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Orientações para Coleta, Transporte,
Processamento, Análise e Meios de Cultura.
• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;• CASOS CLÍNICOS;CASOS CLÍNICOS;
blog do professor:blog do professor:http://chitoteixeira.wordpress.com
Cultivos apropriados
Colheita de Amostras
Quando se suspeita de doença infecciosaTécnicas dirigidas à detecção
sorológica de antígenos e anticorpos
Anticorpos monoclonais
Sondas de DNA - PCR
Outros procedimentos sem cultivo
Na instituição de uma terapia incorreta e ainda danosa, caso o tratamento seja dirigido para um comensal.
Colheita de Amostras
Uma amostra mal colhida:
É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mis importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa.
Fracasso no isolamento de microrganismos importantes.
Exemplo: (caso clínico)
Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro de um paciente com pneumonia clínica;
Escarro colhido de forma inadequada sendo constituído principalmente de saliva;
Klebsiella pneumoniae
pneumonia Nasofaringe
O pior:
O tratamento seria inadequado e só resultaria efetivo, por casualidade, se a espécie causadora da pneumonia tivesse um padrão de susceptibilidade a antibióticos similar à de K. pneumoniae.
A terapia eleita poderia ter sido errônea.
Pseudomonas aeruginosa
• A amostra deve ser material do sítio real de infecção, devendo ser colhida com o mínimo de contaminação dos tecidos, órgãos e secreções adjacentes;
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
• Deve-se estabelecer o momento ótimo para a colheita de amostras, com o objetivo de contar com melhor possibilidade de isolar microrganismos causadores de enfermidades;
• Deve-se obter uma quantidade suficiente de amostra para realização das técnicas de cultivo solicitadas;
Enviar ao laboratório swab seco ou secreções escassas é uma prática inútil e de custo
considerável para o paciente;
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
• Devem ser utilizados dispositivos de colheita, recipientes de amostras e meios de cultura apropriados para assegurar isolamento ótimo de microrganismos.;
Calcularam que o rendimento do isolamento de microrganismos a partir
de culturas de sangue aumentava em cerca de 3% por mL de sangue
colhido; (Mermel e Maki).
Com demasiada freqüência, são enviados ao laboratório 0,5 mL ou menos de material identificado como “escarro” ou “lavado
brônquico”;bactérias anaeróbicas
Swabs retais para isolar espécies de Shigella, o material
colhido deve ser inoculado diretamente na superfície de ágar Mac Conkey ou caldo
enriquecido para gram-negativos
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
• Sempre que possível, deve-se obter amostras antes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, número de idenficacção,
origem, médico e a data/hora da colheita;
Garganta
Neisseria gonorrhoea
Amostrasgeniturinárias
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Líquido cefalorraquidiano (LCR)• O recipiente da amostra deve ser rotulado de
forma correta;
Colheita de AmostrasOutros exemplos importantes.
O objetivo primário no transporte de amostras para diagnóstico consiste em manter a amostra o mais próximo possível de seu estado original, com deterioração mínima, e minimizar os riscos para os transportadores das amostras, utilizando-se dispositivos protetores do recipiente da amostra inseridos no interior de um recipiente adequado.
Transporte de Amostras
Transporte de Amostras
Deve-se evitar:
Condições ambientais adversas
Frio
Calor extremoMudanças na pressão
Transporte de Amostras
Se for previsto:
Um atraso prolongado (acima de 4 dias por exemplo) antes da amostra ser processada;
É preferível congelar a amostra a -70ºC, podendo ser utilizado um congelador a -20ºC, se o período de estocagem for breve.
Transporte de Amostras
As amostras de escarro colhidas principalmente para o isolamento:
Podem ser remetidas sem qualquer tratamento desde que colhidas em recipientes de propileno ou polietileno esterilizados.micobactérias fungos
Transporte de Amostras
A maioria das amostras líquidas, em particular amostra de urina, deve ser transportada ao laboratório o quanto antes possível:
Contexto hospitalar
Recomenda-se um limite máximo de 2 horas entre a colheita e a chegada da amostra ao laboratório.
Transporte de Amostras
O limite de tempo representa um problema quando as amostras são colhidas em consultórios particulares.
Amostras de urina
Podem ser utilizados recipientes contendo uma
pequena quantidade de ácido bórico, se o
transporte rápido não for possível.
Transporte de Amostras
Para a maioria das amostras pode ser utilizado um meio de manutenção ou transporte, seguindo-se as instruções do fabricante.
Meio de transporte Stuart
Solução tampão, isenta de nutrientes e fatores de crescimento, conserva a viabilidade sem permitir a multiplicação das bactérias durante o transporte.
Transporte de Amostras
• Tioglicolato de sódio – tem função de agente redutor para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias;
• Ágar (pequena quantidade) – proporciona uma consistência semi-sólida que impede a oxigenação e o derrame durante o transporte;
Transporte de Amostras
Solução de borato de sódio
Tampão com sacarose, fosfato e glutamato
Transporte de Amostras
As amostras devem ser embaladas de modo a suportar golpes ou mudanças de pressão que podem ocorrer durante a manipulação e causar vazamento do conteúdo;
Um recipiente que vaza não apenas predispõe a amostra a uma potencial contaminação, mas também expõe os microrganismos ao pessoal que transporta ou recebe a amostra;
Transporte de AmostrasTécnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos:
Recipiente primário com tampa à prova d’água
Recipiente secundário de preferência de metal
Embalagem para envio fabricada em cartão
ondulado, cartão grosso ou gomaespuma
Recepção de Amostras
jalecos
luvas
máscaras
Processamento de Amostras
• Ingresso de dados essenciais em um livro de registros ou em um terminal de computador;
• Exame visual e determinação do cumprimento de todos os critérios para
aceitação da amostra;
• Para certas amostras, o exame microscópico de montagens úmidas ou de esfregaços corados, para estabelecer um diagnóstico presuntivo;
Processamento de Amostras
USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:
É recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos diretos das amostras enviadas para cultivo;
Rápido diagnóstico presuntivo Guia para selecionar os meios
de cultura apropriados
Processamento de AmostrasColoração de Gram
• Cristal violeta – serve como coloração primária, unindo-se à parede celular bacteriana após tratamento com uma solução de iodo fraca (mordente para a ligação do corante);
• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) – as bactérias que retêm o corante aparecem azuladas se observadas ao microscópio e são denominadas gram-positivas;
Processamento de AmostrasColoração de Gram
• Contracorante Safranina – certas bactérias perdem a coloração primária com cristal violeta quando são tratadas com o descorante e captam a contracoloração com safranina e aparecem em vermelho quando observadas ao microscópio, denominando-se gram-negativas;
A coloração de Gram pode ser utilizada para efetuar identificações presuntivas.
Processamento de AmostrasColorações de àlcool-ácido-resistência
Recobertas por um espesso material ceroso que resiste à coloração,
entretanto, uma vez coradas, resistem à
descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes,
como o álcool-ácido.
Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).
micobactérias
Processamento de Amostras
Azul de toluidina e Azul de Metileno
OUTROS CORANTES:
Laranja de acridina
Coloração com Prata
Coloração com Wright-Giemsa
Ácido periódico de Schiff
Processamento dos Cultivos
Após recebimento de amostras para cultivo no laboratório de microbiologia, devem ser tomadas as seguintes decisões:
• Selecionar os meios de cultura primários apropriados para o tipo de amostra particular;
• Determinar a temperatura e a atmosfera de incubação para isolar todos os microrganismos potencialmente significativos;
Processamento dos Cultivos• Determinar qual dos microrganismos
isolados em meios primários requer uma maior caracterização;
• Determinar se são necessárias provas de suscetibilidade a antibióticos, uma vez conhecida a identidade do organismo;
Comum a todos é o reconhecimento das dificuldades envolvidas na manutenção da qualidade dos serviços, em vista das políticas de redução de custos, cada vez mais rigorosas;
Seleção de Meios de Cultura Primários
Meios não-seletivos – são isentos de inibidores e permitem o crescimento de microrganismos encontrados freqüentemente em laboratórios clínicos;
Ágar com 5% de sangue de carneiro
Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha
Haemophilus influenzae
Ágar com sangue humano
Gardnerella vaginalis
Ágar sangue
Colistina e o ácido nalidíxico
Inibe gram-negativos e favorece o crescimento de
gram-positivos
Seleção de Meios de Cultura Primários
Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante a adição de um ou mais antibióticos ou de certas substâncias químicas;
Ágar-KV
Canamicina e vancomicina
Bacilos gram-negativos anaeróbios (bacteroides)
Ágar McConkey Ágar EMB
Inibem gram-positivos
Seleção de Meios de Cultura Primários
O caldo de enriquecimento é empregado para isolar microrganismos patogênicos de amostras, como fezes, nas quais existe uma elevada concentração de microrganismos comensais;
Salmonella e Shigella
Escherichia coli e outros comensais entéricos
Fase logaritmica
Fase de latência
Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os vários critérios para rejeição e tenha sido aceita para cultivo, porções apropriadas da mesma devem ser transferidas aos vários meios de cultura descritos no item anterior. Essa atividade também é usualmente realizada em uma parte separada de outras áreas do laboratório, conhecida como área de “semeadura”;
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
jalecos
luvas
máscaras
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
O equipamento necessário para a inoculação primária de amostras é relativamente simples:
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Espalhamento nos quatro quadrantes
UFC
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido (0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semi-sólido é adequado para as provas de motilidade;
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Os microrganismos diferem quanto à temperatura ótima de incubação. Porém, a
maioria dos microrganismos cresce a 35ºC; assim, se o laboratório dispõe apenas de uma
estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;
O crescimento da maior parte dos microrganismos é potencializado por uma
atmosfera de 5% a 10% de CO2;
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na
temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de ar-
condicionado ou de fluxos de calor;
O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos
microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;
Interpretação dos Cultivos
A identificação dos cultivos primários após 24 a 48 horas de incubação requer uma considerável habilidade;
Essa avaliação se faz:
O microbiologista deve avaliar o crescimento das colônias e decidir se são necessários procedimentos adicionais;
Interpretação dos Cultivos
• Anotando as características e o número relativo de cada tipo de colônia isolada em meios de ágar;
• Determinando a pureza, reação à coloração de Gram e morfologia das bactérias em cada tipo de colônia;;
• Verificando mudanças no meio que circunda as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias
isoladas;
Interpretação dos Cultivos
Características macroscópicas das colônias
OBRIGADO