Ricardo dos Santos Simões

Perfil dos glicosaminoglicanos no útero de ratas

ooforectomizadas e tratadas com estrogênios e/ou

progestagênios

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de Concentração: Obstetrícia e Ginecologia

Orientador: Prof. Dr. Edmund Chada Baracat

São Paulo

2010

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Simões, Ricardo dos Santos Perfil dos glicosaminoglicanos no útero de ratas ooforectomizadas e tratadas com estrôgenios e/ou progestagênios / Ricardo dos Santos Simões. -- São Paulo, 2010.

Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Obstetrícia e Ginecologia.

Orientador: Edmund Chada Baracat.

Descritores: 1.Glicosaminoglicanos 2.Estrogênios conjugados 3. Acetato de medroxiprogesterona 4.Ratas 5.Útero

USP/FM/DBD-176/10

“O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a

caminhada. Caminhando e semeando, no fim terás o que

colher”

Cora Coralina

Dedicatória

Dedico este trabalho

Aos meus pais Manuel e Graciete pelo amor incondicional e pelos

ensinamentos que formaram os alicerces de minha história

Aos meus irmãos Fabiana e André, pela convivência e estímulo

constante

A minha futura esposa Ligia, por acreditar nos meus sonhos

diariamente e nas prioridades da vida

Ao Orientador

Ao Professor Dr. Edmund Chada Baracat, Professor Titular do Departamento

de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo (FMUSP), orientador deste trabalho desde o seu inicio, como aluno de

iniciação científica, obrigado pela amizade, compreensão, incentivo, pelos

ensinamentos e pelas oportunidades que tem me proporcionado no convívio

diário. Qualquer palavra de agradecimento longe ficaria da verdade, pois nossa

vida acadêmica, profissional e científica é nele inspirado. O meu muito obrigado.

Homenagem Especial

Ao Prof. Dr. Carl Peter von Dietrich “in memória” e à Profª. Drª Helena Bonciani

Nader Professores Titulares do Departamento de Bioquímica da Universidade

Federal de São Paulo, pela acolhida como aluno de Iniciação Cientifica em 2000,

onde como aluno de graduação fui iniciado nesta linha de pesquisa, seus

exemplos de vida científica nos marcaram profundamente, obrigado por tê-los

conhecido;

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. José Maria Soares Júnior, Professor Associado do Departamento de

Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pelos ensinamentos e

oportunidades que nos proporcionou no dia a dia, nossa eterna gratidão;

Aos Professores Doutores que compuseram a banca Examinadora de

Qualificação deste trabalho que, com suas apreciações muito bem elaboradas,

permitiram-nos aprofundar e melhorar a qualidade desta tese que vinha sendo

construída: Profª Drª. Ângela Maggio da Fonseca (USP), Prof. Dr. José Maria

Soares Júnior (UNIFESP) e Dr. Gustavo Arantes Rosa Maciel (USP);

Ao Prof. Dr. Ricardo Martins de Oliveira Filho, Professor do Departamento de

Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo,

pelas sugestões dadas na parte farmacológica;

Ao Prof. Dr. Adelino Moreira de Carvalho, amigo de longa data, coordenador do

Curso de Medicina de Alfenas (UNIFENAS) e professor de português, muito

obrigado pela correção do vernáculo;

Aos colegas e amigos do Departamento de Bioquímica, em especial da Disciplina

de Biologia Molecular e do Departamento de Morfologia da Universidade Federal

de São Paulo, pelo apoio e pelo incentivo;

Á Claudia Aparecida Vieira pela ajuda, gentileza e disponibilidade nas dificuldades

de nossa trajetória no Curso de pós-graduação e também no auxilio da

formatação deste trabalho.

CONFLITO DE INTERESSE

Este trabalho não apresenta nenhum conflito de interesse.

O desenvolvimento desta pesquisa ocorreu nos Laboratórios de Ginecologia

Estrutural e Molecular da Disciplina de Ginecologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo – LIM 58 (USP/LIM-58), no Laboratório da Disciplina

de Biologia Molecular do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal

de São Paulo (UNIFESP/EPM) e no Biotério da Disciplina de Histologia e Biologia

Estrutural do Departamento de Morfologia e Genética da Universidade Federal de

São Paulo (UNIFESP/EPM).

Sumário

Lista de Símbolos

Lista de Siglas e Abreviaturas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO 1

1.2. Revisão da Literatura 11

2. OBJETIVOS 14

2.1. Objetivo geral 14

2.2. Objetivos específicos 14

3. MATERIAL E MÉTODOS 15

3.1. Material 15

3.2. Métodos 16

3.2.1. Ooforectomia 16

3.2.2. Coleta e processamento do material 17

3.2.3. Extração e determinação dos glicosaminoglicanos sulfatados(GAGs) 18

3.2.4. Eletroforese em gel de agarose 19

3.2.5. Quantificação do ácido hialurônico 20

3.2.6. Quantificação do AH pelo método fluorométrico ELISA-like 21

3.2.7. Ensaio tipo sanduíche do ácido hialurônico 22

3.2.8. Cálculo do tamanho da amostra 23

3.2.9. Método estatístico 23

4. RESULTADOS 24

5. DISCUSSÃO 31

6. CONCLUSÕES 36

7. ANEXO 37

8. REFERÊNCIAS 38

Esta Tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta

publicação:

Referências: adaptado de International Commitee of Medical Journals Editors

(Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações,teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F.

Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena.

2ª ed. São Paulo:

Serviço de Biblioteca e Documentação; 2005.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in

Index Medicus.

Lista de Símbolos

% por cento

< menor que

≤ maior ou igual que

≥ maior ou igual que

°C graus Celsius

µg micrograma

µL microlitro

C carbono

cm centímetro

D.P desvio padrão

g grama

G Unidade de medida de força centrífuga

GL Gay – Lussac

Kg quilograma

L microlítro

M molar (mol/L).

mg miligrama

min minuto

mL mililitro

mM micromolar

mm milímetro

nm nanômetro

ºC grau Celsius

P.M peso molecular

V Volt

α alfa

β beta

Lista de Abreviaturas e Siglas

GlcNAc N-acetilglucosamina

Ad libitum Termo latino que significa à vontade.

AH Ácido hialurônico

AMP Acetato de medroxiprogesterona

ANOVA Análise de variância

BSA Soro albumina bovina

CEDEME Centro de desenvolvimento de modelos experimentais em medicina

e biologia.

CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio

Co Company

CS Condroitim sulfato

DPM Desvio padrão da média

DS Dermatam sulfato

ECE Estrogênios conjugados eqüinos

ELISA Teste imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

EPM Escola Paulista de Medicina

et al Abreviação de uma expressão latina Et alii que significa "e outros"

FGF-7 Fator de crescimento de queratinócitos

Fig. Figura

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

GAG Glicosaminoglicano

GAGs Glicosaminoglicanos sulfatados

GlcNAc N- acetilglucosamina

GlcUA D-glucurônico

HAS Hialuronan sintase

HEP Heparina

HS Heparam sulfato

IL Interleucina

MEC Matriz extracelular

P.M Peso molecular

PGs Proteoglicanos

pH Potencial hidrogeniônico

QS Queratam sulfato

RHAMM Molécula de reconhecimento ao AH nos processos de migração-

específica

TCA Ácido tricloroacético

TNF Fator de necrose tumoral

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

UNIFESP Universidade Federal de São Paulo

USP Universidade de São Paulo

Lista de Figuras

Figura 1 Unidades estruturais dos principais glicosaminoglicanos. 5

Figura 2 Esquema mostrando porção do trato genital da rata, onde se

observa parte da vagina, o colo e parte dos cornos uterinos

18

Figura 3 Esquema do método fluorométrico 21

Figura 4 Comportamento eletroforético dos glicosaminoglicanos sulfatados

presentes nos colos dos úteros de ratas pertencentes aos vários

grupos de estudo.

26

Figura 5 Comportamento eletroforético dos glicosaminoglicanos sulfatados

presentes nos cornos uterinos de ratas pertencentes aos vários

grupos

27

Figura 6 Gráficos mostrando a concentração dos glicosaminoglicanos

obtidos nos colos e nos cornos uterinos de ratas pertencentes aos

vários grupos de estudo.

30

Lista de Tabelas

Tabela 1 Características estruturais dos glicosaminoglicanos 6

Tabela 2 Análise quantitativa dos glicosaminoglicanos no colo uterino de

ratas em diferentes condições hormonais

28

Tabela 3 Análise quantitativa dos glicosaminoglicanos no corno uterino de

ratas em diferentes condições hormonais

29

Resumo

Simões, RS. Perfil dos glicosaminoglicanos no útero de ratas ooforectomizadas e

tratadas com estrogênios e/ou progestagênios [tese]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2010, 65 p.

Objetivo: Avaliar os efeitos dos estrogênios conjugados eqüinos (ECE), isolados

ou associados ao acetato de medroxiprogesterona (AMP) sobre os

glicosaminoglicanos do colo e do corno do útero de ratas. Métodos: 40 ratas

adultas, após 30 dias de ooforectomia foram distribuídas em quatro grupos: GI –

controle (veículo); GII – ECE (50 g/Kg, por dia); GIII – AMP (0,2 mg/Kg, por dia)

e GIV – ECE (50 g/Kg, por dia) + AMP (0,2 mg/Kg, por dia). As substâncias

foram administradas por gavagem por 28 dias consecutivos, sendo que ao final,

após anestesia, o colo e o corpo do útero foram retirados e mergulhados em

acetona para detecção e quantificação dos glicosaminoglicanos. Os

glicosaminoglicanos sulfatados foram submetidos a eletroforese em gel de

agarose e o ácido hialurônico a ensaio fluorimétrico (ELISA-like). Os resultados

foram analisados pelo teste de t de Student e de ANOVA, complementado pelo

teste de Tukey-Kramer (p≤0,05). Resultados: Foi detectada, em todos os grupos,

maior concentração de glicosaminoglicanos sulfatados tanto no colo como nos

cornos uterinos, em especial do dermatam sulfato. Já a concentração de ácido

hialurônico foi maior no corno do que no colo. Com relação ao dermatam sulfato,

os estrogênios promoveram incremento, tanto no colo quanto no corpo, sendo

que a medroxiprogesterona bloqueou esta ação nos cornos uterinos. Os

estrogênios e a medroxiprogesterona, por sua vez, apresentaram ação positiva

nos níveis de heparam sulfato no colo do útero, já no corno este efeito foi

atribuído à medroxiprogesterona. Conclusões: O perfil e a quantificação dos

glicosaminoglicanos nas duas porções do útero de ratas são diferentes. Os

glicosaminoglicanos sulfatados, em especial o dermatam sulfato, mostrou-se em

maior concentração tanto no colo quanto no corno uterino. Os estrogênios e a

medroxiprogesterona têm ação positiva nos glicosaminoglicanos sulfatados do

colo, enquanto a medroxiprogesterona apresenta efeito antagônico no corno. O

ácido hialurônico apareceu em maior concentração no corno do que no colo

uterino.

Descritores: Glicosaminoglicanos. Estrogênios conjugados. Acetato de

medroxiprogesterona. Ratas. Útero.

Summary

Simões, RS. Profiles of glycosaminoglycans in the uterus of adult ooforectomized

rats treated with estrogen and/or progestagen [thesis]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2010, 65 p.

Objective: To evaluate the effects of conjugated equine estrogens (CEE) alone or

associated to medroxyprogesterone acetate (MPg) on glycosaminoglycans

(GAGs) in the cervix and horns of the rat uterus. Methods: Thirty days after

ovariectomy, 40 adult rats were randomly divided into four groups: GI, control

(treated with drug vehicle); GII, CEE (50 µg/Kg per day); GIII, MPg (0.2 mg/Kg per

day), and GIV, CEE + MPg (doses as in GII and GIII). Drugs and vehicle were

given by gavage during 28 days. After this the animals were euthanized, the

uterine cervix and body were removed, fixed in acetone and further processed for

GAGs quantification. Agarose gel electrophoresis was used for sulphated GAGs

analyses; the hyaluronic acid was assayed with an ELISA-like method. Statistical

analysis was done by the Student’s t test and the Tukey-Kramer test. Significant

differences were set at p≤0.05. Results: In all groups sulphated GAGs

concentration (especially dermatan sulphate) was higher than that of non-

sulphated GAGs, both in the cervix and in the uterine horns. Hyaluronic acid

concentration in uterine horns was higher than in the cervix. With regard to

dermatan sulphate, CEE exerted trophic effects both in horns and cervices,

whereas MPg blocked this action in the uterine horn. The cervical concentration of

heparan sulphate was rised by CEE and by MPg; in the uterine horns the same

rise was observed, and this effect was attributed to MPg. Conclusions: The

qualitative and quantitative profiles of GAGs in the horns and cervix of rat uterus

are distinct. Sulphated GAGs (especially dermatan sulphate) are more

concentrated than the non-sulphated ones in both uterine regions. With regard to

sulphated GAGs, estrogens and medroxyprogesterone have trophic actions on

sulphated GAGs at the cervix, whereas at the uterine horn MPg shows an

antagonistic action. The concentration of hyaluronic acid in the uterine horns was

higher than in the cervix.

Descriptors: Glycosaminoglycans. Estrogens, conjugated. Medroxyprogesterone

acetate. Uterus. Rats.

1

1. Introdução

Atualmente, a terapia hormonal é considerada tanto como tratamento de

escolha para o alívio dos sintomas relacionados à menopausa, tais como

alterações do sono, fogachos, secura vaginal, perda da libido e alterações de

humor 1-4, quanto na prevenção e tratamento da osteoporose 5,6. No entanto,

diversos estudos têm atribuído à terapia estrogênica ou estroprogestativa o

surgimento de efeitos colaterais como aumento no risco de câncer de mama e de

endométrio além de tromboembolismo. Desta forma, seu uso tem sido mais

limitado 7-9.

Até alguns anos atrás, o principal elemento relacionado ao aparecimento

de tumores eram alterações nas próprias células. No entanto, com o

desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, passou-se a analisar a

relação entre as células e o seu meio, ou seja, a matriz extracelular. Nesse

sentido, vários autores voltaram sua atenção para alguns componentes desta

matriz, em especial os glicosaminoglicanos e sua eventual ligação com a terapia

hormonal.

A matriz extracelular (MEC) é composta por um conjunto de agregados

supramoleculares, constituídos estes por uma rede molecular contendo colágeno,

glicoproteínas e proteoglicanos, que mantêm as células associadas, possibilitando

a organização dos tecidos e a sobrevivência celular 10,11.

2

Os proteoglicanos (PGs) são macromoléculas formadas por um esqueleto

protéico ao qual estão covalentemente ligadas cadeias de glicosaminoglicanos.

Estão presentes na matriz, na membrana basal e na superfície celular, como

também intracelularmente em grânulos secretórios 11-14. Os proteoglicanos

diferenciam-se das glicoproteínas por possuírem, ligada ao esqueleto protéico,

pelo menos uma cadeia de glicosaminoglicano. O esqueleto protéico é o molde

para a ligação dos glicosaminoglicanos, sendo responsável pelo tráfego

intracelular pela via biossintética secretora e pela interação com outros açúcares

por domínios específicos na molécula. A proteína dos PGs é capaz de interagir

com o ácido hialurônico assim como com outras proteínas da matriz extracelular e

também com membranas celulares, como nos PGs de superfície celular.

A possibilidade de variação estrutural da proteína central (esqueleto

protéico) e dos glicosaminoglicanos, bem como a variação do número de cadeias

e do grau de sulfatação, tudo isto permite ampla gama de arranjos, sendo

atualmente descritos mais de quarenta tipos diferentes de proteoglicanos,

associados a funções bastante diversas no organismo. Atuam como

organizadores teciduais, influenciando o crescimento celular e a maturação de

tecidos especializados. Além disso, têm importante papel como filtros biológicos,

regulam a hidrólise do colágeno, afetam o crescimento e a invasão tumoral, entre

outras funções. Alterações na organização dos proteoglicanos podem interferir

profundamente com as propriedades dos tecidos 15,16.

Os glicosaminoglicanos possibilitam várias funções como a hidratação dos

espaços ao redor das células, formando géis que variam quanto ao tamanho dos

poros e à densidade da carga, atuando como filtros. Estes regulam a passagem

de moléculas através do meio extracelular. Podem ainda se ligar a fatores de

3 crescimento ou a outras proteínas, que servem como sinais de estímulo ou de

bloqueio na orientação da migração celular através da matriz extracelular 10,17.

São carboidratos com estrutura dissacarídica básica e repetitiva. As

unidades dissacarídicas dos glicosaminoglicanos são formadas, em geral, por um

monossacarídeo (glucosamina ou galactosamina) que, na maioria das vezes, é

sulfatado, e por um ácido urônico (glucurônico ou idurônico)15. A presença dos

grupamentos carboxílicos no resíduo de ácido urônico e de quantidade variável de

grupos sulfato por dissacarídeo faz com que essas substâncias apresentem alta

densidade de cargas negativas. Estas cargas garantem a essas moléculas grande

parte de suas características funcionais por se associarem a cátions livres e, com

isso, reterem água nos tecidos. Além disso, permitem também a interação iônica

com diversos componentes tais como proteínas da matriz extracelular e fatores de

crescimento14,15,16,18,19.

A composição dissacarídica e o tipo de ligação glicosídica entre eles, além

do número e da localização dos radicais sulfatos, são levados em consideração

na classificação dos glicosaminoglicanos 15.

Os principais glicosaminoglicanos ácidos encontrados nos tecidos animais

são: condroitim 4 e 6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS),

heparina (HEP), queratam sulfato (QS) e o ácido hialurônico ou hialuronam (AH).

Estes compostos diferem entre si quanto ao tipo de hexosamina e de açúcar não

aminado, quanto ao grau e a posição da sulfatação, bem como quanto ao tipo de

ligação glicosídica inter e intra-dissacarídica.

As unidades estruturais dos diferentes glicosaminoglicanos estão

apresentadas na Figura 1 e na Tabela 1. Essas são as unidades mais

4 freqüentemente encontradas. Entretanto, ocorrem variações no grau de

sulfatação, nas proporções dos tipos de dissacarídeos constituintes e no tamanho

molecular.

Com exceção do AH, todos os glicosaminoglicanos nos tecidos encontram-

se ligados a uma cadeia protéica, formando os proteoglicanos 20,21. O AH é

constituído por unidades dissacarídicas repetitivas de ácido D-glucurônico

(GlcUA) e N-acetilglucosamina (GlcNAc) unidas por ligações glicosídicas β(1-3) e

β(1-4) intra e interdissacarídica, respectivamente. Sua densidade de carga

negativa é conferida apenas pelos grupamentos carboxílicos, uma vez que,

diferentemente dos outros glicosaminoglicanos, não apresenta sulfatação.

A alta complexidade dos proteoglicanos é demonstrada pelas diferenças

que apresentam em suas estruturas, como tipo e número de cadeias de

glicosaminoglicanos, além do tamanho e natureza da cadeia protéica 22. Estas

diferenças contribuem para a sua distribuição e função no organismo. A

classificação que normalmente é utilizada baseia-se na homologia do esqueleto

protéico e na localização celular do proteoglicano, que pode ser subdividido em

três grandes grupos: proteoglicanos de matriz extracelular, proteoglicanos de

superfície celular e proteoglicanos intracelulares ou de grânulos.

5

Figura 1 - Unidades estruturais dos principais glicosaminoglicanos 23.

6

Tabela 1 - Características estruturais dos glicosaminoglicanos 24.

O ácido hialurônico possui três características fundamentais que o

diferencia dos demais glicosaminoglicanos: não se associa covalentemente a uma

proteína central, não é sulfatado e sua síntese ocorre por complexo enzimático

(que se localiza na membrana plasmática) e à medida que é sintetizado ele é

liberado para o meio extracelular 16,25,26. Enquanto os outros GAGs são

adicionados à proteína central e sofrem sulfatação no complexo de Golgi, o AH, à

medida que é sintetizado, na membrana celular, é eliminado para fora da

célula16,25. As enzimas que sintetizam o ácido hialurônico foram denominadas

hialuronan sintases (hyaluronan synthases, HAS) são glicosiltransferases

7 localizadas na membrana plasmática as quais utilizam -N-acetyl-D-glucosamina e

o D-glucuronato como substrato para síntese do ácido hialurônico na superfície

celular e liberá-lo para o meio extracelular 27.

Como o ácido hialurônico é o único GAG que não ocorre sob a forma de

um proteoglicano, sua estrutura é bem simples. Sua arquitetura espiral

polidispersa, estabilizada por pontes de hidrogênio, induz à formação de um gel

altamente viscoso, que ocupa um volume de cerca de mil vezes maior do que a

própria molécula. A capacidade de reter água, intumescer a matriz e formar gel,

confere aos tecidos elevada resistência a forças compressivas 25. Nas

articulações, onde a compressão é constante, o ácido hialurônico é o componente

mais abundante da matriz extracelular 28. Por outro lado, a natureza frouxa,

hidratada e porosa de uma matriz extracelular onde o AH predomina, é capaz de

manter as células separadas umas das outras, permitindo que se movimentem e

proliferem 25.

A maioria das células sintetiza ácido hialurônico (AH) em algum estágio de

sua vida 25. O fígado é o principal sítio de liberação e degradação do ácido

hialurônico circulante. Receptores de células endoteliais sinusoidais reconhecem

o AH, levando à internalização e degradação do mesmo. A concentração desse

GAG no soro resulta do balanço entre a síntese hepática e sua liberação. Assim,

níveis séricos aumentados de AH são encontrados em pacientes com doenças

hepáticas seguidas de fibrose e hipertensão portal 29-34.

O ácido hialurônico tem também papel importante no microambiente celular

do câncer 34. Células tumorais e normais exibem diversos sítios de ligação para

este glicosaminoglicano, como a CD44 e a RHAMM (molécula de reconhecimento

ao AH nos processos de migração-específica) em vários tipos celulares. Sua

8 adesão pode influenciar na mobilidade celular 35. Ele também interage com outras

proteínas da matriz extracelular, como o agrecam (proteoglicano de condroitim

sulfato e de queratam sulfato), o versicam (proteoglicano de condroitim sulfato e

de dermatam sulfato) 33,36 e com fatores de crescimento 37.

O condroitim sulfato (CS) é um GAG policarboxissulfatado constituído por

unidades dissacarídicas formadas de ácido D-glucurônico e N-acetil-D-

galactosamina, com ligação glicosídicas do tipo β(1-3). Entre os dissacarídeos a

ligação é do tipo β(1-4). A sulfatação pode ocorrer nas posições C4 e C6 do

resíduo aminado, levando às designações de condroitim-4-sulfato e condroitim-6-

sulfato, respectivamente 38. As estruturas desses compostos são híbridas, pois o

condroitim-6-sulfato pode apresentar uma certa porcentagem de sulfatação na

posição C4 e vice-versa 39,40.

Os condroitins sulfatos são encontrados principalmente na matriz

extracelular dos tecidos cartilaginosos, representando cerca de 10% do peso seco

desses tecidos 38. O condroitim 4-sulfato ocorre com maior abundância nas

cartilagens que se acham em estágio de crescimento e de ossificação 15,39,41,42. O

condroitim 4-sulfato é também registrado em alguns estados patológicos como

artrose, calo ósseo, condromas e condrossarcomas 39,42.

Por outro lado, a localização preferencial do condroitim 6-sulfato na matriz

das cartilagens articulares 39,40,42 e na matriz extracelular da aorta de várias

espécies animais 43,44 sugere que ele esteja envolvido com a manutenção da

integridade dos tecidos sujeitos a altas pressões. Atua como inibidor de proteases

extracelulares envolvidas no metabolismo do tecido conjuntivo, inibindo a

produção de citocinas 45,46.

9 O condroitim-6-sulfato na cartilagem reduz a apoptose, aumentando a

atividade anabólica dos condrócitos, e limita a excessiva degradação da matriz

extracelular, participando do controle da sua integridade. Apresenta ação anti-

quimiotática e antiinflamatória, podendo agir como modulador estrutural,

mantendo a integridade do espaço intercelular 46. Foi também observado aumento

de condroitim-6-sulfato em diversos tecidos neoplásicos 19,47-55.

O dermatam-sulfato (DS) possui estrutura similar ao CS, diferindo deste

pelo fato de apresentar, além de ácido glucurônico, ácido L-idurônico ligado a N-

acetil D-galactosamina, sulfatada preferencialmente na posição C4 por meio de

uma ligação β(-3) e, mais raramente, na posição C6. Apresenta também

sulfatação na posição C2 do ácido L-idurônico. O dermatam sulfato pode ser

considerado um isômero do condroitim sulfato no qual uma proporção variável de

ácido D-glucurônico é convertida, pela ação de uma epimerase, em ácido L-

idurônico. As ligações entre os dissacarídeos são do tipo β(1-4) 44,56-58.

Apesar do DS estar presente em vários tecidos de vertebrados, sua função

nos tecidos moles ainda não foi esclarecida. Por outro lado, presume-se que, nos

tecidos conjuntivos densos como pele, córnea e tendão, estaria relacionado com

a organização, a velocidade de deposição e à manutenção da malha de fibrilas de

colágeno na cartilagem 14,59-61.

Alguns autores sugerem ainda que o DS esteja envolvido com a fase de

diferenciação, desenvolvimento, envelhecimento e reparo dos tecidos 60,62. Sabe-

se que o DS liga-se à atividade do fator de crescimento de queratinócitos (FGF-7)

além de potencializá-lo. Este é produzido após injúria tecidual, induzindo a

proliferação dos queratinócitos 63.

10 O heparam sulfato (HS) é, provavelmente, o glicosaminoglicano de maior

complexidade estrutural, podendo apresentar até quatro tipos diferentes de

unidades dissacarídicas. É composto por unidades alternadas de ácido D-

glucurônico e α-D-glucosamina unidos por ligação do tipo α(1-4) e, em menor

proporção, resíduos de ácido L-idurônico ligado à glucosamina por ligações

glicosídicas β(1-4). A glucosamina pode ser encontrada com elevado grau de N-

acetilação (40-60%) e o restante, sob a forma N-sulfatada. A glucosamina pode

também se apresentar na forma O-sulfatada na posição C6 19,56,64-70. É sintetizado

in vitro por várias linhagens celulares e está associado à superfície da membrana

celular 13,48,49,71,72. Sua ocorrência na superfície celular aliada à constatação de

que sua estrutura é específica para diferentes tecidos e espécies são indícios de

que este polímero funcione como molécula de reconhecimento celular 18,49,65,73,74.

Níveis aumentados de HS, bem como de colágeno e de fatores de

crescimento encontrados na proliferação de tumores, sugerem sua atuação nos

processos de reconhecimento e de adesão celular, como também seu papel no

controle do crescimento e na angiogênese 15,18,19,48,48,56,65,67,69,70,73,75.

No presente trabalho procuramos identificar e quantificar os

glicosaminoglicanos presentes no útero de ratas sob a ação de estrogênios e/ou

progestagênios.

11

1.2. Revisão da Literatura

Na ausência de gravidez, o colo do útero tem como função secretar o muco

que protege a cavidade desse órgão contra agentes patogênicos, além de possuir

papel importante na ativação dos espermatozóides 76. Alterações bioquímicas

podem levar a distúrbios da fertilidade 77. Já o corpo do útero é o local em que

ocorre a implantação. É responsável também pela nutrição e proteção do

embrião, com função bem definida e essencial para o sucesso da gravidez 77,78.

Durante o trabalho de parto, além das contrações uterinas, processam-se

modificações bioquímicas, com alteração de prostaglandinas, óxido nítrico, matriz

extracelular e ácido hialurônico, para permitir a dilatação do colo 17,78,80,81,82,83, 84.

Vários trabalhos têm chamado a atenção para a relação existente entre a

matriz extracelular, em especial os glicosaminoglicanos, e os tecidos tumorais, o

sistema imune e a terapia hormonal 85-88. No entanto, no colo do útero os

glicosaminoglicanos parecem estar relacionados ao parto 79,82,89,90,91,92. Os

eventos que controlam estas funções ainda não são totalmente conhecidos. Os

proteoglicanos parecem atuar como sinalizadores químicos entre as células, pois,

in vitro, ligam-se a várias moléculas sinalizadoras como os fatores de

crescimento. Estudo de Afify et al. 78 mostrou haver maior produção de ácido

hialurônico no endométrio humano no período de implantação embrionária. Os

proteoglicanos podem também influenciar a imunologia local uterina, durante e na

ausência de gravidez 86,88,93.

Poucos estudos relacionaram os glicosaminoglicanos no útero e a terapia

hormonal. A maioria refere-se ao colo do útero na gravidez e no parto 17,76,80.

O primeiro estudo que refere a presença de glicosaminoglicanos sulfatados

no útero humano foi feito por Loewi e Consden 94. Deve ser mencionado que,

nessa ocasião, os glicosaminoglicanos eram denominados de

mucopolissacarídeos ácidos.

12

Kofoed et al. 95 caracterizaram os glicosaminoglicanos no útero de ratas

imaturas e identificaram a presença de ácido hialurônico, heparam sulfato,

condroitim 4 e 6 - sulfato e dermatam sulfato. Dentre estes predominava o

dermatam sulfato. Os estrogênios isolados aumentavam a concentração de

glicosaminoglicanos, enquanto os progestagênios isoladamente não os alteravam,

mesmo em altas dosagens. El Maradny et al. 80 assinalaram que o ácido

hialurônico se encontra em concentrações muito baixas durante quase toda a

prenhez, aumentando acentuadamente no final da mesma. Tal fato poderia

estimular a produção de metaloproteinases bem como a migração e ativação

leucocitária no colo do útero. Relataram ainda estar o ácido hialurônico

relacionado, no colo do útero, à regulação do conteúdo de água e à atividade das

enzimas colagenolíticas e citoquinas, o que facilitaria a dilatação cervical no

momento do parto.

Takata e Terayama 96 analisando os glicosaminoglicanos no útero de ratas

sob a ação de 17 beta - estradiol ou da progesterona, identificaram como seus

maiores componentes condroitim 4 ou 6 sulfato, dermatam sulfato, heparam

sulfato e ácido hialurônico. Quando os animais foram tratados com 17β-estradiol

encontraram, de maneira geral, maior concentração de glicosaminoglicanos, com

aumento mais acentuado de condroitim 4 ou 6 sulfato em relação ao dermatam

sulfato.

Golichowski et al. 97 notaram, no colo do útero de ratas, aumento de 6%

dos glicosaminoglicanos (ciclo estral) para 33% no final da prenhez. Detectaram

ainda a presença de dermatam sulfato, ácido hialurônico e heparam sulfato.

Destes, o ácido hialurônico aumentou 17 vezes ao término da prenhez. Referem

também que essas mudanças poderiam estar associadas ao acúmulo deste

glicosaminoglicano entre as fibras colágenas, o que determinaria o amolecimento

desse tecido.

Cidadão et al. 98 estudaram, por intermédio de citoquímica, a localização

dos glicosaminoglicanos no útero de ratas e camundongas sob ação do

estrogênio e da progesterona. Relatam que os glicosaminoglicanos localizam-se

de preferência no endométrio, em especial nas lâminas basais e entre os feixes

de colágeno. A administração conjunta de estrógeno e de progesterona aumenta

13 a concentração dos glicosaminoglicanos, os quais devem estar envolvidos no

processo de implantação.

Gomes et al. 99,100 realizaram estudos para localizar e determinar a

concentração de glicosaminoglicanos no corno do útero de camundongas durante

as diferentes fases do ciclo estral. Observaram que a concentração de

glicosaminoglicanos sulfatados e carboxilados acha-se na dependência dos níveis

hormonais, com maior produção de dermatam e condroitim sulfato na fase de

estro e a do ácido hialurônico na de diestro. Estas substâncias encontram-se

principalmente no endométrio e estão localizadas entre as fibras de colágeno, na

membrana basal e ao redor dos fibroblastos.

Cubas et al. 101 idealizaram estudo para determinar a concentração de

glicosaminoglicanos no colo do útero de ratas durante o ciclo estral. Identificaram

a presença de dermatam sulfato, heparam sulfato e ácido hialurônico, observando

que o primeiro se encontrava em maior concentração em todas as fases do ciclo

estral, estando significativamente aumentado na fase de estro. O heparam sulfato

achava-se aumentado na fase de proestro.

Myers et al. 17 compararam a concentração de glicosaminoglicanos no colo

do útero de mulheres no ciclo menstrual e na gravidez e referem haver um

aumento acentuado no conteúdo destes, em especial do ácido hialurônico, na

gravidez.

Pelo que se depreende da literatura, existem alterações nas concentrações

dos glicosaminoglicanos no colo e no corpo do útero relacionadas às variações

hormonais que seriam importantes na implantação, no mecanismo de dilatação

cervical durante o parto e também na carcinogênese 79,80,82,87,90,91,92,102,103,104.

Apesar das evidências quanto à possível ação dos esteróides sexuais sobre os

glicosaminoglicanos, os conhecimentos sobre o perfil, a quantidade e sua

distribuição no útero ainda são pouco estudados com relação à reposição

hormonal. Assim, propusemo-nos realizar o presente estudo com o objetivo de

avaliar o perfil dos glicosaminoglicanos presentes no útero de ratas adultas

ooforectomizadas sob a ação de estrogênios isolados ou associados aos

progestagênios.

14

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

Avaliar o perfil de glicosaminoglicanos presentes no útero de ratas adultas

ooforectomizadas sob a ação de estrogênios conjugados isolados ou associados

à medroxiprogesterona.

2.2. Objetivos Específicos

Avaliar e quantificar os glicosaminoglicanos ácidos (heparam, dermatam e

condroitim sulfatos) presentes no corno e no colo do útero de ratas

ooforectomizadas sob a ação de estrogênios conjugados isolados e/ou

associados à medroxiprogesterona.

Quantificar o ácido hialurônico presente no corno e no colo do útero de

ratas ooforectomizadas sob a ação de estrogênios conjugados isolados

e/ou associados à medroxiprogesterona.

15

3. Material e Métodos

3.1. Material

Foram utilizadas ratas (Rattus norvegicus albinus, Rodentia Mammalia) da

Colônia OUTB EPM-1-Wistar, adultas (±3 meses), virgens, com peso aproximado

de 250 gramas, oriundas do Centro de Desenvolvimento de Modelos

Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) da Universidade Federal de

São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) e manipuladas de

acordo com os Princípios Éticos para Experimentação 105. Antes do início do

experimento, o projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética do

Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (FMUSP) e pela Comissão de Análise de Projetos de

Pesquisa (CAPPesq) sob o número 0223/09.

Os animais foram realocados no Biotério da Disciplina de Histologia e

Biologia Estrutural do Departamento de Morfologia e Genética da UNIFESP-EPM,

sendo confinados 5 em cada gaiola de plástico com tampa gradeada de metal,

com dimensões de 45 x 35 x 15 cm de comprimento, largura e altura,

respectivamente. Todos foram mantidos no biotério sob fotoperíodo claro de 12

horas intercalado com escuro de 12 horas e temperatura controlada (22 °C). O

período claro foi considerado das 7 horas às 19 horas, sendo usada uma

iluminação artificial produzida por lâmpadas fluorescentes marca Phillips (modelo

luz do dia de 40 Watts), desde o início até o término do experimento. A

alimentação constituiu-se de ração padrão (Labina-Purina, São Paulo, Brasil) e

água "ad libitum".

Após uma semana de adaptação ao novo ambiente, todos os animais

foram submetidos a exames colpocitológicos (às 8 horas), por 14 dias

consecutivos, para avaliação do ciclo estral. A secreção vaginal foi obtida através

de hastes de algodão, umedecidas com solução salina (cloreto de sódio a 0,9%).

O conteúdo foi transferido para lâminas histológicas, fixado em solução de álcool-

éter (1:1) e corado pelo Método de Harris-Shorr 106.

16

Posteriormente, as lâminas foram submetidas à análise em microscópio de

luz. Somente as ratas com ciclos estrais regulares (proestro, estro, metaestro e

diestro), ou seja, que apresentavam atividade ovariana satisfatória, foram

incluídas no estudo 107.

Assim, trinta dias após a ooforectomia bilateral, 40 ratas foram divididas em

quatro grupos, contendo cada um 10 animais, a saber:

Grupo I - propilenoglicol, 0,5 mL/animal por dia;

Grupo II - estrogênios conjugados eqüinos (ECE), na dose de 50 g/Kg por

dia 108,109;

Grupo III - acetato de medroxiprogesterona (AMP), na dose de 0,2 mg/Kg

por dia 108,109,110;

Grupo IV - estrogênios conjugados eqüinos (ECE), na dose de 50 g/Kg

por dia, associados ao acetato de medroxiprogesterona (AMP), na dose de

0,2 mg/Kg por dia 108,109,111,112.

Os fármacos foram administrados por gavagem, durante 28 dias

consecutivos, diluídos em 0,5 mL de propilenoglicol para uniformizar o volume

ofertado.

3.2. Métodos

3.2.1. Ooforectomia

Para realização da ooforectomia, foi feita anestesia dissociativa utilizando

cloridrato de xilazina (Rompum® - 16 mg/Kg) e cloridrato de quetamina (Ketalar®

- 60 mg/Kg) por via intraperitoneal. Em seguida as ratas foram posicionadas

decúbito-ventralmente e, após tricotomia, fez-se incisão de aproximadamente 3,5

cm de comprimento na pele da região ventral. Com o auxílio de uma pinça, foram

exteriorizados os ovários e as pontas dos cornos uterinos com a gordura

adjacente. Após identificar-se os ovários, efetuou-se a ligadura dos vasos

17 ovarianos com fio de seda preta (6,0 Ethicon - Johnson & Johnson), os quais

foram imediatamente seccionados e retirados. Em seguida, os demais tecidos

foram cuidadosamente reintroduzidos na cavidade peritoneal após a certificação

de estancamento do sangramento. A cavidade peritoneal foi fechada em dois

planos (muscular – pontos contínuos; cutâneo - pontos separados) com fio de

seda preta 6,0 (Ethicon - Johnson & Johnson). Ao final, a pele foi limpa com álcool

iodado.

Após 15 dias da cirurgia, foram novamente realizados esfregaços vaginais

diários para determinação do hipoestrogenismo por um período de uma semana.

Somente os animais que apresentaram esfregaços com padrão atrófico foram

incluídos no experimento.

3.2.2. Coleta e processamento do material

Após 24 horas da última tomada dos fármacos, os animais foram

anestesiados com mistura de xilazina (16 mg/Kg) e quetamina (60 mg/Kg), por via

intraperitoneal. Por incisão longitudinal do abdome, foram retirados os úteros (Fig.

2). Estes foram imediatamente mergulhados em acetona e, em seguida, separou-

se o colo dos cornos uterinos. Nestes últimos, isolaram-se os terços médios. Os

animais foram eutanasiados logo em seguida, por aprofundamento do plano

anestésico.

18

Figura 2 – Esquema mostrando porção do trato genital da rata, onde se

observa parte da vagina, o colo e parte dos cornos uterinos.

3.2.3. Extração e determinação dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs)

Os fragmentos uterinos (colo e corno do útero) de cada animal, após 24

horas de imersão em acetona, foram triturados e secos em estufa regulada à

temperatura de 40 ºC a 50 ºC, por um período de 3 a 4 horas. O pó cetônico

obtido após a secagem foi incubado com papaína (2,0 mg/mL em tampão fosfato-

cisteína, pH 6,5 na proporção de 5 mL/g de pó cetônico) por 18 horas, a 60 ºC.

Após a incubação, o material foi centrifugado (5000 G por 15 minutos). A seguir, o

precipitado foi descartado e, ao sobrenadante, acrescentou-se NaCl para uma

concentração de 1 M; ácido tricloroacético também foi adicionado até a

concentração final de 10%, sempre em banho de gelo e sob agitação constante.

Os sobrenadantes, após centrifugação (44 G por 10 minutos), foram precipitados

com dois volumes de metanol e mantidos a -20 ºC, durante 18 horas. Os

precipitados alcoólicos (secos a vácuo) foram suspensos em 100 µL de solução

tampão, acetato de sódio 50 mM, em pH 6,0, contendo desoxirribonucleases e

incubados a 30 ºC por 12 horas. Os glicosaminoglicanos foram então analisados.

19

3.2.4. Eletroforese em gel de agarose

Através da eletroforese em gel de agarose, foram identificados e

quantificados os glicosaminoglicanos sulfatados. Utilizou-se o método

desenvolvido por Jaques et al. 113 e modificado por Dietrich e Dietrich 64. Deve ser

salientado que este método permite detectar até 0,015 μg de GAG por mg de

extrato cetônico.

A técnica consiste na aplicação de 5 µg do composto em gel agarose

0,55%, em tampão 1,3 diaminopropano acetato 0,05 M, pH 9,0, com espessura

de dois mm. A corrida eletroforética foi realizada em uma câmara refrigerada,

submetida a uma diferença de potencial elétrico de 100 V, durante

aproximadamente 1 hora ou até que se teve a migração apropriada.

Após a corrida, os glicosaminoglicanos foram precipitados no gel com

CETAVLON (brometo de cetiltrimetilamônio) 0,1%, por um período mínimo de 2

horas. Após secagem sob calor e ventilação, o gel foi corado com azul de

toluidina 0,1% em etanol 50 ºGL e ácido acético a 1%.

A identificação do tipo de glicosaminoglicano foi feita comparando-se a

migração eletroforética das amostras à de padrões conhecidos e purificados.

Estes mesmos padrões foram utilizados para a determinação dos compostos

através de densitometria a 525 nm.

Foram utilizados padrões de heparam sulfato (purificado de pâncreas

bovino como descrito por Dietrich et al.12, condroitim 4 - sulfato (cartilagem de

baleia) e dermatam sulfato (pele de porco), adquiridos da empresa Seikagaku

Kogyo Co. (Tóquio, Japão).

Os resultados foram expressos em μg de GAGs por mg de extrato cetônico

(media ± DPM).

20

3.2.5. Quantificação do ácido hialurônico

O método utilizado foi desenvolvido no Departamento de Biologia Molecular

da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Trata-se de

método fluorométrico para a determinação do ácido hialurônico em fluídos

biológicos, utilizando para tal sondas de ligação ao ácido hialurônico 33. A sonda é

isolada de cartilagem nasal bovina e é constituída da região globular do agrecam

(um proteoglicano formado por um esqueleto protéico ao qual se ligam cadeias de

queratam sulfato e condroitim sulfato) e pela proteína de ligação do ácido

hialurônico. A sonda é usada imobilizada em placas de ELISA, à semelhança de

um anticorpo de captura, como sonda biotinilada, funcionando nesse último caso

como um anticorpo secundário marcado (Fig. 3).

21

Figura 3 – Esquema do método fluorométrico 33.

3.2.6. Quantificação do ácido hialurônico pelo método fluorométrico ELISA-like

O ácido hialurônico foi quantificado a partir de amostras do pó cetônico

obtidas para a determinação dos glicosaminoglicanos. Este procedimento consta,

inicialmente, de adicionar 100 µL de uma solução de proteína de ligação (proteína

de ligação do ácido hialurônico obtida a partir de cartilagem bovina) diluída em

tampão Na2CO3 0,06M, pH 9,6 em cada poço da placa de ELISA mantida

overnight à temperatura de 4 ºC. A solução é removida e a placa lavada com Tris-

HCl 0,05M, pH 7,75 (tampão de lavagem). Os sítios inespecíficos são bloqueados

acrescentando-se 200 µL em cada poço de uma solução Tris-HCl 0,05M, pH 7,75

e soro albumina bovina (BSA) 1% por 1 hora a 37 ºC e mantidas a 4 ºC nesta

solução até o momento das dosagens.

22

Também foram preparadas placas recobertas com ácido hialurônico (50

µg/mL) ou BSA 1% nas mesmas condições descritas anteriormente.

3.2.7. Ensaio tipo sanduíche do ácido hialurônico

À placa coberta com proteína de ligação foram adicionadas 100 µL por

poço de soluções de ácido hialurônico padrão em várias concentrações diluídas

no tampão Tris-HCl 0,05M, pH 7,75 e BSA 1% (tampão de ensaio) além das

soluções amostras obtidas dos tecidos após proteólise em triplicatas. Seguiu-se

uma incubação a 4 ºC, overnight, sendo a placa tratada em seguida com tampão

de lavagem.

A seguir, adicionaram-se 100 µL da sonda do ácido hialurônico (proteína de

ligação extraída da cartilagem bovina biotinilada – 1 mg/mL) diluída 1:5 000 ou

1:10 000 no tampão de ensaio. A placa foi agitada por 2 horas e, em seguida,

lavada com o tampão de lavagem.

Após a lavagem, foram adicionados à placa 100 µL por poço de

estreptavidina, marcada com Európio (Delfia Eu-labelling kit), diluída em 1:10 000

em tampão de ensaio. Agitou-se por uma hora e, a seguir, foi tratada pelo tampão

de lavagem. Por fim, adicionou-se solução de realçe (200 µL por poço), agitou-se

por 5 minutos e a placa foi lida em fluorímetro. As amostras foram analisadas em

triplicata e as placas lidas em fluorímetro Wallac 2-Victor Multilabell Counter

(Pearkin Elmer Life Sciences). Este método permite detectar até 0,2 μg de ácido

hialurônico por mg 33.

3.3. Cálculo do tamanho da amostra

23

O tamanho da amostra foi baseado nos dados obtidos na quantificação dos

glicosaminoglicanos (médias e desvios-padrão). Para tanto, o intervalo de

confiança para este estudo foi fixado em 95%, com erro de 5%.

Aplicou-se a seguinte fórmula: N = (Z2.S2)/d2, onde N = tamanho da

amostra; Z = número de desvios–padrão, que no caso de uma distribuição normal

é de 1,96; S = desvios-padrão das médias e d = diferença das médias 114. Em

nosso estudo, o número mínimo de animais por grupo foi quatro.

3.4. Método Estatístico

Para a análise dos resultados utilizou-se o teste de análise de variância

(ANOVA). Quando houve significância, foi complementado com o teste de

comparações múltiplas de Tukey-Kramer. O teste t de Student pareado foi

aplicado para comparar os glicosaminoglicanos do colo e do corno uterino no

mesmo grupo. Fixou-se p menor que 5% (p ≤ 0,05).

24

4. Resultados

Nossos resultados mostraram a presença de dermatam sulfato (DS),

heparam sulfato (HS) e ácido hialurônico nos colos e nos cornos uterinos em

todos os animais pertencentes aos vários grupos do experimento, como pode ser

visto nas figuras 4 e 5 e nas tabelas 2 e 3. No entanto, não detectamos a

presença de condroitim sulfato (CS).

Analisando os dados referentes às concentrações de glicosaminoglicanos

sulfatados totais no colo e no corpo do útero, percebemos que existem diferenças

quantitativas nessas duas porções (Fig. 6). Notamos haver maior concentração

dos glicosaminoglicanos sulfatados no colo em relação ao corno uterino. Já no

que se refere ao ácido hialurônico, encontramos maior concentração no corno

uterino (Tabelas 2, 3 e Fig. 6).

Com relação ao colo uterino, notamos aumento significante na

concentração de glicosaminoglicanos sulfatados em todos os grupos tratados com

esteróides, o qual foi maior no grupo tratado com estrogênios conjugados eqüinos

associados ao acetato de medroxiprogesterona (GIV) (6,33 ± 0,30* mg/g, p<0,01).

Já no corno uterino, o uso de acetato de medroxiprogesterona não elevou

significantemente o nível de glicosaminoglicanos totais. Entretanto, a

administração de estrogênios conjugados eqüinos isolados ou associados ao

acetato de medroxiprogesterona induziu a aumento na sua concentração (GII =

3,97 ± 0,41* mg/g; p<0,01).

Com relação aos tipos de glicosaminoglicanos sulfatados presentes nas

duas partes do útero (colo e corno), houve respostas diferentes em relação ao

estímulo hormonal por nós induzido.

Na migração eletroforética dos glicosaminoglicanos, registramos alterações

no padrão de migração do dermatam sulfato, que apresentou migração

intermediária entre o dermatam e o condroitim sulfato, em especial no grupo

tratado com estrogênios conjugados eqüinos, indicando a presença de novos

25 compostos sulfatados. O dermatam sulfato encontrou-se aumentado no colo

uterino em todos os grupos tratados com hormônio, sendo maior no recebeu

estrogênios conjugados eqüinos associados ao acetato de medroxiprogesterona

(6,14 ± 0,27; p<0,01). Já no corno uterino notamos que o acetato de

medroxiprogesterona isolado não alterou a sua concentração (1,81 ± 0,10 mg/g).

No entanto, quando administrado conjuntamente aos estrogênios conjugados

eqüinos, induziu ligeira inibição em sua formação (2,62 ± 0,27* mg/g, p<0,01).

O heparam sulfato no colo uterino mostrou-se aumentado em todos os

grupos tratados com hormônios, sendo que o acetato de medroxiprogesterona

mostrou ter ação positiva na produção desse glicosaminoglicano (GIII = 0,18 ±

0,03 mg/g e GIV 0,20 ± 0,02 mg/g em relação aos grupos GI e GII, *p < 0,01). Já

nos cornos uterinos a administração do acetato de medroxiprogesterona reduziu a

concentração desse glicosaminoglicano (GIV = 0,22 ± 0,02* mg/g, p<0,01).

Quando foram comparadas as concentrações de heparam sulfato nas duas

porções do útero, houve maior concentração no corno uterino.

No que diz respeito à concentração de ácido hialurônico, este se encontra

numa concentração 100 vezes menor do que os glicosaminoglicanos sulfatados.

Encontramos maior concentração desse glicosaminoglicano carboxilado nos

cornos uterinos em relação aos colos, com exceção do grupo III (administração da

medroxiprogesterona). No entanto, não encontramos diferenças na concentração

desse glicosaminoglicano sob estímulo hormonal nos colos e nos cornos uterinos.

26

Figura 4 – Comportamento eletroforético dos glicosaminoglicanos sulfatados presentes nos colos dos úteros de ratas pertencentes aos vários grupos. CS – condroitim sulfato, DS – Dermatam sulfato, HS heparam sulfato. Or – origem da corrida eletroforética; P = padrão; + = pólo positivo e – pólo negativo. (G) = grupo. GI = ooforectomizado; GII = estrogênios conjugados eqüinos; GIII = acetato de medroxiprogesterona; GIV = estrogênios conjugados eqüinos + acetato de medroxiprogesterona

27

Figura 5 – Comportamento eletroforético dos glicosaminoglicanos sulfatados presentes nos cornos uterinos de ratas pertencentes aos vários grupos (G) de estudo. CS – condroitim sulfato, DS – Dermatam sulfato, HS - heparam sulfato. Or – origem da corrida eletroforética; P = padrão; + = pólo positivo e – pólo negativo. GI = ooforectomizado; GII = estrogênios conjugados eqüinos; GIII = acetato de medroxiprogesterona; GIV = estrogênios conjugados eqüinos + acetato de medroxiprogesterona

28

Tabela 2 - Análise quantitativa dos glicosaminoglicanos no colo uterino de ratas

em diferentes condições hormonais. Não foi detectada presença de

condroitim sulfato em nenhuma das amostras. Os dados são média ±

EPM de determinações em duplicata. ( ) = número de animais

Grupos

Dosagem

GI (7)

GII (9)

GIII (7)

GIV (10)

Glicosaminoglicanos sulfatados (mg/g)

2,64 ± 0,29 5,02 ± 0,51a* 4,79 ± 0,33 a* 6,33 ± 0,30 b**

Dermatam sulfato (mg/g)

2,60 ± 0,29 4,88 ± 0,49 a* 4,61 ± 0,32 a* 6,14 ± 0,27 b**

Heparam sulfato (mg/g)

0,05 ± 0,03 0,13 ± 0,01 a* 0,18 ± 0,03 b** 0,20 ± 0,02 b**

Ácido hialurônico

( g/g)

7,44 ± 2,98 8,16 ± 2,53 10,01 ± 3,03 10,92 ± 3,52

Legendas: ratas adultas ooforectomizadas e tratadas como segue: GI = ooforectomizadas; GII = tratadas com estrógenos conjugados equinos; GIII = tratadas com medroxiprogesterona; GIV =

tratadas com ambos. As letras sobrescritas indicam comparações entre os valores indicados (a b, P<0,05). Os asteriscos indicam diferença significante em relação ao grupo GI (*p<0,05; ** p<0,01)

29 Tabela 3 - Análise quantitativa dos glicosaminoglicanos no corno uterino de ratas

em diferentes condições hormonais. Não foi detectada presença de condroitim sulfato em nenhuma das amostras. Os dados são média ± EPM de determinações em duplicata. ( ) = número de animais

Grupos

Dosagem

GI (7)

GII (9)

GIII (7)

GIV (10)

Glicosaminoglicanos sulfatados (mg/g)

1,96 ± 0,07 3,97 ± 0,41 b** 2,03 ± 0,11 2,92 ± 0,29 a*

Dermatam sulfato (mg/g)

1,65 ± 0,06 3,56 ± 0,39 b* 1,81 ± 0,10 2,62 ± 0,27 a*

Heparam sulfato (mg/g)

0,31 ± 0,04 0,34 ± 0,06 0,22 ± 0,02 * 0,29 ± 0,04

Ácido hialurônico

( g/g)

15,19 ± 2,91 20,50 ± 3,47 14,17 ± 2,86 24,95 ± 4,82

Legendas: ratas adultas ooforectomizadas (OVx) e tratadas como segue: GI = ooforectomizadas; GII = tratadas com estrógenos conjugados equinos; GIII = tratadas com medroxiprogesterona; GIII

= tratadas com ambos. As letras sobrescritas indicam comparações entre os valores indicados (a b, p < 0,05). Os asteriscos indicam diferença significante em relação ao grupo GI (*p < 0,05; **p < 0,01)

30

Figura 6 – Gráficos mostrando a concentração dos glicosaminoglicanos obtidos nos colos e nos cornos uterinos de ratas ooforectomizadas (GI), tratadas durante 28 dias com estrogênios conjugados eqüinos (GII), tratadas com acetato de medroxiprogesterona (GIII) ou estrogênios conjugados eqüinos + acetato de medroxiprogesterona (GIV). (GAGs = glicosaminoglicanos sulfatados totais). (Teste t de Student pareado, *p < 0,05; **p < 0,01)

31

5. Discussão

Os glicosaminoglicanos formam a matriz extracelular e aparecem

distribuídos na escala filogenética desde espongiários até os mamíferos

superiores, estando presentes em todos os filos que apresentam organização

tissular 12,65,115.

Em nosso material, detectamos a presença de ácido hialurônico,

heparam sulfato e dermatam sulfato no colo e no corno uterino de ratas em todos

os grupos estudados. No entanto, não registramos a presença do condroitim 4 ou

6 sulfato. Esse fato poderia estar relacionado ao longo tempo de castração dos

animais, uma vez que estes dois últimos glicosaminoglicanos foram identificados

no útero de ratas imaturas tratadas com estrogênios imediatamente após a

castração por Kofoed et al.95. Reforçando a ocorrência destes

glicosaminoglicanos no útero, Cidadão et al.98 identificaram a presença de

condroitim 4 ou 6 sulfato em ratas pré-púberes, com baixos níveis de estrogênios.

Nossos dados mostraram que esses dois tipos de glicosaminoglicanos não

reaparecem após 60 dias de castração mesmo após a administração de

estrogênios, ou seja, após longo período de hipoestrogenismo.

Há inúmeros fatores que podem influenciar o metabolismo dos

glicosaminoglicanos na matriz extracelular como, por exemplo, o processo de

envelhecimento que exerce mudanças qualitativas e quantitativas nessas

macromoléculas. Este fato foi muito bem estudado por Weinstein et al. 116 que

verificaram haver alterações no padrão de glicosaminoglicanos no tecido

conjuntivo de ratos com o evoluir da idade, ou seja, observaram queda

progressiva na síntese de ácido hialurônico e pronunciada redução nos níveis de

dermatam sulfato, condroitim 4 e 6 sulfato e do heparam sulfato. Este poderia ser

outro mecanismo que justificaria a não detecção de condroitim 4 e 6 sulfato em

nosso estudo.

Em nosso material notamos que a concentração total de

glicosaminoglicanos se mostrou maior no colo do que nos cornos uterinos, tanto

32 nos valores basais (controles) quanto em resposta à administração dos esteróides

sexuais (estrogênios conjugados eqüinos e/ou acetato de medroxiprogesterona).

Entretanto, nos cornos uterinos registramos maiores quantidades de heparam

sulfato e de ácido hialurônico do que no colo uterino. Estes dados reforçam o fato

de que, além das diferenças morfológicas, existem também diferenças

bioquímicas entre essas duas porções do útero frente à ação hormonal. Isso

explicaria as diferenças funcionais destas duas áreas em resposta aos hormônios

sexuais no decorrer do ciclo menstrual, durante a gravidez e também por ocasião

do parto.

Nos animais que receberam reposição hormonal, em especial os

estrogênios, observamos aumento dos glicosaminoglicanos sulfatados, tanto no

colo quanto nos cornos uterinos. Estes dados são similares aos encontrados por

Kofoed et al. 95 que notaram que os estrogênios induzem o aumento dos

glicosaminoglicanos, enquanto a progesterona isoladamente não alteraria esses

níveis. Em nosso estudo percebemos que a progesterona, quando administrada

conjuntamente aos estrogênios, promove a inibição da produção dos

glicosaminoglicanos no útero. Deve ser mencionado que Kofoed et al.117, em

trabalho onde utilizou o útero como controle, referem que a administração de

acetoxiprogesterona causou a diminuição na concentração dos

glicosaminoglicanos nesse órgão.

Dentre os glicosaminoglicanos sulfatados, deve-se destacar o

dermatam sulfato, que aumentou tanto com a reposição dos estrogênios quanto

com a medroxiprogesterona no colo uterino. Notou-se ainda haver um efeito

aditivo no colo uterino da progesterona ao efeito dos estrogênios quando os dois

hormônios foram administrados conjuntamente. Entretanto, isto não ocorreu nos

cornos uterinos; apenas os estrogênios mostraram ter ação positiva sobre esse

glicosaminoglicano, sendo esta ação bloqueada após a administração da

medroxiprogesterona. Estes dados sugerem haver comportamento distinto do

dermatam sulfato no colo e no corpo do útero da rata. Este fato explica, em parte,

os fatos que envolvem o mecanismo da gravidez e da parturição, visto que esse

glicosaminoglicano está relacionado à estruturação das fibrilas do colágeno tipo

I118, 119. Durante a gravidez, esse glicosaminoglicano é importante para manter a

33 integridade estrutural do colo uterino, no entanto, no corpo do útero o tecido

conjuntivo, deve ser mais frouxo para que o concepto possa receber aporte

sanguíneo adequado 120, 121.

Ainda em relação ao dermatam sulfato, em alguns tecidos

apresenta propriedades farmacológicas particulares, entre as quais se destacam

as atividades trombocitopênicas, redução da formação óssea e anti-

apoptótica122,123,124.

Nossos resultados mostraram alterações no padrão de migração

do dermatam sulfato tanto no colo quanto no corno uterino, em especial no grupo

tratado com estrogênios conjugados eqüinos, indicando a presença de novos

compostos sulfatados. Estudos referem que compostos com este padrão de

migração podem estar envolvidos na carcinogênese125. Nossos dados mostraram

que a medroxiprogesterona atenuou o efeito dos estrogênios em relação ao

padrão de migração. Talvez alguns glicosaminoglicanos sulfatados possam estar

envolvidos na gênese do carcinoma endometrial visto que a progressão das

lesões hiperplásicas precursoras dessa neoplasia estrogênio-dependente são

bloqueadas pela progesterona 126,127. Este fato poderia sugerir que os

progestagênios seriam necessários para prevenir o aumento desse tipo de

glicosaminoglicano. Na prática ginecológica, este dado reforçaria ainda mais o

uso de progestagênios na reposição hormonal na mulher pós - menopáusica com

útero.

Com relação à análise da concentração do ácido hialurônico no

útero de ratas, o que nos chamou inicialmente a atenção foi o fato de estar em

baixas concentrações quando comparado aos glicosaminoglicanos sulfatados.

Acreditamos que este fato decorra de encontrar-se hidratado nos tecidos, pois

seu volume pode aumentar cerca de mil vezes. Nossos resultados revelaram não

haver diferenças, na sua concentração, significantes no colo e no corpo do útero

devidas à ação dos esteróides sexuais. No entanto, a sua concentração foi maior

nos cornos do que nos colos uterinos.

O ácido hialurônico não é produzido no aparelho de Golgi, como

ocorre com os outros glicosaminoglicanos, mas sim na superfície citoplasmática

34 da membrana celular 26. Inúmeras enzimas denominadas hialuronan sintases

(HAS) estão relacionadas à sua síntese. Conhecem-se pelo menos três

isoformas, designadas pelas siglas HAS1, HAS2 e HAS3 que são codificadas em

diferentes cromossomos 128,129. Estas enzimas foram identificadas tanto em

humanos como em roedores e possuem de 55 a 71% de similaridade na

seqüência de seus aminoácidos 130. Heldin et al.129 mostraram que cada uma das

três isoformas da HAS teria a capacidade de polimerizar diferentemente o ácido

hialurônico, formando cadeias de vários tamanhos. Devido ao seu enorme

tamanho, este é transportado para fora da célula assim que vai ocorrendo a sua

síntese.

É documentado na literatura que o ácido hialurônico desempenha

várias funções tais como estimular a produção de IL-8, IL-1 e fator alfa de necrose

tumoral (TNF-α) 130; reparação tecidual, efeito antiinflamatório e

imunossupressão131, 132; angiogênese133, 134, 135, 136; manutenção da integridade do

epitélio e regeneração130. No campo da reprodução estaria envolvido com a

ovulação, implantação, embriogênese e parto133, 137. Este glicosaminoglicano

estaria envolvido com essas inúmeras funções em virtude do tamanho de sua

cadeia. Isto pode ocorrer durante a síntese ou a sua degradação. Stern et al. 138

referem que não se conhece ainda como as células produzem esses fragmentos,

no entanto, dependendo do tamanho, estariam relacionados com à sinalização de

várias vias metabólicas.

Uchiyama et al. 139 estudaram a expressão e a regulação do RNA

mensageiro das três isoformas da HAS em fibroblastos oriundos do colo uterino

de camundongas sob a influência da progesterona e do estrogênio. Notaram que

a expressão do RNA mensageiro da HAS1 e HAS2 foi inibida pela progesterona,

sendo dose-dependente. Em contraste, a progesterona determinou a elevação da

expressão da HAS3. Já o estrogênio não influenciou na expressão do RNA

mensageiro de nenhum dos tipos da HAS.

Sabe-se que durante a gestação há mudanças das proteínas da

matriz extracelular no colo uterino, em especial do colágeno, conforme a elevação

dos níveis de progesterona e de estrogênios, que são importantes para a

manutenção da gravidez e o amadurecimento do colo no seu final, havendo

35 incremento do AH 137, 140. Inúmeros pesquisadores acreditam que os diferentes

polímeros do AH são essenciais para a retenção hídrica no decorrer da gravidez

e, ao final da gestação, são importantes para o desencadeamento da parturição81,

141, 142.

O acúmulo de AH na matriz extracelular pode participar no

amolecimento e do edema do colo uterino devido às suas propriedades de

elasticidade e de afinidade pela água 143. Assim, tanto o aumento como o

aparecimento de polímeros do AH apresentam papel essencial na remodelação

da matriz extracelular no processo de amadurecimento do colo uterino 144. Por isto

mesmo, acreditamos que o AH tem participação na cérvice uterina e estaria sob a

influência dos esteróides sexuais.

Portanto, embasados nos resultados das dosagens dos

glicosaminoglicanos no colo e no corpo do útero de ratas ooforectomizadas,

notamos que os estrogênios conjugados eqüinos associados ou não ao acetato

de medroxiprogesterona apresentaram, de maneira geral, efeito trófico. Além

disto, o tratamento com estrogênios conjugados eqüinos induz a mudanças no

comportamento eletroforético do dermatam sulfato, sugerindo haver novos

compostos, visto terem migração intermediária entre o dermatam e o condroitim

sulfato. Ademais, as ratas tratadas simultaneamente com estrogênios conjugados

eqüinos e acetato de medroxiprogesterona não exibiram essa mudança no

comportamento eletroforético. Essas diferenças sugerem haver, com a

estrogenioterapia, mudanças na estrutura desses glicosaminoglicanos. Tais

resultados deixam entrever um possível papel dos estrogênios na carcinogênese

uterina, que seria bloqueada pelos progestagênios.

36

6. Conclusões

Os ensaios qualitativos e quantitativos realizados no colo e cornos uterinos

de ratas adultas ooforectomizadas e posteriormente tratadas com estrogênios

conjugados eqüinos isolados ou associados ao acetato de medroxiprogesterona,

revelaram:

1. Tanto o colo como o corno uterino apresentam glicosaminoglicanos (GAGs)

sulfatados (dermatam sulfato e heparam sulfato) e carboxilados (ácido

hialurônico). Em ambas porções uterinas, o dermatam sulfato foi predominante

em relação aos outros GAGs;

2. Os estrogênios conjugados equinos mostraram ter ação positiva sobre os

níveis de dermatam sulfato presentes tanto no colo como no corno uterino. Em

contraste, a medroxiprogestrona teve ação negativa sobre este GAG no corno

uterino;

3. O corno é mais rico em heparam sulfato do que o colo uterino. Nesta região, os

estrogênios conjugados e a medroxiprogesterona exerceram ação trófica. Por

outro lado, no corno uterino somente a medroxiprogesterona mostrou esse efeito;

4. O ácido hialurônico apareceu em maior concentração no corno do que no colo

uterino e sua concentração não se modificou sob a ação dos estrogênios ou da

medroxiprogesterona.

37

7. Anexo

38

8. Referências

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