Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PESQUISA E EXTENÇÃO
NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA
FERNANDA MEGIOLARO
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Videira – SC 2016
FERNANDA MEGIOLARO
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Biotecnologia.
Mestranda: Fernanda Megiolaro Orientadora: Drª Jane Mary Lafayette Neves Gelinski Co-orientador: Dr. César Milton Baratto Co-orientadora: Drª Vania Aparecida Vicente – Universidade Federal do Paraná Área: Biotecnologia Aplicada à Agroindústria e Saúde Linha de pesquisa: Bioprospecção, produção e processamento de matéria-prima e bioproduto
Videira – SC
2016
Ficha Catalográfica
Vanessa Pereira – CRB 14/1446
M496p Megiolaro, Fernanda
Potencial biotecnológico de fungos melanizados na degradação e
assimilação de hibrocarbonetos / Fernanda Megiolaro – 2016.
76f. : ils. ; figs. ; tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Biotecnologia) – Programa de
Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia,
Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira –
UNOESC, 2016.
1. Fisiologia. 2. Biomassa. 3. Hidrocarbonetos monoaromáticos.
4. Fungos melanizados. I. Título. II. Autor. III. Orientador.
CDD: 589.2
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelas oportunidades concedidas, por estar sempre presente e
iluminando o meu caminho.
Aos meus pais e porto seguro Cecília e Nelson, que com todas as
dificuldades e o pouco estudo, sempre me estimularam a estudar. Vocês são os
grandes responsáveis por essa conquista.
À minha família “comercial de natal”, pelos alvoroços aos domingos; sem
vocês a vida não teria sentido.
À professora e orientadora Drª Jane Mary Lafayette Gelinski, pelo tempo
dedicado as orientações, pela simplicidade e humildade em transmitir conhecimento,
e por ser um exemplo de profissional. Agradeço também a sua família pela
cordialidade com a qual sempre fui tratada.
Ao professor e co-orientador César Milton Baratto, por sua disposição,
comprometimento e incentivo;
Aos professores Claudriana, Geisson, Jean e Sabrina pela amizade e pelo
bate papo de corredor e também, aos demais professores do mestrado, pela
competência e dedicação.
À Drª Elisandra Minotto, pelos conselhos e sugestões.
Aos meus companheiros de mestrado Ketlin e Cássio, foi maravilhoso
compartilhar esse momento com vocês.
Aos amigos do PLS e SAS, pelo apoio, paciência e momentos de
descontração.
Aos amigos Araceli, Tainara, Duda, Josi, Dani, Suzi, Bel, Pâmela e aos
demais colegas da UNOESC;
À Professora Drª Vânia Aparecida Vicente, pela orientação e oportunidade de
aprendizado.
À Universidade Federal do Paraná, Departamento de Microbiologia,
Parasitologia e Patologia Básica - LABMICRO pelas dicas, ensinamentos e
acolhimento.
À Universidade do Estado de Santa Catarina pelo suporte financeiro e por
possibilitar a realização desta pesquisa.
“...Todo o conhecimento é vão, a não ser
que haja trabalho.
E todo trabalho é vazio, a não ser que haja
amor.
E quando trabalhais com amor, vos ligais a
vós mesmos, aos outros e a Deus...”
(Khalil Gibran)
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO
E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
RESUMO
Os fungos melanizados são caracterizados pela presença da melanina na parede
celular, esta é responsável pela coloração e fornece proteção principalmente contra
irradiação solar. São capazes de crescer em ambientes inóspitos e com escassez de
nutrientes. O oligotrofismo desses micro-organismos sugere potencial para
biorremediação, principalmente para áreas poluídas por hidrocarbonetos. Essa
pesquisa investigou sobre o potencial biotecnológico de fungos melanizados na
degradação de hidrocarbonetos do grupo BTX (benzeno, tolueno e xileno) e ainda,
gasolina e diesel como única fonte de carbono. Foram obtidos 22 isolados, destes
72,72% foram pela técnica de flotação em óleo mineral. A maioria dos isolados
apresentou oligotrofismo crescendo em concentrações elevadas de NaCl (0,0%,
2,5%, 5,0% e 10%), ampla faixa de pH (4-9) e temperatura (25ºC, 28ºC, 30ºC, 35ºC
e 37ºC). Dos isolados, 15 apresentaram índice de emulsificação em 24h (E24) e
91% apresentou caráter hidrofóbico. A atividade enzimática de lacase foi detectada
em 54,54% dos isolados. Todos os isolados apresentaram crescimento nos ensaios
com BTX e também em óleo diesel e gasolina. Seis isolados foram selecionados,
com base no maior potencial de degradação de hidrocarbonetos, para identificação
molecular e análise filogenética. Foram identificados como Cladosporium sp. (n=2)
Cladosporium halotolerans(n=2), Família Cladosporiaceae e Exophiala sp. (n=1) e
Exophiala dermatitidis (n=1) da Família Herpotrichiellaceae. Os isolados de fungos
melanizados de ambientes poluídos por hidrocarbonetos suportam condições
diversas de crescimento e podem ser utilizados na biorremediação destes
ambientes. Análises posteriores sobre a fisiologia das espécies identificadas
deverão ser conduzidas para confirmar a real importância destas como
assimiladoras de hidrocarbonetos na perspectiva de utilização como
biorremediadoras, face ao potencial aqui demonstrado.
Palavras Chaves: Fisiologia. Biomassa. Cladosporiaceae. Herpotrichiellaceae.
Hidrocarbonetos monoaromáticos.
BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF BLACK FUNGI IN DEGRADATION AND
ASSIMILATION OF HYDROCARBONS
ABSTRACT
Black fungi are characterized by the presence of melanin in the cell wall. This is
responsable for coloration and protection mainly against solar irradiation.
They are able to grow in inhospitable environments and shortage of nutrients.
The oligotrophic nature of microorganisms Suggests potential for bioremediation,
Mainly for areas polluted by hydrocarbons. In this study, the objective was to
investigate the biotechnological potential of black fungus with melanin in the
hydrocarbon degradation of BTX group (benzene, toluene and xylene) and still
gasolin and diesel. Twenty-two isolates were obtained of environments and materials
contaminated by hydrocarbons from two methods of isolation: flotation in mineral oil
and inoculum by direct Mycosel agar. Most isolates demonstrated oligotrophic
growing at high concentrations of NaCl (0,0%, 2,5%, 5,0% e 10%), pH range (4-9)
and temperature (25ºC, 28ºC, 30ºC, 35ºC e 37ºC). The average emulsification index
in 24 hours in 15 isolates, and 91% showed hydrophobic character; laccase was
detected in 54.54% of the isolates. All isolates showed growth in BTX and also in
diesel and gasoline. Six selected isolates were identified as Cladosporium sp. (n=2)
Cladosporium halotolerans (n=2) Family: Cladosporiaceae , and Exophiala sp. (n=1)
and Exophiala dermatitidis (n=1), Family: Herpotrichiellaceae These strains had the
best profile of hydrocarbons assimilation. The isolated melanized fungi of polluted
environments hydrocarbons support various growth conditions and can be involved
at process of environmental bioremediation. Additional analysis on physiology of the
identified species should be conducted to confirm the real importance as assimilators
of hydrocarbon, considering the perspective as biorremediadors given the potential
shown here.
Key-words: Physiology. Biomass. Cladosporiaceae. Herpotrichiellaceae.
Monoaromatic hydrocarbons.
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS
18S – Unidade do RNA ribossomal
28S – Unidade do RNA ribossomal
β – Beta
Ø – diâmetro
ε – Epsilon
ºC- Graus Celsius
ABTS – 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid
BTX – Benzeno, Tolueno e Xileno
CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures
DNA – ácido desoxidoribonucleico
DNAr – Ácido desoxiribonucléico ribossomal
DMSO – Dimetil sulfoxido
DNTP – Desoxirribonucleotídeos fosfatados
DOPA – Dihidroxifelilalanina
E24 – Emulsão em 24 horas
EC – Enzyme Commission Numbers
g – grama
g.cm-3 – gramas por centímetros cúbicos
ITS – Espaçador Interno Transcrito/Internal transcribed spacer
K2HPO4 – Fosfato de potássio dibásico
KNO3 – Nitrato de potássio
LSU – Subunidade ribossomal maior/ Large ribossomal subunit
MEA – malt extrat Agar/ágar extrato de malte
mg – Miligrama
MgCl – Cloreto de magnésio
MgSO4 . 7 H2O – Sulfato de magnésio heptahidratado
mL- Mililitro
MM – Meio mineral
mm - Milímetro
(NH4)SO4 – Sulfato de amônio
NaCl – Cloreto de sódio
NaOH – Hidróxido de sódio
ng – nanograma
nm – Nanômetro
PCR – reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
PHAs – Polycyclic Aromatic Hydrocarbons/hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
pmol – Pico molar
RNA – ácido ribonucleico
SSU – Subunidade ribossomal menor / Small ribosomal subunit
U – unidade
μL – Microlitro
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Representação da região do DNAr com Espaçador Interno Transcrito ... 21
Figura 2 – Análise filogenética de seis linhagens identificadas de Cladosporium e
Exophiala pelo método de máxima semelhança .................................................... 60
Fotografia 1 – Macroscopia e microscopia de linhagens de Cladosporium sp. e
Exophiala sp., cultivados em placas em ágar extrato de malte 2% ........................... 42
Fotografia 2- Atividade de lacase por oxidação de ABTS em isolado 1PD em meio
Sabouraud ................................................................................................................. 50
Gráfico 1- Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados em ágar MEA
2% com diferentes porcentagens de cloreto de sódio ............................................... 45
Gráfico 2 – Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados em ágar MEA
2% em diferentes faixas de pH .................................................................................. 47
Gráfico 3 – Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados de fungos em
ágar MEA 2% sob diferentes temperaturas ............................................................... 49
Gráfico 4 – Quantificação da atividade enzimática da lacase de isolados de fungos
melanizados durante 168 horas ................................................................................ 51
Gráfico 5 – Capacidade de emulsificação (%) de isolados fúngicos após 24horas ... 53
Gráfico 6 – Valor médio de massa seca (mg) com adição dos diferentes
hidrocarbonetos BTX em meio mineral ..................................................................... 55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Propriedades físico-químicas de hidrocarbonetos monoaromáticos BTX25
Tabela 2 – Gêneros de fungos que apresentam potencial de assimilação de
hidrocarbonetos ......................................................................................................... 27
Tabela 3 – Amostras utilizadas para o isolamento de fungos melanizados locais com
potencial de assimilação de hidrocarbonetos. .......................................................... 30
Tabela 4 – Descrição dos cultivos utilizados nos ensaios de assimilação de
hidrocarbonetos ......................................................................................................... 36
Tabela 5 – Produtos utilizados para as reações de amplificação dos isolados
fúngicos. .................................................................................................................... 38
Tabela 6 – Número de isolados obtidos a partir de amostras poluídas por
hidrocarbonetos. ........................................................................................................ 40
Tabela 8 – Avaliação qualitativa atividade de lacase nos isolados fúngicos cultivados
em ágar MEA 2% contendo ABTS ............................................................................ 51
Tabela 9 – Características fisiológicas das seis linhagens de fungos selecionadas
pelo maior potencial de assimilação de BTX, gasolina e diesel. ............................... 57
Tabela 10 – Linhagens fúngicas utilizadas na construção da árvore filogenética,
composta por isolados identificados nesse estudo e com similaridade genética ...... 62
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 16
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 16
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 16
3 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 17
3.1 FUNGOS MELANIZADOS .................................................................................. 17
3.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS LEVEDURAS NEGRAS ............................. 18
3.3 FILOGENIA E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR .................................................. 20
3.4 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA LACASE ............................................................. 23
3.5 DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POR FUNGOS MELANIZADOS .... 24
3.6 BIOSURFACTANTES ......................................................................................... 27
4 METODOLOGIA ................................................................................................. 29
4.1 MATERIAIS AMOSTRADOS PARA OBTENÇÃO DE ISOLADOS ...................... 29
4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS MELANIZADOS .................................................... 30
4.2.1 Técnica de Flotação em Óleo Mineral .............................................................. 31
4.2.2 Técnica de Inóculo Direto ................................................................................. 31
4.2.3 Manutenção das culturas ................................................................................. 32
4.4 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS NA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO .................................................................................................. 32
4.4.1 Teste de Hidrofobicidade.................................................................................. 32
4.4.2 Teste de Tolerância ao Cloreto de Sódio ......................................................... 33
4.4.3 Teste de Tolerância ao potencial Hidrogeniônico ............................................. 33
4.4.4 Teste de Tolerância à Temperatura ................................................................. 33
4.4.5 Atividade Enzimática de Lacase ....................................................................... 33
4.4.6 Determinação do Índice de Emulsificação (E24) .............................................. 34
4.4.7 Ensaio de Degradação de Hidrocarboneto ...................................................... 35
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 36
4.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA .................................................. 37
4.6.1 Extração de DNA .............................................................................................. 37
4.6.2 Amplificação da Região ITS – Internal Transcribed Spacer ............................. 37
4.6.3 Sequenciamento e Análise Filogenética........................................................... 38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 40
5.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS MELANIZADOS .................................................... 40
5.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS NA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO .................................................................................................. 43
5.2.1 Hidrofobicidade dos Isolados ........................................................................... 43
5.2.2 Tolerância ao Cloreto de Sódio ........................................................................ 43
5.2.3 Tolerância ao Potencial Hidrogeniônico ........................................................... 46
5.2.4 Tolerância à Temperatura ................................................................................ 48
5.2.5 Atividade Enzimática de Lacase ....................................................................... 50
5.2.6 Determinação do Índice de Emulsificação (E24) .............................................. 52
5.2.7 Degradação de Hidrocarbonetos ...................................................................... 54
5.3 Identificação Molecular e Filogenia ..................................................................... 59
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 63
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 65
APÊNDICES ............................................................................................................. 74
ANEXO ..................................................................................................................... 77
14
1 INTRODUÇÃO
A indústria do petróleo apresenta extensa e fundamental importância para a
industrialização e o desenvolvimento econômico brasileiro. O petróleo e seus
derivados constituem a principal fonte de energia mundial. O setor petrolífero não
está ligado apenas às questões econômicas, mas também aos danos ao meio
ambiente (FONTES; FONTES, 2013).
A exploração do petróleo apresenta um potencial impacto ambiental aquático,
terrestre e atmosférico (UNEP, 1997). Segundo a Petrobrás, em 2014 o Brasil
atingiu uma produção total de 2,17 milhões de barris por dia de derivados de
petróleo (PETROBRÁS, 2015).
O petróleo apresenta frações de hidrocarbonetos aromáticos em sua
composição, o que torna sua degradação lenta (SATOW et al., 2008). Estes
compostos também estão distribuídos no meio ambiente a partir de fontes
antropogênicas, muitos possuem toxicidade, causam mutação ao DNA, são
carcinogênicos e teratogênicos (HESHAM et al., 2009).
A bioprospecção de organismos selecionados de áreas contaminadas por
hidrocarbonetos oferece uma estratégia importante, com a finalidade de obter
potenciais agentes da biorremediação destas áreas.
Nos últimos anos um grupo de fungos, dematiáceos ou melanizados vêm
chamando atenção, principalmente pela capacidade de sobreviver em ambientes
inóspitos, como em altas concentrações de hidrocarbonetos (PRENAFETA-BOLDÚ
et al., 2001). Esses micro-organismos são considerados patógenos primários em
hospedeiros imunocompetentes, mas sua patogenicidade depende do nicho
ecológico em que se encontra e da espécie à que pertencem (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013). Esses fungos são frequentemente encontrados em
ambientes ricos em hidrocarbonetos.
Os fungos fazem parte de um grupo extenso de micro-organismos,
considerados onipresentes, são capazes de sobreviver em diversos habitats, crescer
em inúmeros substratos e desempenhar funções distintas (SHIGH, 2006). Dentre
essas funções, a biorremediação vem ganhando destaque entre a comunidade
cientifica.
Segundo Prenafeta-Boldú, Summerbel e De Hoog (2006) as leveduras negras
possuem capacidade de assimilação destes compostos, sendo capazes de utilizar
15
os hidrocarbonetos aromáticos como única fonte de carbono. Essa descrição
confere um potencial biotecnológico ainda não explorado (HESHAM et al., 2009).
Dentro deste contexto Prenafeta-Boldú, Summerbell e De Hoog (2006) façam
menção à baixa produção científica relacionada à degradação de compostos
monoaromáticos por fungos.
Esta pesquisa teve como objetivo isolar fungos melanizados oriundos de
materiais poluídos por combustíveis, avaliando características fisiológicas e o
potencial biotecnológico na assimilação de hidrocarbonetos do grupo BTX (Benzeno,
Tolueno e Xileno).
16
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o potencial biotecnológico de fungos melanizados, prospectando
micro-organismos assimiladores de hidrocarbonetos benzeno, tolueno e xileno.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter fungos melanizados de substratos poluídos por hidrocarbonetos,
utilizando dois dos principais métodos de isolamento: flotação em óleo mineral e
inóculo direto em ágar;
Avaliar isolados fúngicos melanizados no que tange às características
fisiológicas voltadas à biorremediação ambiental;
Selecionar entre os isolados os que apresentam potencial de assimilação de
hidrocarbonetos BTX, gasolina e diesel;
Identificar os isolados selecionados por análise molecular avaliando-se o
relacionamento filogenético dos mesmos.
17
3 REVISÃO DA LITERATURA
A revisão da literatura aqui realizada apresenta informações relevantes ao
estudo de leveduras negras e fungos melanizados que demonstram potencial de
assimilação de hidrocarbonetos monoaromáticos de origem petrolífera.
3.1 FUNGOS MELANIZADOS
Dados sobre fungos melanizados vem ganhando notoriedade principalmente
por sobreviverem em ambientes inóspitos. Esta característica se mostra de grande
importância, principalmente para aplicações biotecnológicas. Também denominados
de fungos dematiáceos, são caracterizados pela presença da melanina na parede
celular. Conferem a estes, coloração escura, podendo apresentar-se nas cores
negra, roxo, verde oliva e marrom escuro (KEJZAR et al., 2013).
Um dos primeiros fungos melanizados a serem descritos foi o Sporothrix
schenckii, popularizando o termo "sporotrichoid”, que por diversas vezes foi utilizado
para descrever fungos semelhantes. Os termos mais utilizados são “Phaeoid",
"Phaeo-sporotrichose" e "dematiácea" (PAPPAGIANIS; AJELLO, 1994; MARQUES,
et al., 2006) e vem sendo alterados durante as últimas décadas. O termo
comumente encontrado na literatura médica micológica se refere a fungos
dematiáceos, no entanto este termo não tem sido totalmente aceito devido ao seu
termo lexo do grego “deme”que significa “maço”. Por ser mais específico, o termo
melanizado tornou-se mais utilizado e adequado, devido ao seu significado mais
específico. Ainda assim, os termos "dematiáceos," "melanizados", "escuras", e
"phaeoid" são utilizados como sinônimos para designar fungos que contém melanina
(REVANKAR; SUTTON, 2010).
A principal característica destes fungos é a presença da melanina na parede
celular, o que justifica a sua coloração escura, sendo essa percebida tanto
microscopicamente quanto macroscopicamente (REVANKAR; SUTTON, 2010). A
melanina é um biopolímero que protege contra a radiação UV, temperaturas
extremas, agentes oxidantes e, confere virulência (YURLOVA; DE HOOG;
FEDOROVA, 2008; KEJZAR et al., 2013). Outras qualidades atribuídas à melanina
ainda aparecem na produção de bioplásticos, em células fotovoltaicas orgânicas e
18
absorção de UV em lentes ópticas. Além de um papel na biorremediação
(DESHMUKH, 2012).
A melanina está presente em diversos organismos e estas biomoléculas
podem apresentar-se com diversas estruturas, dependendo do organismo e do local
que está sendo produzida (YORLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008). São
biopolímeros de elevado peso molecular, e formados a partir da polimerização
oxidativa de compostos fenólicos; como por exemplo: tirosina e catecol (YORLOVA;
DE HOOG; FEDOROVA, 2008).
Não há uma quantidade específica de melanina para que o fungo possa ser
considerado dematiáceo (REVANKAR; SUTTON, 2010). Os fungos dematiáceos são
considerados sapróbios, onipresentes, e em sua maior parte, encontrado no solo,
mas diversos agentes etiológicos ocupam nichos ou micronichos específicos. O
conhecimento da ecologia natural do fungo pode contribuir para a compreensão do
potencial patológico (CALIGIORNE et al., 1999).
Algumas espécies de fungos dematiáceos, tem capacidade de crescer em
substratos extremos, com altas concentrações de xileno, tolueno, ou madeira tratada
com creosoto (DÖǦEN; ILKIT; DE HOOG, 2013). As espécies da ordem
Dothideales, do gênero Exophiala e afins são comumente chamadas de leveduras
negras, devido a sua capacidade de produzir brotamento e células leveduriformes
em algum momento do seu ciclo de vida, além de hifas e células escuras
(CALIGIORNE et al., 1999; PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG,
2006).
3.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS LEVEDURAS NEGRAS
As leveduras negras incluem-se no Phylum Ascomycota, Ordem
Chaetothyriales, Família Herpotrichiellaceae e Gênero Exophiala. No Phylum
Basidiomycota, as leveduras negras estão presentes nos gêneros Moniliella e
Trichosporonoides, com posição filogenética ainda não definida. De fato, a
separação filogenética entre os dois Phyla ocorreu há 400 milhões de anos, com a
invasão das plantas na terra (GUARRO; GENÉ; STCHIGEL, 1999). A maioria das
espécies destes gêneros dos basidiomicetos tem importância industrial, mas pouca
na área clínica (YORLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008). Com o avanço das
técnicas de biologia molecular, a identificação e o relacionamento filogenético de
19
fungos passaram por mudanças e reagrupamentos. Isto tem minimizado
inclusão/exclusão de grupos com base na classificação binominal geral pelo Código
Internacional de Nomenclatura Botânica (ICBN) (GUARRO; GENÉ; STCHIGEL,
1999; TSUI et al., 2011).
A característica mais marcante destes fungos é a presença da melanina na
parede celular que confere coloração negra, castanho escuro e verde oliva aos
fungos. Mas também podem apresentar-se nas cores marrom e roxo e liberar
pigmento vermelho-vinho em ágar sabouraud (DE HOOG et al., 1995; REVANKAR;
SUTTON, 2010).
A identificação preliminar de fungos melanizados está relacionado à sua
morfologia macroscópica, que se distingue por meio da cor, da taxa de crescimento
e do desenvolvimento em meios específicos (REVANKAR; SUTTON, 2010).
As propriedades fisiológicas são caracterizadas principalmente pela
tolerância à ciclohexemida, assimilação de nitrato, hidrólise da uréia e crescimento
em diversas concentrações de sal. Identificadas ainda pela morfologia celular,
fermentação e assimilação de fonte de carbono e fontes de nitrogênio (HESHAM et
al., 2009).
Além da presença de melanina, de caroteno, as leveduras negras são
caracterizadas pela formação de parede celular espessa, fase leveduriforme, formas
adicionais de conidiogênese, termotolerância, osmotolerância, hidrofobicidade,
produção de polissacarídeos extracelulares, sideróforos, bem como produção de
metabólitos secundários ácidos ou alcalinos (HOOG et al., 2003).
A morfologia microscópica é notada por meio de conídios, hifas, e a
coloração escura da parede celular (DE HOOG et al., 1995). As leveduras negras
apresentam pleomorfismo, ou seja, morfologia microscópica variável na mesma
espécie fúngica, podendo apresentar as fases leveduriforme e, subsequentemente,
a filamentosa. Contudo, apresentar-se ou não na fase leveduriforme depende do
nicho ecológico ao qual elas estão inseridas (ZHAO et al., 2010; SEYEDMOUSAVI
et al., 2014).
As leveduras negras mostram-se ambientadas a uma ampla gama de
condições ambientais (DÖǦEN; ILKIT; DE HOOG, 2013). Contudo demonstram
notabilidade devido a presença em ambientes extremos, incomuns e tóxicos. As que
pertencem, principalmente, à ordem Chaetothyriales são dificilmente isoladas de
ambientes, principalmente por metodologias tradicionais (BADALI et al., 2008). No
20
entanto técnicas seletivas podem mostrar a presença dessa levedura em uma
diversidade de ambientes. Ainda existe uma dificuldade na obtenção de protocolos
otimizados em temperatura, pH, meios nutricionais. Outra dificuldade de isolamento
é devido à alta contaminação, estas aparecem normalmente antes dos fungos
melanizados, que passa por vezes, despercebido (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013).
Algumas leveduras negras apresentam patogenicidade oportunista, sendo
causadoras da cromoblastomicose e feohifomicose, comumente conhecidas e
estudadas por seu caráter patogênico, que afetam principalmente indivíduos
imunocompetentes. No entanto a grande maioria é de origem ambiental e não
apresentam patogenicidade (MATOS et al., 2003; ZHAO et al., 2010).
Outra característica destes organismos é apresentar relações simbióticas com
algas e cianobactérias quando privados de nutrientes (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013). Segundo Voglmayr et al. (2011) podem conviver em simbiose
também com organismos bastante diferenciados como formigas, oriundas da
América do Sul, Sudeste da Ásia Central e África. As leveduras negras são ainda
responsáveis pelo escurecimento de rochas e superfícies de esculturas, na
destruição de mármore e calcário (STERFLINGER; PRILLINGER, 2001).
Badali et al. (2008) citam a presença de leveduras negras em rochas, fazendo
referência ao estudo escasso desses organismos por pesquisadores.
A identificação de fungos melanizados que degradam hidrocarbonetos é um
processo um pouco mais laborioso e lento, além de poucas informações sobre esses
organismos. Devido a essas dificuldades, a identificação genética é de grande
importância, por ser mais rápida e precisa (HESHAM et al., 2009). Conforme Badali
et al. (2008) pesquisas em filogenia molecular possibilitam conhecer as leveduras
negras e as atividades biológicas incomuns que elas apresentam
3.3 FILOGENIA E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Segundo Taylor et al. (2000) a análise filogenética é determinada pela
variação de características do ácido nucleico com a proximidade de suas espécies
evolutivas. A região ITS (Internal Transcribed Spacer/Espaçador Interno Transcrito)
é a unidade mais usada para identificação de espécies e sua filogenia. A região
21
ITS1, 5.8S e ITS2 (Figura 1), fornecem facilidade de amplificação e variabilidade à
nível de espécie (GOSTINČAR et al., 2010)
Figura 1 – Representação da região do DNAr com Espaçador Interno Transcrito
Legenda: 18S e 28S RNAs ribossomais codificados pelo gene rDNA; região ITS= espaçador interno transcrito; oligonucleotídeo iniciador= fragmento curto de ácidos nucléicos. Fonte: Embasado em Kasai et al. (2006)
A filogenia pode esclarecer o papel do micro-organismo em uma determinada
posição e sua função em uma comunidade. As comunidades são mais próximas
filogeneticamente, essa característica permite a sobrevivência dos organismos em
um mesmo habitat (MAHERALI; KLIRONOMOS, 2012).
A caracterização molecular deve ser avaliada seguidamente às semelhanças
fenotípicas. Essas características gênicas são dadas por meio do sequenciamento
dos genes ribossomais em comparação a base de dados do GenBank ou bancos de
dados privados (STERFLINGER; PRILLINGER, 2001; DE HOOG et al., 2006;
REVANKAR; SUTTON, 2010). Podem ser ainda verificados além das regiões ITS, os
domínios D1/D2, β-tubulina, actina, calmodulina, superóxido dismutase de
manganês, subunidade ATPase 6 e quitina-sintase (ZENG, 2007; SEYEDMOUSAVI,
et al., 2014).
Como auxílio na identificação molecular e filogenética, as análises de reação
em cadeia da polimerase (PCR) são de grande importância, pois o uso de
oligonucleotídeos específicos aumentam a sensibilidade da reação. Possibilitando
também a comparação com os bancos de dados e posterior classificação
filogenética (FUNGARO, 2000).
O sequenciamento da região ITS do DNAr (ácido desoxirribonucleico
ribossômico) tem sido amplamente utilizado em estudos de diversidade e filogenia
de fungos (CALIRGIONE et al., 2005; VOGLMAYR, H. et al., 2011; FIGEL et al.,
22
2013). ZENG (2007) por exemplo, apresenta dados referentes à confiabilidade da
amplificação da região ITS para identificação de espécies de Exophiala, sem
necessidade da amplificação de outras regiões. Também, Caligiorne et al. (2005)
descrevem a eficiência das regiões ITS para a identificação de espécies de
leveduras negras e a formação da árvore filogenética, desde que pertençam a um
mesmo Clado. Afirmam ainda que o sequenciamento de genes do DNAr são
indispensáveis para o reconhecimento de espécies de leveduras negras causadoras
de doenças humanas. Isto porque várias espécies possuem polimorfismos intra-
específicos no domínio ITS, reconhecendo diferentes variantes de virulência.
Para avaliar a proximidade filogenética de fungos é utilizado um cálculo de
distância média filogenética taxon (MNTD- mean nearest phylogenetic taxon
distance), quanto menor o MNTD, mais próximos são filogeneticamente (VAMOSI, et
al., 2009).
Estudo realizado por De Hoog et al. (2013) com novas espécies de leveduras
negras demonstrou que uma grande parte das amostras analisadas oriundas de
fontes ambientais fazem parte de um clado com potencial oportunista. Estas
linhagens clínicas podem possuir a mesma constituição genética que seus
homólogos ambientais de mesma espécie. Espécies Cladophialophora psammophila
foram isoladas de solo poluído e demonstra crescimento em tolueno enquanto C.
bantiana é um patógeno humano responsável pela encefalite fatal. Estes fungos são
bem próximos filogeneticamente, mas possuem grande diferença na atividade
biológica (BADALI, 2008; BLASI et al., 2016).
No Brasil, espécimes isoladas de madeira tratada com creosoto e de ambientes
poluídos por hidrocarbonetos foram identificadas por meio de análise molecular
realizada com DNAr. Foram usados os oligonucleotídeos V9G e LS266 para a
amplificação e para sequenciamento os iniciadores ITS1 e ITS4, mostrando que
pertenciam à mesma ordem de agentes etiológicos conhecidos; mas as espécies
ainda não eram descritas pela literatura (VICENTE et al., 2008). Esses autores
relatam ainda que é possível distinguir as categorias de organismos oportunistas,
indicando diferenças na patogenicidade e virulência por intermédio de técnicas
moleculares (VICENTE et al., 2008). Voglmayr et al. (2011) utilizaram a análise
molecular para verificar a diversidade de fungos melanizados simbiontes a formigas,
por meio das regiões ITS1-5,8S-ITS2, com iniciadores V9G, e outras análises
23
complementares. O estudo demonstrou a importância das relações ecológicas que
ocorrem em habitats pouco conhecidos.
3.4 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA LACASE
A lacase é uma polifenol oxidase (p-difenol oxidase EC 1.10.3.2), que pode
ser definida como uma óxido-redutase capaz de oxidar polifenóis (EAWAG, 2003), e
uma ampla gama de compostos, tendo como aceptor terminal de elétrons o oxigênio
molecular (MAYER; STAPLES, 2002).
As enzimas lignolíticas são capazes de degradar os hidrocarbonetos por meio
da oxidação do substrato, formando um radical catiônico. (SILVA et al., 2004;
HARITASH; KAUSHIK, 2009). As lacases oxidam fenóis e estruturas
lignolíticas formando radicais passíveis de repolimerização ou despolimerização
(THURSTON, 1994; LEONOWICZ et al., 1999). O complexo enzimático que degrada
lignina se mostra eficiente na degradação de diversos poluentes orgânicos, bem
como compostos aromáticos fenólicos e não fenólicos (DURÁN et al., 2002; SILVA
et al., 2004).
Estudos evidenciam a importância da lacase em fungos melanizados (FENG,
et al., 2012; SUN. et al., 2012; DO NASCIMENTO et al., 2016). As fenoloxidases são
enzimas envolvidas com a atividade do metabolismo secundário dos fungos
filamentosos (DURAN; ESPOSITO, 2000). Dentre elas, as tirosinases, peroxidades,
catalases e lacases são comumente associadas à síntese de melaninas pela união
das moléculas de 1,8-di-hidroxinaftaleno (DHN) ao final da via de DHN melanina,
quando ocorre a união de moléculas de 1,8-DHN para formar o polímero melanina
(BUTLER; DAY, 1998; YURLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008).
No caso das eumelaninas produzidas por alguns basidiomicetos é possível
prever que esses polímeros são formados nas reações de oxidação da catecolamina
por intermédio de uma lacase (WILLIAMSON; WAKAMATSU; ITO, 1998). Plonka e
Grabacka (2006) revisaram sobre a biossíntese de melanina do ponto de vista
biotecnológico e biomédico. Eles reconheceram que o fungo patogênico
Cryptococcus neoformans produz melanina a partir de precursores de tirosina,
DOPA (dihidroxifelilalanina) e catecolaminas. A lacase é expressa localizando-se na
camada externa da parede celular, assim como a melanina. Isto protege o
organismo contra toxinas e outros fatores adversos o qual a melanina neutraliza.
24
3.5 DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POR FUNGOS MELANIZADOS
Os hidrocarbonetos são compostos formados por carbono e hidrogênio,
encontrado no ambiente e originados a partir de processos biogênicos e geológicos
(ATLAS, 1981). Esses compostos podem apresentar diversas composições e formas
estruturais, sendo simples como alcanos, até formas mais complexas como
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PHAs - Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)
(SILVA et al., 2004; ANDRADE; AUGUSTO; JARDIN, 2013).
Os hidrocarbonetos aromáticos podem apresentar-se como sólidos incolores,
branco, amarelo pálido, possuem baixa solubilidade em água e elevado ponto de
fusão e ebulição. O aumento do peso molecular dos hidrocarbonetos diminui a
solubilização em água, sendo assim, a fração mais leve é também a mais solúvel.
(PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG, 2006). Em geral os
hidrocarbonetos aromáticos são considerados tóxicos, mutagênicos e
carcinogênicos (CHEN; LIAO, 2006). São considerados importantes contaminantes
de solos, originando-se a partir de incêndios florestais, de petróleo e exsudatos de
árvores, queima de combustíveis fósseis, alcatrão de carvão, madeira, óleo usado,
filtros de óleo lubrificante e indústrias químicas. Principalmente em fábricas
produtoras de estireno, onde as contenções realizadas não são adequadas (WILD;
JONES, 1995; FERNANDES et al., 2002; HARITASH; KAUSHIK, 2009).
Os hidrocarbonetos aromáticos de origem petrolífera de maior importância
ambiental compõe um grupo chamado BTX, formado por benzeno, tolueno e os
isômeros de xileno (Tabela 1) (MUKHERJEE; BORDOLOI, 2012).
25
Tabela 1 – Propriedades físico-químicas de hidrocarbonetos monoaromáticos BTX
Legenda: 1 Peso molecular(g.mol-1); 2 densidade (g.cm-3); 3 Solubilidade(mg.L-1) Fonte: Adaptada de El-Nass; Acio e El Telib (2014).
Os compostos orgânicos monoaromáticos possuem frações solúveis em
água, o que provoca grande impacto ambiental marinho, além de alta volatilidade,
gerando um índice elevado destes compostos na atmosfera (NAKHLA, 2003; EL-
NASS; ACIO; EL TELIB, 2014; FERRARI-LIMA et al., 2015).
Haritash e Kaushik (2009) incluem bactérias, fungos ou algas como micro-
organismos que apresentem potencial de degradação de hidrocarbonetos.
Substâncias aromáticas transportadas com poeiras para superfícies rochosas
fornecem fonte de carbono para fungos (STERFLINGER; PRILLINGER, 2001).
Para que ocorra a biodegradação de hidrocarbonetos alguns fatores são
relevantes tanto para fungos quanto para bactérias, como pH, temperatura,
disponibilidade de oxigênio e de nutrientes, estrutura química do composto a ser
degradado, entre outros (HARITASH; KAUSHIK, 2009). El Nass; Acio e El Telib
(2014) citam que o crescimento celular de bactérias/fungos na presença de BTX é
aumentado em uma faixa de temperatura de 7-33°C e o pH em uma faixa entre 6,5 a
8, estes valores são dependentes do micro-organismo responsável pela degradação
destes hidrocarbonetos.
Lima, Oliveira e Cruz (2011) verificaram que os fungos são eficientes na
degradação de frações de compostos saturados e aromáticos e que o uso destes
em áreas de atividades petrolíferas é uma alternativa bastante promissora para
biorremediação.
Conforme Prenafeta-Boldú, Summerbell e De Hoog (2006), os fungos são
envolvidos na degradação de hidrocarbonetos de formas distintas, sendo elas: a
Nomenclatura Benzeno Tolueno o-Xileno m-Xileno p-Xileno
Fórmula
MolecularC6H6 C7H8 C8H10 C8H10 C8H10
Peso Molecular1 78,11 92,13 106,16 106,16 106,16
Densidade2 0,87 0,87 0,88 0,87 0,86
Solubilidade3 1,791 0,535 0,175 0,146 0,156
Fórmula
Estrutural
26
reação de transformação parcial, a degradação total na presença de um segundo
substrato compatível e, também por meio da utilização de hidrocarbonetos como a
única fonte de carbono disponível. Porém a forma mais eficiente de degradação é
por meio da assimilação direta de hidrocarboneto como única fonte de carbono e
energia.
A biodegradação por meio do uso de micro-organismos se mostra mais
eficiente para a remoção de hidrocarbonetos aromáticos presentes no meio
ambiente devido ao custo-eficiência em relação a outras formas de remoção
(HESHAM et al., 2009).
A assimilação de hidrocarbonetos por fungos, principalmente os filamentosos,
ainda é pouco estudada. Esse fato pode ser explicado devido à dificuldade de
adaptação e baixa velocidade de crescimento dos fungos em meio líquido.
(PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG, 2006).
Fungos do gênero Exophiala são conhecidos como degradadores de diversas
classes de xenobióticos orgânicos, assimilando grande variedade de compostos
aromáticos e hidrocarbonetos (ISOLA et al., 2013).
Cox et al. (1993) utilizaram a levedura negra Exophiala jeanselmei em um
biofiltro para tratamento de atmosfera contendo estireno, pelo fato de a mesma
crescer em na presença de hidrocarbonetos aromáticos. Os autores também
verificaram que fungos com capacidade de assimilar estireno se mostram adaptáveis
a condições adversas, principalmente se comparados a bactérias.
Diferentes gêneros de fungos tem sido descrito pela literatura como potenciais
assimiladores de hidrocarbonetos. Na Tabela 2 estão exemplificados alguns destes.
27
Tabela 2 – Gêneros de fungos que apresentam potencial de assimilação de hidrocarbonetos
Gêneros Hidrocarboneto Referência
Penicillium HA Chaîneau et al. 1999
Gongronella HA Chaîneau et al. 1999
Aspergillus HA Chaîneau et al. 1999
Trichoderma HA, HPA, X Potin, Vignie e Rafin (2004); Zafra et al. (2015)
Fusarium HPA Verdin et al. (2005)
Cladosporium HA, T, HPA Prenafeta Boldú et al. (2001); Nikolova; Nenov (2005)
Beauveria HA Chaîneau et al. 1999 Mucor HPA Potin, Vignie e Rafin (2004) Coniothyrium. HPA Potin, Vignie e Rafin (2004) Doratomyces HPA Potin, Vignie e Rafin (2004) Phialophora HPA Zhao, Zeng e De Hoog (2010) Sphaeropsis HPA Potin, Vignie e Rafin (2004) Stachybotrys HPA Potin, Vignie e Rafin (2004)
Cladophialophora BTEX Prenafeta Boldú et al. (2001) Exophialla T De Hoog et al. (2006) Paecilomyces T Estevez, Veiga e Kennes (2005)
Legenda: HA= Hidrocarbonetos aromáticos; HPA= hidrocarbonetos aromáticos policíclicos; B= benzeno; T= tolueno; E= etilbenzeno; X= xileno
3.6 BIOSURFACTANTES
Os compostos tensoativos possuem a capacidade de reduzir a tensão
superficial e interfacial de sólidos, líquidos e gases, permitindo a dispersão destes,
sob a forma de emulsões. Grande parte dos surfactantes utilizados na atualidade
são de origem sintética e ambientalmente tóxicos. Este fato tem despertado o
interesse pela produção de surfactantes de origem biológica (BANAT et al., 2000).
Os biossurfactantes são compostos anfifílicos de origem microbiana que
possuem baixa toxicidade. São eficientes em diversas temperaturas e faixas de pH,
biodegradáveis e têm ampla aplicação (SINGH; VAN HAMME; WARD, 2007; BANAT
et al., 2010). Estes compostos são utilizados nas mais distintas áreas, como
indústrias petroquímicas, agroquímicos, alimentos e bebidas e tem gerado grande
interesse biotecnológico, pois apresentam diversas funções, tais como: de
emulsificação, molhantes e detergentes de petróleo. São ainda, capazes de
aumentar a solubilidade, a mobilidade, a biodisponibilidade e, portanto a
28
biodegradação de compostos orgânicos hidrofóbicos (SINGH; VAN HAMME; WARD,
2007).
De acordo com Gutnick e Rosenberg (1977) um dos fatores que dificultam a
degradação do petróleo por micro-organismos é a insolubilidade deste composto em
meio aquoso. Esses autores destacaram três características necessárias a um
micro-organismo para degradar hidrocarbonetos: a) Sistema de absorção de
hidrocarbonetos, por meio de sítios específicos de ligação e/ou propriedades
emulsificantes que contribuam para o transporte do hidrocarboneto ao interior da
célula; b) Enzimas oxigenases específicas; c) Resposta positiva do organismo aos
hidrocarbonetos presentes no petróleo.
A produção de biossurfactantes ainda é limitada, devido principalmente ao
alto custo de produção. A otimização das condições de cultivo e de metodologias de
produção, bem como a obtenção de linhagens recombinantes podem tornar a
produção mais rentável e viável economicamente (BANAT et al., 2010).
29
4 METODOLOGIA
Neste item são descritos os procedimentos e metodologias definidas para
caracterização fisiológica de fungos melanizados, bem como a identificação
molecular dos selecionados pelo potencial de assimilação de hidrocarbonetos. A
composição de alguns meios de cultivo, reagentes e descrição de protocolos foram
disponibilizados em Apêndice ou Anexos. Todos os experimentos foram realizados
nos laboratórios de Microbiologia e de Biologia Molecular do Núcleo Biotecnológico
da Universidade do Oeste de Santa Catarina, Videira-SC. Também foi realizado
estágio no Laboratório de Microbiologia Molecular do Departamento de
Microbiologia, Parasitologia e Patologia da Universidade Federal do Paraná, ligado
ao Grupo de Pesquisas em fungos melanizados sob supervisão da Profa. Dra. Vânia
Aparecida Vicente visando ao aperfeiçoamento de técnicas de isolamento,
amplificação da região específica e identificação molecular.
4.1 MATERIAIS AMOSTRADOS PARA OBTENÇÃO DE ISOLADOS
As amostras foram coletadas no município de Videira – SC. Oriundas de
oficinas mecânicas, postos de gasolina e “ferro velho”, consistiram de peças e locais
poluídos por hidrocarbonetos conforme pode ser observado na Tabela 3.
30
Tabela 3 – Amostras utilizadas para o isolamento de fungos melanizados locais com potencial de assimilação de hidrocarbonetos.
Ambiente1 Amostras2 Quantidade4 de Amostras
Oficina Mecânica A
Peças com sujidades3 (4), estopa(1), filtro de gasolina (1), filtro de óleo (1), piso (1), e serragem poluída (1).
9
Oficina Mecânica B Filtros de gasolina (3) e estopa (2).
4
Posto de Combustível A Bico ejetor de gasolina (2) e óleo diesel (1) e estopa (2).
5
Posto de Combustível B Bico ejetor de gasolina (2) e óleo diesel(1), estopa(1), peça com sujidades(1).
5
Escola Técnica Laboratório de mecânica (1). 1
Ferro Velho Estopa (2), madeira com óleo diesel(1), peça com sujidades(1), piso(1) e solo(2).
7
Total 31 Legenda: 1- Origem das amostras coletadas; 2- Entre parênteses o número de
unidades de amostra coletada; 3- as amostras com sujidades eram compostas por
ferramentas ou peças quebradas dispostas ao ambiente, tanto interno quanto
externo. 4- O número total de amostras de cada ambiente e a
quantidade final de amostras obtidas
4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS MELANIZADOS
Para o isolamento de fungos melanizados potencialmente degradadores de
hidrocarbonetos foram utilizadas duas metodologias: 1) Técnica de flotação em óleo
mineral (IWATSU et al., 1981); 2) Semeadura direta em placas de ágar mycosel com
swab.
Todos os isolados de fungos foram fotografados (Sony DSC-W310, China)
após crescimento em placas de ágar. Os isolados também foram, após técnica de
microcultivo em lâmina, fotografados para observação de estrutura miceliar com
captura de imagens usando o programa Bel View (Bel Photonics do Brasil LTDA).
Para tal, utilizou-se microscópio Bioval, L2000A (Bioval, Brasil) com objetivas de 40x
(0,70, retrátil), 100x (1,25 retrátil de imersão) e oculares 10x (18mmØ). Para melhor
distribuição e observação das estruturas microscópica de cada isolado, adicionou-se
31
uma gota da solução de lactofenol (Apêndice 1), cobrindo-se o material com
lamínula.
4.2.1 Técnica de Flotação em Óleo Mineral
A metodologia utilizada foi a estabelecida por Iwatsu et al. (1981), adaptada
por Vicente et al. (2001, 2008). A técnica consiste no isolamento de fungos pela
flotação em óleo mineral. Para tal, foram utilizados erlenmeyers de 250mL contendo
100mL solução salina 0,85%, e antibióticos nas seguintes concentrações finais:
200U/L de penicilina, 200µg/L de cloranfenicol, 200µg/L de estreptomicina e 500µg/L
de canamicina (Apêndice 1). Foram adicionadas à solução salina 20g das amostras
com possibilidade de fracionamento (solos,estopas, serragem, etc) para as demais
(bombas de gasolina, peças de uso contínuo, etc) foi utilizado apenas o swab de
superfície e o caldo. A suspensão foi homogeneizada e incubada por 30 minutos à
temperatura ambiente. Após esse período, 200 mL de óleo mineral foram
adicionados a cada erlenmeyer, permanecendo sob agitação por 5 minutos.
Após este processo as amostras permaneceram em repouso por 20 minutos,
havendo assim a separação das fases. Em seguida alíquotas de 150 µL da interfase
óleo-água foram inoculadas em meio Mycosel com antibióticos (Apêndice 1). Essas
alíquotas foram retiradas de cinco pontos distintos: quatro pontos nas extremidades
e um no centro, originando cinco placas de ágar para cada amostra. O inóculo foi
distribuído na superfície do meio sólido com auxílio da alça de Drigalski. As placas
foram incubadas a 28°C até o surgimento de colônias de coloração escura. As
colônias características foram transferidas para outra placa contendo meio Mycosel,
para o isolamento da cultura.
4.2.2 Técnica de Inóculo Direto
Swabs foram coletados de pontos poluídos por hidrocarbonetos, sendo em
seguida semeados em meio Mycosel com antibióticos, por meio da técnica de
estrias. Assim como no método anterior as colônias com características de leveduras
negras foram transferidas para meio Mycosel para a seleção de colônias típicas.
A partir das culturas obtidas com o uso de ambos os métodos, uma colônia foi
inoculada em solução salina e diluições decimais seriadas foram realizadas com os
32
respectivos inóculos em ágar de sabouraud com 200µg/L de cloranfenicol. Uma
colônia foi selecionada e transferida para outra placa ágar Sabouraud com
cloranfenicol.
4.2.3 Manutenção das culturas
Para manutenção e crescimento das culturas de fungos foram utilizados os
meios ágar extrato de malte (MEA 2%) e ágar Sabouraud (Neogen, Brasil)
preparado e esterilizado conforme recomendações do fabricante (Apêndice 1). Para
preservar as culturas todos os isolados crescidos em ágar inclinados MEA 2% em
tubos completados com óleo mineral estéril e vedados com tampa rosca e teflon.
Mantidas em temperatura ambiente ao abrigo de luz.
4.4 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS NA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO
4.4.1 Teste de Hidrofobicidade
O método foi realizado com base na metodologia de Satow et al. (2008).
Esporos de 1cm2 de micélio foram inoculados em 5 mL de água destilada. Após
breve agitação os esporos foram contados estabelecendo a concentração de
esporos/mL da solução (CES), formando a fase aquosa do experimento. Foi
adicionado 1 mL de óleo mineral aos 5mL da solução com suspensão celular de
concentração conhecida (CES). Em seguida essa mistura passou por agitação
durante 30 seg. em vórtex, e permaneceram em repouso por 2 min, para a completa
separação das fases. Uma alíquota da fase aquosa (CES) foi removida para
contagem em câmara de Neubauer espelhada (New Optic). Foram realizadas cinco
repetições independentes.
Valores acima de 50% da contagem inicial na fase aquosa foram
consideradas hidrofílicas e as culturas que apresentaram valores abaixo de 50% da
contagem inicial foram consideradas hidrofóbicas. Portanto, pode-se dizer que:
CES < 50% = Hidrofóbica
CES > 50% = Hidrofílica
33
4.4.2 Teste de Tolerância ao Cloreto de Sódio
Os isolados foram crescidos em ágar MEA 2% durante 7 dias/28°C. Após
esse período, um círculo de 2 mm foi retirado e inoculado centralmente em ágar
MEA 2%, nas concentrações de 0%, 2,5%, 5%, 7,5% e 10% de cloreto de sódio.
Foram realizados dois testes independentes em duplicata. As análises foram
realizadas por meio da verificação do diâmetro da cultura, em centímetros, após sete
dias de crescimento à 28°C (STERFLINGER, 1998).
4.4.3 Teste de Tolerância ao potencial Hidrogeniônico
Para este teste o meio de cultura utilizado foi ágar MEA 2% com pH 4,0-9,0
com intervalos de 1,0. O pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
Foi inoculado em cada placa um círculo de 2 mm da cultura crescida durante sete
dias em ágar MEA 2%. O teste foi realizado em duplicata com repetição. As análises
foram realizadas por meio da verificação do diâmetro da cultura, em centímetros,
após sete dias de crescimento à 28°C (STERFLINGER, 1998).
4.4.4 Teste de Tolerância à Temperatura
Os isolados foram crescidos em meio de cultura ágar MEA 2% nas
temperaturas de 25°C, 28°C, 30°C, 35°C e 37°C. Foi inoculado, centralmente, em
cada placa de ágar um círculo de 2mm da cultura crescida durante sete dias em
ágar MEA 2%. O teste foi realizado em duplicata com repetição. As análises foram
realizadas por meio da verificação do diâmetro, em centímetros, da cultura após sete
dias de crescimento nas diferentes temperaturas (STERFLINGER, 1998).
4.4.5 Atividade Enzimática de Lacase
A atividade qualitativa de lacase foi avaliada a partir da metodologia descrita
por Soden et al. (2002). A partir de culturas crescidas por 7 dias a 28ºC em MEA
2%, amostras de 2mm de diâmetro de cada isolado foram inoculadas centralmente
em placas de ágar Sabouraud contendo 2,2'-azino-bis 3-etilbenzotiazolina-6-
34
sulfónico ácido) (ABTS), pH 5,0. A atividade foi medida pela intensidade da cor
produzida pelo halo de coloração formada.
A escala de intensidade de cor utilizada para expressar os resultados foi: 0 =
negativo, qualquer coloração (sem Atividade ABTS-oxidante); 1 = baixa; 2 =
moderada e 3 = alta coloração. O teste foi realizado em duplicata com repetição.
A partir dos isolados que apresentaram atividade enzimática seguiu-se
metodologia de Bourbonnais, Leech e Paice (1998), a qual consiste na determinação
da atividade de lacase por oxidação de ABTS. Amostras de micélio de 10 mm de
diâmetro obtidos de cultivo em MEA 2% foram adicionadas em meio líquido extrato
de malte a 2% por 7 dias /28ºC sob agitação orbital (100 RPM). Alíquotas de 100 µL
foram retiradas a cada 24 horas para tubos contendo: 800 µL de uma solução
aquosa de 0,003% de ABTS e 100 µL de tampão acetato de sódio em concentração
de 0,1 mol.L-1, em pH 5,0. O ABTS possui um coeficiente de extinção molar (ε) a
420nm de 3,6.104mol.L-1.cm-1. A oxidação de ABTS foi determinada após 1 min da
reação em temperatura ambiente e a leitura realizada em espectrofotômetro UV3000
Pró Análise Vis (λ, 420 nm) . A atividade enzimática foi expressa em unidades por
litro, onde uma unidade de lacase representa a quantidade de enzima que oxida
1µmol de substrato por minuto. Para calcular a atividade enzimática, utilizou-se a
fórmula descrita por Aguiar Filho (2008):
U.L-1= Δabs .106
ε.fdil.t
Onde:
ΔAbs= Absorbância medida no espectrofotômetro
ε= coeficiente de extinção molar (M-1 cm -1)
fdil= fator de diluição
t= tempo da reação em minutos
106= conversão de µL para L
4.4.6 Determinação do Índice de Emulsificação (E24)
Após crescimento das culturas durante 7 dias em meio líquido extrato de
malte 2% as culturas foram avaliadas em relação a capacidade de emulsificação.
35
As culturas foram centrifugadas (CT-0307 PARSEC) a 1100xg por 5 min. Dois
mililitros do sobrenadante livre de células foram adicionados a um tubo de ensaio
com fundo chato acrescido de 2 mL de óleo diesel, agitando-se vigorosamente em
vórtex durante 2 min (IQBAL et al., 1995). As amostras foram deixadas em repouso
durante 24h e o índice de emulsificação foi calculado pela fórmula:
E24= he.100
ht
Onde:
E24 = Emulsão após 24 horas
he = Altura da camada de emulsão formada
ht = Altura total
4.4.7 Ensaio de Degradação de Hidrocarboneto
O teste de degradação de hidrocarboneto foi realizado a partir da biomassa
fúngica produzida para cada isolado. Para desenvolvimento dessa análise os
isolados foram crescidos em meio MEA 2% durante sete dias. Posteriormente foi
realizada a raspagem de aproximadamente 2 cm2 do micélio com o auxílio de uma
lâmina estéril. Os esporos foram inoculados em meio mineral - MM, composto por
5g/L NaCl, 1g/L K2HPO4, 1g/L (NH4)SO4, 0,2g/L MgSO4.7 H2O, 3g/L KNO3,sem
presença de carbono durante sete dias para esgotamento de nutrientes. Após esse
período os inóculos foram preparados utilizando o MM com a suspensão de esporos,
ajustadando-se com o auxílio de câmara de Neubauer, uma concentração de 1,00
x106 esporos.mL-1. O experimento foi realizado em erlenmeyers de 25mL, com
volume final de 10mL. Foram estabelecidos 7 ensaios, sendo:
36
Tabela 4 – Descrição dos cultivos utilizados nos ensaios de degradação de hidrocarbonetos
Composição dos cultivos
Grupos de Ensaios2/ Quantidade (mL)
C- C+ Benzeno Tolueno Xileno Gasolina Diesel
Suspensão de esporos (1,0 x106 esporos.mL-1) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
MM1 9,0 - 8,9 8,9 8,9 8,9 8,9
MM glicosado (3%) - 9,0 - - - - -
Benzeno - - 0,1 - - - -
Tolueno - - - 0,1 - - -
Xileno - - - - 0,1 - -
Gasolina - - - - - 0,1 -
Diesel - - - - - - 0,1
Total (mL) 10 10 10 10 10 10 10 Legenda: 1- Meio mineral; C-= MM sem carbono; C+= MM com glicose; Benzeno= MM com 1% de benzeno; Tolueno= MM com1% de tolueno; Xileno= MM com 1% de xileno; Gasolina= MM com 1% de gasolina; Diesel= MM com 1% de diesel.
Os erlenmeyers foram fechados com papel alumínio e incubados em
dessecadores sob agitação orbital constante de 100 rpm à 28°C, pelo período de
dez dias.
Foram utilizados 7 dessecadores, sendo um para cada ensaio (C-,C+,
benzeno, tolueno, xileno, gasolina e diesel), evitando trocas gasosas entre os
experimentos. As culturas foram então coletadas e filtradas em membranas (Milipore
Ø0,47µm) previamente pesadas e secas à 110ºC, até atingir valor de massa
constante. A massa seca foi calculada utilizando o peso final da membrana após a
filtração, diminuído do peso inicial da membrana.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a obtenção dos dados estatísticos foi utilizado o programa Statistica
(StatSoft South America) e Microsoft office excel 2007®. A análise de variância
(ANOVA ao nível de significância de 5%,) e as médias comparadas pelo teste de
Tukey foram aplicadas quando necessário.
37
4.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA
4.6.1 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada utilizando o Ultra Clean® Microbial DNA
Isolation Kit (MO BIO, laboratories Inc. EUA)1, com alterações na metodologia,
conforme descritas a seguir:
Os isolados foram cultivados em MEA, e após 5 dias foi realizada a raspagem
de aproximadamente 2cm2 de micélio com o auxilio de uma lâmina estéril. O micélio
foi adicionado a um tubo de 2mL contendo 300µL da solução MicroBead e 50µL da
solução MD1. Em seguida o tubo foi agitado horizontalmente por 2 minutos em
vórtex e 2 minutos em banho-maria à 65ºC, alternadamente durante 10 minutos.
Após centrifugação o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5mL e
acrescido 100 µL da solução MD2 e agitado em vórtex. Posteriormente permaneceu
por 10 minutos a 4ºC, centrifugando-se e adicionado-se ao sobrenadante 900µL da
solução MD3. Após agitação, 600µL desta solução foram transferidos para o Spin
Filter e centrifugados, sendo necessário repetir o último passo. Em seguida, o filtro
foi lavado com 300µL da solução MD4. Após a remoção total da solução MD4, o
filtro foi transferido para um novo tubo de 1,5mL. Foram adicionados 50µL de água
ultrapura (miliQ) no centro da membrana filtrante, para eluição do DNA. Após a
centrifugação o DNA foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1,0% em
tampão TBE (Tris base, ácido bórico e EDTA, formulação em Anexo) 0,5X,
adicionado de brometo de etídeo (0,5 µg.mL-1). A integridade do DNA presente na
amostra foi verificada utilizando o sistema de transiluminador UV(VilbertLourmat,
França) e captura de imagem com o programa Photo Capt 12.4 Windows.
4.6.2 Amplificação da Região ITS – Internal Transcribed Spacer
Após a verificação da integridade do DNA, os fragmentos foram sequenciados
a partir de ambas extremidades, direto (forward) V9G
(5'TTACGTCCCTGCCCTTTGTA3') e inverso LS266
1 Zhao et al. (2010) utilizaram o mesmo protocolo determinado pelo Ultra Clean® Microbial
DNA Isolation Kit. No Anexo 1 está o protocolo original.
38
(5'GCATTCCCAAACAACTCGACTC3') (FIGEL et al. 2013). As reações foram
elaboradas conforme a Tabela 5.
Tabela 5 – Produtos utilizados para as reações de amplificação dos isolados fúngicos.
Produto Volume (µL) Concentração
Água ultrapura (miliQ) 14,05 -
Tampão (PBS) 2,50 10x
MgCl2 0,75 50mM
dNTP's 2,00 2,5mM
Primer V9G 1,00 10 pmol
Primer LS266 1,00 10 pmol
Taq polimerase 0,20 1U.mL-1
DMSO 1,50 -
DNA 2,00 50ng Legenda: A reação foi realizada com volume total de 25µL.1. Reagentes Ludwig Biotecnologia LTDA.
As condições para a amplificação em termociclador B960 Gene Mate Series
(China) da região ITS para os isolados foi realizada segundo o programa: 94°C
durante dois minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C
durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto e por fim 72°C durante 3 minutos.
O produto obtido da amplificação foi visualizado por eletroforese em gel de
agarose 1% conforme descrito no item 4.5.
A purificação foi realizada de acordo com Sambrook e Russel (2001), com
pequenas adaptações. Em um tubo de 0,5mL foi adicionado 40µL do produto da
PCR, 60µL de águra ultrapura, 20 µL de acetato de amônio (10mol.L-1) e 250 µL de
etanol absoluto. Após o período de 30 min a 4°C foi realizada a centrifugação por 15
min. Em seguida o sobrenadante foi descartado e após duas lavagens com etanol
70%, o produto foi ressuspenso em água ultrapura. O produto da reação foi
verificado em gel de agarose conforme descrito no item 4.7.1.
4.6.3 Sequenciamento e Análise Filogenética
As sequências foram obtidas com o sequenciador ABI-PRIM 3100 usando o
protocolo padrão do Laboratório ACTGene Análises Moleculares (Centro de
Biotecnologia, UFRGS, Brasil), para isto foram utilizados os oligonucleotídeos V9G e
LS266 conforme descrito no item 4.7.2.
39
Para a elucidação taxonômica e filogenética as sequências resultantes foram
comparadas a linhagens depositadas no GenBank (submissão direta), banco de
dados do NCBI2, bem como linhagens de referência de gêneros Cladosporium e
Exophiala incluídas na base de dados do CBS - Centraalbureau voor
Schimmelcultures 3. As sequências obtidas foram alinhadas utilizando o programa
Clustal W (LARKIN et al., 2007). Análise evolutiva, filogenética e molecular foram
conduzidas usando o MEGA VERSÃO 7 (KUMAR; STECHER; TAMURA, 2016), a
partir dos isolados identificados e linhagens com similaridade de no mínimo 97%.
2 NCBI - National Center for Biotechonology Information. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov>.
3 CBS - Fungal Biodiversity Centre (Holanda), instituto de referência internacional sobre
fungos melanizados.
40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS MELANIZADOS
De acordo com os resultados obtidos nesta pesquisa, as metodologias de
isolamento, por flotação em óleo mineral ou por inóculo direto em ágar mycosel
mostraram-se adequadas na obtenção de fungos melanizados. Conforme a Tabela
7, a partir de 31 amostras coletadas de ambientes poluídos por gasolina e/ou óleo
diesel, foram obtidos 22 isolados de fungos melanizados.
Tabela 6 – Número de isolados obtidos a partir de amostras poluídas por hidrocarbonetos.
Ambientes Amostras Método
Inóculo direto1
Flotação em óleo2
Oficina Mecânica 1 Peças com sujidades 1 3
Estopa 0 0
Filtro de gasolina 0 0
Filtro de óleo 0 1
Piso 1 1
Serragem contaminada 0 0 Oficina Mecânica 2 Filtro de gasolina 0 0
Estopa 0 0 Posto de
Combustível 1 Bico ejetor-gasolina 1 1
Bico ejetor - óleo diesel 1 1
Estopa 0 0 Posto de
Combustível 2 Bico ejetor - gasolina 0 1
Bico ejetor - óleo diesel 0 0
Estopa 1 0 1
Peças com sujidades 0 1 Escola Técnica Laboratório de mecânica 1 0
Ferro Velho Estopa 0 2
Madeira 0 0
Material com sujidades 1 4
Piso 0 0
Solo 0 0
Total 6 16 1- Inóculo direto em ágar mycosel com antibióticos. 2- Metodologia segundo Vicente et al. (2001, 2008)
Entre os tipos de amostras obtidas dos diferentes ambientes poluídos por
hidrocarbonetos, as que mais resultaram em isolados de fungos foram: peças com
41
sujidades, estopas e bico ejetor de gasolina. Satow et al. (2008) obteve pela técnica
de flotação em óleo mineral, 107 isolados a partir de 3 amostras de solo oriundas de
uma área de landfarming de petróleo. Utilizando outra técnica de isolamento,
Prenafeta-Boldú (2001) também obteve sucesso em relação ao isolamento de
fungos assimiladores de hidrocarbonetos. No entanto, apenas os fungos que eram
originalmente obtidos de locais poluídos por BTEX (Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e
Xileno) demonstraram capacidade de assimilar hidrocarbonetos. Portanto, a
presença de hidrocarbonetos no ambiente pode ter sido o fator determinante para o
isolamento das leveduras negras com potencial de biorremediar áreas degradadas
por hidrocarbonetos.
Todos os isolados foram caracterizados macroscopicamente como colônias
com coloração de fundo negra (placas de ágar), castanha ou verde-oliva. E,
microscopicamente, pela presença de hifas ou pseudo-hifas de coloração castanha
escura (Fotografia 1).
42
Fotografia 1 – Macroscopia e microscopia de linhagens de Cladosporium sp. e Exophiala sp., cultivados em placas em ágar extrato de malte 2%
Legenda: Primeira coluna crescimento miceliar visualizado na parte frontal da placa de ágar, segunda coluna visualização do verso da placa de ágar; terceira coluna visualização por microscopia óptica (Bioval, Brasil) respectivas aos grupos A 40x, 100x B-E 40x, F 40x, 100x. = Grupo A: Cladosporium sp.; B: Exophiala sp.; C: Cladosporium halotolerans; D: Cladosporium sp.; E: Cladosporium halotolerans; F: Exophiala dermatitidis.
43
5.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS NA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO
5.2.1 Hidrofobicidade dos Isolados
Noventa e um por cento dos isolados (91%) demonstraram caráter
hidrofóbico, ou seja, com percentual de recuperação de esporos na fase aquosa
abaixo de 50%. Para os hidrofílicos (9%), o percentual foi abaixo de 50%. Segundo
Satow et al. (2008), isolados obtidos pela técnica de flotação em óleo não exclui a
possibilidade de isolar leveduras negras com caráter hidrofílico. No entanto, no
presente estudo, tendo em vista a composição do material em que foram obtidas, ou
seja, na presença de combustíveis (gasolina e diesel), esperava-se que a maioria
dos micro-organismos ali existentes fossem de origem hidrofóbica. Göttlich et al.
(1995) verificaram variação no caráter hidrofóbico entre Exophiala jeanselmei e
Exophiala dermatitidis. Logo, diferentes espécies de um mesmo gênero não
apresentam homogeneidade no caráter hidrofóbico, esse fator pode estar ligado à
ecologia distinta entre essas espécies.
O caráter hidrofóbico pode servir como facilitador na dispersão de esporos,
conforme observado anteriormente por Seyedmousavi (2014), para o gênero
Cladophialophora.
5.2.2 Tolerância ao Cloreto de Sódio
Para o parâmetro tolerância ao cloreto de sódio, todos os isolados tiveram
crescimento (medido a partir do tamanho da colônia em centímetros) sob diferentes
concentrações em meio de cultura. Nas concentrações de 2,5% e 5,0% o
crescimento médio foi mais evidente, embora não tenha havido diferença estatística
significativa (p<0,05) entre os mesmos. Contudo para as demais concentrações do
sal (7,5% e 10%) a diferença de crescimento entre os grupos foi significativa (Gráfico
1). De Hoog et al. (2004), observando linhagens de Fonsecaea em diferentes
concentrações de cloreto de sódio, verificaram crescimento nas concentrações de
2,5% e 5,0%. Entretanto, diferente do presente estudo em que dos 22 isolados
testados 19 cresceram na condição de 10%, os autores não observaram
crescimento de nenhuma das linhagens de Fonsecaea com 10% de cloreto de sódio
44
no meio. Conforme citado por Gunde-Cinerman, Ramos e Pelmenitas (2009)
estudos indicam que fungos com comportamento halofílico não necessariamente
requerem sal no meio, mas conseguem se adaptar bem em ambientes hipersalinos.
A existência de linhagens de fungos, particularmente leveduras, com crescimento
em concentrações moderadas a altas de cloreto de sódio, pode indicar uma
tolerância a íons tóxicos e certa capacidade de adaptação a ambientes inóspitos
(GOSTINCAR et al., 2011).
Sterflinger (1998) foi um dos primeiros pesquisadores a verificar a tolerância
a diferentes concentrações de NaCl por fungos melanizados isolados de rochas. O
estudo resultou que dos 16 isolados, 13 cresceram à 3,5%, 11 à 7%, 8 à 10,5%, 5 à
14%, 2 à 17,25%, 2 à 21% e apenas um isolado cresceu nos meios com
concentração de 24,5% e 27%. Mais recentemente, Kejzar et al. (2013) avaliaram a
integridade da parede celular da levedura negra Hortaea wernecki, isolada
naturalmente de ambientes hipersalinos, a partir da ação de inibidores de melanina
(46 e triciclazole). A liberação da melanina da superfície celular, expos o micro-
organismo aos efeitos danosos do meio com alta salinidade, o qual teve seu
crescimento reduzido à medida que a concentração de NaCl foi maior. Portanto, a
melanina tem ação protetora para H. wernecki. Isto demonstra que a presença da
melanina pode ser um fator determinante para a tolerância a diferentes
concentrações de NaCl em fungos melanizados.
45
Gráfico 1- Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados em ágar MEA 2% com diferentes porcentagens de cloreto de sódio
46
5.2.3 Tolerância ao Potencial Hidrogeniônico
O pH dos isolados foram testados nas faixas de 4 a 9 variando de 1,0. Em
todas as faixas de pH houve crescimento dos isolados, com exceção apenas de 2,
em pH 9,0. Portanto, para todos os demais, o pH não foi um fator inibidor de
crescimento mesmo considerando os extremos, faixas 4,0 e 9,0, uma vez que não
tiveram diferença estatisticamente significativa (Gráfico 2). Estevez; Veiga; Kennes,
(2005) avaliando as leveduras Paecilomyces vaiotii e Exophiala oligosperma,
verificaram crescimento viável e degradação de tolueno por ambas, em todas as
faixas de pH testadas (3,9-6,9 ±0,1), sendo que a melhor condição ficou em pH 5,9.
Esses estudos reforçam sobre a tolerância que os fungos em geral, e
particularmente as leveduras negras, tem em relação ao pH (KUTTY et al., 2013). O
crescimento de fungos em diversas faixas de pH é uma condição desejável,
principalmente para o uso destes em biofiltros (ESTEVEZ; VEIGA; KENNES, 2005).
47
Gráfico 2 – Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados em ágar MEA 2% em diferentes faixas de pH
48
5.2.4 Tolerância à Temperatura
No presente estudo, em relação à temperatura todos os isolados cresceram a
25ºC e 28ºC. Nas faixas de 35ºC e 37ºC cresceram 45,45% (n=10) e 31,81% (n=7)
respectivamente. A 30ºC a maioria dos isolados também apresentou crescimento
(90,91%). Entretanto, quatro tiveram a temperatura de 28ºC como ótima de
crescimento, apenas um isolado apresentou melhor crescimento em 37°C.Para os
demais isolados a temperatura ótima foi de 25ºC. Isto evidencia uma faixa média de
temperatura ótima em torno de 25ºC, uma vez que a 28ºC houve redução do
crescimento estatisticamente significante (p<0,05) (Gráfico 3).
Com base nos dados obtidos com os parâmetros anteriores, verifica-se que a
temperatura é a condição mais crítica para crescimento desses micro-organismos.
Muito embora possam crescer em condições diferentes, há claramente uma
temperatura ótima de desenvolvimento aqui estabelecida entre as testadas.
Há muito já se conhece sobre a tolerância de fungos a condições diferentes
de temperatura, mas faixas ótimas de crescimento podem ser definidas nos
diferentes grupos. Como por exemplo, já anteriormente avaliado por Sterflinger
(1998), no qual verificou o crescimento de 16 isolados de fungos melanizados sob as
temperaturas de 18,5ºC, 27ºC, 32ºC e 37ºC. Na temperatura de 18,5ºC todos os
isolados cresceram. No entanto, a 27ºC e a 32ºC houve crescimento para 13 e 7 dos
isolados, respectivamente, mas a 37ºC nenhum cresceu.Por outro lado temperaturas
extremas também tem sido reportadas para leveduras negras. Tesei et al. (2012;
2015) citam que a termotolerância é um importante fator relacionado à
patogenicidade do fungo. Relatam ainda o crescimento de leveduras negras sob
altas temperaturas, que não expressam proteínas protetoras, levantando à hipótese
de que um grupo diferenciado de proteínas podem estar presente nestes micro-
organismos. Esta suposição abre precedente para novos estudos relacionados a
esses micro-organismos, gerando grande interesse biotecnológico.
49
Gráfico 3 – Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados de fungos em ágar MEA 2% sob diferentes temperaturas
50
5.2.5 Atividade Enzimática de Lacase
A atividade de lacase foi inicialmente verificada de forma qualitativa, por meio
da coloração esverdeada no meio, produzida pela oxidadação de ABTS (Fotografia
2).
Fotografia 2- Atividade de lacase por oxidação de ABTS em isolado 1PD em meio Sabouraud
Verificação de halo verde com intensidade 1, em frente (A) e verso (B) da placa com meio de cultura na presença de ABTS.
Diversos autores demonstram a eficiência do ABTS (2,2-azino-bis-3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) como indicador da enzima lacase (MANDYAM;
LOUGHIN; JUMPPONEN, 2010; FENG, et al., 2012; SUN. et al., 2012;
NASCIMENTO ET.AL., 2016). A oxidação do ABTS e da siringaldazina (4-Hidroxi-
3,5- Dimetoxibenzaldeidazina) são os principais substratos artificiais para
identificação de lacase. No entanto o 2,6-dimetoxifenol, e o guaiacol também podem
ser citados como compostos que auxiliam na verificação da atividade enzimática da
lacase (THURSTON, 1994).
A partir da análise qualitativa, verificou-se que 12 dos isolados demonstraram
atividade enzimática de lacase (Tabela 8).
51
Tabela 7 – Avaliação qualitativa atividade de lacase nos isolados fúngicos cultivados em ágar MEA 2% contendo ABTS
Isolados Intensidade do halo Isolados Intensidade do halo
1II 1 FO 1 1PD 1 CT 1 3II 0 C1 1
3PD 0 DM 1 4II 0 IFV1 2 6II 0 IFV3 1 7II 0 IFV7 1 CL 0 IFV8 1 CB 0 FV11 0
CB2 0 12II 1 CFV 0 13II 1
Legenda: Escala de intensidade de cor: 0= negativo; 1= baixa; 2= moderada e 3= alta coloração
Os isolados que apresentaram oxidação de ABTS em ágar foram submetidos ao
teste quantitativo de lacase por análise espectrofotométrica (Gráfico 4). Com
exceção de dois dos isolados, o pico máximo de atividade ocorreu no tempo de 120h
(5 dias). Assim, os melhores valores de atividade enzimática ficaram em 0,211U.L-1
(isolado IFV1), 0,157U.L-1(isolado 1PD), e 0,147U.L-1 (isolados 13II).
Gráfico 4 – Quantificação da atividade enzimática da lacase de isolados de fungos melanizados durante 168 horas
1II 1PD FO CT C1 DM IFV1 IFV3 IFV7 IFV8 12II 13II
168h 0,026 0,048 0,052 0,049 0,025 0,026 0,072 0,040 0,043 0,026 0,038 0,054
144h 0,113 0,108 0,058 0,086 0,031 0,074 0,138 0,054 0,085 0,101 0,060 0,035
120h 0,113 0,158 0,101 0,054 0,068 0,064 0,211 0,131 0,097 0,142 0,100 0,147
96h 0,063 0,139 0,024 0,064 0,026 0,037 0,169 0,121 0,068 0,052 0,022 0,053
72h 0,055 0,060 0,039 0,060 0,047 0,057 0,126 0,060 0,061 0,060 0,058 0,081
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
Ativid
ade e
nzim
ática (
U.L
-1)
52
Estudos tem demonstrado que há variação na expressão de atividade de
lacases em relação ao tempo de cultivo do micro-organismo. Análises realizadas por
Melo et al. (2015), com Aspergillus ssp. e por Adnan et al. (2015) com Trichoderma
atroviride F03, indicaram melhor atividade de lacase em 96h. No entanto diferentes
linhagens do fungo da podridão branca (white rot fungus) demonstram melhor
resultado em 192h (LING et al., 2015; ZHUO et al., 2011). Diversos estudos
envolvendo os gêneros Chaetothyriales, Cyphellophora, Phialophora, Fonsecaea e
fungos endófitos negros septados (Dark septate endophytes – DSE), tem
relacionado a produção de melanina à enzima lacase (FENG, et al., 2012;
MANDYAM; LOUGHIN; JUMPPONEN, 2010 SUN. et al., 2012).
Em relação aos demais isolados em que não foi detectada atividade de
lacase, deve-se considerar que a ausência de atividade extracelular ABTS-oxidante
não necessariamente implica na falta de capacidade para produzir a enzima, pois
pode ocorrer a inibição desta devido às condições de cultivo e meio de cultura e
substrato utilizados (SAPARRAT et al., 2008).
Ameen et al. (2016) citam que o nível de lacase, lignina peroxidase,
manganês peroxidase e catalase aumentava com a presença de óleo diesel em
relação ao controle; fato devido a necessidade da presença das enzimas para a
degradação do hidrocarboneto. Outros estudos ainda citam as lacases como
enzimas importantes no processo de degradação de compostos orgânicos tóxicos,
dentre eles os hidrocarbonetos cíclicos (GUTNICK; ROSENBERG, 1977;
THURSTON, 1994; DURÁN; ESPOSITO, 2000).
Conforme Gulloto et al. (2008) a conversão de compostos aromáticos por
enzimas como as lacases é favorecida com a utilização de agentes tensoativos.
Estes agentes auxiliam na solubilização de hidrocarbonetos, aumentando a sua
disponibilidade em meio aquoso.
5.2.6 Determinação do Índice de Emulsificação (E24)
O índice de emulsificação de um micro-organismo indica a produção de
biossurfactantes, logo, essa produção é desejável quando se trata de micro-
organismos capazes de degradar hidrocarbonetos (BENTO et al., 2005). Estudos
relacionados a biossurfactantes produzidos por fungos ainda tem sido pouco
53
explorados. De acordo com Bhardwaj et al. (2013) as espécies mais explorados
neste contexto são: Candida bombicol, Candida lipolytica, Candida ishiwadae,
Candida batistae, Aspergillus ustus, Ustilago maydis e Trichosporon ashii.
No presente estudo 72,73% dos isolados (N=16) demonstraram capacidade
de emulsificação. Analisando o Gráfico 5, verifica-se que o maior índice obtido de
E24 foi de 36,06% e o menor de 1,04%. Segundo Bento et al. (2005), diversos
estudos apontam índices em torno de 65% de emulsão como os mais encontrados.
No entanto, valores mais altos foram obtidos por em Silva et al. (2014) que
verificaram um E24= 85% para óleo de motor pelo fungo Cunninghamella
echinulata. Chandran e Das (2010) verificaram que Trichosporon asahii, isolado de
solo poluído por hidrocarboneto, apresentou E24 em óleo diesel de 89 ± 0,7%;
sendo este superior aos surfactantes comerciais Tween 80 (67 ± 0,9%) e dodecil
sulfato de sódio (78 ± 0,8%). Fusarium sp. BS-8 também foi avaliado, Qazi et al.
(2014) de solo poluído com petróleo obtiveram um E24=70% em querosene. Esses
autores também consideraram que, de acordo com essa porcentagem, o fungo tem
grande potencial para produção de biossurfactantes.
Gráfico 5 – Capacidade de emulsificação (%) de isolados fúngicos após 24horas
Os dados aqui obtidos relativos à capacidade de emulsificação por si só não
favorecem a indicação dos isolados como biorremediadores de ambientes poluídos
por hidrocarbonetos. Entretanto, uma possível combinação desses micro-
organismos como um consórcio microbiano pode ser uma estratégia que propicie um
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Capacid
ade e
muls
ionante
Isolados
54
incremento nas taxas de degradação. Para isso, outros estudos devem ser
desenvolvidos visando determinar a viabilidade de um consórcio. Isto tem sido
indicado, como por exemplo, na biorremediação de solos poluídos por óleo diesel,
no qual micro-organismos do próprio local de contaminação tem sido utilizados, pois
facilitam a adaptação dos mesmos diminuindo as interações negativas (BENTO et
al., 2005). Neste sentido, um aumento sinérgico em processo de degradação de óleo
diesel com a utilização de um consórcio de fungos foi observado por Ameen et al.
(2016).
5.2.7 Degradação de Hidrocarbonetos
Nesta pesquisa, valores médios de massa seca obtida (mg) pelos isolados
resultou na seguinte ordem de produção: Diesel > gasolina > tolueno > benzeno >
xileno > meio mineral (MM) sem adição de carbono. O ensaio com MM com uma
fonte de carbono (glicosado) foi utilizado apenas como um controle de crescimento
dos isolados em condições padrão.
Em relação aos ensaios apenas com os hidrocarbonetos benzeno, tolueno e
Xileno (BTX), todos apresentaram crescimento. No entanto, conforme Gráfico 6,
doze (12) dos isolados apresentaram maior massa seca no ensaio com tolueno, 7
com benzeno, 2 com xileno e apenas um isolado teve a maior massa seca no ensaio
com MM na ausência de carbono. Pode-se considerar que esse isolado (IFV7) não é
micro-organismo fastidioso, crescendo em condições mínimas. Contudo, também
não é necessariamente um não assimilador de hidrocarboneto, uma vez que houve
crescimento nos demais ensaios contendo pelo menos um dos BTX.
55
Gráfico 6 – Valor médio de massa seca (mg) com adição dos diferentes hidrocarbonetos BTX em meio mineral
56
Dos 22 isolados, 6 foram selecionados para identificação molecular,
considerando os maiores valores de massa seca obtidos em todos os tratamentos
(gasolina, diesel e BTX), quando comparadas ao crescimento em MM na ausência
de fonte de carbono. Dos seis isolados, todos apresentaram capacidade de
crescimento em concentrações elevadas de cloreto de sódio (10%), e também em
uma ampla faixa de pH (4-9). No entanto= apenas 3 (1PD, CL e FO) foram capazes
de crescer em todas as faixas de temperatura testadas (25°C – 37°C). Quatro destes
isolados apresentaram atividade de lacase em condições ideais de cultivo, sendo
eles: 1PD, FO, C1 e IFV3 (Tabelas 9 e 10).
Hamed et al. (2003) avaliaram sobre a biodegradação de compostos
monoaromáticos derivados do petróleo, e verificaram que o uso de tolueno como co-
substrato torna a biodegradação do benzeno mais lenta. Com os dados obtidos na
presente pesquisa observou-se que mesmo nos ensaios individuais de BTX, a
massa seca resultante com o de tolueno foi superior aquele realizado com o
benzeno.
57
Tabela 8 – Características fisiológicas das seis linhagens de fungos selecionadas pelo maior potencial de degradação de BTX, gasolina e diesel.
2,5 5,0 7,5 10,0 4 5 6 7 8 9 25 28 30 35 37
Cladosporium sp. (1PD) hidrofóbico + + + + + + + + + + + + + + + + 9,90 1,00 0,90 0,40 0,05 0,15 20,25
Exophiala dermatitidis (CL) hidrofóbico + + + + + + + + + + + + + + + - 3,35 0,55 1,60 2,10 0,35 0,10 14,30
Exophiala sp. (CFV) hidrofílico + + + + + + + + + + + + + - - - 32,50 0,95 0,85 1,80 0,10 0,15 475,60
Cladosporium halotolerans (FO) hidrofóbico + + + + + + + + + + + + + + + + 35,35 3,30 1,95 1,55 0,60 0,30 480,15
Cladosporium halotolerans (C1) hidrofóbico + + + + + + + + + + + + + - - + 8,75 0,60 4,05 1,90 0,80 0,05 496,01
Cladosporium sp. (IFV3) hidrofóbico + + + + + + + + + + + + + - - + 6,50 1,20 0,85 0,40 1,65 0,15 474,20
Linhagens
Propriedades Fisiológicos Massa seca (mg)
HidrofobicidadeCresc. NaCl (%) pH Temperatura (°C)
Lacase Diesel Gasolina Benzeno Tolueno Xileno MMMM
(glicosado)
58
Em relação aos ensaios com diesel ou gasolina, os quais são misturas
complexas de hidrocarbonetos, o desempenho dos isolados em termos de massa
resultante, foi superior aos ensaios com cada um dos hidrocarbonetos (BTX). De
acordo com Hamed et al. (2003), misturas de hidrocarbonetos podem diminuir a
atividade microbiana. Mathur e Majumder (2010) verificaram que em misturas de
benzeno, tolueno e fenol, a degradação é parcialmente inibida devido à competição
entre os substratos. Contudo, neste sentido, Penafreta-Boldú et al. (2002)
verificaram crescimento de uma linhagem de Cladophialophora sp. T1 com uma
mistura de BTEX como única fonte de carbono, por meio de uma combinação entre
assimilação e co-metabolismo; pois o tolueno e o etilbenzeno foram utilizados como
fonte de energia, os isômeros de xileno foram co-metabolizados e o benzeno
manteve-se estável durante o processo.
Os gêneros Exophiala e Cladosporium são capazes de metabolizar
compostos aromáticos (COFONE; WALKER; COONEY, 1973, PRENAFETA-BOLDÚ
et al., 2001, POTIN; VEIGNIE; RAFIN, 2004, ZHAO et al., 2010). Conforme Nikolova;
Nenov (2005) em estudo sobre degradação de BTEX por Cladosporium sp. e
Cladophialophora sp., verificou-se que estes micro-organismos foram capazes de
degradar, total ou parcialmente, etilbenzeno, tolueno e os isômeros de tolueno, no
entanto nenhuma linhagem foi capaz de degradar o benzeno.
Ameen et al. (2016) isolaram de manguesais do Mar vermelho na Arábia
Saudita, fungos com capacidade de degradar óleo diesel. Obtiveram, dentre outros,
fungos dos gêneros Exophiala e Cladosporium. Cladosporium apresentou valor de
massa seca, em presença de óleo diesel, superior ao de Exophiala. De acordo com
Weber; Hage e Bont (1995) citam que o micro-organismo Cladosporium
sphaerospermum foi o primeiro eucarioto descrito a crescer na presença de tolueno
como única fonte de carbono.
Zhao et al. (2010) isolaram 66 linhagens de leveduras negras a partir de
solo rico em guano, madeira tratada com creosoto e de bagas de frutas silvestres,
submeteram as amostras à atmosfera gasosa de hidrocarbonetos (benzeno,
tolueno, xileno e naftaleno). Eles consideraram o crescimento de leveduras negras
sob estas condições, como assimiladoras de hidrocarbonetos. E ainda, que a
levedura E. dermatitidis, é raramente isolada de fontes ambientais, no entanto,
quando isoladas destas fontes, frequentemente aparece associada a locais poluídos
como foi isolada de madeira poluída por creosoto e óleo de origem petrolífera.
59
Seyedmousavi et al., (2014) verificaram a baixa incidência de E. dermatitidis
oriundos de fontes ambientais em locais de clima temperado, sugerindo que essa
espécie é de origem tropical.
5.3 Identificação Molecular e Filogenia
Os isolados que apresentaram maior massa seca em todos os ensaios com
hidrocarbonetos foram identificados geneticamente pela amplificação da região ITS.
Após alinhamento e submissão das sequências consenso no NCBI, foi possível
identificar dois gêneros de fungos melanizados, Cladosporium (família
Cladosporiaceae) e Exophiala (família Herpotrichiellaceae). Sendo: duas linhagens
de Cladosporium sp., duas de Cladosporium halotolerans, uma de Exophiala sp. e
uma de Exophiala dermatitidis. Os fungos do gênero Exophiala são os principais
representantes das leveduras negras, grupo esse, que vem se destacando suas
características oligotróficas, bem como a degradação de hidrocarbonetos BTEX
(PRENAFETA-BOLDÚ 2002; REVANKAR; SUTTON, 2010; GONÇALVES et al.,
2016).
O resultado da identificação e a posição filogenética das linhagens foi
evidenciado pela formação da árvore filogenética desenvolvida pelo método Tamura-
Nei (1993). Para elaboração da árvore filogenética foram utilizados os seis isolados
selecionados e identificados, e sequências disponíveis no Genbank com similaridade
genética (Figura 2).
60
Figura 2 – Análise filogenética de seis linhagens identificadas de Cladosporium e Exophiala pelo método de máxima semelhança
Legenda= Árvore filogenética elaborada pelo método Tamura-Nei (1993) utilizando os seis isolados selecionados e identificados pela região ITS e linhagens com similaridade genética.
61
Os primers V9G e LS266, considerados estringentes para o grupo de fungos
melanizados, mostrou-se eficiente, fornecendo qualidade para a amplificação dos
isolados, que apresentaram sequências com tamanhos entre 839-938 pares e
bases, e atingindo 100% de identidade com Cladosporium halotolerans para o
isolado C1. Os demais dados de similaridade genética podem ser observados na
Tabela 10. Corroboram aos estudos de Figel et al. (2013), que utilizaram os mesmos
primers para a identificação de fungos melanizados.
Os fungos são ubiquitários por natureza. Adaptam-se aos mais diversos e
inóspitos ambientes. Fungos melanizados ainda apresentam características
especiais não só morfológicas, mas também fisiológicas, tais como, a presença de
melanina e a produção de compostos bioativos (GONÇALVES et al., 2016) isto
torna-os potenciais candidados à bioprospecção visando à biorremediação
ambiental. Mas normalmente requerem métodos seletivos para isolamento, tais
como flotação em óleo mineral (VICENTE, et al., 2008) erriquecimento com
hidrocarbonetos aromáticos entre outros (ZHAO, et al., 2010; BADALI, et al., 2010).
A tolerância ao estress devido às condições adversas pode estar associada à
presença de melanina (BADALI, et al., 2010)
As linhagens aqui identificadas apresentaram habilidade de sobreviver e
crescer em condições adversas de temperatura, salinidade e pH. Em adição,
também apresentaram capacidade de emulsificação e potencial de degradação de
hidrocarbonetos BTX. Esses dois gêneros, tem espécies que são patogênicas, mas
os isolados de ambiente que apresentam características fisiológicas similares a
isolados clínicos tem, em geral, virulência reduzida (ZHAO et al., 2010).
As seis linhagens identificados por análise molecular serão encaminhadas
para fazer parte da coleção de culturas microbianas do Laboratório de Microbiologia
(LABMICRO) do Departamento de Patologia Básica do Setor de Ciências Biológicas
da Universidade Federal do Paraná, para integrar-se ao Centro de Coleções de
Culturas Biológicas (CCB-UFPR)4. Como parte da parceria de pesquisa do
Programa de Ciência e Biotecnologia com o Programa de Pós em Microbiologia,
Parasitologia e Imunologia da UFPR, setor de Ciências Biológicas.
4 Disponível em: <http://taxonline.nerdweb.com.br/>
62
Tabela 9 – Linhagens fúngicas utilizadas na construção da árvore filogenética, composta por isolados identificados nesse estudo e com similaridade genética
Identificação Molecular Nº de Acesso1 Identidade
Cladosporium sp. CBS 280.49 EU167574.1 100%
Cladosporium halotolerans C1 ---- ----
Cladosporium halotolerans DTO 255-G4 KP701982.1 99%
Cladosporium halotolerans DTO 220-D3 KP701966.1 99%
Cladosporium halotolerans DTO 161-D6 KP701958.1 100%
Cladosporium halotolerans DTO 160-I2 KP701953.1 99%
Cladosporium halotolerans DTO 147-B9 KP701942.1 99%
Cladosporium halotolerans DTO 127-E8 KP701936.1 100%
Cladosporium halotolerans FO ---- ----
Cladosporium cladosporioides MA09-AO GQ458031.1 99%
Cladosporium sp. CBS 266.53 EU167592.1 99%
Cladosporium cladosporioides DTO 039-G6 KP701868.1 99%
Cladosporium cladosporioides DTO 109-E7 KP701913.1 99%
Cladosporium delicatulum DTO 167-H5 KP701964.1 97%
Cladosporium inversicolor DTO 108-F8 KP701908.1 97%
Cladosporium sp. HT-Z1-V KJ527013.1 99%
Cladosporium sp. SS-S12 GU797141.1 99%
Cladosporium sp.IFV3 ---- ----
Cladosporium sp.1PD ---- ----
Exophiala jeanselmii SC1201 05 KC311520.1 99%
Exophiala sp. CFV ---- ----
Exophiala spinifera BMU 00045 AY484985.1 99%
Exophiala dermatitidis CBS 149.90 AF050268.1 99%
Exophiala dermatitidis NH319 AB498925.1 99%
Exophiala dermatitidis CBS 207.35 AF050269.1 99%
Exophiala dermatitidis CBS 748.88 AF050270.1 99%
Exophiala dermatitidis UM 233 JX966558.1 99%
Exophiala dermatitidis CBS 115663 AY663828.1 99%
Exophiala dermatitidis PMM10-90L ISHAM-ITS KP132040.1 99%
Exophiala dermatitidis CL ---- ---- Legenda:1= Número de acesso registrado no Genbank; 2=Identidade obtida no genbank a partir das sequências consenso dos isolados fúngicos.
63
6 CONCLUSÃO
Na perspectiva de avaliação do potencial biotecnológico, nesta pesquisa foi
possível analisar qualitativa e quantitativamente algumas das principais
características fisiológicas de fungos melanizados obtidos de amostras
contaminadas por hidrocarbonetos.
Entre as duas metodologias de isolamento dos fungos melanizados, por
flotação em óleo mineral e por inóculo direto em ágar, a primeira mostrou-se mais
eficiente, pois resultou em um maior número de isolados.
A maioria dos isolados apresentou caráter hidrofóbico. Como a maior parte
foi obtida a partir de materiais de uso e circulação contínua nos ambientes
pesquisados, provavelmente esse caráter hidrofóbico seja um fator facilitador da
dispersão de esporos no ambiente.
A avaliação de cada isolado de fungo melanizado nos ensaios sob diferentes
condições de temperatura, pH, NaCl, evidenciou que entre esses parâmetros, a
temperatura é uma condição crítica para crescimento, sendo 25ºC a temperatura
ótima para a maioria dos isolados.
A atividade de lacase foi detectada em condições padronizadas de cultivo.
Mas, para alguns dos isolados a não expressão dessa atividade pode ter sido devido
a essas mesmas condições, em termos quantitativos e/ou qualitativos (substrato,
temperatura, pH, etc.).
Os isolados suportaram crescimento na presença de BTX, gasolina e óleo
diesel como única fonte de carbono. Os que apresentaram maior capacidade de
degradação de hidrocarbonetos foram identificados como pertencentes às
espécies Cladosporium halotolerans, Cladosporium sp., Exophiala sp., e E.
dermatitidis. Entre os hidrocarbonetos BTX, o tolueno tem melhores resultados para
os fungos em relação a massa seca resultante.
A capacidade de emulsificação (E24) apresentada pelos isolados ficou
abaixo de 65%, resultados próximos ou acima desse valor conferem uma
característica favorável quando se busca por micro-organismos biorremediadores.
Contudo, mais experimentos deverão ser realizados para confirmar a real
importância das linhagens selecionadas como assimiladoras de hidrocarbonetos,
face ao potencial aqui demonstrado sob outros aspectos.
64
A bioprospecção de micro-organismos com potencial em biorremediação
permite avaliar melhor as características morfo-fisiológicas e genéticas. Neste
sentido, a obtenção de representantes de dois gêneros de fungos melanizados nas
condições já expostas, reforçam ainda mais o caráter ubiquitário desses fungos,
presentes mesmo em ambientes inóspitos e improváveis de sobrevivência.
65
REFERÊNCIAS
ADNAN, L. A. et al. Metabolites characterisation of laccase mediated Reactive Black 5 biodegradation by fast growing ascomycete fungus Trichoderma atroviride F03. International Biodeterioration and Biodegradation, v. 104, p. 274–282, 2015. doi10.1016/j.ibiod.2015.05.019 AGUIAR FILHO, J.M.M.. Análise enzimática de fungos lignocelulolíticos cultivados em vinhaçae bagaço de cana- de açúcar. Dissertação (Mestrado em Agricultura Microbiologica) –Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2008 AMEEN, F. et al. Biodegradation of diesel fuel hydrocarbons by mangrove fungi from Red Sea Coast of Saudi Arabia. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 23, n. 2, p. 211–218, 2016. King Saud University. ATLAS, R. M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective, v. 45, n. 1, p. 180, 1981. BADALI, H. et al. Biodiversity of the genus Cladophialophora. Studies in Mycology, v. 61, p. 175–191, 2008. doi: 10.3114/sim.2008.61.18 BADALI, H. Biodiversity, pathogenicity and antifungal susceptibility of Cladophialophora and relatives. 149f.PhD thesis. FNWI: Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), 2010.149f. Disponível em: <http://hdl.handle.net/11245/1.325211>. Acesso em: 30 maio 2016. BANAT, I. M. et al. Microbial biosurfactants production, applications and future potential. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 87, n. 2, p. 427–444, 2010. BENTO, F. M. et al. Diversity of biosurfactant producing microorganisms isolated from soils contaminated with diesel oil. Microbiological Research, v. 160, n. 3, p. 249–255, 2005. doi:10.1016/j.micres.2004.08.005 BHARDWAJ, G.et al. Biosurfactants from Fungi : A Review. Journal Petroleum Environmental Biotechnology, v. 4, 2016, p. 1–6, 2013. doi: 10.4172/2157-7463.1000160 BLASI, B. et al. Pathogenic Yet Environmentally Friendly? Black Fungal Candidates for Bioremediation of Pollutants. Geomicrobiology journal, v. 33, n. 3-4, p. 308–317, 2016. doi: 10.1080/01490451.2015.1052118 BUTLER, M.J. DAY, A.W. Fungal melanins: A Review. Canadian Journal of Microbiology, v. 44. n. 12, 1998. doi: 10.1139/w98-119 CALIGIORNE, R. B. et al. Fungos Dematiáceos. Biotecnologia e Ciência e Desenvolvimento, p. 4, nº11, ano 2. 1999. CALIGIORNE, R. B. et al. Internal transcribed spacer rRNA gene-based phylogenetic reconstruction using algorithms with local and global sequence alignment for black
66
yeasts and their relatives. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 6, p. 2816–2823, 2005. doi: 10.1128/JCM.43.6.2816-2823.2005 CHAîNEAU. C.H. et al. Comparision of the fuel oil biodegradation potential of hydrocarbon-assimlating microorganisms isolated from a temperature agricultural soil. Science of The Total Environment, v. 227, 1999. doi:10.1016/S0048-9697(99)00033-9 CHANDRAN, P. DAS, N. Biosurfactant production and Diesel oil Degradation by yeast species Trichosporon asahii Isolated from Petroleum Hydrocarbon Contaminated soil. International Journal of Engineering Science and Technology, v.2, 2010 CHEN, S-C. LIAO, C-M. Health risk assessment on human exposed to environmental polycyclic aromatic hydrocarbons pollution sources. Science of The Total Environment. v. 366, 2006. doi:10.1016/j.scitotenv.2005.08.047 COFONE, L, J. WALKER, J.D. COONEY, J.J. Utilization of hydrocarbons by Cladosporium resinae. Journal of general Microbiology, v. 76, 1973. COX, H.H.J. Enrichment of Fungi and Degradation of Styrene in Biofi lters. Biotechnology Letters. vol 15. nº 7. 1993. Doi:10.1007/BF01080148 DE HOOG, G.S. et al. Atlas of Clinical Fungi. Centraalbureal voor Schimmelcultures. Universitat Rovira i Virgili. Pg. 158-172.1995.
DE HOOG, G. S. et al. Species Diversity and Polymorphism in the. , v. 41, n. 10, p. 4767–4778, 2003. doi: 10.1128/JCM.41.10.4767-4778.2003 DE HOOG, S.G. et al. Molecular ecology and pathogenic potential of Fonsecaea species. Medical Mycology. V 42. 2004. doi: 10.1080/13693780410001661464 DE HOOG, G. S. et al. Exophiala xenobiotica sp. nov., an opportunistic black yeast inhabiting environments rich in hydrocarbons. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, v. 90, n. 3, p. 257–268, 2006. doi10.1007/s10482-006-9080-z DE HOOG, S. G; VICENTE, V. A.; GORBUSHINA,A. A. The bright future of darkness – the rising Power of Black fungi: Black yeasts, microcolonial fungi, and their relatives. Mycopathologia. 175: 365-368. 2013. doi: 10.1007/s11046-013-9666-8 DESHMUKH, K.R. Isolation, Characterization of Melanin Producing Organism and Etraction of Melanin. International Journal of Scientific & Engineeing Research. v.3. 2012. DO NASCIMENTO, M. M. F.; DE HOOG, G. S.; GOMES, R. R.; et al. Shared Physiological Traits of Exophiala Species in Cold-Blooded Vertebrates, as Opportunistic Black Yeasts. Mycopathologia, 2016. DÖǦEN, A.; ILKIT, M.; DE HOOG, G. S. Black yeast habitat choices and species
67
spectrum onhighaltitude creosote-treated railway ties. Fungal Biology, v. 117, n. 10, p. 692–696, 2013. doi:10.1016/j.funbio.2013.07.006 doi:10.1016/j.funbio.2013.07.006 DURÁN, N. ESPOSITO, E. Potential applications of oxidative enzymes and phenoloxidase-like compounds in wasterwater and soil treatment: a review. Applied Cataysis B: Environmental, v 28, 2000. doi:10.1016/S0926-3373(00)00168-5 DURÁN, N. et al. Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. Enzyme and Microbial Technology, v.31. nº 7, 2002. doi: 10.1016/S0141-0229(02)00214-4 EAWAG BB. Biocatalysis/biodegradation database. 2003.Disponível em : <http://eawag-bbd.ethz.ch/servlets/pageservlet?ptype=e&ECcode=1.10.3.2>. Acesso em 26/01/2016
EL-NAAS, M.H. ACIO, J.A. EL TELIB, A.E. Aerobic biodegradation of BTEX: Progresses and Prospects. Journal of Environmental Chemical Engineering.vol 2. 2014. doi:10.1016/j.jece.2014.04.009 ESTÉVEZ, E. VEIGA, M.C. KENNES, C. Biodegradation of toulene by the new fungal isolates Paecilomyces variotii and Exophiala oligosperma. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 32, 2005. doi 10.1007/s10295-004-0203-0 FONTES, G.A. FONTES, K.A. A Indústria do Petróleo no Brasil: Aspectos Históricos e Jurídicos Acerca da Flexibilização do seu Monopólio. Juris Rationes, v. 6, 2013. FENG, P. et al. Cyphellophora and its relatives in Phialophora: biodiversity and possible role in human infection. Fungal Diversity, n 65, 2012. doi:10.1007/s13225-012-0194-5 FERNANDES, M.B. et al. Atmospheric BTX and polyaromatic hydrocarbons in Rio de Janeiro, Brazil. Chemosphere, v 47, 2002. FERRARI-LIMA, A.M. et al. Photodegradation of benzene, toluene and xylenes under visible light applyng N-doped mixed TiO2 and ZnO catalysts. Catalysis Today, v. 241, 2015. FIGEL, I.C. et al. Black Yests-like Fungi Isolated from Dialysis Water in Homdialysis Units. Mycopathology. 2013. doi 10.1007/s11046-013-9633-4. FUNGARO, P. PCR na Micologia. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, ano 3, n14. p. 12-16, 2000. GONÇALVES, V.N. et al. Fungi associated with rocks of the Atacama Desert:
taxonomy, distribution, diversity, ecology and bioprospection for bioactive
compounds.Environmental Microbiology, v. 18, pg 232-245. doi:10.1111/1462-
2920.13005
68
GOSTINČAR, C. et al. Extremotolerance in fungi: Evolution on the edge. FEMS Microbiology Ecology, v. 71, n. 1, p. 2–11, 2010. doi: 10.1111/j.1574-6941.2009.00794.x GÖTTLICH, E. et al. Cell-surface hydrophobicity and lipolysis as essential factors in
human tinea nigra. Mycoses, v. 38, 1995.
GUNDE-CIMERMAN, N. RAMOS, J. PLEMENITAS, A. Halotolerant and halophilic fungi. British Mycological Society, v. 113, 2009. doi:10.1016/j.mycres.2009.09.002 GUTINCK, D. L. ROSENBERG, E. Oil Tankers and Pollution: A Microbiological Approach. Annual Review of Microbiology,v. 31, 1977. doi:10.1146/annurev.mi.31.100177.002115 HAMED, T.A. et al. Substrate interactions during the biodegradation of benzene, toluene and phenol mixtures. Process Biochemistry,v 30, 2003. doi:10.1016/S0032-9592(02)00293-5 HARITASH, A.K.; KAUSHIK, C.P. Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs): A review. Journal of Hazardous Materials,v.169, n 1-3. 2009.
doi:10.1016/j.jhazmat.2009.03.137 HESHAM, A. E. et al. Isolation and molecular genetic characterization of a yeast strain able to degrade petroleum polycyclic aromatic hydrocarbons. African Journal od Biotechnology, v. 8, n. 10, p. 2218–2223, 2009. HIBBETT, S. D. et al. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research, v. 111, Nº 5, 2007. doi:10.1016/j.mycres.2007.03.004 IQBAL, S. et al. Enhanced biodegradation and emulsification of crude oil and hyperproduction of biosurfactants by a gamma ray-induced mutant of Pseudomonas aeruginosa. Letters in applied microbiology, v. 21, n. 3, p. 176–179, 1995. ISOLA, D. et al. Isolation and Screening of Black Fungi as Degraders of Volatile Aromatic Hydrocarbons. Mycopathologia, v. 175, n. 5-6, p. 369–379, 2013. IWATSU, T. et al. Isolation of Phialophora verrucosa and Fonsecaea pedrosoi from nature in Japan. Mycopathologia, v.75. n 3, 1981. doi:10.1007/BF00482809 KASAI, M. et al. Use of Quantitative Real-Time PCR To Study the Kinetics of Extracellular DNA Released from Candida albicans, with Implications for Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Clinical Microbiology, v 44, 2006. doi: 10.1128/JCM.44.1.143-150.2006 KEJZAR, A. et al. Melanin is crucial for growth of the Black yeast Hortaea werneckii in its natural hypersaline evironment. Fungal Biology, v 177, n4. p. 368-379. doi:10.1016/j.funbio.2013.03.006
69
Kumar S, Stecher G, and Tamura K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution 33:1870-1874. Disponível em: <http://www.megasoftware.net>. Acesso em: 27 jun 2016. KUTTY, S.N. et al. Black yeasts from the slope sediments of Bay of Bengal: phylogenetic and functional characterization. Mycosphere, v.4, 2013. doi: 10.5943/mycosphere/4/3/1 LARKIN, M.A. et al. Clustal W version 2.Bioinformatics, v 23, 2007. doi: 10.1093/bioinformatics/btm404 LEONOWICZ, A. et al. Review: Biodegradation of Lignin by White Rot Fungi. Fungal Genetics and Biology, v 27, 1999. doi:10.1006/fgbi.1999.1150 LING, Z. et al. An extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from White rot fungus Trametes sp.LAC-01 International Journal of Biological Macromolecules, v.81, 2015. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2015.09.011 LIMA, D. F. Utilização Dos Fungos Na Biorremediação De Substratos Contaminados Por Petróleo: Estado Da Arte, Cadernos de Geociências, v.8, n 2, p. 113–121, 2011. MAHERALI, H.; KLIRONOMOS, J. N. Phylogenetic and trait-based assembly of arbuscular mycorrhizal fungal communities. PLoS ONE, v. 7, n. 5, 2012. doi:10.1371/journal.pone.0036695 MANDYAM, K. et al. Isolation and morphological and metabolic characterization of common endophytes in annually burned tallgrass prairie. Mycologia, v. 102, 2010. doi: 10.3852/09-212 MARQUES, S. G. et al. Isolation of Fonsecaea pedrosoi from the shell of the babassu coconut (Orbignya phalerata Martius) in the Amazon Region of Maranhão Brazil. Japanese Journal of Medical Mycology, v. 47, n. 4, p. 305–311, 2006. MATOS, T. et al. Molecular diversity of oligotrophic and neurotropic members of the black yeast genus Exophiala, with accent on E. dermatitidis. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, v. 83, n. 4, p. 293–303, 2003. MATHUR, A.K. MAJUMDER, C.B. Kinetics Modelling of the Biodegradation of Benzene, Toluene and Phenol as Single Substrate and Mixed Substrate by Using Pseudomonas putida.Chemical Biochemical engineering Quaterly,v.24, 2010. MAYER, A.M. STAPLES, R.C. Laccase: New Functions for an old enzyme. Phytochemistry, v.60, 2002. doi:10.1016/S0031-9422(02)00171-1 MELO, T. L. et al. Avaliação do potencial de amostras de Aspergillus ssp isoladas de amostras da caatinga para produção de lacase. Exacta, v 8. n1, 2015. MUKHERJEE, A.K. BORDOLOI, N.K. Biodegradation of benzene, toluene, and xylene (BTX) in liquid culture and in soil by Bacillus subtilis and Pseudomonas
70
aeruginosa strains and a formulated bacterial consortium. Environmental Science and Pollution Research, v 19, 2012. doi: 10.1007/s11356-012-0862-8 NAKHLA, G. Biokinetic modeling of in situ bioremediation of BTX compounds – Impact of process variables and scaleup implications. Water research, v. 37, 2003. doi:10.1016/S0043-1354(02)00491-8 NIKOLOVA, N. NENOV, V. BTEX degradation by fungi. Water Science Technology, v.51, 2005. PAPPAGIANIS, D.; AJELLO, L. Dematiaceous – a mycologic misnomer? Journal Medicine veterinary mycology, v.32, n 4, 1994. doi: 10.1080/02681219480000401 PETROBRÁS. Nossa produção de derivados no Brasil cresceu 2,1% em 2014. Fatos e Dados. 2014. Disponível em: <http://www.petrobras.com.br/fatos-e-dados/nossa-producao-de-derivados-no-brasil-cresceu-2-1-em-2014.htm>. Acesso em 09/2015. PLONKA, P. M.; GRABACKA, M. Melanin synthesis in microorganisms--biotechnological and medical aspects. Acta Biochimica Polonica, v. 53, n. 3, p. 429–443, 2006. POTIN, O. VEIGNIE, E. RAFIN, C. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by Cladosporium sphaerospermum isolated from an aged PAH contaminated soil. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology, v. 51, 2004. doi: 10.1016/j.femsec.2004.07.013 71-78 PRENAFETA-BOLDÚ, F. X.; SUMMERBELL, R.; SYBREN DE HOOG, G. Fungi growing on aromatic hydrocarbons: Biotechnology’s unexpected encounter with biohazard? FEMS Microbiology Reviews, n.30. 2006. doi: 10.1111/j.1574-6976.2005.00007.x 109-130 PRENAFETA-BOLDÚ, F.X. et al. Substrate Interactions during the Biodegradation of Benzene, Toluene, Ethylbenzene, and Xylene (BTEX) Hydrocarbons by the Fungus Cladophialophora sp. Strain T1. Applied And Environmental Microbiology, v.68, n 6, 2002. doi: 10.1128/AEM.68.6.2660-2665.2002 PRENAFETA-BOLDÚ, F. X. et al. Isolation and characterisation of fungi growing on volatile aromatic hydrocarbons as their sole carbon and energy source. Mycological Research, v. 105, n. 4, p. 477–484, 2001. doi: 10.1017/S0953756201003719 QAZI, M. A. et al. Isolation and characterization of a biosurfactant-producing Fusarium sp. BS-8 from oil contaminated soil. Biotechnology Progress, v. 30, 2014. doi: 10.1002/btpr.1933 REVANKAR, S.G.; SUTTON, D.A. Melanized Fungi in Human Disease. American Society Microbiology, v. 23, n 4, 2010. doi: 10.1128/CMR.00019-10 SAMBROOK, J., RUSSEL. D. W. Molecular cloning: a Laboratory manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York : CSHL, 2001
71
SAPARRAT, M.C.N. et al. Extracellular ABTS-oxidizing activity of autochthonous fungal strains from Argentina in solid medium. IberoAmerican Journal of Mycology, n17, 2000. SATOW, M. M. et al. Selective factors involved in oil flotation isolation of black yeasts from the environment. Studies in mycology, v. 61, p. 157–63, 2008. doi:10.3114/sim.2008.61.16 SEYEDMOUSAVI, S. et al. Black yeasts and their filamentous relatives: Principles of pathogenesis and host defense. Clinical Microbiology Reviews, v. 27, n. 3, p. 527–542, 2014. doi: 10.1128/CMR.00093-13 SILVA, C.M.M.S. et al. Produção de Enzimas Ligninolíticas por Fungos Isolados de Solos sob Cultivo de Arroz Irrigado. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento – EMBRAPA, n 18, 2004. SILVA, N. R. A. et al. Biosurfactant-and-Bioemulsifier Produced by a Promissing Cunnunghamella echnulata Isolated from Caatinga Soil in the Northeast of Brazil. International Journal of Molecular Sciences, n 15, 2014. doi:10.3390/ijms150915377 SHIGH, H. Mycoremediation: Fungal Bioremediation. John Wiley & Sons, Inc., New Jersey. United Sates of America. 2006. SODEN, D.M. et al. Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host. Microbiology,
v.148, 2002. doi: 10.1099/00221287-148-12-4003 STERFLINGER, K. Temperature and NaCl – tolerance of rock-inhabiting meristematic fungi. Antonie van Leeuwenhoek, n 74, 1998. doi:10.1023/A:1001753131034 STERFLINGER. K.; PRILLINGER, H. Molecular taxonomy and biodiversity of rock fungal communities in an urban environment (Vienna, Austria). Antonie van Leeuwenhoek., v. 80, p.275–286, 2001. doi:10.1023/A:1013060308809 SUN, J. et al. Molecular Characterization of Pathogenic Members of the Genus Fonsecaea Using multilocus Analysis. PLoS ONE, v.7, 2012. doi:10.1371/journal.pone.0041512 TAYLOR, J. W. et al. Phylogenetic Species Recognition and Species Concepts in Fungi. Fungal Genetics and Biology, v.31. n 1, 2000. doi:10.1006/fgbi.2000.1228 Tamura, K. Nei, M. (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution, v.10, p 512-526.
TESEI, D. et al. Alteration of protein patterns in black rock inhabiting fungi as a response to different temperatures. Fungal Biology,v. 116, n 8, 2012. doi:10.1016/j.funbio.2012.06.004
72
TESEI, D. et al. Proteome of tolerance fine-tuning in the human pathogen black yeast Exophiala dermatitidis. Journal of Proteomics, v. 128, 2015. doi:10.1016/j.jprot.2015.07.007 THURSTON, F.C. The structure and function of fungal laccases. Microbiology, v.140, 1994. Disponível em: <http://www.microbiologyresearch.org/docserver/fulltext/micro/140/1/mic-140-1-19.pdf?expires=1467413440&id=id&accname=guest&checksum=CCE697B34BC8DE67ADEE39D0769D4945>. Acesso em 04/2016 TSUI, C. K. et al. Molecular techniques for pathogen identification and fungus detection in the environment. IMA Fungus, v. 2, n. 2, p. 177–189, 2011. doi: 10.5598/imafungus.2011.02.02.09 UNEP. Environmental management in oil and gas exploration and production. 1997. Disponível em : <http://www.ogp.org.uk/pubs/254.pdf>. Acesso em 04/2016 WEBER, F.J. HAGE, K.O.C. BONT, J. A. M. Growth of the Fungus Cladosporium spherospermum with Toluene as the Sole Carbon and Energy Source. Applied and Environmental Microbiology, v.61,1995. WILD, S.R. JONES, K.C. Polynuclear aromatic hydrocarbons in the United Kingdom Environment: A Preliminary Source Inventory and Budget. Environmental Pollution, v. 88, 1995. doi:10.1016/0269-7491(95)91052-M WILLIAMSON, P.R. WAKAMATSU, K. ITO, S. Melanin Biosynthesis in Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology, v.180, 1998. VAMOSI, S. M.; et al. Emerging patterns in the comparative analysis of phylogenetic community structure. Molecular ecology, v. 18, n. 4, p. 572–92, 2009. VERDIN, A. et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons storage by Fusarium solani in intracellular lipid vesicles. Environmental Pollution, v. 133, n. 2, p. 283–291, 2005. VICENTE, V. A. et al. Environmental isolation of black yeast-like fungi involved in human infection. Studies in mycology, v. 61, p. 137–144, 2008. doi:10.3114/sim.2008.61.14 VICENTE, V.A. et al. Isolation of Herpotrichiellacious fungi from the environment. Brazilian Journal of Microbiology, v.32, 2001 .doi:10.1590/S1517-83822001000100011 VOGLMAYR, H.et al. The diversity of ant-associated black yeasts: Insights into a newly discovered world of symbiotic interactions. Fungal Biology, v. 115, n. 10, p. 1077–1091, 2011. doi: 10.1016/j.funbio.2010.11.006 YURLOVA, N. A.; HOOG, G. S. DE; FEDOROVA, L. G. The influence of ortho- and para-diphenoloxidase substrates on pigment formation in black yeast-like fungi. , p. 39–49, 2008. doi: 10.3114/sim.2008.61.03.
73
ZAFRA, G. et al Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil by a tolerant strain of Trichoderma asperellum. Environmental Science and Pollution Research, p. 1034–1042, 2014. ZENG, J.S. Developing Species Recognition and Diagnostics of Rare Opportunistic Fungi. 2007. Tese de doutorado, Universidade de Amsterdam, Amsterdam and Centraalbureau voor Schimmelculture, Utrecht, 2007. p. 85-106. ZHAO, J.; ZENG, J.; HOOG, G. S. DE. Isolation and Identification of Black Yeasts by Enrichment on Atmospheres of Monoaromatic Hydrocarbons, p. 149–156, 2010. ZHUO, R. et al. Decolorization of different dyes by anewly isolated White-rot fungi strain Ganoderma sp. En3 and cloning and functional analysis of its laccase gene. Journal of Hazardous Materials, v. 192, 2011. doi: 10.1016/j.jhazmat.2011.05.106
74
APÊNDICES
75
APÊNDICE 1– Meios de Cultura e Soluções
Meiosde Cultura
Sabouraud
Peptona de caseína 5g
Peptona de carne 5g
Dextrose 40g
Ágar bacteriológico 15g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Mycosel
Peptona de soja 10g
Extrato de levedura 10g
Glicose 10g
Ágar 15g
Água destilada 1000mL
Antibióticos Cloranfenicol 0,4g
Ciclo hexemide 0,05g
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
MEA 2%
Extrato de malte 20g
Ágar 10g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
MEA 2% com ABTS
Extrato de malte 20g
Ágar 10g
ABTS 1g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Caldo MEA2%
Extrato de malte 20g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Meio Mineral
NaCl 5g
K2HPO4 1g
(NH4)SO4 1g
MgSO4.7 H2O 0,2g
KNO3 3g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Meio Mineral Glicosado
NaCl 5g
K2HPO4 1g
(NH4)SO4 1g
MgSO4.7 H2O 0,2g
KNO3 3g
Glicose 30g
Água destilada 1000mL Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Soluções
Lactofenol sem azul de algodão
Fenol 20g
Glicerol 40mL
Ácido lático 20mL
Água destilada 20mL
Tampão TBE 10X
Tris Base 108g
Ácido Bórico 55g
EDTA 0,5M pH8 40mL Água Deionizada 1L
76
APÊNDICE 2 – Tabela com os valores de crescimento (cm) dos isolados de fungos melanizados em ágar MEA 2% sob as diferentes condições de crescimento
Legenda: MD= Média; DP= Desvio padrão;
Isolados 0,0% 2,5% 5,0% 7,5% 10,0% 4 5 6 7 8 9 25°C 28°C 30°C 35°C 37°C
MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP MD DP
1II 2,40 0,18 2,93 0,30 2,58 0,25 1,93 0,38 1,33 0,24 1,50 0,71 1,73 0,42 1,90 0,24 2,09 0,06 1,63 0,12 1,63 0,64 3,10 0,00 1,65 0,07 0,30 0,00 0,30 0,00 0,23 0,15
1PD 1,63 0,68 2,33 0,29 2,18 0,25 1,94 0,39 1,48 0,68 2,00 0,00 2,23 0,05 2,10 0,35 2,17 0,12 1,71 0,16 1,93 0,22 3,40 0,00 2,27 0,06 1,28 0,04 0,30 0,00 0,00 0,00
3II 1,22 0,13 2,35 0,30 2,48 0,17 2,38 0,13 1,95 0,47 1,20 0,09 1,33 0,10 1,23 0,21 1,13 0,03 0,91 0,03 1,20 0,12 1,11 0,33 1,33 0,06 1,12 0,33 0,40 0,14 0,25 0,29
3PD 1,17 0,15 2,18 0,21 2,43 0,29 2,48 0,05 2,15 0,13 1,25 0,07 1,23 0,15 1,30 0,14 1,20 0,00 1,03 0,16 1,28 0,05 1,90 0,00 1,33 0,12 1,23 0,04 0,20 0,23 0,25 0,29
4II 1,25 0,19 2,23 0,18 2,20 0,28 2,25 0,07 2,05 0,07 1,10 0,23 1,25 0,06 1,21 0,05 1,37 0,06 1,07 0,10 1,10 0,24 1,43 0,15 1,25 0,06 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
6II 1,13 0,38 1,88 0,58 2,19 0,31 2,08 0,29 1,71 0,35 1,08 0,10 1,26 0,05 1,29 0,10 1,28 0,03 0,94 0,06 1,10 0,17 1,40 0,22 1,28 0,05 0,90 0,26 0,00 0,00 0,00 0,00
7II 1,23 0,06 1,69 0,22 1,95 0,20 1,99 0,35 1,29 0,92 0,93 0,04 1,00 0,00 0,78 0,32 0,77 0,29 0,79 0,32 0,80 0,41 1,30 0,00 1,00 0,00 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
CL 0,71 0,17 0,63 0,10 0,41 0,05 0,34 0,05 0,30 0,41 0,90 0,09 0,80 0,14 0,88 0,04 0,90 0,00 0,83 0,09 0,93 0,06 0,80 0,17 1,28 0,49 0,53 0,40 1,20 0,00 0,95 0,07
CB 0,78 0,29 0,65 0,06 0,38 0,06 1,25 2,10 0,05 0,06 1,08 0,18 1,00 0,00 0,95 0,07 0,88 0,04 0,73 0,00 0,90 0,00 0,88 0,03 0,95 0,07 0,90 0,00 0,80 0,00 1,05 0,07
CB2 0,48 0,04 0,30 0,14 0,13 0,04 0,05 0,07 0,00 0,00 0,50 0,00 0,48 0,04 0,40 0,14 0,30 0,00 0,30 0,07 0,45 0,07 0,40 0,00 0,47 0,00 0,43 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00
CFV 1,15 0,06 1,10 0,00 0,57 0,25 0,36 0,20 0,00 0,00 0,98 0,10 1,07 0,15 1,02 0,03 1,10 0,00 0,84 0,06 0,90 0,00 0,90 0,10 1,00 0,00 0,93 0,25 0,45 0,07 0,21 0,25
FO 1,48 0,19 2,50 0,22 2,47 0,21 2,51 0,52 1,77 0,46 1,29 0,18 1,40 0,18 1,38 0,03 1,38 0,12 1,11 0,13 1,25 0,24 1,53 0,06 1,43 0,13 1,20 0,12 0,39 0,10 0,25 0,29
CT 1,48 0,10 2,11 0,38 2,53 0,32 2,45 0,13 1,96 0,59 1,22 0,32 1,34 0,23 1,36 0,26 1,23 0,32 1,01 0,49 1,08 0,32 1,23 0,45 1,28 0,34 1,20 0,00 0,30 0,00 0,00 0,00
C1 1,70 0,09 2,60 0,27 2,13 0,15 1,68 0,21 1,15 0,17 1,41 0,17 1,61 0,13 1,61 0,27 1,60 0,36 1,25 0,21 1,40 0,18 1,48 0,17 1,46 0,19 0,95 0,21 0,00 0,00 0,00 0,00
DM 1,57 0,06 2,73 0,22 2,76 0,31 2,68 0,24 2,00 0,20 1,24 0,16 1,23 0,38 1,25 0,29 1,33 0,26 1,30 0,06 1,55 0,12 1,50 0,46 1,18 0,24 1,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00
IFV1 4,65 0,21 4,75 0,07 4,05 0,21 2,45 0,07 0,00 0,00 4,80 0,28 4,65 0,21 4,00 0,00 4,43 0,04 3,39 0,64 4,90 0,14 3,30 0,14 4,63 0,04 2,60 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
IFV3 0,90 0,00 2,45 0,17 2,30 0,10 1,61 0,25 1,00 0,18 1,10 0,00 0,95 0,07 0,90 0,00 0,68 0,04 0,48 0,07 0,00 0,00 3,40 0,00 0,93 0,04 1,25 0,07 0,00 0,00 0,00 0,00
IFV7 1,15 0,92 2,15 0,13 1,78 0,15 1,19 0,09 0,65 0,07 0,40 0,14 0,35 0,07 0,50 0,00 0,40 0,00 0,35 0,00 0,60 0,00 3,70 0,28 0,33 0,04 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
IFV8 1,14 0,05 2,40 0,14 1,88 0,17 1,26 0,18 0,80 0,14 1,18 0,04 1,30 0,07 1,18 0,04 0,98 0,04 0,68 0,07 0,70 0,00 3,65 0,35 1,33 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
FV11 1,85 0,78 2,45 0,07 1,48 0,90 0,90 0,35 0,40 0,12 1,20 0,00 1,60 0,42 1,15 0,07 1,15 0,07 0,86 0,00 0,80 0,14 3,90 0,00 1,63 0,04 1,55 0,49 0,00 0,00 0,00 0,00
12 0,90 0,10 0,95 0,07 1,10 0,14 0,97 0,06 0,63 0,55 0,70 0,00 0,95 0,07 0,90 0,00 0,50 0,00 0,28 0,00 0,00 0,00 3,10 0,14 0,97 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
13 1,00 0,17 1,67 0,23 1,80 0,16 1,48 0,33 1,65 0,07 1,03 0,75 1,17 0,15 1,09 0,23 1,25 0,50 0,83 0,26 0,80 0,35 1,43 0,06 1,27 0,15 1,01 0,13 0,15 0,17 0,00 0,00
NaCl pH Temperatura
77
ANEXO
ANEXO 1 – Protocolo de Extração de DNA Mo Bio - Ultra Clean® Microbial DNA
Isolation Kit
