Universidade Camilo Castelo Branco

Instituto de Engenharia Biomédica

PÂMELA MARIA MOREIRA FONSECA

EFEITO BACTERICIDA DA OZONIZAÇÃO, SONICAÇÃO E

OZONIZAÇÃO/SONICAÇÃO EM Streptococcus mutans

BACTERICIDE EFFECT OF OZONATION, SONICATION AND

OZONATION/SONICATION IN Streptococcus mutans

São José dos Campos, SP

2012

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PÂMELA MARIA MOREIRA FONSECA

EFEITO BACTERICIDA DA OZONIZAÇÃO, SONICAÇÃO E

OZONIZAÇÃO/SONICAÇÃO EM Streptococcus mutans

Orientador: Prof. Dr. Carlos José de Lima

Co-Orientadores: Prof. Dr. Luciano dos Santos Feitosa

Profa. Dra. Adriana Barrinha Fernandes

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia

da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários

para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia

São José dos Campos, SP

2012

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FICHA CATALOGRÁFICA

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DEDICATÓRIA

Dedico este árduo trabalho à minha pequena “Vitória Helena Fonseca Moreira” que

desde as suas primeiras horas de vida ensinou-me que é preciso coragem para

vencer a vida, e que Deus é Misericordioso perante as dificuldades encontradas.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus que neste percurso, a Tua mão grandiosa permanecia sobre minha vida,

encorajando-me a prosseguir. Àquele que, em Seu infinito amor, me concedeu

coragem para lutar e perseverança para vencer.

Aos meus pais José e Lucília que me deram a vida e ensinaram-me a viver com

dignidade além de iluminarem os meus caminhos, principalmente os obscuros, com

afeto e dedicação para que os trilhasse sem medo e cheios de esperanças. Amo

muito vocês!

Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos José de Lima, pelos ensinamentos, dedicação

e paciência durante estes anos de estudo. Agradeço também pela amizade,

profissionalismo.

Ao Prof. Dr. Luciano dos Santos Feitosa pela imensa contribuição nos

experimentos, cedendo laboratório de Biologia Molecular para a realização destes.

À Prof.ª Dr.ª: Adriana Fernandes Moretti Barrinha pelo carinho e estímulo para o

término desta pesquisa. Obrigada pelos ensinamentos com as placas de pétri e

meios de cultura, além da Escala de Mac Farland.

Ao Prof. Dr. José Lucas Martins e Prof. Dr. José Cássio de Almeida Magalhães

pelo apoio e carinho neste trabalho, e também pela imensa contribuição nas coletas

do material da cárie, e pela autorização do uso da Clínica de Odontologia.

À Petúnia de Àvila Moreira Fonseca pela paciência em me auxiliar neste estudo,

ensinando-me que paciência é uma virtude na vida, sendo uma ferramenta essencial

no crescimento profissional.

Ao Plínio Augusto Moreira Fonseca, pelos momentos de coragem e luta, fazendo-

me a acreditar sempre na vitória.

vii

À Poliana Maria Moreira Fonseca pelos meus maiores presentes: Marcos

Vinícius, Pérola e Vitória Helena! Obrigada pelos momentos de alegria e

felicidades!

Ao Dr. Paulo Luiz de Sá Júnior pelo incentivo, apoio e carinho.

À Cláudia Dos Santos de Oliveira pela amizade desde a minha chegada em São

Paulo, pelos momentos de distração na caminhada a São José dos Campos, além

do companheirismo e incentivo a nunca desistir.

À Profa. Msc. Ana Maria Costa Carneiro pela oportunidade.

Agradeço também a todos os meus colegas da UNICASTELO, amigos e familiares

que contribuíram direto e indiretamente neste sonho e que mesmo distante torceram

pelo sucesso desta etapa!

OBRIGADA!

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"Aceitar-se como um ser humano cheio de limites e fraquezas é acima de

tudo, sinal de equilíbrio, paz consigo mesmo e felicidade ."

Pe. Fábio de Melo

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EFEITO BACTERICIDA DA OZONIZAÇÃO, SONICAÇÃO E

OZONIZAÇÃO/SONICAÇÃO EM Streptococcus mutans

RESUMO

O gás ozônio diluído em água tradicionalmente tem evidenciado resultados

significativos em termos de eliminação de micro-organismos patogênicos; condições

de temperatura da água e grau de pureza deste meio líquido tem mostrado

importante influência na dosagem do O3 para o desempenho biocida. O efeito

piezelétrico atuante no sistema limpador ultrassônico, também evidencia

característica germicida interessante. Instrumentos odontológicos utilizados durante

o procedimento clínico apresentam significativo meio de contaminação cruzada, o

Streptococcus mutans é o responsável pela formação de cárie no dente, e

normalmente durante o tratamento dentário, este germe frequentemente fica

depositado na superfície do instrumento odontológico utilizado. Técnicas de

utilização de água ozonizada e do limpador ultrassônico foram utilizadas para a

higienização da cureta de raspagem odontológica. Streptococcus mutans foi

cultivado em meio de cultura microbiológico especifico, em que as curetas

odontológicas foram contaminadas, por método único. Este material foi submetido

nas técnicas de higienização de água ozonizada, e sistema limpador ultrassônico

sob condição individual e simultânea. Análise quantitativa microbiológica foi

realizada, e os resultados evidenciaram significativa diminuição dos micro-

organismos em cada técnica separada, ocorreu maior redução microbiológica

quando se utilizou as duas técnicas de O3 e ultrassom em situação simultânea, este

processo de higienização de instrumentais odontológicos, sugere viabilidade na

praticidade de higienização destes materiais.

Palavras-Chave: Ultrassom, ozônio, higienização clínica.

x

BACTERICIDE EFFECT OF OZONATION, SONICATION AND

OZONATION / SONICATION IN Streptococcus mutans

ABSTRACT

The ozone gas diluted in water has traditionally been shown to produce significant

results in terms of the elimination of pathogenic microorganisms. The temperature

conditions of the water as well as its purity have an important influence on the

dosage of O3 for sterilization purposes. The piezoelectric effect acting in the

ultrasonic cleaner system also presents interesting germicide characteristics. Dental

instruments used during the clinical procedures constitute important cross

contamination media. Streptococcus mutans is the etiologic agent of dental caries

and, normally, during dental treatment, it contaminates dental instruments.To analyze

the grade of disinfection of a surgical dental instrument using a process suitable for a

common clinical environment, using commercially available instruments.Using

ozonated water and an ultrasonic cleaner were employed for the hygienization of a

dental curette. Streptococcus mutans was grown in a selective medium and used to

contaminate the dental curettes through a single method. The curette was then

submitted to hygienization by ozonated water, by ultrasound, or both combined. The

quantitative microbial analysis was performed. Show that either method, used alone,

produced a significant microbial reduction, but the efficacy of both methods combined

was greater. This method of hygienization of dental instrumentation proved to both

viable and cheap.

Keywords: Ultrasound, ozone, clinical hygienization.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIHA - Associação Americana de Higiene Industrial MAS - Ágar Mitis Salivarius AMSB - Ágar Mitis Salivarius acrescido de Bacitracina Atm - Atmosfera Au - Ouro BHI - Brain Heart Infusion CEP - Comitê de Ética em Pesquisa DIFCO - Difco Laboratories DNA - Ácido Desoxirribonúcleico EGM - Estreptococos do Grupo Mutans H - Hidrogênio HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana IL-1 - Interleucina-1 NaCl - Cloreto de Sódio nº - Número O2 - Oxigênio O3 - Ozônio OH - Hidroxila OMS - Organização Mundial de Saúde OSHA - Administração de Saúde e Segurança Ocupacional pH - Potencial de hidrogênio PPM - Partículas por milhão, Equivalente a mg/L RNA - Ácido Ribonúcleico S. mutans - Streptococcus mutans SF 0,9% - Soro Fisiológico a 0,9% TNF α - Fator de Necrose Tumoral Alfa UFC - Unidades Formadoras de Colônias US - Ultrassom µg/mL - Micrograma por mililitro

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Placa bacteriana em dentes inferiores na região anterior e posterior ................... 20

Figura 2: Cálculo dental visto ao longo da linha da gengiva ................................................ 20

Figura 3: Macro e micromorfologia de colônias de Streptococcus mutans .......................... 26

Figura 4: Fluxo para os processos de limpeza e desinfecção de artigos contaminados ...... 28

Figura 5: Representação da formação do ozônio por descarga elétrica .............................. 35

Figura 6: Estrutura molecular do ozônio.............................................................................. 35

Figura 7: Representação do reator para a geração de ozônio pelo método de descarga elétrica. ................................................................................................................................ 36

Figura 8: Mecanismo de ação do ozônio nos microrganismos: 1) Bactéria; 2) Parede celular em contato com ozônio; 3) Oxidação da parede celular da bactéria; 4), 5) e 6) Ruptura e destruição da bactéria. ......................................................................................................... 39

Figura 9: Regiões de freqüência do som ............................................................................. 40

Figura 10: Cavitação acústica ............................................................................................. 41

Figura 11: Ondas ultras-sônicas e processo de cavitação .................................................. 42

Figura 12: Cureta dentística. ............................................................................................... 45

Figura 13: Meio de cultura BHI no frasco de vidro identificado como positivo, com crescimento bacteriano, turvação do meio e negativo, sem contaminação bacteriana. ........ 45

Figura 14: Frasco de vidro contendo SF0,9% com colônias e tubo numerado (1) da escala Mac Farland. ........................................................................................................................ 46

Figura 15: Bico de Bunsen aceso e instrumentais com os seus respectivosbéquers, durante a contaminação dos instrumentos........................................................................................ 46

Figura 16: Representação esquemática do tratamento realizado na cureta contaminada com Streptococcus mutans, com aparelho de ultrassom. ............................................................ 47

Figura 17: A- Béquers e placas de Petri contendo o meio AMSB, e curetas embaladas em papel crepado. B- Béquers e curetas contaminadas com as respectivas placas de Petri. ... 48

Figura 18: Aparelho gerador de ozônio: a) Fotografia do aparelho; b) Água sendo ozonizada com pedra porosa em uma proveta 1000 mL. ...................................................................... 49

Figura 19: Colônias de S.mutans, gram positivas, microscopia com focal colorida. ............ 51

Figura 20: Placa contendo meio de cultura ágar sangue e contendocolônias de S.mutans alfa e beta hemolíticos. ........................................................................................................ 51

xiii

Figura 21: Tratamento da bactéria S. Mutans com ozonização, concentração: 5 PPM, temperatura da água: 18ºC .................................................................................................. 54

Figura 22: Relação em porcentagem da redução bacteriana após a ozonização (concentração 5 PPM), nos tempos de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 8 minutos ............................... 55

Figura 23: Relação em porcentagem da redução bacteriana após a ozonização/sonicação, nos tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 minutos ................................................................................ 56

Figura 24: Tratamento da bactéria S. Mutans com o híbrido ultrassom/ozonização (5 PPM O3). Dose: concentração x tempo x energia. ........................................................................ 57

Figura 25: Placa de Petri contendo o meio de cultura Mitis Salivarius sacarosado e bacitracina a 2%, e UFC de S. mutans. ............................................................................... 57

Figura 26: Fotografia digital do S. mutans utilizando microscópio confocal. Lâmina com o biofilme formada a partir de meio de cultura específico para este micro-organismo. A- S.

mutans, microscopia confocal colorida; B- S.mutans, microscopia confocal preto e branco. 58

Figura 27: Meio de cultura Agar Sangue contendo colônias de S. mutans, com zonas distintas de hemólise ao redor das colônias. ........................................................................ 58

Figura 28: Tratamento das colônias com ultrassom, mantendo uma distância de 4 cm entre o fundo do béquer e a cuba do aparelho de sonicação, e IC50 = 20 minutos ........................ 59

Figura 29: Tratamento das colônias com ultrassom, mantendo uma distância de 0,5 cm entre o fundo do béquer e a cuba do aparelho de sonicação, e IC50 = 7 minutos ................. 59

Figura 30: Tratamento das colônias com ozônio, concentração 5 PPM, temperatura da água: 18ºC e IC50 = 18 segundos ......................................................................................... 60

Figura 31: Tratamento das colônias com o híbrido ultrassom + ozônio, e IC50 = 0,3 minuto (18 segundos) ...................................................................................................................... 60

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais desinfetantes químicos e esterilizantes utilizados em artigos odontológicos....................................................................................................................... 31

Tabela 2: Relação da temperatura e da solubilidade do ozônio em água. ........................... 37

Tabela 3: Número de Crescimento de S. mutans em UFC/mL após Sonicação, com Distância de 0,5 cm entre o Cristal e o Béquer. ................................................................... 53

Tabela 4: Número de crescimento de S. mutans em UFC após exposição à água ozonizada (5 PPM O3) em diferentes tempos ....................................................................................... 54

Tabela 5: Número de Crescimento de S. mutans em UFC após Exposição à Água Ozonizada (5 PPM O3) e Ultrassom Simultaneamente, em diferentes Tempos ................... 56

xv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17

1.1. Objetivos ......................................................................................................... 18

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 19

2.1. Microbiota bucal e biofilme.............................................................................. 19

2.2. Relação entre doenças periodontais e cardiopatias ........................................ 22

2.3. Cárie ............................................................................................................... 23

2.4 Streptococcus mutans ..................................................................................... 25

2.5. Fluxo e processamento de instrumentos odontológicos .................................. 26

2.5.1. Limpeza ............................................................................................ 29

2.5.2. Enxague ............................................................................................ 29

2.5.3. Inspeção visual ................................................................................. 30

2.5.4. Secagem ........................................................................................... 30

2.5.5. Desinfecção ...................................................................................... 30

2.5.6. Esterilização ...................................................................................... 32

2.5.6.1. Processo físico ............................................................................... 32

2.5.6.2. Armazenamento dos instrumentos esterilizados............................. 33

2.5.6.3. Monitoramento da esterilização ...................................................... 34

2.6. Ozônio ............................................................................................................ 34

2.7. Ultrassom ....................................................................................................... 40

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 43

3.1. Sujeitos da pesquisa ....................................................................................... 43

3.2. Meios de cultura ............................................................................................. 43

3.3. Obtenção da amostra ..................................................................................... 44

3.4. Preparo das cuspensões dos micro-organismos ............................................. 45

3.5. Contaminação dos instrumentais .................................................................... 46

3.6. Tratamento com ultrassom ............................................................................. 47

xvi

3.6.1. Semeadura .................................................................................................. 48

3.7. Ozonização da água ....................................................................................... 49

3.8. Tratamento com água ozonizada .................................................................... 50

3.9. Tratamento com água ozonizada + ultrassom ................................................ 50

3.10. Provas de identificação ................................................................................. 50

3.10.1. Prova da catalase ............................................................................ 50

3.10.2. Coloração de Gram ......................................................................... 50

3.10.3. Prova hemólise ............................................................................... 51

3.11. Análise e apresentação dos dados ............................................................... 51

3.12. Considerações éticas .................................................................................... 51

4. RESULTADOS ................................................................................................................ 53

4.1. Avaliação do tempo de sonicação necessário para reduzir população/ colonias da bactéria S. mutans .......................................................................................................... 53

4.2. Avaliação do tempo de água ozonizada necessário para reduzir as UFC do S.

mutans ................................................................................................................................. 54

4.3. Avaliação do tempo de ozonização e sonicação simultâneos necessários para reduzir as UFCs do S. mutans ............................................................................................. 55

4.4. Identificação da bactéria S.mutans ................................................................. 57

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 61

6. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 68

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 70

ANEXO A. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ............................... 78

ANEXO B. PROTOCOLO DE AUTORIZAÇAO DA PESQUISA EMITIDA PELO .P DA UNICASTELO ...................................................................................................................... 79

17

1. INTRODUÇÃO

Muitos estudos têm demonstrado que o Streptococcus mutans está associado com a

cárie em seres humanos e que há uma correlação entre o número desta bactéria

presente na saliva, a manifestação clínica da doença e o risco ao desenvolvimento

da doença (BRATTHAL; HOSZEK; ZHAO,1996).

Em geral, a aquisição de micro-organismos pelo corpo humano ocorre por

contato direto entre hospedeiro e outro, ou através de objetos inanimados, como

chupetas e brinquedos (LI; CAUFIELD, 1995).

Um dos aspectos de extrema importância na biossegurança diz respeito à

esterilização do instrumental clínico. Jabur e Scabell (2002), afirmam que a

descontaminação de instrumentos impregnados com material ou fluido orgânico

proveniente do paciente é uma fase essencial no controle das infecções passíveis

de serem adquiridas na clínica odontológica.

O Ministério da Saúde determinou que equipamentos, instrumentos e

utensílios contaminados deveriam ser submetidos a alguns processos, como:

limpeza e desinfecção (BRASIL, 2000).

Os processos acima citados estão relacionados à biossegurança, um conjunto

de condutas e medidas técnicas, administrativas e educacionais que devem ser

empregadas por profissionais da área de saúde ou afins.

A evolução das pesquisas voltadas a aplicação do ozônio sob a forma

medicinal tem aumentado de forma significativa. O gás ozônio apresenta

características microbiocidas interessantes, por ser mais seguro e contundente do

que os desinfetantes convencionais agir sobre um grande número de micro-

organismos, incluindo patógenos resistentes. Além de ser reconhecido como seguro

por não gerar resíduos tóxicos. Quimicamente, o ozônio é arranjo molecular

triatômico e instável do oxigênio, que pode ser gerado pela excitação do oxigênio

molecular a oxigênio atômico, através de um ambiente eletricamente energizado que

permite a recombinação de átomos. É um potente agente oxidante (RICE, 2006).

O ultrassom é uma forma de energia que consiste de ondas mecânicas,

produzidas com freqüência além da sensibilidade normal do ouvido humano. Os

sons normalmente audíveis pelo homem possuem freqüências entre 8 a 20 kHz.

18

O ultrassom é usado na indústria para limpeza de materiais, solda de

plásticos, processos químicos, preparação de emulsão e suspensão, degaseificação

de solventes e avaliação não-destrutiva em materiais.

Os efeitos químicos e mecânicos de ultrassom são causados por bolhas de

cavitação que são gerados durante a pressão no período de ondas sonoras, que

provocam a morte bacteriana.

O propósito deste trabalho foi identificar o poder microbiocida com o

ultrassom e ozônio, e os dois simultâneos, em curetas contaminadas com

Streptococcus mutans aumentando o efeito antimicrobiano, e como consequência,

diminuindo o tempo de desinfecção do instrumental, redução dos resíduos tóxicos,

diminuição nos custos, inclusive energia elétrica, além de facilidades para a

desinfecção destes, para os colaboradores que utilizam este instrumental.

1.1. Objetivos

1. Verificar o desempenho das técnicas de ozonização, sonicação e

ozonização/sonicação simultaneamente, como potencial bactericida na

desinfecção e controle microbiológico em instrumentais clínicos

odontológicos.

2. Caracterizar a bactéria Streptococcus mutans no instrumental clínico

específico (cureta), após coleta de material do dente com lesão cariosa.

19

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Microbiota bucal e biofilme

De acordo com os autores Simões, Araújo e Araújo (2008), a microbiota bucal

refere-se às diversas colônias de micro-organismos que colonizam a cavidade oral

desde o nascimento, sendo representada particularmente pelos Streptococcus

sobrinus; Streptococcus mutans; Streptococcus cricetus; Staphylococcus aureus;

Staphyloccus epidermides; Lactobacillos sp; Candida albicans; Candida tropicalis;

Prevotella intermedia; Prevotella melaninogenica; Porphyromonas gingivalis;

Actinobacillus actinomycetemcomitans; Capnocytophaga gingivalis e Fusobacterium

nucleatum.

Normalmente a microbiota residente não causa doenças, porém um

desequilíbrio no estado de saúde geral, má higiene bucal, alimentação rica em

sacarose e outros dissacarídeos, levam ao crescimento excessivo destes micro-

organismos residentes, que por sua vez geram muitos metabólitos nocivos (ácidos:

aceticolático, succínico, fórmico, enzimas proteolíticas, endotoxinas) às celulase ao

próprio dente, causando à cavidade oral doenças infecciosas como: cáries,

periodontites, abscessos orofaríngeos, halitose, entre outras doenças.

A microbiota bucal tem relação direta com o meio ambiente onde o indivíduo

se encontra, e seu estabelecimento é dependente das exigências nutricionais e

físico-químicas dos micro-organismos (LUCAS; BEIGHTON; ROBERTS, 2000;

KONONEN et al., 2001).

Atualmente discutem-se várias estratégias para o controle da microbiota

bucal, visando à prevenção da cárie dental, dentre elas salienta-se a importância de

uma higiene correta, o uso de agentes antimicrobianos como a clorexidina e o flúor,

e principalmente, a prevenção da transmissão dos micro-organismos cariogênicos,

por meio de orientação e educação do núcleo familiar (NEWBRUN, 2002).

A gengivite, bem como a periodontite e a cárie são doenças infecciosas

causadas por bactérias que colonizam a superfície dos dentes, formando a placa

dental. Por este motivo a placa bacteriana é o fator etiológico primordial para o

desencadeamento do processo inflamatório e das cáries (JORGE, 1998;

KOLENBRANDER, 2000).

20

A placa bacteriana (Figura 1) é uma massa densa, não calcificada, constituída

por micro-organismos envolvidos numa matriz rica em polissacarídeos extracelulares

bacterianos e glicoproteínas salivares, firmemente aderida aos dentes, e outras

superfícies da cavidade bucal.

Figura 1: Placa bacteriana em dentes inferiores na região anterior e posterior.

Fonte: Navarro, Grázia e Michel (2007)

O tártaro é o resultado da mineralização da placa bacteriana ou biofilme

maduro. Após aproximadamente 21 dias, caso o biofilme bacteriano não seja

removido, há o estabelecimento de uma comunidade estável de bactérias. O cálculo

então forma-se a partir da mineralização da placa (Figura 2), com a participação da

saliva que contém íons de cálcio, e do dente, de onde a placa retira cálcio e fosfato

pela queda do pH.

Figura 2: Cálculo dental visto ao longo da linha da gengiva. Fonte: Rosing e Loesche (2011)

Segundo Leite et al. (2001), o termo biofilme é usado para denominar

comunidades de micro-organismos aderidas sobre uma superfície dentária e sob a

ação contínua de um fluxo salivar. É a etapa inicial no desenvolvimento da cárie,

assim como de infecções periodontais. A formação do biofilme ocorre através de um

processo ordenado e dinâmico onde há a necessidade da fixação e proliferação de

21

bactérias sobre as superfícies dos dentes. A aderência bacteriana ao dente

representa um dos primeiros mecanismos envolvidos na iniciação do

desenvolvimento do biofilme dental (CARVALHO et al., 2006).

Os biofilmes podem ser formados por uma única ou por diferentes espécies

de micro-organismos. No seu processo de formação, uma comunidade microbiana

de multiespécies, com um patógeno predominante, interage com o hospedeiro,

dividindo espaço e recursos disponíveis com outros organismos oportunistas (LEITE

et al., 2001).

O biofilme dental é composto por um grupo heterogêneo de micro-organismos

e tende a se estabilizar com o passar do tempo. Essa homeostase bacteriana resulta

em um processo dinâmico nas interações microbianas (MARSH, 1989) e a atividade

metabólica causa flutuações de pH até mesmo em condições de repouso. Tais

flutuações de pH causam alterações no fluído do biofilme ou placa dental, resultando

em um distúrbio no equilíbrio na interface dente e placa, levando a intermitente

perda e ganho de minerais na superfície dental (MANJI et al., 1991).

Feres et al. (2004) demonstram a relação entre o biofilme e os múltiplos

determinantes biológicos que influenciam na possibilidade de desenvolvimento da

lesão,entre estes, encontra-se a composição do próprio biofilme, composição e

capacidade de tampão da saliva, velocidade da secreção salivar, composição e

frequência da dieta. Além dos fatores determinantes, existem outros que variam de

população para população, nos quais incluem os fatores sócio-econômicos,

educacionais e comportamentais.

A remoção mecânica do biofilme é um fator importante na prevenção da cárie

e doença periodontal. O biofilme dental é essencial na patogênese da cárie dental e

constitui o maior fator etiológico na gengivite crônica (MICHELIN et al., 2005).

A fluoretação tem eficácia de até 60% na redução das cáries, o mecanismo

pelo qual o flúor confere maior resistência ao esmalte dentário ocorre na superfície

dessa estrutura, ao longo de toda a vida, através de sucessivos episódios de

desmineralização e remineralização superficial, desencadeados pela queda de pH

decorrentes da produção de ácidos a partir de carboidratos. A presença contínua, ao

longo de toda a vida do indivíduo, de pequenas quantidades de flúor no meio bucal

é, portanto, indispensável para que o efeito preventivo se manifeste, com a formação

de fluoreto de cálcio na etapa de remineralização.

22

2.2. Relação entre doenças periodontais e cardiopatias

As doenças cardiovasculares constituem a principal causa de morte em populações

do mundo ocidental, apesar da tendência de declínio de sua incidência e da

mortalidade relatada em diversos países, incluindo o Brasil.

No Brasil, aproximadamente 260 mil indivíduos morrem por doenças

cardiovasculares por ano, e grande parcela dessa mortalidade é devida a eventos

coronarianos agudos (SOUZA; CARVALHO; MARTINS, 2010). Os fatores de risco

para aterosclerose e, conseqüentemente, para a doença arterial coronariana são

classificados em modificáveis e não modificáveis Entre os principais fatores de risco

modificáveis, salienta-se a hiperlipidemia, hipertensão arterial sistêmica, tabagismo e

diabetes melitus. Idade, sexo e história familiar estão entre os principais fatores de

risco não-modificáveis associados à cardiopatia isquêmica (STEELE et al., 2004).

Endotoxinas liberadas pelos micro-organismos bucais e pelos tecidos em

resposta à inflamação podem induzir a agregação plaquetária, causar danos nas

células endoteliais, proliferação do músculo liso e formação de ateromas, que

obstruem progressivamente o diâmetro dos vasos. As doenças periodontais

passaram a ser associadas a cardiopatias pelos seguintes motivos:

� Já foi encontrado material genético de bactérias periodontais (como

Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia) em placas de ateroma.

� Acredita-se que na presença de infecção crônica na cavidade bucal, haja

liberação de produtos bacterianos na corrente circulatória, como é o caso das

endotoxinas, que estimulam o sistema imune a liberar uma série de citocinas

inflamatórias que poderão favorecer a formação de ateromas (ALMEIDA et

al., 2006).

� Em indivíduos com doença periodontal são encontrados níveis aumentados

de proteínas da fase aguda, como fibrinogênio e proteína C reativa (PCR),

que estão associadas a um aumento do risco para as doenças

cardiovasculares.

� Pode haver predisposição genética comum às duas patologias, pois alguns

pacientes apresentam uma resposta inflamatória aumentada na presença de

infecções.

� A periodontite já apresentou relação com a hiperlipidemia através da liberação

de citocinas inflamatórias, como IL-1 e TNF-α.

23

� Outra situação que pode provocar patologias cardíacas é através da

penetração na corrente circulatória de micro-organismos presentes na

cavidade bucal, o que pode provocar infecção em regiões distantes, como as

válvulas cardíacas, ocasionando a endocardite bacteriana (MICHELIN et al.,

2005).

Taylor et al. (2007) realizaram um estudo de intervenção em pacientes com

avançada periodontite que necessitavam extração completa das peças dentárias.

Doze semanas após a completa extração dentária observaram significativa redução

da proteína-C-reativa, inibidor do ativador do plasminogênio, contagem de plaquetas

e glóbulos brancos. Esse estudo demonstrou que a eliminação da periodontite

avançada, pela completa extração dentária reduz marcadores de risco inflamatórios

e trombóticos, suportando a hipótese de que o tratamento de doenças periodontais

pode reduzir o risco cardiovascular.

2.3. Cárie

A cárie dentária é uma doença multifatorial crônica, que progride lentamente na

maioria das pessoas. É considerada a doença mais comum entre as crianças,

representando um aspecto crítico das condições gerais de saúde além de influenciar

na qualidade de vida dos pacientes por causar dor e sofrimento (SOUZA FILHO;

CARVALHO; MARTINS, 2010). É definida como um processo de dissolução do

esmalte ou de dentina, causada pela ação bacteriana na superfície do dente,

mediado por um fluxo físico-químico de íons dissolvidos em água (FERES et al.,

2004).

A cárie é um grande problema de saúde pública devido aos altos custos do

tratamento e medidas preventivas para evitá-la (FEJERSHOV; KIDD, 2005). Ocorre

na presença de micro-organismos na superfície dental, contudo, a simples presença

destes, não é suficiente para o desenvolvimento da doença.

A flora bacteriana associada a lesões de cárie é muito complexa e altamente

diversificada entre diferentes lesões (BECKER et al., 2002; MARSH; NYVAD, 2003).

A frequente presença de carboidratos fermentáveis e a microbiota residente na

cavidade bucal são fatores importantes para o seu desenvolvimento devido à

fermentação dos carboidratos e produção de ácidos pelas bactérias do biofilme

presente sobre a estrutura dentária. A cárie possui uma etiologia multifatorial, ou

24

seja, é causada pela associação de três fatores primários causais: o hospedeiro, a

microbiota e a dieta juntamente com o fator secundário, o tempo (NEWBRUN, 2002).

A multiplicidade de variáveis que condiciona a existência ou não desta

doença, influi também no ritmo e velocidade de sua evolução. O desenvolvimento

econômico, as políticas públicas, o nível educacional da população, assim como

padrões de cultura e de tradição popular, entre outras, interferem na formação de

hábitos alimentares e nas condutas de higiene pessoal e coletiva, que podem

proporcionar a ocorrência de outras doenças (FADEL, 2009).

Nos países desenvolvidos tem ocorrido declínio na prevalência e severidade

da cárie, devido principalmente ao aumento da exposição ao flúor, modificações no

padrão e na quantidade do consumo de açúcar, maior acesso aos serviços

odontológicos e ampliação da educação em saúde bucal. Em contrapartida, em

países subdesenvolvidos observa-se o inverso, uma vez que a condição sócio-

econômica da população tem influência direta na prevalência da doença, havendo

além disso, necessidade de medidas sociais, e não apenas de mudanças dos

hábitos individuais (RIBEIRO; OLIVEIRA; ROSENBLATT, 2005). O flúor e o açúcar

são duas variáveis importantes que podem alterar positivo ou negativamente a

prevalência da cárie.

A cárie dentária é uma doença mediada por desmineralização dos dentes. Se

não for tratada, leva à cavitação, dor, desconforto e eventual perda de dentes

(DUAILIBE; GONCALVES; AHID, 2007).

A prevenção é a maneira mais econômica e eficaz de se evitar o aparecimento e

desenvolvimento dessas doenças. Dentro das várias atividades preventivas, a educação e a

motivação do indivíduo são medidas tomadas com o objetivo de mudar hábitos e

comportamentos, no sentido de promover a saúde e melhorar a higiene bucal do paciente.

A fluoretação das águas de abastecimento público é considerada o método de

prevenção de cáries mais efetivo em termos de abrangência coletiva. Além disso,

trata-se de uma medida simples, econômica, segura e eficaz. Graças a essa

medida, associada ao uso de dentifrícios fluoretados e aos programas preventivos

implantados nos municípios, o país experimenta uma redução da prevalência de

cárie (BARBEAU; NADEAU, 1997).

25

2.4 Streptococcus mutans

Apesar da grande diversidade de espécies de micro-organismos que colonizam a

cavidade bucal, os Streptococcus mutans, destacam-se como o agente etiológico da

cárie em humanos e animais, não sendo, porém, os únicos micro-organismos

envolvidos no processo cariogênico (LUCAS; BEIGHTON; ROBERTS, 2000). Foram

descritos pela primeira vez em 1924, quando Clarke isolou micro-organismos de

lesões de cárie de dentes humanos e os denominou de Streptococcus mutans

devido à morfologia mais ovalada das colônias, aparentando ser uma forma mutante

de estreptococos. A partir de 1956, esses micro-organismos foram "redescobertos" e

demonstraram ser capazes de causar cárie dental em roedores.

São cocos gram positivos, anaeróbios facultativos, catalase negativa,

microaerófilos, acidogênicos, e capazes de formar polissacarídeos extracelulares. A

maioria das cepas é alfa-hemolítico, mas ocasionalmente cepas beta-hemolíticas

são encontradas.

A caracterização preliminar dos estreptococos pode ser realizada através da

determinação da hemólise (KONEMAN et al., 2001). Ao contrário de muitos outros

estreptococos orais que fermentam apenas pequena quantidade de carboidratos, o

grupo do S. mutans fermenta diversos açúcares. Em particular, sua capacidade de

fermentar o manitol e o sorbitol, permite diferenciá-los dos demais estreptococos

orais (SIMÕES; ARAÚJO; ARAÚJO, 2008).

A situação taxonômica dos estreptococos cariogênicos está bem definida no

“Estreptococos do Grupo Mutans” (EGM). Existem sete espécies que estão incluídas

no EGM: S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus, S. ferus, S. macacae, S.

downei. Das espécies citadas, o S. mutans e S. sobrinus apresentam potencial

cariogênico em humanos. As outras espécies são encontradas em animais e, se

estão presentes em humanos, não parecem ser altamente cariogênicas (EMILSON,

1983).

O primeiro habitat de S. mutans é a superfície dentária, podendo ser

encontrado também nas fezes (MECA et al., 2009). É cariogênico em modelos

experimentais de ratos, hamsters e macacos, estando associado com a cárie dental

em humanos (SÁNCHEZ; SÁENZ, 2001).

O meio de cultura mais frequente utilizado para o isolamento primário de

S.mutans é o ágar mitis salivarius (AMS) com adição de sacarose e bacitracina

26

(GOLD; JORDAN; HOUTE, 1973), formam colônias pequenas, com bordas

irregulares, fortemente aderidas ao meio. Com adição de sacarose ao ágar, muitas

linhagens de S. mutans produzem colônias cerca de 1 mm de diâmetro, Figura 3.

A B

Figura 3: Macro e Micromorfologia de Colônias de Streptococcus mutans. Legenda: Micromorfologia (A) característica de S. mutans, coloração de gram. Características macro (B) das colônias em ágar

mitis salivarius, com adição de sacarose e bacitracina. Fonte: Vasconcelos et al. (2006)

Meca et al. (2009) evidenciou altas concentrações do EGM em áreas de cárie

incipiente de esmalte, quando comparadas com áreas adjacentes saudáveis.

Estudos microbiológicos demonstram que o S. mutans é um dos fatores

necessários para o início e a progressão da lesão cariosa em crianças, logo após a

erupção dos primeiros dentes decíduos. S. mutans é amplamente distribuído, não

apenas em populações de moderada ou alta incidência de cárie, como também em

populações que não apresentam ou têm baixo índice da doença, mostrando que a

simples colonização por estes micro-organismos não implica no desenvolvimento de

cárie (DUAILIBE; GONCALVES; AHID, 2007).

Durante seu processo evolutivo, S. mutans desenvolveu fatores que

determinam sua cariogenicidade ou virulência, como o sistema enzimático para o

metabolismo da sacarose, substância mais cariogênica consumida pelos seres

humanos.

2.5. Fluxo e processamento de instrumentos odontológicos

A prática da odontologia abrange inúmeros procedimentos, e durante esta prática,

agentes infecciosos podem ser transmitidos aos pacientes e profissionais por

27

diferentes vias: contato direto com lesões infecciosas, sangue e saliva contaminada;

contato indireto, mediante transferência de micro-organismos presentes em objetos

contaminados; respingos de sangue, saliva e/ou secreções nasofaríngeas,

diretamente em feridas de pele e mucosa; e principalmente, pela transferência de

micro-organismos por aerossóis (BRASIL, 2000).

Apesar de grande parte das infecções relacionadas à assistência a saúde

serem causadas por micro-organismos da microbiota do próprio indivíduo, as

infecções de origens exógenas merecem à atenção dos profissionais de saúde. O

descumprimento de boas práticas de prevenção e controle de infecção são os

principais responsáveis pelas iatrogenias infecciosas (GRAZIANO; GRAZIANO,

2000).

Os riscos biológicos estão representados pelos micro-organismos e podem

afetar pacientes e/ou profissionais de saúde. Porém, muitas vezes nem mesmo o

paciente está ciente desta condição ou às vezes é um portador crônico, ou ainda

está em período de incubação da doença. Sendo assim todo material proveniente de

serviço de saúde que entrou em contato com sangue ou invadiu tecidos subepiteliais

é considerado de risco biológico, portanto, infectante (BLOCK, 2001).

Muitos dos instrumentos utilizados na prática diária dos dentistas são de aço

inoxidável, estando constantemente expostos à contaminação durante os

procedimentos clínicos.

O processamento de artigos compreende a limpeza e a desinfecção e/ou

esterilização, esses processos devem seguir o fluxo descrito na Figura 4 abaixo, de

modo a evitar o cruzamento de artigos não processados (sujos) com artigos

desinfetados ou esterilizados (limpos).

28

Instrumento Contaminado

↓

Exposição agente de limpeza

↓

Enxague

↓

Secagem

↓

Inspeção visual

↓

Preparo e embalagem

↓

Desinfecção/Esterilização

↓

Armazenamento

Figura 4: Fluxo para os processos de limpeza e desinfecção de artigos contaminados.

O cuidado com instrumentais odontológicos é relatado por Brasil (2000) que

preconiza a esterilização, como melhor conduta para o controle de infecção de

instrumentais metálicos, embora seja necessária a realização de um correto

processamento do instrumental contaminado antes da esterilização, visando

redução de sujidades e resíduos orgânicos, e subsequente diminuição do risco de

infecção ocupacional.

29

2.5.1. Limpeza

A limpeza é a remoção mecânica de sujidades, com o objetivo de reduzir a carga

microbiana, a matéria orgânica e os contaminantes de natureza inorgânica, de modo

a garantir o processo de desinfecção e esterilização e a manutenção da vida útil do

artigo. Estudos têm demonstrado que a limpeza reduz aproximadamente 105 UFC

do conteúdo microbiano presente nos artigos e superfícies (RUTULA, 1996).

A limpeza deve ser realizada imediatamente após o uso do instrumento.

Pode-se fazer a imersão em solução aquosa de detergente com pH neutro ou

enzimático, usando uma cuba plástica, mantendo os instrumentos totalmente

imersos para assegurar a limpeza adequada.

O preparo da solução e o tempo de permanência do material imerso devem

seguir as orientações recomendadas pelo fabricante.

A limpeza pode ser manual, por meio de ação física aplicada sobre a

superfície do instrumento, usando:

a) Escova de cerdas macias e cabo longo;

b) Escova de aço para brocas;

c) Escova para limpeza de lúmen;

d) Pia com cuba profunda específica para este fim e preferentemente com

torneira com jato direcionável;

e) Detergente e água corrente.

Ou pode ser limpeza mecânica, quando o procedimento é automatizado para

a remoção de sujidade por meio de lavadoras com jatos de água ou lavadoras com

ultrassom de baixa frequência, que operam em diferentes condições de temperatura

e tempo. Esse tipo de limpeza diminui a exposição dos profissionais aos riscos

ocupacionais de origem biológica, especialmente, aos vírus da hepatite e HIV

(BRASIL, 2000).

2.5.2. Enxague

Deve ser realizado em água potável e corrente, garantindo a total retirada das

sujidades e do produto utilizado na limpeza. A qualidade da água tem relação com a

durabilidade do instrumental, sendo recomendado que o último enxague seja feito

30

com água livre de metais pesados. Os artigos que contêm lúmen devem ser

enxaguados com bicos de água sob pressão (BRASIL, 1999).

2.5.3. Inspeção visual

Serve para verificar a eficácia do processo de limpeza e as condições de integridade

do instrumento. Se necessário, deve-se proceder novamente à limpeza ou à

substituição deste (FERREIRA et al., 2001).

2.5.4. Secagem

Deve ser criteriosa para evitar que a umidade interfira nos processos e para diminuir

a possibilidade de corrosão dos artigos. Pode ser realizada com a utilização de pano

limpo e seco, exclusivo para esta finalidade, secadora de ar quente/frio, estufa

regulada para este fim e/ou ar comprimido medicinal (GANDINI et al., 1997).

2.5.5. Desinfecção

A desinfecção é definida como um processo físico ou químico que elimina a maioria

dos micro-organismos patogênicos de objetos inanimados e superfícies, com

exceção de esporos bacterianos.

Block (2001), classifica a desinfecção como sendo de baixo, médio e alto

nível. Existem diversos produtos para desinfecção que devem possuir registro junto

ao Ministério da Saúde e necessitam ser avaliados com relação ao custo benefício,

a eficácia e ao artigo a ser processado, vide Tabela 1 a seguir.

31

Tabela 1: Principais desinfetantes químicos e esterilizantes utilizados em artigos odontológicos.

Desinfetante Características Indicações Desvantagens

Álcool 70% (etíllico

e isopropílico

Ação rápida, fácil

aplicação, viável

para artigos

metálicos

Desinfecção de nível

médio de artigos e

superfícies

Inflamável, resseca

plástico e opacifica

artigos acrílicos

Cloros e Composto

Cloratos

Em forma líquida ou

sólida; ação rápida e

baixo custo

Desinfecção de nível

médio de artigos e

superfícies e

descontaminação de

superfícies

É corrosivo para

artigos e superfícies

metálicas; irrita

mucosas; odor forte

Glutaraldeído Não danifica

instrumentais,

plásticos; atividade

germicida em

presença de matéria

Esterilização e

desinfecção de alto

nível

Irritante para

mucosas e pele

(olhos, nariz,

garganta, etc.)

Plasma de Peróxido

de Hidrogênio

É realizada através

de equipamento

automatizado e

computadorizado

Esterilização de

artigos sensíveis ao

calor e a umidade

Alto custo do

equipamento

Ácido Peracético Não forma resíduos

tóxicos

Formulações

associadas a

peróxido de

hidrogênio

Instável após a

diluição

Óxido de Etileno Processo de

esterilização

combinado ao calor

úmido da autoclave

Esterilização de

artigos

termossensíveis

Tóxico para pele e

mucosas

Fonte: Brasil (1999)

A realização de desinfecção química dos instrumentos metálicos é

notadamente eficiente como medida de segurança no contágio de doenças

infecciosas na área da saúde.

A efetividade dos procedimentos de desinfecção de instrumentais, visando

diminuição de agentes contaminantes oriundos principalmente de saliva e sangue,

está relacionada com uma adequada seleção do agente químico. Para tanto, o

produto químico escolhido deve realizar, efetivamente, a função de desinfecção,

32

sem alterar a superfície do material, não apresentando inclusive toxidade para o

manipulador.

2.5.6. Esterilização

A esterilização consiste na eliminação ou destruição, completa de todos os tipos de

micro-organismos, estando eles na forma vegetativa ou esporulada (CENTERS FOR

DISEASE CONTROL, 1993). Para garantir a esterilização, é fundamental que os

passos já citados do processamento de instrumentos sejam seguidos corretamente

(BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000).A esterilização pode ocorrer pelos

seguintes métodos:

� Métodos Físicos: Calor úmido e seco;

� Filtração;

� Radiação: Ionizante e Não – Ionizante;

� Métodos químicos: Compostos fenólicos, alcoóis, óxido de etileno,

halogênios, peróxido de hidrogênio, etc.

Na odontologia, os processos de esterilização indicados são:

� a) Físicos: utilizando-se o vapor saturado sob pressão (autoclave);

� b) Químicos: utilizando-se soluções de glutaraldeído a 2% e de ácido

peracético a 0,2%.

A esterilização química deve ser utilizada em instrumentais que não

apresentam resistência com relação à variação de temperatura, ou seja, apenas

quando não houver outro método que a substitua (BRASIL, 1994).

2.5.6.1. Processo físico

Realizado em autoclave, onde os micro-organismos são destruídos pela ação

combinada da temperatura e pressão, que promove a desnaturação das proteínas

da estrutura genética celular.

Os padrões de tempo, temperatura e pressão para esterilização pelo vapor

variam de acordo com o aparelho e encontram-se dentro de: 121° C a 127° C (1 atm

de pressão) por 15 a 30 minutos e 132°C a 134°C (2 atm de pressão) por quatro a

sete minutos de esterilização.

33

Atualmente, a esterilização em estufas (calor seco) é recomendada por

instituições nacionais e internacionais apenas para óleos e pós na área médica e

para alguns tipos de brocas e alicates ortodônticos na odontologia (CENTERS FOR

DISEASE CONTROL, 2003). Estas indicações se justificam pelo fato do processo

exigir longo período de tempo e altas temperaturas, podendo ocorrer falhas no

processo de esterilização. Os equipamentos utilizados atualmente nos serviços

odontológicos não são automatizados, não permitem registros confiáveis dos

parâmetros físicos do processo, são susceptíveis a interrupção do processo e o

monitoramento biológico é complexo.

Lima et al. (1990), analisando seis estufas nacionais, verificaram que as

temperaturas indicadas pelo termômetro das mesmas não eram reais, sendo sempre

superiores a demonstrada no interior da estufa. Além disso, relataram que o tempo

de aquecimento da estufa até atingir a temperatura máxima, variava em torno de 30

a 40 minutos.

A esterilização pode não ser um processo eficiente, principalmente por

envolver erro operacional. Dos processos comuns (óxido de etileno, glutaraldeído,

formaldeído, ácido peracético e plasma de peróxido de hidrogênio), mais da metade

exige emprego de funcionários preparados e treinados, acarretando alto custo de

operação e risco de falha humana.

A autoclave convencional, à base de vapor d'água, utiliza a alta temperatura e

pressão como formas de esterilização. Além de consumir muita energia elétrica

apresenta riscos, pois sua alta pressão de operação pode acarretar explosões

(LINGER et al., 2001).

2.5.6.2. Armazenamento dos instrumentos esterilizados

O instrumental deve ser armazenado em local exclusivo, separado dos demais, em

armários fechados, protegido de poeira, umidade e insetos, e deve haver uma

distância mínima de 20 cm do chão, 50 cm do teto e 5 cm da parede, respeitando-se

o prazo de validade da esterilização (SOCIEDADE BRASILEIRA DE

ENFERMEIROS DE CENTRO CIRÚRGICO, 2001).

34

2.5.6.3. Monitoramento da esterilização

O processo de esterilização deve ser comprovado por meio de monitoramento físico,

químico e biológico. O monitoramento biológico deve ser registrado, juntamente com

a data da esterilização, lote, validade e equipamento utilizado (FERREIRA et al.,

2001).

2.6. Ozônio

Durante os últimos anos, o ozônio tem sido apresentado como um agente

antibacteriano alternativo. Tem sido reconhecido como um forte e eficaz atuador

biocida (SHARMA; HUDSON, 2008). A maioria dos artigos publicados considerando

o uso de ozônio em odontologia tem sido em relação a seus efeitos antimicrobianos

(BAYSAN; LYNCH, WHILEY, 2000; NAGAYOSHI et al., 2004; POLYDOROU; PELZ;

HAHN, 2006) e cárie (BAYSAN; BEIGHTON, 2007; BAYSON; LYNCH, 2006).

O tratamento com ozônio poderia reduzir drasticamente o número total de

micro-organismos e reverter à maior parte de lesões da raiz cariada. Polydorou et al.

(2011), mostrou que o tratamento com ozônio resultou em redução significativa da

quantidade de S. mutans em cavidades de cárie em relação ao grupo controle.

O efeito antimicrobiano do ozônio pode ocorrer através de um mecanismo que

envolve a ruptura das membranas dos micro-organismos (BOCCI et al., 1998;

YAMAYOSHI; TATSUMI, 1993)

É provável que o ozônio interfira no metabolismo celular da bactéria, através

da inibição e bloqueio do funcionamento enzimático. Uma quantidade suficiente de

ozônio pode romper a membrana celular, e isto leva à destruição da bactéria.

Lezcano et al. (1999), afirma que não só a concentração na aplicação de ozônio,

mas também a dose utilizada, desempenham um papel importante em seu efeito

antibacteriano.

Este gás é encontrado de forma natural nas camadas superiores da

atmosfera, que fica aproximadamente entre 25 e 35 km de altura, com importante

papel de absorver a radiação ultravioleta dos raios solares, extremamente

prejudiciais ao homem (GARDUÑO GARDUÑO et al., 1995). O ozônio pode ser

produzido por geradores específicos, sendo que o método de produção é realizado

através da associação de um átomo de oxigênio com uma molécula de oxigênio

35

(O2), expressa por O + O2, o ozônio (O3), Figura 5. Esta molécula instável pode ser

gerada pela passagem de uma descarga elétrica através do oxigênio puro (BRADY;

HUMISTON, 1996; KIRCHHOFF, 2002).

Figura 5: Representação da formação do ozônio por descarga elétrica. Fonte: Kim, Yousef e Chism (1999)

O ozônio é um gás produzido naturalmente na atmosfera terrestre, reativo e

capaz de oxidar metais como ferro, chumbo e arsênio, após várias pesquisas

concluíram-se que o ozônio tem um papel ainda mais importante, utilizando-o como

um eficaz desinfetante durante epidemias infecciosas (INSTITUTO NACIONAL DE

PESQUISAS ESPACIAIS, 2006). Suamolécula contém três átomos de oxigênio

(Figura 6).

Figura 6: Estrutura molecular do ozônio.

Fonte: Rakovsky, Anachkov e Zaikov (2009)

Atribui-se a descoberta do ozônio, ao químico Christian Friedrich Schonbein

que em meados do século XIX, observou que após descargas elétricas na atmosfera

havia um odor, “notado também quando a água era decomposta por uma corrente

36

voltaica”. Schonbein acreditou que esse odor poderia ser atribuído à existência de

um gás atmosférico de odor peculiar (SHELDON; BROWN, 1996).

Cardoso (2006), dentre os processos utilizados para a geração de ozônio,

relata:

[...] o método de descarga dielétrica por efeito corona, vêm

sendo atualmente utilizado em praticamente todos os

ozonizadores disponíveis industrialmente (Figura 7). Através

deste método, o ozônio é gerado pela passagem de oxigênio

puro entre dois eletrodos, a uma elevada diferença de potencial

elétrico, causando dissociação de oxigênio, sendo a formação

do ozônio consequência da recombinação de espécies radicais

de oxigênio com moléculas de oxigênio presentes no sistema.

A concentração do ozônio vai depender da composição do gás

empregado na produção (O2 ou ar), frequência, fluxo de

distribuição do sistema e voltagem aplicada nos eletrodos.

Figura 7: Representação do reator para a geração de ozônio pelo método de descarga elétrica. Fonte: Cardoso (2006)

A taxa de solubilização do ozônio em meio líquido, depende do tamanho das

bolhas do gás que borbulham na água, pois quanto menores as bolhas formadas,

maior a superfície de contato, favorecendo desta forma a probabilidade de

transferência do gás para a água. O tamanho mais adequado deve variar entre 1 e

3mm de diâmetro.

A estabilidade do ozônio em água aumenta com a acidificação e redução de

temperatura, demonstrado na Tabela 2.

37

Tabela 2: Relação da temperatura e da solubilidade do ozônio em água.

Fonte: Rice, 2006

O ozônio é cerca de 50% mais denso que o oxigênio, apresenta-se como um

gás incolor, tem massa molecular igual a 48, liquefaz-se a -112°C, possui ponto de

congelamento de -251,4°C, e sua decomposição ocorre rapidamente, pode

apresentar característica de reação explosiva em temperaturas acima de 100°C

(BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000).

Velano et al. (2001); Haas; Kaymak (2003), relatavam que a ação

antimicrobiana do ozônio depende da relação de sobrevivência do micro-organismo

com o tempo de exposição a este gás, intimamente associado à concentração inicial

de micro-organismos e a concentração do ozônio, e também da velocidade de

dissipação destes expostos a água ozonizada.

Os primeiros usos do ozônio, como agente sanitizante na indústria alimentícia,

são registrados na literatura desde o início do século 20, sendo utilizado na

preservação de alimentos e ingredientes no continente europeu (KIM; YOUSEF;

CHISM, 1999). Comercialmente, foi utilizado pela primeira vez em 1907, em Nice

(França), no tratamento de água potável do município e, em 1910, em Saint

Petesburg (Rússia) (NASCIMENTO; LIMA; VALLE, 2005).

O ozônio tem sido utilizado como uma alternativa de baixo custo, confiável,

prático e com poucos efeitos colaterais no tratamento de várias doenças em

humanos e animais, desde que obedeça a dosagem correta para o objetivo

específico, ressalta-se também a sua aplicação na descontaminação bacteriana,

fúngica e viral de fluidos, objetos, alimentos e ambientes.

Temperatura (ºC) Solubilidade (litros ozônio/litros água)

0 0,640

15 0,456

27 0,270

40 0,112

60 0,000

38

Na Odontologia, o ozônio pode ser empregado em processos de esterilização

de instrumentais e purificação do sistema de irrigação do equipo, servindo como

uma ótima estratégia no controle e prevenção de infecções cruzadas no ambiente

odontológico e no tratamento de diversas doenças orais, obtendo resultados

superiores em comparação às terapias convencionais (SALVADOR et al., 2006).

De acordo com Greene et al. (1993), o ozônio é efetivo na destruição de

bactérias e vírus, em pH variando de 5,6 a 9,8. Segundo o mesmo autor, quando

comparada à cloração, a ozonização possui custo baixo, não requer calor e não

deixam resíduos como os clorados.

O ozônio ataca primeiro a membrana bacteriana pelos glicolipídeos ou

aminoácidos como o triptofano e atua também nos grupos sulfidrilas de certas

enzimas. A morte bacteriana é rápida e é frequentemente atribuída a mudanças na

permeabilidade celular seguida pela lise celular, o que basicamente diferencia o

ozônio de outros agentes desinfetantes é seu mecanismo de destruição dos micro-

organismos (BOCCI, 2000).

O cloro, especificamente, atua por difusão através da parede celular, agindo

sobre os elementos vitais localizados no interior da célula, como enzimas, proteínas,

DNA e RNA. O ozônio, por apresentar uma capacidade de oxidação superior, age

diretamente na parede da célula, causando sua ruptura e morte em menor tempo de

contato, inviabilizando a recuperação dos micro-organismos após o ataque (Figura

8). Com isso, dependendo do tipo de micro-organismo, o ozônio pode agir até 3.125

vezes mais rápido do que o cloro na inativação celular.

A diminuição do crescimento de organismos na água ozonizada se deve

também ao aumento do oxigênio nela dissolvido e disponível. Sua alta capacidade

de remoção de compostos orgânicos através da parcial oxidação é um atributo

importante na atuação bactericida (GUIRQUIS; PROBER; SLOUGH, 1978).

39

Figura 8: Mecanismo de ação do ozônio nos microrganismos: 1) Bactéria; 2) Parede celular em contato com ozônio; 3) Oxidação da parede celular da bactéria; 4), 5) e 6) Ruptura e destruição

da bactéria. Fonte: Snatural & Naturaltec (2013)

De acordo com Korol et al. (1995), a destruição microbiana se reduz quando

tanto as formas vegetativas quanto os esporos estão acompanhados de substâncias

orgânicas que atuariam como protetoras, não só para limitar a penetração do

desinfetante, mas também no caso do ozônio, porque os radicais livres formados por

este elemento reagem com as substâncias mencionadas antes de alcançar os

micro-organismos.

Embora estudos demonstrem que o consumo de alimentos tratados com

ozônio não causa qualquer efeito tóxico à saúde humana e de animais, é importante

que haja o monitoramento e proteção das pessoas que trabalham na manipulação

dessa substância na indústria e em outras atividades. Por ser volátil, o gás ozônio

pode afetar o sistema respiratório e causar sintomas de toxidade, como cefaléia,

tontura, sensação de queimação na região dos olhos, irritação da garganta e tosse.

Em baixas concentrações, o ozônio não provoca sinais de toxicidade, mas em altas

concentrações pode ser fatal aos humanos (BOOT, 1991).

O processo de esterilização por ozônio consiste em encaminhar oxigênio

concentrado para geradores de ozônio sob condições controladas. O ozônio gerado

passa por reatores, sendo em seguida encaminhado para uma câmara de

esterilização. Após o preenchimento da câmara até determinada pressão, o ozônio é

retirado e destruído. Após determinado número de ciclos, o material colocado na

câmara de esterilização estará esterilizado (KIM; YOUSEF; CHISM, 1999).

40

2.7. Ultrassom

Nos últimos anos vem aumentando a utilização do ultrassom em reações orgânicas.

Isto ocorre devido às vantagens que essa ferramenta proporciona como a redução

do tempo de reação, do consumo de energia, na quantidade de solventes e aumento

do rendimento das reações.

O ultrassom tem uma frequência característica num intervalo acima de 20

kHz, sendo que a sensibilidade do ouvido está na faixa de 10 Hz a 18 KHz (Figura

9). O que torna o ultrassom uma ferramenta tão poderosa é o fenômeno físico da

cavitação, baseado no processo de criar, aumentar e implodir cavidades de vapor e

gases.

Figura 9: Regiões de freqüência do som.

Fonte: Cravotto; Cintas (2006)

O limite superior da frequência de ultrassons é de 5 MHz para gases e 500

MHz para líquidos e sólidos. A sua aplicação é dividida em duas áreas: alta

frequência e baixa intensidade (2-10 MHz), aplicada em diagnóstico médico e

análise química, e baixa frequência e alta intensidade (20-100 kHz), normalmente

usada para limpeza, soldadura e sonoquímica (NASCIMENTO; LIMA; VALLE, 2005).

Os equipamentos de ultrassom são fabricados pelo acoplamento de um ou

mais cristais piezelétricos na parte inferior de um reservatório metálico para líquido,

preferencialmente construído em aço inoxidável.

Conforme Williams (1990) é vasta as aplicações de ondas de ultrassom, que

vão desde homogeneização de substâncias, rompimento de células, extração de

produtos fitoquímicos, esterilização de equipamentos, localização de mineral,

emulsificação, até degradação de massa molar e fonoforese (ação do ultrassom

para facilitar a penetração de agentes farmacologicamente ativos através da pele).

41

Experiências realizadas por Scherba, Weigel e Brien (1991), mostraram a

eficiência da ação germicida da energia ultrassônica, a uma freqüência de 26000 Hz

aplicada em suspensões aquosas de bactérias.

Os efeitos químicos e mecânicos de ultrassom são causada por bolhas de

cavitação que são gerados durante a pressão e descompressão durante a

propagação das ondas sonoras.

Segundo Guirro (1999), a cavitação gerada pelo US pode induzir fenômenos

elétricos, químicos e cisalhamento mecânico. Isto acontece quando neste último as

cavidades se colapsam ou quando as bolhas de gás crescem, até ficarem

suficientemente grandes para vibrar em ressonância com as ondas sonoras e

romperem-se. A cavitação produz intensas ondas de choque, aumentos

instantâneos de temperatura e pressão, e efeitos químicos no meio, que são

gerados pelo colapso das cavidades ou microbolhas.

A cavitação é a formação de cavidades ou bolhas no meio líquido contendo

quantidades variáveis de gás, vapor ou ambos, conforme mostra a Figura 10

(BELLO, 2003).

Outro fenômeno citado por Korn, Pereira e Borges (2005), é que no colapso

das bolhas há liberação de energia que pode romper as ligações moleculares

provocando a produção de radicais livres H e OH altamente reativos e, como

conseqüência, causar mudanças químicas.

Figura 10: Cavitação acústica.

Fonte: Korn, Pereira e Borges (2005)

Os equipamentos de limpeza ultrassônica convertem ondas sonoras de ultra e

alta frequência em vibrações mecânicas que se propagam na água criando bolhas

microscópicas, representados na Figura 11 (AMMI, 2010).

42

Figura 11: Ondas ultras-sônicas e processo de cavitação. Fonte: Martines, Davolos e Jafelicci Júnior (2000)

A temperatura no interior e na zona de cavitação poderá ser superior a

5000ºC e a 2000ºC respectivamente (SUSLICK; GRINSTAFF, 1990; SUSLICK,

1990).

43

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Sujeitos da pesquisa

A amostra deste estudo foi constituída por 20 voluntários com idade entre 18 e 35

anos, de ambos os sexos. Os indivíduos em tratamento odontológico foram

selecionados por um professor, diretor de uma Clínica Odontológica, e responsável

pela disciplina de dentística no curso de odontologia em uma instituição de ensino

na cidade de São Paulo.

Foram incluídos neste estudo, clientes que possuíam cárie no dente molar

inferior, por serem os dentes mais frequentemente atingidos pela cárie.

Foram excluídos clientes em uso de antibioticoterapia e que usavam aparelho

ortodôntico, e ainda aqueles que não possuíam cárie neste dente específico, e

também os que possuíam cárie, porém não concordaram em participar da pesquisa.

Todos os indivíduos da pesquisa assinaram o Termo de Consentimento Livre

e Esclarecido (Anexo A), seguindo determinação do Comitê de Ética e Pesquisa

(Anexo B).

3.2. Meios de cultura

Os micro-organismos foram isolados nos meios de culturas demonstrados na

relação abaixo:

� Caldo BHI (Infusão de Cérebro e Coração) (Newprov):

BHI pó 37 g

Água Destilada 1000 mL

Pesado e hidratado o meio conforme instruções do fabricante; distribuído 3,0

mL em tubos com tampa de rosca; esterilizado em autoclave; retirado os tubos da

autoclave e deixado esfriar em temperatura ambiente (BRASIL, 2004).

� Ágar Mitis Salivarius Sacarosado com Bacitracina (AMSB) (DIFCO):

Ágar Mitis Salivarius 45 g

Sacarose 15 g

Água Destilada 500 mL

Bacitracina (sol. Estoque 50.000 µg/mL) 0,30 mL

44

Foi preparado de acordo com o descrito por Gold, Jordan e Houter (1973). A

formulação comercialmente disponível: Bacto Agar Mitis Salivarius (Difco

Laboratories) foi suplementada com 15 % de sacarose (Microbiologie Merk) e 0,2

unidades de Bacitracina (Calbiochem Novabiochem Corporation) por mL de solução.

As placas Petri foram seladas e estocadas sob refrigeração por no máximo seis dias

até sua utilização (OPLUSTIL et al., 2010).

� Ágar Sangue:

Peptona bacteriológica 10 g/L

Extrato nutritivo 10 g/L

Cloreto de sódio 5 g/L

Ágar 15 g/L

Sangue de carneiro desfibrinado 5 mL

Pesado e hidratado o meio conforme instruções do fabricante; esterilizado em

autoclave; esfriado a base a aproximadamente 50ºC; adicionado 5 mL de sangue

desfibrinado de carneiro para cada 100 mL de base; homogeneizado delicadamente

para não formar bolhas; distribuído em placas de Petri de 90 mm de diâmetro

(BRASIL, 2004).

3.3. Obtenção da amostra

As amostras foram colhidas pelo dentista e professor, devidamente paramentado,

roupa e sapato branco, guarda-pó, gorro, máscara, e luva estéril.

As coletas foram realizadas no período da manhã, no dente com cárie, com o

instrumento estéril, uma cureta dentística, cabo sextavado, no 5, autoclavada em

vapor saturado sob pressão a 127ºC, em embalagem grau cirúrgico, com validade

de sete dias conforme protocolo de esterilização, representada na Figura 12.

A amostra do material da cárie foi colhida por raspagem de cima para baixo,

sem ocasionar vai e vem e fricção.

Após a colheita, o instrumental, agora contaminado, foi encaminhado ao

laboratório de Biologia Molecular em recipiente estéril e fechado em condições

assépticas. Este trajeto (clínica de odontologia ao laboratório) não ultrapassou 5

minutos.

45

Figura 12: Cureta Dentística.

As amostras do instrumental foram raspadas por um swab estéril umedecido

e este foi imerso no caldo BHI em tubo de ensaio, o qual foi acondicionado em

estufa a 37ºC, por 48 h, Figura 13.

Após a turvação do meio BHI, semeou-se a solução em placa de Petri,

contendo AMSB, e acondicionados em estufa a 37ºC, por 24 e 48 h.

Figura 13: Meio de Cultura BHI no frasco de vidro identificado como positivo, com crescimento

bacteriano, turvação do meio e negativo, sem contaminação bacteriana.

3.4. Preparo das cuspensões dos micro-organismos

Após crescimento dos micro-organismos na placa de Petri contendo o meio AMSB,

foram preparadas suspensões das colônias do meio, em tubos com 2 mL de solução

fisiológica esterilizada (NaCl 0,9%), baseando-se na escala nefelométrica de Mac

Farland (18 milhões de bactérias por mL de meio), que consiste em uma série de 11

tubos numerados de 0,5 a 10, com diferentes quantidades de cloreto de bário e

ácido sulfúrico para se obter diferentes concentrações de sulfato de bário, que

46

correspondem a diferentes contagens bacteriana (LENNETTE et al., 1985). A

referência de equivalência para a contaminação das curetas foi o tubo número 1,

que equivale a 3 x 108 de bactérias por mL de meio, mostrado na figura 14.

Figura 14: Frasco de vidro contendo SF0,9% com colônias e tubo numerado (1) da escala MacFarland.

Fonte: Lennette et al. (1985)

3.5. Contaminação dos instrumentais

Preparado a suspensão de micro-organismos, referenciado pela escala

nefelométrica de Mac Farland, realizou-se a contaminação dos instrumentos

odontológicos, na suspensão por 30 s, e aguardou-se 30 minutos em ambiente

asséptico, com o bico de Bunsen aceso, para a formação do biofilme no

instrumental, Figura 15.

Figura 15: Bico de Bunsen aceso e instrumentais com os seus respectivosbéquers,

durante a contaminação dos instrumentos.

47

3.6. Tratamento com ultrassom

O aparelho de ultrassom utilizado foi o da marca COLE-PARMER, do modelo 8891E

DTH com frequência de 40KHz, com capacidade total de 2 L de água, e potência

acústica a partir dos dois cristais piezelétricos de 100 W.

O instrumental contaminado foi imerso em béquer de vidro de 200 mL de

capacidade total. No béquer, em condições assépticas foram adicionados 150 mL de

água esterilizada, usou-se uma tela em aço de 10 cm x 10 cm de tamanho, com

orifício central de 2 mm para a introdução da cureta, com a finalidade de suporte do

instrumental.

O instrumental foi imerso no béquer, mantendo uma distância de 0,5 cm

entre a base do béquer e a extremidade da cureta.

O béquer esterilizado por sua vez, através de um suporte, confeccionado para

este fim, conforme Figura 16, foi introduzido na cuba do aparelho de ultrassom,

posicionando em duas distâncias, uma de 0,5 e outra de 4 cm entre a base do

Becker e o fundo do reservatório do equipamento de ultrassom, respectivamente.

Para evitar o acúmulo de calor com o respectivo aumento de temperatura do

equipamento de ultrassom, foi adotado um sistema hidrodinâmico com entrada e

saída de água.

Figura 16: Representação esquemática do tratamento realizado na cureta contaminada com Streptococcus mutans, com aparelho de ultrassom. Fonte: Esquematizado por Prof. Dr. Carlos José de Lima

48

O teste de desinfecção usado pelo ultrassom foi realizado nos seguintes

tempos: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. As dosagens do ultrassom foram

definidas pela potência acústica (W) versus o tempo de atuação do aparelho (s), o

que resulta as dosagens acústicas de 6 kJ, 30 kJ, 60 kJ, 90 kJ, 120 kJ, 150 kJ, e

180 kJ respectivamente.

3.6.1. Semeadura

Após a sonicação, o material remanescente foi removido com auxílio de um swab

estéril, umedecido e em seguida semeado no meio de cultura AMSB em placa de

Petri.

As placas foram identificadas (Figura 17) com o tempo de exposição ao US e

a data do respectivo teste, e acondicionados em estufa para posterior leitura

microbiológica de 24 e 48 horas.

A B

Figura 17: A. Béquers e placas de Petri contendo o meio AMSB, e curetas embaladas em papel crepado. B. Béquers e curetas contaminadas com as respectivas placas de Petri.

O grupo controle positivo foi definido pela raspagem do material de uma

cureta contaminada, sem passar por tratamento, e o grupo controle negativo,

realizou-se o swab de uma cureta estéril, em seguida, semeou-se no meio AMSB e

acondicionados a estufa a 37ºC para posterior leitura.

49

3.7. Ozonização da água

Foi utilizado um gerador de ozônio (Aparelho: Z-OZONE, Modelo: ZOT-5G110V,

método de ozonização: Efeito corona por Descarga Elétrica, potência: 80 W),

apresentado na Figura 18.

A ozonização da água foi realizada a partir do gerador de ozônio, bem como

também através de um cilindro de oxigênio com acoplamento de válvulas de controle

de pressão e fluxo de gás O2 na entrada.

Água destilada e deionizada com volume de um litro foi ozonizada em

recipiente coluna de vidro, com a adição de pedra porosa e tubo de silicone

acoplado ao gerador de ozônio. A monitoração da medida de concentração do O3 no

líquido foi realizada, pelo medidor colorimétrico marca CHEMets, modelo R-7402,

estabeleceu-se a concentração de 5 PPM com temperatura de 18oC.

A B

Figura 18: Aparelho gerador de ozônio: a) Fotografia do aparelho; b) Água sendo ozonizada com pedra porosa em uma proveta 1000 mL.

Para assegurar a limpeza do sistema, foi ozonizado o volume de um litro de

água deionizada contida no reservatório, por 20 minutos. Após este tempo, a água

foi desprezada, e igual volume de novo líquido foi recolocado na proveta para

produção da água a ser utilizada no experimento.

50

3.8. Tratamento com água ozonizada

Os instrumentais contaminados foram imersos em béquer de 200 mL, contendo 100

mL de água ozonizada, concentração: 5 PPM, temperatura de 18ºC, e tempos de 0,

0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 minutos, resultando nas dosagens de: 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25,

respectivamente. Após os testes com água ozonizada, realizou-se as coletas

microbiológicas utilizando o swab nas curetas submetidas a ozonização, e

semeadas em meio AMSB, em placas de Petri, acondicionadas em estufa a 37ºC,

realizou-se a leitura de UFC por 24 e 48 h. Os testes foram feitos em triplicata.

3.9. Tratamento com água ozonizada + ultrassom

Os instrumentos contaminados foram imersos em becker de 200 mL, contendo 100

mL de água ozonizada, concentração 5 PPM, com temperatura de 18ºC, e

simultaneamente sonicados no aparelho de ultrassom, como já descritos

anteriormente na Figura 16, nos seguintes tempos: 0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 9; 10;

15; 30 minutos.

3.10. Provas de identificação

3.10.1. Prova da catalase

A prova da catalase foi realizada colocando-se água oxigenada 3% sobre colônias

características crescidas no AMSB, observando-se a formação de bolhas de gás

(prova positiva). O resultado negativo da prova revela a presença de bactérias do

gênero Streptococcus (KUBICA, 1966).

3.10.2. Coloração de Gram

A técnica de coloração de gram, conforme Koneman et al. (2008), aliada à

observação de lâminas a fresco foram utilizadas para diferenciar os grupos de

bactérias. A imagem coletada na Figura 19 foi adquirida através de um microscópio

óptico confocal laser, marca Olympus, modelo FV1000.

51

Figura 19: Colônias de S.mutans, gram positivas, microscopia confocal colorida.

3.10.3. Prova hemólise

As bactérias S. mutans são hemolíticos em ágar sangue (Figura 20) (BURNETT et

al., 1978).

Figura 20: Placa contendo meio de cultura ágar sangue e contendocolônias de S.mutans alfa e beta

hemolíticos.

3.11. Análise e apresentação dos dados

Os resultados obtidos foram anotados, tabulados e submetidos à análise estatística

para determinar o seu nível de significância. Foi realizada análise estatística, com

média e desvio padrão, através dos resultados encontrados no meio de cultura,

comparando-se com o grupo controle (CAMPOS; CAMPOS, 2002).

3.12. Considerações éticas

A coleta de dados só foi realizada respeitando os preceitos éticos em pesquisa que

envolve seres humanos, após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)

52

da Universidade Camilo Castelo Branco, sob o CAAE: 401042, e número de

processo: 3362-3582/11.

53

4. RESULTADOS

4.1. Avaliação do tempo de sonicação necessário para reduzir população/

colonias da bactéria S. mutans

Realizou-se os testes com o ultrassom, em curetas contaminadas, com duas

distâncias, entre o fundo do béquer e o cristal do aparelho de ultrassom, de 0,5 e 4

cm, respectivamente, e em seguida realizou-se a semeadura do material em placa

de Petri contendo meio de cultura mitis salivarius sacarosado e bacitracina, após 24

e 48 horas, em estufa a 37ºC, realizou-se contagem das UFC contidas nas placas.

Foram observados os efeitos bactericidas de sonicação nos tempos de 1, 5,

10, 15, 20, 25 e 30 minutos, sobre a cureta contaminada com S. mutans. Os valores

de crescimento dos micro-organismos em UFC/mL estão expressos através da

Tabela 3. O tempo zero foi definido como controle positivo.

Tabela 3: Número de crescimento de S. mutans em UFC/mL após sonicação, com distância de 0,5 cm entre o cristal e o béquer.

Número de

testes

Nº de UFC em placas nos tempos determinados em minutos

0 1 5 10 15 20 25 30 1 533 527 304 211 28 83 3 0

2 518 500 298 206 28 40 4 0

3 637 569 333 117 39 43 6 0

4 700 400 432 153 50 39 6 0

5 560 498 498 99 93 28 22 0

Observa-se que durante os experimento com o ultrassom, frequência de

40kHz, potência acústica de 100 W, e dose de 6 kJ, 30 kJ, 60 kJ, 90 kJ, 120 kJ,

150 kJ, 180 kJ, respectivamente, ocorreu um declínio acentuado nas UFC de S.

mutans exposta á sonicação, com distância de 0,5 cm entre o cristal e o béquer, a

partir de 10 minutos, houve queda de 85% das colônias; após 15 minutos a redução

foi de 96%, e 99,5% após 25 minutos de sonicação, com relação a população inicial

de colônias. Observou-se também que no tempo de 30 minutos, ocorreu a

aniquilação total do microorganismo considerado.

54

4.2. Avaliação do tempo de água ozonizada necessário para reduzir as UFC do

S. mutans

Identificou os efeitos de redução das UFCs do S. mutans no instrumental

odontológico (cureta), através da água ozonizada nos tempos de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6,

8 e 10 minutos, com temperatura inicial da água de 18ºC, o tempo zero, foi definido

como controle positivo. Os valores de crescimento dos micro-organismos em UFC

contidos na placa de Petri contendo o meio específico estão expressos através da

Tabela 4 e Figura 21.

Tabela 4: Número de crescimento de S. mutans em UFC após exposição à água ozonizada (5 PPM O3) em diferentes tempos.

Número de

testes

No de UFCs nos tempos determinados em minutos

0 0,5 1 2 3 4 5 6 8 10

1 533 104 194 72 41 12 23 12 0 0

2 518 108 70 70 56 33 14 8 0 0

3 637 79 7 80 9 39 10 6 0 0

Figura 21: Tratamento da Bactéria S.Mutans com ozonização, concentração: 5 PPM, temperatura da

água: 18ºC.

Com relação à população inicial de colônias após 0,5 minuto de ozonização,

houve redução de 87,5% e aumentando a exposição à água ozonizada para 3, 4, 6 e

55

8, há redução de 93,5%, 98,1%, 99,0% e 99,9%, respectivamente, representado na

Figura 22. Também neste caso ocorreu total morte bacteriana a partir do tempo de 8

minutos.

Figura 22: Relação em porcentagem da redução bacteriana após a ozonização (concentração 5

PPM), nos tempos de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 8 minutos.

4.3. Avaliação do tempo de ozonização e sonicação simultâneos necessários

para reduzir as UFCs do S. mutans

Realizou-se os testes com água ozonizada (5 PPM O3) e sonicação (frequência: 40

kHz) simultaneamente, com temperatura de 18ºC, nos tempos de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 7,

8, 9 e 10 minutos. Identificou-se que durante os testes em que foi realizado o

experimento, ocorreu diminuição de 77,8%, 91%, 95%, 97% e 99% da UFC de S.

mutans pelos tempos de 0,5, 1, 2, 3, 4 minutos, respectivamente, representados na

Figura 23.

A Tabela 5 representa o número de testes realizados e as UFC, relacionados

ao tempo e sonicação/ozonização simultaneamente.

56

Tabela 5: Número de crescimento de S. mutans em UFC após exposição à água ozonizada (5 PPM O3) e ultrassom simultaneamente, em diferentes tempos.

No de testes

No de UFCs em placas nos tempos determinados em minutos

0 0,5 1 2 3 4 5 7 8 9

1 533 148 44 29 28 0 0 0 0 0

2 518 124 31 45 30 3 0 0 0 0

3 637 158 50 16 32 6 0 0 0 0

4 700 138 178 28 78 0 0 0 0 0

5 560 498 64 43 34 0 0 0 0 0

Figura 23: Relação em porcentagem da redução bacteriana após a ozonização/sonicação, nos

tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 minutos.

A Figura 24 representa o tratamento simultâneo nas curetas com o ultrassom

e ozônio, bem como os tempos de tratamento.

57

Figura 24: Tratamento da bactéria S.Mutans com o híbrido ultrassom/ozonização (5 PPM O3). Dose: concentração x tempo x energia.

4.4. Identificação da bactéria S.mutans

A caracterização preliminar dos estreptococos pode ser realizada através da

determinação da hemólise e da produção de catalase, uma vez que essas bactérias

são catalase-negativas.

Realizou-se as provas de identificação bacteriana em colônias aderidas ao

meio de cultura AMSB, para a identificação da bactéria S.mutans. Neste meio de

cultura identificam-se colônias ovóides, aderidas ao meio, conforme Figura 25.

Figura 25: Placa de pétri contendo o meio de cultura Mitis Salivarius sacarosado e bacitracina a 2%,

e UFC de S. mutans.

Realizou-se a técnica de coloração de gram, em lâminas á fresco, resultando

em bactérias gram positivas, conforme a Figura 26.

58

A B

Figura 26: Fotografia digital do S. mutans utilizando microscópio confocal. Lâmina com o biofilme formada a partir de meio de cultura específico para este micro-organismo: A- S. mutans, microscopia

confocal colorida; B- S. mutans, microscopia confocal preto e branco.

Realizou-se a prova da hemólise em meio de cultura ágar sangue, os S.

mutans se enquadram no grupo dos α hemolíticos, ou seja, quando em contato com

um meio ágar-sangue, desenvolvem em 48 horas uma zona interna de

descoramento esverdeado (1 a 2 mm) existindo por volta dessa zona, uma zona

externa de hemólise completa, conforme a Figura 27.

Figura 27: Meio de Cultura Agar Sangue contendo colônias de S. mutans, com zonas distintas de

hemólise ao redor das colônias.

Através dos testes realizados fica evidenciada a presença de S. mutans na

amostra colhida do dente molar inferior com cárie.

59

4.5. Determinação da IC50

Realizou-se a determinação da half maximal inhibitory concentration (IC50), é uma

medida da eficácia de um composto em função biológica ou bioquímica de inibição.

Esta medida quantitativa indica a quantidade da concentração do ozônio e ultrassom

foram necessárias em relação ao tempo para inibir a metade da sobrevida de S.

mutans. É a concentração inibitória de metade com relação ao máximo (50%) (IC) de

uma substância (50% IC, ou IC50). É comumente utilizada como uma medida

de antagonista de drogas potência na investigação farmacológica.

A seguir serão apresentadas as Figuras 28, 29, 30 e 31 com as respectivas

IC50.

Figura 28: Tratamento das colônias com ultrassom, mantendo uma distância de 4 cm entre o fundo do béquer e a cuba do aparelho de sonicação, e IC50 = 20 minutos.

Figura 29: Tratamento das colônias com ultrassom, mantendo uma distância de 0,5 cm entre o fundo

do béquer e a cuba do Aparelho de sonicação, e IC50 = 07 minutos.

60

Figura 30: Tratamento das colônias com ozônio, concentração 5 PPM, temperatura da água: 18ºC e

IC50 = 18 segundos.

Figura 31: Tratamento das colônias com o híbrido ultrassom + ozônio, e IC50 = 0,3 minutos (18 segundos).

61

5. DISCUSSÃO

Nesta pesquisa pretendeu-se identificar o desempenho da ozonização, sonicação e

ozonização/sonicação simultaneamente, como potencial da desinfecção e controle

microbiológico em instrumentais clínicos odontológicos, além de caracterizar a

bactéria Streptococcus mutans no instrumental clínico específico (cureta), após

coleta de material do dente com lesão cariosa. O experimento foi quantitativo,

propondo a utilização do híbrido ultrassom/ozônio para verificar o aumento da

eficácia de desinfecção da bactéria S. Mutans.

A desinfecção de instrumentais é importante para a redução de patógenos,

pois as doenças ocasionadas por infecção cruzada são um grande problema de

saúde e continuam sendo um desafio para a equipe responsável pela sua prevenção

e controle.

Este estudo objetivou proporcionar métodos de desinfecção que reduzem e

elimine a bactéria S. mutans, com custos reduzidos, tempos curtos, e facilidades de

acesso aos profissionais que manipulam instrumentais contaminados, seguida de

medidas de intervenção e providências necessárias para garantir um material que

atenda um padrão de qualidade.

A partir do isolamento em AMSB, as colônias características de S. mutans,

com macromorfologia de aspecto puntiformes, pequenas, médias e grandes foram

selecionadas. Duas a três colônias com morfologia característica de S. mutans foram

repicadas em meios próprios para a realização da coloração pelo método gram para

análise de sua micromorfologia, e prova da catalase e hemólise.

É uma espécie de bactérias gram-positivas com morfologia de coco,

pertencente ao gênero Streptococcus. Agrupam-se em colônias pares (meio sólido)

ou agrupadas (caldo). Suas dimensões variam de 0,6 a 1 µm, pela técnica gram, as

características da sua parede celular e membrana simples determina coloração roxa

(gram-positiva). São imóveis (com poucas exceções), e são bactérias anaeróbias

facultativas.

Possuem alto poder cariogênico, devido sua capacidade acidogênica e

acidúrica. A detecção ou não de Estreptococos do Grupo Mutans (EGM) não é

determinante da atividade cariogênica, porém facilita a identificação de clientes

suscetíveis ao desequilíbrio do processo de desmineralização dental, contribuindo

assim para o planejamento e execução de programas preventivos, reduzindo a cárie.

62

A coleta realizada no trigésimo segundo dente molar, com cárie, nesta

pesquisa, confirmou-se, através do meio seletivo, coloração de gram e catalase, a

presença de S.mutans, no raspado dentário. Pacientes livres de cárie apresentavam

na sua maioria baixa contagem de S. mutans, na pesquisa de Ferreira (2009), o que

corrobora esta pesquisa.

O´Sullivan; Thibodeau (1996) estudaram a correlação entre lesões de cárie e

número de S. mutans presentes no biofilme e na saliva. O número de S. mutans,

presentes no biofilme, era comumente estimado, a partir de amostras colhidas na

saliva, sendo a contagem de micro-organismos presentes na saliva considerada um

indicador da totalidade da carga microbiológica dentária.

Spolidorio (1997), em sua pesquisa demonstrou que os S. mutans esteve

presente em 100% da população investigada independente da classe sócio-

econômica estudada; já nos dados apresentado por Campos; Campos (2002), que

pesquisou a contagem e prevalência de (EGM) em 40 crianças (faixa etária de até

12 anos de idade), encontrou 23 (57,5%) colonizadas por S. mutans, sendo que seis

(15%) apresentavam também S. sobrinus (com menos de 105 UFC/mL), dezesseis

crianças apresentam níveis de S. mutans menores que 105 UFC/mL.

Na avaliação do crescimento das colônias, quando a cureta foi submetida ao

ultrassom, variou-se a distância entre o fundo do Becker e a cuba do ultrassom em

0,5 cm e 4 cm, identificou-se uma maior redução do número de colônias na distância

de 0,5 em relação a distância maior, também avaliou-se o tempo de exposição da

cureta ao ultrassom. Portanto, a atividade bactericida apresentou maior eficácia com

menor distância da extremidade da cureta em relação a fonte geradora da onda

acústica, ou seja, o cristal piezelétrico.

Nos experimentos realizados com a distância maior entre a base do vidro

bequer e o cristal piezelétrico (4 cm), a diminuição das UFC nas placas de cultura

não foi significativa nos tempos de 1, 5 e 10 minutos, já nos tempos de 15 e 20

minutos houve redução maior em relação ao controle positivo e não ocorreu inibição

total do crescimento bacteriano. De fato, este fenômeno pode ser explicado devido a

uma maior densidade de potência acústica do ultrassom quando o instrumento a ser

higienizado fica mais próximo em relação ao fundo da cuba do aparelho limpador

ultrassônico, o contrário ocorre quando o bequer fica distante da cuba, a densidade

de potência acústica será menor, diminuindo assim a atuação biocida, e

consequentemente a potência vibracional e o efeito de cavitação no meio.

63

Segundo Suslick (1990), o efeito do ultrassom na área biológica, pode ocorrer

devido ao poder da alta potência acústica, que pode deslocar distorcer e/ou

reorientar partículas intercelulares ou mesmo células com relação a suas

configurações normais. Tais efeitos estão associados a grandes tensões

hidrodinâmicas suficientes para causar danos às células e macrocélulas suspensas.

Além disso, o ultrassom desenvolve o processo biofísico da cavitação que vem

sendo considerado como um dos principais mecanismos que acarretam a atividade

germicida em meio líquido.

A diminuição de colônias de S. mutans nos ensaios realizados nesta

pesquisa, pelo ultrassom evidenciam a capacidade do aparelho, através de um

efeito físico-mecânico em eliminar micro-organismos.

No ponto do colapso e implosão das bolhas, há formação de ondas de

choque, ou seja, na fase vapor no interior da microbolha, há a expectativa de

variações de temperatura e pressão muito elevadas da ordem de aproximadamente

5000°C e pressão de 500 atmosferas.

Segundo Gonze et al. (1998), a destruição ou inativação de micro-organismos

por aplicação de ondas ultrassônicas pode ser utilizado com eficácia na desinfecção

de águas. Ainda estes pesquisadores, concluíram que aumentando o poder do US

aumenta a destruição das células bacterianas e que as ondas do ultrassom de alta

frequência são mais eficazes do que as de baixa frequência com relação ao

processo de desinfecção de água.

Na referência de Bougrier et al. (2006), quando aplicaram o US de 20 KHz o

em condições controladas de laboratório houve diminuição da viabilidade celular de

Saccharomyces cerevisae. A eficiência do US aumenta com o tempo de exposição

aos efeitos das ondas acústicas e da cavitação sobre as células. Segundo este

mesmo autor, o US pode ser utilizado como um método de controle da viabilidade de

micro-organismos em resíduos aquosos e sanitização de águas contaminadas.

Suslick (1990) realizou um estudo com aplicação de US na preparação e

preservação de produtos cosméticos emulsionáveis, constatando por meio de seus

resultados que o US é um excelente agente biocida. O tratamento do cosmético

contaminado com o fungo Aspergillus flavus com ondas ultrassônicas identificou-se

eficiente levando-se em consideração a diminuição do número de micro-organismos

presentes após exposição. Foram estudadas amostras de cosméticos contaminadas

com o fungo e expostas no gerador de US nos tempos de 12, 16 e 20 minutos,

64

mostrando que a diminuição é maior em função do aumento do tempo de atuação

das ondas acústicas, o que corrobora estes ensaios, havendo uma redução maior no

número de colônias, quando a exposição das curetas contaminadas é maior a

sonicação. Vale ressaltar que na verdade a partir de um valor específico de potência

acústica gerada no cristal piezelétrico, os tempos de atuação do ultra-som resultam

tecnicamente em doses referentes à energia em unidades de Joules [J], de fato, as

maiores dosagens evidenciando maior eficácia bactericida, apresentou valores 150 e

180KJ.

O ozônio (O3) é um gás reativo, que forma radical oxidante em função dos

parâmetros do meio em que ele habita, esta partícula iônica atua na membrana

celular do micro-organismo, podendo causar neste ser a lise celular, desta maneira,

apresenta propriedades antimicrobianas (GARDUÑO GARDUÑO et al., 1995;

VELANO et al., 2001).

A especificação da faixa dosagem do O3 em água para o estudo de

desinfecção levando-se em consideração o Streptococcus mutans, foi estabelecida a

partir de uma concentração com um valor de 5 PPM ou 5 mg/L, Song et al.(2007), de

fato, para doses maiores, ou seja, tempo maior de atuação do ozônio, ocorreu maior

inativação microbiológica.

Nesta pesquisa houve redução de 100% das colônias de S. mutans em oito

minutos de ozonização, na concentração de 5 PPM, o que se aproxima de Baysan;

Whiley e Lynch (2000) encontraram uma redução significativa em S. mutans e S.

sobrinus (BOCCI et al,. 1998; YAMAYOSHI; TATSUMI, 1993).

Segundo Torres et al. (1996), quanto maior for o tempo de atuação da

solução ozonizada maior será o seu efeito oxidativo, consequentemente seu

resultado microbiocida.

O processo de higienização e conseqüente descontaminação a base de

ozônio tem como princípio utilizar as propriedades deste gás. O O3 é o mais potente

germicida em relação ao cloro, e nesta condição torna-se eficaz contra vírus,

bactérias, protozoários e fungos, sem a geração de resíduos químicos sintéticos.

Levando em consideração o protocolo de segurança, o processo de geração e

aplicação do ozônio em concentrações e dosagens adequadas na área clínica,

apresenta elevado fator de segurança, garantindo sua operação dentro do próprio

hospital, reduzindo custos e tempo. Um processo totalmente automatizado, que

65

elimina o erro humano, reduz o risco de operação a praticamente zero e pode ser

100% eficaz.

Baysa; Lynch (2006) encontraram em seu estudo, que o tratamento com

ozônio reduziu drasticamente o número total de micro-organismos e reverteu a

maioria das lesões de raiz de cárie.

Aplicação de ozônio na dentina infectada com S. mutans alcançou

consistentemente reduções significativas no número de micro-organismos viáveis

nos grupos teste, nos ensaios de Polydorou, Pelz e Hahn (2006).

Joahnson; Claesson; Dijken (2009), em sua pesquisa para verificar a eficácia

do ozônio, em sua metodologia, borbulhou o gás direto a solução contaminada com

micro-organismo sem o difusor, comprometendo a eficiência da transferência do gás

para o meio líquido, a concentração foi estabelecida a partir do gerador sem

considerar a atuação do tempo. Já neste trabalho proposto, ozonizou-se a água,

com difusor para diminuir o tamanho das bolhas, até atingir um valor de

concentração específico em PPM (5) posteriormente, imergiu as curetas

contaminadas para a higienização.

Johansson; Claesson; Dijken (2009), confirmaram a sensibilidade dos S.

mutans a exposição ao ozônio, concentração de 5 PPM por 60 segundos de

exposição, destruíram quase 100% desta bactéria, já nos ensaios desta pesquisa, a

redução total deste micro-organismo ocorreu após sete minutos de exposição, tal

fato pode ser explicado pela quantidade de bactérias presentes no biofilme do

instrumental usado, uma vez que no protocolo de preparo já citado anteriormente na

metodologia deste trabalho, há uma quantidade numérica do Streptococcus mutans

muito maior.

Para avaliar a utilidade do ozônio como um agente desinfectante e sua

eficácia antimicrobiana é preciso definir as concentrações e as diferentes formas de

contato, bem como o tempo de exposição.

Quando realizamos o tratamento das curetas com ozônio e ultrassom

simultaneamente, observou-se uma redução nos tempos de exposição, quando

comparados ao ozônio e ultrassom isolados, com a dose híbrida com o tempo de 0,5

minuto de exposição, onde houve redução de 77,3% das colônias, quando

comparados ao número de colônias do grupo controle. Observamos também que o

tempo necessário para a redução/inativação do S. mutans foi reduzido.

66

Na realização do híbrido (ultrassom e ozônio) a redução de todas as colônias

(99,9%) ocorreram após 5 minutos de ozonização, que pode ser explicado pelo

aumento de radicais livres O e OH, que a sonicação ocasiona na água ozonizada, e

pelo efeito mecânico e físico do ultrassom nas moléculas, além do efeito bactericida

do próprio ozônio, se tornando mais efetivo que os tratamentos isolados.

Este estudo mostrou que a temperatura da água, a dose de ozônio,

densidade de energia acústica teve um efeito positivo na redução de colônias de S.

mutans, e o híbrido (US+O3) aumentou morte bacteriana, evidenciado pela redução

das UFC´s nas placas de petri, além disso, a sonicação poderia melhorar e

aumentar a decomposição do O3 para gerar mais OH para reagir com o substrato.

Por outro lado, as microbolhas do O3 podem atuar como núcleos fonte de cavitação

produzindo ainda mais efeito de lise celular, o que aumentou a eficiência do

tratamento hídrico (APHA, 2005).

Yan et al. (2012), estudou em suas pesquisas o grau de desintegração de

resíduo químico utilizando o hibrido (US + O3), o ultrassom foi uma sonda

diretamente imersa na água (frequência: 20 kHz, potência: 250 W), e esta estava 1,5

cm abaixo do nível do líquido, diferente deste estudo, no qual a cuba se localizava

na porção inferior do aparelho do ultrassom, e houve redução das colônias a partir

de 0,5 minutos devido ao efeito sinérgico resultante da combinação entre sonicação

e ozonização.

A densidade de potência potencializa os efeitos mecânicos do ultrassom e

com a mistura (US + O3) há aumento do cisalhamento de bolhas do gás, isto

aumentaria a taxa de transferência ozônio na água.

Gary et al. (1975), prepararam vírus e bactérias presentes em meios de

cultura específicos e trataram com água ozonizada e ultrassom simultaneamente,

bem como também de forma isolada de cada técnica, neste artigo não ficou

tecnicamente evidenciado a metodologia de atuação tanto do ultrassom quanto da

aplicação do O3.

A aplicação simultânea do ozônio e do aparelho limpador ultrassônico

demonstrou maior eficácia quando comparado a cada técnica isolada, tanto o evento

das ondas acústicas quanto o do gás ozônio, não acarreta a geração de resíduos

sintéticos intrínsecos, pois, o efeito mecânico, o radical livre e a molécula de

oxigênio são conseqüentes destes próprios eventos.

67

Este trabalho procurou evidenciar a aplicabilidade de desinfecção de

instrumentos cirúrgicos em geral, de fato, em comparação com os tradicionais

métodos de esterilização citando como exemplo a autoclave e a estufa, estes além

de apresentar longo tempo de utilização, custo de manutenção significativo,

considerável consumo energético elétrico, entre outros, este trabalho procurou

evidenciar a provável viabilidade de utilização de um equipamento comercial

limpador ultra-sônico, em conjunção com um gerador de gás ozônio para a

desinfecção destes materiais, pois estes apresentam baixo consumo de energia

elétrica, custo de compra mais viável e também significativa eficácia em termos de

eliminação bacteriana.

68

6. CONCLUSÃO

A partir dos resultados e discussão realizados nesta pesquisa, concluímos que o S.

mutans esteve presente em todas as amostras dos dentes com cárie, sendo uma

bactéria altamente cariogênica.

A desinfecção de instrumentais odontológicos é um importante fator para a

redução do já citado patógeno, contribuindo para a redução de infecções

oportunistas.

O processo de desinfecção com ultrassom mostrou através dos ensaios, ser

um importante fator para a redução microbiológica, reduzindo todas as colônias de

S.mutans a partir de 30 minutos.

Neste estudo evidenciou a importância da distância entre o material a ser

higienizado e o fundo da cuba do aparelho de ultrassom que é onde se localiza o

cristal piezelétrico gerador de ondas acústicas, de fato, identificamos que se a

distância for menor (0,5 cm neste estudo) a eficiência da sonicação será maior,

tendo uma redução de 85% em 10 minutos de sonicação e 100% em 30 minutos,

enquanto para uma distância maior (4 cm) a redução das UFC em 10 minutos foi de

62,1%, e não houve redução total em 30 minutos de sonicação.

O ozônio reduziu totalmente as UFC aos 8 min quando as curetas foram

expostas a água ozonizada, mostrando ser também um eficiente bactericida, pois

após 0,5 minutos, já houve redução de 87,5% das colônias na placa de petri

contendo o meio de cultura seletivo.

No presente estudo, foram especificadas doses individuais do sistema

ultrassônico e do gás ozônio, bem como também da atuação simultânea destas

duas técnicas a fim de verificar o comparativo efetivo.

O ultrassom em condição simultânea com ozônio apresentou uma técnica

mais eficaz para reduzir o número de colônias da bactéria em estudo, visto que os

ensaios apresentaram redução total do número de colônias, aos 5 min, e sendo mais

eficaz do que ozônio e ultrassom sozinhos. E quando as curetas foram submetidas

simultaneamente ao tratamento híbrido, observamos que o tempo necessário para a

eliminação/inativação do S. mutans foi reduzido. De fato, observou-se que o evento

simultâneo do gás ozônio na água e do limpador ultrassônico, mostrou uma redução

mais significativa do número de UFC em tempo menor.

69

Os sistemas tradicionais atuais de esterilização de instrumentais cirúrgicos,

como por exemplo, a autoclave e a estufa, se notabilizam por serem eficazes na

eliminação total microbiana, entretanto estes equipamentos apresentam

características com considerável consumo de energia elétrica e significativo custo de

manutenção.

Futuramente, a partir de mais estudos, pretendemos padronizar a

metodologia de utilização deste sistema híbrido (ultrassom e ozônio) com a

finalidade de realizar a higienização de instrumentais em geral. Além disso, este

sistema apresentaria a vantagem de muito menor consumo energético elétrico, pois

um equipamento comercial de ultrassom somado a um gerador de O3 apresenta

potência elétrica de aproximadamente 350 W.

70

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ANEXO A. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Solicito através deste termo a sua colaboração para participar desta pesquisa, cujo

título é: “OZONIZAÇÃO E SONICAÇÃO NA DESINFECÇÃO DE INSTRUMENTAIS

ODONTOLÓGICOS”, aprovada no Comitê de Ética da Universidade Camilo Castelo

Branco sob o CAAE: 401042, e número de processo: 3362-3582/11,sendo que a sua

contribuição ao pesquisador será a obtenção do título de mestre em Bioengenharia

pela Universidade Camilo Castelo Branco. Você foi convidado a participar deste

estudo por estar em tratamento odontológico na Clínica de Odontologia desta

Universidade e estar entre a faixa etária de 18 a 45 anos.

Este estudo objetiva-se identificar os efeitos do ozônio na desinfecção e controle

microbiológico em instrumentais clínicos odontológicos, e analisar o potencial de

desinfecção do ultra-som comparado-o com a ozonização.

Será coletado com auxílio de um instrumental, (a cureta) esterilizado da microbota

de sua boca, especificamente nos dentes que apresentarem cáries, avaliados pelo

aluno do sétimo e oitavo semestre do curso de odontologia selecionado pelo

professor da disciplina específica de seu tratamento, especificamente, o aluno que

estiver em seu acompanhamento.

Lembro que você poderá desistir da pesquisa quando quiser. Em caso de afirmação

na participação deste estudo, você terá total liberdade para recusar-se em participar

ou retirar o seu consentimento em qualquer fase do trabalho. Esclareço que serão

respeitados os preceitos éticos, garantindo sigilo total e anonimato quanto aos dados

confidenciais envolvidos nesta pesquisa. Esclareço também que não haverá nenhum

pagamento para sua participação na pesquisa.

O participante poderá entrar em contato com a pesquisadora Pámela Maria Moreira

Fonseca RG: 11.513.321 ou CPF: 055.855.656-64, nos telefones: 6688-5045/ 3895-

7650 com o orientador desta pesquisa: Prof.Dr. Carlos José de Lima, CPF:

052.365.168-62, telefone: (12) 3905 4401. Desde já antecipo o agradecimento e a

atenção que me foi dada.

São Paulo, ___ de ___________de

2011.

_____________________________

Assinatura do (a) participante

_______________________________

_

Assinatura da pesquisadora

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ANEXO B. PROTOCOLO DE AUTORIZAÇAO DA PESQUISA EMITIDA PELO .P DA UNICASTELO