUEIREDO et al., 2009; SANTOS et al., 2015). Pela ampla
utilização na indústria de cosméticos na forma de cremes, perfumes, loções e desodorantes, o
óleo essencial de L. sidoides possui alto valor econômico sendo produzido em escala comercial
(BOTELHO et al., 2007).
Diversas atividades foram relatadas para o óleo essencial de L. sidoides, como acaricida,
antiinflamatória, bactericida e inseticida (BACCI et al., 2015; BOTELHO et al., 2016; DE
OLIVEIRA et al., 2014; GOMES et al., 2014). Essas atividades são atribuídas, principalmente,
aos majoritários carvacrol e timol, que avaliados isoladamente apresentaram atividade
acaricida, antimicrobiana, farmacológica e inseticida semelhante a este óleo essencial (CRUZ
et al., 2013; EL-SAYED et al., 2015; MITH et al., 2014; TABANCA et al., 2013).
2.7 Gênero Aristolochia (Aristolochiaceae)
O gênero Aristolochia possui mais de 100 espécies descritas no Brasil. Sua presença é
significativa em zonas de restinga, terrenos sombreados e levemente úmidos (NASCIMENTO;
CERVI; GUIMARÃES, 2010). As espécies deste gênero são amplamente utilizadas na
medicina popular por sua ação antiinflamatória, antiasmática, antidiarreica, antisséptica entre
outras (MESSIANO et al., 2008). Estas atividades estão associadas à diversidade química de
compostos encontrados na parte aérea, caule e raiz das espécies (MESSIANO et al., 2008).
11
Entre os compostos químicos presentes nas espécies de Aristolochia, o ácido
aristolóquico despertou o interesse da comunidade científica devido aos efeitos nefrotóxicos
causados por medicamentos à base dessas espécies (NORTIER et al., 2000). Recentemente foi
elucidado que quando metabolizado, esse ácido reage com o DNA concentrando-se no córtex
renal causando lesões (CHEN et al., 2012). Contudo, a ocorrência deste composto é variável,
podendo não ser encontrado em todas as espécies.
O potencial inseticida das espécies do gênero Aristolochia foi avaliado sobre Anticarsia
germatalis (MESSIANO et al., 2008; NASCIMENTO et al., 2004), Atta sexdens; Acromyrmex
balzani (OLIVEIRA, 2015), Sitophilus zeamais (RAUSCHER et al., 2001), Spodoptera litura
(BASKAR et al., 2011) e Tribolium castaneum (JBILOU et al., 2008). Assim, tendo em vista a
importância e diversidade química de Aristolochia, a atividade biológica dos seus constituintes
deve ser avaliada com intuito de possibilitar sua utilização para espécies- praga, incluindo a sua
utilização como modelo para formulação futura de novos pesticidas.
12
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17
4. ARTIGO 1: VIAS DE EXPOSIÇÃO E EFEITOS SUBLETAIS DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Lippia sidoides E SEUS CONSITUINTES A Cryptotermes brevis
Periódico a ser submetido: Applied Entomology and Zoology
RESUMO
O cupim de madeira seca Cryptotermes brevis é uma das mais importantes pragas estruturais.
As perdas ocasionadas pelo seu ataque são agravadas pela dificuldade de localização e controle
das suas colônias. Substâncias do metabolismo secundário das plantas (ex.: óleos essenciais)
têm sido consideradas uma forma de controle ambientalmente mais segura para pragas urbanas
como os cupins. Neste trabalho, nós avaliamos a toxicidade e as alterações comportamentais e
de caminhamento de pseudergates de C. brevis tratados com o óleo essencial de Lippia sidoides
e seus componentes majoritários por meio de aplicação tópica e fumigação. O óleo essencial de
L. sidoides e o timol foram os tratamentos mais tóxicos a C. brevis quando aplicados
topicamente (DL50 = 9,33 e 8,20 µg.mg-1, respectivamente) e por fumigação (CL50 = 9,10 e
23,66 µL L-1, respectivamente). Os tratamentos reduziram a sobrevivência de C. brevis ao longo
do tempo de exposição com menores tempos letais para a via de fumigação. Os comportamentos
e o caminhamento, individual e coletivo, de pseudergates de C. brevis foram alterados em
função da aplicação dos tratamentos. Assim, o óleo essencial de L. sidoides e seus componentes
têm potencial para aplicação em estratégias de controle deste cupim-praga, já que além da ação
tóxica em duas vias de exposição, estas substâncias apresentaram efeitos sobre o
comportamento e o caminhamento importantes para a coesão das colônias de C. brevis.
Palavras-chave: Isoptera, inseticidas botânicos, terpenos, comportamento coletivo.
18
ABSTRACT
The drywood termite Cryptotermes brevis is one of the most important structural and
cosmopolitan pests. Losses provoked by termite attacks are increase by the difficult to localize
their colonies as well by control them. Substances from the secondary metabolism of high plants
(eg.: essential oils) have been suggested as a most environmental secure form of urban pests
control, such as termites. In this study, we tested the toxicity and the behaviors changes of C.
brevis treated with Lippia sidoides essential oil and its majors compounds by topic application
and fumigation. Essential oil L. sidoides and thymol were the most toxic treatments to C. brevis
when exposed to topic application (LD50 = 9.33 and 8.20 µg.mg-1, respectively) and by
fumigation (LC50 = 9.10 e 23.66 µL L-1, respectively). Treatments reduced the survival of C.
brevis over exposure time, with lower lethal time to fumigation application. Behaviour and
walking, in both individual and group treatments of C. brevis, were altered by the application.
Thus, L. sidoides essential oil and its compounds has potential for application in control
strategies for this pest termite, once besides the toxic action by both routes of exposure, these
substances reduced the interactions between individuals, displaying significant behavioural
effects.
Key-words: Isoptera, botanical insecticides, terpenes, collective behavior.
19
4.1. INTRODUÇÃO
A capacidade de degradação e utilização da celulose, como recurso alimentar, torna os
cupins uns dos principais agentes na ciclagem dos materiais derivados de plantas (Korb 2005).
Nos ambientes terrestres tropicais e subtropicais, estes insetos podem consumir cerca de um
terço da produção anual de madeira morta (Ulyshen 2016), sendo assim, um importante grupo
para o funcionamento dos ecossistemas. Porém, em ambientes urbanos, algumas espécies são
consideradas pragas devido à deterioração de estruturas de madeira seca (ex. utilizadas na
construção civil e fabricação de móveis), o que causa danos irreparáveis, inclusive ao
patrimônio histórico (Constantino 2002).
Dentre tais espécies, Cryptotermes brevis (Walker, 1853) (Kalotermitidae) é uma das
mais importantes pragas estruturais (Constantino 2002; Scheffrahn et al. 2009) que nidifica em
madeira seca. As perdas ocasionadas por C. brevis são agravadas pela dificuldade de
localização e controle das colônias destes insetos (Woodrow et al. 2006; Neoh et al. 2014).
Estruturas infestadas por C. brevis normalmente apresentam poucos sinais externos indicativos
do ataque e podem conter várias pequenas colônias fragmentadas espacialmente (Su and
Scheffrahn 1998). Além disso, à medida que os cupins consomem as estruturas, forma em seus
interiores, um complexo sistema de galerias que dificulta a penetração de substâncias tóxicas
usadas no controle destes insetos (Woodrow and Grace 2007). Adicionalmente, colônias de
cupins de madeira seca são responsivas às mudanças no ambiente externo e intra-colonial, uma
vez que tais espécies possuem um desenvolvimento linear, nos quais os indivíduos podem
passar por mudas progressivas, estacionárias ou regressivas o que torna a determinação de
castas altamente flexível (Korb et al. 2012). Tais características dificultam o controle destes
insetos, normalmente levando ao uso excessivo de inseticidas convencionais. O uso
desordenado de tais produtos tem gerado problemas devido à elevada persistência destes no
ambiente, além de sua redistribuição para áreas não tratadas (Richards et al. 2016).
Neste contexto, substâncias do metabolismo secundário das plantas têm sido
consideradas uma forma de controle ambientalmente mais segura. Os óleos essenciais de
plantas são apontados como alternativa para o controle de pragas [ex.: baratas (Werdin
Gonzalez et al. 2015), cupins (Lima et al. 2013), formigas (Albuquerque et al. 2013) e
mosquitos (Pavela 2015)] devido à sua composição química diversificada (ex. terpenos,
terpenóides oxigenados e benzenóides) (Isman, 2006), alta volatilidade e baixa toxicidade a
organismos não alvos, incluindo os humanos (Regnault-Roger et al. 2012). O potencial de
utilização dos óleos essenciais e seus constituintes para o controle dos cupins-praga é pouco
estudado quando comparado a outros grupos de insetos (Bacci et al. 2015). No entanto, alguns
estudos têm relatado a potencialidade dos óleos essenciais para o manejo de cupins das famílias
Rhinotermitidae e Termitidae (Lima et al. 2013; Bacci et al. 2015), havendo pouca divulgação
de estudos realizados com C. brevis. Estudos que visam determinar novas fontes inseticidas
devem levar em consideração não apenas o potencial letal sobre diferentes vias de exposição,
como também os efeitos subletais sobre os indivíduos. No caso de cupins - insetos
verdadeiramente sociais, que apresentam um elaborado sistema de comunicação - alterações
comportamentais resultantes da exposição às substâncias bioativas podem contribuir de
diferentes formas para o manejo das colônias. Inseticidas de ação mais lenta, por exemplo,
podem ser mais eficazes por não causarem mortalidade ou repelência imediata aos indivíduos,
facilitando assim a difusão da substância aos membros da colônia (Woodrow et al. 2006). Por
outro lado, como sugerido por Bacci et al. (2015), a exposição de indivíduos às substâncias
repelentes pode levar a um maior nível de não reconhecimento e agressividade, contribuído
para perda de coesão da colônia.
Aqui, analisamos o potencial bioinseticida do óleo essencial da planta arbustiva Lippia
sidoides Cham. Verbenaceae espécie nativa do bioma da Caatinga, Brasil (Lorenzi and Matos
2002) sobre pseudergates de C. brevis. Alguns estudos têm demonstrado à ação tóxica do óleo
essencial desta planta sobre diversos grupos de pragas como ácaros, insetos e nematóides
(Moreira et al. 2009; Lima et al. 2013; Gomes et al. 2014).
20
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. Colônias
Para realização dos bioensaios foram utilizadas 15 colônias de C. brevis obtidas de
madeira seca, coletadas no nordeste do Brasil, nos municípios de Alagoinhas, Bahia (12°08’S,
38°25’W) (N = 4), São Cristóvão (10°55’S, 38°6’W) e Simão Dias (10°44’S, 37°48’W),
Sergipe, (N = 7 e 4, respectivamente). As colônias foram transferidas para bandejas plásticas
(15 x 45cm) contendo fragmentos da madeira na qual foram encontrados. As colônias foram
mantidas em estufa incubadora tipo B.O.D. (26 ± 2°C, UR 70 ± 5%, sem iluminação) por 24
horas até a realização dos bioensaios.
A identificação da espécie foi realizada com base em literatura (Scheffrahn and Krecek
1999) e por comparação com espécime exemplar depositado no Laboratório de Termitologia
da Universidade de Brasília, Distrito Federal, Brasil.
4.2.2. Obtenção e análise do óleo essencial de L. sidoides
O óleo essencial de L. sidoides foi obtido da empresa Produtos Naturais (município de
Horizonte, Ceará, Brasil).
A análise dos componentes do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) e detector por ionização em chama (CG-DIC)
(GCMSQP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão), equipado com um amostrador
com injeção automática AOC-20i (Shimadzu). A separação dos componentes do óleo foi
realizada em uma coluna capilar de sílica fundida (Rtx®-5MS Restek; 5%-difenil-95%-
dimetilpolisiloxano) com diâmetro interno de 30 m x 0,25 mm e 0,25 µm de espessura de filme,
com um fluxo constante de Hélio 5,0 a uma taxa de 1,0 mL. min-1.
Um microlitro da amostra do óleo essencial foi injetada a temperatura de 280°C, em
uma razão de split de 1:30. A programação de temperatura do forno iniciou em 50°C (isoterma
por 1,5 minutos) aumentando a 4°C min-1 até 200°C, e em seguida a 10°C min-1 até 300 °C
permanecendo por 5 minutos.
No CG-EM as moléculas foram ionizadas por elétrons com energia de 70 eV e os
fragmentos analisados por um sistema quadrupolar programado para filtrar fragmentos/íons
com m/z na ordem de 40 a 500 Da, detectados por um multiplicador de elétrons. O
processamento de dados foi realizado com software CGMS Postrun Analysis (Labsolutions-
Shimadzu). O processo de ionização para o CG-DIC foi realizado pela chama proveniente dos
gases hidrogênio 5.0 (30 mL min-1) e ar sintético (300 mL min-1). Os compostos químicos
coletados e a corrente elétrica gerada foram amplificadas e processadas no software CG Postrun
Analysis (Labsolutions- Shimadzu).
Foram utilizadas duas metodologias para identificação dos compostos do óleo essencial
de L. sidoides, associados a cada pico observado no CG. A primeira consistiu no cálculo do
índice de retenção de cada composto usando a equação de Van Den Dool e Kratz (1963) em
relação a uma série homóloga de n-alcanos (nC9- nC18). Os componentes do óleo foram
identificados comparando-se os índices de retenção observados com os índices de retenção de
cada composto relatados por Adams (2007). A segunda metodologia utilizada foi a comparação
dos índices de similaridade (>80%) dos espectros de massa dos compostos associados à cada
pico do CG com os espectros de massa de três bibliotecas existentes no equipamento (WILEY8,
NIST107 e NIST21).
4.2.3. Obtenção dos constituintes majoritários
Os compostos que apresentaram concentração superior a 6% foram considerados como
componentes majoritários do óleo essencial de L. sidoides. Assim, (-)-trans-cariofileno
(98,5%), ρ-cimeno (99%) e timol (99%) foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich®
(Steinheim, Germany).
21
4.2.4. Bioensaios
Os bioensaios foram realizados em delineamentos inteiramente casualizados, a fim de
determinar a toxicidade e o tempo letal em duas vias de exposição e, as alterações
comportamentais e de caminhamento de pseudergates de C. brevis submetidos aos tratamentos:
óleo essencial de L. sidoides e seus componentes majoritários (-)-trans-cariofileno, ρ-cimeno e
timol. O tratamento controle consistiu no solvente acetona (Panreac, UV-IR-HPLC-GPC PAI-
ACS, 99,9%).
4.2.4.1. Vias de exposição
As doses e concentrações usadas foram selecionadas em bioensaios prévios
(mortalidade entre 10 e 99%). Em todos os casos, cada repetição dos bioensaios de toxicidade
por aplicação e fumigação, consistiu em um grupo de 10 pseudergates de C. brevis. Indivíduos
pertencentes a cada grupo sempre foram proveniente de uma mesma colônia e foram mantidos
nas arenas juntamente com um fragmento (1cm3) de sua madeira de origem, para alimentação.
Os experimentos foram conduzidos em estufa incubadora tipo B.O.D. (26 ± 2°C; UR 70
± 5%, sem fotoperíodo). As observações de mortalidade foram realizadas 48h após a montagem
dos experimentos. Os cupins foram considerados mortos quando não responderam aos
estímulos feitos com um pincel para via tópica, e quando não apresentaram nenhum movimento
por no mínimo 3s para via de fumigação.
4.2.4.1.2. Tópica
Os tratamentos foram estabelecidos por meio da aplicação de 0,5 µL dos respectivos
compostos no pronoto de cada indivíduo utilizado nos bioensaios, por meio de uma
microseringa de 10 µL (Hamilton, Reno, NV, USA). Para determinação das doses aplicadas
(µg por mg do inseto), a massa corporal de 30 indivíduos foi determinada em balança semi-
analítica (AUW220D, Shimadzu). Os indivíduos tratados foram colocados em placa de Petri (6
x 1,5 cm), forradas com disco de papel filtro e cobertas com filme plástico.
4.2.1.2. Fumigação
Soluções padrão das substâncias utilizadas em cada tratamento foram aplicadas (1µL)
em papel tipo filtro (1 cm²) com o auxílio de uma microseringa de10 µL (Hamilton, Reno, NV,
USA). Cada papel tratado foi acondicionado no interior da tampa de um pote acrílico (22,08
cm³). Em seguida a tampa foi coberta com tecido organza para evitar o contato direto dos cupins
com o papel tratado. Os potes contendo os cupins foram hermeticamente fechados.
4.2.4.2. Tempo letal
Para determinação das curvas de sobrevivência e do tempo letal para matar 50% da
população (TL50) os cupins foram expostos à DL95 e à CL95 determinadas nos bioensaios de
vias de exposição.
O desenho experimental foi o mesmo utilizado nos bioensaios de vias de exposição,
sendo realizadas 10 repetições/ tratamento em cada via de exposição. A mortalidade foi avaliada
a cada 2 h durante as primeiras 100 horas; e posteriormente a cada 12h até que a mortalidade
no grupo controle fosse superior à 20%.
4.2.4.3. Comportamento
Nestes bioensaios foram avaliados os efeitos das substâncias utilizadas em relação (i) às
alterações individuais ocasionadas nos indivíduos tratados; e (ii) as respostas comportamentais
por um grupo de indivíduos não-tratados em relação a um indivíduo tratado, conforme
metodologia descrita por Bacci et al. (2015). Os experimentos foram conduzidos em placas de
Petri (6 x 1,5cm) e os tratamentos consistiram na aplicação da DL50 das substâncias no pronoto
dos indivíduos.
22
Todas as observações foram realizadas com auxílio de uma lupa de mão (aumento 10x).
O experimento foi inteiramente casualizado com 10 repetições para cada tratamento,
totalizando 50 placas e 250 min de observação.
Para o experimento individual, um pseudergate de C. brevis foi tratado após 5 min de
aclimatação na placa de Petri. No experimento coletivo, 11 indivíduos foram inseridos na placa
de Petri, sendo um destes retirado da placa, aleatoriamente, após 5min de aclimatação. Os
indivíduos retirados de cada placa foram submetidos à aplicação dos tratamentos, sendo
realocados junto ao grupo não-tratado, após três minutos. Em ambos os bioensaios foram
registrados os comportamentos após 30s da montagem dos experimentos.
Para o bioensaio com apenas um indivíduo foram contabilizados o número de auto-
limpeza e butting (movimentos acelerados para frente e para trás em sequência (Hoffmann and
Korb 2011); enquanto para o bioensaio contendo um grupo de indivíduos foram registrados o
número de antenações, limpeza (indivíduo não tratado limpando o indivíduo tratado), trofolaxia
(estomatodeal e proctodeal), butting e evitação (quando os indivíduos não-tratados evitaram o
contato com o indivíduo tratado) realizados em relação ao indivíduo tratado. Os
comportamentos foram registrados por 30s contínuos interpolados a cada 30 s, totalizando 5
min de observação/placa.
4.2.4.4. Caminhamento
Os bioensaios foram realizados sem (arena totalmente tratada) e com (arenas com
metade tratada) a chance de escolha. Foram analisados o caminhamento individual (um
indivíduo) e coletivo (quatro indivíduos) em placas de Petri (6 x 1,5cm) cobertas com disco de
papel filtro tratados. Os discos tratados foram mantidos em câmara de exaustão por 3 min. Os
delineamentos experimentais foram inteiramente casualizados, com 15 repetições/ tratamento
totalizando 150 arenas (individual e coletivo) para cada bioensaio, com (N = 150) e sem chance
de escolha (N = 150).
Para os bioensaios com e sem chance de escolha (individuais e coletivos), o movimento
dos indivíduos foi gravado por 10 min utilizando uma câmera de vídeo (Panasonic SD5
Superdynamic - modelo WV-CP504), equipada com lente Spacecom (1/3” 3-8 mm) acoplada
a um computador. Para avaliação do movimento foi utilizado o software Ethovision XT (versão
8.5; Noldus Integration System, Sterling, VA). Os dados captados foram analisados utilizando
o programa Studio 9 (Pinnacle Systems, moutain View, CA).
4.2.4.4.1. Sem chance de escolha
Nestes bioensaios, o papel filtro utilizado para forrar as placas foi totalmente tratado
com 0,2 mL dos tratamentos à 0,1%. Para o experimento coletivo, cada indivíduo foi marcado
com tinta têxtil não tóxica nas cores azul, verde, vermelho e rosa (Acrilex Tintas Especiais S.A.,
São Bernardo do Campo – São Paulo, Brasil), 24 h antes do experimento, a fim de contabilizar
os comportamentos individuais de cada membro e posteriormente calcular a média do grupo.
Testes preliminares indicaram que o uso desta tinta não afetou a distância percorrida (p = 0,82)
e a velocidade de caminhamento (p = 0,25) dos indivíduos.
4.2.4.4.2. Com chance de escolha
O experimento foi realizado dividindo o papel filtro simetricamente em duas áreas,
sendo uma tratada com os compostos e a outra com acetona (solvente). Cada parte do papel
filtro foi tratada, isoladamente, com 0,1 mL das soluções dos compostos à 0,1% e
posteriormente foram fixados com fita dupla-face no fundo das placas. Foi avaliado o tempo de
permanência dos indivíduos nas áreas tratada e não–tratada das placas.
4.2.4.5. Análises estatísticas
Os dados de mortalidade dos tratamentos por via de aplicação tópica e por fumigação
foram corrigidos em relação à mortalidade no controle usando a fórmula de Abbott (Abbott
23
1925). Os dados foram submetidos à análise de Probit (Finey 1971) usando o procedimento
PROC PROBIT do SAS (SAS Institute 2008). Foram aceitas as curvas com probabilidade maior
que 0,05 pelo teste 2. Estas curvas foram utilizadas para determinar as CL50 e DL50, e as CL90
e DL90. Nas comparações das DL e CL foram usados intervalos de confiança a 95% de
probabilidade.
As análises de sobrevivência em função da via de exposição e dos tratamentos foram
realizadas através de estimadores de Kaplan-Meier pelo teste de Log-Rank (Sigmaplot, versão
12.5). Através dessa análise foram determinadas as curvas de sobrevivência e os tempos letais
para causar a mortalidade em 50% dos indivíduos (TL50) referente a cada um dos tratamentos,
em ambas as vias de exposição.
Os dados de comportamento foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis com
comparação múltipla a p<0,05 (R Core Team 2016). Análise de variância seguida pelo teste de
Dunnett a p<0,05 (PROC, ANOVA com DUNNETT; SAS) foi utilizada para avaliar a variação
na distância percorrida (cm) e a velocidade de caminhamento dos indivíduos (cm/s), nos
bioensaios de caminhamento (individual e coletivo) em arenas sem chance de escolha. Análise
similar foi realizada para avaliar o tempo de permanência dos indivíduos (%) nas áreas tratada
e não-tratada nas arenas com chance de escolha. As médias do tempo de permanência em cada
lado da arena foram comparadas pelo teste de Fisher LSD a p<0,05 (PROC, ANOVA com LSD;
SAS).
4.3. RESULTADOS
4.3.1. Composição química do óleo essencial
Dos nove compostos identificados e quantificados no óleo essencial de L. sidoides, o
timol foi o composto em maior concentração (76,34%), seguido pelo ρ-cimeno (10,09%) e o
(trans)-cariofileno (6,80%) (Tabela 1) (Fig. 1).
4.3.2. Vias de exposição
De forma geral, o óleo essencial de L. sidoides e seus componentes majoritários foram
tóxicos ao cupim C. brevis pelas vias de exposição tópica e fumigação. Exceção foi observada
para (-)-trans-cariofileno que causou mortalidade menor que 50% quando aplicado por
fumigação (Tabela 2).
O óleo essencial de L. sidoides e o timol foram os tratamentos mais tóxicos a C. brevis
quando aplicados topicamente (DL50 = 9,33 e 8,20 µg.mg-1, respectivamente) e por fumigação
CL50= 9,10 e 23,66 µL L-1, respectivamente).
4.3.3. Curvas de sobrevivência
Os tratamentos reduziram significativamente a sobrevivência de C. brevis quando
aplicados topicamente (Log-Rank χ2 =253,82, p<0,001) e por fumigação (Log-Rank
χ2=220,598, p<0,001) (Fig. 2). Topicamente, o timol foi o tratamento que apresentou menor
tempo letal (TL50= 2,89h), seguido pelo ρ-cimeno (TL50= 30,65h) e (-)-trans-cariofileno (TL50=
38,27h) (Fig. 2A). Padrão similar foi observado para aplicação por fumigação (TL50: timol =
16,06h; ρ-cimeno = 25,61h) (Fig. 2B).
Em ambas as formas de aplicação, o óleo essencial apresentou maior tempo letal do que
os seus componentes majoritários. Na aplicação tópica foram necessárias 110,36 h para o óleo
essencial causar mortalidade em 50% dos indivíduos de C. brevis. Já por fumigação esse tempo
foi de 29,32 h (Fig. 2).
4.3.4. Comportamento
De forma geral o óleo essencial de L. sidoides e seus compostos majoritários alteraram
os comportamentos individuais e coletivos de C. brevis em relação ao controle (Fig. 3 e 4).
24
Nos bioensaios individuais de limpeza não ocorreram diferenças significativas entre os
tratamentos e o controle. Já no comportamento de butting, ocorreram diferenças para o óleo
essencial e o ρ-cimeno (Kruskal-Wallis χ2 =14,08 p=0,004) (Fig. 3).
Os comportamentos coletivos indicaram que os cupins não-tratados reduziram o contato
com o indivíduo tratado (Fig. 4). Os comportamentos de antenação (Kruskal-Wallis χ2 =22,85
p<0,001) e de evitação (Kruskal-Wallis χ2 =27,03 p<0,001) foram menores para todos os
tratamentos em relação ao controle. Já para trofolaxia essa redução apenas ocorreu para o óleo
essencial e o ρ-cimeno (Kruskal-Wallis χ2 =19,77 p<0,001). Não foram observadas diferenças
significativas para o comportamento de limpeza (Kruskal-Wallis χ2 =7,57 p=0,10), e no
comportamento de butting apenas o timol diferiu do controle (Kruskal-Wallis χ2 =10,63 p=0,03)
(Fig. 4).
4.3.5. Caminhamento sem chance de escolha
Foram observadas diferenças significativas na distância percorrida (Fig. 5A) e
velocidade de caminhamento (Fig. 5B), individual e coletiva, de C. brevis expostos ao óleo
essencial de L. sidoides e aos seus compostos majoritários.
No bioensaio de comportamento individual, houve uma redução da distância percorrida
e da velocidade de caminhamento quando os indivíduos foram expostos ao óleo essencial de L.
sidoides e ao timol; enquanto estes parâmetros aumentaram sob efeito do (-)-trans-cariofileno,
comparados ao controle (Fig. 5A-B).
Já nos bioensaios coletivos, o óleo essencial de L. sidoides mostrou um padrão oposto,
aumentado a distância percorrida e a velocidade de caminhamento do grupo em relação ao
controle (Fig. 5A-B). Efeito similar foi observado quando o grupo foi tratado com os compostos
majoritários (Fig. 5A-B).
4.3.6. Caminhamento com chance de escolha
Quando dada chance de escolha, os cupins mostraram diferentes respostas quando
dispostos individualmente ou em grupo nas arenas. No bioensaio de comportamento individual,
os indivíduos permaneceram a maior proporção do tempo na metade da arena não-tratada,
considerando-se todos os tratamentos (Fig. 6A). Já no bioensaio de comportamento coletivo, os
cupins permaneceram a maior parte do tempo na metade da arena tratada com (-)-trans-
cariofileno do que na metade não-tratada. Por outro lado, não mostraram preferência na escolha
entre ρ-cimeno e a área não-tratada; e reduziram o tempo de permanência nas áreas tratadas
com timol e o óleo essencial de L. sidoides (Fig. 6B).
4.4. DISCUSSÃO
Neste trabalho demonstramos que o óleo essencial de L. sidoides e seus constituintes
timol e ρ-cimeno foram tóxicos ao cupim de madeira seca C. brevis, via aplicação tópica e
fumigação. A alta toxicidade do óleo essencial de L. sidoides em relação aos seus compostos
majoritários, principalmente observada por fumigação, pode estar relacionada a efeitos
sinérgicos entre os seus constituintes (Nerio et al. 2010).
Por via tópica, o timol apresentou mortalidade similar à observada para o óleo essencial
de L. sidoides (Tabela 2), sendo a concentração desse majoritário no óleo menor (76%) do que
a utilizada isoladamente (99%) (tabela 1). Assim, possivelmente a mortalidade causada pelo
óleo essencial deve-se em grande parte a ação tóxica do timol e a efeitos aditivos com outros
compostos (p.ex.: -cimeno e (-)-trans-cariofileno). A toxicidade destes terpenos via fumigação
foi menor (maiores CLs) a causada pelo óleo essencial. Desta forma, estes compostos devem
atuar sinergisticamente potencializando a ação do óleo via fumigação.
O fato do timol ser o composto de maior toxicidade presente no óleo essencial de L.
sidoides, pode estar relacionado ao seu mecanismo de ação. Este constituinte possui ação
neurotóxica sobre os insetos ligando-se aos receptores do neurotransmissor GABA impedindo
o fechamento dos canais de sódio. Essa ligação decorre da presença da hidroxila em sua
25
estrutura (Fig. 1), a qual é apontada como o possível sítio de ligação dos compostos terpênicos
com receptores desse neurotransmissor (Priestley et al. 2003; Tong and Coats 2012). Por outro
lado, a ausência desta hidroxila nas estruturas do ρ-cimeno e do (-)-trans-cariofileno pode
explicar a menor toxicidade desses compostos para os indivíduos de C. brevis (Fig. 1),
especialmente via fumigação.
O elevado tempo letal observado para o óleo essencial de L. sidoides via aplicação tópica
em relação à fumigação (Fig. 2), sugere que a cutícula esteja agindo como barreira à penetração
dos compostos nos pseudergates de C. brevis (Collins and Richards 1966). De fato, as doses
letais do óleo essencial de L. sidoides requeridas para C. brevis (DL50 = 9,33 µg mg-1) são
superiores às observadas para cupins de outros grupos, como Amitermes cf. amifer,
Microcerotermes indistinctus e Nasutitermes corniger (DL50 = 2,43; 1,49 e 0,27 µg mg-1,
respectivamente) (Bacci et al. 2015; Lima et al. 2013), os quais possivelmente possuem cutícula
menos espessa devido ao hábito de forragear dentro de túneis e sob o solo (Habibpour et al.
2010; Hu et al. 2012; Almeida et al. 2016). Assim, além da proteção contra perda de água, a
cutícula de C. brevis funciona como um possível mecanismo para sua tolerância a inseticidas
(ex.: óleos essenciais e terpenos) (Collins and Richards 1966; Shelton and Appel 2001).
Os menores tempos letais observados para a via de fumigação podem estar relacionados
a facilidade de penetração pelos espiráculos e a maior velocidade de alcance dos sítios de ação
dos compostos (Haddi et al. 2015). Neste contexto, considerando o tempo de ação para causar
mortalidade em C. brevis a via de fumigação é a mais indicada para o óleo essencial de L.
sidoides e seus constituintes, com exceção para o (-)-trans-cariofileno.
Os bioensaios de comportamento indicaram que os indivíduos contaminados são
reconhecidos como estranhos, fazendo com que os indivíduos não-tratados reduzam o contato
com eles. De fato, os comportamentos de antenação, meio de comunicação onde os cupins
reconhecem companheiros de ninho através de hidrocarbonetos cuticulares (Howard and
Blomquist 2005), e de evitação foram menores para todos os tratamentos em relação ao controle
(Fig. 4). Por outro lado, os pseudergates de C. brevis sinalizaram individualmente e de forma
coletiva a contaminação com os compostos através do comportamento de butting
(compreendido como sinalização de alarme; Grassé 1986) (Fig. 3 e 4). Essas alterações
comportamentais podem ocasionar um conflito dentro da colônia de C. brevis reduzindo a sua
sobrevivência (Korb and Foster 2010). Porém, o mecanismo de liberação dos inseticidas deve
ser um fator a ser considerado para desencadear tal fato. O aumento na distância e na velocidade
de caminhamento dos grupos de cupins tratados indicam que os pseudergates de C. brevis
reconhecem superfícies tratadas com os compostos (Fig.5). O aumento dessa atividade já foi
demonstrado como uma resposta dos cupins a um sinal de alarme (Cristaldo et al. 2015). Assim,
as alterações comportamentais e de caminhamento observadas neste trabalho podem ocasionar
(de forma conjunta) uma perda de coesão nas colônias de C. brevis, sendo este um aspecto
desejável para o controle de cupins-praga (Evans and Iqbal 2015).
Neste trabalho observamos que o óleo essencial de L. sidoides e o timol foram repelentes
a C. brevis; enquanto o (-)-trans-cariofileno apresentou efeito de atrativo (Fig. 5). O efeito
repelente é de interesse para o controle de pragas urbanas como os cupins, pois permite o
tratamento das estruturas com estes inseticidas evitando a colonização pelos mesmos (Hwang
et al. 2007; Rust and Su 2012). Embora iscas inseticidas sejam consideradas uma boa
ferramenta para o controle dos cupins, estas são utilizadas para espécies de solo, sendo pouco
usuais para cupins de madeira seca (Evans and Iqbal 2015). Por outro lado, o fato do (-)-trans-
cariofileno ter um efeito de atração ao grupo de C. brevis pode ser um indicativo da sua
utilização como isca para os indivíduos alados no período de revoada (responsáveis pela
fundação de novas colônias) (Borges et al. 2014). Contudo, são necessárias investigações para
testar tal efeito sobre esses indivíduos em situações naturais.
Para o controle químico de C. brevis, a localização da infestação é o primeiro fator
considerado para a escolha da via de exposição. Quando esta infestação ocorre de forma
generalizada a via de fumigação é preferível, mas quando esta é de forma pontual a via tópica
26
apresenta-se mais eficiente (Rust and Su 2012). Esta escolha é baseada na economia de
aplicação dos inseticidas e exposição do ambiente a estes compostos (Rust and Su, 2012). Esta
necessidade de utilização de diferentes vias de exposição, dependendo do tipo de infestação,
ressalta ainda mais o potencial de utilização do óleo essencial de L. sidoides e seus constituintes
contra C. brevis, uma vez que estes foram tóxicos por ambas as vias. Adicionalmente, o óleo
essencial de L. sidoides tem produção já realizada em escala industrial (Santos et al. 2015), o
que facilita sua futura utilização no controle de C. brevis. Porém, investigações futuras devem
ser realizadas a fim de determinar formulações adequadas e o efeito sobre organismos não-alvo
a fim de possibilitar a aplicação destes compostos em infestações naturais.
Neste trabalho, avaliamos a toxicidade e as respostas comportamentais de C. brevis
quando expostos ao óleo essencial de L. sidoides e seus constituintes. Demonstramos que esses
compostos botânicos têm potencial para aplicação em estratégias de controle deste cupim-
praga, já que além da ação tóxica em duas vias de exposição, estas substâncias apresentaram
efeitos importantes para a coesão das colônias de C. brevis.
4.5. CONCLUSÃO
Este estudo demonstra que o óleo essencial de L. sidoides e seus componentes são
potenciais inseticidas a serem utilizados como estratégias alternativas ou complementares para
o manejo do cupim de madeira seca C. brevis.
27
4.6. REFÊRÊNCIAS
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30
Tabela 1. Composição química do óleo essencial de Lippia sidoides analisado por CG-EM
e CG-DIC.
1IR= índice de retenção calculado através da equação de Van den Dool; Kratz (1963) para a série de homólogos. 2 Percentual Médio ± EPM dos compostos identificados por CG-EM/CG-DIC com três repetições para cada
método.
Composto
Tempo de
retenção
(min.)
IR1 Conteúdo relativo (%)2
Mirceno 10,553 979 2,09±0,14
δ-3-Careno 11,449 1007 1,05±0,05
ρ-Cimeno 11,712 1016 10,09±0,08
1,8-Cineol 11,927 1022 0,63±0,05
γ- terpineno 12,850 1050 1,39±0,04
Terpinen-4-ol 16,792 1172 0,72±0,01
Metil timol 18,430 1224 0,89±0,03
Timol 20,218 1283 76,34±0,17
(trans)-Cariofileno 24,099 1418 6,80±0,14
Total detectado (%) 100
31
Figura 1. Constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia sidoides: (1) timol, (2) ρ-
cimeno e (3) (trans)-cariofileno.
OH
H
H
E
(1) (2) (3)
32
Tabela 2. Toxicidade do óleo essencial de Lippia sidoides e seus constituintes sobre Cryptotermes brevis em duas vias de exposição.
a N= número de insetos testados. b β=inclinação da curva.
* Não foi possível determinar a curva concentração-resposta devido à baixa toxicidade deste composto.
Composto Aplicação Tópica (µg mg-1) Fumigação (µL L-1)
na DL50 DL90 βb χ2 P na CL50 CL90 βb χ2 P
L. sidoides 679 9,33
(8,83-9,77)
14,06
(13,18-15,34) 7,18 1,00 0,61
404 9,10
(7,94-10,28)
23,44
(20,22-28,27) 3,11 5,24 0,17
Timol 480 8,20
(6,83-9,44)
29,04
(23,50-39,93) 2,33 1,55 0,53
441 23,66
(22,82-24,48)
32,46
(30,73-34,96) 9,31 3,40 0,18
ρ-Cimeno 520 14,87
(13,80-15,93)
28,96
(25,49-35,07) 4,42 3,17 0,20
621
328,57
(307,45-351,35)
592,33
(526,96-700,54) 5,00 4,43 0,10
(-)-trans-
cariofileno 400
14,33
(12,96-15,70)
38,03
(33,50-44,56) 3,02 1,27 0,86 720 > 905 - - - -
33
Figura 2. Curvas de sobrevivência e tempo letal médio (TL50) para Cryptotermes brevis
expostos ao óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários por (A)
aplicação tópica e (B) fumigação.
34
Figura 3. Comportamentos individuais de pseudergates de Cryptotermes brevis expostos ao
óleo essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários. * indicam diferenças
significativas em relação ao controle pelo teste de Kruskal-Wallis a p < 0,05. Barras indicam
os valores mínimo e máximo das observações e ---- a média.
35
Figura 4. Comportamentos coletivos de pseudergates de Cryptotermes brevis expostos ao óleo
essencial de Lippia sidoides e seus componentes majoritários. * indicam diferenças
significativas em relação ao controle pelo teste de Kruskal-Wallis a p < 0,05. Barras indicam
os valores mínimo e máximo das observações e ---- a média.
36
Figura 5. (A) Distância percorrida e (B) velocidade de caminhamento (± erro padrão) durante
10min de exposição individual e coletiva de pseudergates de Cryptotermes brevis em arenas de
papel filtro (9 cm de diâmetro) tratadas com o óleo essencial de Lippia sidoides e seus
componentes majoritários. * indicam diferenças significativas dos tratamentos em relação ao
controle pelo teste de Dunnett a p <0,05.
37
Figura 6. Tempo de permanência (%) (± erro padrão) que pseudergates de Cryptotermes brevis
expostos por contato de forma (A) individual e (B) coletiva ao óleo essencial de Lippia sidoides
e seus constituintes majoritários permaneceram em cada lado de arenas com chance de escolha.
* indicam diferenças significativas entre o tempo de permanência em cada área pelo teste de
Fisher LSD a p < 0,05.
38
5. POTENCIAL INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia trilobata E
SEUS CONSTITUINTES CONTRA Nasutitermes corniger
Periódico a ser submetido: Industrial Crops and Products
RESUMO
Nasutitermes corniger tem sido considerado o cupim-praga de maior distribuição na
América do Sul, responsável por causar consideráveis danos em residências e ao
patrimônio histórico. Plantas do gênero Aristolochia (Aristolochiaceae) têm sido
amplamente utilizadas para fins terapêuticos, porém seu potencial bioinseticida ainda é
pouco estudado. Aqui, avaliamos a atividade cupinicida e os efeitos comportamentais do
óleo essencial (OE) de A. trilobata e seus constituintes sobre N. corniger. O OE e seus
constituites majoritários (identificados por CG-EM e CG-DIC) foram utilizados em
experimentos de toxicidade (doses e tempos letais) e de caminhamento sobre operários e
soldados de N. corniger. Os tratamentos mais tóxicos a N. corniger foram limoneno e
linalol (DL90 = 2,03 e 2,04; respectivamente). A sobrevivência do cupim foi reduzida ao
longo do tempo de exposição ao OE de A. trilobata e seus constituintes com tempos letais
(TL50) inferiores a 11 horas. Tanto os operários quanto os soldados de N. corniger
permaneceram por mais tempo em áreas não tratadas com os compostos. Assim, o OE de
A. trilobata e seus constituintes são promissores para o controle de N. corniger, tendo em
vista sua rápida ação inseticida e alterações comportamentais causadas nos operários e
soldados desta espécie. Estes resultados podem contribuir para o manejo mais seguro de
cupins-praga em áreas urbanas.
Palavras-chave: Aristolochiaceae, inseticidas botânicos, terpenos, Isoptera,
comportamento.
39
ABSTRACT
Nasutitermes corniger have been considered a termite-pest with major distribution at
South America, responsible for cause a significant damage in residences and historical
patrimony. Plants of the genera Aristolochia (Aristolochiaceae) have been highly utilized
in therapeutics purpose, having, as well, bioinsecticide potential. In this study, we tested
the bioinsecticide action, and the behavior effects of the A. trilobata essential oil (EO),
and its majority in N. corniger. The EO and its majority (identified by GC-MS and GC-
FID) were utilized in toxicity bioassays (doses and lethal times) and behavior (walking e
repelence) under workers and soldiers of N. corniger. The most toxic treatments to N.
corniger were limonene and linalool (LD90 = 2.03 and 2.04; respectively). The termite
survival was reduced over exposure time to EO of A. trilobata and its compounds, with
lethal times (LT50) inferior to 11 hours. Both workers and soldiers of N. corniger stayed
longer at the not compounds treated area. Thus, the EO of A. trilobata and its compounds
are a promising alternative to control of N. corniger, considering its fast insecticide action
and behavioural changes in workers and soldiers of this specie. These results can
contribute to a safer management of termites-pest at urban areas.
Key-words: Aristolochiaceae, Botanical Insecticides, Terpenes, Isoptera, Behavior.
40
1. Introdução
Cupins são insetos sociais que desempenham um importante papel ecológico
principalmente nos ambientes terrestres tropicais e subtropicais (Korb, 2005). Porém, a
substituição dos ambientes naturais por áreas urbanas e agrícolas tem levado a um
aumento no registro de espécies-praga (ex. nativas ou introduzidas) (Constantino, 2002a).
Nasutitermes corniger (Termitidae: Nasutitermitinae) tem sido considerado o cupim-
praga (Scheffrahn et al., 2014) de maior distribuição na América do Sul (Constantino,
2002a; Scheffrahn et al., 2005), responsável por causar consideráveis danos em
residências e ao patrimônio histórico (De Mello et al., 2014; Lima et al., 2014). Estes
danos se devem à capacidade dos operários de N. corniger de alimentarem-se da parede
celular presente em estruturas de madeira (ex. celulose e lignocelulose) (Lima et al.,
2014). A voracidade desses insetos tem sido atribuída à elevada atividade de enzimas
(Lima et al., 2014) endógenas (ex. codificadas pelo genoma dos próprios cupins)
(Watanabe et al., 1998) ou exógenas (ex. produzidas por bactérias simbiônticas) (Burnum
et al., 2011) presentes em seu trato digestivo.
O controle de N. corniger é realizado principalmente através da aplicação de
inseticidas diretamente nos ninhos ou em seus túneis (Scheffrahn et al. 2014). No entanto,
o controle de cupins da família Termitidae (grupo mais derivado de Blattodea) (Krishna
et al., 2013) pode ser dificultado não apenas pelo hábito críptico (comum ao todos os
grupos de cupins) como também pela complexidade de organização e estratégias de
forrageio observadas neste grupo (Almeida et al., 2016). Colônias de N. corniger, por
exemplo, abrigam uma enorme quantidade de forrageadores de sítio-central - assim
determinados por possuírem ninho e fonte alimentar independentes, os quais são
interligados por uma rede complexa de túneis e galerias (Costa-Leonardo, 2002).
Adicionalmente, as colônias podem apresentar ninhos policálicos ou satélites (Costa-
Leonardo, 2002) - nos quais uma mesma colônia possui ninhos isolados, interconectados
por túneis (Noirot, 1970). Tais características podem dificultar tanto o encontro dos
ninhos quanto a disseminação dos compostos tóxicos aos indivíduos dentro da colônia.
Embora N. corniger tenha sido considerado relativamente pouco seletivo quanto
à fonte alimentar utilizada (Bustamante and Martius, 1998), estudos demonstram que,
dentre outros fatores (ex. densidade da madeira e seu estágio de decomposição), os
metabólitos secundários de plantas (ex. que agem como fagoestimulantes ou deterrentes)
interferem no seu comportamento de seleção de recursos. Neste sentido, produtos
provenientes do metabolismo secundário de plantas, como por exemplo os óleos
essenciais (OEs) e seus constituintes, podem apresentar bioatividade sobre cupins. De
fato, OEs de plantas têm sido apontados como possível fonte bioinseticida contra cupins-
praga (Lima et al., 2013). As vantagens de utilização destas substâncias, em relação aos
inseticidas convencionais, por exemplo bifentrina, clorfenapir, cipermetrina, fipronil,
imidacloprido e permetrina - pouco recomendados devido aos seus efeitos residuais
(Schummer et al., 2010; Scheffrahn et al., 2014; Verma et al., 2009; Williams et al.,
2008)- está relacionada à sua alta volatilidade e baixo risco toxicológico aos organismos
não alvos (Regnault-Roger et al., 2012).
No Brasil o gênero Aristolochia (Aristolochiaceae) é representado por
aproximadamente 100 espécies. Tais espécies tem sido amplamente utilizadas para fins
terapêuticos (Kuo et al., 2012; Shaw, 2010), porém seu potencial bioinseticida ainda é
pouco estudado quando comparado a outras famílias botânicas como Lamiaceae e
Myrtaceae. Assim, visando o desenvolvimento de novos modelos para síntese de
inseticidas para o controle de N. corniger, avaliamos neste trabalho a toxicidade e os
41
efeitos comportamentais resultantes do OE de Aristolochia trilobata e seus constituintes
sobre operários e soldados de N. corniger.
2. Material e métodos
2.1. Material vegetal
Caules de A. trilobata foram coletados em área de manguezal no município de
Pirambu, Sergipe, Brasil (10º40’S, 36º52’W). As coletas foram realizadas em plantas sob
estágio vegetativo, no período da manhã, em setembro de 2014. As médias de
precipitação e temperatura anuais no mês da coleta são de 100 mm e 24,6 ºC,
respectivamente (Climate Data Org, 2016).
A identificação da espécie foi realizada no Herbário da Universidade Federal de
Sergipe, Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - São
Cristóvão, Sergipe, Brasil, 49100-000, onde espécimen testemunha (ASE 35.723) foi
depositada.
2.2. Obtenção e análise química do OE
Para extração do OE os caules de A. trilobata foram secos em estufa de secagem
com circulação de ar à 60 ± 1ºC por quatro dias (Marconi MA 037) (de Sant’ana et al.,
2010). Após a secagem, os caules foram triturados e o OE foi extraído por hidrodestilação
em aparelho tipo Clevenger modificado por 120 minutos. Após a extração, o OE foi
separado da fase aquosa, armazenado em frasco cor âmbar e mantido em freezer a -4ºC
até utilização nos bioensaios.
A composição química do OE de A. trilobata foi determinada por cromatografia
gasosa acoplada a espectrômetro de massa e a um detector por ionização em chama (CG-
EM; CG-DIC) (GCMSQP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). A injeção
das amostras foi realizada de forma automática (AOC-20i, Shimadzu).
As separações foram realizadas em coluna capilar de sílica fundida (Rtx®-5MS
Restek, 5%-difenil-95%-dimetilpolisiloxano) com diâmetro interno de 30 x 0,25 mm e
0,25 µm de espessura de filme, com um fluxo constante de Hélio 5,0 com taxa de 1,0 mL
min-1.
A temperatura de injeção foi de 280 °C, sendo injetado 1,0 μL (10 mg mL-1) da
amostra em uma razão de split de 1:30. A programação de temperatura do forno foi
iniciada em 50 °C (isoterma durante 1,5 min), com um aumento de 4 °C min-1, até 200
°C. E em seguida, a 10 °C min-1 até 300 °C, permanecendo por 5 min.
Para o CG-EM as moléculas foram ionizadas por elétrons a 70 eV e os fragmentos
analisados por um sistema quadrupolar programado para filtrar fragmentos/íons com m/z
na ordem de 40 a 500 Da, detectados por um multiplicador de elétrons. O processamento
de dados foi realizado com software CGMS Postrun Analysis (Labsolutions- Shimadzu).
O processo de ionização para o CG-DIC foi realizado pela chama proveniente dos
gases de hidrogênio 5.0 (30 mL min-1) e ar sintético (300 mL min-1). As espécies químicas
coletadas e a corrente elétrica gerada foram amplificadas e processadas, sendo este
processamento realizado no software CG Postrun Analysis (Labsolutions- Shimadzu).
A identificação dos constituintes foi realizada com base em comparações com os
índices de retenção da literatura (Adams, 2007). O índice de retenção foi calculado
utilizando a equação de Van Den Dool and Kratz (1963) em relação a uma série homóloga
de n-alcanos (nC9- nC18). Três bibliotecas do equipamento WILEY8, NIST107 e NIST21,
foram utilizadas permitindo a comparação dos dados dos espectros com aqueles
constantes das bibliotecas com um índice de similaridade de 80%.
42
2.3. Obtenção dos constituintes do OE
Os compostos do OE de A. trilobata que apresentaram percentual superior a 10%
(acetato de sulcatila, limoneno, ρ-cimeno e linalol) foram adquiridos da empresa Sigma-
Aldrich (Steinheim, Germany). Exceção ocorreu para o acetato de sulcatila, que foi obtido
a partir da redução química do composto 6-metil-5-hepten-2-ona (sulcatona, 500 mg, 3,97
mmol, Sigma Aldrich®) (Santos et al., 2014). Para tanto, este composto foi adicionado
em um balão (50 mL) sendo solubilizado em 10 mL de metanol e adicionado a NaBH4
(160 mg, 3,97 mmol). Esta mistura foi mantida sob agitação magnética por uma hora à
temperatura ambiente. Água destilada (1 mL) foi adicionada à mistura para interrupção
da reação química.
A extração do produto obtido, (±)-6-metil-5-hepten-2-ol 2 (sulcatol), foi realizada
utilizando acetato de etila (20 mL) que posteriormente foi removido por rota-evaporação.
O sulcatol foi completamente seco utilizando N2, com rendimento de 98% (500 mg, 3,91
mmol). Este sulcatol (500 mg, 3,91 mmol) foi tratado com piridina (1 mL) e anidrido
acético (1 mL) por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida foram adicionados a
mistura 4 mL de HCl (10%) e realizada extração com acetato de etila (20 mL) e 2-acetil
6-metil-5-hepteno (acetato de sulcatila). O solvente foi removido por rota-evaporação e
o acetato de sulcatila foi completamente seco com N2 com um rendimento de 83%
(550mg, 3,24mmol).
2.4. Cupins
Fragmentos de ninhos de N. corniger (N = 5) foram coletados no município de São
Cristóvão, Sergipe, Brasil (10°55’S, 38°6’W) e mantidos em bandejas plásticas (15 x 45
cm) na Clínica Fitossanitária, Universidade Federal de Sergipe (UFS), onde os bioensaios
foram realizados.
Os cupins foram mantidos em estufa incubadora tipo B.O.D. à temperatura de 26
± 2°C, umidade relativa 70% e sem fotoperíodo durante 24 h até a realização dos
bioensaios. Durante esse período somente algodão umedecido em água destilada foi
fornecido aos cupins.
A identificação da espécie foi realizada através de literatura (Constantino, 2002b)
e por comparação com espécime depositado no Laboratório de Interações Ecológicas –
Departamento de Ecologia - UFS.
2.5. Bioensaios
Bioensaios para determinação das doses e tempos letais (via aplicação tópica) e
de alterações comportamentais de N. corniger, foram conduzidos utilizando como
tratamentos o OE de A. trilobata e seus constituintes majoritários: acetato de sulcatila,
limoneno, linalol e -cimeno. O tratamento controle consistiu no solvente acetona
(Panreac, UV-IR-HPLC-GPC PAI-ACS, 99,9% de pureza) (Lima et al. 2013).
Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado,
sendo cada repetição constituída por um grupo de dez indivíduos (8 operários e 2
soldados) para os bioensaios de dose e tempo letal, conforme proporção de castas
encontradas nas colônias de N. corniger (Thorne, 1984). Estudos anteriores
demonstraram que essa densidade de indivíduos por placa não afeta a mortalidade dos
cupins (Lima et al., 2013). Para os bioensaios de alterações comportamentais cada
repetição consistiu de um indivíduo isoladamente de cada casta. Para os bioensaios de
dose e tempo letal, os grupos foram mantidos em placa de Petri (6 x 1,5 cm) contendo 10
g do fragmento do ninho macerado e um pequeno pedaço de algodão umedecido com
água destilada (Lima et al., 2013).
43
2.5.1. Dose letal
Para determinação das doses (µg das substâncias por mg do cupim) aplicadas, a
massa média de 30 indivíduos (24 operários e 6 soldados) foi obtida em balança semi-
analítica com precisão de 0,01 mg (AUW220D; Shimadzu).
Os tratamentos foram aplicados (0,5 µL) na região do pronoto de cada indivíduo
com auxílio de uma microseringa (10 µL, Hamilton, Reno, NV, USA). Foram utilizadas
quatro repetições/ tratamento e de 6 a 12 doses para obtenção de curvas dose-mortalidade
dos tratamentos.
Após aplicação, as placas foram cobertas com filme plástico e acondicionadas em
estufa incubadora tipo B.O.D. (26 ± 2°C, UR 70 ± 5%, sem fotoperíodo). As avaliações
de mortalidade foram realizadas 48 h após montagem dos bioensaios.
2.5.2. Tempo letal
Nestes bioensaios os indivíduos de N. corniger foram expostos a DL95 determinada
no bioensaio de dose letal, a fim de determinar a curva de sobrevivência da espécie e o
tempo letal do OE de A. trilobata e seus constituintes para causar mortalidade em 50%
dos indivíduos (TL50). Foram realizadas 10 repetições/tratamento. As avaliações de
mortalidade foram realizadas a cada 2 h até completar 48 h.
2.5.3. Caminhamento em arenas parcialmente tratadas
O experimento foi realizado com intuito de avaliar o efeito dos tratamentos sobre:
(i) o caminhamento dos operários e soldados em arenas parcialmente tratadas (ii) se este
comportamento difere entre essas castas de N. corniger.
As arenas consistiram de uma placa de Petri (6 x 1,5 cm) dividida simetricamente
em duas áreas (tratada e não-tratada). Os discos de papel filtro foram divididos em duas
partes, e tratados com 0,1 mL das soluções de cada tratamento a 0,1%. Para o controle foi
aplicado 0,1 mL do solvente acetona. As partes foram levadas a câmara de exaustão por
3 min. As duas partes (tratada e não-tratada) foram afixadas na placa de Petri com fita
adesiva dupla face. Os indivíduos N. corniger (um operário ou um soldado) foram
liberados no centro da placa individualmente. Foram realizadas 20 repetições para cada
tratamento x casta, totalizando 240 repetições. O caminhamento de cada indivíduo foi
gravado por 10 min com câmera de vídeo (Panasonic SD5- modelo WV-CP504) acoplada
a um computador.
As análises de caminhamento foram feitas utilizando os softwares Ethovision XT
(versão 8.5; Noldus Integration System, Sterling, VA) e Studio 9 (Pinnacle Systems,
moutain View, CA), sendo calculado o percentual de permanência dos indivíduos em
cada lado da arena (tratado e não-tratado).
2.6. Análises estatísticas
Os dados de mortalidade obtidos a partir do bioensaio de aplicação tópica foram
corrigidos em relação à mortalidade do controle pela fórmula de Abbott (1925). Estes
dados foram submetidos à análise de Probit (PROC PROBIT) (SAS Institute, 2008),
sendo aceitas curvas com probabilidade com p > 0,05 pelo teste 2. A partir destas curvas
foram estimadas as DL50 e DL90 dos tratamentos para N. corniger. Foram utilizados os
intervalos de confiança a 95% de probabilidade (Finey, 1971) para comparações das doses
letais entre os tratamentos.
As curvas de sobrevivência e o tempo letal para mortalidade de 50% (TL50) dos
indivíduos de N. corniger, expostos ao OE de A. trilobata e seus constituintes, foram
determinadas através de estimadores de Kaplan-Meier pelo teste de Log-Rank
(Sigmaplot, versão 12.5).
44
O tempo de permanência em áreas tratadas e não-tratadas em função dos
tratamentos também foram submetidos à análise de variância (PROC ANOVA). O efeito
de cada tratamento sobre operários e soldados foi comparado pelo teste de Fisher (p <
0,05) (PROC ANOVA com LSD). Todas as análises foram realizadas no software SAS
(SAS Institute, 2008).
3. Resultados
3.1. Composição química do OE
O acetato de sulcatila foi o composto presente em maior percentual (28,42%) no
OE de A. trilobata, seguido pelo limoneno (22,32%), ρ-cimeno (10,88%) e linalol
(10,13%) (Tabela 1) (Fig. 1). Os demais constituintes compreenderam 25,49% do total
de 97,24% da composição identificada.
3.2. Dose letal
O OE de A. trilobata e seus constituintes foram tóxicos aos indivíduos de N.
corniger (Tabela 2). O limoneno foi o composto mais tóxico, seguido por linalol e acetato
de sucatila. O ρ-cimeno causou toxicidade semelhante ao OE de A. trilobata. As maiores
inclinações das curvas dose-mortalidade do linalol e limoneno resultaram em menores
doses necessárias para matar 90% da população de N. corniger (2,04 e 2,03 µg.mg-1,
respectivamente) (Tabela 2).
3.3. Tempo letal
A sobrevivência de N. corniger foi significativamente reduzida ao longo do tempo
de exposição aos tratamentos, apresentando tempos letais inferiores a 11 h (Log Rank; χ2
= 311,4; g.l. = 5; p < 0,001) (Fig. 2). Os terpenos mataram N. corniger mais rapidamente
se comparados ao OE de A. trilobata. O menor tempo letal foi observado para ρ-cimeno
que causou mortalidade em 50% da população em apenas 0,8 h. Limoneno e linalol foram
semelhantes. Na média estes terpenos levaram 2,86 h para matar metade da população de
N. corniger.
3.4. Caminhamento arenas parcialmente tratadas
Os cupins permaneceram significativamente por mais tempo no lado não tratado
da arena (Fig. 3 e 4). Foram observadas diferenças significativas entre o tempo de
permanência de operários e soldados de N. corniger em cada lado da arena em função dos
tratamentos (F4; 195 = 4,51; p = 0,0017) (Fig 3 e 4). Mas, essa diferença, apenas ocorreu
para o constituinte limoneno, onde os soldados permaneceram por mais tempo do lado
não tratado que os operários (F1; 38 = 21,98; p < 0,001) (Fig 3 e 4).
4. Discussão
O OE de A. trilobata e seus constituintes apresentaram rápida ação tóxica e
alterações comportamentais (p.ex. repelência) em operários e soldados de N. corniger,
demonstrando assim potencial bioinseticida para o controle deste cupim. Como
demonstrado em outros estudos, este OE foi constituído principalmente por
monoterpenos (85,67% da composição total) (Tabela 1). Porém, a diversidade química
observada aqui (20 compostos) foi inferior à relatada por Santos et al. (2014), que
identificou 42 compostos no OE de A. trilobata. Variações intraespecíficas em relação à
constituição química do OE de plantas podem estar relacionadas à estrutura vegetal
utilizada para extração, estádio fenológico da planta no momento da coleta, tempo de
45
armazenamento do OE, assim como variações de clima e solo (Dhouioui et al., 2016;
Santos et al., 2015).
A toxicidade dos OE’s tem sido atribuída não apenas aos compostos presentes em
maiores percentuais em sua composição; mas também às interações complexas entre eles
e as interações destes com os compostos presentes em menores proporções (Tak et al.,
2015). Aqui, observamos que os monoterpenos limoneno, linalol e acetato de sucatila
foram mais tóxicos que o OE. Contudo, cada composto compõe isoladamente, menos de
30% da totalidade do OE de A. trilobata. Estes resultados sugerem que a toxicidade do
OE de A. trilobata sobre N. corniger seja resultante de intrínsecos efeitos de sinergismo,
aditismo e antagonismo entre seus componentes. De fato, variações na toxicidade de
misturas binárias entre os constituintes do OE de A. trilobata mostraram efeitos de
sinergismo e aditismo para formigas cortadeiras Acromyrmex balzani e Atta sexdens,
respectivamente (Oliveira, 2015), o que comprova que as interações interferem na
bioatividade final do óleo. A complexidade destas interações se acentua em OEs com
elevado número de compostos, o que foi observado em nosso trabalho (20 compostos).
A toxicidade de compostos terpênicos aos insetos tem sido atribuída à presença
de hidroxila em suas estruturas, que provavelmente atua como ligação destes compostos
aos diversos sítios de ação nestes organismos (Tong and Coats, 2012). Assim, o fato do
linalol possuir hidroxila em sua estrutura, pode explicar a maior toxicidade deste sobre
N. corniger, quando comparado aos demais compostos majoritários, os quais não
apresentam tal característica (Fig. 1). Por sua vez, o limoneno, o constituinte do OE de A.
trilobata mais tóxico para N. corniger, já teve sua atividade relatada para diversos grupos
de pragas como besouros, cochonilhas e cupins (Cheng et al., 2004; Hollingsworth, 2005;
Hudaib et al., 2010). Esta ampla ação inseticida é associada a presença da dupla ligação
na sua estrutura que possivelmente aumenta a sua lipofilicidade (Santos et al., 2011).
As baixas doses do OE de A. trilobata e seus terpenos necessárias para causar
mortalidade e alterar o comportamento de N. corniger favorecem o potencial de utilização
destes compostos para o controle deste inseto. Dessa forma, para se obter a bioatividade
pretendida será necessária uma pequena quantidade destas substâncias. O fato de
possuírem baixa persistência no ambiente em relação aos inseticidas sintéticos, também
contribui com a utilização do OE de A. trilobata e seus terpenos. Compostos de baixa
persistência são mais seguros e apresentam menores riscos a organismos não-alvo,
incluindo os humanos (Regnault-Roger et al., 2012).
Por sua vez, os tempos letais inferiores a 11 h é um indicativo de que estes
compostos possuem modo de ação neurotóxico sobre N. corniger. Os OEs e seus
constituintes tem sido relatado como agentes antagonistas de diversos neurotransmissores
e neuromoduladores nos insetos como acetilcolina, GABA, octopamina e tiramina (Enan,
2005, 2001; Park et al., 2001; Tong and Coats, 2012). A atividade destes compostos sobre
múltiplos sítios de ação aliado às alterações provocadas no sistema respiratório dos
insetos podem explicar a rápida ação inseticida observada aqui (Haddi et al., 2015). À
princípio, esta rápida atividade termiticida poderia contribuir para redução da
transferência dos compostos entre os membros da colônia, reduzindo as possibilidades de
utilização dos compostos em iscas. Mas, a atividade de repelência do OE e todos seus
constituintes à operários e soldados de N. corniger (Fig. 3 e 4), sugere a utilização destes
compostos para controle pontual desses cupins evitando seu contato com estruturas de
madeira previamente protegidas.
A diferença no tempo de permanência das castas (operários e soldados) em arenas
parcialmente tratadas com o limoneno (Fig. 3 e 4) pode estar relacionado com a presença
desse composto na glândula frontal de soldados de N. corniger (Gush et al., 1985). Essa
glândula produz uma diversidade de substâncias relacionadas a defesa e a sinalização de
46
alarme nas espécies de Nasutitermes (Gush et al., 1985). Assim é possível que o limoneno
esteja associado com tais ações nas colônias de N. corniger, contudo, são necessários
estudos que avaliem as substâncias presentes na glândula frontal de N. corniger (ex.
limoneno) (De Melo et al., 2016), de forma isolada e conjunta, em bioensaios
comportamentais (Cristaldo et al., 2015).
A prospecção de inseticidas botânicos para o controle de cupins-praga ainda é
pouco estudada em relação a outros grupos de pragas como besouros e lagartas (Bacci et
al., 2015). Aqui, demonstramos que não só o OE de A. trilobata, como também seus
constituintes majoritários, podem ser utilizados para o controle de N. corniger, uma vez
que mostraram efeitos letais e subletais sobre operários e soldados. Tendo em vista a
baixa toxicidade destas substâncias para organismos não-alvo como vertebrados e sua
rápida degradação, estes compostos apresentam potencial para emprego no controle deste
cupim.
5. Conclusão
O OE de A. trilobata e seus constituintes apresentaram toxicidade, com efeito letal
inferior a 11 h, e mostraram efeito repelente ao cupim N. corniger. Estes resultados podem
contribuir para o manejo mais seguro de cupins-praga em áreas urbanas.
47
6. Referências
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51
Tabela 1
Composição química do óleo essencial de Aristolochia trilobata (CG-EM e CG-DIC).
Composto IRa Tempo de retenção (min)1 Conteúdo relativo (%)b
α-pineno 923 8,790 1,77±0,04
cânfeno 938 9,267 3,05±0,09
β-pineno 966 10,138 1,05±0,02
mirceno 977 10,472 1,69±0,04
ρ-cimeno 1013 11,632 10,88±0,19
limoneno 1018 11,792 22,32±0,42
1,8-cineol 1021 11,890 0,38±0,02
(Z)-β-ocimeno 1034 12,316 3,87±0,21
linalol 1085 14,020 10,13±0,05
acetato de sulcatila 1115 14,986 28,42±0,74
borneol 1156 16,306 0,68±0,006
α-terpineol 1180 17,049 0,54±0,006
acetato de bornila 1275 19,956 0,89±0,04
(E)-cariofileno 1414 23,979 0,95±0,003
germacreno D 1475 25,640 0,59±0,005
biciclogermacreno 1491 26,059 1,06±0,03
espatulenol 1575 28,217 3,42±0,12
globulol 1582 28,406 4,43±0,20
viridiflorol 1590 28,611 0,44±0,03
α-cadinol 1649 30,057 0,68±0,04
Total detectado (%) 97,24±0,03 a IR= índice de retenção calculado através da equação de Van den Dool; Kratz (1963) para
a série de homólogos. b Média ±EPM com três repetições.
52
Fig. 1. Constituintes majoritários do óleo essencial de Aristolochia trilobata: (1) ρ-
cimeno, (2) limoneno, (3) linalol e (4) acetato de sulcatila.
(1) (2) (3) (4)
53
Tabela 2
Doses letais do óleo essencial de Aristolochia trilobata e seus constituintes para causar a
mortalidade em 50 e 90% (±IC95%) da população de Nasutitermes corniger após 48
horas de exposição por via de aplicação tópica.
Composto Na DL50 (µg mg-1)
IC95%
DL90 (µg mg-1)
IC95% χ2 βb P
A. trilobata 620 2,44
(2,16-2,73)
5,24
(4,62-6,10) 1,68 3,86 0,56
Ac. de sucatila 560 1,92
(1,69-2,15)
5,78
(4,71-7,89)
0,14 2,67 0,93
p-Cimeno 420 2,65
(2,34-3,27)
8,48
(5,58-23,13)
0,30 2,53 0,85
Limoneno 400 1,02
(0,94-1,10)
2,03
(1,82-2,35)
0,84 4,28 0,66
Linalol 760 1,29
(1,22-1,35)
2,04
(1,88-2,29)
1,65 6,41 0,56
a N= número de insetos testados. b β= inclinação da curva.
54
Fig. 2. Curvas de sobrevivência e tempos letais (TL50) do óleo essencial de Aristolochia
trilobata e seus constituintes aplicados topicamente sobre Nasutitermes corniger ao longo
de 48h (Log Rank: χ2 = 311,39; g.l. = 5; p < 0,001).
55
Fig. 3. Tempo de permanência (%) de operários e soldados (± erro padrão) de
Nasutitermes corniger em arenas parcialmente tratadas com o óleo essencial de
Aristolochia trilobata e seus constituintes por 10 minutos de exposição. * indicam
diferenças significativas entre o tempo de permanência de cada lado da arena pelo teste
de Fisher LSD a p < 0,05.
56
Fig. 4. Trilhas representativas do movimento de operários (vermelho) e soldados (cinza)
de Nasutitermes corniger expostos ao óleo essencial de Aristolochia trilobata e seus
constituintes por 10 minutos em arenas parcialmente tratadas. O lado direito da arena
compreende a área tratada.
57
6. CONCLUSÕES GERAIS
As fortes evidências deste trabalho demonstram que os óleos essenciais de
Aristolochia trilobata, Lippia sidoides e seus constituintes são potenciais inseticidas a
serem utilizados no manejo dos cupins Nasutitermes corniger e Cryptotermes brevis,
respectivamente.
Este estudo corrobora para a hipótese de que os óleos essenciais e seus
constituintes são fontes promissoras para a síntese de inseticidas a serem utilizados no
manejo seguro de cupins-praga em áreas urbanas.
![Constituintes da frase[1]](https://img.document.onl/doc/110x75/558841dad8b42aaf1a8b467c/constituintes-da-frase1.jpg)
