apostila PARASITOLOGIA CLINICA.pdf

8/10/2019 [PDF] apostila PARASITOLOGIA CLINICA.pdf

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Taenia sp. Strongyloides stercoralis Trichuris trichiura

Universidade Jos do Rosrio Vellano


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Esfregao de sangue a fresco:

-Esse mtodo o mais fcil e a forma menos cara de mostrar a presena de parasitas em

sangue, porm o menos sensvel.

-Materiais:

Lanceta

Swab de algodo

Lamnula

Lmina

Soluo Salina

lcool

-Mtodo:

1- Escolha o terceiro dedo a partir do polegar. Limpe o dedo com swab de algodo levemente

umedecido em lcool. Seque bem. Fure o dedo com a lanceta.

2- Colete a primeira gota de sangue que aparecer e coloque-a diretamente no meio da lmina.

3- Adicione uma gota igual de soluo salina. Misture o sangue e a soluo salina usando a

ponta da lamnula. Cubra o preparado com a lamnula.

4- Examine o esfregao sistemicamente no microscpio (objetiva de 10X com ajuste de

condensador reduzido). O primeiro sinal de presena de tripanossomas ou microfilrias vivos o movimento rpido entre as clulas vermelhas.

5- Observe todo o preparo sistematicamente. O tripanossoma refratrio e difcil de ver, por

isso deve-se reduzir a luminosidade.

Pesquisa de hematozotos no sangue perifrico:

A pesquisa por diagnstico da malria pode ser realizada por:

-esfregaos finos (gota estirada ou esfregao em camada delgada)identificao

-esfregao em cama espessa (gota espessa)mais utilizado para diagnstico epidemiolgico

-Notanormalmente utiliza-se duas tcnicas em uma mesma lmina

-Coleta de amostras dever ser feita preferencialmente no pico febril por puno digital ou

coleta venosa.

-Tcnica:


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- Esfregaos sanguneos pelo Giemsa:

-para uma boa colorao, os esfregaos finos e espessos devem ser feitos em lminas

separadas em diferentes concentraes e tempo usado para coloraes. Melhores resultados

so obtidos se o esfregao sanguneo secou de um dia para o outro.

Tcnica:

1-

Fixe o esfregao fino adicionando 3 gotas de metanol, ou mergulhando em um

recipiente com metanol por poucos segundos. Com fixao prolongada pode ser difcil

demonstrar o grnulo de Schuffner e o grnulo de Maurer. Para permitir a

desemoglobinao, o esfregao espesso no pode ser fixado, portanto, evite aexposio ao metanol ou ao vapor do mesmo.

2-

Coloquem as lminas de costas uma para outra na cuba com o corante.

3- Prepare a soluo Giemsa 3% em gua tamponada, pH 7,2 em quantidade suficiente

para completar o numero de cubas usadas. Agite bem o corante.

4-

Despeje o corante com delicadeza na cuba at as laminas estarem totalmente

cobertas.

5- Deixe corando por 30-45 minutos fora da luz solar.

6- Lave com gua limpa.

7- Remova a lmina uma a uma e coloque-as numa estante de laminas para drenar e

secar com o lado do esfregao voltado para baixo, certificando-se de que o esfregao

no toque na estante.

-Mtodo rpido para esfregaos sanguneos finos e espessos na mesma lmina:

1-

Deixe o esfregao espesso secar completamente; se resultados urgentes forem

requisitados, a secagem poder ser apressada por ventilao ou por exposio breve

ao calor brando, assim como a lmpada do microscpio.

2-

Fixe o esfregao fino pincelando-o com algodo embebido em metanol ou imergindo-o

em um recipiente com metanol por poucos segundos. Para ocorrer a

desemoglobinao, o esfregao espesso no deve ser fixado.

3- Prepare uma soluo Giemsa 10% em gua tamponada, destilada ou deionizada, pH

7,2; se pouca quantidade estiver sendo usada, 3 gotas de corante por mL de gua


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tamponada dar a correta concentrao da soluo Giemsa. Uma lmina requer mais

ou menos 3mL de corante feito.

4- Coloque delicadamente o corante na lmina, uma pipeta pode ser usada para isso.

5-

Core de 5 a 10 minutos.

6- Lave a lmina com gua limpa, e coloque-a para secar em estante prpria.

- Soluo tamponada pH 7,2:

-Dissolver 3,0g de fosfato hidrogenado dissdico anidro (Na2HPO4) e 2,1g de fosfato

hidrogenado de potssio (KH2PO4) em 25 mL de gua destilada ou deionizada.

-Ajuste o pH em 7,2 com peagmetro ou papel indicador.

-Armazene em frasco mbar.

-Para preparar a soluo de trabalho, dilua 1 mL do concentrado com 20 mL de gua

destilada ou dionizada.

-Corante Giemsa:

-p Giemsa..................................................................................................................3,8 g

-metanol..................................................................................................................250mL

-glicerol....................................................................................................................250mL

-adicione o metanol, o p Giemsa, misture e ento adicione o glicerol.

OBS.: aconselhvel o uso de prolas de vidro para facilitar a agitao. Este corante

encontrado comercialmente.


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Mtodo rpido para colorao de esfregaos sanguneos finos e espessos pelo

GIEMSA:

1-

O esfregao deve estar totalmente seco.

2- Fixe o esfregao fino pincelando-o com algodo embebido em metanol ou

imergindo-o em um recipiente com metanol por poucos segundos. Para ocorrer a

desemoglobinao, o esfregao espesso no deve ser fixado.

3- Prepare uma soluo Giemsa 10% em gua tamponada, destilada ou deionizada,

pH 7,2; se pouca quantidade estiver sendo usada, 3 gotas de corante por mL de

gua tamponada dar a correta concentrao da soluo Giemsa. Uma lmina

requer mais ou menos 3mL de corante feito.

4- Coloque delicadamente o corante na lmina, uma pipeta pode ser usada para isso.

Alternativamente, as laminas devem ser colocadas de face para baixo numa placa

cncava e o corante pode ser introduzido por baixo da lmina.

5-

Core de 5 a 10 minutos.

6- Delicadamente, escorra o corante fora da lmina por adio de gotas de gua, no

incline a lamina e no lave.

7- Coloque a lamina na estante, com o lado do esfregao voltado para baixo, para

drenar e secar. Certifique-se de que o esfregao no est tocando a estante.

gua tamponada pH 7,2:

-Dissolver 1,0g de fosfato hidrogenado dissdico anidro (Na2HPO4) e 0,7g de fosfato

hidrogenado de potssio (KH2PO4) em 1L de gua destilada ou deionizada.

-Ajuste o pH em 7,2 com peagmetro ou papel indicador.

-Armazene em frasco mbar e guarde ao abrigo da luz.


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Identificao de parasitas de malria em esfregaos sanguneos finos:

-O analista deve observar as clulas vermelhas do sangue infectadas e o parasita no

interior das mesmas.

-Clulas vermelhas infectadas:

Observar o tamanho e a presena de granulaes;

Clulas aumentadas com grnulos de Shuffner presentessugere P. vivax ou P. ovale;

Clula normal com grnulos de Shuffner ausentesP. malarie ou P. falciparum.

OBS.: se forem vistos P. falciparum, a porcentagem da parasitemia (n de clulas

vermelhas infectadas por cento) deve ser relatada.

Mtodo de contagem de parasitas da malria em esfregaos sanguneos espessos:

Baseia-se no nmero de parasita por microlitro de sangue em esfregao espesso, este

sendo contado em relao ao nmero predeterminado de leuccitos. Uma mdia de

8.000 leuccitos por microlitro tomada como padro. Apesar de imprecises devido

a variaes do n de leuccitos entre indivduos com a sade normal, e grandes

variaes em doentes, este padro permite comparaes razoveis.


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Tcnica:

-Se aps contados 200 leucocitos, 10 ou mais parasitas forem identificados, anote o

resultado, mostrando o n de parasitas por 200 leuccitos.

-Se aps 200 leuccitos, 9 ou menos parasitas forem encontrados, continue contando

at que 500 leuccitos tenham sido contados, anote o n de parasitas por 500

leuccitos.

-Converter os resultados para microlitros de sangue pela frmula:

N de parasitas x 8000 = N de parasitas por microlitro de sangue

N de leuccitos

-Isto significa que, se 200 leucocitos forem contados, o n de parasitas multiplicado

por 40, e se 500 leucocitos forem contados, multiplica-se o n de parasitas por 16.

Sistema de cruzes:

+: 1 a 10 parasitas por 100 campos de esfregao espesso

++: 11 a 100 parasitas por 100 campos de esfregao espesso

+++: 1 a 10 parasitas por campo de esfregao espesso

++++: mais de 10 parasitas por campo de esfregao espesso

OBS.: itens que podem ser confundidos com parasitas da malria:

-plaquetas aderidas s clulas vermelhas do sangue em esfregaos finos.

-fragmentos de clulas brancas em esfregao espesso.

-aglomerado de plaquetas.

-p, bactria, leveduras, esporos vegetais e outros organismos que aparecem no

esfregao sanguneo enquanto ele est secando.


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Sorologia para Chagas:

-Sinonmia: Machado guerreiro pesquisa de anticorpos T. Cruzi Sorologia para

tripanossomase.

-Mtodo: imunofluorescncia, hemaglutinao, contaminao bacteriana.

-Interpretao: teste til no diagnstico da infeco por T. Cruzi, que pode

corresponder a doena de Chagas ou quadros de infeco latente, sem qualquer

expresso clnica.

OBS.: reaes falso-positivos ocorrem com frequncia em pacientes com leishmaniose.

-Enzimaimunoensaio:

-Interferentes: soro muito lipmico.

-Valor de referncia: negativo

-Interpretao: um ensaio imunoenzimtico in vitro para deteco qualitativa do

anticorpo contra o T. cruzi.

-Hemaglutinao:

-Mtodo: hemaglutinao passiva.

-Interferentes: soros lipmicos, leishmaniose.

-Interpretao: hemcias de aves estabilizadas e sensibilizadas com antgenos totais de

T. cruzi, so aglutinadas quando colocadas em contato com diluies de soro de

pacientes chagsicos.

-Imunofluorescncia:

-Interferentes: hemlise, lipemia.

-Interpretao: os anticorpos presentes no soro de pacientes chagsicos quando

colocados sobre uma lmina contendo antgeno de T. cruzi, previamente fixado, so

revelados atravs de uma antiglobulina humana, marcada pela fluorescncia,

formando um complexo antgeno-anticorpo cunjugado.

-Xenodiagnstico:

-Mtodo de diagnstico indireto de escolha quando se quer detectar o parasita na fase

crnica da doena.

-Mtodo Natural:


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-Pega-se barbeiros estreis (criados em laboratrio), alimentados com sangue de aves

e coloca-se os mesmos no antebrao do paciente (dentro de uma caixa de fil).

-Deixar o paciente em repouso para que o inseto se alimente. Rotular as caixas com

nome e data.

-Quando os insetos estiverem cheios de sangue, estes sero mantidos em condies

adequadas (umidade70%, Temperatura 26C).

-Aos 30, 60 ou 90 dias, as fezes do inseto so examinadas (presso abdominal por

pina), por exame direto para visualizao de formas epimastigotas e tripomastigotas.

Esse material pode tambm ser inoculado em cobaias ou mantidos em meio de

hemocultura (LIT).

-O mtodo artificial utilizado quando o paciente tem alergia a picada do barbeiro.

-Mtodo do micro-hematcrito:

-Material: Fita adesiva

Tubo capilar

Centrfuga de micro-hematcrito

-Mtodo:

1- fure o dedo do paciente e coloque 2 gotas de sangue na lmina. Adicione 1 gota de

soluo de citrato de sdio 2% e misture. Complete o tudo capilar at de sua

capacidade.

2- vede a ponta do tubo capilar.

3- centrifugue por 2 minutos para microfilrias, e 4 minutos para tripanossomos.

4- deite o tubo capilar numa lmina e prenda as extremidades com fita adesiva para

manter o tubo fixo.

5 com objetiva 10X examine a rea entre as clulas vermelhas e o plasma. Microfilrias

mveis ou tripanossomos podem ser vistos.

OBS.: a OMS preconiza pelo menos dois mtodos sorolgicos para confirmao de

diagnstico positivo para Doena de Chagas.


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Sorologia para toxoplasmose:

-Hemaglutinao:

-Material: soro (mnimo 1mL).

-Preparo do paciente: jejum de 8 horas.

-Interferentes: hemlise.

-Interpretao: os soros, dando reao negativa, so reportados como reagentes e

indicam ausncia de infeco atual. Entretanto, no caso de suspeita clnica da

toxoplasmose aguda, o teste deve ser repetido depois de alguns dias, pois o paciente

pode estar ainda na fase pr-sorolgica da infeco. Todos os soros com resultados

positivos devero ser testados pelo procedimento quantitativo para a confirmao de

positividade e determinao do perfil sorolgico.

-Toxoplasmose IgG e IgM:

-Material: soro (mnimo 1mL).


-Mtodo: imunofluorescncia.

-Interferentes: hemlise, lipemia.

-Valor de referncia: at 1:4000

-Interpretao: as infeces por Toxoplasma gondii esto muito difundidas em seres

humanos e animais, e na maioria dos casos transcorrem sem sintomas clnicos. Em

regies diferentes, e dependendo da idade, os adultos tem anticorpos IgG em nveis de

50% dos casos, e com isso estaro protegidos contra uma nova infeco. A primeira

infeco por Toxoplasma tem grande importncia durante a gravidez (principalmente

na segunda metade). O agente patognico pode contagiar o feto atravs da placenta,

no qual levar ao aborto, ao parto prematuro ou a natimortalidade, como tambm

pode produzir danos graves como hidrocefalia, calcificao intracerebral ou, em casos

leves, ao retardamento cerebral. Somente a primeira infeco pode conduzir a danos

fetais, ao filho e a mulher que, antes da gravidez, j apresenta anticorpos especficos

contra o Toxoplasma gondii.

Toxoplasmoseperfil

-Material: soro ou lquor (mnimo 1mL).



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-Interferentes: lipemia excessiva.

-Valores de referncia:

Hemaglutinao: at 1:4000

IF indireta IgM: negativo

Fixao do complemento: no-reagente

Perfil I: fase aguda

Perfil II: fase de transio

Perfil III: fase crnica

-Interpretao: teste til no diagnstico e seguimento da toxoplasmose. So definidos

3 padres sorolgicos, cuja finalidade determinar aproximadamente o perodo de

incio da infeco.

-Perfil I: infeco recente, com IgM positiva, IgG em altos ttulos iguais ou superiores a

1:8000, fixao ao complemento com ttulos elevados (iguais ou superiores a 1:160)

-Perfil II: fase de transio, IgM negtiva e IgG e hemaglutinao com altos ttulos.

OBS.: pode-se encontrar vestgios de IgM.

-Perfil III: infeco antiga, IgM negativa, IgG e hemaglutinao em baixos ttulos,

fixao em complemento negativa ou em baixos ttulos.

-Risco de transmisso congnita:

-Perfil I: riscos de transmisso.

-Perfil II: dvidas quanto ao risco.

-Perfil III: sem riscos de transmisso.

OBS.: gestante de riscoaquela que nunca entrou em contato com o toxoplasma (IgG

e IgM negativas).

-para diagnstico da toxoplasmose congnita, o melhor indicador sorolgico o IgM,

pois, este no atravessa a placenta.

-o IgG ser indicativo de transmisso congnita se o ttulo do recm-nascido for maior

do que o da me em duas diluies.


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Diagnstico laboratorial de Leishmaniose:

-Reao de Montenegrointradermorreao:

Avalia a reao de hipersensibilidade do paciente frente a um antgeno especfico.

til para diagnstico ou monitoramento epidemiolgico.

-Sensibilidade: 80-100%

-Princpio: inoculao de um antgeno especfico intradermicamente, dando

preferncia s formas promastigotas inculas.

-Material: Antgeno inativado

Seringa de 1mL

Algodo

-Mtodo:

-Inocular o,1 mL do antgeno intradermicamente na face interna do brao.

-Realizar leitura em 48-72 horas e observar formao de ppula.

OBS.: tempo de leitura superior ou inferior ao proposto pode levar a resultados

errneos.

-Resultado:

-Positivo: formao de uma reao inflamatria local (ppula), no tendo sido

estabelecido valor numrico para medida desta reao.

-Negativo: ausncia de reao inflamatria.

OBS.:

-Na forma cutnea simples da LTA, a reao inflamatria varia com a evoluo da

doena, sendo maior nas lceras crnicas.

-Forma mucosa de LTA: reao inflamatria intensa (paciente hiper-reativo)

-Forma difusa: reao negativa (deficincia imunolgica do paciente)

Pesquisa de Leishmaniose:

-Material: raspado de lceras, material de puno, sangue total.

-Colheita: no caso de lceras cutneas, o material deve ser obtido por curetagem junto

a derme e nas bordas da leso.

-Mtodo: microscopia sob imerso / colorao Giemsa.

-Interferentes: medicao tpica.


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-Interpretao: exame til no diagnstico de Leishmaniose, sendo mtodo especfico,

porm, de baixa sensibilidade no caso de leses cutneas. Aconselha-se realizao de

cultura em meio NNN, reao de Montenegro e sorologia.

-Sorologia para Leishmaniose (principalmente LV):

-Material: soro

-Mtodo: Imunofluorescncia indireta

-Interferentes: reao cruzada com Doena de Chagas

-Interpretao: na Leishmaniose Visceral os ttulos so altos (acima de 1/160). Na L.

tegumentar, os ttulos so baixos e tendem a se correlacionar com as extenses das

leses.

OBS.: Meio NNN (McNeal, Novy e Nicolle)

gar...............................................................................................................................14g

NaCl.................................................................................................................................6g

gua Destilada.........................................................................................................900mL


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reas de atuaoLeishmanioseDiagnsticoExame Direto

1. EXAME DIRETO (generalidades)

a tcnica de exame laboratorial que permite visualizar em menor tempo possvel,

fresco ou atravs de colorao, a forma do agente determinante da infeco (vrus,

bactria, protozorio, fungo, helminto, artrpode, etc.), em determinado material

biolgico suspeito (sangue, urina, fezes, exsudatos, linfa-drmica, medula, etc.).

A.

EXAME DIRETO NO DIAGNSTICO DE LEISHMANIOSES

1.1

FUNDAMENTOpermite visualizar atravs da fixao pelo metanol e posterior

colorao pelo GIEMSA, as formas de AMASTIGOTA ou PROMASTIGOTA, no

diagnstico das Leishmanioses Tegumentares (LT), na Leishmaniose Visceral (LV) e/ou

no contedo de tubo digestivo do inseto transmissor infectado (Lutzomyia, Diptera,

Psychodidae), dependendo da amostra biolgica em exame.

AMASTIGOTA nas escarificaes, aspirado ou bipsia do Homem ou outro

hospedeiro vertebrado, nas leses de LT, ou atravs de puno-biopsia de

gnglio (LT e LV), e de medula ssea ou de bao na LV.

Encontrada em pele e vsceras do reservatrio na natureza e, em laboratrio,

em cobaias (hamster) infectados.

PROMASTIGOTAS no vetor infectado, no sangue de alguns reservatrios eem meios de cultura.

PARAMASTIGOTAS encontradas fixadas atravs de hemidesmossomas ao

epitlio do intestino do vetor.

2.

AS TCNICAS DE COLETA (descrio anexa): Na LT, LC ou LM aps a

escatificao, biopsia e/ou aspirado, pode-se proceder ao exame direto a partir do

esfregao em lmina de vidro. A biopsia permite o exame direto atravs da

aposio ou imprint do tecido em lmina, para impresso da linfa-drmica.

Esperar secar, fixar pelo metanol e, em seguida, corar pelo GIEMSA (secar a

amostra em papel-filtro estril antes do imprint); Na LV na puno de medula

(mielograma), gnglio ou de bao, o exame pode ser feito a partir de rpido

esfregao de medula em lmina, que aps seca e fixada pelo metanol, sofre o

mesmo processo de colorao, citado anteriormente.

3. COLORAO PELO GIEMSA: Antes da colorao, deve-se atender alguns itens

importantes:


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3.1 Se no foi voc a realizar a coleta, verificar se as lminas contm material, se tm

identificao correta segundo a solicitao e, se possvel, que contenha o n do

registro, nome do paciente, idade, procedncia, sexo, data da coleta e suspeita

clnica (LV, LM, LCM ou LC).

3.2 Registrar o paciente no livro (ou similar) de entrada de seu laboratrio.

3.3 Se houver dvida quanto fixao das lminas, melhor repeti-la com metanol (PA)

em volume suficiente para cobrir a amostra.

3.4

Calcular o volume total da SOLUO-CORANTE GIEMSA a ser usado, na proporo

de 3mL de soluo por lmina a corar.

3.5 3.5 em proveta de 25mL, pingar de 2 a 3 gotas da SOLUO-ESTOQUE GIEMSA (ver

receita anexa), cuja concentrao varia entre laboratrios, quanto a tempo de

utilizao, maneira de conservao, etc, e completar o volume calculado no item

anterior com SOLUO TAMPO-SULFATO ou GUA TAMPONADA pH = 7.2, e ter

a SOLUO-CORANTE GIEMSA pronta para ser usada.

Exemplo 1: Para corar 20 lminas de 10 pacientes, preciso de 20 x 3mL = 60mL de

SOLUO-CORANTE GIEMSA ou SOLUO-USO.

Preparao da SOLUO-CORANTE GIEMSA: 2 gotas x 60 = 120 gotas (ou 6 mL) de

SOLUO-ESTOQUE GIEMSA que se deve pingar em proveta e completar o volume

para 60 mL com SOLUO TAMPO-SULFATO ou GUA TAMPONADA pH = 7.2.

Exemplo 2: Para cada 15 mL de gua tamponada, usar 30 gotas (ou 1,5 mL) de Giemsa

soluo-estoque e ter uma soluo corante GIEMSA para uso (SOLUO-USO).

3.6 As lminas podem ser mergulhadas na soluo ou esta deve cobrir apenas a face

que contenha a amostra, por tempo que tambm varia de acordo com a qualidade

do corante. Normalmente, aguarda-se 60 minutos, mas desejando o tempo de

colorao mais rpida e dispondo-se de estufa, o tempo pode ser encurtado para

15 a 30 minutos temperatura de 37C.

3.7 Desprezar, limpar o excesso do corante e lavar as lminas em gua corrente, fluxo

suave, evitando jatos fortes para a amostra no se desprender e, em seguida,

sec-las temperatura ambiente ou ventilao, evitando o calor.

3.8 Levar ao microscpio, focalizar e examinar em lente de imerso, procurando as

formas do parasita correspondentes amostra em exame.


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3.9 A microscopia da Leishmania qualitativa e mais simples que a do Plasmodium

(que exige contagem de parasitemia), pois, a partir de uma Amastigota, o

resultado positivo, mas em ambos o resultado negativo o mais difcil, pois,

exige exaustivo exame de toda a amostra.

3.10 Registrar o resultado no livro do exame direto e de entrada do laboratrio, se

possvel, datilografar o resultado e encaminhar ao mdico solicitante.

OBS.: imprescindvel o controle de qualidade interno, com reviso de no mnimo

10% das lminas positivas e 15% das negativas, por outro microscopista mais

experiente do servio, e o controla inter-laboratorial com o laboratrio de referencia

do SNLB, ao qual estiver ligado.

SOLUO-ESTOQUE GIEMSA

Giemsa (p)* 7,5g Giemsa (soluo)* 50 mL

Glicerina P.A. 350mL ou Glicerina (P.A.) 23mL

Metanol P.A. 650mL Metanol (P.A.) 43mL

OBS.: *conforme o adquirido pelo laboratrio, melhor a soluo preparada a partir

do p.

-Dissolver em agitador magntico (se disponvel), em recipiente revestido com papel

alumnio, protegendo de luz e agitar por 1 a 2h. Filtrar, estocar em frasco mbar ou

outro tipo que proteja da luz ambiental, rotulado com nome da soluo, data de

preparao e nome de quem a preparou. Guardar em geladeira, retirando alquotas

em frascos mbar menores para utilizar na rotina conforme a necessidade da

SOLUO-USO, quando ser diluda na soluo tampo-fosfato.

SOLUO TAMPO-FOSFATO

Fosfato de Potssio H2KPO4 0,6g

Fosfato de Sdio (bibsico) Na2HPO4 7,5g

H2O destiladaqsp 1000mL


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Dissolver em agitador magntico, medir pH = 7,2, acondicionar em frasco rotulado

(nome da soluo, pH, data de preparao e nome ou iniciais de quem a preparou) e

conservar para uso na rotina, em temperatura ambiente.

OBS.: Existem outras formulas disponveis, inclusive as que usam somente sais

fosfatados; pode-se tambm prepara-las em solues concentradas, SOLUO-

ESTOQUE ou SOLUO-ME, para diluies na hora da utilizao.

COLORAO PELO PANTICO RPIDO

Importante Esta uma tcnica de colorao alternativa ao GIEMSA tradicional.

Tambm constituda por corantes que compem o GIEMSA, tem como maior

vantagem, a rapidez no processo de colocao (3 minutos ou menos), vindo a

beneficiar o doente com um diagnstico mais rpido.

-Imergir a lmina j com esfregao ou imprint, seco por um (1) minuto no Fixador ou

Soluo 1.

-Retirar as lminas do Fixador, apoiar o excesso no papel toalha e, em seguida, voltar a

imergi-la no Revelador ou Soluo 2 por mais um minuto.

-Aps retirar do Revelador, tornar a apoiar o excesso no papel toalha e agora, colocar

no Corante ou Soluo 3 por mais um minuto.

-Aps esse tempo, lavar as lminas em agua corrente, fluxo suave, evitando jatos

fortes e, em seguida, sec-las temperatura ambiente, ou estufa 40C.

-Levar ao microscpio, focalizar e examinar em imerso, procurando formas do

parasita correspondentes a amostra de em exame.

- A microscopia da Leishmania qualitativa e mais simples que a do Plasmodium (queexige contagem de parasitemia), pois, a partir de uma Amastigota, o resultado

positivo, mas em ambos o resultado negativo o mais difcil, pois, exige exaustivo

exame de toda a amostra.

-Registrar o resultado no livro do exame direto e de entrada do laboratrio, se

possvel, datilografar o resultado e encaminhar ao mdico solicitante.


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OBS.: imprescindvel o controle de qualidade interno, com reviso de no mnimo

10% das lminas positivas e 15% das negativas, por outro microscopista mais

experiente do servio, e o controla inter-laboratorial com o laboratrio de referencia

do SNLB, ao qual estiver ligado.

SOLUO PANTICO RPIDO*

Fixador (soluo 1)

Revelador (soluo 2)

Corante (soluo 3)

*Nome comercial da Laborclin

B. ROTINA PARA TCNICAS DE COLETAS DE AMOSTRAS PARA EXAMES NO

DIAGNSTICO DAS LEISHMANIOSES

1.

A ESCARIFICAO (procedimento tcnico)

1.1

Registrar o doente, conforme a solicitao do mdico e as normas do laboratrio

(livro de registro de entrada + questionrio e n de laboratrio), conferindo dados

de identificao e epidemiologia, informando-o sobre o exame que vai ser

submetido.

1.2

Separar os materiais necessrios para o exame (lista abaixo).

1.3Usar luvas.

1.4Escolher o local para o exame, que deve ser a leso mais recente e com menos

infeco secundria.

1.5

Lavar a leso com gua e sabo, ou soro fisiolgico.

1.6

Fazer assepsia ou limpar a regio a ser escarificada com gaze ou algodo embebido

de lcool 70% ou 96%, trocando 3 a 4 vezes. No usar lcool iodado, se interessar

preservar a viabilidade do parasita ou em caso de alergia do paciente.

1.7

Usar anestsico em gel ou adesivo (EMLA) no local a examinar.

1.8

Utilizar estilete ou lanceta, palito de madeira com a ponta em bisel, escarificador

de Naiff ou lmina de bisturi esterilizados (por serem descartveis, preferimos

coletar com a lateral do estilete ou lanceta, usado no exame de sangue da


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malria). Comprimir a pele (LC) da borda da leso entre os dedos, para provocar a

isquemia do tecido e, ao mesmo tempo, deve-se escarific-lo de modo a conseguir

a linda, preferencialmente sem sangue.

1.9

Proceder os esfregaos em numero e tamanho padronizados/lmina e, no mnimo,

em trs lminas de vidro, previamente limpas, identificadas e ainda, friccionadas

em tecido de algodo limpo, momentos antes da coleta.

1.10 Lembrar que a escarificao tambm permite, se necessrio, colher material

para cultura, inoculao em animal ou para congelao para estudos em biologia

molecular.

1.11 Cuidar do doente, fazendo curativo compressivo com gaze e esparadrapo e

orientar a retira-lo aps 24 horas do exame.

1.12

Fixar o material das lminas com metanol ou lcool metlico por 3 a 5 e

reservar para colorao.

2. A BIPSIA (procedimento tcnico)

2.1Proceder como nas condutas listadas de 1.1 a 1.6 do item anterior (escarificao).

2.2

Anestesiar a regio a partir de um determinado ponto da pele, com injeo

subcutnea de lidocana 2%, sem adrenalina, infiltrar cerca de 0,2 a 0,5mL. Usar,

preferencialmente, seringas tipo tuberculina, com agulhas removveis, tendo

cuidado de sempre trocar a que aspira o anestsico do frasco por uma nova agulha

a ser utilizada no paciente.

2.2.1 Aguardar o tempo de ao do anestsico e proceder bipsia, utilizando

punch de 4 ou 5 mm de (pele e outras localizaes) e de 2 mm de em

pele da face. Movimentar o punch em rotao de meio crculo para a esquerda

e direita, alternadamente, e quando se chegar derme (a amostra comea a

ser visualizada no espao aberto do punch), a movimentao deve passar a ser

em sentido levemente inclinado de 45, no intuito de seccionar a base do cone

da bipsia. Se houver dificuldade de cortar a base com o punch ou bisturi, usar

a tesoura, cortando para baixo. Evite usar a pina. A bipsia tambm pode ser

feita com bisturi, na falta do punch, mas nos dois procedimentos evitar

pontear, porque, na Leishmaniose, possibilita a ampliao da leso. Fazer a

hemostasia compressiva por 1 a 5. Deixar o punch com a amostra em placa

de Petri estril.


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2.3Na musocsa nasal, usar anestsico tpico, em spray, sem sabor e jatear de 3 a 4

vezes, com intervalos de 5 minutos. Biopsiar a mucosa lesada com pina STORZ.

Cuidar do doente, fazendo curativo compressivo com tampo de gaze e orientar

retir-lo aps cessar o sangramento.

2.4Cuidar do doente, fazendo curativo com gaze e esparadrapo, e orientar retir-lo 24

horas aps o exame.

2.5Separar a amostra do punch e seccionar, usando pina de dissecao e bisturis

esterilizados, no sentido longitudinal epiderme-derme, de modo a dividi-la em

fragmentos (secar em papel filtro) para o exame direto, cultura e inoculao em

animal (em soluo salina), histopatologia (formol a 10%) e/ou congelamento para

procedimentos em biologia molecular.

2.6

Alguns preferem separar e no utilizar a epiderme.

OBS.: A bipsia de pele ou mucosa considerada ato mdico, e a de mucosa s deve

ser feita aps treinamento especializado ou por Otorrinolaringologista.

3. O ASPIRADO (procedimento tcnico)

3.1

Procedimentos semelhantes citados nos itens de 1.1 a 1.6 (escarificao).

3.2Anestesiar a regio a ser aspirada a partir de um determinado ponto da pele ou

mucosa, com injeo subcutnea de lidocana a 2%, sem adrenalina. Infiltrar cerca

de 0,2 a 0,5mL. Usar, preferencialmente, seringas tipo tuberculina com agulhas

removveis, tendo cuidados de sempre trocar a agulha que aspirar o anestsico do

frasco por uma nova agulha a ser utilizada no paciente.

3.3Aguardar o tempo de ao do anestsico e proceder a aspirao propriamente

dita: com seringa tipo tuberculina, injetar no ponto anestesiado cerca de o,3mL de

salina estril e tentar aspir-la, movendo a agulha em sentido lateral, ao mesmo

tempo em que feita a aspirao para o meio de cultivo. Pode ser empregada a

tcnica de MARZOCHI (1993) e ROMERO (1999) onde se dispe de um sistema

aspirador conectado a um frasco vacutainer com meio de cultura para

Leishmania + vcuo (de onde foi retirado o ar, atravs de seringa 20 mL),

semelhante ao utilizado para coletar sangue para sorologia.

3.4Como a escarificao, esta tcnica de coleta tambm permite a retirada das

amostras para cultura, inoculao em hamster, exceto histopatologia. Parte do

material aspirado com salina pode ser utilizado para esfregao e/ou aposio em


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trs lminas previamente limpas e identificadas para exame direto e, aps fixao

com metanol, reservar para colorao.

4.

MIELOGRAMA (PUNO DE MEDULA SSEA), LINFONODO OU PUNO DE BAO

Todos estes so considerados atos mdicos e s devem ser realizados por

profissionais treinados, obedecendo s normas tcnicas da OMS (1990), em

ambiente ambulatorial ou hospitalar, oferecendo ao doente as condies devidas

da hemostasia.

4.1Aps a coleta atravs de punobipsiao exsudato (material medular ou linda)

deve ser colocado em frascos estreis, contendo uma gota de anticoagulante

universal (EDTA) para, posteriormente, no laboratrio, ser semeado em cultura,

inocular em hamsters e/ou fazer o esfregao por distenso ou aposio em trs

lminas previamente limpas e identificadas para exame direto e, aps fixao com

metanol, reservar para colorao.


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Material vaginal e uretral:

-A coleta destes materiais visa a deteco de T. vaginalis, que um protozorio

flagelado do sistema urogenital. Normalmente so identificados em montagens

fresco, pois, em preparaes coradas estes organismos sai deformados e podem no

ser reconhecidos.

-Coleta e amostras:

-Materiais: Swab de algodo estril

Lminas microscpicas/lamnulas

Pipetas de Pasteur

Tubos de ensaio tampados e com 3mL de soluo salina

Centrfuga

Microscpio

-Tcnica:

1- Com um swab estril, colete a secreo uretral ou vaginal.

2- Coloque o swab imediatamente dentro de um tubo estril contendo salina. A ponta

do swab pode ser quebrada, se este for maior que o tubo.

3- Podem ser feitos esfregaos para colorao. Para isto, colete mais material com um

segundo swab estril e esfregue na lmina. Deixe secar, e depois prossiga com a

colorao.

4- Etiquete os tubos e as lminas com n ou nome do paciente e a data da coleta.

-Exame direto de esfregaos vaginais e uretrais:

-Se o paciente puder vir ao laboratrio, colha a secreo e coloque em cima de uma

gota de soluo Salina na lmina.

-Cubra com lamnula e examine nas objetivas de 10X e 40X para motilidade dos

flagelados.


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-Material centrifugado ou sedimentado:

1- Se for recebido um swab em soluo salina, remova o excesso de lquido do swab

por aperta-lo contra a parede do tubo. Jogue fora o swab.

2- Centrifugue o tubo por 2 minutos. Se no houver nenhuma centrifuga disponvel,

deixe o tubo descansar por 10 minutos, para permitir a sedimentao.

3- Com uma pipeta, remova o fluido sobrenadante. No agite o sedimento.

4- Pegue uma gota do sedimento e coloque na lmina.

5- Cubra com lamnula e examine com objetiva de 10X e 40X para motilidade dos

flagelados.

OBS.: em montagem a fresco, flagelados podem ser identificados por seus

movimentos padres. Trofozotos de T. vaginalis movem-se como um nervo,

movimento irregular ou saltitante.

-T. vaginalis pode ser frequentemente encontrado em sedimento urinrio, no qual

possvel observ-lo em movimento. A sua presena deveser relatada em laudo.

Mtodo de Diagnstico

Pesquisa e identificao de trofozotos mveis em secreo

uretral recente, esfregao vaginal ou urina.

Pode ser reconhecido em esfregao cervical corado por

Papanicolaou.

Recomendaes para o Diagnstico

1- Corrimento vaginal ou uretral recente ou secrees

prostticas so examinados em preparao mida,

diluda com uma gota de salina.

2- Vrias amostras podem ser necessrias antes de ser

confirmado o diagnstico.


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Colorao de esfregaos sanguneos para Microfilrias:

Materiais e Reagentes:

-5 cubas para corante

-ter - etanol fixador

-descorante de gua - cido clordrico

-corante hematoxilina de Delafield

Tcnica:

1-

Prepare os esfregaos de sangue obtido por puno digital. Deixe secar de um dia para

o outro (810 horas).

2-

Prepare cubas com corantes como se segue:-Cuba 1: gua de torneira

-Cuba 2: ter - etanol

-Cuba 3: corante hematoxilina de Delafield

-Cuba 4: guacido clordrico (HCl a 0,05%)

-Cuba 5: gua de torneira

3- Coloque o esfregao seco em gua de torneira (cuba 1) por 510 minutos. As clulas

vermelhas do sangue lisam, e o esfregao ficar claro ou branco, quando lisar

completamente.

4- Deixe o esfregao secar.

5- Coloque em teretanol (cuba 2) por 10 minutos.

6-

Deixe secar.

7- Coloque o esfregao em corante hematoxilina de Delafield (cuba 3) por 15 minutos.

8- Descore com guacido clordrico (cuba 4). Mergulhe a lmina rapidamente dentro

da mistura por duas vezes. O esfregao ficar vermelho.

9-

Imediatamente coloque a lmina em gua de torneira (cuba 5) para retirar o cido.Ponha a cuba debaixo de gua corrente at o corante ficar azul.

10-Deixe o esfregao secar e examine-o com objetiva de imerso.

Fixador ter-etanol:

-ter........................................................................................................................................20mL

-etanol 95%.............................................................................................................................20mL

Adicione o ter ao lcool numa proveta graduada e agite.


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Corante hematoxilina Delafield:

-cristais de hematoxilina..............................................................................................................1g

-etanol absoluto.....................................................................................................................10mL

-soluo saturada de sulfato de amnia alumnio em gua.................................................100mL

-glicerol...................................................................................................................................25mL

-metanol absoluto..................................................................................................................25mL

OBS.: este corante pode ser comprado comercialmente.

Descorante gua-cido clordrico

-HCl concentrado...................................................................................................................0,5mL

-gua destilada.....................................................................................................................100mL

Mea a gua destilada e coloque-a num recipiente de vidro, e adicione lentamente o HCl.

Teste de Knott para concentrao de microfilrias:

-Quando se suspeita de filariose, pode ser til concentrar o sangue para aumentar a

possibilidade de se encontrar microfilrias.

Tcnica:

1-

Retire 2mL de sangue total e coloque-o imediatamente em tubo de centrifuga

contendo 10mL de formol a 2%.

2- Misture completamente por inverso. O formol hemolisa os glbulos vermelhos, fixa,

mata e endireita o corpo das microfilrias.

3- Centrifugue o tubo por 5 minutos.

4-

Decante o sobrenadante.5- Retire o sedimento com uma pipeta de Pasteur e o espalhe numa gota espessa sobre

uma lmina.

6-

O sedimento pode ser examinado a fresco, ou a lmina pode ser deixada para secar

durante uma noite, seguindo-se a colorao pelo Giemsa durante 45 minutos.

7- Descore em gua por 1015 minutos. Deixe secar e examine.

OBS.: existem outras tcnicas de concentrao, incluindo-se a filtrao de sangue

hemolisado atravs de filtros de poros finos, e ento corando o filtro para pesquisa de

microfilrias, ou passando o sangue atravs do filtro de Sephadex.


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Sorologia para Filariose:

-Mtodo: enzimaimunoensaio

-Valor de referncia: negativo

-Interpretao: o teste tem utilidade relativa no diagnstico, a pesquisa de filria no

sangue fornece dados mais precisos, uma vez que a pesquisa de anticorpos pode sofrer

vrias interferncias.

-Coleta de sangue para pesquisa de microfilrias:

O perodo do dia importante para a coleta, pois, algumas espcies tem periodicidade.

Microfilrias esto presentes no sangue apenas em certos perodos do dia.

-Wulchereria bancrofti: coletar noite, entre 22:00 e 00:00 horas.

Deteco de microfilrias no sangue perifrico:

-Esfregao de sangue espesso (gota espessa)idem malria.

-Exame direto de sanguegota de sangue em soluo salina.

-Exame de sangue venoso hemolisado.

-Materiais e reagentes: Frasco 10mL

Centrfuga

Tubos cnicos para centrifugao

Lminas/lamnulas

Anticoagulantecitrato de sdio 2%, soluo de formalina 2%

Corante Giemsa

ter/etanol

-Mtodo:

1- Adicione 1mL de sangue venoso a 9mL de formalina 2%, espere 5 minutos para

hemlise, e ento centrifugue em alta rotao.

2- Jogue o sobrenadante fora.

3- Coloque uma gota do sedimento na lmina. Espalhe para formar um esfregao fino.

Deixe secar ao ar. Fixe o esfregao usando uma mistura de partes iguais ter/etanol e

deixe secar por 2 minutos. Core com Giemsa.

-Tcnica do micro-hematcrito: idem ao T. cruzi, porm, com tempo de centrifugao de 2

minutos.


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Helmintos

H trs grupos de Helmintos de importncia mdica nematdeos,

cestdeos e trematdeos. Os estgios para diagnstico usual so ovos e

larvas. Menos frequentemente, vermes adultos como Ascarise Enterobius

podem ser vistos; segmentos ou progltides so usados para diagnosticar,

com certeza, vermes de tnia.

Chave para identificao dos ovos

As caractersticas usadas para identificar as espcies dos ovos so as

seguintes:

1.

Tamanho O comprimento e a largura so medidos ao alcanceespecfico.

2.

FormaCada verme tem sua forma particular.

3. Estgio de desenvolvimentoquando coletadas Em algumas espcies,

os ovos consistem em uma nica clula; em outras pode haver vrias

clulas; algumas espcies so, normalmente, embrionadas (ex: eles

contm uma larva) quando coletado nas fezes.

Ocasionalmente, se as amostras de fezes estiverem velhas por vrias

horas ou 1 2 dias, os ovos podem se desenvolver em estgios mais

avanados. Os ovos de Ascaris normalmente tem apenas uma clula

quando coletados nas fezes, contudo, a mesma pode se dividir e, emamostras velhas, pode-se encontrar ovos com 2 ou 4 clulas. Ovos de

ancilstomo em amostras que foram coletadas h vrias horas podem

conter 16, 32 ou mais clulas. Em 12 24 horas, os ovos podem estar

embrionados e, posteriormente, ainda, a larva pode eclodir. Entretanto,

quando observamos o estagio de desenvolvimento dos ovos dos

helmintos, temos certeza de que a amostra de fezes foi coletada fresca.

Se ela tiver vrias horas ou dias, espera-se ver alteraes nos estgios

de desenvolvimento de algumas espcies. ideal aceitar apenas

amostras frescas para diagnstico.

4. Espessura do envoltrio do ovoAlgumas espcies comoAscaristem o

envoltrio espesso, outras como o ancilstomo tem o envoltrio fino.

5. Cor Alguns ovos so incolores (ancilstomo, Enterobius), outros so

amarelos ou marrons (Ascaris, Trichuris).

6.

Presena de caractersticas como oprculo, espculas, tampes,

ganchos ou revestimento externo mamilado.

Se um ovo ou objeto que se parea com o ovo, for encontrado, estas

caractersticas devem ser cuidadosamente observadas para se fazer uma

identificao especfica. Ocasionalmente, podem ser vistos ovos atpicos oudeformados. Nestes casos, ser necessrio procurar por formas tpicas para


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se fazer um diagnstico confivel. Lembre-se de que mais do que uma

espcie de heminto pode estar presente em um nico paciente.

Olhe o tamanho, forma, estgio de desenvolvimento, espessura do

envoltrio do ovo, cor e presena de estruturas especiais como

oprculo, espculas, tampes, ganchos e revestimento externo saliente

para identificar espcies de ovos.


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Aula prtica: Exame direto de fezes

-Material: Lminas microscpicas

Lamnulas

Soluo salina, lugol, soluo azul de metileno

Palitos de dente (esptula de madeira ou plstica, descartvel)

-Exame microscpico:

-Observar a consistncia da amostra fecal e anotar na ficha de diagnstico.

-Verificar a presena de sangue ou muco, e relatar.

-Verificar a presena de proglotes de cestodas e/ou pequenos nematodas (caso positivo,

devem ser separados para clarificaocido actico glacial).

-Exame microscpico:

-Montagem direta em soluo de salina e lugol.

1- Identificao da lmina.

2- Coloque uma gota de salina no meio da lmina.

3- Com o auxlio de um palito, recolha uma pequena poro do material (fezes) e misture coma salina.

4- Acrescente uma gota da soluo de lugol.

5- Cubra com lamnulasugere a lamnula em ngulo reto, toque a margem da gota e abaixe

delicadamente a lamnula sobre a lmina.

6-

Coloque a lmina com a montagem no campo do microscpio e foque com a objetiva

de 10X ou de menor aumento.

7- Regule a luz do microscpio com o diafragma (muita ou pouca luz no adequado).

8-

Examine a rea total da lamnula fazendo movimentos em Z.

-Quando so vistos organismos ou materiais duvidosos, mude para a objetiva de 40X, para

visualizao ntida da morfologia.

-NOTAS:

-Recomenda-se observar 1/3 da lmina com aumento de 40X.

-Os resultados devem ser comprovados por outras tcnicas.

-O uso de lugol fica a critrio do analista ( recomendvel).


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Tcnica de WILLIS - 1921 (Flutuao simples):

-Material:

-Recipientes para coleta de fezes ou frascos com boca no superior a 3 cm de dimetro. O

ideal o frasco de Borrel.

-Basto de vidro.

-Lminas.

-Lamnula.

-Soluo de cloreto de sdio (NaCl) saturada ou com densidade especfica de 1,20 g/mL.

-Procedimento:

1- Colocar uma poro de fezes (1 a 2g), coletada em vrias partes da amostra dentro do

recipiente escolhido para realizao. Colocar a soluo de NaCl at o meio do frasco.

2- Suspender as fezes na soluo, utilizando basto de vidro, at completa homogeneizao.

3- Completar o volume at as bordas do frasco e ento, colocar uma lamnula ou lmina na

borda do frasco de maneira que a lmina fique em contato com o liquido sem haver formao

de bolhas entre as superfcies.

4- Deixar as superfcies em contato por 5 a 15 minutos. A pelcula contendo ovos, cistos e

larvas, se adere parte inferior da lmina.

5- Aps decorrido o tempo, inverter rapidamente a lmina, virando-a para cima.

6- Recobrir com lamnula, adicionar uma gota de lugol ( critrio) e examinar a microscpio

com objetiva de pequeno aumento (10X). Recomenda-se observar 1/3 da preparao com

objetiva de aumento maior (40X).

NOTA: Os ovos no flutuam na superfcie do reagente quando a homogeneizao do material

fecal incompleta. A flutuao dos ovos no se realiza quando o perodo de repouso for

inferior ao estipulado.

-Princpio: flutuao espontnea. Originalmente preconizado para pesquisa de ovos de

ANCILOSTOMDEOS, pode revelar presena de outros ovos como scaris, Enterobius, T.

trichiurus e at S. mansoni. Mtodo especfico para ovos leves (baixa densidade).


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Tcnica de FAUST & COLS (centrfugo-flutuao):

-Material: Soluo de sulfato de zinco, densidade 1,18g/dL.

Frasco de Borrel.

Basto de vidro.

Gazes.

Funil pequeno.

Tubos de centrfuga.

Centrfuga.

Ala de platina.

Lmina/lamnula.

-Procedimento:

-Em frasco apropriado, preparar uma suspenso de fezes.

-Usando um funil pequeno e gaze dobrada, coar a suspenso de fezes para tubo de centrfuga.

-Centrifugar por 1 minuto, a 2500 rpm. Decantar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento.

-Adicionar gua at 1 cm das bordas do tubo. Centrifugar por 1 minuto a 2500 rpm. Decantar o

sobrenadante.

-Adicionar cerca de 3mL de soluo de sulfato de zinco e ressuspender o sedimento. Adicionar

mais soluo de sulfato de zinco at atingir o nvel de 1 cm das bordas do tubo.

-Centrifugar por 2 minutos a 2500 rpm.

-Com uma ala de platina dobrada em L, colher a fina pelcula que se forma da superfcie,

passando-a para lmina (2 ou 3 pescadas).

-Adicionar uma gota de soluo de lugol, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio em

pequeno aumento (10X).


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Mtodo de KATO-KATZ:

-Excelente mtodo para pesquisa de ovos de S. mansoni, A. lumbricoides, T. trichiurus.

-Amostra: fezes frescas ou conservadas. Fezes diarreicas no so utilizadas.

-Tcnica:

-Preparar soluo verde malaquita (finalidade de conservar e clarear as fezes)

Glicerina................................................................................................................................100mL

gua destilada......................................................................................................................100mL

Verde-malaquita 3%.................................................................................................................1mL

-Cortar papel celofane semipermevel em pedaos similares a lamnulas, e deixa-los

mergulhados na soluo de verde-malaquita por 24 horas.

-Colocar a amostra a ser analisada sobre um papel higinico.

-Comprimir a parte superior com um pedao de tela metlica (marca IBRAS 120, fios urdume e

trama 0,09 mm) sobre sua superfcie. Pela malha passam os ovos de helmintos e detritos

menores.

-Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com auxlio de um

palito, para um carto retangular, contendo no seu centro um orifcio de 6 mm de dimetro (as

fezes so colocadas nesse orifcio).

-Aps encheu completamente o orifcio, retirar o carto, cuidadosamente, deixando as fezes

sobre a lmina de vidro.

-Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane, comprimindo a lmina, aps t-la invertido,

contra a folha de papel absorvente (higinico).

-Aguardar de 12 horas e examinar ao microscpio (todos os campos).

-O nmero de ovos encontrados, multiplicados por 23, corresponder ao nmero de ovos por

grama de fezes.

EXEMPLO: 3 ovos encontrados = 69 ovos por grama de fezes.

OBS.: comercialmente, encontra-se Kits prontos para realizao do mtodo Kato-Katz.


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Tcnica de LUTZ; HOFFMAN, PONS & JANER:

-Material: Frasco de Borrel

Basto de vidro

Gazes

Clice para sedimentao

Pipeta de Pasteur ou canudo plstico

Funil de vidro

Lmina/Lamnula

-Procedimento:

-Preparar uma suspenso com 2 4 gramas de fezes e 10mL de gua; aps completa

homogeneizao, adicionar cerca de 10mL de gua.

-Coar a suspenso de fezes atravs de gaze dobrada 4x para o clice. Adicionar gua at 4 cm

da borda do clice.

-Deixar sedimentar por 224 horas.

-Recolher um pouco de sedimento (canudo) e passar para a lmina, recobrir com lamnula e

observar ao microscpio com objetiva de 10X.

NOTAS:

-Use lugoloptativo (recomenda-se).

-Se o lquido da preparao estiver turvo, faz-se a lavagem do mesmo por decantao

cuidadosa, completando-se o volume com mais gua (repouso de 60 minutos).


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Mtodo de Baerman-Moraes:

-Princpio: termo e hidrotopismo de larvas de helmintos.

-Material: fezes ou terra.

-Procedimento:

-Colocar de 810 g de fezes ou terra em uma gaze dobrada em quatro.

-Colocar o material assim preparado em um funil, com gua, a 45C.

-Deixar 1 hora em repouso.

-Passado este tempo, desobstruir a borracha que se encaixa no funil e recolher de 5 a 7 mL.

-Recolher a gua em vidro de relgio (observar em lupa) ou em tubo de centrifugao,

centrifugando o mesmo a 1000 rpm por 1 minuto. Observar o sedimento.

Mtodo de Rugai:

-Colocar de 810 g de fezes ou terra em uma gaze dobrada em quatro e fazer uma pequena

trouxa.

-Colocar o material assim preparado em um clice de sedimentao cheio de gua morna

(45C) at o meio.

-Deixar uma hora em repouso.

-Colher no fundo do clice as larvas porventura existentes, com auxlio de uma pipeta.

-Examinar em lupa ou microscpio.


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MTODOS DE SEDIMENTAO POR CENTRIFUGAO

Mtodo de RITCHIE, Mtodo de Blagg

-Princpio: sedimentao mecnica (centrifugao).

-A diferena nos mtodos acima refere-se principalmente na conservao das amostras.

-Fezes conservadas em formalina 10% - Mtodo de Ritchie ou formol-ter.

-Fezes conservadas em MIFMtodo de Blagg ou MIFC.

-Mtodo de Ritchie:

-Material: Frasco de Borrel

Basto de Vidro

Gazes

Tubos de centrfuga cnicos

Funil pequeno

Swab de algodo

Lmina/lamnula

Formalina 10%

ter

Lugol

-Procedimento:

-Agitar bem o frasco contendo material fecal conservadas em formalina.

-Coar a suspenso por gaze para um tubo de centrfuga at o meio.

-Adicionar salina ou gua at um dedo da borda do tubo. Centrifugar a 1500 rpm por 10

minutos. Decantar o sobrenadante, deixando cerca de 1,5mL do sedimento.

-Adicionar 9mL de formalina 10% e misturar.

-Adicionar 3mL de ter e tampar o tubo com rolha de borracha e agitar vigorosamente por 1

minuto.

-Centrifugar por 10 minutos a 1500 rpm (formao de camadas).

-Soltar a pelcula de gordura com uma esptula e desprezar o sobrenadante por rpida

inverso do tubo.

-Limpar as paredes do tubo com swab de algodo.


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-Transferir parte do sedimento para lmina e observar 10X, 40X (lugol recomendado).

OBS.: 4 camadas:

1- Sedimento

2-

Formalina3-

Tampo de detritos fecais

4-

ter

-Mtodo de Blagg:

-Material: os mesmos da tcnica de Rithcie, com exceo da formalina.

-Procedimento:

-Agitar bem o tubo contendo amostra fecal em MIF.

-Coar a suspenso por gaze para tubo cnico at o meio.

-Adicionar 4,5mL de ter, tampar e agitar por 1 minuto.

-Retirar a tampa e centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto.

-Soltar a pelcula de gordura com uma esptula e desprezar o sobrenadante.

-Limpar as paredes do tubo com swab de algodo.

-Transferir o sedimento para lmina e observar 10X, 40X (lugol recomendado).


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Mtodo de SHEATHES:

-Especfico para oocistos de coccdeos (Isospora, Cryptosporidium).

-Procedimento:

-Misturar em partes iguais fezes e soluo fisiolgica (NaCl).

-Filtrar a soluo em gaze.

-Recolher o filtrado em tubo de centrfuga (at o meio).

-Completar o tubo com soluo saturada de acar.

-Cobrir o tubo com lamnula plstica ou de papel celofane transparente, e fixa-la com elstico.

-Centrifugar por 5 minutos ou deixar em repouso por 1 hora.

-Retirar a lamnula, colocar sobre uma lmina e examinar a microscpio (40X).

FITA GOMADA, ANAL SWAB, MTODO DE GRAHAN

-Mtodo especfico para pesquisa de ovos de E. vermiculares.

-Procedimento:

-Corta-se um pedao de 810 cm de fita adesiva transparente.

-Coloca-se o mesmo sobre um tubo de ensaio com a parte adesiva voltada para fora.

-Passe o tubo com a fita vrias vezes na regio perianal.

-Aps a coleta do material, fixar a fita sobre uma lmina, procurando evitar dobras e formao

de bolhas de ar.

-Examinar todo o campo ao microscpio com objetivas de 10X e 40X.

OBS.: o diagnstico pelo EPF muito falho, no ultrapassando a positividade de 10%, em

funo das caractersticas do prprio ovo (muito leve e flutua por mtodos de sedimentao.

- comum encontrar tambm ovos de Ascaris, T. trichiura e outros parasitas por este mtodo.

-Ideal colher o material pela manh, sem que o paciente troque de roupa ou faa higienizao.


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Pesquisa de SANGUE-OCULTO nas fezes:

Tal pesquisa de grande importncia clnica no diagnstico das hemorragias do trato

digestivo, tendo por base os efeitos catalticos dos compostos de heme sobre a oxidao de

substncias orgnicas como a benzidina, guiiaco, etc.

Sabe-se que a ingesto de carne na alimentao ou de vegetais pode acarretar pequena

atividade de peroxidase. Assim, o sangramento gengival e alimentao podem influir no

resultado do exame. Para realizao de um bom teste deve-se preservar rigorosa dieta por

quatro dias, excluindo-se carnes, vegetais clorofilados, medicamentos a base de ferro e os

demais cuidados em relao a possveis sangramentos gengivais.

-Amostra: fezes recm-emitidas, de preferncia sem conservantes.

-Tcnicas:

REAO DE BENZIDINA:

-A gua oxigenada decomposta pela ao da peroxidase do sangue e o oxignio liberado

oxida a benzidina, formando um composto de cor azul ou verde.

-Procedimento:

-Espalhar pequena quantidade de fezes sobre um papel de filtro, gotejar 2 ou 3 gotas de gua

oxigenada e juntar igual quantidade de soluo de benzidina, observar:

Sem alterao na cor: negativo

Esverdeado: traos

Verde claro: +

Verde escuro: ++

Verde azulado: +++

Azul: ++++

-Reagentes:

-gua oxigenada (perxido de hidrognio 3%)

-Soluo Benzidina:

cido actico glacial...............................................................................................................25mL

Benzidina em p..........................................................................................................................5g


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REAO DE MEYER:

A fenolftalena reduzida pelo zinco para anidrido fltlico que, oxidado pela gua oxigenada,

desprende oxignio pela ao do sangue, transforma-se novamente em fenolftalena,

assumindo colorao vermelha em meio alcalino.

-Procedimento:

-Fazer uma suspenso de fezes 5%. Passar 5mL para um tubo de ensaio e juntar 1mL de

reativo de Meyer-Johannessen. Inverter vrias vezes e acrescentar 3 a 4 gotas de gua

oxigenada.

-Reao positiva: desenvolvimento de cor vermelha imediata.

Reativo de Meyer-Johannessen:

Fenolftalena................................................................................................................................2g

Hidrxido de potssio anidro....................................................................................................20g

gua destilada qsp................................................................................................................100mL

Aquecer at fervura, acrescentando de 10 a 30 g de zinco em p. Armazenas em frasco mbar.

OBS.: Atualmente, vem sendo utilizadas tcnicas mais especficas como a determinao da

hemoglobina humana por um anticorpo monoclonal especfico para a mesma.


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SOMENTE PARA USO DIAGNSTICO IN VITRO

Finalidade:Pesquisa de Sangue Oculto nas fezes pela tcnica de Meyer-Johannessen.

Princpio:A fenolftalena reduzida pelo zinco para anidrido fltlico que, oxidado pela gua

oxigenada, desprende oxignio pela ao do sangue, transforma-se novamente em

fenolftalena. Como o meio alcalino, ela assume a colorao vermelha caracterstica.

Metodologia:Meyer-Johannessen.

Sensibilidade:a sensibilidade do mtodo > 5mg de hb por grama de fezes.

Reagentes:

REAGENTE CROMGENO: Reagente pronto para uso. Constituintes: Hidrxido de potssio

(KOH) 4,46M, fenolftalena 0,07M e zinco em p. Usar sem agitar.

REAGENTE REVELADOR:Reagente pronto para uso. Constituinte: Perxido de hidrognio a 10

volumes.

Armazenamento dos reagentes:entre 15 e 30C.

Estabilidade dos reagentes: Estvel at a data registrada no rtulo, quando respeitadas as

condies de armazenamento.

Amostra biolgica: Fezes. Deve-se fazer um regime alimentar, evitando comer vegetais e

carne durante 3 dias antes da coleta. Quantidade mnima: 10g de fezes.

Conservao da amostra:Conservar entre 2 a 8C, por um perodo mximo de 2 dias. O ideal

utilizar amostra recente.

Materiais e equipamentos necessrios:Pipeta 10mL; Tubo de ensaio 10mL; Estante para tubo.

Procedimento tcnico:

Preparar uma suspenso de fezes a mais ou menos 5% em gua destilada (exemplo: 5g de

fezes em 100mL de gua destilada).

Centrifugar 10mL desta suspenso por 5 minutos.

Colocar em um tubo de ensaio 2mL do sobrenadante e acrescentar 0,5 mL de REAGENTE

CROMGENO. Homogenizar.

Pingar sobre esta mistura, 3 gotas do REAGENTE REVELADOR e homogeneizar. Proceder a

leitura.


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LEITURA:

REAO POSITIVA: cor vermelha (ntida) no tubo.

REAO NEGATIVA: a reao no muda de cor, ou torna-se rosa bem claro.

Valor de Referncia:negativo.

Interferentes:

1-

Mioglobina de hemoglobina de carnes vermelha e/ou branca tem atividade de

peroxidase e podem dar resultado falso-positivo.

2-

Aspirina (cido acetil-saliclico) aumenta o sangramento no trato gastro-intestinal,

provocando um resultado falso-positivo.

3- Vegetais e frutas.

Adequao do KIT e controle de qualidade:

Ao abrir o KIT, realizar os testes de Controle-Positivo e Negativo da seguinte maneira:

1-

Como CONTROLE POSITIVO podem ser usados 2mL de gua destilada + 0,01mL desangue total + 0,5mL de REAGENTE CROMGENO e 3 gotas de REAGENTE REVELADOR.

2- Como CONTROLE NEGATIVO podem ser usados 2mL de gua destilada + 0,5mL de

REAGENTE CROMGENO + 3 gotas do REAGENTE REVELADOR.

Apresentao do KIT:

Kit para 50 reaes:

REAGENTE CROMGENO: 1 x 25mL

REAGENTE REVELADOR:1 x 10mL

BULA.

Periculosidade:corrosivo.

Descarte: O reagente deve ser descartado numa pia, sobre gua corrente. O sedimento deve

ser descartado sobre gua corrente, no desprez-lo no lixo, pois pode causar incndio.

Observaes:

1-

O aparecimento tardio da cor rosa no pode ser considerado positivo.

2-

Dieta: o paciente deve se abster de carne, vegetais verdes (clorofila) e medicamentos a

base de ferro por 3 dias antes do exame.

3-

O desenvolvimento de cor no reagente indcio de deteriorao.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

HENRY, John Bernard, M.D., Diagnsticos Clnicos & Tratamento por Mtodos Laboratoriais,

18 edio. So Paulo: Manole Ltda.

LIMA, A. Oliveira (et al): Mtodos de Laboratrios Aplicados a Clnica, 6 edio. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 1985.


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Tamizao das fezes para pesquisa de proglotes de Taenia ou partes de eliminao

-Para pesquisa de proglotes de Taenias, esclex e eventualmente a eliminao de pequenos

vermes, deve-se coletar todas as fezes emitidas. Em geral, aps o uso de laxantes.

-O paciente dever coletar todo volume fecal proveniente de uma nica evacuao, ou maiorquantidade critrio.

-No laboratrio, emulsionar as fezes em gua com auxlio de basto de vidro e coar todo

material em tamis metlico de 80 a 100 malhas por cm, sob uma torneira aberta.

-Atentamente, coletar as proglotes ou vermes eventualmente retidos na peneira.

Exame macroscpico de fragmentos ou partes de eliminao para comprovao de helmintos:

No raro so levados ao laboratrio para identificao, pequenos fragmentos vegetais mal

digeridos, sementes, pequenos pedaos de plstico e uma infinidade de estranhos espcimesconfundidos com pequenos vermes. Por outras vezes o material pode apresentar larvas de

moscas que so sugestivas de verminose, mas na verdade no passam de contaminao em

amostras deixadas descobertas por mais de 24 horas.

-Exemplares de scaris lumbricoides, Enterobius vermiculares e proglotes de Taenias so

frequentemente enviados para exame, e estes devem ser processados por exame direto com

ou sem colorao.

-O esmagamento da fmea de E. vermiculares expulso nas fezes, entre a lmina e a lamnula

corados pelo lugol, apresenta uma grade quantidade de ovos caractersticos dessa espcie.

Identificao dos proglotes de Taenia:

-Pelo fato da Taenia solium desenvolver cisticercose no homem, a identificao e

caracterizao de proglotes tem alto significado clnico.

-As proglotes de T. solium so expulsas durante ou aps as evacuaes, unidas de 3 a 6

elementos; na T. saginata as proglotes costumam sair ativamente e, em geral, isoladas, nos

intervalos das evacuaes.

Tcnica:

-Mergulhar as proglotes em cido actico glacial, por tempo superior a 15 minutos, utilizando

placas de Petri, vidro de relgio ou qualquer outro recipiente.

-Retirar a proglote do cido, enxaguar o excesso com papel de filtro e comprimi-la entre duas

lminas largas. Examinar sob iluminao intensa.

-Os caracteres do tero e de suas ramificaes permitiro diferenciar proglote grvida das

duas espcies de Taenias.

-Taenia saginata: apresenta o tero com ramificaes laterais, finas e numerosas, prximas ao

tubo uterino longitudinal.


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-Taenia solium: apresenta esses prolongamentos espessos e em menor nmero.

Identificao do esclex de Taenias:

-O encontro do esclex significa eliminao total do parasita, este, por sua vez, pode ser

identificado atravs de microscopia, sendo que esta estrutura tem aproximadamente 1 mm dedimetro.

-Taenia saginata: no possui rostro (coroa de acleos), apresenta ventosas.

-Taenia solium: esclex com rostro armado, apresenta ventosas.


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Gorduras fecais

Normalmente poder existir pequena quantidade de gordura nas fezes (at 7g), na forma de

gorduras neutras, cidos graxos e sabes. O exame microscpico permite constatar uma

quantidade anormal de gordura nas fezes, possivelmente relacionada com esteatorria da

insuficincia pancretica ou com transtornos da absoro.

As gorduras neutras apresentam-se sob a frmula de pequenas gotculas, muito refringentes e

fracamente coradas pela bile.

REATIVO DE HECHT:

Soluo aquosa vermelho neutro........................................................................................1 parte

Soluo aquosa verde brilhante..........................................................................................1 parte

Preparar no momento do uso.

-cidos graxos coram-se de vermelho, e sabes ficam esverdeados.

REATIVO DE LORISHAzul do Nilo

Sulfato de azul do Nilo.................................................................................................................1g

gua destilada......................................................................................................................100mL

-cidos graxos coram-se de azul, e sabes de cinza azulado.

REATIVO DE SAATHOFFSudan III

Sudan III.......................................................................................................................................2g

lcool 96.................................................................................................................................10mL

cido actico glacial...............................................................................................................90mL

-cidos graxos se coram de vermelho. normal ser encontrado 2 ou 3 gotas de gordura por

campo microscpico.


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COPROTEST (Mtodo comercial de concentrao)

Material:

1. Frasco Coprotest com fixador de escolha.

2.

Tubos de centrfuga, cnicos de 15mL graduados.3.

Funil pequeno.

4. Gazes.

5. Swab de algodo.

6. Lmina e lamnula.

7.

Pipetas 10mL

8. Estante ou suporte para tubos.

9. ter ou acetato de etila.

10.Soluo de Lugol 1%.

11.Centrfuga.

O Coprotest atualmente comercializado no Brasil e pode ser adquirido apenas o frasco

coletor com ou sem fixador de escolha do laboratrio ou todos os dispositivos e reagentes

para execuo do procedimento. O basto coletor tem capacidade para 1g, e essa quantidade

interpretada como suficiente. As etapas a serem seguidas para a coleta da amostra de fezes,

como preconizadas, so transcritas a seguir:

1. Abra o frasco e retire a tampa com o basto coletor.

2. Com auxlio de uma pazinha de madeira, preencha o basto coletor com as fezes.

3.

No coloque fezes em excesso: use a pazinha para eliminar o excesso de fezes.

4.

Feche o frasco.5. Agite vigorosamente por 1 a 2 minutos, at dissolver as fezes no lquido.

6. Volte ao frasco para a embalagem. Leve ao laboratrio.


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Procedimento:

1. Agitar um pouco o frasco para homogeneizar.

2.

Destaque o bico da tampa.

3.

Introduza o bico em um tubo de centrfuga e pressione o frasco.

4.

Acrescente uma gota de detergente domstico a suspenso.5. Adicione 3mL de Acetato de Etila comercial.

6.

Tampe os tubos de centrfuga e agite vigorosamente.

7. Centrifugue a 2000 rpm durante 2 minutos.

8. Despreze a camada sobrenadante.

9.

Adicione o sedimento em 7mL de gua, tampe os tubos e agite.

10.Centrifugue a 2000 rpm por 2 minutos.

11.Despreze o sobrenadante com cuidado.

12.

Deixe os tubos emborcados sobre gaze, durante 2 minutos.

13.Adicione soluo de Lugol (3 vezes o volume do sedimento).

14.

Adicione ao sedimento, batendo nas paredes do tubo.

15.

Inverta o tubo sobre uma lmina e deposite uma gota do sedimento.

16.Cubra o sedimento com lamnula.

Examine ao microscpio sistematicamenteaumento de 100X.

Documents

apostila PARASITOLOGIA CLINICA.pdf