PCR PCR –– Reação em cadeia pela DNAReação em cadeia pela DNA polimerasepolimerase

Método e AplicaçõesMétodo e Aplicações

DNA DNA –– PCR (conhecer DNA genômico e genes)PCR (conhecer DNA genômico e genes)RNA RNA –– RTRT--PCR (conhecer a expressão de um gene)PCR (conhecer a expressão de um gene)

qRTqRT--PCR (quantificar a expressão de um gene)PCR (quantificar a expressão de um gene)PCR em tempo real (realPCR em tempo real (real--time)time)

Kary Mullis Kary Mullis 19831983

Orientação de uma Orientação de uma cadeia de DNA ou cadeia de DNA ou RNA: RNA: extremidade 5’ e extremidade 5’ e extremidade 3’extremidade 3’

O3PO

5’

3’

LembretesLembretes

Exemplo de um Exemplo de um oligonucleotídiosoligonucleotídios

5’d(CGAAT)5’d(CGAAT)

Notar que é bem Notar que é bem diferente de diferente de 5’d(TAAGC)5’d(TAAGC)

LembretesLembretes

As duas fitas de As duas fitas de DNA correm em DNA correm em sentidos opostossentidos opostos

Pontes de Pontes de HidrogHidrogêênio na dupla hnio na dupla héélice lice

AA forma 2 pontes de forma 2 pontes de hidroghidrogêênio nio com com TT na fita opostana fita oposta

GG forma 3 pontes de forma 3 pontes de hidroghidrogêênionio com com CC na fita opostana fita oposta

LembretesLembretes

2 fitas complementares2 fitas complementares

A DNA A DNA polimerase polimerase necessita de um trecho de necessita de um trecho de dupla fita para se ancorar e iniciar a síntese dupla fita para se ancorar e iniciar a síntese

da segunda fita de “ polímero” de DNA da segunda fita de “ polímero” de DNA baseandobaseando--se na fita complementar que serve se na fita complementar que serve

de matrizde matriz

A DNA A DNA polimerase polimerase funciona sempre funciona sempre adicionando bases na ponta 3´ portanto a fita adicionando bases na ponta 3´ portanto a fita

cresce de 5´ para 3´cresce de 5´ para 3´

Pergunta: Então qual a direção da fita matriz?Pergunta: Então qual a direção da fita matriz?

2

dGTP

dATP

dATP

dCTP

dCTP

dTTP

dCTP primersprimers

dNTPdNTP

MgClMgCl

TaqTaq DNADNA polimerasepolimerase

DNADNA

dGTP

REAGENTES PARA PCRREAGENTES PARA PCR

Thermus aquaticusThermus aquaticus

Desnaturação por Desnaturação por calorcalor

Ação deAção de Taq DNApolimerase Taq DNApolimerase

Cópia Cópia

Associação dos Associação dos ““primersprimers””

primersprimers

Fita 5’Fita 5’Fita 3’Fita 3’

PCRPCR

GG

TTCC

AA

1 21 22 42 43 83 84 164 165 325 326 646 647 1287 1288 2568 2569 5129 51210 102410 102411 204811 204812 409612 409613 819213 819214 1638414 1638415 3276815 3276816 6553616 6553617 13107217 13107218 26214418 26214419 52428819 52428820 104857620 104857621 2,0. 1021 2,0. 1066

22 4,1. 1022 4,1. 1066

23 8,3 . 1023 8,3 . 1066

24 16,7 .1024 16,7 .1066

25 33,5 .1025 33,5 .1066

26 67,1 .1026 67,1 .1066

27 1,34 .1027 1,34 .1088

28 2,68 .1028 2,68 .1088

29 5,36 .1029 5,36 .1088

30 1.1030 1.1099

Aplicação: amplificação de uma Aplicação: amplificação de uma seqûencia seqûencia de de bases, desde que fornecidos os iniciadores bases, desde que fornecidos os iniciadores ((primersprimers) = especificidade) = especificidade

Vantagens: utilização de diminuta quantidade de Vantagens: utilização de diminuta quantidade de matrizmatriz

Desvantagens: conhecimento prévio da Desvantagens: conhecimento prévio da sequência sequência e amplificação de errose amplificação de erros

Visão do DNA por fluorescênciaVisão do DNA por fluorescência

antes e....antes e....

depois do PCRdepois do PCR

acesso restritoacesso restrito

roupa e cabelosroupa e cabelosadequados, adequados, uso de luvasuso de luvas

e...e...

PROCESSAMENTOPROCESSAMENTO

ÁREA 1ÁREA 1

ÁREA 3ÁREA 3

ÁREA 2ÁREA 2preparo de reagentes

extração deDNA ou RNA

reação de amplificação e

detecção

CONTROLE DE CONTROLE DE CONTAMINAÇÃOCONTAMINAÇÃO

fluxo laminarfluxo laminar

separação de áreasseparação de áreas

desinfecçãodesinfecção frequentefrequente e luz ultre luz ultravioletaavioletaautoclavagemautoclavagem do material biológdo material biológicoicoacondicionamento como lixo hospitalaracondicionamento como lixo hospitalar

AplicaçõesAplicações •• Investigação forense Investigação forense

•• AntropologiaAntropologia

•• PaternidadePaternidade

•• Linhagens animaisLinhagens animais

•• IdentificaçãoIdentificação de de PatógenosPatógenos

•• Identificação Identificação de de doençasdoenças

•• Transgenia Transgenia

•• Identificação Identificação de de restos restos humanoshumanos

•• Monitoramento Monitoramento de de transplantes transplantes e e pêga pêga de de enxertosenxertos

Seqüências repetitivas no DNASeqüências repetitivas no DNA

MinisatélitesMinisatélites muito muito polimórficospolimórficos15 15 -- 70 pb70 pb

SatélitesSatélites 5 5 -- 100 pb100 pb poucopoucopolimórficospolimórficos

MicrosatélitesMicrosatélites 2 2 -- 6 pb6 pb muitomuitopolimórficospolimórficos

O que é um alelo de O que é um alelo de microsatélite microsatélite ??

CCATGCCATGATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT

CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT

alelo 1alelo 1

alelo 2alelo 2

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTTCCATGCCATGATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT alelo 3alelo 3

alelo 4alelo 4

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT alelo 5alelo 5

““slippageslippage””

A A evidência coletada evidência coletada na cena na cena do crimedo crime

Blood TissueSemen

UrineHair

Teeth Saliva Bone

O DNA é O DNA é extraído da extraído da vítima vítima e dos e dos suspeitossuspeitos

Cena do Crime !

Determine qual o suspeito que não pode ser excluído....

CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 1alelo 1

CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 2alelo 2

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 4alelo 4

M M Mm f p p/f m f p p/f D4S139D4S139P

CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 1alelo 1

CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 2alelo 2

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 4alelo 4

alelo mutantealelo mutante

Microsatélites como Marcadores de DoençaMicrosatélites como Marcadores de Doença

CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT

CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT

alelo 1alelo 1

alelo 2alelo 2

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTTCCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT alelo 1alelo 1

alelo 4alelo 4

CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGAATTTTTTTTTT

CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT

alelo 2alelo 2

alelo 5alelo 5

nas meningitesnas meningitesporpor virusvirus como herpes simplescomo herpes simplesporpor microbactériasmicrobactérias: tuberculose : tuberculose

no recém nascidono recém nascidoHIVHIVdoenças genéticasdoenças genéticas

nas infecçõesnas infecçõesjanela imunológica janela imunológica

DIAGNÓSTICOS DIAGNÓSTICOS DIFÍCEISDIFÍCEIS

Preparo dos Preparo dos reagentesreagentespara PCRpara PCR

amplificaçãoamplificação

eletroforeseeletroforese

documentaçãodocumentação

análise de tecido tumoralanálise de tecido tumoral

RNA+

QS

RT-PCR da porção 5’UTdo genoma HCV

com primer biotinilado

adição desolução denaturante

no poço: sonda de DNA interna

reação colorimétricae leitura da placa de ELISA

QSQS

amostraamostra ctrlctrl++ ctrlctrl--

Detecção Quantitativa de Detecção Quantitativa de HIVHIV

produto

QSQSQS

adição de avidinaconjugada à peroxidase

******

Ilhotas Normais

Tumoral - Insulinoma

DNA DNA Microarrays Microarrays –– CodeLink CodeLink (20000 genes)(20000 genes)

SeqüenciamentoSeqüenciamento

Frederick SangerFrederick Sangerganhou 2 prêmios ganhou 2 prêmios Nobel!Nobel!

tecido tumoraltecido tumoral

p53 ....p53 ....

doenças genéticasdoenças genéticas

fibrose císticafibrose cística

hemoglobinopatiashemoglobinopatias

bactériasbactérias

vírus:vírus: genotipagemgenotipagem

medicina forensemedicina forense

paternidadepaternidade

histocompatibilidadehistocompatibilidade

SEQUENCIAMENTOSEQUENCIAMENTO