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PARATUBERCULOSE EM BOVINOS: ANÁLISES ANATOMOCLÍNICA, BACTERIOLÓGICA,
IMUNOISTOQUÍMICA E PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
ANA BÁRBARA FREITAS RODRIGUES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JUNHO – 2005
PARATUBERCULOSE EM BOVINOS: ANÁLISES ANATOMOCLÍNICA, BACTERIOLÓGICA,
IMUNOISTOQUÍMICA E PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
ANA BÁRBARA FREITAS RODRIGUES
"Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal”.
Orientador: Prof. Cláudio Baptista de Carvalho
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
JUNHO – 2005
PARATUBERCULOSE EM BOVINOS:
ANÁLISES ANATOMOCLÍNICA, BACTERIOLÓGICA, IMUNOISTOQUÍMICA E PELA REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE
ANA BÁRBARA FREITAS RODRIGUES
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal”.
Aprovada em 29 de junho de 2005. “Comissão Examinadora” ___________________________________________________________________ Prof. Rogério Tortelly (Doutor, Anatomia Patológica) - UFF Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho (Doutor, Biologia Molecular) - UENF ___________________________________________________________________Prof. Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho (Doutor, Anatomia Patológica)- UENF _________________________________________________________ Prof. Cláudio Baptista de Carvalho ( Doutor, Clínica Médica ) - UENF Orientador
A minha mãe e as minhas irmãs que sempre me apoiaram e me deram força
para que eu alcançasse todos os meus objetivos. ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que sempre esteve ao meu lado, dando-me força, saúde e sabedoria. Ao esposo, Hermínio da Cunha Godinho, pela paciência, compreensão e incentivo em busca desse ideal. À filha, Ana Carolina Freitas Godinho, por ajudar -me a superar os momentos difíceis dessa caminhada. Ao Prof. Cláudio Baptista de Carvalho, pela confiança no trab alho e pelos ensinamentos na vida profissional. Ao Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho, pela orientação e pelo convívio harmonioso durante toda a vida acadêmica e, principalmente, na realização deste trabalho. À professora, Eliene Fonseca, e toda a sua equipe, pela parceria e apoio na execução deste trabalho.
Ao Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho e às técnicas, Verônica de Souza Lima e Valéria Cristina Lopes Marques, pela paciência e grandiosa colaboração.
Às grandes amigas, Alessa O.S. Santos e Luciana Lemos, que sempre
foram companheiras, solidárias e deram-me apoio e incentivo nos momentos em que mais necessitei.
iii
A todos os integrantes do setor de Morfologia e Anatomia Patoló gica-
LSA/UENF, em especial aos técnicos, Rodrigo Barros Crespo e Layla Janaina H. Borges, pelo convívio e importante participação neste trabalho.
Aos amigos, Paula Ristow, Marley Gomes e Walter Oelemann, pela parceria,
apoio e atenção durante a realização deste trabalho.
A todos os proprietários que foram essenciais na realização deste trabalho e, em especial aos Srs. Victor Menandro Barbosa e João Pedro Dias Vieira, pela confiança e grandiosa contribuição.
À UENF, pela oportunidade de realizar o trabalho.
À FAPERJ, pelo apoio financeiro.
iv
BIOGRAFIA
Ana Bárbara Freitas Rodrigues, filha de Zacharias Rodrigues Netto e Vilma
de Souza Freitas Rodrigues, nasceu em 19 de abril de 1975, na cidade de Itaperuna
– R.J.
Em março de 1994, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), em Campos dos Goytacazes –
R.J, concluindo-o em dezembro de 1998.
Foi admitida, em agosto de 1999, no Programa de Pós-Graduação em
Produção Animal, Mestrado, na área de Sanidad e Animal, da UENF, concluindo o
curso em agosto de 2001. Nesta mesma data, foi admitida no Programa de Pós -
Graduação em Produção Animal, Doutorado, na mesma área, submetendo-se à
defesa de tese para conclusão do curso em junho de 2005.
v
CONTEÚDO
RESUMO.....................................................................................................................xi
ABSTRACT................................................ ................................................................xiii
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
1.1. Paratuberculose bovina .................................................. .........................1
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................3
2.1. Definição da Paratuberculose bovina.......................................................3
2.2. Histórico da Paratuberculos......................................................................4
2.2.1.Paratuberculose no Brasil................................................................7
2.3. Agente etiológico ............................................................. ........................8
2.3.1. Análise taxonômica ........................................................................8
2.3.2. Características gerais do Map ...................................................... .9
2.3.3. Condições de resistência do Map ................................................10
2.4. Epidemiologia ........................................................................................11
2.4.1. Distribuição e difusão ...................................................................11
2.4.2. Hospedeiro ...................................................................................12
2.4.2.1. Susceptibilidade de idade, raça e aptidão ..........................13
2.4.3. Fatores de risco... ........................................................................ 14
2.4.4. Infecção...................................................... ..................................15
2.4.4.1. Fases da infecção............................... ................................16
2.4.5. Morbidade e mortalidade .............................................................17
vi
2.4.6. Perdas econômicas......................................................................18
2.4.7. Levantamento epidemiológico .....................................................19
2.5. Patogenia ..............................................................................................21
2.5.1. Localização das lesões na fase inicial da infecção .................... ..21
2.5.2. Entrada e sobrevivência do Map na mucosa intestinal............... 21
2.5.3. Imunopatogenia........................................................................... 22
2.6. Sinais clínicos............................................................ ........................... 23
2.7. Lesões ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,24
2.7.1. Lesões macroscópicas ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,24
2.7.2. Lesões microscópicas ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,26
2.8. Diagnóstico ...........................................................................................29
2.8.1. Diagnóstico clínico ......................................... ..............................29
2.8.2. Diagnóstico diferencial .................................................................29
2.8.3. Diagnóstico laboratorial ...............................................................29
2.8.4. Testes de avaliação da resposta imune celular .......................... 31
2.8.5. Testes de avaliação da resposta humoral ...................................32
2.8.6. Necropsia .....................................................................................34
2.8.7. Bacterioscopia e hstopatologia ....................................................35
2.8.8. Imunoistoquímica .........................................................................35
2.8.9. Bacteriologia ................................................... ..............................39
2.8.10. Métodos moleculares .................................................................40
2.9.Tratamento .............................................................................................44
2.10. Controle da Paratuberculose ..............................................................45
2.11. Saúde pública .....................................................................................46
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 49
3.1. Desenho do estudo ...............................................................................49
3.2. Características zootécnicas das propriedades estudadas.....................49
3.2.1. Propriedade A......................................................................................49
3.2.2. Propriedade B......................................................................................50
3.3. Processamento das amostras.................................... ............................50
3.4. Metodologia utilizada .............................................................................51
3.4.1. Caracterização macroscópica da lesão .......................................51
3.4.2. Histopatologia .......... ....................................................................51
vii
3.4.3. Imunoistoquímica..........................................................................52
3.4.4. Cultura......................................................................................... 52
3.4.5. Reação em cadeia de polimerase - Polymerase Chain Reation
(PCR)....................................................................................................................53
3.4.5.1.Extração dos ácidos desoxiribonucléicos (DNA) de tecido
parafinado ............................................................................................................53
3.4.5.2. Amplificação pela PCR....................................................... 54
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 55
4.1. Medidas de manejo adotadas nas propriedades A e B .......................56
4.2. Histórico e avaliação clínica dos animais...............................................57
4.3. Achados macroscópicos ........................................................................60
4.4. Achados microscópicos.................................................. ....................... 64
4.4.1. Marcação imunoistoquímica .....................................................70
4.5. Bacteriologia......................................................................................... .72
4.6. Detecção do Map nas amostras, via PCR, para o gene F5...................73
5. CONCLUSÃO ................................................................................................. 76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................77
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Vaca (Jacuba). Paratuberculose. Caquexia, emaciação e pelagem áspera
acobreada................................................................................................................ ...56
Figura 2.Vaca (Humorista). Paratuberculose. Extremo estado de magreza
(amiotrofia) e emaciação............................................................................................57
Figura 3. Bovino Garrote. Paratuberculose. Animal caquético. ................................58
Figura 4 . Alça intestinal de bovino com Paratuberculose, visivelmente dilatada......59
Figura 5. Mucosa ileal de bovino com Paratuberculose. Espessamento, corrugação
(aspecto cerebróide) e áreas de hiperemia .............................................................. 60
Figura 6 . Linfonodo mesentérico hipertrofiado no eixo maior (alongado / em cadeia)
de bovino com Paratuberculose.................................................................................61
Figura 7. Vasos linfáticos mesentéricos dilatados, evidenciando linfangiectasia em
bovino com Paratuberculose.............................................................................. .......61
Figura 8. Válvula íleocecal com hipertrofia e congestão de bovino com
Paratuberculose. .......................................................................................................62
Figura 9. Mucosa intestinal (íleo) de bovino com Paratuberculose, demonstrando
lesão granulomatosa com abundante infiltrado de células epitelióides. HE, 100X... 63
Figura 10. Mucosa intestinal de bovino com Paratuberculose, evidenciando infiltrado
de células epitelióides, células de Langhans em formação e linfangiectasia. HE,
400X.................................................... ...................................................................... 64
ix
Figura 11. Íleo de bovino com Paratuberculose. Lesões multifocais com BAAR no
ápice das vilosidades, na região médio -glandular e região basal da mucosa. ZN,
100X. ............... ..........................................................................................................65
Figura 12. Mucosa intestinal (íleo) de bovino com Paratuberculose. Vilosidades
fundidas devido ao infiltrado de células epitelióides e BAAR. ZN, 100X………….... 65
Figura 13. Vaso linfático dilatado na submucosa (ileal) de bovino com
Paratuberculose, contendo lesão granulomatosa, célula gigante de Langhans e
BAAR no seu interior . ZN, 400X................................................................. .............. 66
Figura 14. Corte da porção ileal do intestino de bovino com Paratuberculose,
demonstrando lesão difusa na base da mucosa e em toda submucosa. ZN, 100X. 67
Figura 15. Lesões multifocais com BAAR na região cortical de linfonodo mesentérico
de bovino com Paratuberculose.. ZN,400..................................................................68
Figura 16. Lesões multifocais com BAAR no espaço porta hepático de bovino com
Paratuberculose. ZN, 400X ............................................. ..........................................69
Figura 17. Globias de bacilos imunoexpressados em marrom acastanhado na
mucosa intestinal de bovino com Paratuberculose. IHQ, 400X…..............................70
Figura 18. Grumos de bacilos imunoexpressados no espaço porta-hepático de
bovino com Paratuberculose. IHQ, 400X. .................................................................70
Figura 19. Resultado do nested PCR das amostras intestinais dos animais
estudados: Nas linhas 2 e 3, vaca Humorista; 4 e 5, vaca Jacuba; 6 e 7, bovino
Garote; 8 e 9, vaca Janice; 10 e 11, animal 981; e na linha 12, o DNA bacteriano de
cultura de amostra intestinal da vaca Humorista. Linha 1, ladder, marcador de peso
molecular....................................................................................................................74
x
RESUMO
RODRIGUES, Ana Bárbara Freitas, Médica veterinária. D.S.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; junho de 2005; Paratuberculose em bovinos: Análises anatomoclínica,bacteriológica, imunoistoquímica e pela reação em cadeia da polimerase; Orientador: Cláudio Baptista de Carvalho; Prof. Consel heiro: Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho.
A Paratuberculose bovina é definida como uma enterite crônica,
granulomatosa e que tem, como agente etiológico, Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (Map), um bacilo intracelular facultativo e álcool ácido resistente
(BAAR). A enfermidade leva o animal à síndrome da má absorção devido às graves
alterações metabólicas provocadas pelo processo inflamatório crônico,
especialmente na última porção do intestino delgado, válvula ileocecal e cecum.
No Brasil, um dos principais aspectos na epidemiologia da Paratuberculose diz
respeito à importação de bovinos infectados e nos nascidos no país, filhos de pais
importados. Apesar de os relatos serem esporádicos e impedirem uma estimativa
dos rebanhos infectados, é de grande importância que se atente para a ocorrência
de Paratuberculose em nosso rebanho. Com o intuito de contribuir com dados
epidemiológicos referentes à Paratuberculose no Brasil, este trabalho teve como
objetivo principal identificar e descrever quatr o casos da doença, detectados em
exames clínicos e laboratoriais, na região de Resende–RJ. Diante de uma avaliação
das suspeitas clínicas e dos resultados positivos do teste de ELISA e cultura fecal,
xi
os animais foram necropsiados e, em seguida, feita a identificação das lesões
macroscópicas características, definidas como lesões cerebróides da mucosa
intestinal e hipertrofia dos linfonodos mesentéricos. Uma avaliação microscópica das
lesões, utilizando os métodos de coloração histológicos HE e ZN, fo i realizada. Estes
métodos se mostraram essenciais para a detecção de lesões granulomatosas
nas amostras intestinais assim como para a identificação dos bacilos álcool-ácido-
resistentes, respectivamente. Por meio da técnica de IHQ, foi possível identificar os
bacilos imunomarcados. Todos os quatro casos foram confirmados pela cultura de
tecido em meio “HEY” com micobactina e pelo método de reação em cadeia de
polimerase (PCR), baseado na seqüência F57, que é única do Mycobacterium avium
subsp, paratuberculosis. Diante de uma suspeita clínica, os métodos
anatomospatológico, bacteriológico e molecular utilizados, neste experimento,
proporcionaram a confirmação de todos os quatro casos suspeitos de
Paratuberculose detectados no município de Resende, demonstran do serem
valiosas ferramentas de diagnóstico.
Palavras-Chaves: Anatomopatologia, Map, Paratuberculose, bovino, PCR.
xii
ABSTRACT
RODRIGUES Ana, Bárbara Freitas, Doctor Veterinary medicine. D.S.; State University of the state of Rio de Janeiro North Darcy Ribeiro; June, of 2005; Paratuberculosis in Bovine. Anatomoclinical, bacteriologycal, Immunehistochemistry and Polymerase chain reaction analyses; Orientates: Cláudio Baptista de Carvalho; Prof. Council member: Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho.
The bovine Paratuberculosis is defined as a chronic, granulomatous enteritis
whose etiological agent the Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), is
a facultative intracellular and acid-fast bacillus (BAAR). The disease leads the
animal to the malabsorption syndrome due to serious metabolic changes provoked
by a chronic inflammatory process, especially in terminal small intestines, ileocecal
valve and cecum. In Brazil, one of the main aspects of epidemiology of the
Paratuberculosis concerns the importation of infected bovines previously diagnosed
and the in-borns whose parents have been imported. Reports on this issue are
sporadical, therefore, as the present time, estimates that the number of the country´s
infected animals are still inaccurate. Nevertheless, it is of great importance to turn the
attention to the occurrence of Paratuberculosis in Brazilian flock. The aims of this
study are to provide epidemioloc data on Paratuberculosis in Brazil and, mainly, to
identify and describe four cases of the disease, detected in clinical and laboratorial
examinations, in the region of Resende-Rio de Janeiro. At the head of an evaluation
of the clinical suspicion and the positive results of the ELISA test and fecal culture,
the animals were necropsied and the typical macroscopic lesions, identified. An
viii
microscopical evaluation of the lesions through histological stain xiii methods: HE
and ZN, were carried and proved to be essential in the detection of the
granulomatous lesions in the intestine samples as well as in the identification of the
acid-fast bacillus, respectively. Through the IHQ technique it was possible to identify
the imunomarcados bacillus. All of the four cases were confirmed by the fabric
culture in half "HEY" with micobactina and by the method of reaction in chain of
polimerase (PCR), based in the sequence F57, that is only of the Mycobacterium
avium subsp, paratuberculosis. At the head of one clinical suspicion, the methods
anatomospatological, bacteriological and molecular used in this experiment that they
have provided the confirmation of all the four suspicious cases of Paratuberculose
detected in Resende, proved to be valuable tools of diagnosis.
.Key-Words: Amatomopathology, Map, Paratuberculosis, bovine, PCR.
xiv
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Paratuberculose bovina
A Paratuberculose bovina ou doença de Jonhe é definida como uma enterite
crônica, granulomatosa e que tem, como agente etiológico, Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis (Map), um bacilo intracelular facultativo e álcool-ácido-
resistente - BAAR (CORPA et al., 2000; HUDA e JENSEN., 2003). É conhecida
como doença dos ruminantes domésticos, principalmente, em bovinos leiteiros,
ovinos e caprinos, mas afeta uma grande variedade de outras espécies domésticas
e silvestres.
A bactéria penetra no corpo do animal por meio do trato gastrintestinal e as
lesões se iniciam como discretos granulomas não encapsulados, na parede do
intestino e nos linfonodos satélites. Com o tempo , a lesão inflamatória pode se
desenvolver em um grande granuloma ou em uma inflamação granulomatosa difusa
com número variado de BAAR no interior dos macrófagos e das células gigantes
multinucleadas. As vilosidades, algumas vezes, se fundem e as paredes intestinais
ficam espessadas. Essas mudanças comprometem a função absortiva do intestino e,
em conseqüência disso, ocorre uma maior secreção de fluidos para o lúmem
intestinal (SIGURÕARDÓTTIR et al., 2004). A enfermidade leva o animal à síndrome
de desabsorção devido às graves alterações metabólicas provocadas pelo processo
inflamatório crônico, especialmente na última porção do intestino delgado, válvula
ileocecal e cecum.
2
As principais lesões macroscópicas ocorrem no intestino delgado e
caracterizam-se por acentuado espessamento da mucosa, que assume aspecto
rugoso e megalia dos linfonodos mesentéricos. Os principais achados
histopatológicos consistem em enterite, linfangite e linfadenite granulomatosas
associados ao BAAR em macrófagos (CHIODINI et al., 19 84; KREEGER, 1991).
Em bovinos, essa infecção causa uma moléstia consultiva com curso
prolongado, durante o qual a diarréia intratável, instalada, resulta em desidratação.
Os animais jovens adquirem a infecção por meio da ingestão do Map, presente em
alimentos, água e tetos contaminados. Na fase adulta, após um longo período
assintomático, em que o animal infectado elimina no ambiente uma grande
quantidade do Map por meio das fezes, começam a aparecer os sinais clínicos de
diarréia intermitente, perda de peso progressiva, desequilíbrio eletrolítico, queda na
produção leiteira, aumento de doenças concorrentes, caquexia e, finalmente, a
morte. Uma vez no ambiente, o agente se torna uma fonte de infecção para o
rebanho e para outras espécies, incluindo o home m. Pesquisas recentes vêm
demonstrando que alimentos in natura, de origem animal, provenientes de rebanhos
infectados com Map são possíveis fontes de contaminação para o homem, podendo
causar uma íleocolite granulomatosa em humanos, denominada Doença de Crohn
(CHIODINI e ROSSITER, 1996).
No Brasil, um dos principais aspectos da epidemiologia da Paratuberculose
diz respeito à importação de bovinos infectados, de forma semelhante ao que ocorre
na África do Sul. A doença já foi diagnosticada em bovinos importa dos e nos
nascidos no país, filhos de pais importados. Apesar de os relatos serem esporádicos
e impedirem uma estimativa das perdas econômicas em rebanhos infectados, é de
grande importância que se dê maior atenção para a ocorrência de Paratuberculose
em nosso país, já que existem seis descrições da doença na Região Sudeste
(Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais), e três na Região Sul, (Estados de Santa
Catarina e Rio Grande do Sul).
Com o intuito de contribuir com dados sobre o diagnóstico e a epidemiol ogia
da Paratuberculose no Brasil, este trabalho descreve e discute novos casos da
referida enfermidade.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Definição da Paratuberculose bovina
A Paratuberculose, ou doença de Johne, é definida como uma enterit e
crônica, granulomatosa, que acomete principalmente ruminantes domésticos e
silvestres. A principal via de transmissão é a fecal-oral, pela qual o agente etiológico,
Mycobacterium avium subspécie paratuberculosis (Map), proveniente de animais
cronicamente infectados, é transmitido aos animais jovens susceptíveis. O
microrganismo atinge primeiramente a mucosa intestinal, provocando diarréia, má
absorção, excessiva perda de peso e queda na produção de leite (CHIODINI et al.,
1984; THORNE e HARDIN, 1997).
A Paratuberculose pode ser caracterizada como um processo inflamatório
crônico que provoca progressiva emaciação, aumento e corrugação da parede do
intestino delgado, particularmente da parte terminal do íleo, além de um aumento
dos linfonodos mesentéricos (BARKER et al., 1993; JONES et al., 1996). Tal
processo inflamatório tem como substrato histopatológico uma infiltração de células
epitelióides e células gigantes de Langhans na mucosa e submucosa intestinais e
nos linfonodos mesentéricos, sem contudo, apresentarem sinais de necrose nem de
ulcerações nas lesões (SANTOS e SILVA, 1956; CLARKE, 1997; JONES et al.,
1996).
4
A patogênese da Paratuberculose está relacionada com a resposta imune,
inflamatória e granulomatosa na lâmina própria do intestino delgado e com uma
progressiva atrofia associada às vilosidades (BARKER et al., 1993)
Os aspectos macroscópicos dessa patologia estão diretamente relacionados
às alterações microscópicas. As paredes intestinais afetadas estão espessadas, às
vezes, edematosas, e suas superfícies mucosas contêm muitas pregas transversais
largas e bastante aglomeradas. Essas rugas resultam do espessamento de
vilosidades e dão à superfície um aspecto corrugado, que não desaparece quando a
parede intestinal é distendida (JONES et al., 1996).
2.2. Histórico da Paratuberculose
A Paratuberculose foi primeiramente descrita, em 1895, na Alemanha, por
Johne e Frothingham, como uma enterite crônica dos bovinos. Naquela época,
acharam que o bacilo álcool-ácido-resistente (BAAR) visto no tecido de animais
infectados fosse uma forma modificada do Mycobacterium tuberculosis ou
Mycobacterium avium, e que a doença fosse uma forma de tuberculose intestinal.
Tratava-se de uma vaca de seis anos de idade, que foi sacrificada após apresentar
histórico de perda de peso, diarréia crônica, teste intradérmico com a tuberculina
mamífera inconclusivo e quadro clínico agravado. O veterinário da propriedade
realizou o exame patológico e constatou macroscopicamente uma enterite crônica,
sem sinais de tuberculose intestinal. O intestino delgado apresentava-se espessado
e com a mucosa corrugada. As vísceras foram enviadas ao Instituto de Patologia de
Dresden, Alemanha, onde foram analisadas por Johne e Frothingham. Eles
observaram um espessamento da mucosa intestinal e um aumento dos linfonodos
mesentéricos. No exame histológico, evidenciaram a parede intestinal infiltrada com
leucócitos e células epitelióides associadas com células gigantes, além de
detectarem inúmeros bastonetes nos tecidos lesionados, quando utilizaram a
coloração álcool-ácido-resistente (a.a.r.). Embora o organismo se assemelhasse à
bactéria que causa a tuberculose, uma amostra de tecido infectado, contendo o
organismo, foi incapaz de causar a doença quando injetada em porcos da Índia. A
partir daí, Johne e Frothingham concluíram que a doença observada na vaca tinha
sido causada por uma bactéria que causa tuberculose em aves, M. avium. O
5
reconhecimento da sua similaridade patológica com a tuberculose intestinal
(normalmente causada pelo M. bovis), fizeram-nos propor o nome de
“Pseudotuberculous enteritis” para a doença. Por volta de 1900, a
“Psedotuberculous enteritis” foi reconhecida como uma nova doença e os cientistas
propuseram uma variedade de nomes alternativos para a doença, como, por
exemplo, paratuberculose e enterite hipertrófica (CHIODINI, 1993)
Em 1906, MCFADDEAN utilizou o termo de doença de Johne em uma
publicação anual do Royal Veterinary College e, desde então, muitas publicações
têm utilizado a denominação de doença de Johne ou Paratuberculose quando se
referem a essa patologia. Ainda nesta década, BANG reconhece u que animais com
a doença de Johne respondiam fracamente ou não respondiam às injeções
intradérmicas de antígenos preparados de M. bovis (bacilo da tuberculose), mas
apresentavam uma boa resposta à tuberculina aviária. Com base nessa observação,
BANG sugeriu que tuberculina aviária pudesse ser utilizada como teste para o
diagnóstico em animais. Essa observação foi confirmada, na Inglaterra, por MALE
em 1911. Apesar de a bactéria causadora da doença de Johne ainda não ter sido
isolada, os cientistas acreditavam que esta estaria relacionada, de alguma maneira,
com a bactéria causadora da tuberculose em aves, embora existisse uma diferença
marcante entre as duas bactérias: o fato de o organismo causador da tuberculose
crescer em culturas de laboratório, diferentemente do organismo causador da
doença de Johne. TWORT, em 1910 -1911, isolou o agente etiológico da doença de
Johne, após uma inspeção apurada dos tubos inoculados em que ele observou o
crescimento de pequenas colônias -satélite em culturas contaminadas com um bacilo
comumente encontrado no feno, o M. phlei. A partir daí, TWORT incorporou ao meio
um preparado de M. phlei, pois suspeitava que essa micobactéria estivesse
produzindo algum nutriente essencial para o meio e, desta maneira, proporcionando
um suporte para o crescimento de um novo BAAR. Chamou essa nova bactéria de
“Mycobacterium enteretidis chronicae pseudotuberculose bovis Johnes ”. HOLTH, em
1912, também obteve sucesso no isolamento do agente causal da doença de Johne
e chamou o organismo por ele isolado simplesmente de “Bacillus Paratuberculosis”.
Com o isolamento do agente etiológico da doença de Johne em laboratórios, pode -
se obter antígenos para testes diagnósticos. Esses antígenos foram usados em
testes dérmicos, como é feito na tuberculose, sendo chamado de “Jonina”, e na
detecção de anticorpos em amostras de soro, usando fixação de complemento e
6
técnica de aglutinação. Em 1923, a primeira edição do Manual Bergey de
determinação bacteriológica publicou oficialmente que o agente causal da doen ça de
Johne era o Mycobacterium paratuberculosis (citado por COLLINS e MANNIN,
2003).
Na década de 30, a Paratuberculose foi descrita em países da América do
Sul e Índia, demonstrando, desta forma, que a doença estava mundialmente
distribuída e que era uma possível ameaça à atividade pecuária. Nos anos 40, a
Paratuberculose era conhecida não somente como uma doença de animais
domésticos, mas também dos animais silvestres. Com a avaliação dos testes
diagnósticos até então utilizados, foram observadas reações cruzadas, que
resultaram em reações falso-positivas com organismos do gênero Corynebacterium
e outras espécies antigenicamente relacionadas. Algumas medidas de controle
foram avaliadas e, em 1950, surgiram diversos experimentos em vacinação. Na
década de 60, vários outros testes diagnósticos foram criados como, por exemplo, a
migração de leucócitos e teste de imunofluorescência. Importantes observações
epidemiológicas foram feitas nesta época. Neste mesmo período, ficou reconhecida
a participação de animais subclinicamente infectados (carreadores) que eliminavam
o agente por meio das fezes e a possibilidade de se encontrar o M. paratuberculosis
em sêmem de touros e úteros de vacas infectados, indicando uma provável infecção
intra e trans-uterina do feto. Nas décadas de 70 e 80, vários pesquisadores
começaram a estudar mais intensamente as várias facetas do Mycobacterium
paratuberculosis e da doença de Johne, proporcionando avanços nos
conhecimentos sobre a Paratuberculose. Em 1983, MERKAL organizou o primei ro
Colóquio Internacional em Paratuberculose, (CHIODINI, 1993; citado por COLLINS e
MANNIN, 2003).
No final dos anos 80 e início dos anos 90, novos achados em relação a
Paratuberculose aconteceram, com a descoberta, por COLLINS e McFADEAN, de
uma seqüência genética, única do Mycobacterium paratuberculosis. Essa seqüência
de nucleotídeos foi denominada de IS900, sendo a primeira seqüência de inserção
já registrada em micobactérias. A importância desta descoberta foi a de utilizar
métodos genéticos para detectar Map, já que a detecção mediante cultivo em meios
de cultura leva em torno de 16 semanas. Além disso, tal descoberta alicerça a
sugestão de muitos pesquisadores sobre a participação do Map como agente
7
etiológico da doença de Crohn, após este ter sido isolado de amostras de intestino e
nódulos linfáticos de paciente com esta enfermidade (CHIODINI, 1993).
2.2.1. Paratuberculose no Brasil
No Brasil, a literatura sobre a doença de Johne é escassa, considerando
que, na maioria das vezes, é tratada como raros achados anatomopatológicos que
chegam aos laboratórios de patologia de universidades e instituições (GOMES,
2002). Até hoje, não há dados epidemiológicos amplos sobre a Paratuberculose no
Brasil, nem sobre o seu impacto na economia leiteira (FERREIR A et al., 2001).
A Paratuberculose foi diagnosticada no Brasil pela primeira vez, em animais
importados da raça Flamenga no então Posto Zootécnico Federal de Pinheiros, no
Rio de Janeiro, por OCTÁVIO DUPPONT, que fez a divulgação do fato pelo Jornal
no Comércio do estado do Rio de Janeiro, em 5 de janeiro de 1915. DUPPONT
acreditava ser uma doença tão comum no Brasil quanto na Europa, por isso não se
preocupou em desenvolver a sua comunicação e transformá-la em trabalho técnico
(DACORSO FILHO et al., 1960).
SANTOS e SILVA (1956), ainda no estado do Rio de Janeiro, mais
especificamente no Município de Barra Mansa, relataram, com farta descrições
anatomopatológicas, um outro caso da doença em um touro com seis anos de idade
da raça Holandesa
DACORSO FILHO et al. (1960), mediante exames clínicos e
anatomopatológicos, diagnosticaram a Paratuberculose em dois bovinos da raça
Jersey, provenientes de um rebanho com histórico da doença no município de
Petrópolis-RJ. Estes autores também descreveram outro caso da enfermidade
clínica em um touro da raça Holandesa, filho de mãe importada da Holanda, em uma
propriedade leiteira localizada em Bangu, na cidade do Rio de Janeiro -RJ.
SILVA e PIZELLI (1961) realizaram o diagnóstico de Paratuberculose em
bovinos da raça Jersey, oriundos de uma propriedade situada no Município de
Petrópolis-RJ.
PORTUGAL et al. (1979) relataram dois casos de Paratuberculose bovina
no estado de Santa Catarina: um em touro nacional da raça Normanda, com cinco
8
anos de idade e o outro em uma fêmea Holandesa, importada da Holanda, com seis
anos de idade.
RAMOS et al. (1986) observaram a forma clínica da doença em um touro da
raça Holandesa, doador de sêmen em uma central de inseminação artificial no Rio
Grande do Sul.
NAKAJIMA et al (1991), em Minas Gerais, registraram a enfermidade em
uma vaca com cinco anos de idade da raça Holandesa que fora importada dos
Estados Unidos da América.
DRIEMEIER et al. (1999), no Rio Grande do Sul, descreveram as lesões
clínico-patológicas observadas em oito vacas com doença de Johne, provenientes
de um rebanho de 345 animais, sendo que a maioria desses animais eram vacas
importadas da Argentina.
Em relação às estimativas nacionais da epidemiologia da doença, pode -se
basear em apenas algumas estimativas mais recentes: RIVIERA (1996), no Mato
Grosso do Sul; LARANJA DA FONSECA et al. (2000), em São Paulo; FERREIRA et
al. (2001), no Rio de Janeiro; e GOMES et al. (2002), no Rio Grande do Sul. Tais
estudos estimaram uma soroprevalência de 45,5%, 37,9%, 18% e 39,8% de an imais
infectados, respectivamente.
2.3. Agente etiológico
2.3.1. Análise taxonômica
Após uma criteriosa análise taxonômica do Mycobacterium avium, M.
paratuberculosis e do M. silvicatium, THOREL et al. (1990) propuseram uma nova
denominação para esses agentes e sugeriram que estas espécies fossem
agrupadas como M. avium e separadas pela designação de subspécies, ou seja, M.
avium subsp. avium, M. avium subsp. paratuberculosis e M avium subsp. silvicatium.
No entanto, desde sua publicação no Internatinal Journal of Systematic Bacteriology
(IJSB), em junho de 1990, a nova denominação do agente etiológico da
Paratuberculose é Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (Map),
tornando se, portanto, lei taxonômica.
A partir daí, Map faz parte do complexo M avium (MAC), que além deste,
compreende o M. avium, M intracellulare e M. scrofulaceum (COETSIER et al, 2000).
9
Algumas pesquisas vêm demonstrando que essa relação bem fechada entre Map e
algumas espécies de micobactérias do complexo M. avium (MAC), em particular o
M. avium subspécie avium (Maa), que vivem no ambiente, deve-se ao fato de existir
uma homologia de 97% entre o DNA da maioria de cepas de Map e Maa isoladas
até o momento (BARKER et al., 1993; BANNANTINE et al., 2002).
2.3.2. Características gerais do Map
Map é um patógeno intracelular facultativo, caracterizado como um
bastonete pequeno de aproximadamente 0,5 x 1,5µm, Gram positivo, imóvel, não
esporulado, aeróbico e fortemente álcool-ácido-resistente - BAAR (CASTRO e
TRABULSI, 1999). Nas fezes e em esfregaços tissulares, ao contrário do que
acontece com o M. tuberculosis e com as micobactérias saprófitas, aparecem,
freqüentemente, formando globias (apinhados). Comumente é encontrado dentro
dos macrófagos e células gigantes (SMITH, 1969 ; SEFFNER, 1999).
Map é um microrganismo bastante fastidioso, seu isolamento e cultivo em
meios de cultura é tarefa trabalhosa e demorada. Quando crescido em meios
artificiais como ”Herrold Egg Yolk Médium” (HEYM), “Reid -Watson” ou “Lowenstein-
Jensen” (LJ), formam colônias rugosas despigmentadas, de crescimento lento, em
torno de 8 a 12 semanas. Algumas cepas podem produzir colônias com
pigmentação, variando de amarelada à laranja, sendo estas cepas isoladas
geralmente de ovinos (TAYLOR, 1957; BARCLAY et al.,1985. citados por GOMES,
2002).
Uma característica clássica do Map é o seu crescimento dependente de
micobactina, um aditivo nutricional à base de complexos solúveIs de ferro, que
permite o crescimento do microrganismo fora do hospedeiro, ou seja, em meios de
culturas (BARCLAY et al.,1985; LAMBRECHT e COLLINS, 1992, citados por
GOMES, 2002). O ferro é um elemento essencial para a maioria das bactérias, sua
disponibilidade e o seu seqüestro estão associados com a sobrevivência e com a
virulência bacter iana. Map é incapaz de produzir micobactina, o que o torna incapaz
de seqüestrar o ferro fora do hospedeiro (COCITO et al., 1994)
10
2.3.3. Condições de resistência do Map
Além de causar doenças em animais, nos últimos anos, algumas pesquisas
sugerem o possível envolvimento deste microrganismo com a etiologia de uma
inflamação crônica e granulomatosa no intestino de humanos, conhecida como
Doença de Crohn, já que houve o isolamento de Map em humanos com tal patologia
(CHIODINI et al., 1984; HERMON -TAYLOR et al., 1990).
Trabalhos científicos sugerem a participação do leite e seus derivados como
potentes veículos de transmissão do Map para humanos. CHIODINI e HERMON-
TAYLOR (1993) e MILLAR et al (1996) demonstraram que o processo de
pasteurização em amostras de leite contaminadas laboratorialmente não foi capaz
de inativar completamente o agente da Paratuberculose.
Utilizando a técnica de pasteurização “High Temperature Short Time”
(HTST), GRANT et al (2002a) foram capazes de avaliar a viabilidade do Map em
amostras de leite contaminadas naturalmente pelo Map e concluíram que o
microrganismo era capaz de resistir ao processo de pasteurização utilizado.
GRANT et al (2002b), na Irlanda, avaliaram a incidência de Map em
amostras de leite in natura e amostras de leite comercialmente pasteurizado e
observaram a presença do microrganismo nos dois tipos de amostras, concluindo,
desta forma, que Map está ocasionalmente presente em amostras de leite
pasteurizado no Reino Unido.
Todos esses trabalhos demonstram uma possível ligação entre Map e a
doença de Crohn em humanos, levando-se a suspeitar da possível participação do
leite na transmissão deste agente à população humana ( CORTI e STEPHAN, 2002)
Além da resistência à pasteurização, Map também possui uma notável
resistência aos fatores físicos e químicos, o que lhe garante um grande período de
sobrevivência no ambiente. Alguns trabalhos comprovam a resistência do Map à
dessecação, a condições ácidas e a certos desinfetantes, já que estes podem
sobreviver por vários meses na água, no solo e nas fezes (CHIODINI et al.,1984).
A parede celular das micobactérias é relativamente impermeável e rica em
lipídios, o que lhes confere a propriedade álcool-ácido-resistente. A parede celular
contém uma camada interna de pepitideog licano, uma intermediária bilateral com
cadeias longas de ácidos graxos (micólico) ligados a arabinolactanos e uma outra
camada de pepitidioglicosídeos (micosideos). O lipoarabinomanose (LAM) é um
11
glicolipídeo que está ancorado à membrana e inserido na par ede celular. Ele é
considerado um dos vários imunomoduladores componentes da parede celular do
Map (BERNNAN e NIKAIDO, 1995)
LOVEL et al (1944), citados por CLARKE (1997), demonstraram, mediante
experimento, que Map presente em amostras de fezes no pasto resiste às condições
ambientais naturais por pelo menos um ano, tornando-se, desta forma, uma
importante fonte de contaminação para outros animais
2.4. Epidemiologia
2.4.1. Distribuição e difusão
A Paratuberculose é uma enfermidade de distribuição mund ial.
Provavelmente seja ela a doença infecciosa mais difundida entre os animais
domésticos e a causa de importantes perdas econômicas na criação de bovinos em
todo o mundo (BUERGUELT e DUNCAN, 1978).
Sua prevalência vem aumentando em alguns países onde tem alcançado
proporções significativas economicamente na pecuária (MENZIES, 1998). Nos
últimos anos, foi possível se observar um significativo aumento no número de
animais infectados com Map, em especial bovinos leiteiros, e no número de espécies
afetadas (DARGATZ et al., 1999; COLLINS, 2002)
A Paratuberculose bovina apresenta distribuição mundial, apesar de alguns
países e regiões possuírem uma infecção pequena ou não-endêmica. Sua
ocorrência, na maioria das vezes, está associada a animais importados, sendo,
portanto, a principal causa de doenças em ovinos e bovinos em países como a Nova
Zelândia, Áustria e Reino Unido (COCITO et al., 1984)
A criação de animais selvagens para proliferação ou preservação de
espécies em extinção tem exacerbado o aparecimento de determinadas doenças
que normalmente são incomuns nessas populações, incluindo, entre outras, a
Paratuberculose (HARRIS e BARLETTA, 2001).
12
2.4.2. Hospedeiro
Pesquisas recentes demonstram que uma grande variedade de espécies
animais podem ser infectadas pelo Map, tanto sob condições naturais quanto
experimentalmente (STABEL et al., 2002; VERNA et al., 2002; PEREZ et al., 2002;
GARCIA MARIN et al., 2002). Normalmente, a Paratuberculose está associada a
bovinos, caprinos e ovinos, sendo também diag nosticada em outros ruminantes,
domésticos ou silvesttres (JONES et al., 1996)
A Paratuberculose é freqüentemente encontrada em ruminantes domésticos
(bovinos leiteiros, caprinos e ovinos) e silvestres (COLLINS, 1999; BARKER et al.,
1993). Suínos e eqüinos também podem ser infectados, mas as lesões são mínimas
ou ausentes. Um microrganismo muito semelhante ao Map foi isolado de seres
humanos com doença de Crohn, e de macacos-cotós com uma íleocolite
granulomatosa semelhante (CHIODINI et al., 1984; JONES et al.,1996).
Muitas cepas do Map não são hospedeiro-específicas, mas este
microrganismo pode ter alguma preferência por determinados hospedeiros, assim,
cepas de ovinos parecem ser principalmente encontradas em ovinos, mas nada
impede de infectar outras espécies. As cepas bovinas do Map parecem ter uma
distribuição mais ampla na grande maioria das espécies (BLOOD et al., 1991,
CLARKE, 1997).
A infecção também ocorre em muitas espécies selvagens e exóticas. A
enfermidade pode acometer búfalos e ruminantes que vivem em cativeiro, como os
veados, renas, antílopes, camelos e lhamas. Os camundongos e hamsters também
são susceptíveis e usados extensivamente em trabalho experimental. A habilidade
do Map em infectar diferentes espécies de animais é um fator importante no controle
da Paratuberculose (BLOOD et al., 1991).
A prevalência da Paratuberculose tem aumentado drasticamente em
fazendas de criação de veados na Nova Zelândia nos últimos anos. A ocorrência da
doença clínica em animais com idade inferior a um ano sugere uma patogênese
específica para a espécie, além disso, acredita -se que a infecção nesses rebanhos
seja proveniente de cepas de Map bovina e ovina (O’BRIEN et al., 2002). Na
Escócia, criações de bovinos podem ser infectadas por fezes contaminadas de
coelhos, presentes nas pastagens ou em alimentos estocados (HUTCHINGS et al.,
2002; GREIG et al., 2002).
13
Os hospedeiros atingidos pelo Map não se limitam apenas aos ruminantes,
existem relatos de casos de Paratuberculose em espécies silvestres de criação livre,
tais como: caprinos das Montanhas Rochosas, Oreamnos americanus (WILLIAMS et
al., 1979); veados axis, Axis axis (RIEMANN et al., 1979); veado roe, Capreolus
capreolus (HILLERMARK, 1966); e ovino Bighorn, Ovis canadensis (WILLIAMS et
al., 1979), citados por GOMES, 2002).
MACHACKOVA-KOPECNA et al., (2005) relatam a presença de M. avium
avium e Map em órgãos de veados Red, Cervus elaphus, da região de Rokycany,
parte oeste da Republica Tcheca, e acreditam que esses animais são mais
susceptíveis que os bovinos.
A Paratuberculose também foi diagnosticada em amostras de tecido de
Bisão, Bison bison, suspeitos, da América do Norte, abatidos devido às normas
previstas pelo programa de vistoria da Paratuberculose (BUERGELT e GINN, 2000).
2.4.2.1. Susceptibilidade de idade, raça e aptidão
Os animais jovens são mais susceptíveis à infecção do que animais adultos.
Estes podem se tornar infectados, mas são menos prováveis de desenvolverem a
doença, e, normalmente, recuperam-se da infecção. A idade crítica para
susceptibilidade de uma infecção que irá, decisivamente, produzir uma doença
clínica é de, aproximadamente, seis meses de idade (COLLINS, 1994; BARKER et
al., 1993). Segundo BLOOD et al. (1991), animais jovens com idade inferior a 30
dias são mais susceptíveis à infecção orofecal.
A resistência relacionada à idade se resume na habilidade dos macrófagos do
animal resistente em impedir o crescimento intracelular da bactéria (BARKER et al.,
1993). Acredita-se que a presença de um gene conhecido como “Natural Resistance
Associated Protein 1 Macrophage” (NRAMP1) tenha alguma participação na
resistência genética aos patógenos intracelulares, tais como: M bovis., BCG e
micobacterias atípicas. Embora ainda não tenha sido demonstrado, este gen pode
ser importante na fase inicial da infecção pelo Map (KOETS et al., 1999;
MACKINTOSH et al., 2000). O gene NRAMP1 atua na função fagolisossomal dos
macrófagos alveolares em infecções como a tuberculose humana (POLLOCK e
NEIL., 2002).
14
A susceptibilidade em relação às raças é uma questão ainda não muito bem
definida. Registros mais recentes sugerem que as seguintes raças bovinas: Channel
Island, Shorthorn e Limousin demonstram uma maior particularidade em relação à
incidência de Paratuberculose bovina, no entanto, este fato pode estar ligado
simplesmente à popularidade dessas duas últimas raças. Da mesma forma, outras
raças aparentemente susceptíveis são os ovinos Scottish Blackface e Shetlands
(WHITHERS, 1959, citado por CLARKE, 1997; CETINKAYA et al., 1997).
Os animais com aptidão leiteira apresentam uma maior prevalência da
doença em relação aos animais de corte, o que se deve ao fato de existir uma
estreita relação entre o confinamento e um maior contato com as fezes
contaminadas (MERKAL et al.,1987).
2.4.3. Fatores de risco
Estudos experimentais têm demonstrado que a infecção é favorecida pela
presença de animais jovens e pelas altas doses do microrganismo no ambiente.
Outros fatores considerados como de risco são: propriedades com criação intensiva,
solos ácidos, deficiência alimentar, estresse, transporte de animais, períodos de
lactação e parição e imunossupressão, devido a alguns agentes como o vírus da
diarréia bovina-BVDV (CHIODINI et al., 1984; BLOOD et al., 1991).
CETINKAYA et al (1997) demonstraram que, na Inglaterra, as fazendas com
maiores riscos para o aparecimento da Paratuberculose são aquelas onde se tem o
predomínio da raça bovina Channel Islands, onde as criações de veados estão
presentes e onde os sucedâneos alimentares são oferecidos de maneira limitada.
No entanto, a melhoria em relação às condições higiênicas do local e
melhorias das práticas de manejo poderão minimizar o aparecimento da infecção na
maioria dos rebanhos (JOHNSON-IFEARULUNDU e KANEENE, 1998; MUSKENS
et al., 2003).
2.4.4. Infecção
Estudos têm demonstrado que Map é viável por mais de 250 dias em água,
solo, fezes e secreções de animais. Conseqüentemente, a contaminação de um
15
animal no ambiente por meio das fezes de animais infectados é a maneira mais
comum de transmissão (LARSEN et al; 1856 e LOVEL et al., 1944 citados por
CLARKE, 1997).
O longo período de incubação da doença proporciona a disseminação do
agente pelas fezes dos animais infectados por mais de 18 meses, sem que os sinais
clínicos da doença apareçam. São eliminadas em média 5x105 microrganismo/dia
por animal com a forma clínica da doença (CHIODINI et al., 1984). A contaminação
fecal dos tetos, assim como do colostro e do leite, pode levar o recém-nascido a
ingerir grande quantidade do microrganismo. Além desses, pastos, água e outros
alimentos contaminados também podem ser considerados potentes fontes de
contaminação (TAYLOR et al., 1981; CHIODINI et al., 1984).
Apesar de a doença estar mais intensamente confinada ao trato
gastrintestinal e linfonodos mesentéricos, a infecção pode ser disseminada para
outros locais extra-intestinais. Map também tem sido isolado do leite, de feto, de
pulmão e do sêmen (SWEENEY,1996).
Embora as lesões habitualmente fiquem confinadas aos intestinos e
linfonodos mesentérico, a infecção generalizada foi descrita em bovinos, ovinos e
caprinos natural e experimentalmente infectados, podendo-se observar as lesões no
fígado, baço, pulmões, rins, últero, placenta e linfonoodos não-mesentéricos (JONES
et al., 1996). Existem relatos de hepatite granulomatosa causada por Map em
amostras de fígado de bovinos e ovinos (DRIEMEIER et al., 1999; MAHMOUD et al.,
2002)
Pesquisas confirmam a presença de Map em amostras de leite cru (GIESE
e AHRENA, 2000) e em leite comercializado, demonstrando, desta maneira,
que a pasteurização HTST não é totalmente eficaz na eliminação deste agente, logo
o leite representa um veículo de transmissão do Map de bovinos para humanos
(GRANT et al., 2002a)
O trato reprodutor masculino pode ser contaminado, mas a transmissão
sexual não tem sido comprovada (LARSEN e KOPECKY, 1970, citado por CLARKE,
1997). BUERGELT et al.(2004) detectaram, por meio da reação em cadeia de
polimerase (PCR), Map no sêmen e no sangue de touros com sinais clínicos de
Paratuberculose. RAMOS et al. (1986) relatam um caso de Paratuberculose bovina
em uma central de inseminação artificial, no Rio Grande do Sul, em que Map foi
16
isolado mediante exame bacteriológico de amostras de intestino delgado, fezes,
linfonodos mesentéricos, próstata e do sêmen do animal.
A infecção intra-uterina também ocorre, mesmo quando a mãe é
clinicamente sadia. Fetos de bovinos podem ser infectados no primeiro trimestre de
gestação. Uma prevalência de 26% tem sido registrada para infecções intra-uterinas
quando as mães são culturas positivas, sugerindo, desta maneira, que esta rota de
infecção pode ser epidemiologicamente significante (SEITZ et al.,1989; BARKER et
al.,1993). O isolamento de Map, a partir de órgãos reprodutivos de touros
reprodutores e, conseqüentemente, do sêmen desses animais, representa uma fonte
de infecção para o ambiente uterino das fêmeas (AYELE et al., 2004).
2.4.4.1. Fases da infecção
O longo período de incubação e a grande variedade de estágios da doença
são características da Paratuberculose. Os animais infectados passam por um
espectro de mudanças imunológicas e morfológicas (COCITO et al., 1994). Animais
em um rebanho infectado são agrupados de acordo com o estágio da infecção
(PAVLIK et al., 2000). A doença possui três estágios: (1) fase subclínica, sem
eliminação do agente; neste o processo infeccioso se desenvolve sem que haja a
eliminação da bactéria; (2) fase subliclínica excretora, durante a qual a concentração
da micobacteria na mucosa intestinal e no lúmem intestinal aumenta
progressivamente, (3) fase clínica e excretora, caracterizada por uma intratável
diarréia crônica e pelo aparecimento dos sintomas de um processo infeccioso
generalizado (COCITO et al., 1994; BUERGUELT et al., 2000).
Dependendo da relação entre o agente e o hospedeiro, os animais podem
ser classificados como: (1) infectados resistentes, com os animais desenvolvendo a
resistência rapidamente, controlando a infecção e não sendo eliminadores; (2)
animais intermediários, animais que não conseguem controlar completamente a
infecção, alguns controlam a doença parcialmente e podem eliminar o agente
intermitentemente, e outros incubam a doença tornando-se grandes eliminadores do
agente, e (3) clínicos, após a ingestão dos microrganismos, estes penetram na
mucosa intestinal e são fagocitados pelos macrófagos que se proliferam em grande
número e infiltram na submucosa intestinal, causando diminuição na absorção de
17
proteínas e diarréia crônica, resultando em uma síndrome entérica de má absorção
(BLOOD et al., 1991).
2.4.5. Morbidade e mortalidade
A incidência de casos clínicos de Paratuberculose em um rebanho,
normalmente, é baixa, dificilmente atinge 5% dos animais adultos. Os bovinos que
desenvolvem a doença clínica, geralmente, são aqueles que se infectaram nas
primeiras semanas de vida. A doença clínica manifesta-se, normalmente, em
animais com idade superior a dois anos. A taxa de mortalidade é menor que 1% e,
raramente, pode atingir 5 a 10% dos animais (BLOOD et al., 1991).
Fatores de estresse, como parto e má nutrição, podem desencadear o
aparecimento de sinais clínicos da doença. Portanto, vacas leiteiras de alta
produção possuem maior possibilidade de apresentarem a doença clínica, caso
tenham sido infectadas quando jovens. A infecção é mais freqüente em bovinos
confinados, em função da maior contaminação do ambiente pelas fezes
(BENEDICTUS et al, 1987; KREEGER, 1991; BLOOD et al., 1991).
A detecção dos sinais clínicos da Paratuberculose em um rebanho
representa simplesmente a ponta de um iceberg. Vários outros animais infectados
podem estar assintomáticos (MENZIES, 1998). Rebanhos com 1% a 5% de vacas
afetadas podem ter mais de 50% de bovinos jovens atuando como transmissores
assintomáticos e como carreadores subclínicos (SHERMAN et al., 1990; COLLINS,
1994).
2.4.6. Perdas Econômicas
A Paratuberculose é responsável por grandes perdas econômicas na
pecuária, devido à redução na produtividade, maior susceptibilidade dos animais a
outras doenças, ao aumento do custo sanitár io e à maior taxa de descarte precoce.
Está sendo considerada uma das mais sérias e dispendiosas doenças capaz de
afetar bovinos de leite e corte e, em especial, animais de raças puras (COLLINS,
1994; HUTCHINSON, 1996).
18
É considerada uma das mais devastad oras doenças infecciosas do gado
leiteiro nos Estados Unidos da América (EEUU), proporcionando perdas de US$ 1,5
bilhões por ano (JONES, 1989).Mediante experimento, BENEDICTUS et al. (1987),
na Holanda, observaram que a produção de leite medida da segunda à ultima
lactação dos animais de um rebanho contaminado com Map, caiu 19,5% nos
animais com sintomas clínicos da doença e 16% nos animais assintomáticos.
WILSON et al. (1996) calcularam as diferenças econômicas associadas com
a infecção subclínica e a produção de leite nas diferentes lactações. Eles sugerem
que a forma subclínica da Paratuberculose começa a causar prejuízo durante a
segunda lactação e estimaram as perdas em US$ 160 na terceira lactação e US$
300 em lactações posteriores. Outras perdas associadas com a Paratuberculose
subclínica são a alta taxa de mastite, infertilidade e aumento da taxa de descarte
(ABBAS et al., 1983).
Nos Estados Unidos da América, as perdas econômicas, em rebanhos
leiteiros infectados pelo Map, chegam a grandes proporções. Elas se tornam mais
consistentes ainda (US$ 245 por vaca), quando mais de 10% das vacas de
produção apresentam sinais clínicos da doença. No entanto, quanto maiores são os
custos com a doença, maiores são os incentivos para a implementação de
programas de controle da Paratuberculose. A estimativa Americana do custo da
Paratuberculose, anualmente, para a indústria de leite é de US$ 22 a 27 por fêmea,
devido ao baixo rendimento e ao maior custo com reposição de animais ( OTT et al.,
1999).
Maiores perdas econômicas podem ser atribuídas a partir do momento em
que confirmarem o papel do Map na etiologia da doença de Chron, e este passar a
ser incorporado à lista de agentes infecciosos transmitidos por alimentos.
Certamente, o impacto econômico para a indústria de alimentos será enorme
(KENNEDY e BENEDICTUS, 2001)
2.4.7. Levantamento Epidemiológico
Em diversos países do mundo, a Paratuberculose pode ser diagnosticada.
Rebanhos com boas práticas de manejo podem ter uma prevalência de infecção
menor, enquanto que outros, com manejos mais deficientes, têm uma taxa de
19
infecção maior. Normalmente, os levantamentos epidemiológicos são realizados em
rebanhos leiteiros e apresentam uma variação muito grande dos resultados. Isso
ocorre principalmente devido às diferen ças em relação à sensibilidade e
especificidade de cada método diagnóstico utilizado (CETINKAYA et al., 1997).
A melhor maneira de se mensurar o índice de infecção de um rebanho é
utilizar testes diagnósticos objetivos. No caso da Paratuberculose, testes
sorológicos, como o teste ELISA, e a cultura de fezes, podem ser usados. No
entanto, é importante lembrar que ambos os testes têm em torno de 50% de
sensibilidade na detecção de infecções subclínicas, conseqüentemente, se 5% do
rebanho testado for positivo (prevalência aparente), isso significa que o dobro de
fêmeas (10%) poderão estar infectadas (prevalência verdadeira) (COLLINS, 1994).
O primeiro registro da prevalência da doença de Johne foi limitado a estudos
realizados em matadouros, onde MERKAL et al . (1987) realizaram a biópsia dos
linfonodos mesentéricos, localizados na região do cecum de 7.454 bovino abatidos
em 76 matadouros dos Estados Unidos da América e Porto Rico. Os autores
registraram uma prevalência de 2,9% para bovinos de leite e 0,8% para bovinos de
corte (citado por THORNE e HARDIN, 1997).
Uma estimativa da soroprevalência da Paratuberculose em Missouri (EEUU)
demonstrou que, de um total de 1954 amostras de soro de bovinos de leite e de
corte oriundos de 89 rebanhos randomicamente selecionados, (8%, ±3) e (5%,±2)
dos bovinos leiteiros e de corte, respectivamente, estavam infectados. Do total de
rebanhos analisados, foi detectada a presença de animais infectados em 74% dos
rebanhos leiteiros e em 40% dos rebanho de corte (THORNE e HARDIN, 1997).
ARNOLD et al. (1983), em Wisconsin (EEUU), estimaram a prevalência em
10,8% dentre as 991 amostras de válvulas ileocecais trabalhadas. De LISLE e
MILLESTONE (1993), na Nova Zelândia, estimaram a prevalência da infecção em
rebanhos leiteiros em 16%, utilizando amostras post-mortem. CETINCAYA et al.,
(1998), na Inglaterra e Gales, estimaram a prevalência em 17% dos 2953 rebanhos
testados. WELLS et al. (1999), nos Estados Unidos da América, estimaram que 20%
das 1000 propriedades leiteiras distribuídas em 20 estados americanos estavam
infectadas com Map.( citados GOMES et al., 2002).
Por meio de um estudo da soroprevalência da Paratuberculose em rebanhos
bovinos na Bélgica, foi observado um índice de infecção em torno de 10% em
20
rebanhos leiteiros, 3% nos rebanhos de corte e de 11% nos rebanhos mistos
(BOELAERT et al., 2002).
Diante de uma avaliação da presença do Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis em uma importante região leiteira do Uruguai, amostras de 720
fêmeas foram testadas pelo teste de ELISA comercial e se detectou uma
soroprevalência aparente de 16,02% (±2,58), além disso, 72% dos rebanhos
estudados foram positivos (PIAGGIO et al., 2002).
No Brasil, alguns trabalhos em relação à soroprevalência de Partuberculose
no rebanho vêm sendo feitos. Apesar de serem trabalhos isolados, permitem uma
idéia da estimativa da enfermidade em nosso país.
No Mato Grosso do Sul, RIVERA (1996), utilizando teste de ELISA, estimou
a soroprevalência em 46% das 639 amostras testadas, oriundas de cin co rebanhos
de corte.
Em São Paulo, LARANJA DA FONSECA et al. (2000), também utilizando o
teste de ELISA, estimaram a doença em 37,9% das 403 vacas testadas em 20
rebanhos leiteiros.
No Rio de Janeiro, FERREIRA et al. (2001) estimaram a soroprevaslência
da doença em 16% das 1004 amostras de soro testadas por meio do Kit comercial
de ELISA, de origem australiana.
No Rio Grande do Sul, GOMES et al. (2002) isolaram e identificaram Map
em oito vacas, importadas da Argentina, com sintomas de Paratuberculos e. Os
mesmos autores, utilizando o teste de ELISA adsorvido, estimaram a infecção em
39,8% dos 314 bovinos testados.
2.5. Patogenia
2.5.1. Localização das lesões na fase inicial da infecção
Assim como ocorre em outras infecções micobacterianas, Map é um agente
infeccioso que tem como células-alvo os macrófagos, com uma afinidade em
especial pelos macrófagos do trato gastrintestinal. A infecção dos macrófagos
intestinais ocorre rapidamente após a ingestão do Map. O fato de esse agente
persistir intracelularmente e o desenvolvimento das lesões ser lento são
21
características cardinais da Paratuberculose e que ainda não estão bem entendidas
(CLARKE, 1997).
As lesões inflamatórias se encontram dispersas por todo o trato
gastrintestinal, sendo, predominantemente, localizadas nos "Gut Associated
Lymphoid Tissue” (GALT), tecido linfóide associado ao intestino delgado. Nos
ruminantes, os GALT são composto de agregados de folículos linfóides, que formam
as placas de Peyers (PPs). No jejuno, são encontradas placas de Peyers múltiplas e
discretas, já no íleo é encontrada uma única e contínua placa (SIGURÕARDÓTTIR
et al., 2004).
Nos estudos realizados sobre a patogênese da Paratuberculoses em várias
espécies, é comum a observação de lesões associadas aos GALT, prin cipalmente
no estágio inicial da infecção. Esta associação pode ser o resultado de uma
propriedade funcional específica dos GALT e do mecanismo utilizado pelo Map para
explorar a imunobiologia do intestino de mamíferos (COLLINS, 1999;
SIGURÕARDÓTTIR et al., 2004).
2.5.2. Entrada e sobrevivência do Map na mucosa intestinal
Após ingestão, o microrganismo sofre endocitose pelas células M da
camada externa da cúpula que reveste o tecido linfóide organizado das placas de
Peyer (GALT) do jejuno e, principalmente, do íleo (MOMOTANI et al., 1988; GARCIA
MARIN et al., 1992). Existem evidências de que algumas células epitelióides das
vilosidades próxima à camada externa da cúpula se tornam contaminadas, no
entanto, os enterócitos localizados em outras áreas não são afetados (GARCIA
MARIN et al., 1992). A partir daí, a micobactéria, intacta ou degradada, é
transportada no interior de vacúolos formados nas células M até os macrófagos
presentes nas áreas intra e subepiteliais das placas de Peyer e na lâmina própria
adjacente (MOMOTANI et al., 1988).
Os macrófagos intestinais são as células-alvo para a infecção do Map.
Vários estudos vêm sendo realizados com o intuito de identificar um receptor de
macrófago específico para Map. Existem alguns receptores nos macrófagos que são
considerados importantes para entrada de micobactérias, entre eles estão: os
receptores de complemento (CR1, CR3 e CR4), os receptores de imunoglobulina
22
(FcR), o receptor de manose (MR), o receptor de lipopolissacarídeo - LPS (CD14),
os receptores de tranferrina e o receptor de proteína A. No entanto, parece ser o
receptor CR3 o responsável pela ligação entre Map e Macrófagos (CHEVILLE et al.,
2001; SCHOREY et al., 1995, citados por SIGURÕARDÓTTIR et al., 2004)
No interior dos macrófagos, Map pode se manter intacto e, a partir daí,
proliferar-se ou ser processado e apresentado aos linfócitos T. Nesta fase, a batalha
entre o hospedeiro e o microrganismo causa uma interação complexa entre
macrófagos e linfócitos, a qual promove a secreção de uma cascata de citocinas, o
recrutamento de células para o local da infecção, a ativação e proliferação de
células. Em infecções causadas por micobactérias, tanto a imunidade humoral
quanto a mediada por células estão envolvidas, sendo esta última a mais importante
para proteção da imunidade (COUSINS et al., 1999; STABEL et al., 2000).
Estudos de ultra-estruturas revelaram que, embora os macrófagos
devessem destruir Map, essa não é uma característica de todos os macrófagos. Em
um estudo realizado in vitro, recentemente, avaliou-se a interação do Map com
monócitos ou macrófagos de camundongos e bovinos, quando se observou que o
destino do microrganismo é influenciado pelo estágio de ativação da célula
fagocítica. Embora os macrófagos possuam um efetivo arsenal químico, capaz de
matar e digerir os microrganismos, é um microrganismo capaz de persistir e
proliferar dentro do macrófago (STABEL et al., 2000; SIGUROARDOTTIR el al.,
2004).
2.5.3. Imunopatogenia
Uma forte resposta humoral e uma fraca resposta imune se desenvolv em
quando a doença progride da fase subclínica para a fase clínica. Células T CD4,
CD8 e populações de células T interferon gama (IFN-ϒ) são os principais tipos
celulares envolvidos na imunidade de proteção. Estas células produzem citocinas
que ativam os macrófagos para destruir as micobactérias ingeridas ou causar um
aumento de outras populações de células T, capazes de conter a infecção. Alguns
pesquisadores acreditam na participação do IFN-ϒ como modulador celular na morte
bacteriana em infecções causadas por micobactérias, entre elas, Map (STABEL,
2000; SIGURÕARDÓTTIR et al., 2004).
23
Na doença de Johne, o desenvolvimento da resposta imune tem sido
descrito somente em estudos experimentais. Nestes casos, a imunidade celular
pode ser observada de um a dois meses após a infecção, enquanto a resposta
humoral pode ser detectada de 10 a 17 meses após a infecção (LEPPER et al.,
1989b citado por GOMES, 2002).
O quadro imunológico da Paratuberculose é semelhante ao da lepra
humana. Nas duas patologias, as formas hipereativa e anérgica podem ser
observadas. Na fase hipereativa, característica do estágio inicial da doença, existem
fortes reações imunes mediadas por células que limitam a proliferação do agente
etiológico. Essa fase da Paratuberculose relembra a forma tuberculóide na lepra
humana. Ao contrário desta, na fase de anergia, que ocorre na fase terminal da
doença, pode-se identificar a fase lepromatosa da lepra humana (COCITO et
al.,1994 )
Nos tecidos infectados, formam-se granulomas tuberculóides duran te a
fase da imunidade celular. A principal célula contida nesses granulomas são os
macrófagos com presença de micobactérias. Logo após, formam-se os granulomas
lepromatosos, contendo macrófagos repletos de bacilos (CLARKE, 1997).
2.6. Sinais clínicos
Sobre a primeira observação de Paratuberculose no Brasil, em um touro da
raça Holandesa, com seis anos de idade, importado da Holanda, foram detectados
os seguintes sinais clínicos: diarréia intermitente e fétida, severa emaciação,
caquexia e ausência de febre (SANTOS e SILVA, 1956)
Diarréia persistente, irresponsiva ao tratamento, rápida perda de peso,
apetite normal e ausência de febre são sinais típicos da Paratuberculose bovina. A
diarréia, apesar de crônica, alterna com algumas fases de melhoras, em que o
estado diarréico desaparece (COLLINS et al., 1999). Na doença propriamente dita, a
fase clínica pode ser antecipada devido a fatores de estresse, como parto, lactação
e má nutrição (CHIODINE et al., 1984).
Edema submandibular e em outras áreas tamb ém pode ser visto em casos
avançados da doença. Além disso, a emaciação, com marcante perda de massa
muscular, séria atrofia do depósito de gordura e fluido de efusão na cavidade
24
corporal são freqüentemente observados (BARKER et al., 1993). A anemia é
detectada ocasionalmente e a pele áspera com alopecia e, algumas vezes,
despigmentada podem ser vistas em casos clínicos da doença (BLOOD et al., 1991;
STEHMAN, 1990)
Existe pouca correlação entre a severidade da síndrome clínica e a
severidade das lesões. Mu itos animais que chegam a morrer podem conter lesões
macro- e microscópicas tão sutis que não podem ser notadas a menos que sejam
investigadas. Por outro lado, lesões severas podem ser notadas em animais
relativamente saudáveis (BARKER et al., 1993).
A Paratuberculose bovina subclínica está associada ao aumento dos sinais
inespecíficos como diminuição da produção de leite e transtornos reprodutivos e
uma maior incidência de mastites (MERKAL et al., 1975). No entanto, alguns animais
não exibem uma sintomatologia clínica definida da moléstia. Esta, por sua vez, é
uma característica importante na disseminação da doença (BLOOD et al., 1991).
2.7. Lesões
2.7.1. Lesões macroscópicas
Em casos bem definidos de Paratuberculose, o espessamento da mucosa
intestinal é refletido na dilatação das alças intestinais, as quais apresentam serosas
irregulares, com ondulações e aspecto reticuloso (DRIEMEIER et al., 1999).
Lesões macroscópicas específicas ocorrem no intestino e nos linfonodos
regionais. Os linfonodos mesentéricos, principalmente os ileocecais estão
normalmente aumentados. Algumas vezes, estão notadamente pálidos e
edematosos, especialmente, na região medular. Linfangite e linfangiectasia são
comuns. Os vasos linfáticos se mostram freqüentemente como se fossem cordas
espessadas traçadas da serosa mesentérica até os linfonodos mesentéricos.
Frequentemente, somente a linfangite é observada como alteração macroscópica e
é bastante específica para justificar um diagnóstico presuntivo de Paratuberculose
durante uma necropsia (CHIODINI et al., 1984; BARKER et al., 1993).
As lesões na mucosa podem ocorrer do duodeno até o reto, sendo
segmentadas ou contínuas. São mais desenvolvidas na região do íleo terminal e na
parte inicial do intestino grosso. A região da válvula íleo cecal é também bastante
25
afetada, normalmente, mostrando-se com tamanho aumentado (CHIODINI et al.,
1984).
A ausência de um colabamento completo da mucosa intestinal do íleo foi
detectada por GOMES (2002) em casos de lesões acentuadas. O lúmem do íleo era
mantido mesmo sem conteúdo no seu interior. A mucosa ileal se mostrava altamente
espessada quando comparada com outras áreas do intestino.
A alteração macroscópica clássica é o espessamento difuso da mucosa, a
qual está revestida com rugas transversais, semelhantes às circunvoluções
cerebrais. Esta acentuada hipertrofia da mucosa, normalmente observada no
intestino delgado lhe confere um aspecto nitidamente cerebróide, sendo tal lesão
proveniente do acúmulo de células inflamatórias crônicas e edemas na mucos a e
submucosa (GOMES, 2002; SANTOS e SILVA, 1956)
Segundo RAMOS et al. (1986), as alterações macroscópicas, restritas ao
intestino delgado e aos linfonodos mesentéricos, resumiam um quadro de enterite,
caracterizada pela hipertrofia da mucosa intestinal e pelo aspecto cerebróide da
mesma, além do aumento de volume dos linfonodos.
A mucosa intestinal, em alguns casos, pode apresentar áreas levemente
avermelhadas devido à congestão ou a múltiplas petéquias hemorrágicas, as quais
podem ser detectadas em todo trato intestinal, tanto no intestino delgado quanto no
grosso (DACORSO FILHO et al., 1960).
O reconhecimento de um leve espessamento da mucosa deve ser
considerado um caso suspeito. Quando são observadas lesões macroscópicas bem
desenvolvidas, as alterações microscópicas são óbvias. Já nos bovinos, nos quais
as lesões macroscópicas são mínimas ou ausentes, as alterações microscópicas
são mais sutis (BARKER et al., 1993).
2.7.2. Lesões microscópicas
Em estudo realizado por DRIEMEYER et al. (1999), as principais alterações
microscópicas foram observadas no intestino delgado, mais especificamente no
jejuno e no íleo, nos vasos linfáticos do mesentérico e nos linfonodos mesentéricos,
e incluíam enterite, linfangite e linfadenite granulomatosa. Os autores ain da
relataram que alguns animais avaliados apresentavam lesões na porção ascendente
do cólon, caracterizando-as como lesão difusa na submucosa.
26
DACORSO FILHO et al. (1960) descreveram os achados histopatológicos de
três bovinos da raça Jersey, provenientes das regiões de Petrópolis e de Bangu,
com diagnóstico de Paratuberculose. Os achados histopatológicos eram evidentes
tanto no intestino delgado quanto no grosso e, segundo os autores, havia o domínio
de um infiltrado de elementos histiocitários de núcleo s vesiculosos, dispostos
excentricamente no abundante citoplasma acidófilo. As células histiocitárias eram
volumosas, os seus limites não eram nítidos, tendo sido comum achar, entre elas,
grande número de células multinucleadas, gigantócitos, em que os núc leos
vesiculosos se dispõem na periferia do citoplasma, dando -lhes, às vezes, um
aspecto de ferradura ou de coroa. Junto ainda aos histiócitos, foram observados
células linfocitárias e, menos freqüentemente, plasmócitos, dispostos tanto nas
mucosas quanto nas submucosas dos intestinos. Nas camadas musculares, assim
como na subserosa, foram encontrados raros acúmulos desses elementos
histiocitários, uni e multinucleados assumindo aspecto granulomatoso. É importante
ressaltar que não foram detectadas lesões granulomatosas e nem detectados BAAR
em quaisquer outros órgãos a não ser no intestino e linfonodos.
Os achados microscópicos detectados em amostras de intestino delgado,
grosso, válvulas íleocecais e linfonodos mesentéricos de 16 fêmeas abatidas,
oriundas de rebanhos leiteiros infectados e não -infectados com Map, foram
analisados e se pôde evidenciar, na mucosa intestinal, muitos granulomas
localizados na lâmina própria e no topo das vilosidades. No linfonodos mesentéricos,
esses granulomas foram vistos predominantemente na área paracortical adjacente e
nos sínus capsular. Nas seções de intestino, observaram-se um grande número de
lesões, microgranulomas e BAAR que foram também localizados na túnica
submucosa, na placa de Peyer e em outras áreas da submucosa. Esses
microgranulomas, na mucosa intestinal, continham um irregular acúmulo de
macrófagos e células epitelióides, já os linfonodos continham acúmulo de
macrófagos e células epitelióides, formando ninhos (HUDA e JENSEN , 2003).
Um reprodutor da raça Holandesa, com suspeita de Paratuberculse, foi
necropsiado e amostras de intestino delgado e linfonodos mesentéricos foram
processados e corados para a avaliação histológica. As amostras de intestino
delgado evidenciaram espessamento da mucosa e submucosa, acúmulo de células
epitelióides, presença de células gigantes multinucleadas e alterações na estrutura
anatômica das vilosidades. A presença de células epitelióides e células gigantes
27
também foram vistas nos linfonodos mesentéricos. Um infiltrado de células
mononucleares e eosinófilos foram percebidos na lâmina própria, mucosa e
submucosa. Os autores, RAMOS et al. (1986), relatam ainda, na serosa, um
infiltrado focal de células mononucleares, o qual foi capaz de atingir as camadas
musculares. Neste experimento, com o auxílio da coloração de ZN foi possível
visualizar BAAR no interior das células epitelióides e células gigantes nas amostras
de intestino e linfonodos mesentéricos.
Por meio da microscopia, pôde-se observar, na lâmina própria, um infiltrado
difuso de linfócitos, células plasmáticas e um grande número de eosinófilos
(BARKER et al., 1993).
Em casos bem definidos, as vilosidades estão moderadas ou severamente
atrofiadas, e os macrófagos estão dispostos nas vilosidades e na lâmina própria,
como parte de um grande infiltrado de célula inflamatória de maneira focal ou difusa.
Algumas células gigantes de Langhans podem estar presentes. O infiltrado
inflamatório pode separar ou deslocar as criptas, que são alongadas com epitélio
hiperplásico. As criptas podem estar distendidas com muco ou com células
descamadas, provavelmente, devido à compressão e obstrução por vários meses,
proporcionadas por edemas e células inflamatórias. Grande quantidade de células
epitelióides pode acumular-se na submucosa (SANTOS e SILVA, 1956, BARKER et
al., 1993).
Segundo GOMES (2002), após uma avaliação histopatológica dos animais
com Paratuberculose necropsiados em seu experimento, a maior freqüência de
reações inflamatórias foram observadas na mucosa intestinal e nos linfonodos
satélites. Nestes últimos, a inflamação granulomatosa afetava as regiões cortical e
medular e consistia em um infiltrado composto por grande quantidade de
macrófagos e células gigantes de Langhans nos seios subcapsulares e medulares.
A linfangite é uma das alterações mais consistentes. Inicialmente, os vasos
linfáticos estão rodeados por linfócitos e células plasmáticas e podem conter
aglomerados de células epitelióides no seu lúmem. Granulomas podem ser
formados na parede dos vasos e se proje tarem para o lúmen. Em casos avançados,
uma linfadenite granulomatosa pode ocorrer nos linfonodos mesentéricos e em
outros órgãos e tecidos, onde os bacilos também podem ser isolados. Em caso de
bovinos, somente existe descrição de lesões no fígado, linfonodos hepáticos e, mais
raramente, nos rins e pulmão. Normalmente, são descritos como granulomas focais
28
e, mais comumente, encontrados no fígado, onde os focos de células epitelióides e
linfócitos são encontrados dispostos no parênquima. Nestas lesões, os bacilos
podem ser visualizados (CHIODINI et al., 1984; KREEGER, 1991, BARKER et
al.,1993)
Normalmente, lesões patognomônicas consistem de um infiltrado de células
epitelióides e células gigantes de Langhans na lâmina própria da mucosa intestinal,
na placa de Peyer e no córtex dos linfonodos mesentéricos (OIE, 2000)
Alguns autores comparam as lesões histopatológicas da Paratuberculose de
ovinos com as de outras micobacterioses, tais como, a tuberculose humana e a
lepra. Classificam-nas como lesão multibacilar ou lepromatosa, na qual o macrófago,
contendo grande número de micobactéria, é a principal célula inflamatória; e lesão
paucibacilar ou tuberculóide, na qual o infiltrado inflamatório é composto de linfócitos
e alguns macrófagos, contendo pouco ou nenhum microrganismo (CARRIGAN e
SEAMAN 1990; CORPA et al., 2000).
Em um estudo realizado com ovinos adultos, tentou -se descrever um espectro
de lesões microscópicas em casos clínicos e subclínicos de Paratuberculose. Os
parâmetros para classificação das lesões histopatológicas foram os propostos por
PEREZ et al. (1996): (1) presença de lesões granulomatosas; (2). localização dos
granulomas em diferentes regiões e camadas do intestino; (3) intensidade e
distribuição das lesões; (4) tipo de célula presente no in filtrado inflamatório e (5)
presença e número de BAAR nas lesões (citados por CORPA et al., 2000)
O diagnóstico da Paratuberculose clínica baseado nas alterações
morfológicos é um desafio para os patologistas. Torna-se difícil ainda quando o
diagnóstico histológico é realizado em amostras subclínicas de Paratuberculose.
Para a obtenção de sucesso com esse tipo de diagnóstico, variados linfonodos
mesentéricos devem ser coletados e examinados para comprovar a presença de
microgranulomas e BAAR. Para tanto, os patologistas devem utilizar um roteiro
uniformemente estabelecido e critérios morfológicos para o diagnóstico subclínico da
Paratuberculose (BUERGUELT e GINN, 2000).
29
2.8. Diagnóstico
2.8.1. Diagnóstico clínico
O diagnóstico clínico, associado aos dados epidemiológicos, permite
suspeitar da existência de Paratuberculose em um rebanho. Geralmente, é um
processo crônico que se apresenta em forma de caso raro. Animais com diarréia
persistente e edemaciados devem ser considerados suspeitos. (GOMES, 2002)
2.8.2. Diagnóstico diferencial
Os sinais clínicos da Paratuberculose são comuns a várias outras
enfermidades. No entanto, é de grande valia se fazer um diagnóstico diferencial com
outras doenças crônicas caquetizantes como: estados severos de desnutriçã o,
tuberculose, deficiência de ferro e cobalto, intoxicação por molibidênio, intensas
parasitoses gastrintestinais, enfermidades hepáticas crônicas e abcessos internos
(BLOOD et al., 1991).
2.8.3. Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial da Paratuberculose é dificultado pelo lento
crescimento do Map e pela resposta imune complexa que é montada pelo
hospedeiro frente ao agente. Durante o início da fase subclínica, o hospedeiro
apresenta uma resposta celular que é caracterizada por uma forte rea ção de
hipersensibilidade retardada do tipo IV, com proliferação de linfócitos aos antígenos
do agente e produção de linfocinas estimuladas por linfócitos T sensibilizados. Com
a progressão da enfermidade, ocorre uma diminuição da resposta imune -celular e
predomínio da resposta humoral. A presença de anticorpos não protege o
hospedeiro contra a doença e, no seu estágio final, há perda de resposta celular
específica, permitindo a rápida disseminação da infecção no hospedeiro (STABEL,
2000; GOMES, 2002)
Na realidade, o diagnóstico da Paratuberculose é dividido em duas partes: o
diagnóstico da doença clínica e a detecção subclínica da infecção, que é essencial
para o controle da doença em rebanhos O diagnóstico da Paratuberculose, baseado
30
em achados clínicos, pode ser confirmado pela demonstração do Map nas fezes, por
microscopia, cultura ou por uso de sondas de DNA e reação de polimerase em
cadeia (PCR). Mediante a necropsia, o diagnóstico é feito a partir de achados de
lesões patognomônicas da doença, macroscópicas e microscópicas no intestino, ou
por meio do isolamento do Map de outros tecidos, utilizando meios de cultura
específicos. A detecção de infecções subclínicas depende da demonstração de uma
reação de hipersensibilidade tardia pela Jonina ou pela tuberculina aviária, da
detecção de anticorpos específicos mediante sorologia ou da cultura de Map a partir
das fezes. A cultura do Map pode ser obtida de fezes ou tecidos, após as amostras
receberem tratamentos para a eliminação de contaminantes, são seguida mente
inoculadas em meio artificial, com ou sem o fator de crescimento (micobactina), que
é essencial para o crescimento do microrganismo (OIE, 2000)
A escolha de um teste diagnóstico depende das circunstâncias e do grau de
sensibilidade requerida para uma avaliação individual do animal ou do nível do
rebanho (COLLINS, 1996).
Os testes diagnósticos preferencialmente os utilizados para diagnosticar a
Paratuberculose, podem ser divididos em duas principais categorias: métodos para a
detecção do agente e métodos de detecção de anticorpos específicos presentes no
soro. Os testes para detecção do agente incluem cultura bacteriana, sondas
genéticas e exame histológico de tecidos-alvo para detecção do bacilo álcool-ácido-
resistente. Entre os testes para detecção de anticorpos específicos, o teste de ELISA
é o mais amplamente utilizado (BUERGELT e GINN, 2000).
2.8.4.Testes de avaliação da resposta imune -celular
A reação de hipersensibilidade tardia, ou teste intradérmico, tem sido uma
prova de imunidade celular utilizada no diagnóstico da Paratuberculose em bovinos,
apesar da sua baixa sensibilidade e especificidade (LARSEN et al., 1965, LARSEN,
1972, citados por CLARKE, 1997). Os animais infectados com Map demonstram
uma resposta imune do tipo celular, quando se faz a inoculação intradérmica de
determinados produtos micobacterianos como os derivados protéicos purificados
(PPD), tais como a, Jonina e a tuberculina aviária obtidas do cultivo do Map e do
Maa, respectivamente.
31
Assim como no diagnóstico da Tuberculose bovina, o teste cutâneo utilizado
no diagnóstico da Paratuberculose é considerado positivo, quando há um aumento
na espessura da pele maior que 3mm, no local da inoculação, após 24 a 72 horas
(NIELSEN et al., 2001).
Segundo CHIODINI et al. (1984); COC ITO et al. (1994) e COLLINS (1996), o
teste cutâneo no diagnóstico da Paratuberculose bovina não é recomendado, pois
possui baixa sensibilidade e pequena correlação com o estágio de infecção do
animal.
O teste intradérmico (PPD) é um método diagnóstico de baixo valor devido a
muitos animais reagentes estarem infectados com micobacterias do complexo M
avium, presentes no ambiente. Logo, a especificidade deste método pode ser
significativamente melhorada com a utilização de um antígeno purificado de Map
(PAOLICCHI et al, 2003)
A resposta imune-celular em doenças micobacterianas também pode ser
detectada por meio de imunoensaios in vitro. A prova do interferon ? (interferon
gama), por exemplo, utilizada na detecção de infecções causadas pelo Map em
rebanho bovino com casos clínicos e subclínicos de Paratuberculose, demonstrou
animais infectados em todas as fases da doença, revelando, desta forma, que, na
fase subclínica, a prova seria positiva antes mesmo dos animais começarem a
eliminar Map pelas fezes. Com o progredir da enfermidade, os níveis de interferon ?
diminuem em alguns animais, que, por sua vez, se revelam anérgicos a este teste
(STABEL, 1995; SWEENEY, 1996).
Os testes que mensuram a imunidade mediada por célula podem ajudar no
controle da Paratuberculose, se forem capazes de detectar animais infectados com
Map na fase inicial da doença, antes destes se tornarem uma potente fonte de
infecção. O grande problema destes testes é a baixa especificidade. No entanto, em
um estudo realizado para determinação da especificidade da Jonina e do teste do
interferon gama, observou-se que a especificidades desses testes chegam a 97,6%,
se forem feitos em paralelo e se, somente animais positivos em ambos os testes
forem considerados infectados pelo Map (KALLIS et al., 2003).
2.8.5. Testes de avaliação da resposta humoral
32
Os testes sorológicos mais comumente utilizados na determinação da
resposta humoral em diagnósticos de Paratuberculose bovina são: fixação de
complemento (FC), teste imunoenzimático (ELISA) e o tes te de imunodifusão em gel
de ágar (IDGA) (CHIODINI et al., 1984; OIE, 2000).
O teste de FC foi utilizado por muitos anos como teste-padrão em bovinos.
Este teste tem bom resultado quando utilizado em amostras de animais clinicamente
suspeitos, no entanto, não possui suficiente especificidade que lhe permita ser
utilizado como teste de rebanho, quando o propósito é o controle da doença (OIE,
2000). A baixa especificidade do teste de FC está relacionada ao uso de antígenos
vivos e/ou falhas na capacidade de evitar reações cruzadas. Este teste ainda é
utilizado como referência na importação de animais (GILMOUR e GOUDSWAARD,
1972; COLLINS, 1996).
O teste de ELISA é, atualmente, o mais sensível e específico para detecção
de anticorpos para Map no soro. A sua sensibilidade é comparada ao do teste de FC
em casos clínicos, mas, em casos subclínicos, ele é mais sensível. A especificidade
deste teste pode ser aumentada com a utilização de um ELISA pré-adsordido com
M. phlei. Esta técnica tem o objetivo de remover ou bloquear alguns anticorpos
responsáveis por reações cruzadas, pelos resultados falso-positivos (OIE, 2000). O
teste de ELISA tem como importantes vantagens a rapidez, a acurácia e o baixo
custo (COLLINS., 1999).
Existem atualmente dois testes comerciais que são amplamente utilizados: o
Allied ELISA (Allied Monitor Inc. Fayette, Mo) e o CSL -ELISA (Johnes adsorbed EIA,
Commonwealth Serum Laboratories Melbourne Austrália), baseados no antígeno
parcialmente purificado da cepa 18 e no antigeno citoplasmático da cepa VRI 316,
respectivamente. O teste de ELISA, baseado no polissacarídeo lipoarabinomanano
(LAM), utilizado em testes a campo, mostrou perda de especificidade devido a
reações cruzadas com corinebactérias e outras micobactérias (McNAB et al., 1991).
Um ELISA baseado no antígeno A36 foi capaz de detectar de maneira
correta os bovinos infectados, em todos os estágios da doença. Após a identificação
de epitopos, espécie específica na proteína P34, componentes do antígeno A36, da
porção carboxiterminal desta proteína (a362), que contém somente epitopos
espécie-específicos foram utilizados como antígenos no ELISA. O teste de ELISA
utilizando o antígeno a362, foi negativo em testes realizados com animais
33
tuberculosos e positivos para testes em animais com Paratuberculose (De KESEL et
al., 1993, citado por COCITO et al., 1984).
O teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), assim como o teste de
fixação de complemento (FC), não são técnicas muito sensíveis para serem
aplicadas no controle da Paratuberculose. O IDAG é um teste normalmente utilizado
para confirmar o diagnótico de Paratuberculose em animais com sinais clínicos
suspeitos da doença, visto que esse teste se torna positivo em amostras de animais
em estágio avançado da doença (SHERMAN et al., 1989; SHERMAN et al., 1990).
Segundo NIELSEN et al. (2002), na avaliação do teste de ELISA como
método de diagnóstico, é de grande importância o reconhecimento das diferenças
que podem ocorrem nos valores dos testes positivos em animais com mais de uma
parição e em diferentes estágios de lactação. No entanto, nos casos de subseqüente
tentativa de diagnóstico de Paratuberculose, a interpretação desses valores deve ser
cuidadosamente avaliada, sempre levando em consideração o número de parições e
o estágio de lactação.
Os testes de ELISA são mais sensíveis para aqueles animais no estágio final
da doença, no momento em que os sinais clínicos aparecem. Os registros de baixa
sensibilidade dos testes de ELISA estão diretamente relacionado aos dos casos em
que os animais eliminam poucas bactérias pelas fezes (“low shedders”), que são
somente detectadas pela sensibilidade da cultura. O teste de ELISA tem maior
sensibilidade (75%), em animais que eliminam grande quantidade de bacilos pelas
fezes “hight shedders”, enquanto em animais “low shedders”, a sensibilidade
observada é de 15% (WHITLOCK et al., 2000).
Um dos métodos de confirmação da Paratuberculose é o isolamento do Map
por meio de cultura. No entanto, de acordo com PAOLICCHI et al. (2003), e outros
trabalhos similares, a detecção de anticorpos por ELISA adsordido é um valioso
método para detecção de animais com esta enfermidade.
2.8.6. Necropsia
A Paratuberculose não pode ser somente diagnosticada pelo exame
superficial do intestino com sinais de espessamento. O intestino deve ser aberto, do
duodeno até o reto, com o objetivo de expor a mucosa. Não existe nenhuma
34
correlação entre a severidade dos sinais clínicos e a extensão das lesões intestinais.
A mucosa, especialmente na parte terminal do íleo, apresenta carac terísticas
patognomônicas de espessamento e corrugação e os linfonodos mesentéricos
podem estar aumentados e edematosos. Além disso, pode-se observar, também, um
aumento de tamanho da válvula ileocecal, que se apresenta, na maioria das vezes,
edemaciada e congesta (BARKER et al., 1993; OIE, 2000).
A baciloscopia direta de amostras da mucosa intestinal afetada e dos
linfonodos mesentéricos podem ser coradas pelo método de Ziehl-Neelsen e
observadas microscopicamente para a detecção de BAAR, que tem características
morfológicas do Mycobacterium avium paratuberculosis. No entanto, bacilos álcool-
ácido-resistentes não estão presentes em todos os casos. O diagnóstico é melhor
confirmado pela coleta de várias amostras de intestino e dos linfonodos
mesentéricos que deverão ser fixados em formol tamponado 10% e processados
histologicamente, utilizando-se a coloração de Hematoxilina e Eosina (HE) e Ziehl -
Neelsen (ZN). As lesões patognomônicas consistem de infiltrado, na lâmina própria,
placas de Payer e no córtex dos linfonodos mesentéricos, de células epitelióides e
células gigantes multinucleadas de Langhans com presença de “grumos” de bacilos
ou alguns bacilos álcool-ácido-resistente dispostos isoladamente. Células gigantes
de Langhans são comuns e contêm poucos bacilos (SANTOS e SILVA, 1956; OIE,
2000).
2.8.7. Bacterioscopia e histopatologia
A bacterioscopia é um método de diagnóstico que consiste na observação
microscópica de bactérias procedentes de esfregaços realizados a partir de fezes e
tecidos que podem ser corados pela técnica de Ziehl-Neelsen. O exame
microscópico direto pelo Ziel-Neelsen é fácil e prático, aplicado às amostras colhidas
(mucosa ileocecal e gânglios regionais), durante a necropsia. Apesar de detectar
somente em torno de 46% dos casos clinicamente confirmados mediante o cultivo
fecal (TAYLOR, 1981), é muito utilizado para a confirmação rápida da doença,
principalmente, nos casos de diagnósticos suspeitos, embora apresente baixa
sensibilidade (MERKAL, 1973).
35
O exame histológico é rápido, fácil e barato no diagnóstico da
Paratuberculose bovina. Amostras de tecidos coradas pela técnica de ZN podem
determinar a presença do agente. A visualização de ninhos de BAAR dentro de
macrófagos, especialmente na lâmina própria e submucosa intestinal, geralmente,
está associada ao diagnóstico positivo (HUDA e JENSEN, 2003)
A confirmação microscópica do diagnóstico da Paratuberculose requer a
presença de infiltrado de células inflamatórias, assim como a demonstração
histológica de um ou mais bacilos álcool-ácido-resistentes compatíveis com Map.
Para o animal ser considerado livre de infecção, células granulomatosas e bacilos
álcool-ácido-resistentes, intracelulares, devem estar ausente no tecido examinado.
Uma terceira categoria de diagnóstico inclui animais suspeitos de Paratuberculose,
quando os tecidos revelam microgranulomas que incluem células gigantes tipo
Langhans, mas não demonstram o bacilo álcool ácido resistente (BUERGELT e
GINN, 2000).
2.8.8. Imunoistoquímica
A imunoistoquímica (IHQ), segmento moderno da histoquímica, é um
conjunto de técnicas relativamente recentes cuja crescente utilização tem provocado
grande impacto na patologia humana e veterinária, devido à sua elevada
sensibilidade e especificidade (OLIVEIRA, 1998). Ao combinar técnicas histológicas,
imunológicas e bioquímicas, a imunoistoquímica possibilita a detecção de antígenos
teciduais por meio da utilização de anticorpos específicos e moléculas marcadoras
(GIMENO, 1995). A localização de tais antígenos pode ser feita a partir de tecidos
frescos (cortes de congelação) ou de tecidos já fixados e processados pelos
métodos histológicos convencionais.
O diagnóstico da Paratuberculose, pela imunoistoquímica, mostrou ser mais
sensível que a coloração a.a.r. na visualização do Map (MASSONE et al., 1990).
Entretanto, este procedimento não é específico, não diferenciando as espécies do
gênero Mycobacterium spp, especialmente, o M. bovis (COETSIER et al., 2000).
Uma alternativa no diagnóstico da Paratuberculose foi o desenvolv imento de
procedimentos imunoistoquímico, tendo, como base, a presença de antígenos do
36
agente no tecido, por meio do uso de imunoglobulinas espécie -específica (HINES et
al. 1987; MASSONE et al., 1990; COETSIER et al.,2000).
A demonstração de antígenos localizados nos tecidos, mediante técnicas
imunoistoquímicas, tem por base a conjugação das moléculas de imunoglobulina
com moléculas marcadoras, as quais, geralmente, possuem natureza enzimática,
destacando-se a peroxidase e a fosfatase alcalina, dentre outr as (SILVA e
NOGUEIRA, 2002)
Na maioria dos trabalhos que utilizam a técnica de imunoistoquímica para o
diagnóstico da Paratuberculose, é utilizado o método indireto, empregando a enzima
peroxidase como molécula marcadora de anticorpos. Após a união entre o antígeno
e o anticorpo, a detecção da peroxidase é feita por meio de um processo
denominado revelação, que se baseia numa reação entre a enzima e seu substrato
específico, o peróxido de hidrogênio. Este, por sua vez, reage com a substância
cromógena, obtendo-se como produto final um polímero corado. A substância
cromógena mais utilizada é o “diaminobenzidina tetraidrocloreto” (DAB), que
proporciona um produto final estável, insolúvel em água, de cor amarronzada e de
fácil visualização em microscópio óptico(GIMENO, 1995).
Mediante o método de imunoistoquímica indireto, várias técnicas vêm sendo
empregadas, como, por exemplo, a técnica da peroxidase -antiperoxidase (PAP), que
consiste na utilização de um anticorpo primário (que se conjuga com o antígeno
específico nos tecidos), um anticorpo secundário e um complexo de três moléculas
de peroxidase e dois anticorpos antiperoxidase (complexo PAP). Outra técnica é a
da avidina-biotina, que é de alta sensibilidade, na qual são empregados anticorpos
primários (que se ligam a antígenos específicos nos tecidos) e secundários,
marcados com peroxidase biotinilada, conjugados com biotina (que se ligam aos
anticorpos primários), este liga-se à avidina por meio da biotina (GIMENO,1995). A
técnica do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC-P), também se baseia na
interação das moléculas de avidina e biotina, que compreende a utilização de um
anticorpo primário não-conjugado, um anticorpo secundário conjugado com biotina e
um complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC-P). A formação do complexo é obtida
a partir da incubação de relativo excesso de avidina com biotina marcada com
peroxidase. Durante a formação desse complexo, a avidina atua como “ponte” entre
as moléculas de biotina conjugadas com peroxidase e estas, por sua vez, possuem
sítio de ligação com as moléculas de avidina. Com isso, ocorre a formação de um
37
intenso complexo composto por numerosas moléculas de peroxidase, o que
determina uma elevação significativa da sensibilidade dessa técnica em relação às
demais. Por fim, uma outra técnica que também vem sendo utilizada no diagnóstico
de Imunoistoquímica para o diagnóstico da Paratuberculose é a técnica da
estrepavidina-biotina marcada, a qual compreende o emprego de um anticorpo
primário não-conjugado, um anticorpo secundário biotinilado e uma solução de
estrepavidina marcada com peroxidase. Esta é considerada uma técnica de elevada
sensibilidade e de rápida realização (MASSONE et al., 1990; CANCELA e MARIN,
1993; GIMENO, 1995)
Segundo WILEY et al. (1990), o uso de um anticorpo policlonal contra
diferentes micobactérias, entre elas, o Mycobacterium paratuberculosis, em tecidos,
por meio da técnica de imunoistoquímica, serviu para demonstrar que esta técnica
tem sensibilidade maior quando comparada a outros métodos de c oloração, como o
de Kinyoun, Fite e Truant.
No trabalho realizado por CANCELA e MARIN (1993), a técnica de Imuno -
histoquímica foi utilizada em comparação com o método de coloração de Ziehl -
Neelsen, na detecção de Mycobacterium bovis em tecido de bovinos e caprinos com
lesão de tuberculose. O objetivo do trabalho foi investigar o uso da
imunoistoquímica, utilizando o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC-P) como
método para a detecção do M. bovis e fazer uma possível relação com o tipo de
lesão. O método ABC-P, assim como o peroxidase-antiperoxidase (PAP), segundo
PEREZ et al. (1989), citados por CANCELA e MARIN (1993), são conhecidos devido
à capacidade de detectar antígenos de Mycobacterium paratuberculosis em lesões
nas quais a coloração de ZN tiveram resultados negativos.
CORPA et al. (2000) utilizaram a técnica de Imunoistoquímica, e o método
ABC-P, para detectar a presença de Mycobacterium paratuberculosis em amostras
de intestino de caprinos infectados, e, ao mesmo tempo, descreveram o espectro da
lesão na mucosa intestinal e em linfonodos mesentéricos.
MASSONE et al. (1990), utilizando três diferentes técnicas de
imunoistoquímica peroxidase-antiperoxidase (PAP), streptoavidina-biotina (SB) e o
complexo avidina-biotina (ABC) - demonstraram que o uso de técnicas de
imunoperoxidase são melhores que o método de ZN, para a detecção do Map em
amostras de tecido de bovinos, especialmente naqueles casos em que se tem um
pequeno número de Map.
38
Segundo PAOLICCHI et al. (2001), a imunoistoquímica foi conside rada a
técnica mais eficaz na identificação do Map em tecidos de veados infectados. Esta
técnica pode ser amplamente utilizada nos casos em que a detecção bacteriológica
do agente, mediante isolamento, é inviável. Além disso, os autores consideram a
imunoistoquímica como um método mais rápido, quando comparada com o longo
tempo requerido para o crescimento do Map.
A técnica de Imunoistoquímica parece ser superior à coloração de ZN como
método de diagóstico da Paratuberculose em ovinos. No entanto, e ste método pode
ser facilmente aplicado em cortes de tecidos incluídos em parafina que tenham sido
estocados por muitos anos, permitindo, desta forma, um estudo retrospectivo. Em
casos com alterações post-mortem, em que bactérias mortas estão presentes nas
amostras de tecido e não podem ser identificadas por meio da cultura, a IHQ
possibilita uma fácil identificação das mesmas. Apesar de ser mais demorada e mais
laboriosa, a técnica de IHQ é uma valiosa fermenta no diagnóstico de doenças
incidiosas e crônicas, conforme a Paratuberculose (THORESEN et al., 1994).
2.8.9. Bacteriologia
O teste diagnóstico mais utilizado e considerado gold standart na detecção
de animais infectados é o isolamento e cultivo do agente a partir de fezes ou tecidos,
este último em casos de biópsia ou necropsia. É um procedimento muito demorado,
pois requer várias etapas no processamento das amostras, além de um período de
incubação de 8 a 16 semanas. A contaminação das amostras de Map ou meios de
cultura pelos microrganismos contaminantes representa um grave problema para o
diagnóstico, pois pode impossibilitar a leitura das amostras inoculadas. O
processamento de amostras, para o isolamento e cultivo do Map, inclui diversas
metodologias, bem como tratamento com diferentes drogas descontaminantes. Em
alguns casos em que o número de microrganismo é pequeno, como, por exemplo,
no leite, inúmeras técnicas capazes de aumentar a concentração de Map na amostra
são utilizadas, dentre elas, podemos citar a técnica de centrifugação, sedime ntação,
filtração e separação imunomagnética (GOMES, 2002).
O cultivo do Map, a partir de amostras de tecidos, é considerado o método
mais seguro para a detecção de animais com Paratuberculose. As amostras de
39
tecido devem passar por diferentes etapas como , por exemplo: o processo de
digestão do tecido, de descontaminação do inóculo e, finalmente, a inoculação em
meio de cultura e incubação. Map pode ser cultivado na maioria dos meios de
cultura utilizados para o cultivo de outras micobactérias, necessitando, no entanto,
de um aditivo nutricional, a micobactina. Os meio normalmente utilizados são Dubos,
que têm como base o soro: o Herrold Eggs Yolk Médium, que tem como base a
gema do ovo; e o meio Lowenstein-Jensen, que tem como base o ovo completo.
Além desses, podemos lançar mão de meios sintéticos como o Watson -Reid ou as
diferentes variantes do Middlebrook (WHIPPLE e MERKAL, 1983; THOREL e
HAAGSMA, 1987).
RAMOS et al. (1986) relatam que, a partir do exame bacteriológico de
amostras de intestino delgado, fezes, linfonodos mesentéricos e sêmem
provenientes de um touro reprodutor, necropsiado com suspeita de Paratuberculose,
foi possível visualizar colônias características de Map a partir da sexta semana da
inoculação dessas amostras em meio Herrold com micobatina.
As amostras intestinais de oito vacas com Paratuberculose, necropsiadas no
Rio Grande do Sul, foram cultivadas em meio Herrold, enriquecido com micobactina,
revelando o crescimento de colônias bacterianas somente após um período superior
a seis semanas (GOMES, 2002).
2.8.10. Métodos moleculares
Atualmente, as técnicas baseadas na detecção do DNA bacteriano estão
sendo amplamente utilizadas para a elucidação de enfermidades que possuem
dificuldades para serem diagnosticadas pelos métodos conven cionais.
Recentes avanços na área de biologia molecular, em particular, no
desenvolvimento da reação em cadeia de polimerase (PCR), têm oferecido novos
suportes para o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para
detectar determinadas doenças. No caso da Paratuberculose, a identificação de uma
sequência de inserção conhecida como IS900, considerada única para Map, tem
facilitado a utilização do PCR na detecção desse organismo em fezes e em tecidos
(COLLINS et al., 1993).
40
Sondas de DNA estão sendo desenvolvidas para oferecer um método de
detecção do Map em amostras de fezes ou tecidos, com mais rapidez e eficiência. A
utilização de PCR, em especial a seqüência de inserção IS900, possibilita fazer a
diferenciação entre Map e outras micobactérias do complexo avium (PAOLICCHI et
al., 2003).
Atualmente, está sendo utilizada uma modificação na técnica de PCR, que
inclui duas reações de amplificação, utilizando nested primers que pode aumentar a
sensibilidade do teste, possibilitando detectar cerca de 50 organismo/g de fezes
(COLLINS et al., 1993).
Em um estudo-piloto realizado com 46 vacas, com infecção subclínica e
provenientes de rebanhos com casos confirmados de Paratuberculose, uma
avaliação por meio do nested PCR (nPCR) foi realizado, detectando 52% de animais
positivos para Map, quando as amostras de leite e de sangue foram avaliadas.
Contrariamente, somente 39% de bovinos positivos ou suspeitos foram detectados
pelo teste de ELISA. Vários animais positivos foram detectados, mediante o nPCR,
no grupo de animais diagnosticados como negativos pelo teste sorológico ELISA
(BUERGUELT et al., 2004).
Segundo WHITTINGTON et al. (1999), o desenvolvimento de novos
métodos de PCR, para serem utilizados na análise direta de ácidos nucléicos
extraídos de tecido fixado em formol e embebido em parafina, permitirá a
confirmação de muitos casos suspeitos de Paratuberculose, que se encontram
arquivados. Além disso, essa é uma potente ferramenta diagnóstica que pode
auxiliar na confirmação do diagnóstico da Paratuberculose em bovinos, ovinos e
caprinos.
O estudo realizado por MILLER et al. (2002) comprovou que os testes
utilizando PCR em tecido parafinado, ocasionalmente, podem melhorar a detecção
de infecções micobacterianas quando a cultura bacteriana falha, o que auxiliaria no
diagnóstico micobacteriano realizado por muitos laboratório. Os autores registraram
que a sensibilidade do PCR pode ser melhorada quando são utilizadas amostras de
tecidos frescos, já que o método histopatológico de fixação e embebi mento do tecido
em parafina pode degradar o DNA bacteriano.
GARRIDO et al. (2000) demonstraram que a alta sensibilidade do PCR,
comparada com as dificuldades da cultura fecal em amostras de ovinos,
proporcionou o desenvolvimento de um protocolo de extraçã o de DNA de amostras
41
fecais, o freeze-boiling (FB), que demonstrou uma sensibilidade de 94,1% e uma
especificidade de 93,2%.
Atualmente, somente dois fragmentos de DNA espécie-específica têm sido
identificados no genoma do Map. Sondas de DNA têm sido desenvolvidas para
identificação do Map em vários tipos de amostras. Uma das sondas corresponde à
seqüência de inserção IS900, presente em múltiplas cópias no genoma do Map. E a
outra sonda é a F57, um clone recombinante F57 que provou ser específico para o
agente da Paratuberculose. Esta sonda falhou na hibridização com o genoma de
todas as outras micobactérias testadas, por outro lado, reconheceu o Map em todas
as amostras isoladas de animais com Paratuberculose e em humanos com doença
de Crohn (COCITO et al., 1994)
A preparação de uma sonda RNA específica (F57) para detecção de Map
vem proporcionando grandes avanços no diagnóstico da Paratuberculose. A
seqüência de inserção F57 é uma seqüência única do Map, não sendo encontrada
em nenhuma outra micobactéria (POUPART et al.,1993).
O isolamento e a caracterização de uma colônia com suspeita de Map,
oriunda de uma vaca leiteira saudável, identificou uma bactéria contendo uma cópia
de seqüência com 94% de similaridade com a seqüência de inserção IS900,
presente no genoma do Map. Utilizando uma PCR baseada nas seqüências F57 e
us-p34, os autores demonstraram que a bactéria em questão não era Map, nem uma
subespécie de M avium ou M. intracelulare , talvez pudesse ser uma nova espécie de
micobactéria. No entanto, o resultado positivo para amostras clínicas testadas com a
seqüência IS900, mediante PCR direto, deve ser confirmado ou por isolamento do
Map ou pela utilização da PCR que tenha outros alvos no genoma do Map
(ENGLUND et al., 2002).
O registro da amplificação de uma seqüência semelhante a IS900, a like-
IS900, de micobactérias ambientais, demontrou que resultados falsos-positivos
podem ser obtidos de cepas que não são Map. Atualmente, os resultados baseados
somente na seqüência IS900 devem ser interpretados co m cautela. O primer
comumente usado IS900 pode não ser espécie-específico para Map, já que
elementos semelhantes ao IS 900 podem estar presentes em outras micobactérias.
A combinação de dois testes de PCR, que amplifiquem as seqüências de inserção
IS900 e a F5, tem sido superior na identificação do agente da Paratuberculose
(VANSNICK et al., 2004).
42
O resultado de um teste molecular, o duplex PCR, baseado nas sequências
F57 e us-p 34, realizado em amostras de tecido parafinado, foi comparado ao dos
testes convencionais: bacteriológicos e histológicos, incluindo a coloração de Ziehl
Nielsen, mostrando-se sensível o suficiente para detectar e identificar corretamente
micobacterioses com marcantes lesões histológicas (COETSIER et al., 2000).
Segundo RAJEEV et al. (2005), uma combinação de testes diagnósticos
como a cultura, coloração de BAAR e PCR são essenciais para a confirmação do
Map em animais infectados. Em geral, numa rotina no processo de screening de
rebanhos, obtêm-se em torno de 10 – 15% de amostras positivas como resultado
para Map. Se for utilizada a avaliação pelo PCR somente em amostras positivas pela
coloração de BAAR, tem-se uma redução no custo com testes diagnósticos, o que
ajudaria eliminar os resultados falso-positivos.
Outro método que vem dando um importante suporte para o diagnóstico da
Paratuberculose é o “Restriction Fragment Lenght Polimorfismo” (RFLP), que
permite observar o polimorfismo em relação ao tamanho dos fragmentos resultantes
da restrição enzimática. MOREIRA et al. (1999) e VERNA et al. (2000) utilizaram a
técnica de RFLP, para comparar 61 cepas de Map isoladas de bovinos e veados
com as cepas isoladas nos países Europeus. CHOY et al. (1998) desenvolveram um
protocolo para a purificação do Map de mucosa intestinal de caprinos infectados,
utilizando a técnica de RFPL para analisar o organismo geneticamente e compará -lo
com Map de bovinos e outros ruminantes na Argentina. MACHACKOVA-KOPECNA
et al. (2005) utilizaram a técnica de RFLP para fazer um estudo epidemiológico de
duas micobactérias, Map e M. a. avium em um rebanho de veados vermelhos na
região de Rokycany, República Tcheca, e concluíram que o agente causador da
Paratuberculose foi difundido neste rebanho em virtude da importação de veados da
Escócia.
No entanto, o uso de sondas moleculares torna -se complicado pela
presença de inibidores nas amostras clínicas, comprometendo, desta forma, o
sucesso da técnica diagnóstica. Um dos principais problemas relacionados ao uso
de PCR como ferramenta para o diagnóstico é o grande número de reações falso -
negativas quando comparadas às do cultivo tradicional, atribuídas ao limite de
detecção (102 a 105), à presença de substâncias como uréia, hemoglobina e
heparina, que inibem as reações enzimáticas e a lise bacteriana (NIELSEN et al.
2001).
43
De acordo com COETISIER et al. (2000), o diagnóstico molecular, baseado
em PCR, tem como vantagens o potencial para detecção e identificação de
micobactérias diretamente de amostras clínicas. No entanto, no caso de amostras
fixadas e embebidas em parafina, a sensibilidade do teste é diminuída, quando
comparada com a da análise molecular de amostras de cultura. Essa diferença pode
ser explicada pela presença de inibidores na PCR, assim como pela dificuldade de
extração do DNA micobacterino em amostras com pequena carga bacteriana.
Provavelmente, inibidores presentes em amostras clínicas podem diminuir a
sensibilidade da PCR. Em estudo realizado por PAOLICCHI et al. (2003), obteve-se
resultado positivo para reação de PCR em amostras fecais de animais com sintomas
clínicos da doença. Provavelmente, isto ocorreu porque os animais sem sintomas
clínicos liberavam pouca micobactéria pelas fezes.
2.9. Tratamento
O tratamento da Paratuberculose raramente é indicado ou justificável, a não
ser nos casos em que os animais possuem um alto valor genético. O tratamento da
Paratuberculose requer o uso de medicamentos diários por um longo período e
somente os resultados paliativos são observados, em vez de uma cura definitiva (St.
JEAN e JERULGAN, 1991).
Normalmente, o tratamento é antieconômico, possuindo um custo que,
muitas vezes, supera o valor do animal. Além disso, na maioria dos casos, as
melhoras desaparecem quando cessa o tratamento (LARSEN et al., 1950, citados
por GOMES, 2002; BLOOD et al.,1991).
A terapia por meio de antimicrobianos pode reduzir os sinais clínicos da
Paratuberculose, mas não elimina a infecção (MERKAL et al., 1973; BELLOLI et al.,
2001).
Diferentes tratamentos para Paratuberculose têm sido testados. Quatro tipos
de drogas - isoniazida, clofazamine, rifampicina e gentamicina - têm sido analisadas
em testes in vitro e in vivo. Os resultados promissores com os testes realizados in
vitro , quando comparados com os resultados dos testes in vivo, são facilmente
explicáveis se forem ressaltadas as dificuldades de acesso às micobactérias. No
caso da Paratuberculose, o agente etiológico, Map, se multiplica dentro dos
macrófagos ou dentro de outras células da mucosa intestinal ou placas de Peyer. As
44
drogas antimicrobianas possuem uma grande dificuldade para penetrarem no Map
localizado intracelularmente (COCITO, 1994). O progresso no desenvolvimento de
drogas para o tratamento da Paratuberculose está baseado na utilização de drogas
capazes de penetrar em macrófagos e que possam ser usadas na alimentação dos
animais (HARRIS e BARLETTA, 2001)
A vacina contra a doença de Johne foi descrita pela primeira vez na França
por VALLEE e RINGJARD (1926), quando se fez uma inoculação subcutânea de
cepas vivas do Map, não resultando em infecção (CHIODINI, 1993).
A vacinação, geralmente, reduz o número de animais com a forma clínica da
doença, diminuindo o número de animais eliminadores da micobactéria pelas fezes e
o número de animais com infecções intestinais detectáveis. A vacina protege o
animal da doença clínica ou apenas retarda o seu apar ecimento. Essa característica,
de certo modo, pode ser vantajosa, pois coloca a possibilidade de aparecimento da
doença em um período posterior ao período produtivo. Os animais que recebem a
vacina não podem ser considerados livres de Paratuberculose, sendo, portanto,
muito importante a manutenção de medidas eficazes de controle (STUART, 1965;
LARSEN et al., 1978, citados por CLARKE, 1997).
2.10. Controle da Paratuberculose
A prevenção da infecção é a maneira mais efetiva no controle da
Paratuberculose (MUSKENS et al., 2003). Quando não se tem como evitar a
aquisição de novos animais para um rebanho, estes devem ser cuidadosamente
adquiridos de rebanhos com testes negativos e, de preferência, com certificado de
livre de Paratuberculose. Muitos estados nos Estados Unidos da América, assim
como na Austrália, possuem certificados do Programa de controle da
Paratuberculose bovina (COLLINS, 1994; COLLINS, 1999). A identificação da
potencial fonte de infecção, assim como a determinação das rotas de transmissão,
são peças fundamentais no controle desta enfermidade (HARRIS e BARLETTA,
2001).
A difícil tarefa de se fazer um controle eficaz da Paratuberculose está
intimamente relacionada com o longo período de incubação da doença, assim como
a ausência de sinais clínicos nos estágios iniciais da doença, período em que os
45
animais podem estar disseminando o agente infectante pelas fezes, sem apresentar
sinais clínicos da doença (COLLINS e MORGAN, 1991).
O sucesso de um programa de erradicação da Paratuberculose em ov inos,
caprinos ou bovinos somente é possível se forem usadas medidas de manejo
preventivas, vários testes de diagnóstico, vacinação e restrição da movimentação de
animais (BENEDICTUS et al., 2000).
Além das estratégias de manejo, para se ter sucesso no controle e
erradicação da Paratuberculose, são necessárias melhorias nas técnicas de
diagnóstico, possibilitando, de maneira mais rápida, a identificação de animais
infectados no rebanho ou a identificação da maioria dos animais que não estão
liberando a bactéria. Também são de grande importância as pesquisas para a
fabricação de vacinas que previnam a eliminação fecal do Map e a aplicação de
novos métodos terápicos e profiláticos (EMERY e WHITTINGTON, 2004).
Na maioria dos países, as implantações de medidas de controle ainda são
inteiramente dependentes dos recursos individuais das propriedades, tais como:
manejo, força de trabalho e recursos financeiros. A ausência de uma prova
diagnóstica eficiente e eficaz dificulta o controle e a erradicação da Paratuber culose.
Animais infectados em um rebanho podem ser detectados, por meio da aplicação de
provas bacteriológicas, sorológicas e da imunidade celular. Entretanto, esta última
proporciona, na maioria das vezes, um elevado número de resultados falso -
positivos. Para um controle eficiente, há a necessidade de se utilizar testes
apropriados e, atualmente, o teste de ELISA e o cultivo fecal estão sendo os mais
usados, já que os outros testes possuem limitações que impedem os seus usos
como testes de rebanho (COLLINS et al, 1996; COLLINS et al, 1991).
O desenvolvimento de novos testes de diagnóstico (sondas) e imunoensaios
(ELISA) irão ajudar na identificação de animais infectados e na prevenção da
propagação da Paratuberculose. A sonda IS900 identificada por Mc Fadd en e
colaboradores, assim como a sonda F57 e o ELISA a362, podem ser consideradas
novas ferramentas diagnóticas efetivas para estudos experimentais e clínicos
(COCITO et al., 1994).
Os programas de controle da infecção têm como prioridade, mudanças no
manejo do rebanho para limitar a transmissão do Map. Testes de diagnóstico são
usados somente para dar suporte e agilidade aos programas de controle da
Paratuberculose. Testes diagnósticos em programas de controle da
46
Paratuberculose, sem mudanças no manejo do rebanho, são considerados inúteis e
onerosos (KALLIS et al., 2004).
2.11. Saúde pública
A doença de Crohn é considerada, atualmente, uma enfermidade sistêmica,
caracterizada por um processo inflamatório crônico, transmural e recidivante.
Provoca a formação de úlceras, espessamento da parede intestinal e formação de
fístulas em várias partes do trato gastrintestinal de humanos (CLARKE, 1997;
SELBY, 2000);
A similaridade entre as desordens digestivas, como doença de Crohn e a
Paratuberculose, foi primeiramente observada em 1913 por Dr. Dalziel. Em 1932,
Crohn descreveu a doença, e, desde então, vem se tentanto descobrir o agente
etiológico responsável por tal processo inflamatório intestinal (CHIODINI et al., 1984;
ACHESON, 2001; EL-ZAATARI et al., 2001). Essas duas enfermidades que,
normalmente, afetam adultos jovens, são caracterizadas por lesões granulomatosas
crônicas, tipicamente concentradas na região do íleo terminal e que proporcionam o
aparecimento de sinais clínicos de diarréia e perda de peso (CLARKE, 1997).
O agente causal da doença de Crohn ainda não está muito bem
definido.Várias etiologias vêm sendo sugeridas, entre elas, falhas no sistema auto -
imune, fatores genéticos, componentes na dieta alimentar, fatores ambientais e
emocionais e agentes infecciosos (CHIODINI e ROSSITER, 1996; NASER et al.,
2002). Entre os agentes infecciosos, existe uma grande suspeita de o agente causal
ser uma micobactéria, em especial , Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
(Map) (ACHESON, 2001).
Experimento realizado por SANDERSON et al. (1992), utilizando a técnica
de PCR, baseada na seqüência de inserção IS900, aplicada em amostras de DNA
extraído de amostras intestinais, obtidas cirurgicamente de 40 pacientes com doença
de Crohn, 23 pacientes com colite ulcerativa e 40 pacientes-controle sem lesão
inflamatória intestinal, revelou a presença de Map em 26 dos 40 pacientes com
doença de Crohn (65%), em um dos 23 pacientes com colite ulcerativa e em cinco
dos 40 pacientes controle. A presença de Map em 2/3 dos pacientes com doença de
Crohn e em menos de 5% dos pacientes com colite ulcerativa dá sustentação ao
papel do Map na etiologia desta patologia de humanos.
47
Desde que Map foi isolado de amostras intestinais de paciente com doença
de Crohn, existe a controvérsia em relação à sua real participação na etiologia desta
patologia. Sabe-se que o leite pode ser um veículo potencial na transmissão do Map
para população humana (CORTI e STEPHAN, 2002).
Segundo HINES et al., 1987, existem várias evidências de que Map pode
estar presente no leite cru. Isto pode ocorrer devido à contaminação fecal durante a
amostragem ou pela presença da bactéria no úbere pela invasão através do canal
do teto ou como resultado de uma disseminação sistêmica.
GRANTS et al. (2002a) realizaram estudos envolvendo pasteurização e
observaram que Map de leite naturalmente infectado é capaz de sobreviver à
pasteurização hight temperatura short time (HTST), não sendo possível a sua
completa eliminação em amostras naturalmente contaminadas.
A investigação da prevalência de Map em tanque de expansão de leite em
várias regiões da Suiça estimou uma prevalência de Map em rebanhos leiteiros
infectados em torno de 19,7% utilizando um teste baseado em PCR IS900. Das
1.384 amostras de leite, 273 foram positivas, o que mostrou uma ampla distribuição
de Map em rebanhos leiteiros infectados e demonstrou a possibilidade do Map ser
freqüentemente transmitido aos humanos pelo consumo de leite (CORTI e
STEPHAN, 2002).
Embora a cultura bacteriana seja um dos métodos-diagnóstico mais sensível
e apropriado para confirmação ou exclusão da participação de uma micobactéria na
etiologia da doença de Crohn, existem alguns obstáculos que inviabilizam a
execução do método. O fato de o Map ser considerado um microrganismo fastidioso,
de crescimento lento, dependente de micobactina, capaz de apresentar-se em forma
de esferoblasto, impossibilita a utilização do citado método como diagnóstico de
rotina na doença de Crohn (HERMON-TAYLOR et al., 1994).
Há necessidade de novos métodos nos quais Map seja detectado diretamente
de amostras de intestino de pacientes com doença de Crohn. Recentes avanços em
métodos de biologia molecular têm proporcionado melhores resultados na detecção
desta bactéria. Um dos mais populares é o uso da PCR, baseada na amplificação de
uma multicópia da seqüência de inserção IS900, específica do genoma do Map. A
utilização de um duplex-PCR, baseado na seqüência F57 e na p34, poderia
contribuir de forma bem consistente e com maior rapidez para o diagnóstico de
diferenciação entre doenças infecciosas micobacterianas tuberculosas e não -
48
tuberculosas oportunistas, que atingem o homem. Como exemplo, pode-se citar o
uso deste teste diagnóstico em pacientes infectados com vírus HIV tipo 1, nos quais
a prevalência de micobactérias não-tuberculosas é alta; e em pacientes com doença
de Crohn, em que a patogenicidade do Map ainda é questionável (COCITO et al.,
1994; NASER et al., 1999, citados por COETSIER et al., 2000).
49
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Desenho do estudo
O trabalho foi realizado utilizando-se amostras teciduais de quatro animais
com Paratuberculose, sendo três deles necropsiados e um abatido em matadouro,
oriundos de duas propriedades (A e B), localizadas no município de Resende – RJ.
3.2 Características zootécnicas das propriedades estudadas
3.2.1. Propriedade A Propriedade leiteira, com 340 bovinos mestiços de Girolando, com sistemas
de manejo semi-intensivo para produção de leite tipo B. As fêmeas são todas
nascidas na propriedade, só havendo a aquisição de touros autóctones e de sêmen
importado da Argentina e Uruguai.
Segundo o proprietário, nos últimos anos, a produção de leite diminuiu e
ocorreram episódios de diarréia em animais adultos que não respondiam aos
tratamentos. Além disso, alguns animais apresentavam progressiva perda de peso,
caquexia e, por fim, óbito após um quadro de diarréia crônica. O primeiro relato de
óbito com os sintomas característicos da Paratuberculose ocorreu há,
aproximadamente, cinco anos.
Os bezerros recebiam o aleitamento natural e o desmame era espontâneo,
sendo utilizado um bezerreiro comum, com animais de diferentes faixas etárias, com
um alto potencial de contaminação do leite, da água e dos alimentos pelas de fezes.
50
3.2.2. Propriedade B
Também uma propriedade leiteira, com um rebanho de 150 animais
mestiços de Girolando, criados em sistema semi -intenso para produção de leite tipo
C. A grande maioria dos animais desta propriedade havia sido adquirida da
propriedade A, em 2001.
O proprietário relatou que, entre os anos de 2001 e 2002, ocorreram 12
óbitos devido à diarréia crônica intratável e caquexia. Na época, este fato
representou uma grande perda para um rebanho que era de apenas 100 animais. A
principal suspeita da causa mortis foi a Paratuberculose.
Nesta propriedade, os bezerros também recebiam aleitamento natural e
eram desmamados naturalmente. Eram criados em bezerreiros comunitários,
durante as primeiras semanas de vida e, logo após, transferidos para bezerreiros
tipo curral, onde passavam a ter contato com outros animais de diferentes faixas
etárias.
Durante a ordenha, eram mantidos cuidados criteriosos como: limpeza dos
tetos com jatos de água antes da ordenha e remoção das fezes do ambiente,
minimizando assim a contaminação do leite, da água e dos alimentos.
3.3. Processamento das amostras
Após suspeita clínica de Paratuberculose, realização do teste sorológico
(ELISA) e cultura de fezes, três dos animais foram eutanasiados e necropsiados. O
quarto animal foi abatido em matadouro municipal. Foram colhidos fragmentos de
intestinos delgado (duodeno, jejuno, íleo e válvula íleocecal) e grosso (ceco, cólon e
reto) e linfonodos mesentéricos. Essas amostras foram fixadas em formol
tamponado neutro a 10%, incluídas em parafina , cortadas em micrótomo rotativo a
5µm e coradas com Hematoxilina-Eosina (HE). Cortes dos intestinos e linfonodos
mesentéricos foram também corados pela técnica de Ziehl-Neelsen (ZN), para
detecção de bacilos álcool-ácido-resistentes (BAAR) e submetidos ao tratamento
imunoistoquímico (IHQ) para marcação do bacilo.
Parte das amostras das mucosas intestinais, linfonodos e válvulas ileocecais
foram congeladas a -20°C e realizada a cultura do microrganismo, que consistiu no
51
cultivo e isolamento do microrganismo, em meio de cultivo específico Herold eggs
yolk medium (HEYM), enriquecido com micobactina.
Os testes laboratoriais foram realizados no Setor de Morfologia e Anatomia
Patológica (SMAP) do Laboratório de Sanidade Animal/CCTA/UENF, onde foram
executadas as técnicas histopatológicas, seguidas das já citadas colorações.
No setor de Patologia da Universidade Federal Fluminense, instalado no
Hospital Antônio Pedro-Niterói/RJ, foi realizada a técnica de imunoistoquímica.
No Núcleo de Análise Genômica (NAG)/UENF, foram executadas as técnicas
de biologia molecular.
3.4. Metodologia utilizada
3.4.1. Caracterização macroscópica da lesão
As amostras das mucosas intestinais, linfonodos mesentéricos e válvulas
ileocecais, oriundas dos animais necropsiados, foram avaliadas segundo as suas
características macroscópicas: espessamento da mucosa intestinal e aumento de
volume dos linfonodos mesentéricos.
3.4.2. Histopatologia
Consistiu na microscopia de amostras de tecidos cortadas em micrótomo
rotativo semi-automático a 5µm e coradas pelas técnicas de HE e ZN.
3.4.3. Imunoistoquímica:
Utilizando as amostras de tecido contidas em blocos de parafina, foram
selecionados cortes de 4µm e colocados em lâminas previamente silanizadas. As
lâminas, imersas em xilol, foram mantidas em estufa a 60°C por 10 minutos e,
posteriormente, desparafinadas pela passagem das mesmas em xilol (quatro banhos
de cinco minutos cada), hidratadas pela passagem em álcool absoluto e álcool 96%
e lavadas em água destilada.
52
Com objetivo de bloquear a peroxidase endógena, às vezes presente em
determinados tecidos, as lâminas foram banhadas em uma solução de peróxido de
hidrogênio 3% por 30 minutos. Logo após, foram banhadas em água destilada e
iniciada a etapa de recuperação antigênica com tampão citrato pH 6,0 realizada em
banho-maria por 30 minutos à temperatura de 96°C, seguido de resfriamento, em
temperatura-ambiente, por 20 minutos. As lâminas foram lavadas em água destilada
e banhadas em uma solução-tampão TBS-Tween, pH 7,4 - 7,6. Para se evitar
ligações inespecíficas, as lâminas foram incubadas em uma solução de BSA (soro
albumina bovina) e leite desnatado.
O anticorpo primário utilizado foi um anti-M. bovis policlonal, produzido em
coelho (Dako, USA), na diluição de 1:6000. Foi utilizado o kit da marca Dako LSA+.
As lâminas foram processadas conforme protocolo geral do autocorador da marca
Dako (Autostain), segundo especificação do fabricante. A coloração foi revelada
após a incubação das lâminas com a solução cromógena à base de
diaminobenzidina (DAB ).
3.4.4. Cultura
As amostras de intestino provenientes dos animais suspeitos foram
primeiramente congeladas em Freezer, a -2OºC e, logo após, levadas para o
Laboratório de Micobactérias/UFRJ, onde foi realizado o cultivo e isolamento do
Map. O protocolo utilizado foi o proposto pela Organização Internacional de
Epizootias - OIE, 2000.
3.4.5. Reação em cadeia de polimerase - Polymerase Chain Reation (PCR)
Os blocos parafinados com amostras de intestino dos animais estudados
com resultados histopatológicos positivos foram processados pelo método de
biologia molecular, reação em cadeia de polimerase (PCR), seguindo protocolo
adaptado de COETSIER et. al. (2000).
Também foi testada, por este método, uma amostra intestinal de um animal
com suspeita clínica de Paratuberculose, na qual foram detectadas lesões
microscópicas características da doença e presença de BAAR. Esta amostra em
53
bloco parafinado (animal 981) foi cedida do arquivo do setor de Anatomia Patológica
da Universidade Federal Fluminense (UFF).
3.4.5.1. Extração dos ácidos desoxiribonucléicos (DNA) de tecido parafinado:
Inicialmente, os blocos de parafina foram limpos com etanol e duas seções
de 5µm foram obtidas por corte em micrótomo semi -automático. Em seguida, foram
transferidas para um tubo de centrífuga de polietileno estéril contendo 1ml de xilol.
Os tubos foram incubados a 37ºC por 20 minutos, para que os cortes fossem
desparafinados. Logo após, foram centrifugados a 13.201x g por cinco minutos e o
xilol sobrenadante foi descartado. A extração por xilol foi repetida. Uma solução de
95% de etanol e 5% de metanol (1ml) foi adicionada aos tubos, e centrifugados da
mesma forma anterior. O sobrenadante foi descartado e a extração alcoólica foi
repetida. O pellet foi seco em temperatura-ambiente durante a noite.
Em cada tubo contendo as amostras de tecido, foram adicionados 200 µl de
H2O destilada, contendo 0,5% Tween 20 e, em seguida, os tubos foram submetidos
a dois ciclos de fervura e resfriamento por 10 minutos cada, e, finalmen te, uma
última fervura seguida de uma centrifugação a 4000 x g por 20 minutos. O
sobrenadante foi retirado e estocado a - 200C.
3.4.5.2. Amplificação de DNA via PCR:
A partir da seqüência do gene F57, presente no genoma do Map, iniciadores
foram desenhados. O protocolo da PCR utilizado foi adaptado de COETSIER et. al.
(2000) cujo objetivo foi a amplificação da porção 5` da sequência F57. Os iniciadores
utilizados (F57a, F57b, F57c e F57d), suas seqüências de nucleotídeos e suas
localizações no respectivo gene estão resumidos na tabela 1.
A amplificação da seqüência F57 foi realizada utilizando-se um duplo PCR,
ou seja, um nested-PCR. Na primeira reação de PCR, foram usados os iniciadores
F57a e F57b e, na reação posterior, os iniciadores F57c e F57d.
Na primeira PCR, 1µl de cada amostra extraída foi utilizado e a reação foi
padronizada para um volume final de 25 µl, contendo 17,7 µl de água ultrapura, 1 ul
de cada iniciador F57a e F57b (20 pMoles), 0,2µl de 10 mM DNTp Mix, 0,1 µl de taq
polimerase recombinante, 2,5µl de tampão de reação da enzima taq (NH4)2SO4 10x
54
e 2µl de MgCl2. A cada ensaio de amplificação, foi incluído um controle positivo
(amostra de DNA bacteriano (Map), proveniente de cultura de tecido positivo para a
cepa IS900 e um controle negativo (contendo somente água destilada e a solução
de reação). A reação foi feita no termociclador PTC 100 TM (Programmable Thermal
Controller-MJ research, Inc.), utilizando-se as seguintes condições de
temperatura/tempo: desnaturação a 94°C por dois minutos, 40 ciclos de:
desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 42°C por um minuto e
extensão a 72°C por um minuto e 30 segundos, seguidos de uma extensão final a
72 °C, por sete minutos.
No nested PCR, 0,5 µl da primeira PCR foi utilizado e a solução de reação
também foi padronizada para um volume final de 25 µl, contendo: 18,2 µl de água
ultrapura, 1 ul de cada iniciador F57c e F57d (20 pMoles), 0,2 µl de 10 mM DNTp
Mix, 0,1 µl de taq polimerase recombinante, 2,5µl de tampão de reação da enzima
taq (NH4)2SO4 10x e de 2µl de MgCl2. Os tubos foram colocados novamente no
termociclador e a amplificação foi feita nas seguintes condições de
temperatura/tempo: desnaturação a 94°C por dois minutos, 40 ciclos de:
desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por um minuto e
extensão a 72°C por um minuto e 30 segundos, seguidos de uma extensão final a
72°C, por sete minutos.
Os produtos das amplificações foram submetidos a eletrofose em gel de
agarose1,2 % preparado com TAE 1X, corado com brometo de etídi o, segundo
SAMBROOK et al. (1989), e visualizado por transiluminação ultravioleta no aparelho
EAGLE EYETM II – STRATAGENE.
55
Tabela 1. Seqüências de nucleotídeos, localização dos iniciadores na seqüência F57 e tamanho do produto do nested PCR, referente aos iniciadores F57c e F57d, utilizados no diagnóstico de bovinos com Paratuberculose.
Iniciadores (primers)
Seqüência dos nucleotídeos Gen alvo
Posição Tamanho do
fragmento amplificado
F57 a F57 b F57 c F57 d
5’ - GAA TAT GTT GTT GCC CTG TCT- 3’ 5’- TCT CAG ACA GTG GCA GGT G - 3’
5’- CGG CTC CGA AGC TGG CGT - 3’ 5’- AAT TCG ATC ACG GAC TAG A - 3’
F57
137 - 157 598 - 617 580 - 597
158 -176
439 pb
56
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Medidas de manejo adotadas nas propriedades A e B
Após uma avaliação do manejo adotado em ambas as propriedades, pôde-
se identificar diversos fatores que, certamente, contribuíram para a introdução do
Map nos referidos rebanhos e a transmissão deste a outros animais susceptíveis.
Entre os principais fatores de risco identificados, ressaltam-se: a aquisição de
animais de rebanho infectado, a compra de sêmen de origem duvidosa e de países
com alto índice de Paratuberculose e a criação conjunta de animais de diferentes
faixas etárias. Esses achados, segundo COLLINS (1994) e BLOOD et al. (1991), são
pontos críticos para a disseminação da Paratuberculose em um rebanho. Além
disso, a contaminação fecal do ambiente, provavelmente, contribuiu para a
transmissão do Map a outros animais susceptíveis, num ambiente sem condições
higiênicas e manejos adequados (JOHNSON-IFEARULUNDU e KANEENE, 1998;
MUSKENS et al., 2003).
57
4.2. Histórico e avaliação clínica dos animais
No momento da visita à propriedade “A”, em junho de 2003, foram
detectadas três vacas (Jacuba, Humorista e Janice), adultas (cinco e seis anos),
com suspeita clínica de Paratuberculose.
As vacas, Jacuba e Humorista, vinham apresentando sinais próprios de
Paratuberculose, (Fig1 e 2) como: diarréia crô nica há aproximadamente seis meses,
caquexia, emaciação, pelagem áspera e sem brilho. A diarréia era de consistência
líquida, esverdeada, sem cheiro, com muco ou sangue e irresponsiva à
antibioticoterapia. Apesar dessa clínica, esses animais apresentavam apetite e
funções reprodutivas normais.
Fig. 1. Vaca (Jacuba). Paratuberculose. Caquexia, emaciação e pelagem áspera acobreada.
58
A vaca Janice, além de um considerável estado de magreza (amiotrofia),
também apresentava episódios diarréicos, porém, há menos tempo. O apetite e as
funções reprodutivas desse animal eram normais.
Na propriedade B, no mesmo período, um bovino adulto jovem, Garrote, de
aproximadamente dois anos e meio se mostrava apático, edemaciado e caquético
(Fig. 3), além de apresentar um quadro de diarréia líquida esverdeada e com
bastante muco. Neste animal o apetite também era mantido normalmente, apesar de
expressar sensibilidade (dor) abdominal ao toque retal.
O quadro de diarréia crônica, às vezes, intermitente, e de perda de peso
progressiva foi observado em todos os animais. Diarréia crônica irresponsiva, rápida
perda de peso, apetite normal e ausência de febre são sinais típicos da
Paratuberculose bovina (CHIODINE et al., 1984; BLOOD et al., 1991). Entretanto,
esses dados não são específicos da Paratuberculose, sendo comum a outras
doenças (STEHMAN, 1990).
Os dados epidemiológicos associados aos quadros clínicos levaram á
suspeita de Paratuberculose. Condição esta, semelhante a outras já descritas em
bovinos infectados pelo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (SANTOS e
SILVA, 1956; DACORSO FILHO et al. 1960; CHIODINI et al., 1984).
Fig. 2. Vaca (Humorista). Paratuberculose. Extremo estado de magreza (amiotrofia) e
emaciação.
59
A queda na produção leiteira na propriedade A pode ser um sinal
inespecífico, porém, em alguns casos, pode estar associada a infecções subclínicas
(MERKAL et al., 1975).
Todos os três animais da propriedade A e aquele da propriedade B foram
reativos ao teste de ELISA-PPA e positivos para amostras fecais semeadas em meio
HEYM com micobactina. Os diagnósticos sorológico e bacteriológico confirmaram a
suspeita clínica de Paratuberculose. Estes dois testes são amplamente utilizados
para o diagnóstico de Paratuberculose em rebanho (COLLINS, 1999; WHITLOCK et
al., 2000; PAOLICCHI et al., 2003).
A partir do histórico dos animais, dos sinais clínicos e dos resultados
positivos do teste de ELISA-PPA e da cultura de fezes, decidiu-se necropsiar os
animais. Exceto a vaca Janice, que foi abatida em matadouro municipal, logo após
uma recuperação corporal aparente.
Fig.3. Bovino (Garrote). Paratuberculose. Animal caquético.
60
4.3. Achados Macroscópicos
Os três animais necropsiados estavam em péssimo estado nutricional. Havia
uma escassez de gordura nos depósitos naturais, amiotrofia e uma notável dilatação
das alças intestinais com ondulações vistas através da serosa, mais precisamente,
na região do intestino delgado (Fig.4). Estes acha dos também foram observados por
DRIEMEIER et al. (1999). Na necropsia, pôde -se observar um espessamento da
parede intestinal, principalmente na do intestino delgado, cujas mucosas
hiperêmicas continham muco e estavam extremamente corrugadas, assumindo,
desta forma, em vários seguimentos do intestino, um aspecto “cerebróide” (Fig.5).
Estas evidências são registradas por BARKER et al. (1993), como alterações
macroscópicas clássicas da Paratuberculose.
Fig. 4. Alça intestinal de bovino com Paratuberculose, visivelmente dilatada.
61
Em alguns segmentos do intestino delgado, as lesões eram bem evidentes.
Os graus de corrugação e de espessamento da mucosa intestinal variavam entre:
leve (parede intestinal pouco espessada e sem corrugação); moderado (parede
moderadamente espessada e corrugada); e intenso (parede estava extremamente
espessada e corrugada em diferentes segmentos do intestino). Segundo BARKER et
al. (1993), basta o reconhecimento de um leve espessamento da mucosa para que o
animal seja considerado suspeito.
O bovino Garrote apresentou espessamento da parede tanto no intestino
delgado quanto no grosso. Havia também pontos de aderência entre as alças.
CHIODINI et al. (1984) relataram que as lesões na mucosa podem ocorrer desde o
duodeno até o reto, podendo ser segmentadas ou contínuas.
A presença de linfadenomegalia e linfangiectasia foram evidentes nos três
casos necropsiados, assim como, a congestão e edemaciação das válvulas
íleocecais, que, na maioria das vezes, se apresentavam aumentadas em
aproximadamente em duas vezes o seu tamanho (Figs. 6, 7 e 8). Apesar da
linfadenomegalia, os linfonodos não apresentavam, ao corte, alterações, senão por
estarem muito alongados, quase que numa cadeia mesentérica contínua. A
linfadenomegalia e a hipertrofia das válvulas íleocecais também são relatad as em
outros casos de Paratuberculose (CHIODINI, 1984; DRIEMEIER et al., 1999).
Fig. 5. Mucosa ileal de bovino com Paratuberculose. Espessamento, corrugação (aspecto cerebróide) e áreas de hiperemia (seta).
62
Fig. 6. Linfonodo mesentérico hipertrofiado no seu maior eixo (alongado / em cadeia) de bovino com Paratuberculose
Fig. 7. Vasos linfáticos mesentéricos dilatados, evidenciando linfangiectasia (seta) em bovino com
Paratuberculose.
63
À necropsia, outros órgãos como coração, pulmões, rins, baço, rúmem,
omaso e abomaso também foram inspe cionados. Este não apresentaram alterações
macroscópicas que impressionassem, a não ser o fígado do bovino Garrote que
apresentou áreas de telangiectasia, mesmo estando com o volume, a cor e a
consistência normais. Estes achados macroscópicos corroboram co m SANTOS e
SILVA (1956), que não apreciaram quaisquer alterações em outros órgãos. No
entanto, SWEENEY et al. (1992) relataram que, apesar de as lesões características
de Paratuberculose ocorrerem comumente na mucosa intestinal e nos linfonodos
mesentéricos, infecções extra-intestinais podem acontecer.
Em relação à vaca Janice, após ser abatida, teve -se acesso apenas a uma
amostra de jejuno. Este por, sua vez, apresentava uma mucosa moderadamente
espessada e corrugada, apresentando algumas áreas de hiperemia.
Fig. 8. Válvula íleocecal com hipertrofia e congestão (seta) de bovino com Paratuberculose.
64
4.4. Achados Microscópicos
Os principais achados histopatológicos foram os do intestino delgado, nos
seus linfáticos e nos linfonodos mesentéricos, resultando em enterite, linfangite,
linfangiectasia e linfadenite granulomatosas. As lesões nas amostras intestinais, se
restringiam às túnicas mucosa e submucosa, principalmente do jejuno, do íleo e das
válvulas ileocecais. Caracterizavam-se por um infiltrado inflamatório de linfócitos,
eosinófilos e, principalmente, macrófagos, que assumiam aspecto ep itelióide ou de
células gigantes de Langhans. Estas com formação bastante incipiente (Figs. 9 e
10).
Fig. 9. Mucosa intestinal (íleo) de bovino com Paratuberculose, demonstrando lesão granulomatosa com abundante infiltrado de células epitelióides (seta). HE, 100X.
65
Somente no bovino Garrote foram observadas lesões granulomatosas tanto
no intestino delgado quanto o grosso. Estas, na maioria das vezes, eram multifocais
com BAAR localizados no ápice das vilosidades, na região médio-glandular,
entremeadas às glândulas de Lieberkuhn, e na região basal da mucosa, no limite
com a muscular da mucosa (Fig. 11). As vilosidades intestinais de alguns
segmentos, principalmente do jejuno e do íleo, mostravam-se “fundidas” (Fig. 12),
devido à grande quantidade de células epitelióides e BAAR. Além disso, a presença
de vasos linfáticos dilatados com lesão granulomatosa e BAAR (Fig. 13) contribuiu
para a alteração da morfologia da submucosa. A localização das lesões, e a
constituição do granuloma, associada ao tipo de lesão, foram semelhantes aos
achados por RAMOS et al. (1994); DREIMEYER et al. (1999); HUDA e JENSEN,
(2003).
Fig. 10. Mucosa intestinal de bovino com Paratuberculose, evidenciando infiltrado de células epitelióides, células de Langhans em formação (seta A) e linfangiectasia (seta B). HE, 400X.
A
B
66
Fig. 11. Íleo de bovino com Paratuberculose. Lesões multifocais com BAAR no ápice das vilosidades (seta A), na região médio-glandular (seta B) e região basal da mucosa (seta C). ZN, 100X.
Fig.12. Mucosa intestinal (íleo) de bovino com Paratuberculose. Vilosidades fundidas devido ao infiltrado de células epitelióides e BAAR (seta). ZN, 100X.
A
B C
67
Lesão difusa na região basal da mucosa e em toda a submucosa, puderam
ser visualizadas em amostras de jejuno e de válvula ileocecal da vaca Jacuba e em
amostras de íleo e válvula íleo cecal do animal Garrote, comprometendo, desta
forma, a arquitetura das mesmas (Fig. 14). Havia também ectasia linfática na
submucosa que contribuiu para um espessamento desta área. Ao contrário dos
achados de HUDA e JENSEN (2003), as lesões difusas na submucosa intestinal
desses dois animais, com grande quantidade de BAAR nos macrófagos e de vasos
linfáticos dilatados, também favoreceram para o espessamento desta área.
Em uma amostra intestinal de jejuno da vaca Jacuba, lesões focais, com um
número discreto de células epitelióides foram detectadas na serosa, caracterizando
uma serosite granulomatosa. Em amostra do íleo do animal Garrote, havia também
lesões focais entre as duas camadas musculares e na serosa. A evidência de lesões
granulomatosas em áreas extra-mucosa e submucosa corrobora com dados de
DACORSO FILHO et al. (1965) ; RAMOS et al. (1986).
Fig. 13. Vaso linfático dilatado na submucosa (ileal) de bovino com Paratuberculose, contendo lesão granulomatosa, célula gigante de Langhans e BAAR (seta) no seu interior . ZN, 400X.
68
Como característica de casos avançados de Paratuberculose pôde -se
detectar lesão granulomatosa multifocal com BAAR (Fig. 15) e, às vezes, difusa nos
linfonodos mesentéricos dos três animais examinados. Este processo inflamatório
era composto de um infiltrado de células epitelióides, gigantócitos de Langhans, com
diferenciação incipiente, e linfócitos em quantidade moderada na região cortical,
mais especificamente, nos seios subcapsulares e nos folículos linfóides. O
comprometimento dos linfonodos mesentéricos é um reflexo do tropismo do bacilo
pela mucosa intestinal, já que esses linfonodos são satélites e estão envolvidos na
drenagem linfática da mucosa intestinal. O considerável comprometimento dos
linfonodos mesentéricos, principalmente, os ileais e os jejunais, são freqüentemente
detectados em casos bem definidos de Paratuberculose (CHIODINI et al., 1984);
KREEGER, 1991; BARKER et al. 1993; GOMES, 2002).
Fig. 14. Corte da porção ileal do intestino de bovino com Paratuberculose, demonstrando lesão difusa na base da mucosa (seta A) e em toda submucosa (seta B). ZN, 100X.
A
B
69
Em todas as amostras intestinais analisadas, a utilização da coloração
especial de Ziehl-Neelsen (ZN), evidenciou BAAR nos macrófagos, apinhados e em
grumos, na mucosa intestinal, especialmente, no ápice das vilosidades, nas regiões
médio-glandular e basal da mucosa, além do parênquima dos linfonodos
mesentéricos. As globias, devido à grande quantidade de bacilos fucsinófilos nos
macrófagos, quando corados com ZN, permitiu caracterizar as lesões das mucosas
intestinais e dos linfonodos mesentéricos como lesões lepromatosas ou
multibacilares. A forte marcação dos bacilos (fucsinofilia), tanto em amostras
intestinais quanto de linfonodos, foi uma característica de grande relevância neste
estudo. Na maioria das vezes, era possível visualizar extensas áreas coradas pela
fucsina fenicada, devido ao grande número de BAAR. Embora o relato de BAAR nos
macrófagos e a presença de células epitelióides serem achados comuns nos casos
de Paratuberculose (SANTOS e SILVA 1956; RAMOS et al., 1986, BARKER et al.,
1993; HUDA e JENSEN, 2003), nas amostras desta investigação, pôde-se observar
uma grande quantidade de BAAR nas lesões das mucosas e submucosas
intestinais, os quais formavam grumos de bacilos, semelhantes aos observados por
CARRIGAN e SEAMAN, 1990; CORPA et al., 2000.
Nenhum outro órgão, a não ser o fígado do animal Garrote, apresentou
lesões microscópicas (extra-intestinais) de Paratuberculose. Foram observados
microgranulomas multifocais dispersos nos espaços -porta por todo o órgão,
Fig. 15. Lesões multifocais com BAAR na região cortical de linfonodo mesentérico de bovino com Paratuberculose (setas). ZN, 400X.
70
composto de moderada quantidade de células epitelióides, linfócitos e células
gigantes em diferenciação contendo BAAR que permitiram a caracterização de uma
hepatite-portal, granulomatosa e multifocal (Fig. 16) pelo Map (CHIODINI et al.,
1984; KREEGER, 1991). Esses achados também foram relatados por DRIEMEIER
et al. (1999) e MAHMOUD et al. (2002).
As alterações microscópicas dos casos analisados são semelhantes às
definidas por SANTOS e SILVA (1956); BARKER et al. (1993) ; BUERGELT e GINN
(2000), mostrando de forma evidente a patognomonia nestes casos de
Paratuberculose.
4.4.1. Marcação Imunoistoquimica
Com a técnica de IHQ indireta, estreptoavidina biotina e um anticorpo primário
policlonal anti-M. bovis, produzido em coelho (Dako, USA), na diluição de 1:6000 , foi
possível visualizar Map imunoexpressado em marrom-escuro, nos citoplasmas dos
macrófagos (epitelióides) e na mucosa e submucosa intestinais, quando revelados
Fig.16. Lesões multifocais com BAAR no espaço-porta hepático de bovino com Paratuberculose. ZN, 400X
71
com o kit Dako DAB+, conforme especificação do fabricante (Fig. 17). Também
foram obtidos resultados positivos para a IHQ, quando da submissão de amostras de
linfonodos e de fígado (Fig. 18) do bovino Garrote.
Fig. 17. Globias de bacilos imunoexpressados em marrom acastanhado na mucosa intestinal de bovino com Paratuberculose (setas). IHQ, 400X.
Fig. 18. Grumos de bacilos imunoexpressados no espaço-porta hepático de bovino com Paratuberculose. IHQ, 400X.
72
A utilização do anticorpo na diluição de 1:6000, proporciono u uma eficiente
marcação do Map com diminuição de reações inespecíficas, referidas como fundo
(background). A referida técnica é amplamente utilizada no diagnóstico da
Paratuberculose (GIMENO, 1995). Apesar de o método não ser específico na
diferenciação entre algumas espécies do gênero Mycobacterium, em especial do M.
bovis, ele se mostrou mais sensível que outros métodos de coloração,
principalmente na coloração de ZN, na visualização do Map, permitindo, desta
forma, a demonstração de bactérias íntegras, de fragmentos e antígenos
bacterianos, conforme WILEY et al. (1990), MASSONE et al. (1990) e STABEL et al.
(1996).
Segundo PAOLICCHI et al. (2001), a imunoistoquímica é a técnica mais
eficaz na identificação do Map em tecidos. Pode ser amplamente utilizada nos casos
em que a detecção bacteriológica do agente, mediante isolamento, é inviável. Além
disso, THORESEN et al. (1994) consideram a IHQ um método mais rápido, quando
comparada com o longo tempo requerido para o cultivo do Map, e uma valiosa
ferramenta no diagnóstico de doenças insidiosas e crônicas, como a
Paratuberculose, o que se pôde comprovar neste estudo.
4.5. Bacteriologia
O cultivo em meio HEYM, com e sem antibiótico, das amostras de alças
intestinais e de linfonodos mesentéricos das vacas Jacuba e Humorista revelaram
colônias redondas, brancas, lisas e levemente rugosas, após um período de 60 dias
de incubação. Já o cultivo das amostras intestinais do animal Garrote revelou
colônias pequenas, brancas translúcidas, lisas e redondas após um pe ríodo atípico
de 17 dias de incubação.
Devido à contaminação da amostra intestinal da vaca Janice, abatida, não foi
possível o isolamento do Map. O resultado de cultura negativo para a amostra desse
animal pode ser explicado pelo processo de congelamento e descongelamento a
que esta amostra foi submetida até chegar ao laboratório, já que o abate foi
realizado no Município de Barra Mansa e esse material só chegou ao laboratório
vários dias depois.
73
O isolamento e a confirmação do Map foram realizados no Laboratório de
Micobactéria da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFF), como parte
experimental de uma tese de mestrado.O isolamento do Map em meio HEYM com
micobactina serviu para confirmar a natureza do agente da Paratuberculose neste
estudo.
As características morfológicas das colônias de Map isoladas e o tempo de
incubação foram semelhantes aos dos relatos de RAMOS et al. (1986) e GOMES
(2002). Todas as colônias bacterianas isoladas das amostras intestinais dos animais
necropsiados, neste estudo, foram positivas para o teste de dependência de
micobactina e confirmadas como Map pela técnica de biologia molecular (PCR)
baseada na seqüência de inserção IS900, conforme MILLER et al. (2002).
4.6. Detecção de Map nas amostras via PCR para o gene F57
O resultado do nested PCR, baseado na seqüência F57, foi positivo para as
amostras de tecido parafinado (intestino) dos animais necropsiados, da vaca Janice
e da amostra testada proveniente do arquivo da UFF. A amplificação de um produto
de 439 pb referente à seqüência genômica F57, permitiu uma identificação
específica do Map em todas as amostras testadas, com a obtenção de fragmentos
(bandas) de tamanhos esperados após o nested PCR (Fig. 19).
A modificação na técnica de PCR, incluindo nested primers, possibilitou o
aumento da sensibilidade deste teste diagnóstico. Além disso, a utilização da PCR
na análise direta de ácidos nucléicos, extraídos de tecido fixado em formol e
incluídos em parafina, mostrou ser uma técnica rápida, sensível e específica para
detecção do Map (COLLINS et al.,1993; WHITTINGTON et al., 1999; BUERGUELT
et al., 2004).
Diversos trabalhos de detecção de Map via PCR baseiam-se na seqüência
IS900. Entretanto, a existência de seqüências similares, like-IS900, em outras
espécies de micobactérias pode gerar equívocos no diagnóstico molecular que
utilize tal abordagem (POUPART et al., 1993; ENGLUND et al., 2005). Assim, o
diagnóstico da Paratuberculose baseado apenas na PCR IS900 deve ser
74
interpretado com muita cautela, necessitando, portanto, de uma confirmação com a
PCR baseada na seqüência F57 (VANSNICK et al., 2004).
Em contrapartida, a seqüência F57 é considerada exclusiva do Map,
tornando-se uma interessante abordagem para o diagnóstico (POUPART et al.,
1993; ENGLUND et al., 2005). O conjunto de iniciadores proposto no presente
trabalho mostrou-se eficiente para a detecção de tal seqüência, permitindo, por meio
de nested PCR a geração de bandas específicas de elevada intensidade.
O resultado do nested PCR baseado na F57 que foi aplicad o nas amostras
intestinais analisadas neste estudo são semelhantes aos resultados obtidos por
COETSIER et al. (2000). Mediante esta técnica, pode -se confirmar todas as
amostras intestinais positivas com a PCR baseada na IS900, conforme VANSNICK
et al., 2004.
Neste estudo, não foi possível se fazer uma avaliação da sensibilidade da
PCR na detecção de Map em amostra de tecido parafinado. Segundo
WHITTINGTON et al. (1999), vários fatores podem interferir na sensibilidade da
referida técnica, e inibidores da reação, como o tipo e o tempo de fixação, podem
comprometer a extração do DNA em amostras de tecido. Diante deste fato, acredita -
se que a exibição de bandas fracas nas posições 3, 10 e 11, podem ser explicadas
pela ação de algum inibidor durante o processo de extração do DNA da amostra
intestinal, já que as amostras foram fixadas com formol tamponado 10% e, em
especial, as amostras provenientes do animal 981 foram processadas e fixadas à
vários anos .
Os testes preliminares realizados neste experimento revelaram que a citada
técnica se mostrou capaz de detectar e identificar corretamente Map em amostras
de tecido parafinado, além de ser uma importante ferramenta diagnóstica quando o
diagnóstico bacteriológico falha, como por exemplo, no caso da vaca Janice.
75
Fig. 19. Resultado do nested PCR das amostras intestinais dos animais estudados: nas linhas 2 e 3, vaca Humorista; 4 e 5, vaca Jacuba; 6 e 7, bovino Garote; 8 e 9, a vaca Janice; 10 e 11, animal 981; e na linha 12 o DNA bacteriano de cultura de amostra intestinal da vaca Humorista. Na linha 1 (ladder), marcador de peso molecular.
10.000 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
450 pb
439 pb
76
5. CONCLUSÕES
Existem poucos diagnósticos de Paratuberculose bovina no Brasil. Havendo
falta de dados oficiais.
Os métodos histológicos utilizados se mostraram essenciais para detecção
de lesões granulomatosas nas amostras intestinais, bem como para a identificação
de bacilos álcool-acido-resistentes e imunoexpressados mediante a coloração de ZN
e IHQ.
Os métodos moleculares utilizados no referido estudo mostraram ser uma
vantajosa ferramenta diagnóstica, devido à rapidez, sensibilidade e especificidade
para detecção de Map.
A disponibilidade de um método de detecção molecular da região F57 gerou o
isolamento e a perspectiva de sequenciamento de tal fragmento para o conjunto de
amostras disponíveis, proporcionando futuros trabalhos de filogenia molecular.
Há necessidade de contínuos estudos sobre o tema.
77
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