PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

RT- PCR em Tempo Real RT- PCR em Tempo Real

PCR quantitativoPCR quantitativo

PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão de um fluorescente

PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

Quantificação em gel x Real-Time PCR:Quantificação em gel x Real-Time PCR:““Relação quantitativa entre quantidade de DNA Relação quantitativa entre quantidade de DNA inicial e a quantidade de produto durante a fase inicial e a quantidade de produto durante a fase

exponencial de um programa de ciclagem”exponencial de um programa de ciclagem”

Detector de sequências a laser, totalmente automatizado

Requerimentos específicos da técnicaRequerimentos específicos da técnica

Equipamento de leitura da amplificação;Equipamento de leitura da amplificação;

Química específica de fluorescência na reação;Química específica de fluorescência na reação;

Método matemático de correlação;Método matemático de correlação;

Uso de soluções-padrão ou genes de referência.Uso de soluções-padrão ou genes de referência.

PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

ExperimentaçãoExperimentação

reação em branco, (Hreação em branco, (H22O);O);

diluição serial (10diluição serial (10-1-1, 10, 10-2-2, 10, 10-3-3, 10, 10-4-4, 10, 10-5-5););

amostrasamostras

primers: gene de interesse x gene de referênciaprimers: gene de interesse x gene de referência

em triplicatas !!!em triplicatas !!!

PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real

Baseline Ct- linha basal: não houve clivagem suficente do corante-repórter para que se possa detectar a fluorescência

- fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo

- fase platô: não há mais aumento no número de amplicons

Piso de Fluorescência: Piso de Fluorescência: threshold cyclethreshold cycle

CtCtThreshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

CtCtNo ponto referido como Ct a fluorescência aumenta acima

da linha basal, de forma exponencial. Amostras mais concentradas (com maior no de templates iniciais) mostram valores menores de Ct.

Esse fenômeno criou um novo paradigma para quantificação por PCR: é avaliado o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.

Curva de diluição Curva de diluição

Uso como referência absoluta (se for o caso);Uso como referência absoluta (se for o caso);

Cálculo de eficiência da reação de PCR;Cálculo de eficiência da reação de PCR;

TMEM_10-6 21,086 63000 4,799341TMEM_10-6 20,6472 63000 4,799341TMEM_10-6 20,7712 63000 4,799341TMEM_10-7 24,8432 6300 3,799341TMEM_10-7 25,1673 6300 3,799341TMEM_10-7 24,8378 6300 3,799341TMEM_10-8 28,4401 630 2,799341TMEM_10-8 28,5971 630 2,799341TMEM_10-8 28,0928 630 2,799341TMEM_10-9 32,2972 63 1,799341TMEM_10-9 31,326 63 1,799341

Curva de diluição Curva de diluição

logng/ulCt

Genes de referência Genes de referência (housekeeping)

Curva de desnaturação Curva de desnaturação ((melt curvemelt curve))

Químicas de Fluorescência em Tempo Químicas de Fluorescência em Tempo RealReal

especificidade requeridaespecificidade requerida

escala de aplicaçãoescala de aplicação

custocusto

experiência do laboratórioexperiência do laboratório

leitura do aparelholeitura do aparelho

Químicas de Fluorescência em Tempo RealQuímicas de Fluorescência em Tempo Real

Sybr-GreenSybr-Green

Químicas de Fluorescência em Tempo Químicas de Fluorescência em Tempo RealReal

TaqManTaqManSonda FRETSonda FRET::FluorescentFluorescentResonanceResonanceEnergyEnergyTransferTransfer

Quencher (repressor)Quencher (repressor)

Atividade 5’ Atividade 5’ exonuclease da DNA exonuclease da DNA polimerasepolimerase

O sistema de quantificação em tempo real tem tido as seguintes aplicações:

1 - Análise da expressão gênica - RNA total (RT-PCR)2 - Identificação de alelos em DNA genômico3 - Análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes4 - Análise de patógenos em alimentos5 - Análise de produtos transgênicos, etc....

O sistema permite a detecção simultânea de até 3 fluorocromos diferentes, de modo que o controle interno ou externo pode ser

analisado simultaneamente à analise da molécula alvo.

RotorGene 3000 (Corbett)RotorGene 3000 (Corbett)

Mede o aumento do sinal de fluorescencia proporcional a qtidadeDNA produzido durante cada ciclo da PCR

Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

Real Time PCR

Sequenciamento de DNA

Sanger, 1977

Gel radioativo Dideoxinucleotídeos A C G T