04/03/2017

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Diagnose de doenças de plantasPatologia Florestal

Daniel Diego Costa Carvalho

Mestre em Fitopatologia (UFLA)

Doutor em Fitopatologia (UnB)

PFv004

Cada método é utilizado para diagnosticar?

Diagnose tradicional de doenças de plantas?

Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?

Diagnose baseada em técnicas moleculares?

1. Diagnose tradicional de doenças de plantas

1.1. Diagnose de doenças conhecidas (já descritas)

SINTOMA x SINAL

SINTOMAS: manifestação das reações da planta a um agentenocivo

SINAIS: Estruturas do patógeno, ou o próprio patógeno, presentesnas plantas doentes

Bursaphelechus cocophilus

http://www.agrolink.com.br/agricultura/problemas/busca/anel-vermelho_2990.html

Cylindrocladium sp.

http://w3.ufsm.br/fitoflorestal/detalhador.php?id=55#sthash.lN7cFMWH.IYbVkNBi.dpbs

Citrus tristeza virus

Agrios, 2005.

Ralstonia sp.

Alfenas e Zauza, 2007.

Diagnose tradicional de doenças de plantas

Como as doenças de plantas são diagnosticadas?

SINTOMAS SINAIS

Carvalho, 2015.

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Descrição da sintomatologia de doenças:

Chaves de identificação publicadas em livros

Comparação entre as ilustrações e as plantas doentes

São suficientes para o diagnóstico de uma doença

Carvalho, 2015.

Procedimentos para a diagnose de doenças conhecidas

Procedimento para a análise de laboratório

Informações de campo +

Teste laboratoriais para identificação do patógeno

Literatura

Doença conhecida

Doença desconhecida

1.2. Diagnose de doenças desconhecidas:

Nenhuma evidência de doenças conhecidas nomaterial analisado, o que fazer?

Postulados de Kock: Teste de patogenicidade

POSTULADOS DE KOCH

1. ASSOCIAÇÃO CONSTANTEO microrganismo deve estar associado à doença em todas as plantas examinadas.

2. ISOLAMENTO E CULTIVOO microrganismo deve ser isolado da planta doente, cultivado em cultura pura e suas características descritas.

3. INOCULAÇÃO (Teste de patogenicidade)O microrganismo em cultura pura deve ser inoculado sobre plantas sadias (mesma espécies ou variedade) e produzir a mesma doença.

4. REISOLAMENTOO microrganismo deve ser novamente isolado em cultura pura e exibir as mesmas características.

Regras para análise de sementes, 2009.

1.3. Diagnose de doenças em sementes contaminadas

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Aspergillus spp. e Cladosporium spp.

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blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro – após 7 diasa 20ºC.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Kobayasti et al., 2011.

Aspergillus sp.

Cladosporium sp.

- Lâminas microscópicas semi-permanentes

- para confirmação de cada gênero fúngico

Guimarães & Carvalho, 2014.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

1.4. Diagnose de doenças que requer o isolamento dopatógeno

http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdf http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdf

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http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdfOliveira, 2010.

https://www.uoguelph.ca/~gbarron/Misc2009/newadd5.htm

Carvalho et al., (2008).

Vasconcelos et al., (2014).

Vasconcelos et al., (2014).

1.5. Exemplos de Doenças de fácil Diagnose

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Botrytis em eucalipto

Alfenas e Zauza, 2007.

Cylindrocladium pteridis

Foto: D.Carvalho (2017).

http://www.missouribotanicalgarden.org/gardens-gardening/your-garden/help-for-the-home-gardener/advice-tips-resources/pests-and-problems/diseases/fungal-spots/black-spot.aspx

Foto: D.Carvalho (2017).

1.6. Extração de nematóides para diagnóstico

Agrios, 2005.

Anel vermelho do coqueiro: Bursaphelenchus cocophilus

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2. Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica

2.1. Microscopia eletrônica de transmissão para auxílio na diagnose de vírus

Tobacco mosaic virusAlfalfa mosaic virus

Cucumber mosaic virus

Agrios, 2005.

Citrus tristeza virus

Coconut cadang-cadang viroid

Agrios, 2005.

Cell inclusion bodies observed with an electron microscope.

Indicative of the presence of one or more viruses and, often, are diagnostic of the genus of the virus.

Typical pinwheel-like inclusion bodies diagnostic of potyviruses

Agrios, 2005.

Agrios, 2005.

Clorose Variegada do Citros - CVC: Xylella fastidiosa

2.2. Microscopia eletrônica de transmissão e varredura para auxílio na diagnose de micoplasmas. 3. Diagnose baseada em técnicas moleculares

3.1. Hibridização molecular

Imobilização do ácido nucléico em um suporte sólido e formação de híbridos

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Ácido Nucléico Imobilizado

Ácido Nucléico Imobilizado

Sonda

Sonda

Sondas Radioativas ** ** * * *

nucleotídeo radioativo (P-32)

DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular

Membrana

Membrana

Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA

EY YYE EE YEY

Revelar

NBT-BICPColorimetria

ECLQuimioluminescência

3.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Desenvolvido por Kary Mullis (Mullis & Faloona, 1987)

Amplifica fragmentos de DNA in vitro milhares de vezes

Reação:

DNA genômico

Tampão

Primers (~20 bases) “forward” e “reverse”

dNTPs (nucleotídeos A, T, C, G)

Taq (polimerase de DNA)

MgCl2 (Cofator da Taq)

H2O ultra pura

http://www.bio-rad.com/en-us/product/mj-mini-thermal-cycler

http://biomol.com.br/produto/amplitherm-termociclador-sem-gradiente-96-microtubos

http://pt.depositphotos.com/45206661/stock-photo-loading-samples-into-gel-for.html

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http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php

VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA

Análise eletroforética em gel de agarose (1%) dos produtos amplificados por PCR para confirmação da identidade dos isolados de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

Regras para análise de sementes, 2009.

Aplicações da PCR:

Detecção

Identificação

Quantificação (PCR real time)

Fitopatógenos

Cada método é utilizado para diagnosticar?

Diagnose tradicional de doenças de plantas?Doenças conhecidas e doenças não conhecidasFungos, Bactérias, Micoplasmas, vírus, nematóides

Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?MEV e METMicoplasmas (Spiroplasmas), vírus...

Diagnose baseada em técnicas moleculares?Fungos, Bactérias, vírus...

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Bibliografia citada e recomendada:

AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 5 ed. San Diego, Academic Press, 2005, 948p.

ALFENAS, A.C.; ZAUZA, E.A.V. Doenças na cultura do eucalipto.Viçosa: SIF. 1 ed. 2007, 164p.

CARVALHO, D.D.C. Herbário de Doenças de Plantas – FitopatologiaAplicada. Ipameri: Universidade Estadual de Goiás, 2017, 32 p.

CARVALHO, D.D.C.; ALVES, E.; BATISTA, T.R.S.; CAMARGOS, R.B.;LOPES, E.A.G.L. Comparison of methodologies for conidia production byAlternaria alternata from citrus. Brazilian Journal of Microbiology, v.39,p.792-798, 2008.

GUIMARÃES, G.R.; CARVALHO, D.D.C. Incidência e caracterizaçãomorfológica de Cladosporium herbarum em feijão comum cv. ‘Pérola’.Revista Brasileira de Biociências, v.12, n.3, p.137-140, 2014.

KOBAYASTI, L.; ADORIAM, A.I.; PAIVA NETO, V.B.; ALVES, C.Z.;ZUFFO, M.C.R. Incidência de fungos em sementes de pinhão-manso.Pesquisa Agropecuária Tropical, v.41, n.3, p.385-390, 2011.

OLIVEIRA L.S.S. Agressividade de isolados de Ceratocystisfimbriata em clones de Eucalyptus spp. Viçosa: Programa de PósGraduação em Fitopatologia - Universidade Federal de Viçosa, 29 p.(Dissertação de mestrado).

REGRAS PARA ANÁLISE DE SEMENTES. Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária.Mapa/ACS, Brasília, 2009, 399p.

VASCONCELOS, C.V.; SILVA, D.C.; CARVALHO, D.D.C. Ocorrência deAlternaria alternata (Fr.:Fr) Kessil. em tubérculos de batata, no Brasil.Pesquisa Agropecuária Tropical , v.44, n.2, p.219-222, 2014.

Leitura Obrigatória:

REZENDE, J.A.M.; MASSOLA JUNIOR, N.S.; BEDENDO, I.P.;KRUGNER, T.L. Conceito de doença, sintomatologia e diagnose. In:AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual deFitopatologia: Princípios e conceitos . 4ed, Piracicaba, AgronômicaCeres, v.1, 2011, p.37-60.

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