POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA EM NEOPLASIAS …portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67;

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE DDOO MMIINNHHOO

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM

NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS

Orientador: Prof. Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva

Co-orientador: Prof. Doutora Margarida Paula Pedra Amorim Casal

RAQUEL JORGE FERREIRA CATARINO

Porto, 2005

DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE
APRESENTADA À UNIVERSIDADE DO MINHO

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Doutor Rui Medeiros, orientador deste trabalho, pela

paciência, motivação e incentivo, sempre disposto a oferecer estímulos e ouvir

com interesse e ânimo todas as questões, dúvidas e problemas e pela confiança

depositada em mim e no meu trabalho.

À Doutora Margarida Casal, pelos comentários, observações e críticas

construtivas a este trabalho e pelo empenho dedicado ao Mestrado de Genética

Molecular.

Ao Núcleo Regional do Norte da Liga Portuguesa Contra o Cancro, em

particular ao Dr. Cardoso da Silva e ao Dr. Vítor Veloso, por me concederem a

bolsa que permitiu a realização deste trabalho.

Ao Professor Carlos Lopes, pela disponibilização dos meios necessários à

realização deste projecto.

À Dra. Deolinda Pereira e ao Dr. Eduardo Breda, pelo apoio fundamental

na parte clínica deste trabalho.

Aos meus colegas de trabalho, que apesar das dificuldades continuam a

batalhar pela investigação básica. À Paula pelos momentos e desabafos de

confidências, à Gui pelo constante sorriso e boa disposição, à Xaninha pelo

carinho, à Dani e ao Hugo pelo incentivo e prestabilidade e à Ana, pela amizade

e intervalos cúmplices.

V

Aos meus amigos, sempre interessados e solícitos em ajudar-me, por

suportarem e perdoarem as minhas ausências. À Tânia pela amizade franca e

incondicional, à Mafas pela partilha de choros e risos, ao Viet pela fraternidade, à

Joaninha pela amizade para uma vida e à Vaninhas, que apesar de estar longe,

está sempre presente quando é preciso…

Ao Joaquim Paulo, pela disponibilidade e paciência infinitas na elaboração

da parte gráfica desta dissertação.

À minha madrinha, vítima desta doença e desde sempre razão motivadora

para eu estudar Oncologia.

Ao Rui, sempre solícito, por toda a dedicação, paciência, amor e carinho e

pelos pequenos grandes miminhos determinantes para o meu sorriso diário e

fácil…

À minha família, pelo apoio incondicional. Aos meus pais, por terem

suportado todos os meus encargos, pela confiança que me incutem e pela

felicidade que sempre me proporcionam. Foi graças a todo o vosso apoio que

tive oportunidade de estudar o que sempre gostei e de concluir esta dissertação,

podendo retribuir um pouco do orgulho que sinto pelo dois.

Ao meu irmão e à minha mana de sangue e sempre…

Ao meu avô, que sempre acreditou em mim…

VI

INDICE

Índice RESUMO IX

ABSTRACT XV

INTRODUÇÃO 1

BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR DDOO CCAANNCCRROO 3

VVAARRIIAAÇÇÕÕEESS GGEENNÉÉTTIICCAASS:: PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOOSS 8

CCAANNCCRROO EE CCIICCLLOO CCEELLUULLAARR 10

VVÍÍRRUUSS EE CCAANNCCRROO 13

CCIICCLLIINNAA DD11 EE CCAANNCCRROO 17

PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOO AA887700GG NNOO GGEENNEE CCCCNNDD11 21

CCAANNCCRROO DDOO CCOOLLOO DDOO ÚÚTTEERROO 23

CCAANNCCRROO DDAA NNAASSOOFFAARRIINNGGEE 27

OBJECTIVOS 31

MATERIAL E MÉTODOS 35

PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO 37

Indivíduos Controlo 37

Pacientes com Cancro do Colo do Útero 38

Pacientes com Cancro da Nasofaringe 40

PPRROOCCEESSSSAAMMEENNTTOO DDAASS AAMMOOSSTTRRAASS 42

AAMMPPLLIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDOO DDNNAA PPOORR PPCCRR 43

Identificação do fragmento do produto de PCR 44

AANNÁÁLLIISSEE DDOO PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOO NNOO GGEENNEE CCCCNNDD11 PPOORR RRFFLLPP 44

Identificação dos fragmentos obtidos por RFLP 45

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS VII

INDICE

AANNÁÁLLIISSEE EESSTTAATTÍÍSSTTIICCAA 45

RESULTADOS 47

AAMMPPLLIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDOO DDNNAA 49

AANNÁÁLLIISSEE DDOO PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOO AA887700GG NNOO GGEENNEE CCCCNNDD11 49

FFRREEQQUUÊÊNNCCIIAASS AALLÉÉLLIICCAASS EE GGEENNOOTTÍÍPPIICCAASS DDOO PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOO AA887700GG CCCCNNDD11 51

Indivíduos Controlo 51

Pacientes com Lesões do Colo do Útero 53

Pacientes com Cancro da Nasofaringe 61

DISCUSSÃO 69

SSUUSSCCEEPPTTIIBBIILLIIDDAADDEE PPAARRAA CCAANNCCRROO DDOO CCOOLLOO DDOO ÚÚTTEERROO 71

SSUUSSCCEEPPTTIIBBIILLIIDDAADDEE PPAARRAA CCAANNCCRROO DDAA NNAASSOOFFAARRIINNGGEE 74

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS 79

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 85

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS VIII

RESUMO

A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e reflecte

as alterações genéticas que promovem a transformação progressiva de

células humanas normais em células altamente malignas.Nos últimos anos

tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de baixa

penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e

manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e

diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios.

A variação genética inter-individual pode constituir um factor

importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento

de cancro. Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser

definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo

um risco alterado para desenvolver cancro.

Têm sido descritos muitos estudos relativamente à epidemiologia

do cancro e aos efeitos carcinogénicos de microrganismos,

nomeadamente os vírus. No caso de vírus que possuem a capacidade de

persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais

frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e predisposição

para modificações mais alargadas na expressão genética das células.

A proteína ciclina D1 (CCND1) parece ser muito importante na

regulação do ciclo celular, particularmente no ponto de controlo G1/S do

ciclo celular. O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no

cromossoma 11q13 muitas vezes alterado em diversos tipos de tumores.

Foi identificado um polimorfismo no nucleótido 870 do gene CCND1, que

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS XI

RESUMO

consiste na transição das bases azotadas adenina e guanina no exão 4 do

gene.

Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo,

com os objectivos de analisar a frequência do polimorfismo A870G no

gene da ciclina D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer

patologia, em mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com

carcinoma da nasofaringe e verificar e avaliar a existência de associações

entre a frequência do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética

para carcinoma do colo do útero e nasofaringe.

Foram analisadas amostras de DNA correspondentes a

quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. O grupo de indivíduos

controlo consistiu em cento e oitenta e sete (187) indivíduos normais sem

patologia oncológica conhecida, constituído por cento e três (103)

mulheres e oitenta e quatro (84) homens. Foram analisadas amostras de

DNA de 178 mulheres com lesões colo do útero e 94 indivíduos com

cancro da nasofaringe.

A análise do polimorfismo e avaliação dos genótipos foi efectuada

através da técnica PCR-RFLP.

Através da análise dos resultados observou-se que mulheres

portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o

desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95%

CI 1,45-9,31; p=0,007) e 3,24 vezes superior para o desenvolvimento de

carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;

p=0,006). Relativamente ao grupo de indivíduos com carcinoma da

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS XII

RESUMO

nasofaringe, a análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que

indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no

desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;

p=0,016) e um risco ainda superior quando analisados os resultados

relativos ao tipo histológico indiferenciado (UCNT) em indivíduos

portadores do genótipo GG (OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018).

Estes resultados podem ajudar na compreensão do papel e

influência da ciclina D1 no cancro, dos mecanismos biológicos do cancro

do colo uterino e da nasofaringe e na definição de um perfil genético para

estas neoplasias.

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS XIII

ABSTRACT

Tumorigenesis in humans is a multistep process and these steps

reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of

normal cells into highly malignant derivatives.

In the last few years low penetrance genes have been intensely

studied, namely genes involved in DNA repair, genomic integrity

maintenance, cell cycle control and metabolism of carcinogens.

The genetic variation between individuals may be important in the

characterization of cancer susceptibility. Some of these genetic variations

can be defined as low penetrance susceptibility alleles, conferring an

altered risk in cancer development.

Many important discoveries relating to cancer epidemiology and to

the carcinogenic effects of micro-organisms, namely virus, have been

reported. The mechanism likely to occur more frequently is the imprinting

of modified cell cycle control and predisposition to more extensive

changes in cellular gene expression in the case of viruses that persist in

the cells they infect.

Cyclin D1 (CCND1) is a protein very important in cell cycle

regulation, particularly in the G1/S checkpoint of the cell cycle. CCND1 is a

proto-oncogene located on human chromosome 11q13 often altered in

many human tumors. A single nucleotide polymorphism at nucleotide 870

has been identified.

We performed a case-control study, in order to analyze the

frequency of the A870G CCND1 polymorphism in healthy individuals,

women with lesions of the uterine cervix and individuals with

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS XVII

ABSTRACT

nasopharyngeal carcinoma, and evaluate the possible associations

between the frequency of the polymorphism and genetic susceptibility to

cervical and nasopharyngeal cancers.

We analysed DNA samples of 459 individuals: 178 women with

cervical lesions and 94 individuals with nasopharyngeal cancer. The

control group consisted of 187 healthy individuals, including 103 women

and 84 men.

The analysis of the A870G polymorphism was performed by PCR-

RFPL techniques.

The GG genotype was associated with a 3,67 fold higher risk for the

development of high-grade lesions of the cervix (OR=3,67; 95% CI 1,45-

9,31; p=0,007) and a 3.24 fold increased risk for the development of

squamous invasive cervical cancer (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;

p=0,006). Concerning the nasopharyngeal cancer group, the analysis of

the frequencies of CCND1 genotypes indicates that individuals carrying the

GG genotype have a 2,17 fold increased risk for the development of

nasopharyngeal cancer (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98; p=0,016) and a

slightly higher susceptibility, with a risk of 2,32 fold (OR=2,32; 95% CI

1,20-4,17; p=0,018), when considering the undifferentiated histological

type of nasopharyngeal carcinoma (UCNT).

These results can lead to a better understanding of cyclin D1 influence in

cancer, the biological mechanisms of cervical and nasopharyngeal cancers

and in the definition of a genetic profile for these diseases.

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS XVIII

IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

Biologia Molecular do Cancro

O cancro constitui um importante problema de saúde pública a nível

mundial, sendo detectados todos os anos cerca de 10 milhões de novos

casos no mundo inteiro (Parkin 2001). Em Portugal, esta doença constitui

a segunda causa de morte (Pinheiro et al. 2003).

O cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no

genoma, que se encontra alterado em múltiplos locais nas células

cancerígenas. A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e

reflecte as alterações genéticas que promovem a transformação

progressiva de células humanas normais em células altamente malignas

(Hanahan e Weinberg 2000). Danos não letais no material genético são a

base da carcinogénese, podendo ser herdados ou adquiridos ao longo da

vida através da acção de agentes ambientais, nomeadamente compostos

químicos, radiação e agentes infecciosos (Kumar et al. 2003). O número

exacto de alterações necessárias ao desenvolvimento de neoplasias não é

conhecido, variando provavelmente com o tipo de alteração e tipo de

tumor. O objectivo da investigação oncológica consiste na definição destas

alterações moleculares e no desenvolvimento de estratégias de prevenção

e tratamento eficazes (Weber 2002).

Um tumor maligno é então o resultado de uma série de alterações

no DNA de uma única célula, ou clones desta célula, que originam perda

das funções normais, crescimento celular descontrolado e, por vezes,

metástases (dispersão de células malignas e crescimento neoplásico à

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS 3


distância do tumor primário). A progressão de uma célula normal até uma

célula maligna é um processo lento e envolve a acumulação de mutações

em genes determinantes, nomeadamente em proto-oncogenes (genes

cuja função consiste na indução da proliferação celular), genes

supressores tumorais (genes que codificam geralmente proteínas que

inibem a divisão celular), genes associados à regulação da apoptose e

genes envolvidos na reparação de DNA (Brennan 2002).

Durante a carcinogénese, seis propriedades celulares essenciais são

alteradas e adquiridas pelas células malignas, designadamente a auto-

suficiência em factores de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores

de crescimento, potencial replicativo ilimitado, fuga à apoptose,

capacidade de invasão tecidular e metastização e angiogénese (figura 1).



Figura 1 – Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado

de Hanahan e Weinberg 2000).



Os meios através dos quais estas alterações podem ser adquiridas

variam no seu mecanismo e cronologia. O número de mutações

necessárias para adquirir uma determinada propriedade é também

variável conduzindo, no entanto, ao mesmo resultado (Weber 2002). Por

outro lado, os mecanismos celulares que impedem a carcinogénese

podem diferir entre indivíduos, devido à variabilidade populacional dos

genes polimórficos que regulam estes processos (Brennan 2002).

A variação genética inter-individual pode constituir um factor

importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento

de cancro. Tem sido sugerido que os genes envolvidos na susceptibilidade

para cancro podem ser considerados de acordo com a sua penetrância: o

grupo de genes de susceptibilidade com elevada penetrância, como o caso

dos genes BRCA1 e APC e o grupo de genes de susceptibilidade de baixa

penetrância, que são genes comuns com uma interacção gene-ambiente e

associação geralmente esporádica (Shields e Harris 1991). Nos últimos

anos tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de

baixa penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e na

manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e

diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios. Embora estes

genes tenham um menor impacto no risco individual para o cancro,

podem ter relevância quando analisados em termos de risco atribuível na

população. Estas descobertas podem ajudar na elaboração de estratégias

de prevenção direccionadas para indivíduos de alto risco (Brennan 2002).



As causas de uma determinada neoplasia variam de indivíduo para

indivíduo, tornando-se essencial compreender estas variantes genéticas de

modo a definir grupos de indivíduos que sejam mais susceptíveis a uma

determinada neoplasia.

A epidemiologia molecular surge como a ciência que analisa a

contribuição dos potenciais factores de risco genéticos e ambientais,

identificados a nível molecular, para a etiologia, distribuição e prevenção

da doença ao nível das populações.



Variações Genéticas: Polimorfismos

Polimorfismos são variações na sequência de DNA que existem em

indivíduos normais de uma população, estando a variante menos

frequente presente em pelo menos 1% da população (Brookes 1999). As

variações de sequência mais comuns no genoma humano são single

nucleotide polymorphisms (SNPs), isto é, polimorfismos em que a variação

ocorre num único nucleótido (Erichsen e Chanock 2004).

Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser

definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo

um risco alterado para desenvolver cancro. O risco para cancro parece ser

influenciado pelos padrões de SNPs que o indivíduo possui em

determinados genes chave de susceptibilidade (Brookes 1999).

A avaliação do risco relativo (RR) estima a magnitude de uma

associação entre o factor de exposição, como o polimorfismo, e a doença,

constituindo uma indicação sobre a probabilidade de desenvolvimento da

doença no grupo portador de uma das variantes desse polimorfismo

comparativamente às restantes. Grande parte dos estudos realizados é do

tipo caso-controlo, em que o risco relativo pode ser avaliado pela

determinação do quociente OR (Odds Ratio). O Odds Ratio representa a

magnitude desta associação e fornece informação que pode ser

importante no julgamento da causalidade e na definição do risco

atribuível, ou seja, a proporção de todos os casos da doença atribuível ao

factor de risco (Knudsen et al. 2001).



A análise de SNPs e haplótipos na pesquisa oncológica pode ajudar

na determinação e elaboração de terapias para a intervenção e prevenção

do cancro.



Cancro e Ciclo Celular

O cancro é, na sua essência, uma doença do ciclo celular (Pines

1995). Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação

da proliferação celular são acontecimentos necessários para o

estabelecimento de um tumor.

O ciclo celular é constituído por quatro fases ou processos

estritamente coordenados: fase M, fase G1, fase S e fase G2. Na fase M

ocorre mitose (divisão celular), seguida da fase G1, que corresponde a um

intervalo entre a mitose e o início da replicação do DNA. A fase G1

antecede a fase S, onde ocorre replicação do DNA, que por sua vez é

seguida da fase G2, durante a qual a célula continua a crescer e a

sintetizar proteínas na preparação para a mitose. A progressão das células

através do ciclo celular é estritamente regulada por sinais extracelulares e

internos que monitorizam e coordenam os vários processos que ocorrem

durante as diferentes fases do ciclo celular. Esta coordenação entre fases

é dependente de um sistema de checkpoints (pontos de controlo) e vias

bioquímicas de transdução de sinal, que previnem a entrada numa nova

fase até que os eventos que ocorrem na fase anterior sejam completados

(Nurse 2002).

Esta progressão ordenada é controlada por ciclinas, cinases

dependentes de ciclinas (CDKs) e pelos seus inibidores. As CDKs

promovem o ciclo celular através da fosforilação de proteínas alvo que são

necessárias à progressão das células para uma nova fase do ciclo celular e



são activadas por fosforilação após a ligação das ciclinas (subunidades

reguladoras), formando-se um complexo ciclina-CDK (Kumar et al. 2003).

Embora cada fase do ciclo celular seja estritamente regulada, a transição

da fase G1 para a fase S constitui um ponto de controlo de extrema

importância, pois após esta passagem as células são forçadas a progredir

através da fase S (Sherr 1996). Quando a célula recebe sinais indutores

de crescimento, a síntese de ciclinas D que complexam com as CDK4 e

CDK6 e de ciclina E, que complexa com a CDK2, são estimuladas. Estes

complexos fosforilam a proteína retinoblastoma (RB) e provocam a

libertação dos factores de transcrição que vão activar a expressão de

genes necessários à progressão através da fase S do ciclo celular (Sherr

1995; Sherr 1996) (figura 2).

A ciclina D1 tem sido particularmente estudada, devido ao seu

papel importante na promoção da carcinogénese.



Figura 2 – Ilustração esquemática do papel das ciclinas e cinases dependentes

de ciclinas (CDKs) na regulação do ciclo celular (adaptado de Kumar et al. 2003).



Vírus e Cancro

Nos últimos anos têm sido descritos muitos estudos relativamente à

epidemiologia do cancro e aos efeitos carcinogénicos de microrganismos.

Agentes infecciosos, especialmente os vírus, contribuem para mais de

20% das neoplasias (quadro I). Aproximadamente um quinto de todos os

carcinomas registados no mundo surgem no estômago (9%), fígado (6%)

e colo do útero (5%) (Talbot e Crawford 2004).

A replicação do genoma de muitos vírus de DNA encontra-se

parcialmente dependente da célula hospedeira. Neste processo, podem

alterar a expressão genética do hospedeiro para promoverem a síntese de

DNA e a proliferação celular. No caso de vírus que possuem a capacidade

de persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais

frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e da

predisposição para modificações mais alargadas na expressão genética

das células (Pagano et al. 2004).





PPaappiilloommaavviirruuss HHuummaannoo -- HHPPVV

O HPV (Human Papillomavirus) é um vírus pequeno de DNA de

cadeia dupla, pertencente à família Papovaviridae. Foram já catalogados

mais de 120 tipos de HPVs, estabelecidos por homologia da sequência de

DNA. Os tipos de HPV associados a risco para cancro incluem as variantes

16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 (Duarte-Franco e

Franco 2004). Dados epidemiológicos, moleculares e clínicos sugerem que

os HPVs de alto risco, especialmente o HPV-16 e o HPV-18, desempenham

o papel principal na etiologia do cancro do colo do útero. Mais de 90% dos

carcinomas do colo uterino possuem DNA de HPV de alto risco (Bosch et

al. 2002). As proteínas virais E6 e E7 do HPV possuem propriedades

oncogénicas, importantes para a imortalização celular, desregulação do

ciclo celular e inibição da apoptose (Wolf et al. 2003).

EEppsstteeiinn--BBaarrrr vvíírruuss -- EEBBVV

O EBV (Epstein-Barr Vírus) é um vírus de dupla cadeia de DNA, que

pertence à família Herpesviridae e infecta principalmente linfócitos B

(Kuppers 2003). O vírus foi originalmente isolado a partir de biópsias de

Linfoma de Burkitt. Posteriormente, a infecção por EBV foi associada ao

desenvolvimento do cancro da nasofaringe, linfomas pós-transplante, uma

percentagem de linfomas não-Hodgkin e cancros gástricos e a raros

exemplos de linfomas de células T (Young e Rickinson 2004). O EBV

possui a capacidade de alterar a regulação do crescimento dos linfócitos B

e de induzir a transformação de crescimento permanente. O genoma do



EBV codifica diversas proteínas que alteram profundamente a expressão

celular, nomeadamente o oncogene LMP1 (Latent Membrane Protein 1),

essencial para a transformação dos linfócitos e juntamente com outro

gene viral, o LMP2 (Latent Membrane Protein 2), contribui para a

activação da expressão de genes celulares, principalmente através da

activação do factor de transcrição NFkappaB (Nuclear Factor kappa B)

(Pagano et al. 2004).

Outras neoplasias epiteliais, nomeadamente cancro do pulmão, do

cólon, da bexiga e da próstata, são promovidas por imunossupressão,

sugerindo que podem existir vírus ainda não identificados com um papel

importante no desenvolvimento destas neoplasias (Talbot e Crawford

2004).



Ciclina D1 e Cancro

A ciclina D1 (CCND1) parece funcionar como um sensor chave na

integração dos sinais extracelulares em células que se encontram no início

da fase G1 do ciclo celular, mediando a sua função através da ligação às

CDKs. A abundância de CCND1 é induzida por factores de crescimento,

nomeadamente EGF (Endothelial Growth Factor) (Alisi et al. 2003), FGF2

(Fibroblast Growth Factor-2) (Holnthoner et al. 2002), aminoácidos

(Nelsen et al. 2003), LPA (ácido lisofosfatídico) (Hu et al. 2003) e

hormonas gástricas (Song et al. 2003; Pradeep et al. 2004), cada um

regulando a expressão de CCND1 em tipos celulares específicos. Vários

sinais oncogénicos induzem a expressão de CCND1, incluindo RAS

(Albanese et al. 1995), Src (Lee et al. 1999), Neu (Lee et al. 2000) e β-

catenina (Shtutman et al. 1999; Lin et al. 2000).

O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no cromossoma

11q13 (figura 3), que codifica uma proteína de 33.7 kDa (Bates e Peters

1995), sendo também designado de bcl-1 ou PRAD1. Foi originalmente

isolado como um gene clonado, rearranjado e sobre-expresso em

adenomas da paratiróide (Motokura et al. 1991).



A

Figura 3 –

transcrito (B

O C

desenvolvi

nomeadam

adenomas

11q15, o q

do gene d

células B,

elemento r

Boer et al.

cromossóm

vários tipo

POLIM

B

Localização do gene CCND1 no cromossoma 11 (A) e estrutura do

).

CND1 é um proto-oncogene muitas vezes activado durante o

mento de tumores através de vários mecanismos,

ente por translocação e amplificação (figura 4). Em alguns

da paratiróide ocorre inversão, envolvendo as regiões 11q13 e

ue resulta na expressão de CCND1 sob o controlo do promotor

a hormona paratiróide (Motokura et al. 1991). Em linfomas de

o gene CCND1 sofre translocação e fica sob o controlo do

egulador do gene da imunoglobulina no cromossoma 14q32 (de

1993). A activação do gene (devido a amplificação ou rearranjo

ico) e/ou sobre-expressão da proteína têm sido descritos em

s de tumores, nomeadamente cólon (Palmqvist et al. 1998),

ORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS 18


mama (Marsh e Varley 1998), cabeça-pescoço (Callender et al. 1994),

pulmão (Betticher et al. 1996), bexiga (Sgambato et al. 2002), fígado

(Nishida et al. 1994) e próstata (Chen et al. 1998). A sobre-expressão de

CCND1 tem também sido correlacionada com proliferação aumentada,

podendo originar a passagem prematura da célula através do ponto de

controlo G1/S, resultando na propagação de erros não reparados no DNA,

acumulação de erros genéticos e numa vantagem selectiva de crescimento

para as células alteradas (Quelle et al. 1993; Zheng et al. 2001).

Figura 4 – Mecanismos de activação de CCND1 em tumores humanos (adaptado

de Bates e Peters 1995).



A amplificação do gene e a expressão desregulada de CCND1 em

células tumorais têm também sido associadas a sobrevida livre de doença

reduzida e mau prognóstico, apesar de haver alguma controvérsia nestas

associações (McIntosh et al. 1995; Michalides et al. 1995; Betticher et al.

1996; Keum et al. 1999; Drobnjak et al. 2000).



Polimorfismo A870G no gene CCND1

Betticher e colaboradores identificaram um polimorfismo no

nucleótido 870 do gene CCND1, que consiste na transição das bases

azotadas adenina e guanina no exão 4 do gene. Este polimorfismo não

origina uma mudança de aminoácido, no entanto, o nucleótido variante

interfere com o splicing do exão 4 para o exão 5, dada a sua localização

no splice donor site do exão 4 do gene CCND1. O RNAm pode sofrer

splicing alternativo e originar dois transcritos diferentes (a e b), que

existem simultaneamente em diversos tecidos (figura 5). O transcrito a

sofre splicing normal e o transcrito b é cortado no intrão 4 e não possui o

as sequências existentes no exão 5 do gene.

O alelo G está associado a ambos os transcritos, enquanto que o

alelo A, que está apenas associado ao transcrito b, dá origem ao splicing

alternativo, resultando numa proteína truncada que não possui as

sequências envolvidas na degradação rápida e tu nover da proteína

codificadas no exão 5 do gene (Betticher et al. 1995).

r



IIssooffoorrmmaa aa

Figura 5 – Splicing normal e alternativo do gene CCND1 (adaptado de Fu et al.

2004).

Os diferentes genótipos têm sido significativamente associados à

carcinogénese e prognóstico clínico em diversas neoplasias,

nomeadamente cancro da próstata (Wang et al. 2003), cabeça-pescoço,

(Matthias et al. 1998; Matthias et al. 1999; Holley et al. 2001; Wang et al.

2002; Monteiro et al. 2004), bexiga (Wang et al. 2002) e colorectal

(McKay et al. 2000).



Cancro do Colo do Útero

O tipo histológico mais comum de cancro do colo do útero é o

carcinoma espinocelular, que pode ser queratinizante ou não

queratinizante. Os adenocarcinomas são responsáveis por apenas 14%

dos cancros do colo do útero. Os carcinomas adenoescamosos e de

pequenas células são relativamente raros (Pazdur 1995).

Nos últimos anos as taxas de incidência e mortalidade têm

diminuído consideravelmente nos países desenvolvidos, provavelmente

devido à aplicação de programas de rastreio citológico, nomeadamente o

teste de Papanicolau. O cancro do colo do útero é um problema de saúde

pública, com aproximadamente 500000 mulheres a desenvolverem a

doença por ano, em todo o mundo. Em muitos países menos

desenvolvidos constitui a causa mais comum de morte por cancro. O

cancro do colo uterino ocupa o segundo lugar das neoplasias nas

mulheres em todo o mundo, sendo que aproximadamente 80% dos casos

surgem em países menos desenvolvidos (Waggoner 2003).

Em Portugal, a taxa de incidência ajustada à idade de novos casos

de cancro do colo uterino por ano é de 17,0 por cada 100 000 mulheres e

na União Europeia, de 10,5 por cada 100 000 mulheres. A taxa de

mortalidade anual ajustada à idade por cancro do colo do útero em cada

100 000 indivíduos é de 6,3 em Portugal e de 4,4 na União Europeia

(Pinheiro et al. 2003) (figura 6).



Figura 6 – Incidência do cancro do colo do útero no mundo em 2000 (adaptado

de Parkin 2001).

FFAACCTTOORREESS DDEE RRIISSCCOO

A infecção por tipos de HPV de alto risco é presentemente aceite

como o principal factor causal no desenvolvimento de cancro do colo do

útero, sendo um factor necessário, mas não suficiente, para o

desenvolvimento desta neoplasia. Grande parte das infecções provocadas

pelo HPV é transiente e apenas uma porção se torna persistente. O risco

para o desenvolvimento de lesões intra-epiteliais precursoras de cancro do

colo do útero é substancialmente aumentado em mulheres que

desenvolvem infecções persistentes com tipos de HPV oncogénicos (Bosch

et al. 2002). Outros factores de risco importantes incluem o número de

parceiros sexuais, a idade de coitarca, outras infecções sexualmente

transmissíveis e o fumo de cigarro. O número de partos tem também sido

associado ao desenvolvimento de cancro do colo uterino, sendo que

múltiplas gravidezes provocam um efeito traumático e imunossupressor



cumulativo no colo do útero, podendo facilitar a infecção por HPV. Tem

também sido descrita uma associação entre o uso prolongado de

contraceptivos orais e risco aumentado para cancro do colo do útero.

Relativamente a factores alimentares, a ingestão de frutas e vegetais que

contêm carotenóides e vitaminas C, A e E parece reduzir o risco para

cancro do colo uterino (Franco et al. 2001; Duarte-Franco e Franco 2004).

Factores genéticos, como haplótipos HLA específicos e

polimorfismos em alguns genes envolvidos na regulação do ciclo celular e

reparação do DNA têm sido associados ao desenvolvimento desta

neoplasia (Hildesheim e Wang 2002a; Jee et al. 2004) (figura 7).



Figura 7 – Modelo etiológico da infecção por HPV e cancro do colo do útero e

possível papel de outros co-factores na persistência da infecção e mediação da

progressão das lesões (adaptado de Franco et al. 2001).



Cancro da Nasofaringe

O cancro da nasofaringe (NPC) constitui um tipo distinto de cancro

da cabeça-pescoço. A classificação segundo a World Health Organization

(WHO) distingue três tipos histológicos de NPC, baseada no grau de

diferenciação. O carcinoma de células escamosas (SCC) queratinizante,

pertence ao tipo I, semelhante a outros cancros da cabeça-pescoço. No

tipo II agrupam-se os carcinomas não queratinizantes e no tipo III, mais

comum, os carcinomas indiferenciados (UCNT – Undifferentiated

Carcinoma of the Nasopharyngeal Type). O carcinoma indiferenciado

possui uma morfologia típica, com um infiltrado linfoplasmocítico

proeminente, também denominado de linfoepitelioma (Pazdur 1995). Os

diferentes tipos histológicos de NPC são encontrados em regiões

endémicas e não endémicas. Em zonas endémicas, o tipo III é

responsável por mais de 97% dos casos, enquanto que o SCC

queratinizante é mais comum em países Ocidentais (75%) (Marks et al.

1998).

O cancro da nasofaringe é raro na maioria dos países,

especialmente na Europa e América do Norte, com incidência anual

inferior a 1/100 000 indivíduos. Nestes países o tipo histológico mais

comum é o indiferenciado, que está associado ao consumo de fumo de

cigarro, com incidência de 0,5-2 em 100 000 indivíduos por ano. No

entanto, a incidência de NPC é elevada em várias regiões no sul da China,

nomeadamente na região de Cantão perto de Guangzhou, onde a



incidência é aproximadamente de 30-80/100 000 indivíduos por ano.

Outras áreas de elevada incidência incluem a Ilha Formosa, o Vietname e

as Filipinas. Nestas áreas, é provável que a dieta desempenhe um papel

importante na carcinogénese, dado que a dieta característica destas

populações consiste em carne e peixe curados que quando cozinhados

podem libertar nitrosaminas voláteis. Os países Arábia Saudita, Caraíbas e

populações de Esquimós do Alasca e Gronelândia possuem uma incidência

intermédia de NPC (Spano et al. 2003) (figura 8).

Esta neoplasia possui uma distribuição diferente entre homens e

mulheres, sendo que a taxa homem/mulher é normalmente de dois ou

três homens para uma mulher (Spano et al. 2003).

A distribuição do NPC de acordo com a idade não é idêntica no

Sudeste Asiático e Norte de África. Na Ásia, a maioria dos casos surge na

quinta ou sexta década de vida. No Norte de Africa, a distribuição parece

ser bimodal, com um pico por volta dos cinquenta anos de idade e outro

mais pequeno em indivíduos entre os 10 e 25 anos. Esta forma juvenil da

doença é responsável por aproximadamente 20% dos pacientes e possui

características clínicas e biológicas distintas (Spano et al. 2003).

As taxas de sobrevida aos 5 anos variam de 30 a 60%, dependendo

do estádio do tumor, da técnica de radiação utilizada e da percentagem

de pacientes com linfoepitelioma.



Figura 8 – Incidência do cancro da nasofaringe no mundo em 2000 (adaptado

de Parkin 2001).

FFAACCTTOORREESS DDEE RRIISSCCOO

Os factores etiológicos que parecem ser importantes no

desenvolvimento do carcinoma da nasofaringe incluem susceptibilidade

genética e factores ambientais, nomeadamente a dieta e infecção por

Epstein-Barr vírus.

A dieta é um factor de extrema relevância no desenvolvimento de

NPC. Como foi referido anteriormente, a ingestão de peixe curado e

outros alimentos preservados, tradicionais do sul da China, contêm

nitrosaminas voláteis que são factores associados ao desenvolvimento de

cancro da nasofaringe (Lo e Huang 2004).

A infecção por EBV está fortemente associada ao NPC. Pensa-se

que o EBV desempenha um papel crítico na transformação das células

epiteliais na nasofaringe em cancro invasivo (Lo e Huang 2004).



Relativamente aos factores genéticos, têm sido observadas perdas

de material genético em alguns cromossomas, nomeadamente 3p, 9, 11q,

13q, 14q e 16q e ganho de material genético no cromossoma 12. Tem

sido sugerido um papel importante dos haplótipos do HLA com o

desenvolvimento de NPC, sendo que alguns antigénios do HLA possuem

uma eficiência reduzida na activação da resposta imunológica à infecção

por EBV (Hildesheim et al. 2002b). Alguns polimorfismos em genes

envolvidos na metabolização de carcinogénios (CYP2E1) e reparação de

DNA (XRCC1 e hOGG1) têm sido associados a risco aumentado para o

desenvolvimento de NPC (Hildesheim et al. 1997; Nazar-Stewart et al.

1999; Cho et al. 2003).

O cancro da nasofaringe envolve a acumulação de diversas

alterações genéticas que resultam na modificação de vários mecanismos

celulares, como a alteração de vias envolvidas na regulação do ciclo

celular, nomeadamente as vias da TP53 e RB (Lo e Huang 2004).


OBJECTIVOS

Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo, com os

objectivos de:

- Analisar a frequência do polimorfismo A870G no gene da ciclina

D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer patologia, em

mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com carcinoma da

nasofaringe;

- Verificar e avaliar a existência de associações entre a frequência

do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética para carcinoma do

colo do útero e da nasofaringe.


MATERIAL E MÉTODOS POPULAÇÃO

Neste trabalho foi realizado um estudo do tipo caso-controlo em

quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. Todas as amostras

estudadas foram provenientes de indivíduos da região norte de Portugal.

IINNDDIIVVÍÍDDUUOOSS CCOONNTTRROOLLOO

O grupo de indivíduos controlo consistiu em cento e oitenta e sete

(187) indivíduos normais sem patologia oncológica conhecida, constituído

por cento e três (103) mulheres e oitenta e quatro (84) homens, com uma

idade média de 55,0 anos, desvio padrão (dp) de 16,8 e mediana de 55,0

anos.

Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens,

a média das idades foi de 54,5 anos, desvio padrão de 17,4 e mediana de

56,5 anos. O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possui

uma idade média de 46,7 anos, desvio padrão de 12,5 e mediana de 46,0

anos.


MATERIAL E MÉTODOS

PPAACCIIEENNTTEESS CCOOMM CCAANNCCRROO DDOO CCOOLLOO DDOO ÚÚTTEERROO

Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de

cento e setenta e oito (178) mulheres com lesões colo do útero

diagnosticado no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil –

Centro Regional de Oncologia do Porto e que deram entrada no

laboratório de Patologia Molecular entre 1997 e 2003. A idade média de

diagnóstico foi de 46,6 anos (dp de 12,7) e a mediana de 46,0 anos.

Aquando do diagnóstico foram analisadas as seguintes características

clínico-patológicas: tipo e grau de lesão, de acordo com o recente sistema

de classificação de Bethesda, tipo histológico do tumor e estádio, de

acordo a FIGO – Federation Interantionale de Gynecologie et

d’Obstetrique e AJCC – American Joint Comittee on Cancer. Em alguns

casos não foi possível a obtenção de informação relativamente ao estádio

do tumor. Estes dados estão descritos no quadro II.


MATERIAL E MÉTODOS


MATERIAL E MÉTODOS

PPAACCIIEENNTTEESS CCOOMM CCAANNCCRROO DDAA NNAASSOOFFAARRIINNGGEE

Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de

noventa e quatro (94) indivíduos com cancro da nasofaringe diagnosticado

no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de

Oncologia do Porto e que deram entrada no laboratório de Patologia

Molecular entre 2001 e 2004. A idade média de diagnóstico foi de 47,9

anos (dp de 14,5) e a mediana de 50,0 anos. Foram analisadas as

seguintes características clínico-patológicas na altura do diagnóstico: tipo

e grau histológico e estádio do tumor, de acordo a AJCC – American Joint

Comittee on Cancer. Não foi possível a obtenção de informação

relativamente a estas características em alguns casos. Estes dados estão

descritos no quadro III.


MATERIAL E MÉTODOS


MATERIAL E MÉTODOS PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Foram recolhidos aproximadamente 8 ml de sangue periférico dos

indivíduos atrás referidos, através de uma técnica padronizada de colheita

intravenosa, para tubos contendo uma solução de EDTA.

O isolamento de DNA genómico foi efectuado através da técnica

mista salting-out-clorofórmio a partir de células nucleadas de sangue

periférico (Mullenbach et al. 1989).

Adicionou-se uma solução hipotónica (AKE) às amostras, de forma

a provocar a lise dos eritrócitos e incubou-se a 4ºC durante 30 minutos.

Centrifugou-se a 2000 rpm (rotações por minuto), durante 10 minutos a

4ºC e ressuspendeu-se o sedimento na solução hipotónica. Centrifugou-se

novamente e ressuspendeu-se o sedimento em PBS, seguindo-se outra

centrifugação a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC.

Após a obtenção do sedimento de células, desprezou-se o

sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em 4 ml de tampão SE, de

modo a provocar a lise das células nucleadas. Adicionou-se SDS

(dodecilsulfato de sódio, Gibco BRL 5525UA), promovendo a dissociação

do DNA de proteínas. Adicionou-se posteriormente proteinase K

(Boehringer Mannheim 745723), para uma concentração final de 200

µg/ml e incubou-se a 55ºC durante 12 horas para degradação proteica.

Adicionou-se 1 ml de NaCl 6 M previamente aquecido (concentração

final de 1,5 M), de forma a precipitar as proteínas (salting-out). A

separação das proteínas foi realizada através da adição de igual volume


MATERIAL E MÉTODOS de clorofórmio (Merck 1124451000) e agitação suave durante 30 a 60

minutos. De seguida, centrifugou-se a 2500 rpm, durante 10 minutos a

4ºC com o objectivo de separar a fase aquosa que contém o DNA, da fase

orgânica, que contém as proteínas degradadas. Recolheu-se a fase

aquosa e adicionou-se igual volume de isopropanol (Panreac cod131090),

para precipitação do DNA. O DNA foi posteriormente lavado com etanol

(Merck 1009831000) a 70% (p/v). Após evaporação do etanol,

ressuspendeu-se o sedimento em água bidestilada.

Armazenaram-se as amostras a 4ºC ou -20ºC, consoante o tempo

de armazenamento previsto.

AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR

A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada através da

técnica de Polimerase Chain Reaction (PCR), de forma a obter um

fragmento de 167 pares de base (pb) (Betticher et al. 1995). A reacção foi

efectuada num termociclador programável Biometra T-Gradient, num

volume final de 50 µl, consistindo em aproximadamente 0,2 µg de DNA

genómico, 1 U de Taq DNA polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e

respectivo tampão de reacção 1×, 1,5 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0,2

mM de desoxinucleosídeos trifosfato (dNTP) (MBI Fermentas, #R0192), e

30 ρmol de primers específicos para a região do gene pretendida (F: 5’

GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C 3’ e R: 5’ GGG ACA TCA CCC TCA CCC


MATERIAL E MÉTODOS TCA CTT AC 3’). As condições da reacção incluíram um passo de pré-

desnaturação a 95ºC durante 10 minutos para activar a enzima, seguido

de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC durante 1 minuto, annealing a 55ºC

durante 1 minuto e extensão a 72ºC durante 1 minuto, com um passo de

extensão final durante 2 minutos a 72ºC.

IIDDEENNTTIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDOO FFRRAAGGMMEENNTTOO DDOO PPRROODDUUTTOO DDEE PPCCRR

A identificação do fragmento de DNA foi efectuada por

electroforese em géis de agarose a 1.5% (p/v), corados com brometo de

etídeo e visualizados sob luz ultravioleta, num equipamento Image Master

VDS (Pharmacia Biotech).

ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1 POR RFLP

O polimorfismo estudado foi analisado através da técnica

Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). Cerca de 15 µl de

produtos de PCR foram submetidos a digestão enzimática com 1U da

enzima de restrição ScrF1 (Fermentas #ER1422) e respectivo tampão de

reacção durante 4 horas a 37ºC.


MATERIAL E MÉTODOS

IIDDEENNTTIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDOOSS FFRRAAGGMMEENNTTOOSS OOBBTTIIDDOOSS PPOORR RRFFLLPP

Os fragmentos obtidos por RFLP foram submetidos a electroforese

em géis de agarose a 3% (p/v), corados com brometo de etídeo e

visualizados sob luz ultravioleta. O produto de PCR de 167 pb é cortado

pela enzima, se o alelo G estiver presente, originando dois fragmentos de

145 e 22 pb.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística dos resultados foi efectuada com auxílio do

software estatístico SPSS (Versão 11,5, SPSS Inc., 2002) Epi Info (Versão

3,3, 2004).

A análise do qui-quadrado foi utilizada para comparar variáveis

categóricas, com um nível de significância de 5%. O valor de p foi obtido

pelo teste de χ2 e considerado estatisticamente significativo quando

inferior a 0,05. O valor Odds Ratio (OR) e o seu Intervalo de Confiança de

95% (95% CI) foram calculados como uma medida da associação entre os

alelos e genótipos do gene CCND1 e o risco para cancro. O equilíbrio de

Hardy-Weinberg foi testado através de um teste goodness of fit de

Pearson, de forma a comparar as frequências observadas e esperadas.


MATERIAL E MÉTODOS

Foi calculada a Proporção Atribuível (PA), fracção de doença

atribuível a um dado factor de risco, através da fórmula: PA = PRF × 1-

1/OR; PRF é a percentagem do factor de risco nos casos e OR é o Odds

Ratio.


RESULTADOS

AMPLIFICAÇÃO DO DNA

A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada por PCR, de

forma a obter um fragmento de 167 pares de base (pb). Os produtos de

PCR foram submetidos a electroforese em géis de agarose a 1,5 % (p/v),

corados com brometo de etídeo, utilizando um marcador molecular de

peso conhecido (marcador de 100 pb), de forma a verificar a amplificação

do fragmento de DNA pretendido de 167 pb (figura 9).

Figura 9 – Análise da amplificação dos produtos de PCR em gel de agarose a 1,5 %,

exemplificando o fragmento de 167 pb, correspondente à região de CCND1 amplificada

(M – marcador molecular de 100 pb).

ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1

A técnica RFLP permitiu a visualização dos genótipos possíveis do

polimorfismo A870G no gene CCND1. Após digestão enzimática, a enzima

de restrição ScrF1 origina dois fragmentos de DNA quando o alelo G está


RESULTADOS

presente (145 e 22 pb) e apenas um, com peso de 167 pb, no caso de

presença do alelo A.

Através da visualização dos géis de agarose a 3% (figura 10),

podemos observar três padrões de fragmentos possíveis: um único

fragmento de 167 pb, correspondente ao genótipo homozigótico AA; um

fragmento de 145 pb e outro de 167 pb, correspondente ao genótipo

heterozigótico AG; ou um único fragmento de 145 pb, no caso de

genótipo homozigótico GG. A banda de 22 pb não é visível nos géis de

agarose, visto que possui um peso molecular muito baixo.

Figura 10 – Análise do polimorfismo A870G no gene CCND1 por RFLP em gel de

agarose a 3%, exemplificando os três padrões de RFLP obtidos. M – marcador molecular

de 100 pb; 1,3 e 7 – heterozigóticos AG; 2,4 e 5 – homozigóticos GG; 6 e 8 –

homozigóticos AA.


RESULTADOS

FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO A870G CCND1

IINNDDIIVVÍÍDDUUOOSS CCOONNTTRROOLLOO

As frequências genotípicas do polimorfismo A870G no gene CCND1

nos indivíduos controlo estão descritas no quadro IV.

O grupo de indivíduos controlo total, constituído por 187 indivíduos,

dos quais 103 mulheres e 84 homens, possuiu frequências genotípicas de

28,9%, 56,1% e 15,0% relativamente aos genótipos AA, AG e GG,

respectivamente. Relativamente ao modelo recessivo, as frequências

obtidas foram de 85,0% para os genótipos AA/AG e de 15,0% para o

genótipo homozigótico GG.

O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possuiu uma

distribuição genotípica constituída por 37,9% relativamente ao genótipo

AA, 53,4% relativamente ao genótipo AG e 8,7% relativamente ao

genótipo GG. No modelo recessivo, a frequência dos genótipos AA/AG foi

de 91,3% e 8,7% para o genótipo GG.

Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens,

as frequências dos genótipos AA, AG e GG observadas foram

respectivamente 17,9%, 59,5% e 22,6%. No que respeita ao modelo

recessivo, as frequências obtidas foram de 77,4% para os genótipos

AA/AG e de 22,6% para o genótipo homozigótico GG.


RESULTADOS


RESULTADOS

PPAACCIIEENNTTEESS CCOOMM LLEESSÕÕEESS DDOO CCOOLLOO DDOO ÚÚTTEERROO

A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no

gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com lesões do

colo do útero (casos), incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma

espinocelular do colo do útero (ICC) está descrita no quadro V.


RESULTADOS


RESULTADOS

A frequência do alelo G foi superior no grupo de pacientes com

lesões do colo do útero (46,9%) relativamente ao grupo controlo (35,4%)

e esta diferença é estatisticamente significativa (p=0,011). A frequência

dos genótipos AA, AG e GG foi de 37,9, 53,4 e 8,7%, respectivamente, no

grupo controlo e de 30,8, 44,7 e 24,5%, respectivamente, no grupo dos

casos. A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está

de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para

populações em equilíbrio (P=0,672 no grupo dos casos e P=0,461 no

grupo controlo).

A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que

mulheres portadoras do genótipo GG possuem um risco cerca de 3,4

vezes superior no desenvolvimento de lesões do colo do útero (OR=3,38;

95% CI 1,55-7,41; p=0,001). A estratificação da análise de acordo com a

mediana das idades dos pacientes indicou que o grupo de mulheres com

idade superior a 46 anos portadoras do genótipo GG, possui um risco

aumentado de cerca de 3 vezes no desenvolvimento de lesões do colo do

útero (OR=3,20; 95% CI 1,25-8,16; p=0,017).

No caso dos pacientes com carcinoma do colo do útero, a

proporção de casos de cancro do colo uterino atribuível à influência do

genótipo GG foi de 17,26%.

Na figura 11 estão representadas as distribuições genotípicas do

polimorfismo A870G no gene CCND1 no grupo controlo e grupos de lesões


RESULTADOS

do colo uterino, incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma

espinocelular do colo do útero (ICC).

As frequências genotípicas no grupo controlo, no grupo de

pacientes com lesões de alto grau e carcinoma espinocelular do colo do

útero e resultados da análise estatística tendo em conta o grau de lesão

estão descritas no quadro VI.

AA/AG

GG

AA/AG

GG

AA/AG

GG

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Per

cent

agem

Controlos HSIL ICC

GGAA/AG

Figura 11 – Representação gráfica da distribuição das frequências do

polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo, pacientes com lesões

de alto grau do colo uterino (HSIL) e no grupo de pacientes com carcinoma

espinocelular do colo do útero (ICC).


RESULTADOS


RESULTADOS

Através da análise dos resultados observou-se que mulheres

portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o

desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95%

CI 1,45-9,31; p=0,007) e de 3,24 vezes superior para o desenvolvimento

de carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,41-

7,46; p=0,006).

VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS

Foi analisado o estádio do tumor com o objectivo de avaliar a

influência do polimorfismo A870G no na agressividade e progressão

tumoral.

Foi efectuada uma re-codificação do estádio, de forma a avaliar

diferenciadamente os estádios menos agressivos (I, IIa) e os estádios

mais agressivos com invasão e envolvimento dos paramétrios (IIb, III e

IV).

Na figura 12 está representada a distribuição dos genótipos CCND1

nos diferentes estádios dos casos de carcinoma espinocelular do colo

uterino.


RESULTADOS

AA/AG

GG

AA/AG

GG

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Pe

rcen

tage

m

<II b ≥ II b

GGAA/AG


polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais.

No quadro VII estão descritos os resultados da análise estatística

referente às frequências dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios.

Não se verificaram diferenças estatisticamente significativas nas

frequências genotípicas nestes dois grupos de casos (p=0,49).


RESULTADOS


RESULTADOS

PPAACCIIEENNTTEESS CCOOMM CCAANNCCRROO DDAA NNAASSOOFFAARRIINNGGEE

A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no

gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com cancro da

nasofaringe está descrita no quadro VIII.

No grupo de pacientes com carcinoma da nasofaringe, as

frequências de ambos os alelos, A e G, foi de 50,0%. A frequência dos

genótipos AA, AG e GG foi de 28,9, 56,1 e 15,0%, respectivamente no

grupo controlo e 27,7, 44,6 e 27,7%, respectivamente no grupo dos

pacientes com cancro da nasofaringe. A percentagem de indivíduos

portadores do genótipo GG foi superior no grupo dos pacientes,

relativamente ao grupo controlo (figura 13).


RESULTADOS

AA/AG

GG

AA/AG

GG

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Perc

enta

gem

NPC Controlos

GGAA/AG

Figura 13 - Representação gráfica da distribuição das frequências do

polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo e pacientes com cancro

da nasofaringe.

A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está

de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para

populações em equilíbrio (P=0,804 no grupo dos casos e P=0,357 no

grupo controlo).

A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que

indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no

desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;

p=0,016).


RESULTADOS


RESULTADOS

No quadro IX estão descritas as frequências genotípicas no grupo

controlo e no grupo de pacientes com carcinoma indiferenciado da

nasofaringe (UCNT). A análise estatística dos resultados tendo em conta

este tipo histológico demonstra um risco ainda superior no

desenvolvimento de UCNT em indivíduos portadores do genótipo GG

(OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018).

A proporção de casos de cancro da nasofaringe atribuível à

influência do genótipo GG foi de 14,94%.


RESULTADOS


RESULTADOS

VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS

O grupo de pacientes com cancro da nasofaringe foi estratificado

de acordo com o estádio do tumor e presença/ausência de metástases

ganglionares, com o intuito de analisar uma possível influência do

polimorfismo A870G na agressividade tumoral.

Na figura 14 estão representadas as distribuições dos genótipos

CCND1 nas diferentes variáveis clínico-patológicas analisadas no grupo de

pacientes com cancro da nasofaringe. Novamente, foi efectuada uma re-

codificação do estádio do tumor, com o objectivo de comparar os estádios

menos agressivos (I, II e III) e o estádio de maior agressividade (IV).

AA/AG

GG

AA/AG

GG

0

10

2030

4050

60

7080

90100

Perc

enta

gem

I/II/III IV

GG

AA/AGAA/AG

GG

AA/AG

GG

0

10

2030

40

5060

7080

90

100

Perc

enta

gem

Não Sim

GG

AA/AG

A B


polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais (A) e

referente à presença/ausência de metastização ganglionar (B).


RESULTADOS

No quadro X apresentam-se os resultados da análise estatística

referente às distribuições dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios e

referentes à metastização ganglionar. Não foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas nas frequências genotípicas dos sub-grupos

definidos tendo em conta as variáveis clínico-patológicas analisadas (para

a variável estádio do tumor, p=0,795 e presença/ausência de

metastização ganglionar, p=0,788).


RESULTADOS


DISCUSSÃO

Nos últimos anos a investigação oncológica tem demonstrado que o

cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no genoma.

Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação da

proliferação celular são eventos necessários para o estabelecimento de um

tumor.

O gene CCND1 é um proto-oncogene envolvido na regulação do

ciclo celular e alterações neste gene têm sido descritas em vários tumores.

O polimorfismo A870G no gene CCND1 tem sido analisado em alguns tipos

de neoplasias, com resultados controversos.

Os objectivos deste estudo consistiram na análise da frequência do

polimorfismo no codão 870 no gene CCND1 em indivíduos sem qualquer

patologia, em mulheres com lesões do colo uterino e indivíduos com

cancro da nasofaringe e avaliar a existência de associações entre a

frequência do polimorfismo estudado e a susceptibilidade para cancro do

colo do útero e cancro da nasofaringe.

SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DO COLO DO ÚTERO

O cancro do colo do útero permanece um problema de saúde

pública mundial, especialmente em países em vias de desenvolvimento. A

infecção por estirpes de HPV de alto risco constitui o principal factor

etiológico associado à carcinogénese do cancro do colo do uterino. No

entanto, apenas uma percentagem das mulheres infectadas desenvolve


DISCUSSÃO

esta neoplasia. Pensa-se que factores genéticos individuais, em associação

com a infecção, sejam responsáveis por uma maior susceptibilidade de

determinadas mulheres para o desenvolvimento de cancro do colo uterino

(Bosch et al. 2002).

As oncoproteínas E6 e E7 do HPV são importantes na imortalização

celular e alteram pontos de controlo do ciclo celular. A oncoproteína E7

possui a capacidade de ligação à proteína retinoblastoma (RB) tornando-a

funcionalmente inactiva. Quando as células se aproximam da fase S do

ciclo celular, a RB é fosforilada, originando a libertação dos factores de

transcrição E2F e activando a expressão dos genes necessários à

progressão através da fase S do ciclo celular. A oncoproteína E7 do HPV

ultrapassa este controlo e liga-se directamente à RB, originando a

libertação não fisiológica dos factores E2F. A acumulação de alterações

genéticas como resultado de alterações no controlo de checkpoints do

ciclo celular pode ser um mecanismo importante no processo de

imortalização celular por estirpes de HPV de alto risco (Koromilas et al.

2001; Tindle 2002; Scheffner e Whitaker 2003).

O gene CCND1 codifica a proteína ciclina D1, que é expressa em

resposta a sinais mitogénicos e promove a transição através do ponto de

controlo G1/S do ciclo celular. Southern e Herrington (Southern e

Herrington 1998) descreveram a ausência de expressão de CCND1 na

maioria das lesões de baixo grau do colo uterino infectadas por estirpes

de HPV de alto risco e sobre-expressão de CCND1 na maior parte das

lesões infectadas com estirpes de HPV de baixo risco. Estes resultados são


DISCUSSÃO

concordantes com as observações in vitro de que a sobre-expressão de

CCND1 não é necessária à progressão através da fase G1 em linhas

celulares de queratinócitos humanos que expressam as oncoproteínas E6

e E7 das estirpes de HPV de alto risco. A ligação da proteína E7 à RB faz

com que a célula não necessite de CCND1 e assegura a libertação dos

factores de transcrição E2F. Consequentemente, as células progridem para

a fase S do ciclo celular e é induzida a expressão dos genes necessários à

síntese celular e viral (Lukas et al. 1994).

A proteína E7 do HPV 16 possui homologia com os locais de ligação

à RB da CCND1, induzindo consequentemente a libertação dos factores de

transcrição E2F (Cho et al. 2002). As ciclinas D ligam-se ao domínio

hipofosforilado da RB através de sequências LXCXE, que são partilhadas

com vários vírus de DNA associados a tumores (Dowdy et al. 1993).

Um artigo publicado recentemente (Bae et al. 2001) indica que a

expressão do RNAm e da proteína CCND1 é baixa em células malignas do

colo uterino e sugere que a expressão da proteína é regulada a nível da

transcrição. Por outro lado, a expressão de CCND1 tem sido

correlacionada com os genótipos do polimorfismo A870G no gene,

sugerindo que o genótipo GG está associado a uma baixa expressão de

CCND1 em carcinomas de células escamosas (Holley et al. 2001).

Se a disponibilidade de CCND1 na célula é reduzida, é possível que

os níveis reduzidos da proteína originem uma menor interacção com a RB

de forma quantitativa. Dado que a proteína E7 do HPV possui homologia

com os locais de ligação da CCND1 à RB, isto pode facilitar a interacção da


DISCUSSÃO

oncoproteína E7 com a RB. Assim, a CCND1 pode não competir com a

oncoproteína E7 pelo mesmo local de ligação à RB, facilitando e

promovendo a ligação da proteína E7 a este regulador celular, com a

consequente libertação dos factores de transcrição E2F e induzindo a

expressão de genes necessários à síntese celular e viral.

Os nossos resultados sugerem que mulheres portadoras do

genótipo GG no gene CCND1 possuem um risco aumentado para o

desenvolvimento de lesões no colo do útero (OR=3,67 para lesões de alto

grau e OR=3,24 para carcinoma espinocelular do colo uterino).

O polimorfismo A870G no gene CCND1 pode então actuar como um

co-factor da infecção por HPV na indução e iniciação da carcinogénese do

colo uterino.

SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA NASOFARINGE

O cancro da nasofaringe é uma neoplasia associada ao vírus

Epstein-Barr. No entanto, a etiologia do NPC é complexa e multi-factorial,

sendo que carcinogénios de origem não viral e predisposição genética

podem constituir outros factores etiológicos de importância relevante.

Vários polimorfismos genéticos relacionados com a susceptibilidade

individual para o cancro têm sido estudados relativamente à sua

associação com o risco para NPC.


DISCUSSÃO

Neste estudo, o polimorfismo A870G no gene CCND1 foi analisado

de forma a avaliar a sua importância no desenvolvimento de NPC.

Os nossos resultados indicam que indivíduos portadores do

genótipo GG possuem um risco 2,17 vezes superior para o

desenvolvimento de cancro da nasofaringe e uma susceptibilidade ainda

superior, com um risco acrescido de 2,32 vezes, quando considerados

apenas os casos de pacientes com carcinoma indiferenciado da

nasofaringe, associado à infecção por EBV.

Estes resultados são concordantes com os resultados publicados

recentemente por Deng e colaboradores, que demonstram que a proteína

LMP1 do EBV possui a capacidade de regular o crescimento celular pela

expressão de CCND1 através da via NF-kB no NPC e sugerem que o

polimorfismo A870G no gene CCND1 está associado ao desenvolvimento e

susceptibilidade para NPC (Deng et al. 2002).

Os nossos resultados são concordantes com os encontrados por

outros autores, sugerindo que o genótipo GG está associado ao

desenvolvimento de tumores. Matthias e colaboradores (Matthias et al.

1998; Matthias et al. 1999) demonstram que o genótipo GG de CCND1

está associado a tumores pouco diferenciados de cabeça-pescoço e

sobrevida livre de doença reduzida em carcinomas da laringe e faringe,


DISCUSSÃO

estabelecendo uma ligação entre os alelos A870G de CCND1 com a

expressão da proteína e prognóstico clínico nos carcinomas de células

escamosas da cabeça-pescoço. Um estudo realizado na população

portuguesa refere uma correlação entre o genótipo GG e susceptibilidade

aumentada para o desenvolvimento de tumores na laringe (Monteiro et al.

2004).

No entanto, o papel dos diferentes genótipos do gene CCND1 no

desenvolvimento de neoplasias não é ainda claramente conhecido, tendo

sido publicados resultados controversos (Kong et al. 2000; Zheng et al.

2001; Wang et al. 2002; Wang et al. 2003). Tem sido sugerido que o

transcripto b é originado maioritariamente através do alelo A em vários

tipos de células tumorais. O genótipo AA origina um aumento dos níveis

de transcrito b nas células tumorais, resultando num aumento da

quantidade de uma proteína que não possui sequências envolvidas no

turnover e degradação rápida, a região PEST (destruction box), e possui

um tempo de semi-vida superior (Betticher et al. 1995; Sawa et al. 1998;

Wang et al. 2002).

O mecanismo para esta associação não é ainda conhecido e

embora o alelo G origine uma menor quantidade de transcripto b do que o

alelo A, os indivíduos que possuem o genótipo GG podem possuir níveis

celulares de CCND1 diferentes dos indivíduos que possuem o genótipo AA.

Por outro lado, um estudo recente indica que o transcripto b origina uma

proteína que não é acumulada de forma alterada nas células e possui uma

estabilidade semelhante à proteína originada pelo transcripto a. Este


DISCUSSÃO

estudo demonstra ainda que o transcripto a constitui um catalisador mais

eficiente da fosforilação/inactivação da RB (Solomon et al. 2003).

Estes resultados sugerem que o efeito do genótipo no

comportamento do tumor pode exibir algum grau de especificidade

tecidular. É possível que estes resultados controversos reproduzam os

diferentes mecanismos através dos quais a expressão alterada da ciclina

D1 ocorre no cancro.

Por outro lado, a contribuição de polimorfismos genéticos no risco

para cancro pode ser dependente da população estudada, assim como de

factores ambientais e outros factores que influenciam essa mesma

população. Têm sido descritas diferenças étnicas e geográficas

relativamente à frequência genotípica de diversos polimorfismos. Os

nossos resultados obtidos na população portuguesa são concordantes com

um estudo recentemente publicado e realizado na nossa população

(Monteiro et al. 2004).

Estes resultados podem ajudar na compreensão do papel da ciclina

D1 no desenvolvimento de cancro do colo uterino e da nasofaringe.


CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

A ciclina D1 é um regulador positivo importante do ponto de

controlo G1/S do ciclo celular que tem sido correlacionado com vários

tipos de tumores humanos. O gene CCND1 é um dos genes mais

frequentemente alterados em neoplasias humanas, dado que a expressão

alterada da proteína pode originar a proliferação celular desregulada.

Vários estudos recentemente publicados indicam que o gene CCND1 pode

constituir um marcador molecular muito útil na determinação do

prognóstico clínico de alguns tumores. O polimorfismo A/G no codão 870

do gene CCND1 tem sido relacionado com o prognóstico clínico e risco

alterados para diversas neoplasias.

Este estudo demonstra que o genótipo GG do polimorfismo A870G

no gene CCND1 parece ter um papel preponderante na susceptibilidade

para cancro do colo do útero e da nasofaringe, conferindo um risco

acrescido no desenvolvimento destes tumores.

A análise de variações genéticas inter-individuais, como os

polimorfismos, pode contribuir para uma melhor caracterização da

susceptibilidade para cancro. A definição de sub-grupos de indivíduos mais

susceptíveis para determinadas neoplasias, de acordo com o seu genoma,

pode ser determinante na elaboração de estratégias de prevenção para

estas doenças.

Estudos realizados em culturas de tecidos demonstram que a

CCND1 possui a capacidade de potenciar a transformação oncogénica de



outros oncogenes, nomeadamente RAS, Src e E1A. O papel da CCND1

parece ser dependente e específico para o tipo de tecido e oncogene.

Estudos posteriores poderão incluir a análise combinada com outros

polimorfismos que foram já associados a susceptibilidade para cancro e

publicados pelo nosso grupo, incluindo CYP2E1, GST, ecNOS, ARStuI,

VDR, TP53, CCR2 (Medeiros et al. 2002; Ferreira et al. 2003; Medeiros et

al. 2003a; Medeiros et al. 2003b; Medeiros et al. 2004; Coelho et al. 2005;

Santos et al. 2005).

Pretendemos também aumentar a amostragem do estudo, com o

objectivo de alargar os resultados a amostras de grande número e

analisar o papel do polimorfismo na susceptibilidade para outros cancros,

nomeadamente outras neoplasias associadas a vírus.

Estudos recentes sugerem que a CCND1 pode constituir um

potencial alvo terapêutico em alguns carcinomas (Sauter et al. 1999;

Sauter et al. 2002; Fu et al. 2004) e parece alterar a sensibilidade das

células tumorais à radiação ionizante (Coco Martin et al. 1999; Finkielstein

et al. 2002; Jayasurya et al. 2004). É também nosso objectivo alargar este

estudo numa perspectiva farmacogenómica, com o intuito de avaliar o

papel deste polimorfismo na resposta à terapia.

Acreditamos que a continuação deste estudo é então fundamental,

de forma a uma melhor compreensão do papel e influência da ciclina D1



no cancro, dos mecanismos biológicos do cancro do colo do útero e da

nasofaringe e na definição de um perfil genético para estas neoplasias.


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ANEXOS

ANEXO I – SOLUÇÕES

PBS

Na2HPO4 1,48g/l (Merck 1065860500)

NaH2PO4 0,495 g/l (Merck 63460500)

NaCl 7,2 g/l (Panreac cod131659)

AKE

NH4Cl 82,9 g/l (Merck 101146)

KHCO2 10 g/l (Merck 48540500)

EDTA 0,37 g/l (Merck 108418)

SE

NaCl 75 mM (Panreac cod131659)

EDTA 25 mM (Merck 108418)

POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS

ANEXOS

ANEXO II

Provas do artigo intitulado “Increased risk of cervical cancer

associated with cyclin D1 gene A870G polymorphism”, aceite para

publicação na revista Cancer Genetics and Cytogenetics.


Increased risk of cervical cancer associated with cyclin D1 gene

A870G polymorphism

Raquel Catarinoa, Ana Matosa,b, Daniela Pintoa, Deolinda Pereirac, Rogéria

Craveirod, André Vasconcelosa, Carlos Lopesa, Rui Medeirosa*.

a Molecular Oncology Unit of Portuguese Institute of Oncology - Porto, Portugal

b Gynaecology Department of Júlio Dinis Maternity

c Medical Oncology Department of Portuguese Institute of Oncology - Porto,

Portugal

d Radiobiology Department of Portuguese Institute of Oncology - Porto, Portugal

*Correspondence should be addressed to:

Rui Medeiros, PhD

Instituto Português de Oncologia, Porto,

Laboratórios - Piso 4, Unit of Molecular Oncology,

R. Dr. Ant. Bernardino Almeida,

4200-072 Porto,

Portugal.

Tel: 351 - 22 5084000 (Ext 5414)

Email: [email protected]


ABSTRACT

Human papillomavirus (HPV) play the major role in the etiology of cervical

cancer. However, a complex correlation between viral and cellular genes is

necessary for cell cycle control deregulation in the progression to invasive

cervical cancer (ICC).

Cyclin D1 (CCND1) is an important positive regulator of the G1/S phase of the

cell cycle. The CCND1 gene is located at chromosome 11q13 and is often altered

in human cancers.

We analysed the A870G CCND1 polymorphism by PCR-RFLP in 246 women

including, 50 cases with high-grade squamous intraepithelial lesions of the cervix

(HSIL), 93 with ICC and 103 healthy women. The GG genotype was associated

with a 4.32 fold higher risk for the development of HSIL (aOR=4.32, 95% CI

1.50-12.46, P=0.0067), and a 3.26 fold increased risk for the development of ICC

(aOR=3.26, 95% CI 1.42-7.53, P=0.006).

The proportion of cervical cancer cases attributable to the GG CCND1 genotype

was 17.26%.

This is the first study reporting that A870G CCND1 polymorphism could act as a

cofactor of HPV in the initiation of cervical carcinogenesis, particularly in the

transformation zone of HPV infected women, supporting evidence for a genetic

factor on ICC risk.


INTRODUCTION

Invasive cervical cancer (ICC) is the most common gynaecologic malignancy

worldwide and one of the most common causes of death in women. In Portugal,

cervical cancer has an age-standardised incidence rate of 17.0 per 100.000 women

and is responsible for 4.2% of malignant deaths [1].

The primary cause in the development of ICC is infection with human

papillomavirus (HPV). More than 90% of squamous cervical cancers contain

HPV DNA [2]. HPV 16 and 18 have two transcriptional units, E6 and E7, which

encode proteins important for cell immortalization [3]. Integration of HPV DNA

into the host genome results in the constitutive expression of the viral

oncoproteins E6 and E7, which deregulate cell cycle control through interaction

with oncogenes and tumor-suppressor gene products, initiating the crucial step for

tumorigenesis [4,5]. The E7 oncoprotein binds to retinoblastoma protein (RB),

and the related pocket proteins p107 and p130, leading to functional inactivation

of these proliferation regulators, which ultimately allows unchecked cell-cycle

progression in cells infected with HPV 16 or 18 [4,6,7].

Epidemiological and clinical data suggest that human papillomavirus, especially

HPV-16 and HPV-18 (high-risk HPV), play the major role in the etiology of

cervical cancer [8]. However, some researchers acknowledge that HPV is a

necessary but not a sufficient factor in the etiology of ICC. The progression from

HPV infection to cancer involves other environmental and host factors. Single-

nucleotide polymorphism (SNP) markers should be considered in the

determination of the combinations of genetic factors involved in precancerous

changes to cervical cancer [9]. It is unclear whether the association of these


environmental and genetic factors with cervical cancer reflects secondary

associations also attributable to infection, or if they are independent risk factors,

or even if they act as cofactors of HPV infection in induction of cervical

carcinogenesis [10].

A frequent target in transitional cell carcinogenesis is the deregulation of G1/S

phase progression in the cell cycle which is regulated by cyclins, cyclin-dependent

kinases and their inhibitors [11].

Cyclin D1 (CCND1) is a key regulator of cell cycle progression, an important

positive regulator of the G1/S phase and a demonstrated oncogene [12,13,14].

CCND1 is located at chromosome 11q13 and alterations in this gene have been

described in several cancers [15,16-20,21]. CCND1 regulates cell cycle

progression by activating cyclin-dependent kinases 4 and 6 (CDK4 and CDK6),

which in turn phosphorylate RB. This reaction inactivates RB and is postulated to

lead to progression through a G1-S checkpoint, committing the cell to DNA

replication [22,23].

Recently, it has been reported that CCND1 mRNA is alternatively spliced to

produce two transcripts (a and b), which are present simultaneously in a variety of

normal tissues and cancer cells [24,25]. Betticher and colleagues [25] identified a

single base pair polymorphism (A870G) in CCND1, and CCND1 genotypes have

been significantly associated with carcinogenesis and clinical outcome in a variety

of cancers [26-32]. Alterations in this gene, such as gene amplifications and

overexpression have been observed in cervical cancer patients [33-36].

The genetic association between CCND1 A870G polymorphism and genetic

susceptibility to cervical cancer has not yet been investigated. The aim of our


study was to determine if the CCND1 genotypes were associated with genetic

susceptibility to cervical cancer.

PATIENTS AND METHODS

PATIENTS

We tested the association between the CCND1 A870G polymorphism and risk of

cervical cancer using a case-control study. 143 patients were selected for this

study; 50 patients with histologically confirmed high-grade intraepithelial

squamous lesions of the cervix (HSIL) and 93 with also histologically confirmed

invasive cervical carcinoma (ICC). Patients were admitted to the Portuguese

Oncology Institute-Porto, Portugal, during the period from 1997 to 2003. The

median age at diagnosis was 46 years (standard deviation 12.5). The control group

consisted of 103 healthy women, with a median age of 55 (standard deviation

16.3), without clinical history of cancer, from the same geographic area as the

case group. All samples were taken after informed consent according to the

declaration of Helsinki.

POLYMERASE CHAIN REACTION/RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM

(PCR-RFLP) ANALYSIS

DNA was extracted from peripheral blood leukocytes from each study subject

using a salting out protocol [37]. The detection of the A870G polymorphism of

CCND1 was carried out essentially as previously described [25]. The PCR

reactions consisted of nearly 0.2 µg of genomic DNA, 30 ρmol of each primer, 0.2

mM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 × Taq Buffer, and 1 U of Taq DNA

polymerase to a final volume of 50 µl. Primers used in the analysis were CY26


(5´GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C 3´) and CY27 (5´ GGG ACA TCA

CCC TCA CCC TCA CTT AC 3´). Thirty five cycles were performed, consisting

of an initial heating at 95ºC for 10 min to activate the enzyme, followed by 35

cycles of denaturation at 94ºC for 1 min, annealing at 55ºC for 1 min and

extension at 72ºC for 1 min, with a final extension step at 72ºC for 2 min.

PCR products (15 µl) were digested with 1 U ScrF1 at 37ºC for 4 hr, and

visualized by electrophoresis on 3% agarose containing 0.5 µg/ml ethidium

bromide. The 167 bp PCR product generated is not cut by ScrF1 if the A allele is

present, whereas the product from the G allele is cut to produce fragments of 145

and 22 bp (Fig.1). Figure 1

STATISTICAL ANALYSIS

Analysis of data was performed using the computer software SPSS for Windows

(Version 12.0) and Epi Info (version 6.04). Chi-square analysis was used to

compare categorical variables and a 5% level of significance was used in the

analysis. The odds ratio (OR) and its 95% confidence interval (CI) were

calculated as a measurement of the association between CCND1 genotypes and

cervical cancer risk. The Hardy-Weinberg equilibrium was tested by a Pearson

goodness of fit test to compare the observed versus the expected genotype

frequencies. Logistic regression analysis was used to calculate the adjusted OR

(aOR) and 95% CI for the influence of CCND1 genotypes in the risk of cervical

cancer, with adjustment for age.

We calculated the attributable proportion (AP) using the following formula: AP =

PRF × (1-1/OR), where AP is the fraction of disease attributable to the risk factor


and PRF is the percentage of the risk factor in case subjects and OR is the odds

ratio.

RESULTS

The distribution of CCND1 genotypes among cases and controls and the risk of

cervical cancer due to the influence of CCND1 polymorphism are shown in Table

1.

Table1

The frequency of the G allele was higher in cases (46.9%) than in controls

(35.4%), and this difference was statistically significant (P=0.011). The

frequencies of AA, AG and GG genotypes were 37.9, 53.4 and 8.7%, respectively

in normal controls, and 30.8, 44.7 and 24.5%, respectively in the case group. The

genotype distribution of both groups was in the Hardy-Weinberg equilibrium

(P=0.672 in the case group and 0.461 in the control group). The analysis of the

frequencies of CCND1 genotypes indicates that women carrying two G-alleles

have a 3-fold increase in the risk for cervical lesions (aOR=3.48, 95% CI 1.57-

7.70, P=0.0021). The stratification of the analysis according to the patients

median age (women older than 46 versus younger than 46 years) lead to the

observation that, for the group of women older than 46 years carrying two G

alleles, there is a statistically significant threefold increase of cervical cancer risk

(OR=3.20, 95% IC 1.25-8.16, P=0.017).

No significant differences were found in the frequencies of CCND1 genotypes

between different stages of ICC (histological differentiation), as shown in Table 2.

However, women carrying the GG genotype have 4.32 fold higher risk for the

development of HSIL (aOR=4.32, 95% CI 1.50-12.46, P=0.0067), and a 3.26 fold

Table 2


increased risk for the development of ICC (aOR=3.26, 95% CI 1.42-7.53,

P=0.006).

For the ICC patients, the proportion of cervical cancer cases attributable to the GG

CCND1 genotype was 17.26%.

DISCUSSION

Cervical cancer remains a major worldwide health problem, especially in

developing countries. During the past decades, the expansion of molecular

biology has been of great importance in understanding the basis of cancer

development and progression. The mechanism of cervical cancer carcinogenesis

is not well understood. Our study is the first report suggesting a role for CCND1

polymorphism in cervical cancer.

It is now known that specific types of human papillomavirus (HPV) are the

principal etiologic agents for both cervical cancer and its precursors. However, the

discrepancy between high rates of HPV infection and low rates of cervical cancer

development among women suggests that additional genetic events are necessary

for progression to a malignant phenotype, namely alterations in oncogenes and

tumor suppressor genes [8].

HPVs encode two proteins, E6 and E7, which are important for cell

immortalization. HPV 16 E6 and E7 disrupt cell cycle checkpoints, particularly

affecting nearly all cyclin-dependent kinase inhibitors linked to the G1 and G2

checkpoints, in each case through a different mechanism [3]. E7 binds to RB

originating its functional inactivation [4,6]. In quiescent cells, RB is complexed to

the transcription factor E2F. Approaching S phase of the cell cycle, RB becomes


hyperphosphorylated, causing release of E2F, which then activates expression of

growth-associated genes. E7 bypasses this RB-dependent control by binding to

RB and causing the non-physiological release of active E2F [38,39].

HPV infection may constitute the initial cause of subsequent genetic alterations

leading to the development of cervical tumors, whether the mechanism is due to

direct integration of HPV DNA or subsequent interaction with other cellular

proteins or both [40]. The accumulation of genetic abnormalities as a result of

alterations in cell cycle checkpoint control is likely to be an important mechanism

in the process of cellular immortalization by high-risk HPVs [41].

CCND1 encodes cyclin D1 protein, which is expressed in response to mitogenic

signals promoting transition through the restriction point in the G1 phase of the

cell cycle [23].

Shirley and colleagues [42] reported the absence of CCND1 expression in the

majority of naturally occurring low-grade cervical lesions infected with high-risk

HPVs, in contrast with the overexpression of CCND1 in most lesions containing

low-risk HPVs. These findings are compatible with the in vitro observation that

CCND1 overexpression is not required for G1 phase progression in human

keratinocyte cell lines expressing the E6 and E7 proteins of high-risk HPVs [43].

The binding of the E7 protein of high-risk HPVs to the RB protein obviates the

requirement of the cell for CCND1 and ensures the unrestricted release of E2F

transcriptional factors. This in turn leads to S phase entry, thereby inducing the

expression of genes required for cellular and viral synthesis [43].

HPV 16 E7 shows homology with the RB binding sites of CCND1, consequently

inducing the release of E2F transcriptional factors [44]. D-type cyclins bind to the


pocket domain of hypophosphorylated RB through their LXCXE sequences,

which are shared with several DNA tumour viruses [45].

Several genetic polymorphisms contributing to individual’s susceptibility to

cancer have been studied regarding their association with cervical cancer risk

[46,47]. In this study we analysed a single-nucleotide polymorphism in CCND1,

in order to evaluate its importance in the development of cervical cancer. The

A870G polymorphism at codon 242 within the conserved splice donor site of

exon 4 of the gene appears to modulate the splicing of CCND1 mRNA,

originating two transcripts (a and b), which are present in a variety of tissues

[25,48,49]. The transcript a is identical to the reported CCND1 cDNA [12].

However, transcript b fails to splice at the exon 4/intron4 boundary, does not

contain exon 5, and terminates downstream of exon 4. The main difference in the

cyclin D1 proteins encoded by the two transcripts (a and b) is in the C-terminal

PEST-rich region (destruction box) encoded by exon 5 which is responsible for

rapid intracellular degradation and turnover of the G1 cyclins [25,48,50].

It has been suggested that the variant A allele is a major source of variant

transcript b in several types of cancer cells [25,29,49]. The AA genotype increases

the products of transcript b in tumor tissue cells, resulting in an increase of an

altered protein that lacks the PEST-region with increased half-life [25,29].

Duk-Soo Bae and colleagues [33] reported that CCND1 mRNA and protein

expression is decreased in cervical cancer, suggesting that CCND1 expression is

regulated at the level of transcription. Moreover, CCND1 expression has been

correlated with the CCND1 genotypes, suggesting that the GG genotype is

associated with low expression of CCND1 in squamous cell carcinoma [51]. We


hypothesize that if the availability of CCND1 in the cell is reduced, there is less

CCND1 to interact with the RB in a quantitative manner. Since high-risk HPV E7

protein shows homology with the RB binding sites of CCND1, the reduced levels

of this cyclin in the cell may facilitate the interaction of the HPV E7 protein with

the RB. Therefore, CCND1 may not compete with HPV protein E7 for the same

binding site in RB, endorsing the binding of E7 to this cell cycle regulator, with

consequent release of the transcriptional factors E2F and inducing the expression

of genes required for cellular and viral synthesis.

Our results suggest that women carrying the CCND1 GG genotype have increased

risk for the development of cervical lesions (aOR=4,32 for HSIL and aOR=3.26

for ICC) and are consistent with previous findings suggesting that CCND1 GG

genotype is associated with cancer development. Matthias and colleagues [27, 52]

reported that CCND1 GG genotype was associated with poorly differentiated

tumors of head and neck and reduced disease-free interval in laryngeal and

pharyngeal carcinomas, independently from tumor differentiation, providing a

link between CCND1 A870G alleles with CCND1 expression and clinical

outcome in SCCHN (Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck). A recent

report [51] found a significant trend between a reduction in the proportion of

CCND1-expressing cells within the tumors of patients with CCND1 GG. Another

recent published study reported a correlation between GG genotype and increased

susceptibility for laryngeal tumor development [53]. However, controversial

results have been reported regarding the role of CCND1 genotypes in cancer

development [26,28,29,30,32]. The mechanism for this association is unknown,

although because the G allele splices less of transcript b than the A allele,


individuals with CCND1 GG may have different cellular levels of CCND1 to

subjects with CCND1 AA.

Furthermore, these results suggest that the effect of genotype on tumor behaviour

may exhibit some degree of tissue specificity [27]. It is possible that these

conflicting results in part reflect the many different mechanisms through which

deregulated expression of CCND1 can occur in cancer.

The contribution of genetic polymorphisms to the risk for cervical cancer may be

dependent on the studied population, as well as on several environmental and

other factors that influence that population. Geographical or ethnic differences

have been reported regarding the genotype frequency of several polymorphisms.

Our results within the Portuguese population are consistent with a recently

published study in our population [53].

To the best of our knowledge, this is the first study that demonstrates an

association between A870G CCND1 polymorphism and risk for cervical cancer.

Our results suggest that A870G CCND1 polymorphism could act as a cofactor of

HPV in induction and initiation of cervical carcinogenesis, particularly in the

transformation zone of HPV infected women, supporting evidence for a genetic

factor on ICC risk.

Further studies may include the analysis of other genetic polymorphisms

(CYP2E1, GST, ecNOS, ARStuI, VDR) that have been already associated with

cancer risk [54-58] in order to characterize the genetic profile of cervical cancer

susceptibility. Moreover, in order to assess the gene-viral interaction, additional

studies should include an ideal control group of HPV positive women without

cervical cancer to a more accurate adjustment for this association.


The determination of a genetic profile may help to explain the observation that not

all high-risk HPV-infected SIL lesions will progress to invasive carcinomas.

Larger scale molecular studies are needed to confirm the role of A870G

polymorphism of CCND1 in cervical cancer. These results can lead to a better

understanding of cyclin D1 influence in cancer, the biological mechanisms of

cervical cancer and in the definition of a genetic profile for this disease.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the Liga Portuguesa Contra o Cancro (Portuguese League

against Cancer) – Centro Regional do Norte for their support.

We gratefully acknowledge funding of this work by the Ministry of Health of

Portugal (CFICS – 206/2001).

The current affiliation of Ana Matos is Júlio Dinis Maternity.


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Table 1 Prevalence and odds ratios (OR) of CCND1 genotypes and alleles among control group and patients with cervical lesions (HSIL and ICC)

Patients (n=143)

Controls (n=103)

n % n % OR 95% CI P

Alleles* A 152 53.1 133 64.6 1.00 reference G 134 46.9 73 35.4 1.61 1.09-2.36 0.011 Genotype AA 44 30.8 39 37.9 1.00 reference AG 64 44.7 55 53.4 1.03 0.59-1.81 1.000 GG 35 24.5 9 8.7 3.45 1.47-7.56 0.004 Recessive model

AA/AG 108 75.5 94 91.3 1.00 reference GG 35 24.5 9 8.7 3.48** 1.57-7.70** 0.0021** Age <46 years AA/AG 52 76.5 28 93.3 1.00 reference GG 16 23.5 2 6.7 4.31 0.92-20.10 0.052 ≥46 years AA/AG 56 74.7 66 90.4 1.00 reference GG 19 25.3 7 9.6 3.20 1.25-8.16 0.017

* Total allele number in the case group=286 and control group=206. **P, OR and 95% CI using logistic regression analysis adjusting for age.


Table 2 Distribution of CCND1 genotypes among case and control groups and histological stage of ICC

CCND1 genotype

N (frequency)

AA/AG GG

OR 95% CI P

Cases

Controls (n=103) 94 (91.3) 9 (8.7) 1.00 reference

HSIL (n=50) 37 (74.0) 13 (26.0) 4.32* 1.50-12.46* 0.0067*

ICC (n=93) 71 (76.3) 22 (23.7) 3.26* 1.42-7.53* 0.006*

FIGO staging

<IIb 3 (16.7) 15 (83.3) 1.00 reference

≥IIb 7 (26.9) 19 (73.1) 0.543 0.12-2.46 0.49 *P, OR and 95% CI using logistic regression analysis adjusting for age.


Figure 1. Analysis of the CCND1 genotypes – Restriction Fragment Length Polymorphism of the PCR products. M – 100 bp ladder; cases 1, 3 and 7 – CCND1 heterozygous (G/A); cases 2, 4 and 5 – homozygous GG; case 6 and 8 – homozygous AA.


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POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA EM NEOPLASIAS …portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67;