Termociclador

PCR

Reação de Polimerase em

Cadeia

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Técnica que permite a amplificação

da quantidade de DNA específico

utilizando a enzima Taq DNA

polimerase, sequências iniciadoras

específicas (primers) e variações de

temperatura controladas.

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

MgCl2

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

Taq DNA polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus,

a qual é uma bactéria encontrada

sobrevivendo a altas temperaturas em

geisers no Yellow Stone National Park.

Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida

durante 45 minutos a 95°C.

• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que

cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de

incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.

• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U

(0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.

• É importante deixar claro que o excesso de enzima

também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo

inclusive inibi-la.

Taq DNA polimerase

• Os primers (forward e reverse) devem ser

construídos de acordo com a conveniência do

investigador, de modo que esses possuam

seqüências complementares a determinadas

regiões do DNA que limitam os segmentos a

serem amplificados.

Seqüências dos primers

Problemas comuns no Desenho de Primers

• Auto-complementariedade

• Complementariedade entre primers

Auto Complementariedade

• Formação de alça

GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC Tm = 71oC

ACTGAA

• São as bases nitrogenadas que constituirão as

novas cadeias de DNA.

• Sua concentração numa reação pode variar de

20 a 200 uM sendo importante que as quatro

devam variar em concentrações equivalentes.

• Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou

todos) podem ocorrer erros de incorporação de

bases, gerando cópias alteradas

Desoxinucleotídios trifosfatados

(dNTP)

• O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que

desempenha um papel de extrema importância na

atividade da enzima Taq DNA polimerase.

• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a

maioria das necessidades.

- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos

pouco ou nenhum produto

- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a

PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas

bandas ou “smear”.

Íon magnésio

Smear

PCR “Requerimentos”

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo: 1 µg

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

94ºC

DENATURAÇÃO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas

(Termociclador)

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

94ºC

DENATURAÇÃO

57ºC

ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas

(Termociclador)

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

94ºC

DENATURAÇÃO

72ºC

EXTENSÃO

57ºC

ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas

(Termociclador)

25-40 (35) CICLOS

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotideos)

http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

94ºC

DENATURAÇÃO

57ºC

ANELAMENTO

Primer forward Primer reverse

72ºC

EXTENSÃO

Taq

DNA polimerase

Essa temperatura está relacionada, por exemplo,

com a quantidade das bases C e G, de modo que

quanto maior for o número dessas bases, a

temperatura de hibridização tende a aumentar.

• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios

contendo 50 a 60% de G + C são adequados.

• Para se calcular a TM (temperatura média de

hibridização) de primers com até 20 nucleotídios

aplica-se a seguinte formula:

4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM

Temperatura média (Tm) de Anelamento

Ponte de Hidrogênio

fosfatopentose

Citosina

Guanina

Timidina

Adenina

Ponte de Hidrogênio

fosfatopentose

Citosina

Guanina

Timidina

Adenina

• Esse fator depende do comprimento do

segmento a ser amplificado e da concentração

do DNA molde utilizado na reação.

• A temperatura ótima de extensão dos primers é

de 72°C (temperatura ótima de atividade da

polimerase) e o tempo de extensão de 1

minuto é considerado suficiente para estender

produtos de aproximadamente 1.250 pb (em

condições ideais).

Tempo de extensão dos primers

• As condições de desnaturação utilizadas

normalmente são de 95°C por 5 minutos

(desnaturação inicial) e por 30 segundos

(desnaturação na ciclagem), sendo que

temperaturas mais altas podem ser utilizadas

quando se trabalha com seqüências moldes

ricas em G+C.

• Temperaturas muito altas e tempos longos de

desnaturação levam a perda de atividade da

enzima

Tempo e temperatura de denaturação

Amplificação de DNA

(exponencial)

Log [DNA]

X ciclos

Geométrica

Plateau Linear

Gel EtBr

y = 2X

Amplificação de DNA

(Platô)

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA

0 1

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

7 128

8 256

9 512

10 1,024

11 2,048

12 4,096

13 8,192

14 16,384

15 32,768

16 65,536

17 131,072

18 262,144

19 524,288

20 1,048,576

21 2,097,152

22 4,194,304

23 8,388,608

24 16,777,216

25 33,554,432

26 67,108,864

27 134,217,728

28 268,435,456

29 536,870,912

30 1,073,741,824

31 1,400,000,000

32 1,500,000,000

33 1,550,000,000

34 1,580,000,000

Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: 1.580.000.000

Análise

dos dados

Reação:

DNA

Enzima Taq

Primer

Nucleotídeos

Tampão

Água

Análise

dos dados

Termociclador

Reação:

DNA

Enzima Taq

Primer

Nucleotídeos

Tampão

Água

Análise

dos dados

Termociclador

Reação:

DNA

Enzima Taq

Primer

Nucleotídeos

Tampão

Água

Reação de PCR

+ Tampão Corado

(Loading Buffer)

Análise

dos dados

Eletroforese em gel de agarose

+ Brometo de Etídeo

Termociclador

Reação:

DNA

Enzima Taq

Primer

Nucleotídeos

Tampão

Água

Reação de PCR

+ Tampão Corado

(Loading Buffer)

Análise

dos dados Luz Ultravioleta

Fotodocumentação

Termociclador

Reação:

DNA

Enzima Taq

Primer

Nucleotídeos

Tampão

Água

Eletroforese em gel de agarose

+ Brometo de Etídeo

Reação de PCR

+ Tampão Corado

(Loading Buffer)

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2%

REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO

COM LUZ ULTRAVIOLETA

Marcador

de pares

de base

(pb)

300

200

100

400

500 600

1400

1300

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%

UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

Marcador

de pares

de base

(pb)

300

200

100

400

500 600

1400

1300

400 400 400

600 600

100 100 100 100

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%

UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE

DNA AMPLIFICADOS

- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm,

construindo cópias complementares de DNA (cDNA).

- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação

de carga viral.

- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa

frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).

Variações da técnica de PCR

• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como

a sua especificidade, nos permite amplificar uma

seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com

baixo grau de pureza e de quantidades mínimas

de DNA, o que torna o método viável não só para a

pesquisa básica mas também para a pesquisa

aplicada.

Aplicações do PCR

Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes

utilidades/ aplicações:

1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela

geração de produtos amplificados que apresentam

alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de

bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos

genéticos podem ser determinadas pela ação das

enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

Aplicações do PCR

3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional

(particularmente para doenças herdadas).

4. Na tipagem para transplantes de órgãos e

susceptibilidade para doenças auto-imunes

específicas (detecção de polimorfismo para HLA).

5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem

genética, como o câncer, através do estudo dos

genes relacionados a essas doenças.

6. Na medicina forense (DNA fingerprint).

7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes

patogênicos diversos

Aplicações do PCR