Páginas iniciais - 2 ed 2016 - design.jet.com.br‡ÃO... · 2 IsolaMEnto DE FUngos FItoPatogênICos Acelino Couto Alfenas, Francisco Alves Ferreira, Reginaldo Gonçalves Mafia e

Sumário1 EstERIlIzação, PREPaRo DE MEIos DE CUltURa E FatoREs

assoCIaDos ao CUltIVo DE FItoPatógEnos

Edival Ângelo Valverde Zauza, Acelino Couto Alfenas eReginaldo Gonçalves Mafia

1 Introdução ............................................................................................................ 27

2 Esterilização ......................................................................................................... 27

2.1 Método físico ................................................................................................. 28

2.1.1 Calor ................................................................................................... 28

2.1.2 Filtragem ............................................................................................. 32

2.1.3 Radiação ultravioleta (UV) ................................................................... 33

2.1.4 Radiações gama e beta ........................................................................ 33

2.2 Método químico ............................................................................................ 34

2.2.1 Gases tóxicos ....................................................................................... 34

2.2.2 Soluções desinfestantes ....................................................................... 35

3 Higienização do Laboratório ................................................................................ 36

4 Meios de Cultura .................................................................................................. 37

4.1 Classificação dos meios de cultura ................................................................. 38

4.2 Composição e preparo dos principais meios de cultura ................................. 38

4.2.1 Meios sólidos ....................................................................................... 38

4.2.2 Meios líquidos ..................................................................................... 46

4.2.3 Meios seletivos para o isolamento de fungos fitopatogênicos e oomicetos ........................................................................................... 46

5 Fatores Associados ao Cultivo de Patógenos ......................................................... 51

5.1 Temperatura .................................................................................................. 51

5.2 Luz ................................................................................................................ 52

5.3 pH ................................................................................................................. 52

5.4 Aeração ......................................................................................................... 53

6 Exercícios ............................................................................................................. 53

7 Referências ........................................................................................................... 53

2 IsolaMEnto DE FUngos FItoPatogênICos

Acelino Couto Alfenas, Francisco Alves Ferreira, Reginaldo Gonçalves Mafia e Rivadalve Coelho Gonçalves

1 Introdução ............................................................................................................ 55

2 Métodos Básicos de Isolamento ............................................................................ 56

2.1 Isolamento direto........................................................................................... 56

2.2 Isolamento indireto ........................................................................................ 58

2.2.1 Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos) ................................................ 58

2.2.2 Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não lenhosos ou não carnosos (folhas, ramos finos, radicelas) .............................................. 62

3 Métodos Especiais de Isolamento ......................................................................... 64

3.1 Isolamento de fungos de crescimento lento ................................................... 64

3.1.1 Isolamento a partir de cirros ................................................................ 64

3.1.2 Isolamento a partir de ascósporos e basidiósporos ejetados ................. 65

3.1.3 Isolamento em meio seletivo a partir de tecidos infectados .................. 67

3.1.4 Sanduíche de cenoura para isolamento de Ceratocystis fimbriata ........ 68

3.2 Isolamento de fungos de sementes ................................................................ 70

3.2.1 Fungos externos e internos às sementes ............................................... 71

3.2.2 Fungos internos às sementes ................................................................ 71

3.3 Isolamento de fungos fitopatogênicos do solo................................................ 72

3.3.1 Método de isca qualitativo para Calonectria spp. ................................. 73

3.3.2 Método de isca qualitativo para Rhizoctonia spp. ................................ 75

3.3.3 Método de isca qualiquantitativo para Calonectria spp. e Rhizoctonia spp. ............................................................................... 76

3.3.4 Peneiramento e transferência de solo ou substrato para isolamento de Calonectria spp. e Cylindrocladiella spp. ......................................... 79

3.3.5 Oomicetos (Phytophthora spp. e Pythium spp.) ................................... 81

3.4 Isolamento de Ceratocystis fimbriata do solo ................................................. 88

4 Exercícios ............................................................................................................. 89

5 Referências ........................................................................................................... 91

3 aRMazEnaMEnto DE MICRoRganIsMos EM CUltURa CoM ênFasE EM FUngos FItoPatogênICos

Rivadalve Coelho Gonçalves, Acelino Couto Alfenas e Reginaldo Gonçalves Mafia

1 Repicagens Periódicas .......................................................................................... 94

2 Armazenamento em Água (Método de Castellani) ................................................ 94

3 Óleo Mineral ........................................................................................................ 96

4 Armazenamento em Grãos de Cereais.................................................................. 97

5 Armazenamento em Sílica-Gel ............................................................................. 97

6 Armazenamento em Solo ..................................................................................... 98

7 Armazenamento em Nitrogênio Líquido ............................................................... 99

8 Armazenamento por Congelamento ..................................................................... 100

8.1 Em glicerol .................................................................................................... 101

8.2 Armazenamento de bactérias por impregnação ............................................. 101

8.3 Em tiras de papel-filtro para fungos ............................................................... 101

9 Armazenamento por Liofilização .......................................................................... 103

10 Exercícios ........................................................................................................... 105

11 Referências ......................................................................................................... 105

4 PRoDUção, DEtERMInação E CalIbRação Da ConCEntRação DE InóCUlo EM sUsPEnsão

Acelino Couto Alfenas, Edival Ângelo Valverde Zauza, Reginaldo Gonçalves Mafia e Rafael Ferreira Alfenas

1 Introdução ............................................................................................................ 107

2 Produção de Inóculo ............................................................................................ 108

2.1 Produção de esporos ..................................................................................... 109

2.1.1 Produção de esporos em meio de cultura ............................................ 109

2.1.2 Produção de esporos na planta hospedeira ......................................... 111

2.2 Produção de micélio ...................................................................................... 112

3 Determinação e Calibração da Concentração de Inóculo ..................................... 113

3.1 Determinação e calibração da concentração de inóculo em suspensões de esporos ..................................................................................................... 113

3.1.1 Hemacitômetro .................................................................................... 113

3.1.2 Contador automático de esporos ......................................................... 117

3.2 Determinação da concentração e calibração de inóculo para esporos a seco e para micélio triturado ......................................................................... 119

4 Viabilidade do Inóculo .......................................................................................... 119

5 Exercícios ............................................................................................................. 120

6 Referências ........................................................................................................... 121

5 InoCUlação DE FUngos FItoPatogênICos

Acelino Couto Alfenas, Francisco Alves Ferreira e Rafael Ferreira Alfenas

1 Introdução ............................................................................................... 123

2 Objetivos da Inoculação Artificial ............................................................ 126

3 Fatores que Afetam a Inoculação ............................................................. 127

4 Métodos de Inoculação............................................................................ 1304.1 Esporos a seco como inóculo ........................................................................ 130

4.2 Suspensão de esporos ou de micélio triturado como inóculo ......................... 131

4.2.1 Fungos não cultiváveis em meios de cultura ........................................ 131

4.2.2 Fungos cultiváveis em meios de cultura ............................................... 132

4.3 Suspensão de inóculo injetada no caule ........................................................ 133

4.4 Inoculação com cilindros ou cubos de cultivos artificiais contendo micélio do patógeno .................................................................................................. 134

4.5 Infestação de solo e inoculação de raízes ....................................................... 134

5 Exercícios ............................................................................................................. 136

6 Referências ........................................................................................................... 143

6 DEtECção, IsolaMEnto E InoCUlação DE baCtéRIas FItoPatogênICas

Reginaldo Gonçalves Mafia, Acelino Couto Alfenas e Rivadalve Coelho Gonçalves

1 Introdução ............................................................................................................ 145

2 Detecção de Bactérias Fitopatogênicas ................................................................. 146

2.1 Detecção de bactérias fitopatogênicas em caules ........................................... 146

2.2 Detecção de bactérias fitopatogênicas em folhas ........................................... 149

2.3 Outros métodos de detecção de bactérias em plantas .................................... 149

3 Meios de Cultura para Isolamento de Bactérias Fitopatogênicas ........................... 151

4 Métodos de Isolamento ........................................................................................ 153

4.1 Isolamento direto........................................................................................... 153

4.2 Isolamento indireto ........................................................................................ 156

5 Semeadura da Suspensão de Células em Meio de Cultura Sólido ........................ 157

5.1 Semeadura pelo método de estrias ou riscas ................................................. 157

5.2 Semeadura pelo método de diluição em placas ............................................. 159

5.3 Semeadura pelo uso de alça de Drigalsky ..................................................... 160

6 Inoculação de Bactérias Fitopatogênicas .............................................................. 160

6.1 Preparo do inóculo de bactérias fitopatogênicas ............................................ 161

6.2 Quantificação e calibração da concentração de inóculo ................................ 161

6.3 Acondicionamento das plantas antes e depois da inoculação ........................ 162

6.4 Métodos de inoculação ................................................................................. 162

6.4.1 Atomização .......................................................................................... 163

6.4.2 Injeção ................................................................................................ 163

6.4.3 Imersão de raízes ................................................................................. 164

6.4.4 Outros métodos de inoculação ............................................................ 165

6.5 Reação de hipersensibilidade (HR) para comprovação de patogenicidade .... 167

7 Exercícios ............................................................................................................. 169

8 Referências ........................................................................................................... 169

7 QUantIFICação DE DoEnças EM Planta

Luiz Antônio Maffia, Eduardo Seiti Gomide Mizubuti, Acelino Couto Alfenas e Reginaldo Gonçalves Mafia

1 Introdução ............................................................................................................ 171

2 Definições ............................................................................................................ 172

3 Métodos de Quantificação da Intensidade de Doenças de Plantas ........................ 174

3.1 Quantificação direta ...................................................................................... 174

3.1.1 Medição das dimensões, da área, do volume e, ou, do número de lesões .............................................................................................. 174

3.1.2 Quantificação direta da severidade propriamente dita ......................... 176

3.2 Escalas descritivas ......................................................................................... 176

3.2.1 Nominais ............................................................................................. 176

3.2.2 Graus de “infecção” ............................................................................. 176

3.3 Escalas de notas ............................................................................................ 177

3.3.1 Aritméticas .......................................................................................... 180

3.3.2 Logarítmicas ........................................................................................ 180

3.4 Escalas diagramáticas (chaves de campo) ..................................................... 181

3.5 Outros métodos ............................................................................................. 184

4 Exercícios ............................................................................................................. 184

5 Referências ........................................................................................................... 184

8 PRInCíPIos básICos Da FotogRaFIa téCnICa, FotoMICRogRaFIa E MICRoMEtRIa óPtICa

Reginaldo Gonçalves Mafia, Edival Ângelo Valverde Zauza,Acelino Couto Alfenas e Tonimara de Souza Cândido

1 Introdução ............................................................................................................ 187

2 Câmeras Fotográficas ........................................................................................... 188

3 Objetivas .............................................................................................................. 190

3.1 Objetiva normal ............................................................................................ 190

3.2 Teleobjetiva ................................................................................................... 191

3.3 Grande angular ............................................................................................. 191

3.4 Macro-objetiva .............................................................................................. 191

3.5 Objetiva zoom ............................................................................................... 192

4 Câmeras Embarcadas para Fotos Aéreas em VANTs ............................................. 192

5 Composição Fotográfica ....................................................................................... 193

6 Informações Úteis ................................................................................................. 195

6.1 Eliminação de sombras ................................................................................. 195

6.2 Horário de fotografar .................................................................................... 195

7 Fotomicrografia .................................................................................................... 196

7.1 Composição dos microscópios ...................................................................... 196

7.2 Obtenção de fotomicrografias........................................................................ 197

8 Micrometria .......................................................................................................... 198

9 Edição de Imagens ............................................................................................... 203

10 Exercícios ........................................................................................................... 204

11 Referências ......................................................................................................... 205

9 PREPaRaçõEs E obsERVaçõEs MICRosCóPICas DE EsPéCIMEs FúngICos

Reginaldo Gonçalves Mafia e Acelino Couto Alfenas

1 Introdução ............................................................................................................ 207

2 Controle da Iluminação ........................................................................................ 208

3. Limpeza das Lentes Microscópicas ...................................................................... 209

4 Preparações Microscópicas ................................................................................... 209

4.1 Preparo de lâminas microscópicas temporárias.............................................. 211

4.1.1 Lâminas preparadas com fita adesiva .................................................. 211

4.1.2 Lâminas de raspagem .......................................................................... 211

4.1.3 Lâminas de cortes histológicos ............................................................. 213

4.1.4 Microcultura ........................................................................................ 216

4.2 Corantes e técnicas de coloração de núcleos ................................................. 217

4.3 Coloração com safranina O ........................................................................... 219

4.4 Coloração pelo método Giemsa .................................................................... 220

5 Exercícios ............................................................................................................. 222

6 Referências ........................................................................................................... 222

10 MICRosCoPIa E sUas aPlICaçõEs no EstUDo Das IntERaçõEs FUngo-Planta

Olinto Liparini Pereira e Jorge Fernando Pereira

1 Introdução ............................................................................................................ 225

2 Técnicas Microscópicas ........................................................................................ 227

2.1 Microscopia óptica ........................................................................................ 227

2.2 Microscopia de fluorescência ......................................................................... 229

2.2.1 Técnicas imunocitoquímicas ................................................................ 229

2.2.2 Corantes fluorescentes ......................................................................... 230

2.2.3 Proteínas fluorescentes verde, azul e vermelha .................................... 230

2.3 Microscopia de varredura a laser confocal (MVLC) ....................................... 231

2.4 Microscopia eletrônica de transmissão – Imunolocalização ............................ 232

2.5 Microscopia crioeletrônica ............................................................................. 233

2.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ................................................... 233

2.7 Microscopia eletrônica associada à microanálise por raios X ......................... 233

3 Métodos ............................................................................................................... 234

3.1 Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em folhas ............................ 234

3.1.1 Técnica de clareamento e coloração de fragmentos vegetais de Bruzzese e Hasan (1983) ..................................................................... 235

3.1.2 Técnica de coloração de cortes por ácido periódico-Schiff (Dring, 1955) ....................................................................................... 236

3.1.3 Reagente de Bell (Bell, 1951) .............................................................. 237

3.1.4 Tionina e Orange G (Stoughton, 1930) ............................................... 238

3.1.5 Azul-de-toluidina (Ghemawat, 1977) ................................................... 238

3.1.6 Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em raízes ................... 239

3.1.7 Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em tecidos lenhosos .. 241

3.1.8 Coloração de estruturas fúngicas em material embebido em resina (LR White resin ou Spurr’s resin) ............................................... 242

3.2 Histoquímica de compostos fenólicos em tecido vegetal ................................ 243

3.2.1 Compostos fenólicos gerais .................................................................. 243

3.2.1.1 Cloreto de ferro III (Johansen, 1940) ...................................... 243

3.2.1.2 Formalina 4% e sulfato ferroso 10% (Johansen, 1940) .......... 243

3.2.1.3 Dicromato de potássio (Gabe, 1968) ....................................... 244

3.2.1.4 Diazorreação (Ganter e Jollés, 1970) ...................................... 245

3.2.1.5 Ação de fluorocromos (Charrière-Ladreix, 1976) “em luz ultravioleta”............................................................................. 245

3.2.2 Taninos - Vanilina clorídrica (Mace e Howell, 1974) ............................ 246

3.2.3 Lignina ................................................................................................ 247

3.2.3.1 Floroglucinol (Johansen, 1940) ............................................... 247

3.3 Histoquímica de calose em tecido vegetal ..................................................... 247

3.3.1 Azul-de-anilina (Smith e Mccully, 1978) “em luz azul” ......................... 247

3.3.2 Calcofluor White “em luz ultravioleta” ................................................. 248

3.4 Estudo da interação fungo-planta pela introdução de gene repórter .............. 248

3.4.1 Proteína verde fluorescente para estudos do crescimento e monitoramento de hifas fúngicas ......................................................... 249

3.4.2 Proteína verde fluorescente para análise da expressão de genes envolvidos na interação fungo-planta e localização de proteínas de interesse .......................................................................................... 250

4 Exercícios ............................................................................................................. 252

5 Referências ........................................................................................................... 252

11 MétoDos EM nEMatologIa VEgEtal

Leandro Grassi de Freitas, Wânia dos Santos Neves e Rosângela D’arc de Lima Oliveira

1 Introdução ............................................................................................................ 257

2 Amostragem ......................................................................................................... 258

3 Extração de Nematoides....................................................................................... 261

3.1 Extração de nematoides vermiformes do solo ............................................... 262

3.2 Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo seco (Shepherd, 1970) .......................................................................................... 267

3.3 Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo úmido: método da sacarose densa (Dunn, 1969) .................................................................. 268

3.4. Extração de nematoides das raízes ............................................................... 268

3.5 Extração de nematoides de partes aéreas de plantas ..................................... 270

4 Preparo de Lâminas ............................................................................................. 270

4.1 Preparo de lâminas temporárias (Cobb, 1918) .............................................. 270

4.2 Preparo de lâminas permanentes .................................................................. 271

5 Coloração de Nematoides .................................................................................... 274

5.1 Método de coloração de nematoides no interior do sistema radicular de plantas com fucsina ácida (Byrd et al., 1983) ................................................ 274

5.2 Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com fucsina ácida (Silva et al., 1988) .................................................................... 276

5.3 Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com floxina B (Taylor e Sasser, 1978) ................................................................... 277

5.4 Método de coloração de massas de ovos e ovos de Meloidogyne spp. com corantes da indústria alimentícia (Rocha et al., 2005) ............................ 277

6 Inoculação de Nematoides ................................................................................... 278

6.1 Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne spp. para infestação de solo ................................................................................. 278

6.2 Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Heterodera glycines para infestação de solo .................................................................................. 279

6.3 Calibração de suspensões de ovos de Meloidogyne spp. e de Heterodera glycines, para inoculação .............................................................................. 279

7 Identificação de Espécies e Raças de Meloidogyne spp. ........................................ 280

7.1 Identificação de espécies por padrão perineal da fêmea ............................... 280

7.2 Identificação de espécies de Meloidogyne spp. pela eletroforese de isoenzimas .................................................................................................... 281

7.3 Identificação de espécies e raças de Meloidogyne spp. por hospedeiros diferenciadores .............................................................................................. 291

8 Determinação do Índice de Galhas ....................................................................... 292

9 Identificação de Raças de Heterodera glycines ..................................................... 293

10 Referências ......................................................................................................... 295

12 MétoDos EM VIRologIa VEgEtal

Francisco Murilo Zerbini e Poliane Alfenas-Zerbini

1 Introdução ............................................................................................................ 297

2 Métodos de Diagnose de Viroses Vegetais ............................................................ 299

2.1 Determinação da gama de hospedeiros de um vírus ..................................... 299

2.2 Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (ELISA) ............... 303

2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................ 306

2.4 PCR em tempo real ....................................................................................... 310

3 Métodos Utilizados para Estudo das Propriedades e dos Componentes da Partícula Viral ....................................................................................................... 315

3.1 Purificação de vírus de plantas ..................................................................... 315

3.1.1 Purificação de um tobamovírus (TMV) ................................................ 319

3.1.2 Purificação de um comovírus (BRMV) ................................................. 321

3.2 Eletroforese da proteína capsidial de um vírus ............................................... 323

3.3 Purificação e eletroforese do RNA de um vírus ............................................. 327

4 Métodos para a Caracterização Molecular de Vírus de Plantas .............................. 330

4.1 Amplificação de fragmentos do genoma viral via RT-PCR ............................. 330

4.2. Extração e amplificação do genoma completo de begomovírus .................... 334

4.3 Clonagem de fragmento do genoma viral amplificado por RT-PCR ............... 338

4.3.1 Ligação ao plasmídeo vetor ................................................................. 338

4.3.2 Transformação de Escherichia coli ....................................................... 340

4.3.3 Extração de DNA plasmidial por lise alcalina ....................................... 342

4.3.4 Análise dos plasmídeos recombinantes ................................................ 344

4.4 Sequenciamento de DNA .............................................................................. 345

4.5 Análise de sequências .................................................................................... 347

4.6 Caracterização de proteínas virais supressoras de silenciamento ................... 349

5 Exercícios ............................................................................................................. 351

6 Referências ........................................................................................................... 353

13 MétoDos DIagnóstICos Da PoDRIDão Do lEnho DE áRVoREs VIVas

Maria Alves Ferreira, Vinicius Resende de Castro e Acelino Couto Alfenas

1. Introdução ........................................................................................................... 355

2 Avaliação da Podridão do Lenho por Métodos Não Destrutivos ........................... 356

2.1 Métodos não invasivos .................................................................................. 357

2.1.1 Análise visual ....................................................................................... 357

2.1.2 Tomografia de impulso ........................................................................ 367

2.1.3 Tomografia de impedância elétrica ...................................................... 370

2.1.4 Extensômetro ...................................................................................... 371

2.2 Métodos invasivos ......................................................................................... 372

2.2.1 Trado de incremento ........................................................................... 372

2.2.2 Furadeira ............................................................................................. 374

2.2.3 Resistógrafo ......................................................................................... 374

2.2.4 Raios X ................................................................................................ 378

3 Exercícios ............................................................................................................. 384

4 Referências ........................................................................................................... 388

14 PRInCíPIos E MétoDos PaRa IDEntIFICação MolECUlaR DE FUngos

Danilo Batista Pinho, Alexandre Reis Machado e André Luiz Firmino

1 Introdução ............................................................................................................ 389

2 Obtenção de Culturas Monospóricas .................................................................... 390

2.1 Isolamento monospórico ............................................................................... 391

2.2 Isolamento monospórico de fungos que produzem esporos no interior de corpos de frutificação ............................................................................... 392

2.3. Fungos com micélio estéril ............................................................................ 394

3 Extração de DNA ................................................................................................. 395

3.1 Extração de DNA por resina .......................................................................... 395

4 PCR ..................................................................................................................... 397

4.1 Variações da PCR .......................................................................................... 398

4.1.1 PCR convencional ............................................................................... 398

4.1.2 PCR multiplex ..................................................................................... 398

4.1.3 Nested PCR ......................................................................................... 399

4.2 Reagentes utilizados na PCR ......................................................................... 399

4.2.1 Taq DNA polimerase ........................................................................... 399

4.2.2 Primers ................................................................................................ 400

4.2.3 Desoxirribonucleotídeos fosfatados ...................................................... 401

4.2.4 MgCl2 .................................................................................................. 401

4.2.5 Tampão ............................................................................................... 401

4.2.6 Água .................................................................................................... 402

4.3 Princípios da PCR ......................................................................................... 402

4.3.1 Desnaturação ...................................................................................... 402

4.3.2 Anelamento ......................................................................................... 402

4.3.3 Extensão ............................................................................................. 404

5 Eletroforese .......................................................................................................... 404

6 Identificação Molecular de Fungos ........................................................................ 405

6.1 Detecção de fungos fitopatogênicos utilizando a PCR.................................... 405

6.1.1 PCR em tempo real ............................................................................. 406

6.2 Sequenciamento ........................................................................................... 407

6.2.1 Técnicas de sequenciamento ............................................................... 407

6.2.2 Verificação dos eletroferogramas e obtenção das sequências consenso .. 409

6.3 Comparações de sequências em banco de dados .......................................... 410

6.3.1 Blast (“Basic Local Alignment Search Tool”) ........................................ 411

6.4 Código de barras para fungos ....................................................................... 413

6.5 Análise filogenética na identificação de fungos .............................................. 414

6.5.1 Alinhamento múltiplo de sequências ................................................... 415

6.5.2 Principais métodos de reconstrução filogenética .................................. 416

6.5.3 Testes de confiança de topologias ........................................................ 419

6.5.4 Árvores filogenéticas ............................................................................ 419

7 Exercícios ............................................................................................................. 420

8 Referências ........................................................................................................... 421

15 DEtECção E IDEntIFICação DE baCtéRIas FItoPatogênICas

Jorge Luis Badel, Daniele A. A. Arriel, Lúcio M. S. Guimarães eHélvio G. M. Ferraz

1 Introdução ............................................................................................................ 423

2 Meios Seletivos ..................................................................................................... 424

3 Métodos Sorológicos ............................................................................................ 426

3.1 Produção de anticorpos policlonais ............................................................... 428

3.2 Produção de anticorpos monoclonais ............................................................ 429

3.3 Conjugação de anticorpos ............................................................................. 431

4 Principais Métodos Sorológicos ............................................................................ 432

4.1 Imunodifusão radial ...................................................................................... 432

4.2 Aglutinação ................................................................................................... 433

4.3 Imunofluorescência (IF) ................................................................................. 435

4.4 ELISA ........................................................................................................... 436

4.5 Testes de fluxo ............................................................................................... 438

4.6 Teste de “Pocket Diagnostic®” ....................................................................... 439

4.7 Citometria de fluxo ........................................................................................ 440

4.8 Imunocaptura magnética ............................................................................... 441

5 Métodos Moleculares ............................................................................................ 442

5.1 Extração de DNA de bactérias ....................................................................... 443

5.2 PCR convencional ......................................................................................... 446

6 Variações da Técnica da PCR ............................................................................... 449

6.1 BIO-PCR ....................................................................................................... 450

6.2 Nested-PCR ou PCR aninhada ...................................................................... 450

6.3 Co-PCR ......................................................................................................... 450

6.4 Multiplex PCR ............................................................................................... 451

6.5 Rep-PCR ....................................................................................................... 452

6.6 RFLP-PCR ..................................................................................................... 454

6.7 PCR em tempo real ....................................................................................... 454

7 Identificação Baseada em Sequências de DNA ..................................................... 457

7.1 Sequenciamento de genes ............................................................................. 457

7.2 Sequenciamento de genomas ........................................................................ 464

8 Exercícios ............................................................................................................. 466

9 Referências ........................................................................................................... 467

ESTUDO DIRIGIDO ................................................................................................ 473ÍNDICE ................................................................................................................... 499

27Esterilização, preparo de meios de cultura e fatores associados ao cultivo de fitopatógenos

Esterilização, Preparo de Meios de Cultura e Fatores Associados ao Cultivo de

Fitopatógenos

Edival Ângelo Valverde ZauzaAcelino Couto Alfenas

Reginaldo Gonçalves Mafia

1 Introdução

Desde o século IV a.C., Aristóteles recomendava ferver a água como medida preventiva contra enfermidades. Por muitos anos, vários estudiosos verificaram a importância da higienização do material usado no trabalho, do próprio ambiente e das mãos, observando a potencialidade da transmissão de doenças via uso de material contaminado. Daí surgiu a esterilização de utensílios pelo uso do calor (água quente), álcool, cloro, iodo e fenol. Posteriormente, veio a esterilização por vapor, sendo o primeiro protótipo de autoclave desenvolvido em 1880, por Charles Chamberland. Desde então, vários métodos de esterilização foram concebidos e aprimorados, sendo o calor, a radiação (UV), os gases tóxicos e a filtragem os mais usados, atualmente, em Fitopatologia.

2 Esterilização

A esterilização de utensílios e vidrarias usados rotineiramente em Laboratórios de Fitopatologia pode ser feita por métodos físicos e químicos.

CAPÍTULO 1

28 Zauza, Alfenas e Mafia

2.1 Método físico

2.1.1 Calor

É utilizado para esterilizar materiais que não alteram sua forma e, ou, peso quando expostos a altas temperaturas. A esterilização via calor pode ser por meio de vapor saturado (calor úmido) ou calor seco.

Vapor saturado ou calor úmido

Na esterilização por vapor saturado, emprega-se a autoclave (Figura 1.1). Na falta desse equipamento, pode-se utilizar uma panela de pressão equipada com um manômetro e um termômetro. A temperatura e o tempo de esterilização a úmido são menores que os da esterilização a seco, uma vez que seu poder de penetração é maior, levando os microrganismos à morte pela coagulação das proteínas. O tempo e a temperatura de autoclavagem variam de acordo com o tipo de material e o seu grau de contaminação. Normalmente, se esse grau for baixo, será suficiente o binômio tempo/temperatura de 10-15 min a 121 ºC ou 20 min a 115 ºC sob pressão de 1,1 e 0,7 kgf/cm2, respectivamente (Dhingra e Sinclair, 1995). No entanto, quando o grau de contaminação for mais elevado, procede-se a duas a três autoclavagens sucessivas, em intervalos de 24 h a 121 ºC/2 h, entre cada autoclavagem (esterilização fracionada). A esterilização fracionada é um processo utilizado em situações em que a autoclavagem convencional não elimina os propágulos infectivos. Tal processo é comumente utilizado para esterilização de solo ou substrato para produção de mudas. Após a última autoclavagem, esses elementos devem ser mantidos em repouso durante 5-7 dias, para que os compostos tóxicos, como manganês, liberados durante o processo de autoclavagem sejam novamente incorporados à solução do solo, de modo a não desencadear fitotoxicidade (Menezes e Silva-Hanlin, 1997).

Recomenda-se a autoclavagem para esterilização de meios de cultura, água, material em pó, solo e outros similares. No entanto, óleos ou produtos oleaginosos não podem ser autoclavados, pois a esterilização ocorre superficialmente, devendo, então, ser esterilizados via calor seco ou filtragem. Ademais, alguns compostos termolábeis, como hormônios, antibióticos, vitaminas, fungicidas e outros, são parcial ou totalmente inativados quando expostos a altas temperaturas, razão pela qual devem ser adicionados ao meio de cultura após a autoclavagem e submetidos previamente à esterilização por filtragem. Alta temperatura causa alterações no meio de cultura, razão pela qual se deve autoclavá-lo pelo tempo mínimo sugerido. As mudanças mais comuns incluem (Dhingra e Sinclair, 1995):


Figura 1.1 - Autoclave utilizada para esterilização via vapor saturado.

•Alterações no pH; por isso, recomenda-se aferi-lo após a autoclavagem.

•Hidrólise parcial de carboidratos.

•Reações entre açúcares e aminoácidos, formando compostos inibitórios aos microrganismos. Ademais, as sucessivas autoclavagens podem hidrolisar o ágar e inibir o crescimento microbiano.

A autoclavagem requer os seguintes cuidados:

•Antes de iniciar o processo, verifique sempre o nível da água.

•Mantenha a válvula de saída do vapor limpa, bem como as demais partes da autoclave.

•Não empilhe material dentro da autoclave, impedindo a circulação do vapor, pois isso proporcionará autoclavagem imperfeita.

•Nunca encha os frascos com mais de 2/3 de sua capacidade, pois durante a autoclavagem o líquido ferverá, podendo transbordar.

•Jamais aperte completamente a tampa dos frascos, pois com a fervura ela pode se romper e causar o derramamento da amostra.

•Recipientes vazios devem ser autoclavados deitados, para que o vapor circule adequadamente.


•Para que a esterilização seja eficiente, ao ligar a autoclave, deixe sair bastante vapor, para que ocorra a completa remoção do ar, pois assim a temperatura interna será adequada à pressão fornecida pelo manômetro.

•Ao desligar, não abra imediatamente a válvula de exaustão do vapor; deixe-o sair lentamente, pois, do contrário, o líquido poderá entrar em ebulição e extravasar. No entanto, no caso de material de superfície, como vidrarias, a exaustão pode ser rápida.

Após a completa exaustão do vapor, o material deve permanecer na autoclave por 15-45 min, para secagem eficiente. Em autoclaves de alto vácuo, o tempo de secagem é de 5-10 min.

Caso não se disponha de autoclave ou aparelho similar, deve-se esterilizar o meio de cultura via tindalização, ou seja, ferver o meio em banho-maria por 30-60 min em intervalos de 24 h, por três dias consecutivos.

Calor seco

A esterilização a seco é usada para vidrarias, instrumentos de metal, alguns tipos de plástico, óleos (ponto de ebulição = 200 ºC) e outros compostos estáveis a alta temperatura.

Consiste em aumentar a temperatura do ambiente para matar o organismo por oxidação, ocorrendo um processo de desidratação de seu núcleo celular. Como o calor seco apresenta menor poder de penetração, é necessário empregar temperatura e tempo maiores que na esterilização via calor úmido, sendo o tempo inversamente proporcional à temperatura. Assim, os binômios mais usados são 1 h a 180 ºC, 2 h a 170 ºC, 4-6 h a 140 ºC, 12-16 h a 120 ºC e 24 h a 100 ºC, iniciando-se a contagem do tempo logo que a temperatura atinja o valor desejado.

Os equipamentos utilizados para esterilização a seco são denominados estufa esterilizadora ou forno Pasteur, nos quais a dissipação do calor pode ocorrer de dois modos: ar forçado (Figura 1.2 A) e gravidade (Figura 1.2 B). Neste último não há circulação de ar, por isso o tempo para atingir a temperatura desejada de esterilização é bem maior. Durante a esterilização, deve-se atentar para os seguintes cuidados:

•Verificar o tipo de material e a temperatura em que este será esterilizado, pois há material que entra em combustão quando exposto a temperaturas elevadas.

•A esterilização a seco não é recomendada para material graduado, pois podem ocorrer alterações que afetem a precisão volumétrica das medidas.


•Ao esterilizar qualquer tipo de material que esteja enrolado em papel, não abra a porta da estufa durante o processo, visto que o papel pode entrar em combustão quando em contato com o oxigênio.

•Não colocar o material em contato com as paredes internas da estufa, organizando-o de modo a facilitar a circulação do calor. Ademais, os materiais devem ser acondicionados em latas de inox, papel-alumínio ou “Kraft”, a fim de evitar contaminações posteriores à esterilização.

Figura 1.2 - A - Estufas com circulação forçada de ar; e B - Estufas com circulação de calor por gravidade.

Flambagem

É usada na esterilização de utensílios metálicos (agulhas, estiletes, alça de platina e outros) ou de vidro durante o processo de isolamento e repicagem de microrganismos. Para flambagem, usa-se a chama produzida por bico de Bunsen ou lamparina com álcool (Figura 1.3 A). A temperatura ideal é acima de 45 ºC, no entanto, na prática, ao flambar metal, considera-se que essa temperatura é atingida no momento em que esse material fica avermelhado (Figura 1.3 B); objetos de vidro devem ser passados várias vezes pela chama.

AB


Figura 1.3 - Flambagem: A - Bico de Bunsen (esquerda) e lamparina com álcool (direita); e B - Ponto ideal para flambagem de material metálico.

2.1.2 Filtragem

Separa fisicamente microrganismos, células e fragmentos orgânicos, porém não o faz com vírus ou produtos metabólicos. É utilizada para esterilizar soluções aquosas, orgânicas, óleos e produtos termolábeis (vitaminas, hormônios etc.) (Figura 1.4).

A B

Figura 1.4 - Esquema de esterilização por filtragem.


5.4 Aeração

Dióxido de carbono (CO2) e oxigênio são os principais gases que afetam o crescimento de microrganismos. O gás carbônico é utilizado em todas as células em determinadas reações químicas; no entanto, seu excesso no meio de cultura, como também o de amônia e de outras substâncias voláteis, pode inibir o crescimento e esporulação de alguns fungos.

6 Exercícios

Os exercícios a seguir visam ao treinamento quanto a manuseio de autoclave, medições de pH e preparo de meios de cultura.

6.1) Prepare 200 mL dos meios ágar-água (AA) (Tabela 1.1) e batata-dextrose-ágar (BDA) (Tabela 1.2) em erlenmeyers de 500 mL de capacidade, conforme previamente descrito.

6.2) Ajuste o pH do meio para 5,5 antes da autoclavagem.

6.3) Prepare 20 tubos de ensaio (150 x 15 mm) contendo cada um 5 mL dos respectivos meios.

6.4) Prepare 10 placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo cada uma 10 mL dos respectivos meios.

6.5) Após a solidificação, repique a colônia do fungo para a placa e o tubo e avalie o seu crescimento.

7 ReferênciasALFENAS, A. C.; PETERS, I.; BRUNE, W.; PASSADOR, G. C. 1991. Eletroforese de proteínas e isoenzimas de fungos e essências florestais. Viçosa, MG: UFV, Imprensa Universitária. 242 p.

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TUITE, J. 1969. Plant pathological methods. Fungi and bacteria. Minneapolis: Burgess Publishing Co. 239 p.

55Isolamento de fungos fitopatogênicos

CAPÍTULO 2

Isolamento de Fungos Fitopatogênicos

Acelino Couto AlfenasFrancisco Alves Ferreira

Reginaldo Gonçalves MafiaRivadalve Coelho Gonçalves

1 Introdução

O isolamento de fungos fitopatogênicos consiste na sua obtenção em cultura pura a partir de tecidos doentes do hospedeiro, solo, água ou substrato. A obtenção do patógeno em cultura pura é essencial para estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e fisiologia, bem como em testes de patogenicidade, resistência genética de plantas e sensibilidade a fungicidas. As operações de isolamento são executadas sob rigorosa assepsia, em ambiente próprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados.

A obtenção de um organismo em cultura pura, a partir de uma planta doente, não significa que ele seja o agente causal. Para provar que dado organismo é o agente causal de uma enfermidade, é essencial seguir rigorosamente estas regras do postulado de Koch:a) Associação constante do organismo suspeito com os sintomas de uma

determinada doença.b) Isolamento do organismo em cultura pura.c) Inoculação do organismo isolado em plantas sadias e reprodução dos

sintomas e sinais típicos da doença.d) Reisolamento do mesmo organismo inoculado.

56 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves

Para parasitas biotróficos (obrigatórios), via de regra não cultiváveis, o organismo é inoculado a partir de inóculo obtido do próprio hospedeiro ou de plantas de outras espécies suscetíveis à doença e que, preferencialmente, tenham maior capacidade de produção de esporos. Em um dos exemplos, é possível produzir esporos de ferrugem (Puccinia psidii) por meio da inoculação do patógeno em plantas de jambeiro e, posteriormente, inoculação em mudas de eucalipto.

Vários meios de cultura podem ser usados, dependendo das exigências nutricionais do organismo (Capítulo 1). Os meios batata-dextrose-ágar (BDA) e extrato de malte-ágar (EMA) são rotineiramente utilizados nos laboratórios de Fitopatologia, por serem relativamente de baixo custo e fácil preparo e possibilitarem o crescimento da maioria dos fungos cultiváveis. O organismo é cultivado em placas de Petri contendo o meio de cultura e, após o seu crescimento, repicado para tubos com meio BDA inclinado, para ser armazenado e utilizado quando necessário.

2 Métodos Básicos de Isolamento

Diferentes técnicas de isolamento são usadas, conforme a natureza do órgão doente, o substrato e o estádio de desenvolvimento do patógeno (vegetativo ou reprodutivo), bem como a critério do operador. Os métodos básicos de isolamento são o direto e o indireto.

2.1 Isolamento direto

O isolamento direto consiste na transferência, com o auxílio de um estilete ou de qualquer instrumento de ponta fina, de estruturas do patógeno (esporos, hifas, rizomorfos, escleródios) diretamente do órgão infectado ou de qualquer outro substrato para o meio de cultura. Quando a pretensão é trabalhar com esporos, mas estes não estão presentes na amostra, pode-se estimular a esporulação do fungo, mantendo o material em câmara úmida (por um a três dias) a 25 ºC. A exposição do material à luz contínua, em câmara úmida, é geralmente recomendável para favorecer a esporulação. A câmara úmida pode ser feita de várias maneiras, mas a mais comum é o uso de placas de Petri ou bandejas envoltas por saco plástico transparente, com pelo menos a tampa translúcida, contendo papel-filtro ou algodão embebido em água (Figura 2.1). Placas de Petri contendo ágar-água (AA) também podem ser utilizadas como meio suporte para germinação de esporos e para iscas e fragmentos de tecido lesionado, pois funcionam também como câmara úmida. De modo geral, conseguem-se bons resultados com o isolamento direto a partir de:


a) Produção de conidióforos e conídios livres nos hifomicetos.b) Produção de picnídios e acérvulos nos coelomicetos com cirros conidiais nos

ápices dessas estruturas.c) Produção de peritécios nos ascomicetos, havendo, em alguns casos, acúmulo

de ascósporos exsudados nos ápices dessas estruturas.A estrutura fúngica formada na superfície do hospedeiro deve ser

visualizada à lupa estereoscópica e, com o auxílio de um estilete previamente flambado e resfriado, transferida assepticamente para placas ou tubos contendo o meio de cultura. Quando os esporos são produzidos em cavidades picnidiais ou periteciais, elas serão expostas por meio de cortes sob lupa, de onde o fungo é transferido assepticamente para o meio.

Figura 2.1 - Câmara úmida preconizada a partir de A - placa de Petri ou B - bandeja ou gerbox com tampa translúcida + algodão ou papel-filtro umedecido.

Vantagens do isolamento direto

a) Permite obter o organismo puro, isento de contaminações de microrganismos saprófitas associados ao tecido infectado.

b) Permite saber e controlar exatamente qual organismo está sendo transferido para o meio.

c) Permite estabelecer comparações entre as estruturas do organismo formadas na superfície do hospedeiro e as características da cultura pura obtida.

d) O isolamento é realizado de forma rápida e com baixo custo.

Material necessário

a) Microscópio estereoscópico (lupa).b) Estilete.c) Lamparina com álcool.d) Placas de Petri com BDA.e) Tubos de ensaio com BDA inclinado.

A B

58 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves

Procedimento (ver Figura 2.2)

a) Focalize as estruturas do patógeno em lupa.b) Flambe o estilete.c) Resfrie a ponta do estilete, tocando-a levemente no meio de cultura. d) Transfira estruturas visualizadas para uma placa com o meio de cultura.

Coloque uma estrutura no centro e três ao redor dela, aproximadamente equidistantes. Para melhor controle, antes da transferência das estruturas fúngicas, demarque no fundo da placa de petri os pontos que receberão as estruturas do fungo.

e) Incube até o aparecimento da colônia desejada.f) Repique essa colônia para tubos com BDA inclinado.

2.2 Isolamento indireto

A técnica de isolamento indireto consiste na transferência, para o meio de cultura, de porções infectadas de tecido do hospedeiro ou amostras de solo, areia, substrato ou sementes infestadas. Os métodos de isolamento indireto variam com o tipo de órgão ou tecido infectado (órgãos lenhosos ou carnosos, não lenhosos ou não carnosos) ou substrato de onde o organismo é recuperado. Em muitos casos, o patógeno está dentro dos tecidos da planta sem produzir estruturas na superfície do órgão lesionado. Nessas situações, a superfície dos tecidos mortos é invadida por outros organismos saprófitas (fungos e bactérias), o que dificulta a obtenção do patógeno em cultura pura. Para evitar a incidência de contaminantes, o isolamento deve ser feito, sempre que possível, a partir de material recém-infectado, onde o patógeno se encontra em crescimento ativo nos tecidos e há menos saprófitas invasores. Empregam-se, também, métodos especiais de isolamento conforme a natureza do órgão infectado, visando reduzir ou eliminar completamente os contaminantes superficiais.

2.2.1 Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos)

Quando os tecidos são lenhosos ou carnosos e o patógeno atinge as camadas de células mais profundas, a incidência de contaminantes superficiais é evitada pela remoção dos tecidos expostos e transferência de apenas fragmentos tissulares mais internos, retirados das margens da lesão, para o meio de cultura. A exposição dos tecidos dos quais o patógeno é isolado é feita com o auxílio de um escalpelo ou lâmina de barbear previamente flambados, tendo-se o cuidado de não tocar com a ferramenta cortante na região do tecido recém-exposto. Pequenos fragmentos


do tecido recém-descoberto são cortados nas margens da lesão e assepticamente transferidos para o meio de cultura, com o uso de uma pinça ou estilete.

Figura 2.2 - Representação esquemática do isolamento de um fungo a partir de suas estruturas produzidas sobre a lesão.

457Detecção e identificação de bactérias fitopatogênicas

7 Identificação Baseada em Sequências de DNAA disponibilidade de sequenciamento rápido e barato de DNA associado

a grandes bases de dados, como o KEGG e o NCBI, permitiu mudança radical na taxonomia bacteriana (Bull & Koike, 2015). Sequências de qualquer gene ou de genomas inteiros podem ser facilmente comparados e analisados utilizando métodos filogenéticos para múltiplas bactérias. A partir dessa comparação, é possível identificar a bactéria em níveis intraespecíficos.

7.1 Sequenciamento de genes

A principal região-alvo do genoma explorada para detecção de bactérias fitopatogênicas é o DNA ribossomal. Em bactérias são encontrados três tipos de moléculas de RNA que fazem parte dos ribossomas: o 5S e 23S, que constituem a subunidade grande (50S), e as moléculas de 16S que constituem a subunidade menor (30S). O DNA ribossomal está presente em todas as bactérias em elevado número de cópias por genoma, apresentando-se altamente conservado. Além disso, particularmente o 16S rDNA apresenta grande número de sequências depositadas nos bancos de dados. A metodologia utilizando primers dessa região é relativamente simples e com bom poder de resolução. Atualmente, vem sendo empregada na identificação de bactérias, principalmente em nível de gênero e, em alguns casos, também de espécies. Para identificação em níveis de subespécie ou patovar, geralmente outros genes são requeridos.

Como o sequenciamento do gene 16S rDNA não discrimina algumas espécies de bactérias e, principalmente, níveis infraespecíficos, são necessários métodos adicionais na detecção precisa de bactérias fitopatogênicas. Atualmente, a maioria dos trabalhos tem demonstrado que a análise de sequências multilocos (MLSA) proporciona maior confiança nas conclusões filogenéticas e de diagnose do que a análise de genes individuais. Na prática, os fragmentos de quatro a oito genes são sequenciados individualmente e fragmentos de sequências pequenas são unidos in silico (concatenadas) antes da análise. A análise dos genes concatenados fornece uma poderosa ferramenta filogenética, útil na classificação e identificação das bactérias. Um grupo de genes mais usualmente utilizados nas MLSA são os genes housekeeping (Tabela 15.3). Os genes housekeeping vêm sendo muito utilizados em análises filogenéticas e na identificação de linhagens de bactérias, cujas relações genéticas são muito próximas, por serem conservadas e essenciais para a manutenção de funções celulares básicas.

458 Badel, Arriel, Guimarães e Ferraz

Tabela 15.3 - Funções biológicas de alguns genes housekeeping frequentemente usados em MLSA

Gene Proteína codificada Fonte

atpD Subunidade β da ATP sintase Young & Park, 2007

recA Recombinase A Eisen, 1995; Waleron et al., 2002; Young & Park, 2007

gyrB, Subunidade β da DNA girase Mondal et al., 2012

rpoB Subunidade β da RNA polimerase Dahllof et al., 2000

rpoD Fator sigma da RNA polimerase Young et al., 2008

dnaK Proteína de choque térmico Young et al., 2008

fyuA Proteína transmembrana Young et al., 2008

A seguir será apresentado um exemplo de como utilizar o sequenciamento da região parcial do gene 16S rDNA para auxiliar na diagnose e detecção de fitobactérias.

As etapas envolvidas no processo estão apresentadas na Figura 15.12.

Figura 15.12 - Etapas envolvidas na detecção de bactérias fitopatogênicas, por meio do sequenciamento da região 16S do RNA ribossomal.


Após a extração do DNA como descrito anteriormente, deve-se proceder à amplificação por PCR de parte da região do gene 16S rDNA. Como exemplo, será utilizado o par de primers fd2 e rp1 (Weisburg et al., 1991).

As reações devem ser conduzidas em volume total de 25 µL, contendo:

5,0 µL de tampão para PCR 5X.

2,5 µL de MgCl2 (25 mM).

2,0 µL de cada dNTP (2,5 mM).

1,5 µL de cada primer (10 mM) - fd2 e rp1.

0,2 µL da Taq polymerase (5 U/µL).

2,0 µL do DNA (10 ng/µL).

10,8 µL de água ultrapura.

O programa no termociclador deve ser:

Desnaturação inicial a 94 °C, 2 min.

35 ciclos de: 94 °C, 30 segundos; 52 °C, 30 segundos; 72 °C, 2 min.

Extensão final a 72 °C, por 5 min.

Realizada a PCR, deve-se confirmar a amplificação da região-alvo. Para isso, aplica-se uma alíquota do produto da PCR em gel de agarose e, após a eletroforese, o fragmento de tamanho esperado é visualizado. Uma vez confirmada a amplificação, deve-se fazer a purificação do produto da PCR para que excesso de reagentes, que não foram consumidos durante a amplificação das amostras, seja removido. Para a purificação, devem-se usar kits comerciais apropriados e seguir as instruções do fabricante. Após a purificação, realiza-se a quantificação das amostras em espectrofotômetro, diluindo o produto da PCR, se necessário. Em seguida, o produto da PCR e uma alíquota dos primers usados na amplificação devem ser enviados para o sequenciamento. Atualmente, já existem empresas especializadas em prestar esse tipo de serviço. As sequências de nucleotídeos geradas pelo sequenciamento são representadas por códigos de uma única letra identificando cada uma das bases nitrogenadas contidas no DNA: A (Adenina), T (Timina), C (Citosina) e G (Guanina). Geralmente, o resultado de cada amostra sequenciada é representado num formato denominado FASTA. Uma sequência em formato FASTA começa com uma descrição de uma única linha, seguida por linhas de dados em sequência. A linha de descrição deve ser iniciada por um símbolo maior-que (“>”), seguida (sem espaço) da identificação da sequência. A partir da segunda linha, a sequência de nucleotídeos lida pelo sequenciador é apresentada na Figura 15.13.


Figura 15.13 - Exemplo de sequência em formato FASTA. A primeira linha iniciada pelo símbolo (“>”) identifica a sequência, a qual é seguida por linhas contendo a sequência de nucleotídeos.

Obtida a sequência, a comparação desta com outras disponíveis em bancos de dados, como o GenBank do NCBI, pode ser realizada. O GenBank é o banco de dados de livre acesso, onde podem ser encontradas todas as sequências de DNA publicamente disponíveis. Dentro do GenBank, a comparação das sequências de nucleotídeos pode ser obtida por meio do algoritmo Blast (Altschul et al., 1997), o qual pode ser acessado pelo endereço: <https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch>. Uma vez acessado o site do Blast, a sequência a ser consultada deve ser colada em formato FASTA no espaço Enter Query Sequence. Nenhum dos parâmetros ou opções-padrão da página precisa ser alterado. Em seguida, deve-se clicar na aba BLAST em azul no fim da página à esquerda (Figura 15.14).

O algoritmo irá procurar por sequências semelhantes no banco de dados e fazer o alinhamento com aquelas que apresentarem maior homologia. Após a busca, uma nova página com os resultados será aberta (Figura 15.15). No início da página constarão algumas informações referentes à sequência em análise como a identificação, o tamanho em pares de base e o tipo de sequência (nucleotídeos, proteínas). Logo abaixo na página será apresentada uma representação esquemática indicando a homologia da sequência analisada com outras disponíveis no GenBank. A primeira linha vermelha representa a sequência para a qual se está fazendo a análise, e as linhas abaixo representam


as sequências de nucleotídeos do GenBank que apresentam um grau de homologia mais significativo (da mais significativa para a menos significativa) com a sequência comparada (Figura 15.16).

Figura 15.14 - Página inicial do Blastn, onde a sequência a ser analisada deve ser copiada.


Figura 15.15 - Página inicial do resultado da busca usando o algoritmo Blastn. No início da página, são apresentados a identificação da sequência avaliada e o seu alinhamento com outras disponíveis no GenBank.

Figura 15.16 - Descrição das sequências que foram alinhadas com a sequência em estudo. Nessa tabela também aparece o E-value, o qual indica a significância do alinhamento. Quanto menor o E-value, mais significativo.

Ainda nesta mesma página, logo abaixo da representação esquemática da sequência é apresentada uma tabela, com os dados das sequências com homologia mais significativa. Na primeira coluna, Description, há uma descrição


breve de cada sequência, contendo normalmente o organismo, o isolado e a região gênica sequenciada. As duas colunas seguintes referem-se ao Score e estão relacionadas às estatísticas do Blastn para alinhar as sequências. A coluna E-value refere-se ao número de alinhamentos esperados ao acaso, quando se usa uma base de dados de um tamanho específico. O E-value é um indicador do grau de significância do alinhamento e, quanto menor o seu valor, mais significativo é o resultado. A coluna Ident refere-se à porcentagem de identidade entre a sequência depositada no GenBank e a sequência comparada. A coluna Accession indica o número de acesso no GenBank da sequência alinhada com a que se está comparando. Após essa tabela, é apresentado o alinhamento da sequência avaliada com cada uma das sequências com as quais ela foi alinhada. No exemplo, a sequência da região 16S rDNA amplificada é da espécie tipo de E. psidii, IBSBF 435. Como essa sequência já foi previamente depositada no GenBank, o alinhamento encontrado foi de 100% e o E-value (Expected), altamente significativo (valor igual a 0) (Figura 15.17).

No caso de se trabalhar com uma sequência de uma bactéria desconhecida, a análise da região 16S fornece bom indicativo da espécie à qual o isolado em estudo pertence. No entanto, para a correta definição da espécie, devem-se procurar na literatura primers de regiões conservadas mais utilizados para o gênero da bactéria em questão e realizar análises mais específicas, como análises filogenéticas envolvendo multilocos.

Figura 15.17 - Detalhe do alinhamento entre a sequência estudada e outra sequência depositada no GenBank.


7.2 Sequenciamento de genomas

O interesse de cientistas em aprofundar os seus conhecimentos acerca da biologia dos organismos culminou no desenvolvimento de técnicas para determinar as sequências de nucleotídeos dos genomas. O sequenciamento completo de vários organismos-modelo foi inicialmente determinados pelo método de Sanger (Sanger & Coulson, 1975; Sanger et al., 1977; Smith et al., 1986), requerendo-se um significativo investimento econômico devido ao alto custo do sequenciamento. Consórcios entre universidades e centros de pesquisa brasileiros, franceses e americanos foram pioneiros no sequenciamento dos genomas das três primeiras bactérias fitopatogênicas, Xylella fastidiosa (Simpson et al., 2000), Ralstonia solanacearum (Salanoubat et al., 2002) e Pseudomonas syringae pv. tomato (Buell et al., 2003), usando o método de Sanger. Sequências de bom comprimento médio (em torno de 1.000 pb) e baixa taxa de erro são obtidas com o referido método, facilitando a montagem de genomas. A principal limitação do método de Sanger no sequenciamento de genomas é a sua baixa saída, ou seja, a quantidade de sequência gerada em determinado período de tempo. No entanto, esse método continua a desempenhar importante papel na determinação de sequências difíceis de sequenciar, como sequências repetitivas, utilizando-se outras tecnologias.

A limitação imposta pelo alto custo e a baixa saída do sequenciamento Sanger foram superadas parcialmente com o advento de métodos de sequenciamento de alta saída, conhecidos como Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing – NGS). Os primeiros dois sistemas de NGS comercialmente disponibilizados foram o Genome Sequencer (GS), baseado na tecnologia de pirossequenciamento desenvolvida pela 454 Life Sciences em 2005 (Margulies et al., 2005) e o Illumina, baseado na tecnologia de sequenciamento por síntese (Sequencing By Synthesis – SBS), originalmente desenvolvida por Solexa e comercializado pela primeira vez em 2006 (Liu et al., 2012). Ambos os métodos têm sido amplamente utilizados para o sequenciamento de genomas de diversas bactérias fitopatogênicas (Studholme et al., 2011). Em 2007, a Applied Biosciences (ABI) disponibilizou o sistema de sequenciamento por ligação e detecção de oligonucleotídeo (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection – SOLiD), baseado na química de hibridação-detecção (Shendure et al., 2005).

Um método de NGS que tem ganhado bastante aceitação por parte da comunidade científica nos últimos anos para determinar sequências de genomas de bactérias fitopatogênicas, principalmente devido ao maior comprimento dos reads, é o Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT) desenvolvido pela Pacific Biosciences (Korlach et al., 2010). Existem outras


tecnologias de NGS, como o Ion Torrent (Merriman et al., 2012) e a Complete Genomics (Lee et al., 2015) que, devido a suas limitações atuais, não têm sido utilizados amplamente no sequenciamento de bactérias fitopatogênicas, mas que poderiam fornecer alternativas de sequenciamento no futuro. A escolha do método de sequenciamento baseia-se nas vantagens e limitações de cada método, incluindo o comprimento dos fragmentos sequenciados (read length), a taxa de erro (error rate), a quantidade de sequência gerada em uma só corrida (output) e se os reads obtidos permitem obter a sequência completa do genoma.

Independentemente do método escolhido para sequenciar o genoma de uma bactéria, a abordagem experimental é a mesma: (1) o DNA de boa qualidade da bactéria fitopatogênica é isolado, geralmente usando kits comercias; (2) o DNA é fragmentado para promover a quebra aleatória das moléculas de ácido nucleico; (3) fragmentos dentro de determinada faixa de tamanho são selecionados; (4) uma biblioteca é preparada mediante a ligação de adaptadores nas extremidades dos fragmentos, se for necessário; e (5) a biblioteca é sequenciada usando o método de sequenciamento selecionado. Após a sequência dos fragmentos ser determinada, a sequência do genoma completo deve ser montada (assembled), usando ferramentas de bioinformática.

Existem diversos algoritmos que podem ser usados para montar genomas, entre eles: SPAdes (Bankevich et al., 2012), Velvet (Zerbino et al., 2008), SOAP de novo, SOAPGapCloser (Luo et al., 2012) e mais alguns adequados para o tipo de reads obtidos no sequenciamento, cuja utilidade irá depender se a montagem é feita mediante alinhamento dos reads a um genoma de referência ou se trata de uma montagem de novo. O objetivo é alinhar os reads com o intuito de obter fragmentos de sequências maiores (contigs) até conseguir montar a sequência completa do genoma. No entanto, muitas vezes não é possível determinar a sequência de nucleotídeos de alguns setores do genoma que são difíceis de sequenciar devido a diversas razões, como a formação de estruturas secundárias ou sequências situadas em regiões altamente repetitivas. No caso da identificação e detecção de bactérias fitopatogênicas, um rascunho do genoma (quando ainda existem setores do genoma cujas sequências não têm sido determinadas) pode ser suficiente para posicionar uma estirpe bacteriana em um grupo taxonômico em níveis intraespecíficos. A comparação da sequência do genoma da estirpe bacteriana de interesse com aquelas de outras estirpes possibilitará o seu posicionamento taxonômico. Há vários programas que podem ser usados para comparar sequências genômicas de vários organismos, sendo o Mummer um dos mais utilizados (Kurtz et al., 2004). No entanto, a base de dados de genomas bacterianos é ainda pequena para conseguir o posicionamento taxonômico de muitos patovares.


Embora o NGS tenha facilitado a determinação de sequências genômicas de inúmeras estirpes de bactérias fitopatogênicas, este é ainda um método oneroso para ser aplicado de maneira rotineira. Os equipamentos para NGS são bastante caros, e os processos de preparação das amostras, preparação das bibliotecas, sequenciamento das bibliotecas e montagem do genoma requerem profissionais altamente qualificados, fazendo que poucos laboratórios tenham a capacidade de realizar todos os processos. No entanto, existem múltiplas empresas especializadas em diversos países do mundo que prestam o serviço de NGS a um custo relativamente baixo. Espera-se que o custo do NGS continue a baixar nos próximos anos, devido aos avanços tecnológicos que permitem aos equipamentos acrescentarem tanto o comprimento dos reads quanto a quantidade de sequência gerada (output).

8 Exercícios

8.1) Você receberá uma amostra de tecido de eucalipto infectado com uma estirpe bacteriana. Seguindo as descrições fornecidas neste capítulo:

a) Obtenha um isolado bacteriano puro.

b) Prepare DNA total desse isolado.

c) Por meio da técnica de PCR e utilizando os primers específicos p759 (5’ -GTC GCC GTC AAC TCA CTT TCC- 3’) e p760 (5’ -GTC GCC GTC AGC AAT GCG GAA TCG- 3’), determine se a bactéria que causa os sintomas é Ralstonia solanacearum.

8.2) Imagine que você acabou de obter um isolado bacteriano puro a partir de uma amostra de plantas de eucalipto com sintomas de murcha. Para identificar o agente causal, você faz uma PCR com primers para amplificar a região 16S rDNA, e logo depois sequencia o fragmento amplificado usando cada um dos primers, obtendo a seguinte sequência:

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Páginas iniciais - 2 ed 2016 - design.jet.com.br‡ÃO... · 2 IsolaMEnto DE FUngos FItoPatogênICos Acelino Couto Alfenas, Francisco Alves Ferreira, Reginaldo Gonçalves Mafia e