MARIA APARECIDA FERNANDES

PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA

EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ACANTHURIDAE

(PERCIFORMES)

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

NATAL-RN

2015

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Sistemática e Evolução

da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, em cumprimento às exigências para

obtenção do título de Mestre em Sistemática

e Evolução.

1

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro

de Biociências

Fernandes, Maria Aparecida.

Padrões temporais e grau de diversificação cariotípica em espécies

Atlânticas da família Acanthuridae (Perciformes) / Maria Aparecida

Fernandes. – Natal, RN, 2015.

54 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Sistemática e Evolução.

1. Evolução cromossômica. – Dissertação. 2. Fusões cêntricas. –

Dissertação. 3. Acanthuridae. – Dissertação. I. Molina, Wagner Franco

II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 575

2

MARIA APARECIDA FERNANDES

PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA

EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ACANTHURIDAE

(PERCIFORMES)

Área de concentração: Sistemática e Evolução

Aprovada em 26/03/2015

BANCA EXAMINADORA:

__________________________________________________________

Dr. Wagner Franco Molina

Universidade Federal do Rio Grande Do Norte

(Orientador)

___________________________________________________________

Dra. Sathyabama Chellappa

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

___________________________________________________________

Dr. Roberto Ferreira Artoni

Universidade Estadual de Ponta Grossa

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Sistemática e Evolução

da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, em cumprimento às exigências para

obtenção do título de Mestre em Sistemática

e Evolução.

3

DEDICATÓRIA

A meus pais Vilmar (In memoriam) e Inácia,

por todo amor, conselhos e dedicação, e a

meu esposo Leandro pelo incondicional

apoio ao longo desses anos. A vocês todo

meu amor e gratidão.

4

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer especialmente aos meus pais, por todo esforço empenhado em minha

educação. As minhas irmãs (Josivânia e Josenilda) e irmãos (Adriano, Mariano e João Paulo)

pela maravilhosa convivência familiar, pelo carinho demonstrado e principalmente pela

compreensão nos momentos difíceis!

Ao meu esposo Leandro pelo companheirismo e por contribuir sempre de maneira

incondicional para o meu crescimento pessoal e profissional.

Ao professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio, orientação e confiança depositados

durante a realização deste trabalho.

Aos companheiros de luta do LGRM: Gideão, Karlla, Rafael, Rodrigo, Amanda, Paulo,

Clóvis, Juliana, Inailson, Allyson, Josi, Roberta, Calado e Cris. Obrigada a todos pelas

significativas contribuições seja nos procedimentos laboratoriais e/ou em campo, e pelos

momentos de descontração durante nossos cafezinhos.

Registro também meu agradecimento à minha querida professora Drª. Simone Almeida por

todo apoio, disponibilidade e conselhos (acadêmicos e pessoais) desde os primeiros

momentos da minha vida acadêmica.

Agradeço também as professoras Drª Danielle Pereti, Danielly Alves e Drª Maisa Clari pelo

apoio durante a graduação e a transição para o mestrado.

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.

À UFRN e ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução por me permitir

concluir mais esta estapa de meu processo educacional.

Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,”,

FAPESB (no. APP0064/2011) e ICMBio/SISBIO (licenças 19135-1, 131360-1, e 27027-2)

pela autorização de coleta de espécimes.

5

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Acanthuridae 11

1.2. Filogenia e evolução da família Acanthuridae 12

1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Acanthurus 13

1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas

16

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral 19

2.2. Objetivos específicos

19

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material 20

3.2. Métodos 20

3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos 20

3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo 20

3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolo 21

3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva 21

3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos 21

3.2.6. Hibridação in situ fluorescente FISH 22

3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridação 22

3.2.6.2. Hibridação cromossômica

22

4. CAPÍTULO I - Sequential Steps of Chromosomal Differentiation in

Atlantic Surgeonfishes: Evolutionary Inferences

24

5. CAPÍTULO II - Atlantic Surgeonfishes Bear Only Minor

Microstructural Changes in Highly Derived Karyotypes

37

6. CONCLUSÕES

48

7. REFERÊNCIAS 49

6

LISTA DE FIGURAS

Parte introdutória

Figura 1. (a) Hipótese filogenética para a família Acanthuridae,

modificado de Sorenson et al. (2013). (b) Relações entre

espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta

por Bernal & Rocha (2011).

13

Figura 2. Espécime de Acanthurus coeruleus. Em destaque indivíduo na

fase juvenil. Barra: 2 cm.

15

Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm. 15

Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm. 16

Capítulo 1

Figura 1.

Mapa da América do Sul mostrando os pontos de coleta de

Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) no

estado do Rio Grande do Norte (1) e Bahia (2), nordeste do

Brasil.

26

Figura 2.

Figura 3.

Cariótipos de Acanthurus coeruleus ((a) e (b)) com 2𝑛 = 48, A.

bahianus ((c) e (d)) com 2𝑛 = 36, e A. chirurgus ((e) e (f) ) com

2𝑛 = 34, após coloração convencional com Giemsa ((a), (c), e

(e)) e badamento-C ((b), (d) e (f)). Os cromossomos portadores

de RONs, de cada espécie, após tratamento com nitrato de prata

são apresentados em caixas (par 2 de A. coeruleus e par de 8 de

A. bahianus e A. chirurgus).

Idiogramas de conjuntos cromossômicos de Acanthurus

coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) mostrando as

características citogenéticas mais conspícuas divididas em

caixas. Em (d), o cariótipo basal dos Perciformes (2𝑛 = 48a) e

uma hipótese filogenética com base em rearranjos

28

29

7

cromossômicos sequênciais inferidos nas três espécies

Acanthurus.

Capítulo 2

Figura 1. Cariótipo e metáfases de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A.

chirurgus (C) após a coloração Giemsa (esquerda), two-color

FISH (centro) com DNAr 18S (vermelho) e 5S DNAr (sinais

verdes) distribuição de sondas de (TTAGGG)n sequências

(direita). Caixa, os cromossomos portadores de RONs são

mostrados após a coloração de nitrato de prata (esquerda) e

coloração com fluorocromos (centro). Barra = 5m.

40

Figura 2.

Idiograma de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A. chirurgus

(C), combinando os resultados de NOR / localização de região

rica em GC e mapeamento físico de ribossomal e sequências

teloméricas. Os cromossomos homeólogos derivados de

inversões pericêntricas (cromossomos sm-st) e fusões cêntricas

(m-cromossomos) são destacados nas caixas. O asterisco no par

7 de A. chirurgus indica uma suposta autapomorfia (fusão em

tandem) para esta espécie.

44

8

LISTA DE ABREVIATURAS

2n – Número diploide

a – Acrocêntrico

AFLP – Amplified fragment lenght polymorphism

AgNO3 – Nitrato de prata

Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato

de prata

AT – Adenina e Timina

Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário

BC – Bandamento C

CMA3 – Cromomicina A3

DAPI – 4`4’,6-diamidino-2-fenilindol

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DNAr/rDNA – Ácido desoxirribonucleico ribossômico

FISH – Fluorescence in situ hybridization

GC – Guanina e Citosina

HCl – Ácido clorídrico

KCl – Cloreto de potássio

LGRM – Laboratório de Genética de Recursos Marinhos

m – Metacêntrico

Ma – Milhões de anos

MM - Mitramicina

n – Número amostral

NF – Número fundamental

RN – Rio Grande do Norte

RNAr/rRNA – Ácido ribonucleico ribossômico

RONs – Regiões organizadoras de nucléolo

sm – Submetacêntrico

st – Subtelocêntrico

UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte

9

RESUMO

A família Acanthuridae é um grupo bastante representativo dentre os peixes marinhos e que

desempenha um papel fundamental na dinâmica ecológica dos recifes de corais. Três espécies

pertencentes ao gênero Acanthurus são comuns ao longo dos recifes costeiros do Atlântico

Ocidental: A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus. No presente estudo, são apresentados

dados citogenéticos para estas três espécies de Acanthurus com base em métodos

citogenéticos clássicos e no mapeamento de sequências ribossomais repetitivas, como DNAr

18S e 5S, além de sondas teloméricas com a finalidade de auxiliar na compreensão da

carioevolução deste grupo. O padrão citogenético dessas espécies indica que as etapas

sequenciais de rearranjos cromossômicos, que datam 19-5 milhões de anos atrás (Ma), são

responsáveis por suas diferenças interespecíficas. Acanthurus coeruleus (2n=48; 2sm + 4st +

42a), A. bahianus (2n=36; 12m + 2sm + 4st + 18a) e A. chirurgus (2n=34; 12m + 2sm + 4st +

16a) compartilham um antigo conjunto de três pares cromossômicos originados através de

inversões pericêntricas. Um conjunto de seis grandes pares metacêntricos formados por

translocações Robertsonianas (Rb) encontrado em A. bahianus e A. chirurgus e uma suposta

fusão em tandem presente em A. chirurgus são eventos mais recentes. A falta de sequências

teloméricas intersticiais (ITS), apesar de várias fusões cêntricas em A. bahianus e A.

chirurgus pode estar relacionada com o longo período de tempo após a sua ocorrência

(estimado em 5 Ma). Além disso, as homeologias entre os pares de cromossomos que

carregam os genes ribossomais, além de outras características estruturais, destacam grandes

regiões cromossômicas conservadas nas três espécies. Nossos resultados indicam que as

mudanças macroestruturais ocorreram durante a cladogênese dessas espécies não foram

seguidas por rearranjos microestruturais visíveis nos cariótipos.

Palavras-chave: Evolução cromossômica; fusões cêntricas; rearranjos Robertsonianos;

Acanthuridae; telômeros.

10

ABSTRACT

The Acanthuridae family is a representative group from the marine fish that plays a key role

in ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of

Western Atlantic: Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus and Acanthurus chirurgus. In

the present study, cytogenetic data are presented for these three species Acanthurus based on

classical cytogenetic methods and mapping of repetitive sequences such as ribosomal 18S and

5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype evolutionary analyses. The

cytogenetic pattern of these species indicated sequential steps of chromosomal

rearrangements dating back 19 to 5 millions of years ago (M.a.) that accounted for their

interspecific differences. A. coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36;

12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a) share an older set of three

chromosomal pairs that were originated through pericentric inversions. A set of six large

metacentric pairs formed by Robertsonian (Rb) translocations found in A. bahianus and A.

chirurgus and a putative in tandem fusion found in A. chirurgus are more recent events. The

lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several centric fusions in A. bahianus

and A. chirurgus might be related to the long period of time after their occurrence (estimated

in 5 M.a.). Furthermore, the homeologies among the chromosome pairs bearing ribosomal

genes, in addition to other structural features, highlight large conserved chromosomal regions

in the three species. Our findings indicate that macrostructural changes occurred during the

cladogenesis of these species were not followed by conspicuous microstructural

rearrangements in the karyotypes.

Keywords: Chromosomal evolution; centric fusions; Robertsonian rearrangements;

surgeonfish; telomeres.

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Acanthuridae

A família Acanthuridae está inserida na Ordem dos Perciformes, subordem

Acanthuroidei. Esta família conta com seis gêneros (Acanthurus, Ctenochaetus, Naso,

Paracanthurus, Prionurus e Zebrasoma) subdivididos em 80 espécies (NELSON, 2006). É

caracterizada morfologicamente por indivíduos de pequeno a médio porte, podendo chegar a

36 cm, com um corpo alto, oval e comprimido lateralmente (RANDALL, 2001).

São conhecidos popularmente como peixes-cirurgião (surgeonfishes), devido à

presença de um espinho dobrável alojado dentro de uma bainha em cores, em ambos os lados

do pedúnculo caudal, utilizado durante comportamentos agressivos inter e intraespecíficas.

Tal característica constitui-se como a autapomorfia compartilhada pelo grupo (RANDALL,

2001).

Os cirurgiões são exclusivamente marinhos e distribuídos em mares tropicais e

subtropicais de todo o mundo, sendo ausentes somente no Mediterrâneo (NELSON, 2006). A

maioria das espécies de Acanthuriadae são herbívoras errantes diurnos com associação

obrigatória a ambientes recifais (BELLWOOD; WAINWRIGHT, 2002; NELSON, 2006). A

maioria das espécies de Acanthuridae têm estômagos com paredes finas e pastam em algas, e

alguns têm estômagos semelhantes a moelas, com paredes espessas estes utilizam a areia para

macerar detritos (FERREIRA et al., 2004; RANDALL, 2005).

Este grupo possui uma posição relevante do ponto de vista ecológico e evolutivo nas

comunidades dos recifes tropicais. Sendo um importante agente físico (bioerosão) devido sua

atividade de escavar o substrato contribuindo para sedimentação intensiva e biológica

(herbivoria) influenciando na composição, desenvolvimento, abundância e padrão de

distribuição da população de algas e comunidades associadas (HORN, 1989).

Ao longo de sua história de vida sofrem mudanças ontogenéticas sobre os aspectos

da preferência por tipos de habitats (FERREIRA et al., 2004; ROCHA, 2002) com ovos

planctônicos que eclodem após cerca de um dia, um período pelágico larval relativamente

longo variando entre 51 até 75 o que lhes conferem enorme capacidade de dispersão e adultos

sedentários associados a recifes de corais (THRESHER, 1984; MUSS et al., 2001; ROCHA et

al., 2002, RANDALL, 2005).

Em ambiente natural os adultos podem ser observados geralmente formando

pequenos cardumes, e eventualmente indivíduos isolados. Entretanto, em períodos de

reprodução, ou, quando estão forrageando em territórios defendidos por outros peixes, podem

12

ser encontrados constituindo grandes cardumes heterogêneos (RISK, 1998; LAWSON, et al.,

1999; BELL e KRAMER, 2000; ROCHA et al., 2002).

1.2. Filogenia e evolução da Familia Acanthuridae

Acanthuridae é um grupo monofilético relativamente antigo, com cerca de 54

milhões anos (SORBINI e TYLER, 1998; TANG et al., 1999; SORENSON et al., 2013). A

primeira aparição da família se deu no Eoceno Médio. A maioria dos acanthurideos fósseis

conhecidos foi encontrada na região do Monte Bolca, no norte da Itália, que é a região mais

representativa da rica ictiofauna recifal do Eoceno (BELLWOOD, 1996; CLEMENTS et al.,

2003;. KLANTEN et al., 2004).

Embora muitos dos caracteres supraespecíficos que definem este grupo tenham uma

duração prolongada no registro fóssil, o moderno conjunto de espécies parece ser de origem

recente. Apoio à origem recente das espécies de peixes de recife é fornecido por McMillan e

Palumbi (1997), que apresentaram argumentos para especiação recente ligada às mudanças no

nível do mar, temperatura dos mares e clima global, ocorridas no Pleistoceno.

Questões referentes à filogenia desta família têm sido estudadas profundamente

através de evidências morfológicas (WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e

WINTERBOTTOM, 1993; TYLER et al., 1989) e análises moleculares (HOLCROFT e

WILEY, 2008; KLANTEN et al., 2004; TANG et al., 1999). De forma geral, as relações

filogenéticas dentro da família Acanthuridae estão bastante esclarecidas, entretanto, a relação

entre os gêneros Acanthurus e Ctenochaetus tem gerado controvérsias ao longo das décadas.

Embora a possibilidade de parafiletismo entre esses dois grupos já tivesse sido

sugerida com base em caracteres osteológicos compartilhados e caracteres merísticos

(RANDALL, 1955; WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993), esta

questão só foi elucidada por Clements et al. (2003) e mais tarde corroborada por Sorenson et

al. (2013), estabelecendo uma filogenia mais compreensiva desta família através de análises

moleculares (Figura1a). Além da corroboração da hipótese de parafiletismo entre os gêneros

Acanthurus/Ctenochaetus, existem indícios de que os gêneros desta família são relativamente

antigos, com intensos episódios de especiação, pelo menos três ao longo da história

filogenética (SORENSON et al., 2013; BERNAL e ROCHA, 2011).

Análises filogeográficas identificaram que A. bahianus, em relação às espécies A.

chirurgus e A. coeruleus, parece altamente sensível a restrição ecológica imposta pela pluma

de água doce do Orinoco-Amazonas (ROCHA et al., 2002) e tem sido utilizada como

exemplo de profunda estruturação populacional devido à separação evolutiva por uma barreira

13

geográfica. De fato, as linhagens do Atlântico Sul e do Caribe de A. bahianus são, na verdade,

espécies diferentes, a linhagem caribenha foi nomeada como A. tractus (Figura 1b) (BERNAL

e ROCHA, 2011).

O plano corporal comum aos cirurgiões atuais apareceu no limite entre o

Paleoceno/Eoceno Inferior, e passou por uma dramática radiação durante o Eoceno Médio (50

Ma). Dentro do gênero Acanthurus a irradiação da espécie A. coeruleus ocorreu em meados

do Mioceno (20 Ma) e a separação entre A. chirurgus e A. tractus (espécie irmã da A.

bahianus) no Final do Mioceno (10 m.a.) (SORENSON et al., 2013).

1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Acanthurus

O gênero Acanthurus possui ao todo 36 espécies, sendo o único, dentre toda a

família, a ocorrer no Atlântico Ocidental (RANDALL, 2002). Na costa brasileira podemos

encontrar três espécies deste gênero: Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801),

Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787), Acanthurus bahianus Castelnau (1855) (RANDALL,

1956; MENEZES e FIGUEIREDO, 1985; FLOETER et al., 2008; BERNAL e ROCHA,

2011).

A taxonomia detalhada das espécies citadas é representada por:

Filo - Chordata

Subfilo - Craniata

Figura 1. (a) Hipótese filogenética para espécies do gênero Acanthurus, modificado de Sorenson et al. (2013).

(b) Relações entre espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta por Bernal & Rocha (2011).

a b

14

Superclasse - Gnasthostomata

Classe - Actinopterygii

Subclasse - Neopterygii

Divisão - Teleostei

Subdivisão - Euteleostei

Superordem - Acanthopterygii

Série - Percomorpha

Ordem - Perciformes

Subordem - Acanthuroidei

Família - Acanthuridae

Subfamília - Acanthurinae

Tribo - Acanthurini

Gênero - Acanthurus Forsskål (1775)

Espécies - Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787)

Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801)

Acanthurus bahianus Castelnau (1855)

A espécie A. coeruleus (Figura 2), exibe um comportamento territorialista, embora

possam eventualmente, formar pequenos cardumes. São quase que exclusivamente

herbívoros, e por isso, diferentemente das demais espécies aqui estudadas, possui um

estômago com parede mais finas. Pode ser encontrada em profundidades que variam de 2-60

metros (LAWSON e KRAMER, 1999; ROCHA et al., 2000). Sua diagnose apresenta 9

espinhos e 26-28 raios na nadadeira dorsal e anal com 3 espinhos e 24-26 raios. A coloração

do corpo quando juvenis é na cor amarela passando gradativamente ao azul violáceo com

linhas estreitas e escuras no flanco quando adultos; eventualmente, durante o período

reprodutivo, os machos podem adquirir um padrão bicolor, mais escuro na porção anterior e

mais claro na porção posterior do corpo (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e

MENEZES, 2000; ARAÚJO et al., 2004).

15

A mais comum dentre as espécies de acanthurideos encontradas no litoral brasileiro,

A. chirurgus (Figura 3), geralmente, formam grandes cardumes, tem preferência por recifes

mais rasos e possui hábito alimentar semi-detritívoro (DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO

et al., 2010). Morfologicamente se diferencia das demais espécies por apresentar a nadadeira

dorsal com 9 espinhos e 24-25 raios; a nadadeira anal com 3 espinhos e 22-23 raios e caudal

emarginada. A coloração do corpo é acinzentada com 10 barras verticais mais escuras e o

pedúnculo caudal mais claro que o restante do corpo (CERVIGÓN et al., 1993;

FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER, 2002).

A espécie A. bahianus (Figura 4) é caracterizada por apresentar na nadadeira dorsal

com 9 espinhos e 23-26 raios e anal com 3 espinhos e 21-23 raios. O padrão de cor do corpo é

semelhante ao A. chirurgus, com ausência das barras verticais nos flancos e uma nadadeira

caudal lunada (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER,

2002). Ocorre em grupos de cinco ou mais indivíduos, habitando recifes rasos de até 25

Figura 2. Espécime de Acanthurus coeruleus. Em destaque indivíduo na fase juvenil. Barra: 2 cm.

Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm.

16

metros (ROCHA, 2002). Considerada também como semi-detritívora, tem em comum com A.

chirurgus e algumas outras espécies do gênero, a presença de um estômago constituído por

paredes grossas semelhantes a uma “moela” onde a areia ingerida ajuda a triturar as algas

(FERREIRA e GONÇALVES, 2006; DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO et al., 2010).

1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas

Análises citotaxonômicas contribuem significativamente para o estudo da evolução

pelo fato do material genético estar contido nos cromossomos (ALMEIDA-TOLEDO, 1998).

Portanto, alterações como, rearranjos cromossômicos, polimorfismos estruturais e/ou

numéricos, poliploidia natural, sistemas de cromossomos sexuais entre outros, são quase

sempre significativas para que se possa inferir o rumo evolutivo das espécies (GUERRA,

1988).

As técnicas citogenéticas convencionais (Giemsa, banda-C, Ag-RONs) e moleculares

como a marcação com fluorocromos base-específicos (DAPI/MM) e o desenvolvimento nos

últimos anos, de novas ferramentas de análise mais aprofundadas como a técnica de

Hibridação in situ Fluorescente (FISH), são de grande importância na identificação de

diversificação cromossômica. Juntas, a citogenética clássica e a molecular têm fornecido

contribuições importantes para o entendimento da composição e estrutura dos cromossomos e

em estudos que visem à formulação de hipóteses filogenéticas (BERTOLLO et al., 1978;

FELDBERG et al., 2003; MARTINS et al., 2011).

A técnica por impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) é utilizada para

evidenciar as Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs), porção particulalrmente variável

do genoma eucarioto, as quais possuem sítios ribossômicos ativos, que podem estar

Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm.

17

localizados nas posições terminais ou intersticiais dos cromossomos (FORESTI e TOLEDO,

1985). A caracterização do número e posição das RONs tem sido muito utilizada em peixes e

pode constituir um excelente marcador citotaxonômico para alguns grupos (GALETTI, 1998;

MOLINA et al., 2002).

Os bandamentos cromossômicos foram as primeiras ferramentas usadas para

comparação de genomas, pois, espécies próximas apresentam um padrão muito similar de

bandas tornando o estudo comparativo viável. O bandamento C permite a localização de

regiões ricas em heterocromatina constitutiva (sequências de DNA altamente repetitivas). Em

estudos evolutivos, a análise de heterocromatina pode fornecer dados para a caracterização de

ocorrência de rearranjos em espécies próximas (MEDRANO et al., 1988).

O uso de fluorocromos é muito importante, principalmente DAPI e MM tem sido

muito usados para discriminar a composição de bases da região heterocromática e o número e

localização dos sítios de DNA ribossomal (MARTINS et al., 2011).

Com o desenvolvimento da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), a

citogenética obteve avanços significativos para o conhecimento do genoma com base nos

cromossomos (MARTINS et al., 2011). Esta técnica definiu a transição da era clássica da

citogenética à era molecular, permitindo estudos mais detalhados com a integração da

informação molecular das sequências de DNA e sua localização física ao longo dos

cromossomos e genomas (SCHWARZACHER, 2003; JIANG e GILL, 2006).

Análises citogenéticas moleculares utilizando a técnica de FISH são atualmente

muito utilizadas e vêm se mostrando eficientes ferramentas no estudo da evolução cariotípica

em peixes, devido ao mapeamento de sequências ribossomais 5S e 18S (MARTINS e

GALETTI, 2001; MOLINA, 2002; MARTINS et al., 2011a; MOTTA-NETO et al., 2011b;

CALADO et al., 2013; CALADO et al., 2014).

Informações citogenéticas em peixes marinhos têm aumentado nas últimas décadas,

Entretanto, somente cerca de 7% das espécies, em sua maioria da Ordem Perciformes, grupo

mais representativo entre os teleósteos (NELSON, 1996; GALLETTI et al., 2000). Onde, em

grande parte de suas espécies, um padrão marcante de conservadorismo cromossômico, com

número diploide composto por 48 cromossomos acrocêntricos (MOLINA, 2007; MOTTA-

NETO et al., 2011).

Uma maior divergência de padrões cariotípicos em Perciformes é geralmente descrita

para espécies dulcícolas, representada pela família Cichlidae e Percidae (OHNO, 1974), ou

em grupos sedentários como Gobiidae e Bleniidae (BRUM e GALETTI, 1997). Além disso,

variações genéticas no ambiente marinho podem ser principalmente encontradas em espécies

18

que se mostram adaptadas ou isoladas em ambientes singulares, como, as que são associadas a

recifes de corais e ilhas oceânicas, onde as massas de água que os circundam podem funcionar

como a barreira geográfica e limitar a dispersão (PALUMBI, 1994; ROCHA, 2003).

Os peixes recifais são principalmente compostos por Perciformes e contêm uma

elevada diversidade de espécies que representam linhagens evolutivas distintas. Dentre os

Perciformes um dos grupos mais representativos e carismáticos é a família Acanthuridae

(ROBERTSON, 1983; LAWSON et al., 1999), que devido a sua diversidade na forma de

forrageamento e sua forte associação com recifes de corais são um grupo bastante utilizado

em estudos que busquem identificar o ritmo de evolução que conduz a biodiversidade em

peixes de corais, e na investigação da importância dos fatores ecológicos na diversificação de

ambientes recifais (SORENSON et al., 2013).

A família Acanthuridae é relativamente bem estudada, sobretudo sob aspectos da

evolução morfológica (TYLER, 1970a, b; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993; BORDEN,

1998; WINTERBOTTOM, 1993), e da filogenia molecular (ROCHA et al., 2002;

CLEMENTS et al., 2003; BERNAL e ROCHA, 2011; SORENSON et al., 2013). Entretanto,

no que tange a evolução cromossômica, a família Acanthuridae ainda está sub-representada,

menos de 5% das espécies, sendo todas no oceano Pacífico (ARAI, 2011).

As três espécies analisadas do Pacífico, Acanthurus triostegus (LINNAEUS, 1758),

Prionorus scalprum Valenciennes, 1835 (ARAI e INOUE, 1976) e Ctenochaetus striatus

(QUOY e GAIMARD, 1825) (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) mostram um cariótipo

conservado com 2n=48 acrocênticos, considerado basal entre os Perciformes (BRUM e

GALETTI, 1997; ARAI, 2011). Não existem quaisquer informações sobre espécies de

Acanthuridae presentes no Oceano Atlântico, a ausência destas informações impede

inferências filogenéticas e dificulta uma visão mais ampla dos processos de evolução

cariotípica do grupo.

19

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Tendo em vista a importância das informações citogenéticas e a carência delas no

que diz respeito às espécies da família Acanthuridae, o presente trabalho tem como foco

principal estabelecer aspectos carioevolutivos, com base em análises da citogenética clássica e

molecular de três espécies da família Acanthuridae presentes no Atlântico Ocidental.

2.2 Objetivos específicos

Caracterizar cromossomicamente por meio de bandamento C, Ag-RONs e coloração

com fluorocromos base-específicos MM/DAPI as espécies A. coeruleus, A. bahianus e

A. chirurgus.

Mapear as sequências das subunidades ribossomais DNAr 5S e 18S por meio de dual-

color FISH das espécies analisadas das famílias Acanthuridae.

Identificar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica das

espécies estudadas.

20

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material

Os exemplares das espécies A. coeruleus (n=23), A. bahianus (17) e A. chirurgus

(12) foram coletados ao longo da costa de Natal, Rio Grande do Norte (5o46'S, 35

o12'O) e

Salvador, Estado da Bahia (13°00'S, 38°32'O), nordeste do Brasil. As coletas ocorreram por

meio de mergulho livre em recifes costeiros nas áreas citadas utilizando-se de apetrechos de

pesca como puçás e tarrafas. Após a coleta os exemplares foram transportados vivos ao

Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, e mantidos em aquários aerados até que se procedesse à realização de preparações

cromossômicas.

3.2. Métodos

3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos

Vinte e quatro horas antes da preparação cromossômica, os animais foram

inoculados via intramuscular com uma solução de complexos antígenos para indução mitótica

(MOLINA et al., 2010). Após esse período, os exemplares foram anestesiados e sacrificados

seguindo procedimento estabelecido por Blessaing et al. (2010).

Para obtenção de cromossomos mitóticos, fragmentos do rim anterior foram

adicionados em meio de cultura RPMI 1640 de acordo com a técnica in vitro preconizada por

Gold et al. (1990). Os fragmentos foram dissociados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640

através de aspirações com seringas de vidro de 10 ml até obter um mistura homogênea, onde

foi adicionado 5 gotas de colchicina 0,025%, deixando agir por 30 minutos em temperatura

ambiente. Após o processo anterior o material foi centrifugado por 10 minutos a 1000 rpm.

Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 8 ml da solução hipotônica de KCl a 0,075M,

que após ser homogeneizada agiu por 28 minutos em temperatura ambiente. A suspensão

celular foi pré-fixada com 0,5 ml de solução de metanol e ácido acético (3:1) recém-

preparado. Após homogeneização a suspensão foi centrifugada por 10 minutos. O processo de

fixação do material foi repetido por 3 vezes, após o que as suspensões celulares foram

estocados em tubos Eppendorf de 1,5 ml à -20oC.

3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo

As suspensões celulares foram gotejada sobre uma lâmina recoberta por um filme de

água destilada aquecido a 60°C e corada com solução de Giemsa a 5%, diluída em tampão

fosfato pH 6,8.

21

As análises foram realizadas em microscópio óptico de epifluorescência Olympus™

BX51 e fotografadas sob aumento de 1.000X através de sistema digital de captura Olympus

DP70 utilizando o software DPController 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.). Cerca de

trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. As melhores metáfases foram

selecionadas para montagem do cariótipo a partir da nomenclatura preconizada por Levan et

al. (1964) com modificações, onde os cromossomos foram definidos, quanto à posição dos

centrômeros, em metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando

de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e

acrocêntricos (a), RB>7,01.

3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos

A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de

impregnação por prata preconizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina

previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 7 gotas de solução

gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml água e 0,5ml ácido fórmico), e 6 gotas

de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi homogeneizada com a

extremidade de uma lamínula e recoberta por ela sendo então incubada em estufa a 60°C, até

obtenção da cor amarelo escuro. Após a remoção da lamínula com jatos de água destilada,

eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações podiam ser coradas por

cerca de 20 segundos com solução de Giemsa a 5%.

3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva

A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C,

segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa a

37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâmina foi imersa em HCl 0,2 N por 14

minutos em temperatura ambiente, sendo lavada com água destilada e seca. Posteriormente a

lâmina foi mergulhada em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C por cerca de 1 minuto

e 35 segundos sendo rapidamente lavadas em HCl 0,1N e posteriormente água destilada. Após

secar ao ar, a lâmina foi então imersa em solução salina 2x SSC a 60°C em estufa por 40

minutos. Para análise o material foi corado com Giemsa 5% por 8 minutos.

3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos

Fluorocromos base-específicos foram utilizados para detectar regiões ricas em pares

de bases, como a Mitramicina (MM) para pares de bases GC e DAPI para regiões ricas em

22

pares de bases AT, de acordo com Carvalho et al. (2005). As lâminas com suspensão celular

de cada exemplar foram coradas com 30µl de (MM) 0,5 mg/ml cobertas com lamínulas e

depositadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada após 60 minutos,

coradas com 30 µl de DAPI 2µl/ml, cobertas por lamínulas e colocada em câmara úmida, no

escuro, por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com água destilada e

montadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1) coberto com lamínula e selado com

esmalte incolor. As lâminas foram então guardadas à 4oC em câmara escura e analisadas após

3 dias (DAPI) e 15 dias (MM) com fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus™ BX51)

com filtros apropriados, em aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo

sistema digital Olympus DP73 com uso do software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus

Optical Co. Ltd.).

3.2.6. Hibridação in situ fluorescente – FISH

3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridização

A FISH foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986) usando sondas teloméricas

de 18S e 5S. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidos a partir

de amostras de DNA de A. coeruleus via PCR utilizando os iniciadores A 5'-TAC CCG CGA

TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (PENDAS et al.,

1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT

ACG AG-3' (WHITE et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick

translation digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick

translation biotina-14-dATP (Roche) , de acordo com as especificações do fabricante. As

sequências (TTAGGG)n foram mapeadas pela técnica de FISH com Kit FISH Telomere

PNA/FITC de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation).

3.2.6.2. Hibridização cromossômica

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) foi realizada em metáfases mitóticas

(PINKEL et al., 1986) das três espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando

sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse

(20mg / mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C

por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em

série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC a

72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10%

de sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/µl). Após hibridação, overnight à 37°C, as

23

lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C

por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da

sonda foi detectado usando avidin-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina

rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados

com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico foram

realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos.

24

4. Capítulo I

Abstract

Surgeonfishes are a species-rich group and a major biomass on coral reefs. Three species are

commonly found throughout South Atlantic, Acanthurus bahianus, A. chirurgus, and A.

coeruleus. In this paper, we present the first cytogenetic data of these species, revealing a

sequential chromosomal diversification. A. coeruleus was characterized by a relatively

conserved karyotype evolved by pericentric inversions of some pairs (2n = 48, 2sm + 4st +

42a). In contrast, the karyotypes of A. bahianus (2n = 36) and A. chirurgus (2n = 34) were

highly differentiated by the presence of six large metacentric pairs in A. bahianus (12m + 2sm

+ 4st + 18a) and A. chirurgus (12m + 2sm + 4st +1 6a) probably derived by chromosomal

fusions that corroborate their closer relationship. A discernible in tandem fusion represents an

autapomorphic character to A. chirurgus. In spite of macrostructure variation, single nucleolar

organizer regions (NORs) on short arms of a subtelocentric pair and similar distribution of C-

bands were observed in the three species. Overlapping of chromosomal data with molecular

phylogeny indicated pericentric inversions which took place nearly at 19Ma while centric

fusions are as recent as 5Ma. A physical mapping of coding and noncoding sequences in

Acanthurus could clarify the role of additional rearrangements during their chromosomal

evolution.

25

1. Introduction

Acanthuridae are a monophyletic fish family composed of about 80 species,

popularly known as surgeonfishes or tangs (NELSON, 2006). This is an ancient group (nearly

54Ma) and most of genera (Acanthurus, Ctenochaetus, Naso, Paracanthurus, Prionurus e

Zebrasoma) diverged between 17 and 21 Ma in Early Miocene (NELSON, 2006).

Apparently, the Pacific Ocean is the center of origin of surgeonfishes, retaining most

of Acanthuridae richness (TANG et al., 1999; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993). Further

colonization events resulted in distribution of this family to virtually all tropical and

subtropical seas of the world, but Mediterranean Sea (SORENSON et al., 2013; TANG et al.,

1999) The genus Acanthurus is the largest within the family, but monophyly of the genus is

still controversial (TANG et al., 1999; CLEMENTS et al., 2003). This fish group is

morphologically and ecologically diversified, mainly in relation to foraging behavior and

dentition, composing one of themost representative herbivorous fish group on coral reefs

(TANG et al., 1999; FRANCINI-FILHO et al., 2010)

A total of four species of Acanthuridae, all belonging to the genus Acanthurus, are

present in western Atlantic (BERNAL e ROCHA, 2011). Three species are common along the

Brazilian coast (Western South Atlantic): Acanthurus coeruleus (blue tang), A. bahianus

(barber surgeonfish), and A. chirurgus (doctorfish) (BERNAL e ROCHA, 2011;

FIGUEIREDO e MENEZES, 2000). Another Acanthurus species (A. monroviae) was also

recorded off southeastern coast of Brazil, but it seems to be an occasional occurrence (LUIZ

JR. et al., 2004). Moreover, A. bahianus was thought to range from USA to southern Brazil,

but morphological and genetic analyses have shown that populations from Massachusetts to

Caribbean actually refer to another species, validated as A. tractus (FIGUEIREDO e

MENEZES, 2000).

In spite of the low diversity of Atlantic species when compared to Pacific and Indian

oceans, surgeonfishes are a dominant fish group forming large assemblages in several reef

areas from South Atlantic (TANG et al., 1999). A. coeruleus specimens are usually solitary

due to their territoriality behavior, while A. bahianus and A. chirurgus are commonly found in

small to large schools, depending on the ontogenetic stage (LAWSON et al., 1999). As most

Acanthurids, these species present relatively long pelagic larval stages with a mean duration

from 51,6 to 55,2 days (ROCHA et al., 2002). Usually, wide-range reef fish species with long

pelagic larval development are characterized by a lack of genetic subdivision among

populations (EBLE et al., 2011) and low rates of chromosomal variation (MOLINA, 2007).

26

However, reports about cytogenetic patterns of Acanthuridae are still

underrepresented (less than 5% of species) and restricted to Indo-Pacific species (ARAI,

2011). The three analyzed species from Pacific, Acanthurus triostegus, Prionurus scalprum

(ARAI & INOUE 1976), and Ctenochaetus striatus (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) all share

a conservative Perciformes-like karyotype with 2𝑛 = 48a, considered basal to this fish group

(BRUM e GALETTI, 1997).

In order to increase the karyotypic data of Acanthuridae and to infer the

chromosomal evolution of Atlantic species, cytogenetical analyses were carried out for three

Acanthuridae species from Brazilian coast, South Atlantic.

2. Material and Methods

Nine individuals of A. coeruleus, four individuals of A. bahianus, and 17 individuals

of A. chirurgus were cytogenetically studied. Animals were collected using hand nets (60x100

cm) by snorkeling at coastal reef areas from the states of Rio Grande do Norte (5°46’S,

35°12’W) and Bahia (13°00’S, 38°32’W and 13°52’S, 38°56’W) in northeastern Brazilian

shore (Figure 1). Right after collection, specimens were transported in plastic bags with

Figure 1. Map of South America showing the collections sites of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b),

and A. chirurgus (c) in the states of Rio Grande do Norte (1) and Bahia (2), northeastern Brazil.

27

oxygen to the laboratories and placed in 60 L tanks equipped with filtration and aeration

systems.

Twenty-four hours prior to chromosomal preparation, the animals were inoculated

via intramuscular with a solution of antigen complexes (Munolan) for mitotic induction

(MOLINA et al., 2010). After this period, the specimens were anesthetized and euthanized by

immersion in in water at 0–4º Cup to complete interruption of gill movements (Blessaing et

al., 2010). To obtain mitotic chromosomes in vitro, portions of anterior kidney were removed

and transferred to RPMI medium (Cultilab) with about 50 𝜇L of 0.025% colchicine, followed

by hypotonic treatment (KCL 0.075M) for 20 minutes at 37∘C and fixation in Carnoy’s

fixative (methanol : acetic acid 3 : 1) (GOLD et al., 1990). Chromosomes were stained with

5% Giemsa in phosphate buffer (pH 6.8) for karyotypic analyses. Nucleolus organizer regions

(NORs) were detected by silver nitrate staining (Ag-NORs) (HOWELL e BLACK, 1980),

whereas heterochromatic regions were evidenced by Cbanding (SUMNER, 1972).

Metaphases were photographed using an Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japan)

epifluorescence photomicroscope equipped with digital capture system. Chromosomes were

classified as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st), and acrocentric (a)

based on arm ratio (LEVAN, 1964). The pairs were arranged in decreasing order size

according to each morphological category (m, sm, st, and a) in karyotypes using the software

Adobe Photoshop CS6 v. 13.0.

3. Results

The three Acanthurus species showed remarkable karyotype diversification.

Acanthurus coeruleus presented 2𝑛=48, composed of two submetacentric, four subtelocentric,

and 42 acrocentric chromosomes (Figure 2(a)). The diploid number of A. bahianus equals

2𝑛=36 with a karyotype composed of 12 large metacentric, two submetacentric, four

subtelocentric, and 18 acrocentric chromosomes (Figure 2(c)) while A. chirurgus was

characterized by 12 large metacentric, two submetacentric, four subtelocentric, and 16

acrocentric chromosomes (2𝑛=34) (Figure 2(e)).

Small amounts of heterochromatin were detected mainly at pericentromeric regions

and interspersed with NORs in studied species (Figures 2(b), 2(d), and 2(f)). In A. bahianus,

terminal C-bands were also observed in some pairs (Figure 2(d)).

28

Single nucleolar organizer regions (NORs) were located by silver nitrate staining on

short arms of the largest subtelocentric pair in the three Acanthuridae species (Figure 2,

inbox). Based on chromosomal data, idiograms were generated to highlight particular

karyotype traits for each species and the inferred pathways of chromosomal differentiation

based on a phylogenetic hypothesis to Atlantic Acanthurus (Figures 3(a)–3(d)).

Figure 2: Karyotypes of Acanthurus coeruleus ((a) and (b)) with 2𝑛=48, A. bahianus ((c) and (d)) with 2𝑛=36,

and A. chirurgus ((e) and (f)) with 2𝑛=34 after conventional Giemsa staining ((a), (c), and (e)) and

C-banding ((b), (d), and (f)). The NOR-bearing chromosomes after silver nitrate staining of each

species are shown in boxes (pair 2 of A. coeruleus and pair 8 of A. bahianus and A. chirurgus).

29

4. Discussion

It is assumed that the presence of 48 acrocentric chromosomes represents a

plesiomorphic feature within Perciformes (BRUM e GALETTI JR., 1997; GALETTI JR. et

al., 2006). This condition is particularly frequent among marine fish and could be related to

Figure 3. Idiograms of chromosomes sets of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), and A. chirurgus (c)

showing the most conspicuous shared cytogenetic traits in boxes. In (d), the basal karyotype of

Perciformes (2n=48a) and a phylogenetic hypothesis based on sequential chromosomal

rearrangements inferred in the three Acanthurus species.

30

dispersal abilities (high gene flow) between populations, thereby preventing the fixation of

new chromosomal rearrangements and karyotypic divergence (MOLINA, 2007). In fact, the

low genetic structure in reef fish species has been correlated to the production of planktonic

eggs and/or larvae that can be dispersed over large distances (EBLE et al., 2011). This trend

(2n=48a) seems to be valid for Acanthuridae species from Indo-Pacific Ocean of different

genera, such as Acanthurus, Ctenochaetus, and Prionurus (ARAI, 2011). However,

inconsistent relationship between pelagic larval duration (PLD) and genetic connectivity or

chromosomal patterns has been reported in some marine species (ROCHA et al., 2002;

AFFONSO e GALETTI JR., 2005). In these cases, ecological and biogeographic aspects of

each species might be more relevant to explain the genetic variation than PLD itself, as

observed in the present study.

As expected for widely distributed species with long PLD, A. coeruleus presented

typical Perciformes-like features, that is, a diploid number of 48, single NORs, and a large

number of acrocentric chromosomes (Figure 2a).The karyotype of this species (2sm + 4st +

42a) demonstrates the occurrence of pericentric inversions in three chromosome pairs (1st,

2nd, and 3rd pairs), a common rearrangement in Perciformes that accounts for most of

karyotype diversification in marine fish (GALETTI JR. et al., 2006).

A similar set of three chromosomal pairs in both morphology and size is also

observed in A. bahianus and A. chirurgus, represented by a submetacentric pair and two

subtelocentric pairs, including the NOR-bearing pair. Because of the high resemblance of

such pairs in the three Acanthurus species, they are supposed to share a common origin before

the differentiation of each lineage, thereby indicating a symplesiomorphic trait. Estimates of

divergence time between the subclade that comprises A. coeruleus and that clusters A.

chirurgus and A. tractus (SORENSON et al., 2013), a sister-species of A. bahianus, suggest

that these putative homeologous pairs (sm and st) had arisen at nearly 19Ma.

On the other hand, A. bahianus and A. chirurgus presented an evolutionary

chromosomal pattern rarely found in typical marine fishes. The drastic reduction in diploid

number from 48 chromosomes to 2n=36 and 2n=34, respectively, along the presence of

large metacentric pairs is evidence of sequential Robertsonian rearrangements or centric

fusions (Figures 2c and 2e). Indeed, the uniqueness of Robertsonian translocations in

karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus (Figure 3), and similar size of metacentric pairs

reinforces these rearrangements are a recently shared trait between both species. An

additional fusion representing an autapomorphic condition is presented in A. chirurgus

31

karyotype since this species has an exclusive large sm pair (7th) and lacks the smallest

acrocentric pair observed in the other two species (Figure 2e).

The chromosomal speciation observed in Acanthurus species of South Atlantic is

likely to reflect historical events. Extensive analysis of biogeography and evolution of reef

fish from Atlantic indicated that changes in ocean dynamics over the past 10Ma have

determined the differential richness and endemism levels of fish genera and families of reef

fish (FLOETER et al., 2008). As discussed by Galetti et al. (2006) the rate of chromosomal

evolution in reef fish from Atlantic Ocean also seems to be strongly related to habitat

isolation of coastal areas during glaciation periods followed by further sea level uprising.

Unfortunately, no reports about time of divergence between A. bahianus and A.

chirurgus are available, thus hindering the minimum time span after Robertsonian

rearrangements that gave rise to the large metacentric chromosomes, herein referred as a

single trait. However, estimates inferred for A. chirurgus and A. tractus (SORENSON et al.,

2013) being the latter a sibling species of A. bahianus (FRANCINI-FILHO et al., 2010),

point out that these rearrangements took place by at least 5Ma. Even though the time

estimates for the occurrence of chromosomal fusions in both Acanthurus species might

require some bias correction, they are intermediary to periods of major biogeographic

isolation events in Atlantic Ocean such as Amazon outflow (∼10Ma) and uplifting of

Panama isthmus (∼3Ma) (Rocha, 2003). Nonetheless, the influence of these biogeographic

barriers in the putative fixation of chromosomal rearrangements remains unclear and further

cytogenetic studies in other species, particularly A. tractus, are highly encouraged.

Different from pericentric inversions, centric fusions or Robertsonian rearrangements

are usually reported in non-Perciformes marine fish, such as flatfish (Pleuronectiformes)

(BITENCOURT et al., 2014) toadfish (Batrachoidiformes) (COSTA e MOLINA, 2009) and

some mullets (Mugiliformes) (NIRCHIO et al., 2005) Centric fusions are particularly

common in Batoidea (stingrays, guitarfish, and skates), the most derived superorder of

elasmobranchs (ROCCO et al., 2007). Conversely, these rearrangements have been scarcely

identified in Perciformes at a polymorphic stage in Pomacentridae (MOLINA e GALETTI

JR., 2002) Gobiidae (GILES et al., 1985; THODE et al., 1985), Lutjanidae (NIRCHIO et al.,

2008), Apogonidae (OJIMA e KOJIMA, 1985) and Uranoscopidae (VITTURI et al., 1991)

or else restricted to a particular taxon like Sparisoma (parrotfishes) (SENA e MOLINA,

2007). Therefore, the karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus can be regarded as highly

derived in relation to basal karyotype suggested to Perciformes.

32

While the macrostructure was variable, the NOR-bearing chromosomes seem to be

conserved in the three species (Figure 2, inbox). This pattern indicates that these

chromosomal regions as poor cytotaxonomic markers, differing from other Atlantic fishes in

which the identification of ribosomal cistrons has proved to be efficient to distinguish

apparently homogeneous karyotypes, as in Lutjanidae (ROCHA e MOLINA, 2008)

Serranidae (MOLINA et al., 2002) and Gerreidae (CALADO et al., 2012) or even

population units (ACCIOLY et al., 2012) Similarly, heterochromatin was virtually similar

among A. coeruleus, A. bahianus, and A. chirurgus, being mainly dispersed over

centromeres and NORs, as commonly found in most Perciformes (MOLINA et al., 2013)

Therefore, it is unclear if the deep divergences in these fish karyotypes are followed by

microstructural changes. Further analyses using other banding methodologies and mapping

of sequences by fluorescence in situ hybridization (FISH) are required to evaluate the

extension of such apparent homogeneity of specific chromosomal regions in Acanthurus.

The amount of chromosomal traits in the three Acanthurus species from Brazilian

coast allows raising a phylogenetic hypothesis to them. Indeed, the ordination and sharing of

the traits show a closer phylogenetic relationship between A. bahianus and A. chirurgus than

to A. coeruleus. This result is corroborated by previous genetic analyses. Indeed, analysis of

CytB sequences showed a more basal condition between A. coeruleus in relation to the other

two congeners (FRANCINI-FILHO et al., 2010). Recently, a phylogenetic analysis of

Acanthuridae based on sequence data of two mitochondrial and seven nuclear genes

(SORENSON et al., 2013) corroborated the ancestral position of A. coeruleus in relation to

A. chirurgus and A. tractus, which replaces A. bahianus in the Caribbean (FRANCINI-

FILHO et al., 2010; CALASTELLANOS-GELL et al., 2012).

Thus, for analyzed Atlantic species, the chromosomal traits show robust support to

clarify the phylogenetic arrangement among them serving as useful markers to evolutionary

studies in Acanthuridae. Moreover, in agreement with phylogeographic studies (ROCHA et

al., 2002; FLOETER et al., 2008), the chromosomal differences between Atlantic species of

Acanthurus seem to be more related to ecology and evolutionary history than to dispersal

potential since the three species share a relatively long PLD.

5. Conclusion

In conclusion, the chromosomal analyses in Acanthurus allowed identifying

sequential events related to speciation process that differ from most cytogenetical reports on

marine Perciformes, where specific rearrangements are often unclear. A step-by-step

33

karyotype modification can be inferred from the most basal pattern, involving few structural

rearrangements (pericentric inversions in A. coeruleus) to high derived ones, originated by

Robertsonian fusions in both A. bahianus and A. chirurgus and additional in tandem fusion in

A. chirurgus. This scenario reveals a unique condition to tracing back the order of

chromosomal evolutionary changes in Atlantic surgeonfish.

Acknowledgments

The authors thank CAPES, CNPq (no. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,”

and FAPESB (no. APP0064/2011) for the financial support and ICMBio/SISBIO (licenses

19135-1, 131360-1, and 27027-2) for the authorization in collecting specimens. They are

also grateful to Dr. José Garcia Júnior for the taxonomic identification of specimens.

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37

5. Capítulo II

Abstract

Acanthurus is a representative and widespread genus of marine fish that plays a key role in

ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of Western

Atlantic: A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. The cytogenetic pattern of these species

indicated sequential steps of chromosomal rearrangements dating back 19 to 5 millions of

years ago (M.a.) that accounted for their interspecific differences. Acanthurus coeruleus

(2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34;

12m+2sm+4st+16a) share an older set of three chromosomal pairs that were originated

through pericentric inversions. A set of six large metacentric pairs formed by Robertsonian

(Rb) translocations found in A. bahianus and A. chirurgus and a putative in tandem fusion

found in A. chirurgus are more recent events. In the present study, new cytogenetic data are

being reported for these three Acanthurus species based on mapping of repetitive sequences

such as ribosomal 18S and 5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype

evolutionary analyses. The lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several

centric fusions in A. bahianus and A. chirurgus might be related to the long period of time

after their occurrence (estimated in 5Ma). Furthermore, the homeologies among the

chromosome pairs bearing ribosomal genes, in addition to other structural features, highlight

large conserved chromosomal regions in the three species. Our findings indicate that

macrostructural changes occurred during the cladogenesis of these species were not followed

by conspicuous microstructural rearrangements in the karyotypes.

38

1. Introduction

The Acanthuridae family (Perciformes) is a monophyletic and relatively ancient

group of marine fishes (nearly 54 millions of years ago) with fast evolutionary divergence

(CLEMENTS et al., 2003; SORENSON et al., 2013). Nowadays, this family is divided into

six genera and comprises about 80 species, popularly known as surgeonfishes (NELSON,

2006).

The genus Acanthurus Forsskål (1775) is one of the mostemblematic groups of

surgeonfishes closely associated to coastal reefs (BELLWOOD and WAINWRIGHT, 2002;

NELSON, 2006). This genus is widespread over tropical and subtropical seas, playing a major

role in the ecology and evolution of coral reefs due to their herbivory habit (VALENTINE

and HECK JR., 1999). The large assemblages of Acanthuridae and other grazers (e.g.

parrotfishes and damselfishes) influence the coral reef structure by promoting bioerosion and

controlling the spread of macroalgae cover (HORN, 1989; PADDACK et al., 2006).

Four Acanthurus species are recorded in Western Atlantic, being three of them

commonly found throughout brazilian coast; A. coeruleus Bloch and Schneider (1801), A.

bahianus Castelnau (1855), and A. chirurgus (BLOCH, 1787) (BERNALL and ROCHA,

2011; MENEZES and FIGUEIREDO, 1985). These three species present highly differentiated

karyotypes (2n=48, 36, and 34, respectively) in which Robertsonian rearrangements reduced

the diploid values from 2n=48 to 2n=36 in A. bahianus and 2n=34 in A. chirurgus.

In fact, six large metacentric pairs, which are absent in A. coeruleus, were derived

from centric fusions and are apparently homeologous between A. bahianus and A. chirurgus,

corroborating their close phylogenetic relationship. Such remarkable differences in the

karyotype macrostructure are rare in marine fishes. Comparing these results to molecular data

available for Acanthuridae, it was possible to infer that centric fusions have taken place about

5 M.a. while the pericentric inversions shared by the three species were more ancient events

(nearly 19 M.a.) (AFFONSO et al., 2014).

In view of the unusual cytogenetic variation in Atlantic Acanthurus, chromosomal

banding and cytogenetic mapping of ribossomal genes and telomeric sequences were

performed in A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. Our purpose was to infer if

microstructural chromosome differentiation also followed the diversification in the karyotype

macrostructure.

39

2. Material and methods

Cytogenetic analyses were carried out in specimens of A. coeruleus (N=23), A.

bahianus (N=12) and A. chirurgus (N=17) collected along the shoreline of Natal, Rio Grande

do Norte state (5o46’S, 35

o12’W) and Salvador, Bahia state (13°00’S, 38°32’W), northeastern

Brazil. Mitotic stimulation was performed by the inoculation of antigen complexes in the

specimens (MOLINA, 2001, MOLINA et al., 2010). After 24 h, the animals were

anesthetized with crave oil (1 mL/15 L of salt water) and euthanized for removal of anterior

kidney. The experiments and euthanasia of specimens were authorized by the Committee of

Animal Ethics (CEUA/UESB) from Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (#32/2013).

Chromosomal spreads were obtained by interrupting the cell cycle in vitro (GOLD et

al., 1990). The active nucleolar organizer regions (NORs) were detected by silver nitrate

staining (HOWELL and BLACK, 1980). Once heterochromatin patterns have been previously

reported in the analyzed species (AFFONSO et al., 2014), chromosomes were stained with

base-specific fluorochromes to locate GC- and AT-rich sites by mithramycin (MM) and 4’-6-

diamino-2-fenilindole (DAPI), respectively (SCHWEIZER, 1980).

FISH was performed according to Pinkel et al. (1986) using 18S, 5S and telomeric

probes. The probes of 5S rDNA (nearly 200 bp) and 18S rDNA (nearly 1400 bp) were

obtained from DNA samples of A. coeruleus via PCR using the primers A 5’-TAC GCC

CGA TCT CGT CCG ATC-3’/B 5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al.,

1994) and NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’/NS8 5’-TCC GCA GGT TCA CCT

ACG GA-3’ (WHITE et al., 1990), respectively. Both probes were labeled by nick translation

(Roche, Mannheim, Germany). The 5S rDNA probes were labeled with biotin-14-dATP

(Invitrogen) and detected with avidin-FITC (Sigma); while the 18S rDNA probes were

labeled with digoxigenin-11-dUTP (Roche) and detected with anti-digoxigenin-rhodamin

(Roche). The (TTAGGG)n sequences were mapped by FISH using Telomere PNA FISH

Kit/FITC according to manufacturer’s instructions (DakoCitomation).

The micrographs were obtained using an epifluorescence photomicroscope

OlympusTM

BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) with appropriate filters equipped with digital

capture system Olympus DP73 using the software CellSens (Olympus). The karyotypes were

arranged as previously defined by Affonso et al. (2014) with identification of metacentric (m),

submetacentric (sm), subtelocentric (st) and acrocentric (a) chromosomes based on arm ratio.

An idiogram was built based on the structural features of chromosomal pairs of each species

combining the results of mapped sequences.

40

3. Results

The karyotypic patterns agree with the previous results reported for the three

Acanthurus species (AFFONSO et al., 2014). Therefore, A. coeruleus presented 2n=48

(2sm+4st+42a; NF=54), A. bahianus 2n=36 (12m+2sm+4st+18a; NF=54) e A. chirurgus

2n=34 (12m+2sm+4st+16a; NF=52) (Figure 1A-C). Active NORs were located at terminal

position on short arms of the largest st pair of each species, corresponding to pairs 2, 8 and 8

of A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus, respectively (Figure 1, inbox). The GC-rich

sites (MM+/DAPI

-) were identified only at active NORs while AT-rich heterochromatin

segments were absent in the three species.

Figure 1. Karyotypes and metaphases of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (c) after Giemsa

staining (left column), two-color FISH (middle column) with 18S rDNA (magenta signals) and 5S

rDNA (green signals) probes and distribution of (TTAGGG)n sequences (right column). Inbox, the

NOR-bearing chromosomes are shown after silver nitrate staining (left column) and fluorochrome

staining (middle column). Bar = 5µm.

41

The 18S rDNA sites were coincident with Ag-NORs in all species, except for A.

coeruleus that presented an additional and probably inactive NOR site (unidentified by silver

nitrate staining) on pair 13. On the other hand, the 5S rDNA sites were invariably located in

the largest acrocentric pair of the three acanthurids, corresponding to pair 4 in A. coeruleus,

and pair 10 in both A. bahianus and A. chirurgus. The (TTAGGG)n sequences were located

exclusively at terminal chromosomal regions (Figure 1). The two-color FISH with ribossomal

probes showed lack of synteny between the 18S and 5S rDNA sites.

4. Discussion

Previous cytogenetic reports allowed tracing back the occurrence of chromosomal

rearrangements in the Atlantic surgeonfish A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus

(AFFONSO et al., 2014). These authors verified that a set of sm-st chromosomes (pairs 1 to 3

in A. coeruleus and 7 to 9 in A. bahianus and A. chirurgus) shared by these species derived

from relatively ancient pericentric inversions when compared to the basal karyotype of

Perciformes (2n=48a). On the other hand, a set of large metacentric pairs (1 to 6), associated

with the drastic reduction in 2n values of A. bahianus and A. chirurgus, indicated a more

recent event of Rb translocations that corroborates the closer phylogenetic relationship

between both species in relation to A. coeruleus.

This approach was favored by the rare possibility of dating chromosomal

rearrangements in this group. The divergence period estimated for the three Acanthurus

species (considering A. tractus as sister-group of A. bahianus) by molecular analyses

(SORENSON et al., 2013) provides a reliable indication that the set of six metacentric

chromosomes related to Rb rearrangements and shared by A. bahianus and A. chirurgus has

arisen at least 5 Ma (AFFONSO et al., 2014). In the face of karyotype macrostructure

variation in Acanthuridae from brazilian coast, the mapping of repetitive sequences is

particularly useful to the identification of possible shared chromosomal similarities as well as

refining the understanding about the interspecific differentiation after the origin of

chromosomal rearrangements.

In the three Acanthurus species, the heterochromatin is mainly distributed over

pericentromeric regions and interspersed to NORs. Following this trend, the qualitative

analysis of heterochromatic segments presented in this study also revealed similar base

composition with homogenous amounts of GC and AT content after fluorochrome staining.

The only exception were the GC-rich sites (MM+/DAPI

- signals) at NORs, as usually detected

in teleosteans.

42

This reduced and quite homogenous heterochromatic pattern of Acanthuridae

(AFFONSO et al., 2014) has been considered as an obstacle to evolutionary changes in

karyotypes of marine Perciformes (MOLINA, 2007). Indeed, the mapping of repetitive

sequences in several families of this order, characterized by stable karyotypes, revealed a

reduced phylogenetic variation (MOTTA-NETO et al., 2011a, b; CALADO et al., 2013). On

the other hand, heterochromatin heterogeneity has been reported in some fish groups with

remarkable karyotypic changes such as Gobiidae (CAPUTO et al., 1997; LIMA-FILHO et al.,

2014; MOLINA et al., 2014), Characidae (MANTOVANI et al., 2000) and Erythrinidae

(CIOFFI et al., 2009; BLANCO et al., 2011).

For instance, some species of marine Perciformes like Centropyge aurantonotus

(Pomacanthidae), presented unusual karyotype for the family and a unique richness of C-

bands and GC-rich sites (AFFONSO et al., 2005). Therefore, the absence of heterochromatin

variation in the differentiated karyotypes of Acanthurus species in the present work represents

an unusual condition. However, it should be pointed out that heterochromatin might be more

complex than previously thought after analyses of other repetitive sequences (histones,

transposons, retrotransposons and microsatellites), as revealed in some Perciformes species

(COSTA et al., 2013; COSTA et al., 2014).

The location of 18S and 5S rRNA genes has been proved to be efficient

cytotaxonomic markers in distinct marine fish groups like Gerreidae (CALADO et al., 2013;

CALADO et al., 2014), Lutjanidae (ROCHA and MOLINA, 2008) and Nototheniidae

(PISANO and GHIGLIOTTI, 2009). Usually, both families of these ribosomal genes are not

syntenic (GORNUNG, 2013), as observed in Acanthurus (Figure 1). Nonetheless, the

distribution of both 18S and 5S rDNA sites were quite similar among the three species, being

apparently located in homeologous pairs.

The major NOR-bearing pairs identified by silver nitrate and fluorochrome staining

as well as by FISH with 18S rDNA probes were included in “sm-st chromosomes set”

possibly formed by pericentric inversions that took place before the split of the three

Acanthurus species around 19 Ma (SORENSON et al., 2013). In spite of the conservatism of

NORs in these acanthurids, an additional 18S rDNA site was located on pair 13 in the

karyotype of A. coeruleus, regarded as the most basal taxon among the analyzed species

(BERNAL and ROCHA, 2011; CASTELLANOS-GELL et al., 2012; SORENSON et al.,

2013). Differently from the rDNA at pair 2 identified by both FISH and silver nitrate staining,

the ribosomal site in pair 13 lacks argyrophylic nature indicating either an inactive copy of

43

ribosomal gene (SANTORO, 2005) or pseudogenes (AFFONSO et al., 2005; LIMA-FILHO

et al., 2014).

The lack of conspicuous microstructural changes in karyotypes of Acanthurus

contrasts with the remarkable variation in chromosomal number and morphology found in A.

bahianus and A. chirurgus, particularly caused by Robertsonian (Rb) translocations or centric

fusions that formed the “m-chromosomes set” pairs in both species.

Previous reports in fishes suggested that Rb rearrangements are favored by the

presence of terminal 18S or 5S rDNA sites interspersed with heterochromatin in formerly

acrocentric chromosomes (FUJIWARA et al., 1998; MOLINA and GALETTI, 2002). This

seems to be the case of Selene setapinnis (Carangidae) in which a Rb translocation was

inferred to explain internalized 18S rDNA regions previously located at terminal regions

(Jacobina et al., 2013). Similarly, biarmed chromosomes derived from centric fusions in the

pomacentrids Chromis flavicauda and C. jubauna shared 5S rDNA sites (MOLINA and

GALETTI, 2002). The mapping of 18S rDNA in A. bahianus and A. chirurgus did not show

these sequences in the m-chromosomes set. However, the presence of an extra rDNA site in

the terminal position of an acrocentric pair of A. coeruleus, a species carrying the basal

karyotype 2n=48, does not excludes the role of this DNA family in the Rb processes occurred

in the Acanthurus genus.

The mapping of telomeric sequences by FISH is highly indicated to species or

populations with reduced chromosomal numbers by centric fusions (REED and PHILLIPS,

1995). This approach is able to reveal internal telomere sequences (ITS) that serve as

evidence of Rb rearrangements (BITENCOURT et al., 2014; MEYNE et al., 1990). However,

several cases of centric fusions are not followed by the presence of these ectopic sites. In

vertebrates, this lack of correlation between Rb rearrangements and ITS has been related to

losses during centric fusions or modification of telomeric sequences after long periods of

internalization (NANDA et al., 1995; OCALEWICZ, 2013). Likewise, ITS were absent in the

fused chromosomes of A. bahianus and A. chirurgus. Taking into account that Rb

rearrangements in both species have probably taken place at nearly 5Ma it seems plausible to

infer that the telomeric-like sequences internalized by fusions accumulated enough mutations

or were lost during this long period of time.

A more recent chromosomal rearrangement was inferred in A. chirurgus and

representing an autapomorphic feature. Putatively, the reduction of the chromosomal number

(2n=34) in this species was derived from a tandem fusion of a small acrocentric pair (present

in A. bahianus) on the short arms of the chromosomal pair 7 in A. chirurgus (Figure 2).

44

Usually, ectopic telomeric sequences could also be preserved after tandem fusions (CIOFFI et

al., 2011; HARTMANN and SCHERTHAN, 2004). However, internal (TTAGGG)n

sequences were not identified in this case and could have been probably lost during the

chromosomal rearrangements.

In conclusion, the refined analysis of karyotypic features in the three species of

Acanthurus showed little microstructural changes despite of their long-term evolutionary

history of chromosomal rearrangements. The coincident distribution of ribosomal genes, as

well as the presence of homeologous and phylogenetically related sets of sm-st chromosomes

(3 pairs) and m chromosomes (6 pairs) reveals the conservatism of large syntenic

chromosomal regions in these species. This condition has been reported in other marine

Perciformes (MOLINA, 2007; MOLINA et al., 2013; MOTTA-NETO et al., 2011a),

revealing that chromosomal rearrangements have probably taken place during cladogenesis of

these groups and remained fixed ever since.

Acknowledgments

The authors thank CNPq (#556793/2009-9; 301409/2009-9), INCT “Ciências do

Mar”, and FAPESB (#APP0064/2011) for the financial support, CAPES for the MSc

Figura 2. Idiogram of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (v) combining the results from

NOR/GC-rich region location and physical mapping of ribossomal and telomeric sequences. The

homeologous chromosomes derived from pericentric inversions (sm-st chromosomes set) and

centric fusions (m-chromosomes set) are highlighted in boxes. The asterisk in pair 7 of A. chirurgus

indicates a putative autapomorphy (in tandem fusion) to this species.

45

scholarship to M.A.F., and ICMBio/SISBIO (licenses 19135-1, 131360-1, and 27027-2) for

the authorization in collecting specimens. We are also grateful to Dr. José Garcia Júnior for

the taxonomic identification of specimens.

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48

6. CONCLUSÕES

As espécies de Acanthurus do Atlântico Ocidental apresentam cariótipos

conspicuamente diferenciados.

Diferentes rearranjos estruturais tiveram participação na diferenciação dos cariótipos

das espécies. Inversões pericêntricas em A. coeruleus, fusões Robertsonianas em A.

bahianus e A. chirurgus, espécies que apresentaram maior derivação, e uma possível

fusão em tandem com ocorrência adicional em A. chirurgus.

Os padrões de divergência citogenética são concordantes com processos sequenciais

de cladogênese destas espécies. Estes conjuntos de rearranjos datam de 19 milhões

(inversões pericêntricas) a 5 milhões (translocações Robertsonianas) de anos atrás.

A distribuição coincidente de genes ribossomais, bem como a presença de conjuntos

homeólogos de cromossomos sm-st (3 pares) e cromossomos m (6 pares) revela o

conservadorismo em grandes regiões cromossômicas sintênicas nestas espécies.

As espécies de Acanthurus apresentam uma microestrutura cromossômica conservada,

com poucas modificações, apesar da ocorrência de rearranjos cromossômicos antigos

ao longo de sua história evolutiva.

As informações obtidas estimulam o uso de marcadores citogenéticos mais

resolutivos, proporcionados pelo mapeamento sequências repetitivas de DNA, para um

melhor entendimento dos processos envolvidos na diversificação cromossômica da

família.

49

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