POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA ... - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp104071.pdf · Milhares de livros grátis para download. POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES

DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS

ATIVADOS POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS DE

TEMPO

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POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES DA MATRIZ

(MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS ATIVADOS POR DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS

PERÍODOS DE TEMPO

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São

José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE,

pelo Programa de Pós-graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área

Microbiologia / Imunologia.

Orientador: Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge

Co-orientador: Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira

São José dos Campos 2009

Apresentação gráfica e normalização de acordo com: Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008.

V618a Vilela, Polyana das Graças Figueiredo.

Avaliação da liberação de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) por macrófagos ativados por diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) em variados períodos de tempo / Polyana das Graças Figueiredo Vilela. __ São José dos Campos : [s.n.], 2009.

74.f. : il. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,Universidade Estadual Paulista, 2009.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge 1. Metaloproteinases da Matriz. 2. Endotoxinas. 3. Macrófagos. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título

tD24

Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP

AUTORIZAÇÃO

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.

São José dos Campos, 20 de Agosto de 2009 . Assinatura : E-mail: [email protected]

BANCA EXAMINADORA

Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador)

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos

Universidade Estadual Paulista – UNESP

Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos

Universidade Estadual Paulista – UNESP

Profa. Dra. Mariella Vieira Pereira Leão

Instituto Básico de Biociências

Universidade de Taubaté - UNITAU

São José dos Campos, 23 de Julho de 2009.

DEDICATÓRIA

A meu pai e minha mãe do céu, por abençoarem cada dia de

minha vida.

Aos meus amados pais, Dércio Afonso Maria Vilela e Celma

Figueiredo Vilela. Vocês são meus maiores exemplos de dignidade,

bom caráter, perseverança, responsabilidade, sabedoria, força e

humildade. Obrigada por tudo que fazem por mim. Minha família é

o maior presente que Deus me deu.

À minha amada irmã Luciana Figueiredo Vilela, por ser

minha eterna e grande amiga. Por estar sempre ao meu lado, me

dando um pouco de sua força e sabedoria.

Aos meus queridos sobrinhos Álvaro, João Pedro e Luís

Henrique e ao meu afilhado Luan, por nos darem o prazer e a

alegria da convivência.

Ao Eder, por seu amor, seu companheirismo, sua paciência

e por todos os momentos simples e felizes que tivemos. Sua

presença neste momento foi muito importante.

A todos de minha grande e maravilhosa família, que mesmo

longe estão presentes em minha vida.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do

diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj.

José Roberto Rodrigues e do vice-diretor Prof. Dr. Carlos Augusto

Pavanelli.

Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na coordenação

da Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito e Profa. Adj. Rosilene Fernandes

da Rocha.

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal.

Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima

Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria

Aparecida Consíglio de Souza, pelos auxílios prestados.

À Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pela

concessão da bolsa de mestrado (Processo 2007/57552-4) e do Auxílio à

Pesquisa (Processo 2008/55780-2) que possibilitaram a realização deste

trabalho.

Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, pelo conhecimento

compartilhado, pelo apoio, pela confiança e por suas sábias

considerações. Seu senso de justiça, equilíbrio, sabedoria e ponderação

são marcantes e admiráveis.

À Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira. Agradeço especialmente e muito

carinhosamente por sua amizade, compreensão, paciência, preocupação,

dedicação, por suas orações, seu carinho, seus ensinamentos científicos

e pessoais e pelo apoio de sempre.

À Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito. Muito obrigada por sua amizade,

seu apoio, ensinamento, carinho, preocupação e disposição em todos os

momentos, principalmente nos mais difíceis.

À Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira, pelo convívio fraterno e pelos

ensinamentos compartilhados.

À minha querida amiga Emanuele Gonçalves Brito, que muito me ajudou

e ensinou neste ano. Muito brigada por tudo que fez por mim.

Aos amigos da Pós-graduação, Rogério de Lima Romeiro, Pietro

Mainenti, Joyce da Silva Martins, Bruno Mello de Matos, Alessandra

Sverberi Carvalho, Marta Majewski, Rosilene Batista de Aguiar Almeida,

Flávio Pires Molina, Ana Carolina Salvia, Daniel Freitas Alves Pereira, Ana

Paula de Lima, Karina Bortolin Lodi e Mary Anne Moreira Bárbara pelo

convívio fraterno e pelas parcerias, em especial agradeço Cristiane

Aparecida Pereira, Fernanda Lourenção Brighenti, Graziella Nuremberg

Back Brito, Simone Vilela e Guilherme Rodrigues Teodoro, que me deram

apoio em todos os momentos. Muito obrigada pelo carinho, pela amizade

e preocupação nos momentos difíceis.

Ao Sérgio Giovanny Alves, Domingos Gonçalves Pontes e Ana Paula

Simão Correa Matos, pela convivência e por tudo que fazem por nós da

Pós-graduação.

A Sílvia Scarpel e Carlos Guedes, pelos auxílios prestados.

Ao Prof. Dr. Josemar Parreira Guimarães, por apoiar e incentivar meu

crescimento na área acadêmica e de pesquisa.

A toda equipe do COAT, em especial Prof. Wagner de Oliveira, Profa.

Marta Rampani, pelo apoio e pela convivência enriquecedora e agradável.

Aos amigos José Márcio Nacur de Almeida e Aldo Ivan Pereira Paiva e às

amigas Patrícia Almeida Grunewald, Aneíse Gomes de Moura, Liliam

Gazolla, Ana Carolina Nogueira, Patrícia Reis, Luciana Caetano, Michele

Cardoso, Ana Paula Ferreira, Isabela Oliveira, Gleyce Oliveira Silva, que

mesmo longe ou perto sempre me deram apoio. À Lívia Maria Serpa

Gregorio, Lo Ruana Pereira de Freitas e Lígia Tiaki Yamamoto, pela

convivência fraterna.

“Tão misericordioso é Deus, que nos dá oportunidade de corrigir erros,

começar de novo, fazer o dia de hoje melhor que o dia de ontem.”

R. O. Dantas

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................... 10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................. 11

1 INTRODUÇÃO.......................................................................... 12

2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................... 17

2.1 Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e

periapicais.................................................................................

17

2.2 Envolvimento das metaloproteinases da matriz (MMP) nas

alterações pulpares e periapicais.............................................

20

3 PROPOSIÇÃO.......................................................................... 31

4 MATERIAL E MÉTODO............................................................ 32

4.1 Cultura celular........................................................................... 32

4.2 Diferenciação celular................................................................ 33

4.3 Viabilidade da cultura de células.............................................. 35

4.4 Endotoxinas (LPS).................................................................... 36

4.5 Ativação celular pela endotoxina (LPS).................................... 37

4.6 Análise da liberação de metaloproteinases da matriz

extracelular (MMP-3 e MMP-8) pelos monócitos/macrófagos

(U937).......................................................................................

38

5 RESULTADOS.......................................................................... 41

5.1 Produção de MMP-3................................................................. 41

5.2 Produção de MMP-8................................................................. 46

6 DISCUSSÃO............................................................................. 52

6.1 Da metodologia......................................................................... 52

6.2 Dos resultados.......................................................................... 55

7 CONCLUSÃO........................................................................... 62

8 REFERÊNCIAS........................................................................ 63

ANEXO ............................................................................................. 73

ABSTRACT........................................................................................ 74

Vilela PGF. Avaliação da liberação de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) por macrófagos ativados por diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) em variados períodos de tempo [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2009.

RESUMO

A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP-3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p<0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados.

Palavras-chave: metaloproteinases da matriz; endotoxinas; macrófagos.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMPc = Adenosina Monofosfato Cíclico

CMT = Tetraciclina Quimicamente Modificada

COX = Cicloxigenase

cPLA2 = Fosfolipase A2 citosólica

DO = Densidade Óptica

ELISA = Ensaio Imunossorbente Ligado à Enzima

EU = Unidade de Endotoxina

FGF = Fator de Crescimento para Fibroblatos

IL = Interleucina

ICAM 1 = Molécula de Adesão Intercelular-1

LPS = Lipopolissacarídeo

MEC = Matriz Extracelular

MMP = Metaloproteinase da Matriz

MT-MMP = Metaloproteinase ligada à Membrana Plasmática

NO = Óxido Nítrico

(O2-) = Superóxido

PDGF = Fator de Crescimento Plaquetário

PGE2 = Prostaglandina E2

PMA = Phorbol-12-myristate-13-acetate

PMN = Polimorfonuclear Neutrófilo

RNAm = Ácido Ribonucléico mensageiro

TIMP = Inibidor de Metaloproteinase Tecidual

TNF = Fator de Necrose Tumoral

TGF = Fator de Crescimento e Transformação

VCAM 1 = Molécula de Adesão Celular Vascular-1

1 INTRODUÇÃO

Microrganismos e seus produtos são os principais

responsáveis pela indução e manutenção das alterações pulpares e

periapicais, promovendo reação inflamatória e reabsorção óssea

periapical (Hong et al., 2004). A inflamação pulpar geralmente é causada

por uma extensão da cárie dentária, permitindo que as células da polpa

entrem em contato com bactérias ou seus produtos, o que pode resultar

em pulpite (Hahn; Liewehr, 2007; Lee et al., 2008). Em dentes com

necrose pulpar e periodontite apical, a infecção é causada por

combinações específicas de bactérias anaeróbias facultativas e estritas,

principalmente Gram-negativas (Sundqvist et al., 1989).

O principal fator de virulência das bactérias Gram-

negativas é representado pela liberação de endotoxinas, que são

complexos lipopolissacarídicos presentes na membrana externa da

parede celular bacteriana (Petsch; Anspach, 2000). O acúmulo destes

componentes bacterianos na polpa dentária ou na região periapical pode

estimular macrófagos presentes na área a produzirem citocinas. A

secreção de citocinas pode estimular as células da polpa a produzirem

enzimas que degradam a matriz extracelular (Panagakos et al., 1996).

Desta forma, as bactérias Gram-negativas têm papel central na

inflamação pulpar e periapical (Lee et al., 2008).

Durante a inflamação periapical, as células residentes do

tecido periapical liberam vários mediadores inflamatórios, citocinas pró-

inflamatórias e fatores de crescimento por meio de resposta imune inata e

adaptativa (Lin et al., 2007; Carneiro et al., 2009). Citocinas como IL-1 e

TNF- são potentes estimuladores da reabsorção óssea. Um dos

mecanismos pelos quais estas citocinas induzem reabsorção é por meio

13

da estimulação da produção e secreção de metaloproteinases da matriz

(MMP) pelas células presentes no local da inflamação (O’Boskey;

Panagakos, 1998).

Em 1997, Wang et al. demonstraram em modelo

experimental de reabsorção óssea em ratos, que IL-1 e TNF- são

importantes mediadores da reabsorção óssea na patogênese da lesão.

Entretanto, existe pouca informação sobre o efeito das citocinas e do LPS

na produção de MMP por células da polpa in vitro (Panagakos et al.,

1996) e o mecanismo patológico preciso, envolvido na lesão periapical,

ainda não está totalmente esclarecido (Takahashi, 1998).

Estudos relataram que a inoculação de LPS no interior dos

canais radiculares de cães produziu reação inflamatória e reabsorção

óssea periapical (Nelson-Filho et al., 2002; Silva et al., 2002),

demonstrando a correlação positiva entre endotoxinas e presença de

lesões periapicais (Sundqvist, 1992).

Hong et al. (2004) sugeriram que a presença de

endotoxinas em canais radiculares infectados estimula macrófagos a

liberar IL-1 e TNF-, as quais induzem a síntese de metaloproteinase da

matriz (MMP-1) e, conseqüentemente, reabsorção óssea periapical. De

acordo com os autores, IL-1 e TNF- apresentam papel significante na

patogênese das alterações pulpares e periapicais. Os autores verificaram

ainda, em modelo experimental de lesão periapical em ratos, que a

administração de polimixina B (antibiótico catiônico com potente atividade

sobre LPS) reduziu a extensão das lesões em 76% a 80% e,

simultaneamente, reduziu o número de macrófagos produtores de MMP-1.

As metaloproteinases da matriz são uma família de

enzimas estruturalmente relacionadas, mas geneticamente distintas, que

degradam componentes da matriz extracelular (Sorsa et al., 2004) e estão

envolvidas com a remodelação fisiológica e patológica do tecido (Krane,

1994; Lin et al., 2001). Este grupo de 23 enzimas humanas é classificado

em colagenases (MMP-1, 8 e 13), gelatinases (MMP-2 e 9),

14

estromelisinas (MMP-3, 7, 10, 11 e 12) , enamelisina (MMP-20) e MMPs

ligadas à membrana plasmática (MT-MMP), entre outras (Llano et al.,

1997; Tjäderhane et al., 2001). O conhecimento detalhado das MMP é

importante para o entendimento da patogênese da inflamação pulpar e

periapical (Tsai et al., 2005).

As MMP são produzidas por diversos tipos de células

incluindo neutrófilos, fibroblastos e macrófagos (Kumar et al., 2005) e sua

atividade é controlada por alterações no delicado balanço entre a

expressão e síntese das MMP e seus principais inibidores endógenos

(Sorsa et al., 2004). A produção das MMP e dos inibidores de

metaloproteinases teciduais (TIMP) pelas células é regulado por muitas

citocinas, fatores de crescimento e hormônios. O desequilíbrio entre MMP

e TIMP pode influenciar o processo de destruição tecidual (Takahashi,

1998).

Assim como em outros tecidos com inflamação, as MMP

estão presentes no tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais

(Wahlgren et al., 2002). Entretanto, os dados sobre a presença e função

das MMP nos tecidos dentários são limitados (Tjäderhane et al., 2001).

De acordo com Takahashi (1998), são necessários mais estudos para

determinar o mecanismo regulatório de MMP e TIMP nas lesões

periapicais. Em 2001, Lin et al. sugeriram que a expressão gênica de

MMP-1 e TIMP-1, estimulada por citocinas em fibroblastos da polpa, é

mediada, em parte, por uma via dependente de prostaglandina. Outros

autores têm demonstrado que a prostaglandina E2 (PGE2) tem sido

relatada como sinérgica ou antagônica com IL-1 ou TNF- na modulação

da expressão de MMP-1 e TIMP-1, dependendo do tipo de célula

(Takahashi et al., 1997; Zhang et al., 1998).

Lin et al. (2002) relataram que macrófagos e osteoblastos

estão envolvidos no desenvolvimento de lesões periapicais e que

promovem reabsorção óssea pela produção de MMP-1, IL-6 e

cicloxigenase-2 (COX-2). Em 2003, Lin et al. relataram que a participação

15

de diferentes citocinas em estimular a secreção de MMP envolvidas nas

alterações da polpa e periápice ainda não está bem esclarecida.

Shin et al. (2002) detectaram MMP-1, MMP-2 e MMP-3 em

tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais, sugerindo que as MMP

têm importante papel na inflamação pulpar e periapical, especialmente em

pulpites sintomáticas, o que poderia estar relacionado com o aumento do

nível de prostaglandina E2 (PGE2) nestas situações. No entanto, esta

interação entre MMP e prostaglandina em macrófagos deve ser melhor

estudada.

As células do infiltrado inflamatório são as principais

produtoras de MMP, e o efeito parácrino e autócrino do repertório de

citocinas destas células inflamatórias é, provavelmente, o que causa o

desequilíbrio na proporção entre MMP e TIMP, levando, por fim, à

alteração da arquitetura da matriz extracelular (Kim et al., 2006).

Em 2007, Bodet et al. avaliaram a produção de MMP e de

seus inibidores (TIMP) por fibroblastos gengivais estimulados por LPS de

Actinobacillus actinomycetemcomitans e verificaram que LPS pode

estimular a produção de MMP-2, MMP-3 e TIMP-1 e a atividade das

MMP. É provável também que o aumento da expressão de TIMP não

compense o aumento da expressão de MMP, causando um desequilíbrio

na relação MMP/TIMP, o que pode contribuir para destruição do tecido

conjuntivo periodontal.

LPS é um potente ativador de monócitos/macrófagos e

pode, portanto, induzir a produção de diversos mediadores e citocinas

(Tanabe; Grenier, 2008) como TNF-, IL-1β, PGE2 (Bodet et al., 2006;

Lee et al., 2007) e IL-1α (Hong et al., 2004), além de possuir importante

papel na maturação de células progenitoras de osteoclastos e na perda

óssea (Islam et al., 2007). No entanto, o real papel do LPS na indução e

manutenção da reabsorção óssea periapical ainda não está totalmente

esclarecido, de modo que sua participação na liberação de citocinas e,

conseqüentemente, de diferentes metaloproteinases da matriz

16

extracelular poderia esclarecer melhor os efeitos do LPS na patogênese

das alterações pulpares e periapicais e os principais fatores envolvidos

neste processo.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e

periapicais

A partir da década de 80, os avanços tecnológicos na

cultura e identificação microbiológica demonstraram que, em canais

radiculares de dentes com necrose pulpar e lesão periapical crônica,

predominavam microrganismos anaeróbios, principalmente Gram-

negativos (Leonardo et al., 2004). Quando a polpa dentária é exposta à

cavidade bucal, ocorre contaminação inicial, predominantemente, de

microrganismos aeróbios e facultativos. À medida que o processo

infeccioso progride, o decréscimo de oxigênio e o desenvolvimento de um

baixo potencial de óxido-redução favorecem a mudança desta microbiota

que passa a ser, predominantemente, de microrganismos anaeróbios

(Sundqvist; Sweden, 1994). Tani-Ishii et al., em 1994, verificaram que na

fase ativa de destruição óssea periapical e expansão das lesões em ratos,

havia predomínio de bactérias anaeróbias estritas Gram-negativas.

Os microrganismos Gram-negativos, além de possuírem

diferentes fatores de virulência e gerarem produtos e subprodutos tóxicos

aos tecidos apicais e periapicais, contêm lipopolissacarídeo (LPS) na

membrana externa de sua parede celular. O LPS, que tem atividade de

endotoxina, é liberado quando há multiplicação ou morte bacteriana,

desencadeando uma série de efeitos biológicos, que levam a uma reação

inflamatória e à reabsorção dos tecidos mineralizados (Nelson-Filho et al.,

2002; Leonardo et al., 2004), desempenhando importante papel na

indução e manutenção das lesões periapicais (Jiang et al., 2006).

18

Segundo Takahashi (1998), os possíveis mecanismos

patológicos da lesão periapical precisam ser discutidos, uma vez que, o

mecanismo preciso envolvido nesta lesão ainda não está totalmente

esclarecido. Existem poucos estudos que avaliaram, isoladamente, o

efeito do LPS no tecido apical e periapical (Silva et al., 2002) e a relação

entre LPS e o desenvolvimento de lesão periapical com concomitante

reabsorção óssea, permanece controversa (Hong et al., 2004).

Lee et al. (2008) examinaram o papel do LPS de E. coli na

reação inflamatória em células da polpa dentária humana, para tanto,

avaliaram a capacidade do mesmo induzir a expressão da molécula de

adesão intercelular-1 (ICAM-1) e molécula de adesão celular vascular-1

(VCAM-1). Estas moléculas são expressas no tecido pulpar em resposta

ao estímulo inflamatório e contribui para o recrutamento e migração das

células inflamatórias. A expressão destas moléculas pelas células

aumentaram, significativamente, de acordo com a dose e o tempo de

tratamento com LPS. Com base neste resultado, os autores propuseram

que LPS purificado de E. coli é um potente indutor da inflamação pulpar.

Estudos, realizando inoculação de LPS nos canais

radiculares de cães, mostraram que, após 30 dias, a endotoxina presente

nos canais induziu área de lesão periapical com extensa reabsorção

óssea visível radiograficamente (Nelson-Filho et al., 2002) e um intenso

infiltrado inflamatório, com predomínio de neutrófilos e macrófagos (Silva

et al., 2002).

Durante o desenvolvimento da lesão periapical, que resulta

da interação entre a resposta imune e a infecção microbiana (Lee et al.,

2007), os macrófagos são as principais células responsáveis pela

destruição tecidual e pela produção de vários mediadores pró-

inflamatórios, como IL-1β e TNF-α, que são citocinas importantes na

regulação da reabsorção óssea na região periapical (Stashenko et al.,

1998; Lee et al., 2007). Wang et al. (1997) demonstraram, em modelos

experimentais em ratos, o envolvimento de IL-1α e TNF-α no

19

desenvolvimento de lesão periapical com concomitante reabsorção óssea.

Pita et al. (2009), demonstraram que a aplicação de LPS de E. coli na

polpa dentária de ratos, induziu reação inflamatória, com produção de

PGE2 e MMP-3 associadas com a alta atividade de óxido nítrico e

sugeriram que NO induz a expressão de COX-2 e que a PGE2 produzida

pela COX-2, induz a produção de MMP-3.

As endotoxinas, quando presentes, ligam-se ao receptor

CD14 na superfície de monócitos e macrófagos, e estas células ativadas

secretam interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8), fator de necrose tumoral- (TNF-

), superóxido (O2-), óxido nítrico, interferons , e , e moléculas

lipídicas como o fator ativador de plaquetas e as prostaglandinas, entre

outros (Janeway et al., 2002). Assim, diversos estudos têm sugerido que

as endotoxinas representam um dos principais fatores etiológicos

envolvidos na patogênese da inflamação pulpar e periapical (Barthel et

al., 1997; Nelson-Filho et al., 2002; Silva et al., 2002; Tanomaru et al.,

2003; Hong et al., 2004; Silva et al., 2004).

O acúmulo de LPS na área infectada pode estimular a

liberação de citocinas pró-inflamatórias de neutrófilos ou

monócitos/macrófagos (Wilson et al., 1996; Lin et al., 2001). Citocinas

como IL-1 e TNF- podem iniciar e, conseqüentemente, aumentar a

resposta inflamatória levando à destruição tecidual (Unemori et al., 1994;

Lin et al., 2001) desempenhando importante papel na degradação da

matriz extracelular durante a inflamação pulpar e periapical (Wisithphrom;

Windsor, 2006). Segundo Lin et al. (2001), as reações que levam à

destruição tecidual da polpa e periápice após a indução de IL-1 e TNF-

ainda não estão totalmente esclarecidas, mas acredita-se, que a possível

degradação da matriz extracelular, que ocorre durante a pulpite, resulte

da excessiva produção de MMP, determinada pelas citocinas pró-

inflamatórias. Desta forma, a secreção de MMP pode ter uma correlação

com o nível de citocinas e endotoxinas presentes na lesão pulpar e

periapical (Salo et al., 1991; Shin et al., 2002). Assim, o conhecimento

20

detalhado das MMP pode ser importante para o entendimento da

patogênese da inflamação pulpar, uma vez que o mecanismo preciso

desta patogênese ainda precisa ser elucidado (Tsai et al., 2005).

2.2 Envolvimento das metaloproteinases da matriz (MMP) nas

alterações pulpares e periapicais

A lesão periapical geralmente é uma resposta à chegada

de microrganismos pelo canal radicular (Itoh et al., 2009), consistindo em

inflamação periapical com destruição do ligamento periodontal e

reabsorção do osso alveolar e da raiz (de Paz, 2007; Morimoto et al.,

2008).

O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo denso,

localizado entre o cemento e o osso alveolar, suportando o dente. A

destruição do ligamento periapical é inicializada pela degradação da

matriz extracelular (MEC), que é composta principalmente por fibras

colágenas e elásticas, incluindo fibras oxitalânicas e fibras contendo

elastina (Kielty et al., 2005; Morimoto et al., 2008).

A matriz extracelular (MEC) do tecido pulpar é composta

primariamente por colágeno tipo I e II (van Amerongen et al., 1983; Lin et

al., 2001), sendo o tipo I mais abundante na matriz orgânica da dentina

(Tjäderhane et al., 2001; Sulkala et al., 2007). A degradação do colágeno

apresenta importante papel na destruição pulpar durante a pulpite

(Takahashi, 1998; Lin et al., 2001). No processo de periodontite apical, o

colágeno é a principal proteína destruída, resultando na destruição das

fibras colágenas e na reabsorção óssea (Takahashi, 1998). Uma vez

gerados, os fragmentos de colágeno ativam os osteoclastos para a

reabsorção óssea; desta forma, acredita-se que as MMP sejam essenciais

para o início da reabsorção óssea (Holliday et al., 1997), o que poderia

21

explicar o fato da reabsorção óssea ser altamente sensível a citocinas

como IL-1 e TNF- (Birkedal-Hansen, 1993). Como as MMP são as

principais enzimas responsáveis pela degradação da MEC (Takahashi,

1998; Massova et al.,1998), sugere-se que as mesmas apresentam

importância em condições inflamatórias, como nas alterações pulpares e

periapicais (Wahlgren et al., 2002; Shin et al., 2002), mas o mecanismo

molecular envolvendo as MMP nestes processos ainda não é

completamente conhecido (Carneiro et al., 2009).

As metaloproteinases da matriz são uma família de

endopeptidases que inclui mais de 20 membros classificados de acordo

com a especificidade ao substrato e estrutura molecular, em: a)

colagenases (MMP-1, 8 e 13), que atuam em colágeno fibrilar dos tipo I, II

e III; b) gelatinases (MMP-2 e 9), que degradam o colágeno amorfo, bem

como a fibronectina; c) estromelisinas (MMP-3, 7, 10, 11 e 12), que atuam

numa variedade de componentes da matriz extracelular, incluindo

proteoglicanas, laminina, fibronectina e colágenos amorfos; d)

enamelisina (MMP-20), que degrada enamelina; f) MMPs ligadas à

membrana plasmática (MT-MMP) (MMP-14, 15, 16 e 17), entre outras

(Llano et al., 1997; Tjäderhane et al., 2001).

Diversos tipos de células (fibroblastos, macrófagos,

neutrófilos, células sinoviais e algumas células epiteliais) produzem as

MMP (Birkedal-Hansen, 1993; Kumar et al., 2005) e sua liberação é

induzida por estímulos, incluindo fatores de crescimento (PDGF, FGF),

citocinas (IL-1, TNF) e estresse físico. São inibidas por TGF-, esteróides

e inibidores de proteases, como os inibidores de metaloproteinases

teciduais (TIMP) (Kumar et al., 2005). O desequilíbrio entre MMP e seus

inibidores (TIMP) pode influenciar o processo de destruição tecidual, de

modo que o mecanismo regulatório entre MMP e TIMP nas lesões

periapicais precisa ser mais estudado (Takahashi, 1998; Lin et al., 2002;

Wahlgren et al., 2002).

22

As MMP estão envolvidas em processos fisiológicos,

incluindo remodelamento, reparação e desenvolvimento tecidual

(Massova et al., 1998; Uitto et al., 2003; Sorsa et al., 2004). Em tecidos

adultos, a expressão e a atividade das MMP são normalmente baixas,

mas aumentam significativamente em várias condições patológicas que

podem levar à destruição tecidual, como doenças inflamatórias e

neoplasias, assim como em doenças bucais como câncer e cárie (Sorsa

et al., 2004). Podem atuar também na aterogênese, onde as MMP

produzidas pelos macrófagos podem ser responsáveis pela ruptura da

placa aterosclerótica (Hua et al., 2009). Como o papel das MMP na

degradação tecidual tem se tornado evidente em muitas doenças,

tentativas de controlar suas atividades por meios farmacológicos têm

ganhado muita atenção (Sorsa et al., 2004). Em 2009, Hua et al.

demonstraram que a aspirina pode inibir a expressão de MMP-2 e MMP-9

assim como pode potencializar a sua inibição pela indução da expressão

de TIMP-1 e TIMP-2, resultado este que sugere um novo efeito

farmacológico protetor da aspirina quanto à ruptura da placa

aterosclerótica. No entanto, o exato papel das MMP nestas várias

doenças ainda não está totalmente esclarecido (Uitto et al., 2003; Sorsa

et al., 2004).

Em 1996, Panagakos et al. utilizando células da polpa

dentária humana e células de ratos, avaliaram, in vitro, o papel do LPS e

de citocinas inflamatórias na síntese e secreção de MMP. Os autores

observaram que, em uma cultura de curto período (24 a 48h), não houve

alteração no padrão e na quantidade de MMP determinada pelas células

humanas e que as células de ratos secretaram maior quantidade de MMP

após tratamento com IL-1 β e TNF-α. Em 1998, O’Boskey e Panagakos

avaliaram o efeito de citocinas na produção e secreção de MMP por

células da polpa dental humana, mas em culturas de longo-período (2 a

16 dias). Os autores observaram que houve aumento da produção de

MMP-2 e MMP-9 a partir do nono dia, sugerindo que as citocinas

23

desempenham um papel crítico na patogênese da inflamação pulpar e

que, durante a fase crônica desta inflamação, o aumento dos níveis das

citocinas potencializam as células pulpares quanto à secreção de MMP.

Existem indícios da ação das MMP na organização da

matriz dentinária e na regulação da mineralização, mas os dados da

presença e das funções das MMP nos tecidos dentários são limitados

(Tjäderhane et al., 2001). A presença das formas pró e ativa da MMP-8,

MMP-2 e MMP-9 foi demonstrada em lesões de cárie dentária humana. A

presença da forma ativa serve como indicativo da atividade das MMP

durante a degradação da matriz na dentina (Tjäderhane et al., 1998).

Segundo Itoh et al. (2009), a lesão periapical, que é uma resposta à

chegada de microrganismos do canal radicular e que está relacionada à

destruição da MEC, pode estar associada à ativação de

metaloproteinases da matriz como MMP-1, MMP-2 e MMP-9. Estes

autores demonstraram que Prevotella nigrescens, que têm sido isoladas

de canal radicular e associadas com lesão periradicular, são capazes de

ativar as formas proMMP-2 e proMMP-9 in vivo e esta ativação pode estar

relacionada à destruição do tecido periapical. Neste mesmo ano, Santos

et al. (2009) investigaram a presença de MMP na dentina radicular por

meio de zimografia e Western blotting. Os autores puderam confirmar a

presença de MMP-2, MMP-8 e MMP-9 na dentina coronária, assim como

demonstrar a sua existência também região radicular do dente.

Wahlgren et al. (2002) detectaram presença significativa

de MMP-8 em tecidos pulpares inflamados e demonstraram que os

macrófagos presentes no local da inflamação podiam expressar MMP-8.

Além disso, o nível de MMP-8 presente no exsudato periapical diminuiu

nos pacientes com sucesso do tratamento endodôntico e manteve-se alto

naqueles em que o processo inflamatório persistiu, indicando que a sua

análise poderia servir para monitorar a atividade inflamatória e como

indicador do sucesso do tratamento. No entanto, são necessários mais

estudos clínicos para que a mensuração de MMP dos canais radiculares,

24

durante o tratamento, seja usada como instrumento para avaliação da

inflamação periapical (Wahlgren et al., 2002), assim como estudos sobre

o mecanismo regulatório entre MMP e TIMP nas lesões periapicais

(Takahashi, 1998). Acredita-se que inibidores de MMP em canais

radiculares e em tecidos periapicais possam oferecer, no futuro, uma nova

perspectiva para o tratamento endodôntico (Wahlgren et al., 2002).

Segundo Ramamurthy et al. (2002), nas últimas décadas,

intensificou-se o interesse no desenvolvimento de inibidores de MMP para

uso terapêutico em diversas doenças. Os autores demonstraram que o

uso de inibidores de MMP reduziu a atividade de MMP e adicionalmente

reduziu a margem de reabsorção óssea em periodontites induzidas em

ratos pela injeção local de LPS.

As metaloproteinases da matriz são tradicionalmente vistas

como enzimas destrutivas em doenças inflamatórias, no entanto, com

base nos resultados do seu estudo, Tjäderhane et al. (2007) propõem

uma nova visão do papel da MMP. Os autores avaliaram o efeito de

inibidores de MMP (tetraciclina quimicamente modificada/CMT-3) na

formação da lesão periapical em modelo experimental de ratos e,

surpreendentemente, encontraram maior área de necrose pulpar e lesão

periapical no grupo de ratos que receberam (CMT-3) do que no grupo

controle (submetido somente à exposição pulpar). De acordo com os

autores, estes resultados podem indicar que as MMP possuem

propriedades anti-infecciosas e/ou anti-inflamatória na patologia pulpar e

periapical. Desta forma, são necessários mais estudos para avaliar se o

efeito anti-infeccioso e/ou anti-inflamatório das MMP é local, específico a

um determinado tecido ou é geral e também verificar se este efeito está

relacionado a uma MMP ou a vários membros da família de MMP.

Utilizando-se ensaio imunoenzimático (ELISA), Shin et al.

(2002) avaliaram o nível e a distribuição de MMP em tecidos pulpares

inflamados e em lesões periapicais. Os autores verificaram que as

concentrações de MMP-1, MMP-2 e MMP-3 foram significativamente

25

maiores nos grupos com pulpite aguda do que no grupo controle

(pacientes com polpa no seu estado normal), sugerindo o importante

papel das MMP na progressão do processo inflamatório pulpar e na

destruição tecidual periapical. Além disso, por análise imunohistoquímica,

MMP-1 e MMP-3 foram localizadas na matriz extracelular ao redor das

células inflamatórias, resultado este sugestivo de que MMP-1 e MMP-3

podem ser secretadas por células inflamatórias como neutrófilos,

macrófagos e linfócitos (Shin et al., 2002) e que há uma fonte multicelular

de MMP nas infecções endodônticas (Tjäderhane et al., 2007). Entretanto,

a regulação da produção de MMP-3 durante a inflamação pulpar ainda é

pouco entendida. Acredita-se que durante o processo inflamatório da

polpa dentária há indução e ativação da síntese de óxido nítrico pelas

células endoteliais, fibroblastos, macrófagos que então catalisam a

síntese de NO. Este, por sua vez, induz a expressão de COX2 causando a

liberação de PGE2. O acúmulo de PGE2 determina a secreção de MMP-3

(Pita et al., 2009).

A técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) adotada no

estudo de Shin et al. (2002) também foi utilizada por Figueredo et al.

(2003) para quantificar MMP-9 do fluido gengival de pacientes com

gengivite e de pacientes com periodontite crônica. Segundo os autores,

esta técnica consegue quantificar a MMP-9 ativa somada a proMMP-9, ou

seja, ela não é capaz de analisar a atividade gelatinolítica total, nem as

frações ativas e latentes separadamente, no entanto, ela é extremamente

sensível. Os resultados deste estudo demostraram que a quantidade de

MMP-9 nos sítios com perda de inserção foi maior do que nos sítios com

inflamação mas sem destruição periodontal, sugerindo que esta enzima

pode estar envolvida na destruição tecidual que ocorre na periodontite.

Além de MMP-8 (Wahlgren et al., 2002), MMP-1 e MMP-3

(Shin et al., 2002), outra metaloproteinase da matriz encontrada em níveis

aumentados em dentes com inflamação pulpar é a MMP-9, indicando que

esta MMP pode estar relacionada com a destruição do tecido pulpar

26

(Gusman et al., 2002). Em 2005, Tsai et al. demonstraram que o tecido

pulpar humano pode expressar MMP-9, uma vez a mesma foi detectada

em odontoblastos, fibroblastos, infiltrados inflamatórios e células

endoteliais. Adicionalmente, o nível de MMP-9 nas polpas com inflamação

foi, significativamente, maior do que nas polpas com aspectos clínicos

saudáveis. Assim, estes autores relataram existir boa evidência para

suspeitar que MMP-9 pode ter um papel importante na patogênese da

inflamação pulpar.

Carneiro et al. (2009) demonstraram que a expressão de

MMP-9 também foi significativamente maior em dentes com periodontite

apical do que naqueles com ligamento periodontal normal, sugerindo que

a MMP-9 pode estar diretamente envolvida na destruição da MEC nestas

lesões e, portanto, pode estar associada ao desenvolvimento e

progressão da lesão periapical. Os resultados deste estudo sugeriram a

participação de várias células inflamatórias na expressão de MMP-9 em

particular macrófagos, sugerindo que estas células são fonte de MMP-9

durante periodontite apical. A presença de macrófagos na periodontite

periapical crônica é crucial devido ao seu papel na reposta protetora,

assim como no desenvolvimento da lesão e na perpetuação da resposta

inflamatória (Márton; Kiss, 2000; Carneiro et al., 2009).

Os macrófagos desempenham importante papel na

regulação do turnover da MEC por meio da secreção de proteases,

incluindo MMP, inibidores de proteases e citocinas, tanto em condições

normais como patológicas (Hong et al. 2000; Shin et al. 2002). Os

macrófagos podem expressar várias MMP, incluindo colagenase I (MMP-

1), gelatinases (MMP-2, MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-7, MMP-

12), colagenase-3 (MMP-13) (Goetzl et al., 1996; Imai et al., 1998) e outra

colagenase (MMP-8) (Wahlgren et al., 2002).

Alguns estudos sugerem que a expressão de MMP por

macrófagos ativados com LPS pode ocorrer por meio de uma via

dependente de PGE2 e AMPc (Wahl; Corcoran, 1993). Em 1998, Zhang et

27

al. foram os primeiros a demonstrar que a produção de MMP-1 por

monócitos pode ser induzida por citocinas e que MMP-1, MMP-9 e TIMP-1

são diferentemente regulados por combinações de citocinas, por de

mecanismos dependentes (MMP-1) e independentes (MMP-9 e TIMP-1)

de prostaglandina (PG). O primeiro mecanismo foi demonstrado pela

inibição da produção de MMP-1 dos monócitos pela indometacina e a

reversão desta inibição com o uso de agentes exógenos, como PGE2, que

eleva o nível intracelular de AMPc. A produção de MMP-9 e TIMP, por sua

vez, não apresentou alteração na presença de indometacina, sugerindo

um mecanismo de regulação de MMP por via independente de PG. Estes

autores (Zhang et al.,1998) relataram ainda que os mecanismos

sinalizados por citocinas e que promovem a produção de MMP parecem

ser, em parte, diferentes para diversos tipos de células.

De acordo com Takahashi et al. (1997), os efeitos de

inibidores de cicloxigenase e de PGE2 na produção de TIMP-1 e MMP-1

também parecem variar de acordo com o tipo de célula estudada.

Utilizando fibroblastos da sinóvia de pacientes com artrite reumatóide, os

autores observaram que IL-1 estimulou a produção de TIMP e pro-MMP,

efeito este que foi aumentado com a utilização de inibidores da

cicloxigenase, entretanto, por outro lado, foi suprimido na presença de

PGE2 exógena, indicando que esta tem efeito negativo na produção de

TIMP-1 e pro-MMP-1 (Takahashi et al.,1997). Lin et al. (2001) relataram

que a expressão gênica de MMP-1 e TIMP-1 induzida por mediadores

como IL-1 α, TNF-α e PGE2 em fibroblastos da polpa dental é, em parte,

mediada por uma via dependente de PGE2. Na presença de IL-1α e TNF-

α houve elevada expressão pelas células de MMP-1 e baixa expressão de

TIMP-1, enquanto PGE2 induziu alta expressão de TIMP-1, mas não teve

o mesmo efeito na MMP-1. Por sua vez, o uso concomitante de PGE2 e

IL-1 α ou TNF-α suprimiu a indução de MMP-1 em comparação ao efeito

destas citocinas utilizadas isoladamente. Por outro lado, o uso de PGE2

aumentou o efeito na expressão de TIMP induzida por estas citocinas, o

28

que sugere um possível efeito protetor da PGE2 à excessiva destruição

tecidual durante a pulpite.

Em modelos experimentais de lesão periapical em ratos,

Lin et al. (2002) detectaram a expressão gênica de MMP-1, TIMP-1, IL-6 e

COX-2, indicando, portanto, o envolvimento destes mediadores no

desenvolvimento da lesão periapical associada à reabsorção óssea. Os

macrófagos foram as principais fontes de MMP-1, IL-6 e COX-2,

principalmente na fase inicial. Estas células se agregaram ao redor da

área de reabsorção óssea e o número de células expressando MMP-1

aumentou consideravelmente à medida que a lesão progredia, implicando

o envolvimento dos macrófagos no desenvolvimento da lesão periapical.

Os autores observaram também uma redução característica da área de

reabsorção óssea e na expressão de MMP-1 e IL-6 após uso de inibidores

da COX-2, sugerindo a importância da COX-2 na patogênese da lesão

periapical pela modulação indireta à expressão de MMP-1 e IL-6. Shin et

al. (2002) relataram, entretanto, que são necessários novos estudos sobre

a relação entre MMP e prostaglandinas em macrófagos.

A hipótese do envolvimento de citocinas como IL-1α, IL-1β

e TNF-α na produção de MMP-1 foi verificada na estudo de Hojo et al.

(2000), no qual anticorpos contra estes mediadores foram colocados em

co-cultura de células endoteliais e monócitos o que resultou numa

significativa inibição da produção de MMP-1 por estas células, quando na

presença de anti-IL-1β e anti-TNF-α.

Para avaliar o papel do LPS em lesões periapicais, Hong

et al. (2004) investigaram in vitro o efeito do LPS na produção de IL-1 α,

TNF-α e MMP-1 por macrófagos de camundongos (J774) e demonstraram

que o LPS induziu a produção destas citocinas e a expressão gênica de

MMP-1, efeito este que foi reduzido, significativamente, com o uso de

anticorpos anti-IL-α e anti-TNF-α. Além disso, o uso de polimixina B,

antibiótico com importante ação sobre endotoxina, reduziu a produção de

MMP-1 e a extensão da lesão associada com a perda óssea na análise, in

29

vivo, dos modelos experimentais de ratos. Desta forma, os autores

sugeriram que o LPS desempenha um importante papel nas lesões

periapicais, onde a reabsorção óssea é induzida pela liberação de

citocinas pró-inflamatórias, que por sua vez modulam a produção de

MMP-1 pelos macrófagos.

Durante o desenvolvimento da lesão periapical, induzida

por exposição pulpar (7, 14, 21, 28 e 42 dias) em modelos experimentais

de ratos, foi avaliada a presença de elastase (macrófago elastase), que é

um membro da família de MMP produzida especificamente por

macrófagos e de neutrófilo elastase, secretada por neutrófilos. A

macrófago elastase, detectada após 7 dias, foi significativamente maior do

que neutrófilo elastase entre 7º e 21º dias, enquanto neutrófilo elastase,

detectada a partir do 14º dia, aumentou gradualmente entre 14º e 28º

dias. Ambas elastases aumentaram durante o desenvolvimento da lesão,

com destruição do osso alveolar. Estes resultados indicam que a atividade

de macrófago elastase aumentou no início destruição do tecido

periradicular e que a atividade de neutrófilo elastase pode estar

relacionada com a expansão da destruição. Uma vez que os macrófagos

foram mais ativos durante o estágio inicial da lesão periradicular, acredita-

se que macrófago elastase possa contribuir para o início da destruição da

MEC do tecido periapical (Morimoto et al., 2008).

Monócitos/macrófagos humanos da linhagem U937,

considerados úteis para estudar o comportamento dos macrófagos (Jiang

et al., 2003; Lee et al., 2007), têm sido utilizados para quantificação, por

ensaio imunoenzimático (ELISA), após ativação por LPS, da produção de

citocinas (Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007;

Tanabe; Grenier, 2008), PGE2 (Tanabe; Grenier, 2008) e de

metaloproteinases da matriz (Maldonado et al., 2004; Bodet et al., 2006;

Grenier; Grignon, 2006; Tanabe; Grenier, 2008). Em 2006, Grenier e

Grignon, utilizando monócitos/macrófagos humanos (U937),

demonstraram que o LPS de Fusobacterium nucleatum induziu

30

significativo aumento da secreção de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, PGE2 e

MMP-9 por estas células. Em 2008, Tanabe e Grenier também

demonstraram significativa indução destes mediadores pelos macrófagos

(U937), após 24 horas de ativação por LPS de A.

actinomycetemcomitans. No entanto, são poucos os estudos na literatura

que avaliaram a relação específica das MMP produzidas por macrófagos

com outros fatores liberados numa infecção endodôntica, como

endotoxinas, citocinas e prostaglandinas.

Assim, torna-se interessante avaliar a relação entre LPS e

a produção de MMP por macrófagos, a fim de verificar o envolvimento do

LPS na produção de MMP, uma vez que as vias de ativação das MMP

nas alterações pulpares e periapicais ainda não estão totalmente

esclarecidas.

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a capacidade de

diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli

induzirem a secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, nos

períodos de 24, 48 e 72 h.

4 MATERIAL E MÉTODO

Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos

Campos (102/2007-PH/CEP – Anexo).

4.1 Cultura celular

Foi utilizada linhagem de monócitos humanos (U937)

obtida do banco de células da Associação Técnico Científica Paul Ehrlich

(APABCAM, Rio de Janeiro, RJ). As células foram mantidas em meio

RPMI-1640 (LGC Biotecnologia, Cotia, SP), enriquecido com 10% de soro

fetal bovino (GIBCO, Invitrogen, NY, USA), em incubadora a 37ºC com

5% de CO2 (Figura 4). O meio de cultura foi trocado (Figura 1) a cada dois

dias, mantendo uma concentração celular entre 1x105 e 2x106

monócitos/mL para garantir ótimo crescimento (Grenier; Grignon, 2006).

Figura 1 – Troca do meio de cultura para manutenção da linhagem celular.

33

4.2 Diferenciação celular

Os monócitos humanos da linhagem (U937) foram

diferenciados em macrófagos aderentes por meio de tratamento com

phorbol-12-myristate 13-acetato (PMA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,

USA) (Figura 2). Para isto 1 x 106 monócitos/mL foram mantidos por 48 h

em meio RPMI-1640, enriquecido com 10% de soro fetal bovino, na

presença de 1 g/mL de PMA (Figura 2). Este tratamento foi realizado

para induzir características de macrófagos maduros (Rovera et al., 1979;

Vogel et al., 2005; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al.,

2007; Tanabe; Grenier, 2008). Em seguida, o meio foi removido por

aspiração e as células foram incubadas novamente em meio RPMI-1640,

enriquecido com 10% de soro fetal bovino, livre de PMA, pelo período de

24 h.

A B

Figura 2 – a) frasco contendo phorbol-12-myristate 13-acetato (PMA; SIGMA- Aldrich); b)

adição de 1g/mL de PMA à cultura celular.

Os macrófagos aderidos foram retirados com uso de cell

scrap (SPL Ciencor Scientific, São Paulo, SP) (Figura 3) e a solução foi

centrifugada (1200 Xg/ 10 min/ 250C) (Figura 4 e Figura 5) e

ressuspendida com meio RPMI-1640 enriquecido com 1% de soro fetal

bovino. Em seguida, foi feita a análise da viabilidade celular.

34

Figura 3 – Uso de cell scrap (SPL Ciencor) para retirada de macrófagos aderidos. A B

Figura 4 - a) incubadora de CO2 (Ultrasafe/Biosystems Ltda); b) centrífuga

microprocessada (MPW/Biosystems Ltda).

Figura 5 – Células aderidas na parede do tubo Falcon após a centrifugação;

35

4.3 Viabilidade da cultura de células

A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de exclusão

utilizando azul de tripan (0,5%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e

contagem das células viáveis em câmara de Neubauer. Para tanto, em

uma alíquota de 50 L da suspensão celular foi adicionado 5 L de azul

de tripan 0,5% (Figura 6). Uma alíquota de 10 L desta mistura foi

colocada na câmara de Neubauer (Figura 6) e visualizada em microscópio

óptico, para realizar a contagem das células viáveis (não coradas).

A B

Figura 6 – a) adição de 5 L do azul de tripan 0,5% à suspensão celular; b) câmara de

Neubauer sendo preenchida com uma alíquota da cultura celular acrescentada de azul de tripan.

Para realização dos testes, foram colocados 1 x 106

células viáveis em cada poço da placa de polistireno (apirogênica) de 24

poços (COSTAR, Corning Incorporated, NY, USA) acrescentado de meio

RPMI-1640 enriquecido com 1% de soro fetal bovino até obter volume

final de 1000 L (Figura 7).

36

Figura 7 – Distribuição de 1 x 106 células viáveis em cada poço da placa de polistireno

(apirogênica) de 24 poços.

4.4 Endotoxinas (LPS)

Foi utilizada neste estudo endotoxina padrão de

Escherichia coli (Cambrex), em diferentes concentrações (0, 5, 10 e 20

EU/mL) (Figura 8).

Figura 8 – Frasco contendo endotoxina padrão de Escherichia coli (Cambrex, MO, USA).

37

4.5 Ativação celular pela endotoxina (LPS)

Após distribuição das células nos poços, estas foram

ativadas com diferentes concentrações de LPS (0, 5, 10 e 20 EU/mL)

(Figura 9). Foram realizadas 30 repetições para cada concentração de

LPS, totalizando 120 amostras. A produção de metaloproteinases da

matriz foi avaliada em três diferentes períodos de tempo após ativação

celular: 24, 48 e 72 h, sendo utilizadas 10 repetições para cada tempo de

avaliação.

Figura 9 – Placa de cultura de 24 poços contendo macrófagos. As células foram ativadas

pela adição de diferentes concentrações de endotoxinas.

38

4.6 Análise da liberação de metaloproteinases da matriz extracelular

(MMP-3 e MMP-8) pelos monócitos/macrófagos (U937)

A produção de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e

MMP-8) foi avaliada por ensaios imunoenzimáticos (ELISA) utilizando os

Kits DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis,

USA) (Figura 10). Assim, microplacas de 96 poços (Nunc) foram

previamente sensibilizadas com anticorpos de captura anti-MMP-3 ou

anti-MMP-8 (R&D Systems). As placas foram mantidas overnight, em

temperatura ambiente e depois foi feita lavagem abundante com PBS

contendo Tween 20. (Figura 11). Após a lavagem, foi feito bloqueio

(Figura 11) com a adição de Reagente Diluente (PBS contendo 1% de

Soro Bovino Albumina–BSA) e a placa foi mantida em temperatura

ambiente por 1 h. Após uma nova lavagem, amostras dos sobrenadantes

de cada poço da cultura de células e os controles da reação (curva-

padrão) foram adicionados e as placas mantidas por 2 h em temperatura

ambiente (Figura 12). Os testes foram realizados em duplicata para cada

amostra. Após lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 foi

acrescentado anticorpo de detecção anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 marcado

com biotina (Figura 12). Após 2 h de incubação, as placas foram

novamente lavadas e foi adicionada estreptoavidina conjugada com

peroxidase (R&D Systems) e foram mantidas por 20 minutos ao abrigo da

luz. Repetiu-se a lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 e a

reação foi revelada (Figura 13) com solução de substrato cromogênico

que contem Reagente A (peróxido de hidrogênio) e Reagente B

(tetrametilbenzidina) (R&D Systems) (Figura 10). A reação foi bloqueada

após os 20 minutos com ácido sulfúrico 2 N (Figura 14). As densidades

ópticas (DO) foram lidas no leitor de microplacas (Biotek) (Figura 15) com

comprimento de onda de 450 nm e os níveis de MMP-3 e MMP-8

presentes nos sobrenadantes das culturas foram determinados. Os

39

resultados foram analisados estatisticamente, pela análise de variância

ANOVA, com nível de significância de 5%, e pelo teste de Tukey.

A B

Figura 10 - Kit e Reagentes utilizados para quantificação de MMP. a) Kit DuoSet® ELISA

Development System (R&D Systems, Minneapolis, USA; b) Reagente A e Reagente B (R&D Systems, Minneapolis, USA).

A B

Figura 11 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático a) lavagem da placa

com PBS contendo Tween 20; b) adição de Reagente Diluente (Bloqueio). A B

Figura 12 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático. a) adição das

amostras e dos controles; b) adição de anticorpo de detecção anti-MMP-3.

40

A B

Figura 13 – Revelação da reação: a) adição da solução de substrato cromogênico que

reage com a peroxidase; b) resultado da reação após 20 minutos.

Figura 14 - Procedimento realizado no ensaio imunoenzimático: bloqueio da reação

anterior com ácido sulfúrico 2 N.

Figura15 - Leitor de microplacas (Biotek) utilizado para realizar as leituras das

densidades ópticas (DO).

5. RESULTADOS

5.1 Produção de MMP-3

Os valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL)

obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por

endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL,

em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas

Tabelas 1 a 4, respectivamente.

Tabela 1 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo

Amostras* 24 h 48 h 72 h

1 63,28 391,92 712,83

2 113,12 239,90 814,36

3 58,36 245,05 711,34

4 77,48 192,09 622,25

5 155,72 189,00 385,58

6 106,36 124,27 895,61

7 328,50 677,14 617,28

8 369,67 797,30 2105,77

9 158,58 291,93 327,18

10 118,75 273,87 339,11

* grupo controle: sem ativação por endotoxina.

42

Tabela 2 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 5 EU/mL, nos diferentes períodos de tempo


1 913,33 1623,23 2629,09

2 879,72 2312,72 2589,09

3 1050,20 1157,65 2008,72

4 759,70 1503,54 2105,00

5 892,18 2521,21 1991,66

6 869,59 1988,33 2045,01

7 1095,62 2532,12 2268,33

8 1322,45 2185,46 2100,03

9 1191,53 2238,77 2126,39

10 1286,06 2119,75 2125,59

* grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxina.

Tabela 3 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 10 EU/mL nos diferentes períodos de tempo


1 2111,71 2151,88 2240,23

2 2160,29 2407,64 2343,36

3 2208,83 2127,78 2248,26

4 2036,61 2309,19 2657,44

5 2200,07 2144,57 2303,76

6 2095,19 2323,09 2503,51

7 2154,07 2126,32 2205,18

8 2452,40 2510,98 2588,54

9 2147,27 2327,90 2406,83

10 2100,89 2363,71 2576,07


43



1 2092,73 2119,75 2174,51

2 2422,19 2514,55 2542,49

3 2515,32 2577,41 2589,83

4 2392,70 2474,19 2402,79

5 2396,58 2447,03 2561,11

6 1491,69 1527,82 1528,86

7 1621,40 1538,76 1624,82

8 1505,68 1555,76 1564,79

9 1449,82 1484,56 1482,80

10 1607,69 1516,43 1617,01


Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se

verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-3 (24, 48 e

72 h), exceto no grupo ativado com endotoxina na concentração 20

EU/mL. Assim, no grupo controle houve aumento significativo da

produção de MMP-3 do tempo 24 ou 48 h para 72 h (p<0,05). No grupo

ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve aumento significativo na

produção de MMP-3 do tempo de 24 h para os tempos de 48 ou 72 h. No

grupo ativado com 10 EU/mL de endotoxinas, no período de 24 h a

produção de MMP-3 foi significativamente inferior ao período de 72 h

(p<0,05). Já no grupo ativado com 20 EU/mL, os valores da produção de

MMP-3 foram similares em todos os períodos avaliados (p>0,05). As

tabelas 5 a 8 demonstram os valores médios ± desvios-padrão da

produção de MMP-3 em cada grupo, em função do tempo, e a formação

de grupos homogêneos.

44

Tabela 5 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)

Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos

24 154,98 108,21 A

48 342,25 221,70 A

72 753,13 514,30 B

Tabela 6 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3

(pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 5 EU/mL


24 1026,00 193,14 A

48 2018,30 453,77 B

72 2198,90 229,53 B




24 2166,70 112,78 A

48 2279,30 134,66 A B

72 2407,30 163,99 B




24 1949,60 452,30 A

48 1975,60 490,33 A

72 2008,90 484,80 A

45

Com relação à concentração de endotoxina utilizada na

ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve

significativo aumento na produção de MMP-3 (p<0,05) após ativação com

diferentes concentrações de endotoxina (5, 10 e 20 EU/mL).

Comparando-se as concentrações de endotoxinas, somente no tempo de

24 h houve diferença significante entre a concentração 5 EU/mL em

relação às concentrações 10 ou 20 EU/mL (p>0,05). Nos períodos de 48 e

72 h, não houve diferença significante entre as concentrações de

endotoxinas utilizadas (p>0,05) na ativação celular. Os valores médios e

desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos

tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 9 a 11.

Tabela 9 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 24 h

Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 154,98 108,21 A

5 1026,00 193,14 B

10 2166,70 112,78 C

20 1949,60 452,30 C


(pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 48 h

Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 342,25 221,70 A

5 2018,30 453,77 B

10 2279,30 134,66 B

20 1975,60 490,33 B

46


Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 753,13 514,30 A

5 2198,90 229,53 B

10 2407,30 163,99 B

20 2008,90 484,80 B

5.2 Produção de MMP-8

Os valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL)

obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por

endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL,

em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas

Tabelas 12 a 15, respectivamente.

47

Tabela 12 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo


1 1893,36 2295,33 2056,14

2 1490,35 1837,69 1999,26

3 1202,75 1568,78 3503,92

4 908,56 1801,75 3680,98

5 1625,70 1826,04 2617,54

6 1088,51 1847,46 2212,66

7 1325,37 2356,83 4029,48

8 1800,76 2735,03 3926,28

9 1436,96 2494,08 3421,77

10 1264,68 1990,22 3202,14

* grupo controle: sem ativação por endotoxina.



1 554,88 797,98 1202,75

2 520,74 981,38 1084,02

3 418,99 1007,29 1068,09

4 754,30 1158,99 984,41

5 710,26 1010,36 1477,66

6 804,86 1313,26 1242,35

7 825,76 921,74 1084,02

8 1334,91 1371,17 1688,79

9 1282,31 1081,07 1693,72

10 1366,14 1445,86 1841,67


48



1 622,91 1490,58 1047,05

2 369,17 1112,95 1171,23

3 907,36 1009,64 1069,04

4 792,59 1148,52 1297,52

5 416,68 1078,48 1048,38

6 691,65 1496,34 1376,12

7 496,07 676,15 582,46

8 867,17 1263,04 1378,82

9 485,77 464,04 513,58

10 953,97 1301,70 548,35




1 445,01 568,91 605,20

2 393,78 543,01 543,50

3 380,74 670,54 608,82

4 326,77 594,32 681,01

5 237,82 521,04 704,31

6 177,11 435,92 942,13

7 269,19 294,60 618,68

8 192,80 356,85 593,80

9 208,01 554,41 590,70

10 210,23 844,24 684,32


49

Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se

verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-8 (24, 48 e

72 h), independente da concentração de endotoxina utilizada na ativação

celular. Assim, em todas as amostras, incluindo o grupo controle, houve

aumento significativo da produção de MMP-8 do tempo de 24 até 72 h. No

grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve significativo aumento

da produção de MMP-8 do tempo 24 h para 72 h (p<0,05). Nos grupos

ativados com 10 ou 20 EU/mL, houve aumento significativo da produção

de MMP-8 do tempo 24 h para 48 h (p<0,05) e do tempo 24 para 72 h

(p<0,05), sendo que os períodos de 48 h e 72 h apresentaram valores

semelhantes (p>0,05). As tabelas 16 a 19 demonstram os valores médios

± desvios-padrão da produção de MMP-8 em cada grupo, em função do

tempo, e a formação de grupos homogêneos.

Tabela 16 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)


24 1403,70 310,14 A

48 2075,30 372,29 B

72 3065,00 779,64 C

Tabela 17 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 5 EU/mL


24 857,31 349,68 A

48 1108,90 209,59 A B

72 1336,70 312,18 B

50



24 660,33 213,83 A

48 1104,10 328,63 B

72 1003,30 337,80 B



24 284,15 95,72 A

48 538,38 155,83 B

72 657,25 111,86 B

Com relação à concentração de endotoxina utilizada na

ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve

significativa redução da produção de MMP-8 após ativação com

endotoxinas nas diferentes concentrações. A produção de MMP-8 nos

grupos ativados com 5 e 10 EU/mL foram semelhantes entre si (p>0,05) e

significativamente inferior ao grupo controle (p<0,05). A produção de

MMP-8 no grupo ativado com 20 EU/mL foi significativamente inferior a de

praticamente todos os grupos avaliados (p<0,05). Os valores médios e

desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos

tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 20 a 22.

51


Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 1403,7 310,14 A

5 857,3 349,68 B

10 660,3 313,83 B

20 284,1 95,72 C


Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 2075,3 372,29 A

5 1108,9 209,59 B

10 1104,1 328,63 B

20 538,4 155,83 C


Concentrações de

endotoxina (EU/mL)

média

desvio-padrão

Grupos homogêneos

0 (controle) 3065,0 779,64 A

5 1336,7 312,18 B

10 1003,3 337,80 B C

20 657,25 111,86 C

6 DISCUSSÃO

6.1 Da metodologia

Na presente pesquisa, para verificar os efeitos da

endotoxina sobre a produção de metaloproteinases da matriz, foi

selecionada a linhagem celular humana U937 (monócitos/macrófagos),

pois os macrófagos têm importante papel no início e manutenção do

processo inflamatório periapical, incluindo reabsorção óssea (Grenier;

Grignon, 2006). Estudos têm demonstrado que endotoxinas (LPS) têm a

capacidade de se ligar ao receptor CD14 na superfície de monócitos e

macrófagos e induzir a liberação de citocinas envolvidas no processo

inflamatório, incluindo metaloproteinases da matriz (MMP) (Hong et al.,

2004; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). A

linhagem U937 foi selecionada, pois é muito utilizada em diversos estudos

recentes que avaliam os efeitos de LPS em macrófagos, como a

produção de diversas citocinas e também de MMP (Maldonado et al.,

2004; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007; Lee et al., 2007;

Tanabe; Grenier, 2008).

Como as células da linhagem U937 (monócitos) não são

aderentes, foi preciso realizar a diferenciação celular para macrófagos

maduros (Hojo et al., 2000; Jiang et al., 2003; Vogel et al., 2005; Grenier;

Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). Para obter esta

diferenciação, foram realizados primeiramente dois pilotos: a) as células

foram mantidas em phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) na

concentração 5 µg/mL por 48 h para promover aderência celular (Vogel et

al., 2005); b) as células foram mantidas em PMA na concentração 10

53

ng/mL por 48 h para promover aderência celular (Tanabe; Grenier, 2008).

Após a realização destes pilotos, um maior número de células aderidas

viáveis foram obtidas com a metodologia proposta por Tanabe e Grenier

(2008), entretanto, foi também realizado um terceiro piloto, utilizando

concentração intermediária de PMA (1 g/mL) por 48 h, a qual promoveu

um maior número de células viáveis aderidas, sendo este protocolo

selecionado para a presente pesquisa.

Foi utilizado o teste de exclusão com azul de tripan (0,5%)

para verificar a viabilidade celular, pois este é um método confiável,

utilizado por vários autores (Chang et al., 2002; Vogel et al., 2005; Bodet

et al., 2006; Bodet et al., 2007; Oliveira et al., 2007). A quantidade de

células viáveis distribuídas em cada poço da placa foi padronizada em

1x106 células/mL, quantidade previamente relatada na literatura (Bodet et

al., 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).

Para promover ativação celular foi utilizada endotoxina

purificada de E. coli. Embora esta bactéria não seja comumente

encontrada no interior dos canais radiculares com polpa necrosada, sua

endotoxina apresenta a estrutura básica do componente lipídico, que

representa o centro ativo responsável pelas propriedades tóxicas do LPS

(Yin et al., 2003). Além disso, endotoxina de E. coli é considerada padrão

e é utilizada na maioria dos trabalhos relatados na literatura (Jiang et al.,

2004; Maldonado et al., 2004; Oliveira et al., 2005; Oliveira et al., 2007;

Jiang et al., 2006; Lee et al., 2007; Nareika et al., 2007).

As metaloproteinases da matriz (MMP) representam uma

família de endopeptidases zinco-dependentes com atividades proteolíticas

sobre vários componentes da matriz extracelular (Krane, 1994; Lin et al.,

2001). Os macrófagos expressam várias MMP, incluindo colagenases

(MMP-1, MMP-8), gelatinases (MMP-2, MMP-9), estromelisinas (MMP-3,

MMP-7, MMP-12) e colagenase-3 (MMP-13) (Goetzl et al., 1996; Imai et

al., 1998; Wahlgren et al., 2002).

54

Tendo em vista que MMP-3 (Shin et al., 2002; Pita et al.,

2009) e MMP-8 (Wahlgren et al., 2002; Sulkala et al., 2007) estão

relacionadas com inflamação pulpar e periapical, no atual estudo, foram

selecionados estas MMP (estromelisina: MMP-3 e colagenase: MMP-8)

para verificar se a endotoxina apresenta capacidade de induzir a

produção destas MMP na mesma linhagem celular.

Com relação às diferentes concentrações de endotoxinas

utilizadas para ativação celular, foram padronizadas as concentrações de

5, 10 e 20 EU/mL, baseado no estudo de Hong et al. (2004), que

utilizaram as concentrações de 1, 5 e 10 EU/mL de LPS por 24 h para

verificar a expressão gênica de MMP-1 em macrófagos (linhagem J 774,

camundongo). No presente estudo, foi acrescentada a concentração de

20 EU/mL para verificar se esta concentração promoveria maior ativação

celular, sem causar efeitos citotóxicos (morte celular). A ativação por

diferentes concentrações de endotoxinas é importante para verificar se a

produção de MMP é dependente da dose de endotoxina ou apenas da

sua presença (dose-independente).

Com relação ao tempo de ativação celular, foram

avaliados na presente pesquisa três diferentes períodos de tempo: 24, 48

e 72 h. A maioria dos estudos que avaliam os diferentes efeitos de LPS

em cultura de macrófagos, incluindo produção de citocinas e MMP,

avaliam apenas no período de 24 h (Hong et al., 2004; Maldonado et al.,

2004; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007;

Tanabe; Grenier, 2008). Em 2007, Bodet et al. avaliaram, em fibroblastos,

os efeitos de LPS na produção de diferentes MMP e seus inibidores após

estimulação por 6, 24 e 48 h. Assim, tornou-se interessante também

verificar, em macrófagos, se a produção de MMP aumenta de acordo com

o aumento do período de ativação.

A detecção de MMP na presente pesquisa foi realizada

pelo ensaio imunoenzimático ELISA utilizando Kits específicos (R & D

System). Estes Kits utilizam anticorpos anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 total

55

humana, ou seja, conseguem detectar MMP-3 ativa somada a forma pró-

MMP-3 ou MMP-8 ativa somada a forma pró-MMP-8. Estes kits foram

selecionados pois são os mais utilizados na literatura (Figueredo et al.,

2003; Maldonado et al., 2004; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006;

Nareika et al., 2007; Sundararaj et al., 2008; Tanabe; Grenier, 2008).

6.2 Dos resultados

Com relação aos resultados obtidos da produção das MMP

em função do tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da

produção de MMP-3 e MMP-8 em função do aumento de tempo, exceto

no grupo MMP-3 ativado por 20 EU/mL, em que o aumento da produção

de MMP-3 não foi significativo em relação ao tempo. Na maioria das

amostras, incluindo o grupo controle (sem ativação por endotoxina),

houve aumento da produção de MMP-3 e MMP-8 à medida que o tempo

aumentou, de 24 até 72 h. Estes resultados concordaram com os estudos

de Chang et al. (2002) e Bodet et al. (2007). Chang et al. (2002)

verificaram que a produção de MMP-2, em fibroblastos do ligamento

periodontal humano, aumentou significativamente de acordo com o

tempo, sendo que para esta linhagem celular, o nível de MMP-2 começou

a aumentar no 4º dia. Bodet et al. (2007) também demonstraram que a

produção de MMP-2 e MMP-3 em fibroblastos aumentou em função do

tempo tanto nas amostras do grupo controle (sem ativação) como nas

ativadas por LPS.

Como o aumento de MMP-3 e MMP-8 em função do tempo

também ocorreu no grupo controle (sem ativação por endotoxina), é

provável que este aumento tenha ocorrido devido ao aumento no número

de células na cultura (O’Boskey; Panagakos, 1998), o que resultou em um

maior número de enzimas presente nos sobrenadantes. De acordo com

56

os resultados da presente pesquisa, as células mesmo sem ativação por

endotoxinas produziram MMP-3 e MMP-8. Isto pode ser atribuído à

expressão gênica destas MMP nesta linhagem celular, pois a expressão

da maioria das MMP é induzida, em pequeno número, a um nível

constante (Palosaari et al., 2003).

Além disso, o tratamento com PMA pode ter induzido a

liberação de MMP-3 e MMP-8 no grupo controle. Bodet et al. (2007)

ativaram cultura de fibroblastos com LPS ou PMA por 6, 24 e 48 h e

verificaram que no caso de MMP-2, a utilização de PMA não induziu

aumento da produção de MMP-2 em relação ao controle (sem ativação),

já com relação à MMP-3, a utilização de PMA promoveu produção de

MMP-3 superior ao grupo controle. Grenier e Grignon (2006) e Tanabe e

Grenier (2008) realizaram o tratamento da linhagem celular (U937) com

phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) e demonstraram que os

macrófagos diferenciados por este tratamento produziram MMP-9 na

ausência de LPS (grupo controle). Este resultado corrobora com o

presente estudo, no qual houve produção de MMP-8 também no grupo

controle, mas diverge quanto à redução da produção de MMP-8

observada após ativação de LPS.

Esta significativa redução da produção de MMP-8, em

relação ao controle, após ativação com diferentes concentrações de

endotoxinas, também difere de Sundararaj et al. (2008) que, semelhante

ao presente estudo, avaliaram a produção de MMP-8 por monócitos

(U937) e, utilizando reação ELISA (Kits R & D) encontraram aumento

significativo, em relação ao grupo controle, da produção desta MMP após

ativação com 100 ng/mL de LPS por 24 h.

Uma das possíveis explicações para esta divergência de

resultados em relação ao trabalho de Sundararaj et al. (2008), estaria no

fato que estes autores não induziram a diferenciação celular de monócitos

para macrófagos maduros com uso de PMA, que é um potente ativador

da proteína C quinase e regula a expressão de COX-2 (Jiang et al., 2003).

57

Esta diferenciação celular utilizada na presente pesquisa e

em diversos trabalhos (Hojo et al., 2000; Jiang et al., 2003; Vogel et al.,

2005; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008)

leva a alterações permanentes dos parâmetros celulares como na

morfologia, na função, no metabolismo e no crescimento celular (Dini et

al., 2009). Além disso, é alterada também a propriedade dos monócitos

humanos em metabolizar ácido araquidônico e liberar prostaglandina

após estimulação. Os macrófagos derivados de monócitos passam a ser

mais responsivos ao LPS e, portanto, passam a liberar maior quantidade

de PGE2, segundo Jiang et al. (2003). Estes autores compararam a

produção de fosfofolipase A2 citosólica (cPLA2), cicloxigenase 1 e 2 (COX-

1 e 2), ácido araquidônico e PGE2 entre monócitos (U937) ativados com

LPS e PMA e macrófagos diferenciados de monócitos (U937) com uso de

PMA, também ativados com LPS e PMA. Os macrófagos ativados com

LPS apresentaram maior produção de ácido araquidônico e PGE2 do que

os monócitos ativados com LPS. Os monócitos só produziram uma

quantidade significativa de ácido araquidônico e PGE2 quando ativados

por PMA, além disso, ao contrário dos macrófagos que expressaram

COX-1 e COX-2, os monócitos expressaram somente COX-1.

Esta capacidade dos macrófagos derivados de monócitos

serem mais responsivos ao LPS e, portanto, liberar uma maior quantidade

de PGE2, via COX-2, poderia explicar a redução característica da

produção de MMP-8 observada no presente estudo, pela hipótese de que

a produção desta MMP-8 estaria relacionada à presença de PGE2 ou

COX-2. Neste caso, a presença de COX-2 ou a presença excessiva de

PGE2 poderia ter efeito inibitório à produção de MMP-8. Diversos estudos

relatam que a expressão de MMP por macrófagos ativados com LPS

pode ocorrer por meio de uma via dependente de PGE2 e AMPc (Wahl;

Corcoran, 1993; Zhang et al., 1998) ou independente de PGE2 (Zhang et

al., 1998), além disso, os efeitos de inibidores de cicloxigenase e de PGE2

58

na produção de TIMP e MMP podem variar de acordo com o tipo de

célula estudada (Takahashi et al., 1997).

Takahashi et al. (1997), utilizando fibroblastos da sinóvia

de pacientes com artrite reumatóide, observaram que a produção de pro-

MMP-1 foi aumentada com a utilização de inibidores da cicloxigenase,

mas, por outro lado, foi suprimida na presença de PGE2 exógena. Lin et

al. (2001) também relataram que a expressão gênica de MMP-1 induzida

em fibroblastos da polpa dental é, em parte, mediada por uma via

dependente de PGE2. O uso concomitante de PGE2 e IL-1α ou TNF-α

suprimiu a indução de MMP-1 em comparação ao efeito destas citocinas

utilizadas isoladamente. Por outro lado, Lin et al. (2002) demonstraram,

em modelos experimentais de lesão periapical em ratos, o envolvimento

MMP-1 e COX-2 no desenvolvimento da lesão. Os autores observaram

uma redução característica na expressão de MMP-1 após uso de

inibidores da COX-2, sugerindo a importância da COX-2 na modulação de

MMP-1. Tendo em vista que há uma grande divergência quanto à relação

entre MMP e PGE2 e/ou cicloxigenases, Shin et al. (2002) relatam que são

necessários novos estudos sobre o papel das prostaglandinas na

produção de MMP por macrófagos.

A maioria dos trabalhos encontrados na literatura

envolvendo MMP-8, refere-se à quantificação desta MMP dos tecidos

dentários humanos (Tjäderhane et al., 1998; Wahlgren et al., 2002;

Palossari et al., 2003; Sulkala et al., 2007; Santos et al., 2009) e não de

culturas de células (estudo in vitro), o que dificultou a comparação dos

resultados da presente pesquisa com as demais.

Com relação à concentração de endotoxina utilizada para

ativação celular, pode-se verificar que em todas as concentrações de

endotoxinas (5, 10 e 20) houve redução da produção de MMP-8, sendo

esta redução mais evidenciada na concentração de 20 EU/mL. Hong et

al., 2004 e Maldonado et al., 2004, por outro lado, demonstraram que

quanto maior a concentração de LPS utilizada para a ativação celular,

59

maior a produção de MMP. Maldonado et al., 2004 utilizaram LPS de E.

coli nas concentrações de 1 a 100 ng/mL para induzir a produção de

MMP-1 por monócitos humanos (U937). Hong et al., 2004 que também

avaliaram a produção de MMP-1, utilizaram LPS de Fusobacterium

nucleatum e de Porphyromonas endodontalis nas concentrações de 1 a

10 EU/mL para ativar macrófagos de camundongos (J774).

Com relação à produção de MMP-3, pode-se verificar que

houve significativo aumento da produção desta MMP quando as células

foram ativadas com endotoxina de E. coli, em relação ao grupo controle

(sem ativação). De acordo com os resultados da atual pesquisa, o

aumento da produção de MMP-3 foi semelhante nas amostras ativadas

com 5, 10 ou 20 EU/mL, especialmente nos períodos de 48 a 72 h,

demonstrando que as células quando ativadas por LPS, independente da

concentração, produziram MMP-3. Assim, esta ativação depende da

presença de LPS e não de uma dosagem específica (dose-independente).

Estes resultados concordaram com diversos estudos na literatura que

utilizaram outras linhagens celulares, endotoxinas de outros

microrganismos ou outras MMP e que demonstraram que endotoxina

ativa a célula a produzir MMP (Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006;

Bodet et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).

Bodet et al. (2006) avaliaram os efeitos de uma mistura de

LPS de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tanerella

forsythia (concentração final 1 µg/mL) sobre uma co-cultura celular

(macrófagos e células epiteliais) após 24 h de estimulação e verificaram

que houve significativo aumento na produção de MMP-9 e PGE2. Grenier

e Grignon (2006) verificaram os efeitos de LPS de Fusobacterium

nucleatum (5 µg/mL) sobre monócitos U937 diferenciados em macrófagos

aderentes pelo tratamento com PMA. Após 24 h de ativação, houve

significativo aumento na produção de MMP-9, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF- α e

PGE2. Bodet et al. (2007) avaliaram a produção de diferentes MMP e seus

inibidores em fibroblastos gengivais (humanos) estimulados por LPS de

60

Actinobacillus (Aggregatibacter) actinomycetemcomitans (1 µg/mL) nos

períodos de 6, 24 e 48 h. Os autores verificaram que houve significativo

aumento na produção de MMP-2, MMP-3 e TIMP-1 após ativação por

LPS e que este aumento foi proporcional ao período de ativação. Em

2008, Tanabe e Grenier verificaram que a estimulação de macrófagos

(monócitos U937 diferenciados pelo tratamento com PMA) por endotoxina

de A. actinomycetemconitans na concentração 1 µg/mL por 24 h induziu

significante aumento na secreção de TNF-α, IL-6, IL-8 e MMP-9.

De acordo com os resultados da presente pesquisa pode-

se verificar que, especialmente nos tempos de 48 e 72 h, a ativação

celular foi dependente da presença de LPS e independente da dose.

Estes resultados discordam dos estudos de Hong et al. (2004) e

Maldonado et al. (2004), quanto à afirmação pelos mesmos, de que a

ativação celular por LPS e a produção de MMP é dose-dependente. No

entanto, estes autores avaliaram a produção de MMP por um período

curto de tempo de ativação (24 h). Na atual pesquisa, pode-se verificar

que no tempo de 24 h houve diferença significativa entre a concentração

de 5 EU/mL em relação a de 10 e 20 EU/mL e, por outro lado, não houve

diferença entre as concentrações de 10 e 20 EU/mL. Assim, baseado

nestes resultados, pode-se inferir que o período de 24 h seja

relativamente curto para analisar a produção de MMP e por outro lado, os

períodos de 48 e 72 h, que apresentaram resultados mais uniformes,

sejam mais confiáveis para análise da produção de MMP.

A relação precisa entre endotoxina e produção de MMP

ainda não está bem esclarecida. Hong et al. (2004) sugeriram que LPS

promove liberação de citocinas (IL-1α, TNF-α) por macrófagos no sítio da

inflamação e que estas citocinas pró-inflamatórias podem modular a

subseqüente produção de MMP-1 por macrófagos, contribuindo para a

reabsorção óssea periapical. Em 1998, O’Boskey e Panagakos

verificaram que houve significativo aumento na produção de MMP-2 e

MMP-9 por células da polpa humana na presença de citocinas (IL-1 e

61

TNF-α) em culturas de longo período (acima de 9 dias). Em 2006,

Wisithphrom e Windsor avaliaram os efeitos de TNF-α, IL-1β e IL-6 na

degradação de colágeno por fibroblastos pulpares e verificaram que estas

citocinas aumentaram a expressão (RNAm) de MMP-1, MMP-2 e MMP-3.

Bodet et al. (2007) sugeriram que LPS pode induzir várias vias de

sinalização intracelular, como via proteína-serina quinase p38, que pode

levar ao aumento da atividade do fator de transcrição nuclear NF-kappa-B

p50, o qual pode estimular a expressão de MMP-2, MMP-3 e TIMP-1.

Tendo em vista que são poucos os estudos na literatura

(Lin et al., 2002; Hong et al., 2004) que avaliaram a relação da produção

metaloproteinases da matriz por macrófagos com outros fatores liberados

numa infecção endodôntica, como endotoxinas, citocinas e

prostaglandinas, o presente estudo demonstrou que

monócitos/macrófagos humanos da linhagem U937, considerados úteis

para estudar o comportamento dos macrófagos (Jiang et al., 2003; Lee et

al., 2007), são capazes de produzir MMP-3 e MMP-8. Entretanto, as vias

de produção das MMP pelos macrófagos e sua relação com LPS,

citocinas e prostaglandinas precisam ser melhor esclarecidas, pois no

presente estudo pode-se observar que houve significativo aumento da

produção de MMP-3 na presença de LPS e, por outro lado, houve

significativa redução de MMP-8, sugerindo que os mecanismos

envolvidos na produção da MMP-3 e MMP-8 são diferentes.

7 CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que:

a) diferentes concentrações de endotoxinas (5, 10 e 20

EU/mL) apresentaram capacidade de induzir aumento

significativo da produção de MMP-3 em relação ao

grupo controle nos período de 24, 48 e 72 h,

independente da concentração utilizada, sugerindo

que esta ativação foi dependente da presença de

endotoxina e não da dose;

b) a presença de endotoxinas em diferentes

concentrações (5, 10 e 20 EU/mL) induziu

significativa redução da produção de MMP-8 em

relação ao controle, em todos os períodos de tempo

avaliados. Esta redução foi mais evidenciada na

concentração 20 EU/mL;

c) o aumento da produção de MMP-3 e MMP-8 foi

diretamente proporcional ao aumento do período de

tempo, especialmente em 48 e 72 h.

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ANEXO – Certificado do comitê de ética em pesquisa

Vilela PGF. Evaluation matrix metalloproteinases (MMP-3 and MMP-8) liberation by macrophages activated by different concentrations of endotoxins (LPS) and different periods of time [dissertation]. São José dos Campos: School of Dentistry of São José dos Campos, UNESP- São Paulo State University; 2009.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the capacity of different concentrations of endotoxins (LPS) of Escherichia coli to induce secretion of MMP-3 and MMP-8 in macrophages in vitro, in the periods of 24, 48 and 72 h. For this purpose, human monocytes line U937 were differentiated into mature macrophages with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and were activated with different concentrations of endotoxins: 0 (control), 5, 10 and 20 EU/ml and the production of MMP-3 and MMP-8 were evaluated at three periods of time (24, 48 e 72 h) by immunoenzymatic assays (ELISA). The results were analyzed statistically by ANOVA and Tukey’s test, 5%. Significant increase in the production of MMP-3 (p<0.05) after the activation with different concentrations of LPS in relation to the control at the periods of 24, 48 and 72 h were observed. Regarding MMP-8, significant reduction in the production after the activation with different concentrations of endotoxins in relation to the control was observed at all the periods evaluated. Basically in all groups (including the controls) the production of MMP-3 and MMP-8 increased significantly in relation to the time. It could be concluded that: a) different concentrations of endotoxins were able to induce significant increase in the production of MMP-3 at the periods of 24, 48 and 72 h, independently of the concentration used, suggesting that this activation is dependent of the presence of the endotoxin and dosis-independent; b) the presence of different concentrations of endotoxins induced significant reduction in the production of MMP-8 in relation to the control in all the periods of evaluation. Key-Words: matrix metalloproteinases; endotoxins; macrophages.

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