OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE …

Departamento de Química

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OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE METALOTIONEÍNAS DE

BÍLIS DE TILÁPIA PARA USO COMO BIOMARCADORES DE EXPOSIÇÃO A

METAIS

Alunos: Julia Arias Feijó de Lemos

Roberto Vinicius Granha Fiúza

Co-orientadoras: Carolina Lyrio T. Correia

Rachel Ann Hauser-Davis

Orientadora: Tatiana Dillenburg Saint’Pierre

1. Introdução

Metalotioneínas (MTs) são uma classe de proteínas de baixo peso molecular com alta

afinidade por íons metálicos livres.1

Elas têm papel na regulação de metais essenciais e a

detoxificação de metais tóxicos. A capacidade de indução das MTs é maior nos tecidos que

estão envolvidos na captação, acúmulo e excreção, como fígado, rins, brânquias e intestino.2,3

Dessa forma, a MT é encontrada em maior quantidade nesses órgãos, o que justifica a escolha

dessas matrizes para análises metalômicas. A bílis, por ser um fluido produzido pelo fígado,

também contém essa proteína, porém em menores concentrações. A bílis foi escolhida como

matriz principal deste trabalho por ser naturalmente líquida e, portanto, mais simples de se

trabalhar em relação ao fígado. Além disso, não há necessidade de sacrificar o animal, já que

existe a possibilidade de canulação hepática para sua extração.4 As MTs têm sido amplamente

utilizadas como biomarcadores de exposição a metais traços, devido a sua potencial função

como agente detoxificante. Esse seu papel tem sido estudado e empregado em diferentes

espécies de animais aquáticos para a avaliação da contaminação de ecossistemas aquáticos

por metais.5,6

As características fisiológicas e ecológicas da espécie de tilápia Oreochromis

niloticus são favoráveis para sua utilização como espécie bioindicadora de exposição a metais.

Além disso, o banco de dados de proteínas da tilápia já está quase todo mapeado, o que

também justifica a sua escolha como objeto de estudo.7

2. Objetivos

O objetivo deste estudo foi avaliar e padronizar o método térmico de extração

atualmente aplicado para a purificação e quantificação de metalotioneína de bílis de peixe

utilizando diferentes reagentes e a análises estatísticas multivariadas num contexto

proteômico / metaloproteômico, uma vez que esta proteína foi previamente relatada como um

biomarcador potencial em bílis de peixe.

3. Materiais e métodos

Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) foram adquiridas diretamente de

fornecedores certificados que vendem peixe para consumo humano, na zona sul do Rio de

Janeiro. Fígado e bílis foram imediatamente removidos, o último por meio de punção direta

da vesícula biliar com uma seringa de plástico de 5,0 mL. O fígado foi pesado e o volume e a

cor da bílis foram registados. Ambos os órgãos foram então armazenadas a -80 °C até a

análise em tubos de polipropileno estéreis. As amostras de fígado foram liofilizadas no

laboratório (LioTop L101, São Paulo, Brasil), para facilitar a manipulação da amostra.


2

3.1. Exposição a metais no laboratório

As tilápias compradas foram submetidas a doses subletais de quatro metais: Cd, Pb,

Zn e Ni, enquanto o grupo controle não foi exposto.

A exposição a substâncias tóxicas no laboratório ocorre tipicamente entre 24 e 96

horas. Os testes são muitas vezes realizados em condições estáticas, ou seja, sem a renovação

da água durante todo o experimento, uma vez que este é mais simples e menos caro em

comparação com os sistemas semi-estáticos (substituição parcial) ou sistemas de fluxo

contínuo (renovação contínua). O sistema estático é especialmente recomendado quando a

substância for comprovada estável no ambiente, tais como o cobre e outros metais.8

Tanques de 500 L, contendo água sem cloro, pH 7,0, foram preparados para receber os

peixes. Soluções contendo Pb, Zn, Cd e Ni em doses subletais, de acordo com a concentração

máxima permitida de cada elemento na água salobra, de acordo com a Resolução n º 357 (17

de março de 2005, o CONAMA) foram usadas. Os valores das concentrações finais de cada

um dos elementos nas soluções que receberam os peixes são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Concentrações das soluções usadas na experiência de exposição em laboratório, de

acordo com as concentrações máximas permitidas pela Resolução CONAMA 357 (2005).

Metal Concentração (mg L-1

)

Ni 0.025

Zn 0.09

Pb 0.01

Cd 0.005

3.2. Extração das MTs

Os procedimentos de extração utilizados foram baseados no protocolo de extração de

Erk et al.9

Este protocolo utiliza DTT como agente redutor, e tempos de centrifugação de 1

hora e depois de 30 minutos, com corte térmico da temperatura de extração de 70 oC. Neste

estudo a normalização, no entanto, foi feita com uma mistura de 100 μL de sobrenadante

purificado de MT de bílis (n=10) e fígado (n=10). Estes sobrenadantes foram

homogeneizados em três soluções diferentes, contendo β-mercaptoetanol a 0,01%, DTT

(Ditiotreithol) 0,01% ou TCEP (Tris 2-carboxietil-fosfina) 1% como agentes redutores em

Tris-HCl 20 mmol L-1

, pH 8,6 a redução, com PMSF (phenylmethylsulphonylfluoride) 0,5

mmol L-1

adicionado como um agente antiproteolítico. Para as amostras de fígado, 100 mg da

mistura das amostras (a partir dos mesmos 10 peixes utilizados para obter as amostras

biliares) foram homogeneizados em 2 mL das mesmas soluções redutoras, utilizando um

bastão de vidro. As amostras foram centrifugadas a 20.000 xg por diferentes tempos

pré-estabelecidos, a 4 ºC. Os sobrenadantes foram então cuidadosamente separados do

sedimento e transferidas para novos frascos Eppendorf esterilizados, e aquecidos durante 10

min a diferentes temperaturas pré-estabelecidas. Uma segunda centrifugação foi realizada a

20.000 xg durante períodos variáveis, a 4 ºC e os sobrenadantes finais contendo MT nas

sub-amostras purificadas foram separados e congelados a -80 ºC até à análise. Um

planejamento experimental foi realizado para otimizar e padronizar a purificação de MT

destas amostras. Três protocolos diferentes, A, B e C, foram realizados com cada um dos

tempos de centrifugação e temperaturas e variando os agentes redutores (Tabelas 2, 3 e 4).

Para a maioria das aplicações, a faixa de concentração de TCEP 5-50 mM oferece

excesso molar suficiente para reduzir de forma eficaz ligações dissulfeto de peptídeo ou

proteína. Por essa razão, a concentração de TCEP utilizada para os procedimentos de extração

(1%) foi maior do que a dos demais reagentes (0,01%).10


3

Tabela 2. Procedimento de extração 1.

Extração 1ª Centrifugação (min) Banho-maria (°C) 2ª Centrifugação (min)

A 45 60 15

B 60 70 30

C 75 80 45

Tabela 3. Procedimento de extração 2 (variando a temperatura e fixando os tempos).


B’ 60 50 30

B’ 60 60 30

B’ 60 70 30

B’ 60 80 30

B’ 60 90 30

Tabela 4. Procedimento de extração 3 (variando os tempos e fixando a temperatura).


A’’ 45 70 15

B’’ 60 70 30

C’’ 75 70 45

3.2 Quantificação das MTs

A quantificação das MTs foi realizada por espectrofotometria aplicando a reação

de Ellman.11

Este é um ensaio de quantificação indireta, uma vez que são medidos os grupos

sulfidrilo presentes na amostra e não a concentração absoluta de MT.

Após a aplicação dos diferentes procedimentos de purificação para as amostras

de fígado e biliares, 50 μl das sub-amostras purificadas foram tratadas com HCl 1 mol L-1

contendo EDTA 4 mmol L-1

, NaCl 2 mol L-1

, 0,43 mmol L-1

DTNB (ácido 5,5

'-ditiobis-2-nitrobenzóico), tamponadas com 0,2 mol L-1

de fosfato de sódio, pH 8.0 e

incubadas durante 30 minutos.

As amostras foram então centrifugadas a 3000 xg durante 5 minutos e a

absorvância do sobrenadante foi avaliada a 412 nm usando um leitor de microplacas

SpectraMax (Hamilton, EUA). Na reação de formação de cor do reagente de Ellman com

grupos sulfidrilo, o DTNB reage com grupos tiol, tais como cisteínas de peptideos, de modo a

formar dissulfideos e TNB, o que torna possível medir a cor a 412 nm . Concentrações de MT


4

foram aproximadas usando o padrão, glutationa reduzida (GSH), para a curva de calibração.

(0-1000 mmol L-1

) a partir de uma de solução estoque de 10 mmol L-1

. Embora este método

meça todos os tióis ácidos solúveis, a glutationa é mais do que 90% dos grupos tiol reativos,

sendo considerado um padrão apropriado.12

A concentração de MT foi estimada assumindo a

razão 1:20 MT/GSH, como descrito por Kagi13

para peixes.

3.3 Quantificação de proteínas totais

As concentrações de proteína total nas amostras de bílis e fígado foram

medidas pelo método de Lowry modificado por Peterson.14

A curva analítica foi preparada

com uma série de diluições com uma solução estoque de concentração de albumina de soro

bovino a 2 mg mL-1

(BSA, Sigma-Aldrich), em um intervalo de massa de 0 a 50 mg de BSA.

Resumidamente, a solução de 0,1% de sulfato de cobre, tartarato de potássio e sódio 0,2%,

carbonato de sódio a 10% e NaOH e SDS, foram misturados em conjunto, resultando em

"Reagente A". "Reagente B", por sua vez, é uma solução Follin-Ciocalteau (Sigma-Aldrich)

5x diluída com água ultra-pura. 400 L de "Reagente A" foi adicionado a cada 10 L de

amostra. Os tubos foram agitados manualmente e encubados por 10 min. Em seguida, 200 L

de reagente B foram adicionados com agitação. Os tubos foram então deixados em repouso

durante 30 minutos e as amostras e curva de calibração foram medidos a 750 nm, utilizando

um leitor de microplacas SpectraMax (Hamilton, EUA).

3.4 Análise em SEC-HPLC-ICP-MS

Os perfis qualitativos das metalotioneínas, bem como os metais ligados a elas, foram

analisados pelas técnicas de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e espectrometria

de massas por plasma indutivamente acoplado (ICP-MS).

A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é uma técnica cromatográfica que

separa as moléculas dissolvidas com base no seu peso molecular, bombeando-as por colunas

que contêm um recheio de material microporoso. As moléculas grandes eluem primeiro da

coluna, já que elas têm maior dificuldade de penetrar nos poros. Já as pequenas penetram

mais facilmente na maioria dos poros e, por isso, são eluídas mais tardiamente. O ICP-MS

pode realizar seletiva monitorização, em tempo real, de um dado elemento associado a um

determinado composto eluído de uma coluna cromatográfica. Para isso, utilizou-se uma coluna Superdex 75 acoplada ao HPLC hifenado ao

ICP-MS. Ela foi equilibrada com água ultra-pura e, em seguida, com Tris-HCl 0,02 mol L-1

,

pH 7,4, ambos a uma vazão de 0,5 mL min-1

. A velocidade da bomba durante a análise foi de

0,70 mL min-1

, e os seguintes isótopos dos metais que se ligam a MT foram monitorados

online: 208

Pb, 60

Ni, 114

Cd, 66

Zn.

3.5 Eletroforese em Gel

A eletroforese em gel de poliacrilamida em uma dimensão foi utilizada para a

separação de proteínas de acordo com seu peso molecular.

Géis de poliacrilamida (15%) foram preparados de acordo com Laemmli et al.15

Alíquotas de extratos de MT, tanto de fígado quanto de bílis, foram aplicadas para cada

poço, junto com os padrões de peso molecular. Os géis foram corridos, em triplicata, por

aproximadamente 2 h30 min, a 45 mA / gel. Os géis foram depois corados usando o método

de coloração com prata, como descrito abaixo. Foram utilizados os padrões de peso molecular

(BioRad Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards) para determinar os pesos

moleculares das bandas de proteínas e manchas.

Os géis foram corados com nitrato de prata seguido o protocolo de Heukeshoven e

Dernick16

, onde os géis são primeiro fixados com solução de fixação (10% de ácido acético,


5

30% etanol), sensibilizados em uma solução de 5% de tiosulfato de sódio e 20% de etanol.

Lavou-se os géis com água ultrapura e deixou-os reagir com nitrato de prata (2,5%), e, em

seguida, lavou-se novamente. Os géis foram revelados em uma solução de formaldeído a

0.05% e carbonato de sódio 3%. O desenvolvimento é então interrompido com EDTA a 1,5%,

evitando a redução dos íons de prata na solução. Os géis foram então conservados em uma

solução contendo 25% de etanol e 5,3% de glicerol (que evita com que o gel fique com

fissuras durante a secagem) para análise de imagem e subsequente espectrometria de massa.

Os géis foram escaneados no ImageScanner II (GE Healtchare, Upspsalla, Sweden),

com o densitômetro operando em resolução de 300 dpi. O software de análise de imagem

Image-Master 2D Platinum 6.0 Sowftare (Genebio, Geneva, Switzerland) foi utilizado para as

análises dos géis após sua coloração.

4. Resultados e discussão

4.1 Análise espectrofotométrica

Três processos de purificação diferentes, nomeados de A, B e C, foram

estabelecidos, onde os tempos de centrifugação, a temperatura de extração e os diferentes

reagentes redutores variaram como um único fator. A escolha dos reagentes redutores foi

baseada na literatura que utiliza o processo de extração de metalotioneína. Os reagentes mais

utilizados são o DTT e -mercaptoetanol. No entanto, neste trabalho, a eficiência de redução

do reagente TCEP também foi testada, visto que ele tem sido amplamente utilizado em

análise metaloproteômica. Uma vantagem do TCEP é que, como seu intervalo de pH é mais

amplo, a sua absorção UV é menor do que os outros, além disso, o TCEP mantem

efetivamente as condições de redução, mesmo a concentrações de μM.

Não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os

procedimentos A e B, tanto para as sub-amostas de MT (p <0,05) de bílis, quanto para as de

fígado, quando se comparou os processos de quantificação de MT. A temperatura de extração

de 70 °C utilizando TCEP como o reagente redutor (que tem uma ampla faixa de estabilidade

de pH 1,5-8,5, enquanto -mercaptoetanol tem uma faixa de trabalho de pH 5,0-8,5 e o poder

redutor do DTT é limitado a valores de pH acima de 6,5), no entanto, mostrou-se o mais

adequado para ambas as matrizes, com diferenças significativas (p <0,05) quando comparado

com as outras temperaturas de extração e agentes redutores. Comparando os dois órgãos, a

quantidade de MT na bílis foi inferior à quantidade de MT no fígado, como era de se esperar,

uma vez que o fígado acumula MT com taxas de desintoxicação mais lento do que a bílis, que

é liberada a partir da vesícula biliar durante a alimentação, e diluído por água.

Figura 1 - Concentrações de metalotioneína na bílis e no fígado (expressa em mol L-1

) para cada um

dos procedimentos de purificação testados e reagentes.


6

Seguindo o planejamento experimental para os três protocolos iniciais, fixamos os

tempos de centrifugação só para avaliar a influência da temperatura do banho-maria. 60

minutos para a primeira centrifugação e 30 minutos para a segunda centrifugação (tempos de

centrifugação da extração B) foram escolhidos, visto que a extração B provou-se ser a mais

eficaz quando comparada com as outras, mesmo que não tenha sido observadas diferenças

significativas. O reagente utilizado foi TCEP, como concluímos a partir dos primeiros

resultados de extração de que este é o mais eficiente entre os três reagentes testados. A Figura

2 mostra os resultados de extração MT na bílis e no fígado, com as diferentes temperaturas do

banho de água.

Figura 2 - Concentrações de MT na bílis (a) e no fígado (B) em diferentes condições de temperatura

do banho-maria

Como pode ser visto através da análise de dados, o perfil da temperatura se

assemelha a uma curva de Gauss, com um ponto máximo, o que corresponde à temperatura

ótima para extração. Uma razão para este comportamento é que, apesar de ser uma proteína

termoestável, a MT começa a se desnaturar a temperaturas superiores a 70 °C. Portanto, a

temperaturas mais elevadas, a extração de MT é menos eficaz. A temperaturas mais baixas, a

extração é também ineficiente, possivelmente indicando que a função de TCEP pode ser

prejudicada, uma vez que na melhor a temperatura, maior é o número de interações entre as

moléculas do reagente redutor e os grupos tiol proteicos. Na última operação de extração de

MT, a temperatura do banho foi fixada (70 ° C), o reagente redutor foi o TCEP, e foi avaliada

a influência dos primeiro e segundo tempos de centrifugação (Figura 3).

Figura 3 - Concentração de MT na bílis (a) e no fígado (B) em diferentes tempos de centrifugação.


7

O TCEP, em particular, é um potente agente redutor, versátil e praticamente sem

odor. Ele tem sido aplicado de forma ampla para estudos de proteínas e outras pesquisas

envolvendo a redução de pontes de dissulfeto. Ela também é facilmente solúvel em soluções

aquosas. O TCEP reduz pontes de dissulfeto de forma tão eficaz como DTT, mas ao contrário

deste e de outros agentes de redução contendo tiol, TCEP não tem de ser removido antes de

certas reações de ligação cruzada.

4.2 1D- SDS - PAGE

A análise qualitativa do 1D-SDS-PAGE demonstrou também que os melhores

resultados de purificação são alcançados quando utiliza-se TCEP como o agente redutor para

fígado e bílis. Quando se utiliza este agente redutor, a extração de MT mostrou-se mais

eficiente e o sobrenadante final era mais puro, com menos bandas de proteína discerníveis em

diferentes pesos moleculares.

Ao comparar estes resultados qualitativos eletroforéticos (Figura 4) com as

quantificações espectrofotométricas de MT bílis, foram observadas diferenças:

Para amostras de bílis, as análises espectrofotométricas não mostraram diferenças

estatisticamente significativas (p <0,05) para os procedimentos A e B, enquanto que as

análises do SDS-PAGE mostraram que as bandas de proteína de cerca de 150 kDa

desapareceram nos procedimentos de extração B e C.

O procedimento A foi mais eficiente em relação à exclusão de proteínas de baixo peso

molecular.

Bandas acima de 250 kDa estavam presentes em todos os procedimentos de extração.

Bandas em torno de 50 kDa estavam presentes em todos os procedimentos, exceto

naqueles que utilizaram TCEP, confirmando ainda mais a eficiência deste reagente.

Bandas fracas entre 50 e 75 kDa estavam presentes apenas nas extrações A feitas com

DTT e β-mercaptoetanol e ausente nos procedimentos que utilizaram TCEP e na extração

de B e C feitas com estes agentes redutores.

Procedimento C, mesmo quando usou-se TCEP, não foi tão eficiente, como pode ser visto

pelas bandas ligeiramente mais fracas sobre o SDS-PAGE. Provavelmente isso é devido à

temperatura significativamente mais elevada utilizada no processo, o que pode desnaturar

as proteínas presentes na amostra, enquanto procedimentos A e B (60 ºC e 70 ºC,

respectivamente), mostraram bandas de MT mais fortes.


8

Figura 4 - Gel SDS-PAGE para amostras de bílis e fígado, utilizando os diferentes procedimentos de

extração e reagentes analisados estudo.

Para as amostras de fígado, as bandas de proteína de cerca de 150 kDa, também

desapareceram nos procedimentos de extração de B e C, o que indica que as proteínas

presentes nesta faixa desnaturaram a temperaturas acima de 70 ºC. Bandas fracas entre 25 e

20 kDa estavam presentes no extrações B e C, com DTT e β-mercaptoetanol em ambos os

procedimentos, e bandas mais fracas estavam presentes na extração B usando TCEP, Figura 5.

Esta banda estava ausente do procedimento de extração utilizando TCEP. O procedimento C,

mesmo usando TCEP, não era tão eficiente para a extração de MT, como pode ser visto pelas

bandas mais fracas no gel de SDS-PAGE, também provavelmente devido à temperatura mais

elevada utilizada no processo. As amostras de fígado, no entanto, provavelmente devido ao

fato de ser sólido e mais complexo do que a bílis, não apresentaram géis tão "limpos" e

bandas de proteínas distintas, comparado com a bílis, isso indica que as análises de bílis são

mais fáceis de conduzir e mostram melhores resultados.

4.3 Quantificação de proteína total O nível de proteína total foi determinado devido à necessidade de conhecer a

concentração de proteína total para a preparação de gel e, consequentemente, a análise de

espectrometria de massa, a fim de identificar as proteínas presentes nas amostras extraídas. O

método de Lowry modificado por Peterson foi usado e se mostrou eficiente e reprodutível.

A quantificação de proteína total nos extratos de fígado e bílis usados para otimizar o

protocolo de extração de metalotioneína mostrou-se consistente com os resultados obtidos por

SDS-PAGE. A melhor extração, como discutido acima, foi com o reagente TCEP, uma vez

que os géis 1D tratados pareciam "mais limpos", o que indica uma melhor extração e

estabilidade ao calor. Consequentemente, uma extração mais eficiente deve levar a um menor

teor de proteína total nas amostras deixando apenas MT. A extração “A” apresentou menores

concentrações de proteínas totais, o que significa que mais proteínas indesejáveis foram

eliminadas durante o procedimento de extração de MTs. Além disso, houve um menor desvio

padrão em relação à média das replicatas para essa extração, o que enfatiza ainda mais a sua

eficiência em relação às outras (B e C).


9

4.4 Análise por SEC-HPLC-ICP-MS

Ao acoplar SEC-HPLC com ICP-MS, pode-se determinar quais os elementos estão

ligados a proteínas, auxiliando na caracterização da contaminação por metal, se existir, e

também na investigação de possíveis diferenças no comportamento dos perfis de ligação a

metais em MT diferentes situações.

O cromatograma de SEC-HPLC-UV (extratos de bílis e MT-I (solução padrão

contendo Cd)) e de espectros de SEC-ICP-MS (metaloproteínas) obtidos com os diferentes

procedimentos de extração (tratados com DTT e -mercaptoetanol (protocolos A, B e C)) são

mostrados na figura 7.

Figura 7 - Amostras SEC-HPLC-UV-ICP-MS e padrão MT-I para extratos de bílis


10

Todas as leituras foram realizadas no mesmo dia, a fim de comparar as intensidades de

sinal e, assim, indiretamente, as concentrações. Não foram observadas alterações

significativas entre os tratamentos, no entanto, foi observada uma pequena diferença no perfil

de cromatografia, quando a amostra é tratada com -mercaptoetanol (protocolo B),

influenciando o pico de MT e o zinco ligado a esta proteína, embora o pico deste elemento

tenha sido bem definido em todas as medições. As análises foram realizadas no mesmo dia,

permitindo assim a comparação das intensidades entre os dois espectros.

A presença de Zn nas amostras é devida ao fato de que este metal é um elemento

traço essencial necessário para certos processos metabólicos, atuando como um co-factor para

várias metaloproteínas e enzimas na maioria dos organismos vivos, enquanto que os outros

fatores analisados estudo (Pb, Cd e Ni) são metais não-essenciais. Além disso, o zinco é

também um regulador de metalotioneína. Estes fatores corroboram ainda mais a presença de

níveis basais de MT em situações de não contaminação.

Diferenças significativas foram observadas para as amostras de fígado quando

comparado com as amostras de bílis. Obviamente, existem diferenças entre as duas matrizes

normais, embora algumas semelhanças também sejam observadas, uma vez que estes órgãos

são interligados no corpo.

O níquel esteve mais presente na bílis, quando comparado ao fígado, provavelmente

devido ao fato de que esta matriz reflete mais rapidamente a recente exposição a

contaminantes do que o fígado, que leva mais tempo para acumular estes xenobióticos. Além

disso, este elemento é normalmente extraído através dos rins e excretados na urina, apesar de

excreção por outras vias, tais como a bile, também ser possível, dependendo da forma que o

elemento é absorvido pelo organismo e do tipo de exposição que o animal sofre.

A presença de Cu e Cd foi mais acentuada no fígado e estes elementos estavam

presentes em outras diferentes metaloproteínas (sem ser MT). No procedimento de extração

que utilizou DTT, percebemos que este reagente não é capaz de eliminar metaloproteínas

termoestáveis a esses metais. A presença de Cd nas matrizes pode indicar uma contaminação

remota, uma vez que este elemento é menos presente na bílis. O Cu, no entanto, é um

elemento-traço essencial e espera-se que apareça tanto na bílis quanto no fígado.

Zn é predominantemente ligado a MT em ambas as matrizes, mas menos

pronunciada nas amostras de fígado tratadas com DTT.

Picos de MT estavam também presentes em todos os testes, indicando a presença

de MT nas amostras de bílis e de fígado, independentemente de exposição do metal ou não,

confirmando que esta é uma ocorrência natural de metaloproteína nestes organismos. A

presença de um único pico de MT nos cromatogramas indica que a cromatografia de exclusão

de tamanhos não é eficiente na separação de MT isofórmicas.

5. Conclusões

O tratamento térmico remove eficazmente as proteínas mais indesejáveis nas

amostras fígado e bilis de peixe, no entanto os resultados indicam que a temperaturas acima

de 70 º C não é mais eficiente uma vez que também é removida MT de ambas as matrizes.

Entre os três agentes redutores analisados, TCEP demonstrou-se ser o mais eficiente,

enquanto que o DTT e β-mercaptoetanol revelara resultados semelhantes tanto na

quantificação espectrofotométrica e na análise qualitativa por SDS-PAGE.

As análises de SDS-PAGE mostraram-se úteis, corroborando com a

padronização dos resultados obtidos pela espectrofotometria. Além disso, eles auxiliaram a

distinguir certas características que não podem ser observadas nas análises

espectrofotométricas dos diferentes processos de purificação, tais como a presença ou


11

ausência de outras proteínas nas amostras purificadas. Os resultados também indicam que os

tempos de centrifugação não são tão importantes na quantificação de MT como a escolha do

agente redutor, e que os tempos de centrifugação descritos na literatura podem ser reduzidos a

fim de analisar mais amostras no mesmo período de tempo com a mesma resposta de

quantificação. Assim, o protocolo estabelecido neste trabalho é mais rápido e

significativamente mais eficiente para a bílis de peixe, e também corrobora relatórios

anteriores que indicam que o TCEP é um potente agente redutor.

Os perfis obtidos a partir das análises de SEC-HPLC-ICPMS mostraram não

haver diferenças significativas quando se compara bilis e fígado, sugerindo que ambas as

matrizes seriam capazes de proporcionar a mesma informação sobre a indução de MT,

corroborando ainda mais o potencial de bílis como um biomarcador interessante. No entanto,

as isoformas de MT não são capazes de ser separados por meio desta técnica. Esta técnica

também corroborou as análises de SDS-PAGE, indicando que o processo de extração não só

é eficaz para a MT, uma vez que outras proteínas termoestáveis também são extraídas no

processo e também foram separados por técnicas de cromatografia de exclusão de tamanho.

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