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Orientações para Coleta, Transporte, Processamento, Análise e Meios de Cultura. ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS; ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS; CONTEÚDO PROGRAMÁTICO; CONTEÚDO PROGRAMÁTICO; CASOS CLÍNICOS; CASOS CLÍNICOS; blog do professor: blog do professor: http://chitoteixeira.wordpress.co m

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Orientações para Coleta, Transporte,

Processamento, Análise e Meios de Cultura.

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Na instituição de uma terapia incorreta e ainda danosa, caso o tratamento seja dirigido para um comensal.

Colheita de Amostras

Uma amostra mal colhida:

É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mis importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa.

Fracasso no isolamento de microrganismos importantes.

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Exemplo: (caso clínico)

Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro de um paciente com pneumonia clínica;

Escarro colhido de forma inadequada sendo constituído principalmente de saliva;

Klebsiella pneumoniae

pneumonia Nasofaringe

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O pior:

O tratamento seria inadequado e só resultaria efetivo, por casualidade, se a espécie causadora da pneumonia tivesse um padrão de susceptibilidade a antibióticos similar à de K. pneumoniae.

A terapia eleita poderia ter sido errônea.

Pseudomonas aeruginosa

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• A amostra deve ser material do sítio real de infecção, devendo ser colhida com o mínimo de contaminação dos tecidos, órgãos e secreções adjacentes;

Considerações fundamentais na colheita de amostras.

Colheita de Amostras

• Deve-se estabelecer o momento ótimo para a colheita de amostras, com o objetivo de contar com melhor possibilidade de isolar microrganismos causadores de enfermidades;

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• Deve-se obter uma quantidade suficiente de amostra para realização das técnicas de cultivo solicitadas;

Enviar ao laboratório swab seco ou secreções escassas é uma prática inútil e de custo

considerável para o paciente;

Considerações fundamentais na colheita de amostras.

Colheita de Amostras

• Devem ser utilizados dispositivos de colheita, recipientes de amostras e meios de cultura apropriados para assegurar isolamento ótimo de microrganismos.;

Calcularam que o rendimento do isolamento de microrganismos a partir

de culturas de sangue aumentava em cerca de 3% por mL de sangue

colhido; (Mermel e Maki).

Com demasiada freqüência, são enviados ao laboratório 0,5 mL ou menos de material identificado como “escarro” ou “lavado

brônquico”;bactérias anaeróbicas

Swabs retais para isolar espécies de Shigella, o material

colhido deve ser inoculado diretamente na superfície de ágar Mac Conkey ou caldo

enriquecido para gram-negativos

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Considerações fundamentais na colheita de amostras.

Colheita de Amostras

• Sempre que possível, deve-se obter amostras antes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, número de idenficacção,

origem, médico e a data/hora da colheita;

Garganta

Neisseria gonorrhoea

Amostrasgeniturinárias

Haemophilus influenzae

Neisseria meningitidis

Líquido cefalorraquidiano (LCR)• O recipiente da amostra deve ser rotulado de

forma correta;

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Colheita de AmostrasOutros exemplos importantes.

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O objetivo primário no transporte de amostras para diagnóstico consiste em manter a amostra o mais próximo possível de seu estado original, com deterioração mínima, e minimizar os riscos para os transportadores das amostras, utilizando-se dispositivos protetores do recipiente da amostra inseridos no interior de um recipiente adequado.

Transporte de Amostras

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Transporte de Amostras

Deve-se evitar:

Condições ambientais adversas

Frio

Calor extremoMudanças na pressão

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Transporte de Amostras

Se for previsto:

Um atraso prolongado (acima de 4 dias por exemplo) antes da amostra ser processada;

É preferível congelar a amostra a -70ºC, podendo ser utilizado um congelador a -20ºC, se o período de estocagem for breve.

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Transporte de Amostras

As amostras de escarro colhidas principalmente para o isolamento:

Podem ser remetidas sem qualquer tratamento desde que colhidas em recipientes de propileno ou polietileno esterilizados.micobactérias fungos

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Transporte de Amostras

A maioria das amostras líquidas, em particular amostra de urina, deve ser transportada ao laboratório o quanto antes possível:

Contexto hospitalar

Recomenda-se um limite máximo de 2 horas entre a colheita e a chegada da amostra ao laboratório.

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Transporte de Amostras

O limite de tempo representa um problema quando as amostras são colhidas em consultórios particulares.

Amostras de urina

Podem ser utilizados recipientes contendo uma

pequena quantidade de ácido bórico, se o

transporte rápido não for possível.

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Transporte de Amostras

Para a maioria das amostras pode ser utilizado um meio de manutenção ou transporte, seguindo-se as instruções do fabricante.

Meio de transporte Stuart

Solução tampão, isenta de nutrientes e fatores de crescimento, conserva a viabilidade sem permitir a multiplicação das bactérias durante o transporte.

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Transporte de Amostras

• Tioglicolato de sódio – tem função de agente redutor para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias;

• Ágar (pequena quantidade) – proporciona uma consistência semi-sólida que impede a oxigenação e o derrame durante o transporte;

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Transporte de Amostras

Solução de borato de sódio

Tampão com sacarose, fosfato e glutamato

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Transporte de Amostras

As amostras devem ser embaladas de modo a suportar golpes ou mudanças de pressão que podem ocorrer durante a manipulação e causar vazamento do conteúdo;

Um recipiente que vaza não apenas predispõe a amostra a uma potencial contaminação, mas também expõe os microrganismos ao pessoal que transporta ou recebe a amostra;

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Transporte de AmostrasTécnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos:

Recipiente primário com tampa à prova d’água

Recipiente secundário de preferência de metal

Embalagem para envio fabricada em cartão

ondulado, cartão grosso ou gomaespuma

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Recepção de Amostras

jalecos

luvas

máscaras

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Processamento de Amostras

• Ingresso de dados essenciais em um livro de registros ou em um terminal de computador;

• Exame visual e determinação do cumprimento de todos os critérios para

aceitação da amostra;

• Para certas amostras, o exame microscópico de montagens úmidas ou de esfregaços corados, para estabelecer um diagnóstico presuntivo;

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Processamento de Amostras

USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:

É recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos diretos das amostras enviadas para cultivo;

Rápido diagnóstico presuntivo Guia para selecionar os meios

de cultura apropriados

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Processamento de AmostrasColoração de Gram

• Cristal violeta – serve como coloração primária, unindo-se à parede celular bacteriana após tratamento com uma solução de iodo fraca (mordente para a ligação do corante);

• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) – as bactérias que retêm o corante aparecem azuladas se observadas ao microscópio e são denominadas gram-positivas;

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Processamento de AmostrasColoração de Gram

• Contracorante Safranina – certas bactérias perdem a coloração primária com cristal violeta quando são tratadas com o descorante e captam a contracoloração com safranina e aparecem em vermelho quando observadas ao microscópio, denominando-se gram-negativas;

A coloração de Gram pode ser utilizada para efetuar identificações presuntivas.

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Processamento de AmostrasColorações de àlcool-ácido-resistência

Recobertas por um espesso material ceroso que resiste à coloração,

entretanto, uma vez coradas, resistem à

descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes,

como o álcool-ácido.

Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).

micobactérias

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Processamento de Amostras

Azul de toluidina e Azul de Metileno

OUTROS CORANTES:

Laranja de acridina

Coloração com Prata

Coloração com Wright-Giemsa

Ácido periódico de Schiff

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Processamento dos Cultivos

Após recebimento de amostras para cultivo no laboratório de microbiologia, devem ser tomadas as seguintes decisões:

• Selecionar os meios de cultura primários apropriados para o tipo de amostra particular;

• Determinar a temperatura e a atmosfera de incubação para isolar todos os microrganismos potencialmente significativos;

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Processamento dos Cultivos• Determinar qual dos microrganismos

isolados em meios primários requer uma maior caracterização;

• Determinar se são necessárias provas de suscetibilidade a antibióticos, uma vez conhecida a identidade do organismo;

Comum a todos é o reconhecimento das dificuldades envolvidas na manutenção da qualidade dos serviços, em vista das políticas de redução de custos, cada vez mais rigorosas;

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Seleção de Meios de Cultura Primários

Meios não-seletivos – são isentos de inibidores e permitem o crescimento de microrganismos encontrados freqüentemente em laboratórios clínicos;

Ágar com 5% de sangue de carneiro

Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha

Haemophilus influenzae

Ágar com sangue humano

Gardnerella vaginalis

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Ágar sangue

Colistina e o ácido nalidíxico

Inibe gram-negativos e favorece o crescimento de

gram-positivos

Seleção de Meios de Cultura Primários

Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante a adição de um ou mais antibióticos ou de certas substâncias químicas;

Ágar-KV

Canamicina e vancomicina

Bacilos gram-negativos anaeróbios (bacteroides)

Ágar McConkey Ágar EMB

Inibem gram-positivos

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Seleção de Meios de Cultura Primários

O caldo de enriquecimento é empregado para isolar microrganismos patogênicos de amostras, como fezes, nas quais existe uma elevada concentração de microrganismos comensais;

Salmonella e Shigella

Escherichia coli e outros comensais entéricos

Fase logaritmica

Fase de latência

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Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os vários critérios para rejeição e tenha sido aceita para cultivo, porções apropriadas da mesma devem ser transferidas aos vários meios de cultura descritos no item anterior. Essa atividade também é usualmente realizada em uma parte separada de outras áreas do laboratório, conhecida como área de “semeadura”;

Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

jalecos

luvas

máscaras

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Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

O equipamento necessário para a inoculação primária de amostras é relativamente simples:

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Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

Espalhamento nos quatro quadrantes

UFC

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Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido (0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semi-sólido é adequado para as provas de motilidade;

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Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

Os microrganismos diferem quanto à temperatura ótima de incubação. Porém, a

maioria dos microrganismos cresce a 35ºC; assim, se o laboratório dispõe apenas de uma

estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;

O crescimento da maior parte dos microrganismos é potencializado por uma

atmosfera de 5% a 10% de CO2;

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Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na

temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de ar-

condicionado ou de fluxos de calor;

O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos

microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;

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Interpretação dos Cultivos

A identificação dos cultivos primários após 24 a 48 horas de incubação requer uma considerável habilidade;

Essa avaliação se faz:

O microbiologista deve avaliar o crescimento das colônias e decidir se são necessários procedimentos adicionais;

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Interpretação dos Cultivos

• Anotando as características e o número relativo de cada tipo de colônia isolada em meios de ágar;

• Determinando a pureza, reação à coloração de Gram e morfologia das bactérias em cada tipo de colônia;;

• Verificando mudanças no meio que circunda as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias

isoladas;

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Interpretação dos Cultivos

Características macroscópicas das colônias

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OBRIGADO