Universidade de So Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Prebiticos e probiticos dietticos, desempenho e higidez de juvenis de pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887)

Brunno da Silva Cerozi

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia Animal e Pastagens

Piracicaba 2012

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Brunno da Silva Cerozi Engenheiro Agrnomo

Prebiticos e probiticos dietticos, desempenho e higidez de juvenis de pacu Piaractus

mesopotamicus (Holmberg, 1887)

verso revisada de acordo com a resoluo CoPGr 6018 de 2011

Orientador: Prof. Dr. JOS EURICO POSSEBON CYRINO

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia Animal e Pastagens

Piracicaba 2012

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao DIVISO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP

Cerozi, Brunno da Silva Prebiticos e probiticos dietticos, desempenho e higidez de juvenis de pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) / Brunno da Silva Cerozi. - - verso revisada de acordo com a resoluo CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2012.

79 p. : il.

Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2012.

1. Suplementos dietticos 2. Imunomodulao 3. -glucano 4. Bacillus subtilis 5. Piaractus mesopotamicus 6. Morfologia intestinal 7. Pacu I. Ttulo

CDD 639.375 C416p

Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor

3

minha me, Mrian da Silva Cerozi, ao meu pai, Rubens Cerozi Jnior,

aos meus avs Palmira e Grson, Rosalina e Rubens, pelo amor,

esforo, ensinamentos e confiana.

Mellina da Silva Cerozi, minha irm e eterna amiga, pelo amor,

apoio e incentivo.

Jacqueline Mazini Lafratta, minha eterna fonte de inspirao,

amor da minha vida.

DEDICO

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AGRADECIMENTOS

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Universidade de So Paulo e ao

Programa de Ps-graduao em Cincia Animal e Pastagens do Departamento de Zootecnia

pela oportunidade da realizao do curso;

Ao Prof. Dr. Jos Eurico Possebon Cyrino, por todos os ensinamentos, conselhos e

amizade, que contriburam para minha formao cientfica e pessoal;

Aos professores do Curso de Ps-Graduao em Cincia Animal e Pastagens, pela

disponibilidade, ateno e conhecimento compartilhado;

FAPESP pelo apoio financeiro fornecido atravs de bolsa de estudos;

Ao amigo Ricardo Basso Zanon, um agradecimento especial, no s pela ajuda

prestada na montagem, conduo e avaliao de todos os experimentos envolvidos nessa

dissertao, mas principalmente pela amizade e apoio at quando tudo estava perdido;

Aos colegas de laboratrio Tarcila Silva, Lgia Uribe, Giovanni Vitti Moro e Thyssia

Bomfim pelo convvio e pelo auxlio no desenvolvimento dos projetos de pesquisa;

Aos amigos Prof. Dr. lvaro Bicudo, Prof. Dr. Ricardo Sado e Dr. Ricardo Borghesi

pelos conselhos, mesmo que distncia;

Aos tcnicos do Setor de Piscicultura Srgio Vanderlei Pena e Ismael Baldessin Junior

pela ajuda na instalao dos experimentos;

A todos que de maneira direta ou indireta me ajudaram na realizao deste trabalho.

MUITO OBRIGADO!

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7

Penso, logo existo.

Ren Descartes

Se A o sucesso, ento A igual a X mais Y mais Z. O trabalho X; Y o lazer; e Z manter a boca fechada.

Albert Einstein

O ignorante afirma, o sbio duvida, o sensato reflete.

Aristteles

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SUMRIO RESUMO ................................................................................................................................. 11

ABSTRACT ............................................................................................................................. 13

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. 15

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. 17

1 INTRODUO ..................................................................................................................... 19

2 REVISO BIBLIOGRFICA .............................................................................................. 21

2.1 Imunoestimulantes na nutrio de peixes ........................................................................... 21

2.1.1 Prebiticos ....................................................................................................................... 24

2.1.2 Probiticos ....................................................................................................................... 27

2.1.3 Simbiticos ...................................................................................................................... 30

2.1.4 Imunoestimulantes e suas respostas imunolgicas .......................................................... 31

2.1.5 Imunoestimulantes e a morfologia intestinal ................................................................... 33

2.2 Modelo biolgico utilizado ................................................................................................. 34

3 MATERIAL E MTODOS ................................................................................................... 37

3.1 Dietas e delineamento experimental Experimento 1 ....................................................... 37

3.2 Dietas e delineamento experimental Experimento 2 ....................................................... 39

3.3 Avaliao dos parmetros de desempenho ......................................................................... 40

3.4 Avaliao das respostas imunolgicas ............................................................................... 40

3.4.1 Protenas totais, albumina, globulina sricas e ndice A:G ............................................. 40

3.4.2 Ensaio da atividade de lisozima....................................................................................... 41

3.4.3 Exploso respiratria de leuccitos ................................................................................. 41

3.5 Avaliao da morfologia intestinal ..................................................................................... 42

3.6 Anlises estatsticas ............................................................................................................ 42

4 RESULTADOS E DISCUSSO .......................................................................................... 43

4.1 Parmetros de desempenho ................................................................................................ 43

4.2 Protenas totais, albumina, globulina sricas e ndice A:G ................................................ 46

4.3 Exploso respiratria de leuccitos .................................................................................... 50

4.4 Atividade de lisozima ......................................................................................................... 53

4.5 Avaliao da morfologia intestinal ..................................................................................... 55

5 CONCLUSO ....................................................................................................................... 61

REFERNCIAS ....................................................................................................................... 63

ANEXOS .................................................................................................................................. 77

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RESUMO

Prebiticos e probiticos dietticos, desempenho e higidez de juvenis de pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887)

O aumento populacional e a elevao no consumo de alimentos tem aumentado a

necessidade de intensificao da aquicultura objetivando maiores produtividades para atendimento elevao na demanda. Consequentemente, aumentam as chances de ocorrncia de surtos epizoticos dentro dos sistemas de produo, devido ao maior estresse imposto aos animais densidade elevada, manejo constante, transporte, baixa qualidade da gua, etc. Alteraes no estado fisiolgico dos animais fazem com que seu sistema imunolgico no consiga combater agentes incuos em situaes normais, mas que se tornam patognicos nos casos de imunodepresso, levando a grandes perdas econmicas, seja com mo de obra, mortandade, medicamentos, etc. Assim, este estudo avaliou o efeito da administrao individual ou conjunta de -glucano e Bacillus subtilis na dieta de juvenis de pacu, Piaractus mesopotamicus. Em um primeiro ensaio, quantidades crescentes de -glucano (60; 120; 180; 240 e 300 mg kg-1 de rao) e de B. subtilis (109 UFC g-1 de B. subtilis; 0,025%, 0,050%, 0,075%, 0,100%, 0,125%) foram adicionados a uma dieta basal extrudada (32% de protena bruta PB; 3200 kcal kg-1 de energia digestvel ED) e administrados a juvenis de pacu (8,91 0,30 g) at a saciedade aparente por 75 dias, em um delineamento inteiramente aleatorizado. Ao final do perodo experimental, os animais foram anestesiados, pesados, submetidos coleta de sangue e tecidos, para determinao do ganho de peso, converso alimentar, taxa de crescimento especfico, protenas totais, albumina e globulina sricas, ndice albumina:globulina (A:G), atividade da lisozima srica, exploso respiratria de leuccitos e morfometria intestinais. Em um segundo ensaio conduzido nas mesmas condies ambientais, juvenis de pacu (2,0 0,1 g; 15 peixes/aqurio) foram alimentados por 59 dias com raes suplementadas pelos aditivos em questo, mais um grupo controle: -glucano de levedura 240 mg kg-1 de rao; B. subtilis comercial (109 UFC B. subtilis g-1) 0,100% de incluso; tratamento simbitico 240 mg de -glucano kg-1 + 0,100% de B. subtilis. Ao final do perodo experimental os peixes foram amostrados para determinao dos mesmos parmetros anteriormente descritos. A incluso dos nveis de -glucano e de Bacillus subtilis na dieta no influenciou o desempenho (P>0,05) de juvenis de pacu, mas peixes alimentados com a dieta contendo o B. subtilis consumiram mais rao (P0,05), nem nos valores de exploso respiratria, atividade de lisozima, protenas totais sricas e globulinas sricas. Quando os dois imunoestimulantes foram adicionados s dietas em combinao, tambm no foi observado efeito sobre os parmetros de desempenho, exploso respiratria e atividade de lisozima, mas as proteinas totais sricas e as globulinas sricas foram positivamente influenciadas pelos tratamentos (P

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ABSTRACT

Dietary prebiotics and probiotics, performance and health of pacu juvenile (Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887)

Stimulation of immune response by dietary supplements has already been proven

effective in aquaculture. This work evaluates effects of dietary supplementation with the prebiotic -glucan, the probiotic Bacillus subtilis and their synbiotic combination on growth performance, immune responses, and intestinal morphology of pacu Piaractus mesopotamicus. In a first trial, a basal diet (32% crude protein; 3200 kcal kg-1) was supplemented with either -glucan (60; 120; 180; 240 e 300 mg kg-1) and B. subtilis (109 UFC g-1 of B. subtilis; 0.025%, 0.050%, 0.075%, 0.100%, 0.125%) levels and fed to groups of juvenile pacu (eight fish; 8.91 0.3 g) stocked in 33 glass aquariums (70 L) for 75 days, setting up a totally randomized design trial (n=3). Fish were then weighed and had their blood drawn for determination of leucocytes respiratory burst activity, serum lysozyme activity and serum immunoglobulin concentration; intestinal tissue was sampled from two fish from each unit for micromorphology analysis. The inclusion of -glucan and Bacillus subtilis in the diet did not affect growth (P>0.05) of pacu juvenile, but fish fed diet containing levels of B. subtilis showed higher feed consumption (P0.05). In a second trial, a basal diet (34% crude protein; 3400 kcal kg-1) was supplemented with either -glucan (240 mg kg-1), B. subtilis (0.1 %) and -glucan + B. subtilis mix and fed to groups of juvenile pacu (15 fish; 2.0 0.1 g) stocked in 16 glass aquariums (70 L) for 59 days, setting up a totally randomized design trial (n=4). Fish fed diets supplemented with -glucan + B. subtilis mix presented better growth rate, but it was not significantly different from other feeding groups. Serum total proteins and serum globulins (serum total proteins serum albumin) were affected by dietary supplements (P < 0.05); fish receiving the synbiotic treatment had higher serum globulin contents, but respiratory burst and lysozyme activity were not significantly affected. Dietary synbiotic mix altered the micromorphology of anterior intestine (P < 0.05), but the same effect was not observed in the mid and posterior intestines (P > 0.05). Dietary -glucan + B. subtilis synbiotic mix affected the intestinal ultrastructure of pacu, improved responses of immune system but did not significantly affect growth rate.

Keywords: Piaractus mesopotamicus; Synbiotics; Immunology; Performance; Intestinal

morphology

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Nveis de reao ou proteo dos imunoestimulantes. A altura das colunas indica os nveis de proteo que um peixe pode apresentar aps exposio ao PBS, imunoestimulantes, vacinas ou uma combinao dos dois. Adaptado de Anderson (1992) .... 21

Figura 2 - Diagrama mostrando as diferentes ligaes dos -glucanos. (A) glucanos encontrados em cereais; (B) glucanos encontrados em micro-organismos. Adaptado de Park et al. (2003) ................................................................................................................................... 25

Figura 3 - Atividade respiratria de leuccitos do sangue de pacus alimentados com nveis crescentes de -glucano na rao ( DP) .............................................................................. 50

Figura 4 - Atividade respiratria de leuccitos do sangue de pacus alimentados com nveis crescentes de Bacillus subtilis na rao ( DP) ..................................................................... 51

Figura 5 - Atividade respiratria de leuccitos do sangue de pacus alimentados com diferentes imunoestimulantes na rao ( DP). -glucano = 240 mg kg-1; B. subtilis = 0,100% de incluso; simbitico = 240 mg kg-1 + 0,100% ........................................................ 52

Figura 6 - Atividade de lisozima srica de pacus alimentados com nveis crescentes de -glucano na rao ( DP) ........................................................................................................ 53

Figura 7 - Atividade de lisozima srica de pacus alimentados com dietas contendo nveis crescentes de Bacillus subtilis ( DP) ................................................................................... 54

Figura 8 - Atividade de lisozima srica de pacus alimentados com diferentes imunoestimulantes na rao ( DP). -glucano = 240 mg kg-1; B. subtilis = 0,100% de incluso; simbitico = 240 mg kg-1 + 0,100% .......................................................................... 55

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composio da dieta basal experimental, ensaio 1 ................................................. 38

Tabela 2 - Recuperao de B. subtilis nas dietas experimentais aps suplementao por asperso oleosa ......................................................................................................................... 38

Tabela 3 - Composio da dieta basal experimental, ensaio 2 ................................................. 39

Tabela 4 - Recuperao de B. subtilis nas dietas experimentais .............................................. 39

Tabela 5 - Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa de crescimento especfico (TCE) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com nveis crescentes de -glucano ..................................... 43

Tabela 6 Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa de crescimento especfico (TCE) de juvenis de pacu alimentados com nveis de B. subtilis ............................................................................................................................. 44

Tabela 7 - Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa de crescimento especfico (TCE) de pacus alimentados com a combinao de -glucano e B. subtilis ..................................................................................... 45

Tabela 8 - Protenas totais sricas (PT), albumina srica (ALB), globulinas sricas (GLO) e relao albumina:globulina (A:G) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com nveis de incluso de -glucano ............................................................... 47

Tabela 9 - Protenas totais sricas (PT), albumina srica (ALB), globulinas sricas (GLO) e relao albumina:globulina (A:G) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com nveis de incluso de B. subtilis ............................................................... 48

Tabela 10 - Protenas totais sricas (PT), albumina srica (ALB), globulinas sricas (GLO) e relao albumina:globulina (A:G) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com diferentes imunoestimulantes ................................................................... 49

Tabela 11 Altura de dobras (hD) e altura de microvilosidades intestinais (hMV) de pacus alimentados com nveis crescentes de -glucano durante 75 dias ............................................ 56

Tabela 12 Altura de dobras (hD) e altura de microvilosidades intestinais (hMV) de pacus alimentados com nveis crescentes de B. subtilis durante 75 dias ............................................ 57

Tabela 13 - Morfologia intestinal de juvenis de pacu (m) alimentados com dietas suplementadas com imunoestimulantes durante 59 dias .......................................................... 58

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1 INTRODUO

A populao mundial tem aumentado em ritmo tal que para o ano de 2050 estima-se

que o nmero de pessoas no mundo, que em 2007 era de 6,7 bilhes, varie entre 7,8 a 11,8

bilhes (NAES UNIDAS, 2007), ou seja, considerando as expectativas mais

conservadoras, possvel que a populao mundial cresa a uma taxa de, pelo menos, 16,8%

nas prximas quatro dcadas. Desse modo, fcil antecipar que haver necessidade de

aumentar a oferta de alimento para sustentar o foroso aumento da demanda.

A piscicultura mundial cresceu consideravelmente durante a dcada passada e um

crescimento adicional esperado nos prximos anos em resposta ao crescimento populacional

e consequente aumento na demanda por produtos de carne de peixe. Os estoques naturais

esto supra-explotados, fato que tem limitado a captura de pescado na natureza. A produo

da aquicultura mundial, em que se inclui a piscicultura, saltou de apenas um milho de

toneladas nos anos 1950, para 51,7 milhes de toneladas no ano de 2006, constituindo-se no

setor de mais rpido crescimento em comparao aos outros setores na produo de alimentos

(FAO, 2008). Em 2008 a aquicultura foi responsvel por 47% de todo o abastecimento

pesqueiro e seu maior produtor mundial, a China, foi responsvel por 69% de todo pescado

oriundo de aquicultura (FAO, 2010). Concomitantemente ao aumento generalizado da

piscicultura, ocorre a tendncia de intensificao das prticas de criao em funo dos

constantes avanos tecnolgicos e cientficos, bem como incentivos econmicos para

aumentar a quantidade de produtos comercializveis por unidade de sistema de produo.

Como resultado, existe uma tendncia de piora da qualidade da gua nos sistemas intensivos

de produo como resultado das costumeiramente elevadas densidades de estocagem de

peixes. Esse cenrio deve levar ao aumento da incidncia de doenas e outros efeitos

deletrios sade dos peixes confinados. Dentre os principais agentes causadores de doenas,

esto bactrias como as do gnero Aeromonas sp., micro-organismos cosmopolitas, ubquos,

ordinariamente inofensivos, mas agentes patognicos oportunistas de etiologia severa

(PLUMB, 1999), comumente combatidos pela adio de quimioterpicos e antibiticos s

dietas. Entretanto, o uso indiscriminado de agentes teraputicos pode levar ao

desenvolvimento de cepas de organismos resistentes (COLLADO et al., 2000; KAWAKAMI

et al., 1997).

A utilizao de antibiticos em doses sub-teraputicas como promotores de

crescimento na produo animal tem sido praticada por cerca de 50 anos em vrios pases, o

Brasil inclusive (DIBNER; RICHARDS, 2005). Entretanto, apesar dos timos resultados da

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desta prtica, vrios pases vm impondo barreiras importao, exportao e consumo de

produtos de origem animal tratados com tais substncias. A Sucia foi primeira nao a banir

em 1986 o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento (DIBNER; RICHARDS

apud AARESTRUP, 2003). Desde 2006, a Unio Europeia baniu a administrao de

quaisquer tipos de antibiticos e drogas promotoras de crescimento a quaisquer rebanhos

confinados. Por essas e outras razes, se o agronegcio da aquicultura deseja competir de

maneira incisiva no mercado internacional, ter de se adaptar exigncia cada vez mais

restritiva da no utilizao de antibiticos e drogas relacionadas nas suas criaes.

Assim sendo, o desenvolvimento de estratgias de profilaxia, que permitem aos

animais combaterem os agentes patognicos per se, vm ganhando mais ateno e sendo

desenvolvidas. Uma destas possveis estratgias a adio de fatores dieta dos animais que

aumentem a resistncia dos animais aos processos infecciosos, com destaque para os

imunoestimulantes, substncias ou micro-organismos capazes de modular o sistema

imunolgico do animal, no s evitando a ocorrncia de surtos epizoticos, como tambm

contribuindo para a melhora do ambiente aqutico, promovendo assim melhores ndices de

desempenho zootcnico e, consequentemente, melhorando os ndices econmicos.

21

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Imunoestimulantes na nutrio de peixes

Imunoestimulantes so fatores capazes de melhorar os mecanismos de defesa do

organismo. Por definio, um imunoestimulante pode ser uma substancia qumica, um

estressor ou uma ao que aumenta os mecanismos de defesa no especficos, bem como os as

respostas especficas (ANDERSON, 1992). A altura das colunas na Figura 1, por exemplo,

representa os nveis de proteo que um peixe pode apresentar aps exposio soluo

tampo fosfato-salino [phosphate buffered saline PBS], imunoestimulantes, vacinas ou uma

combinao dos dois. Peixes mantm um nvel baixo de alerta contra patgenos: (a) o simples

manejo dos animais pode induzir alguns nveis adicionais (ou tambm reduzir) contra doenas

atravs da estimulao da defesa no especfica; (b) o mesmo acontece com a injeo de PBS,

porm, podendo provocar uma resposta levemente acentuada; (c) administrao de

imunoestimulantes ir induzir altos nveis de respostas no especficas, bem como as

respostas especficas; (d) reao esperada ou nvel de proteo induzida por uma vacina; (e)

imunoestimulantes adicionados a vacinas conferem proteo mxima:

ab

c

d

e

Manejo PBS Imunoestimulante Vacina Vacina+Imunoest.

Nveis de reao ou proteo

Figura 1 Nveis de reao ou proteo dos imunoestimulantes. A altura das colunas indica os nveis de proteo que um peixe pode apresentar aps exposio ao PBS, imunoestimulantes, vacinas ou uma combinao dos dois. Adaptado de Anderson (1992)

Os imunoestimulantes podem ser divididos em diversos grupos dependendo de suas

fontes: bacteriano, derivados de algas, nutrientes, aditivos dietticos, hormnios e citocinas

(SAKAI, 1999). Em aquicultura, os imunoestimulantes so muito aplicados na larvicultura,

22

existindo muitos exemplos de sucesso do seu uso na melhora do bem estar, sade e produo

de peixes (BRICKNELL; DALMO, 2005). Os benefcios tericos da utilizao de

imunoestimulantes so considerveis, com destaque para o potencial de melhora dos

mecanismos de defesa inata dos peixes antes e depois da exposio a um agente patognico.

Desse modo, tem sido demonstrado que alguns imunoestimulantes podem ser efetivos contra:

(i) infeces bacterianas: melhora na resistncia por meio de -glucanos, muramil dipeptdeo

(MDP) e peptideoglicano; (ii) infeces virais: melhora na resistncia pelo levamisol, CpG,

single-stranded RNA (ssRNA), MDP, -glucanos e lipopolissacardeos (LPS); e (ii)

infestaes por parasitas: melhora na resistncia obtida por meio de -glucanos, MDP e

levamisol (BRICKNELL; DALMO, 2005).

Alguns componentes bacterianos so capazes de estimular as respostas celulares e

inflamatrias em animais, considerando, logicamente, que estes indivduos estejam

condicionados geneticamente e ambientalmente a combater agentes patognicos

(ANDERSON, 1992). Por exemplo, o muramil-dipeptdeo (MDP), um componente da parede

celular de Mycobacterium sp., j foi usado experimentalmente para estimular respostas em

pacientes com cncer (ADAMS; LEDERER, 1984 apud ANDERSON, 1992), ativao de

macrfagos, linfcitos B e via alternativa do complemento em camundongos (SAKAI, 1999),

atividade fagoctica, atividade respiratria de leuccitos e resistncia a desafio bacteriano em

truta arco-ris (KODAMA et al., 1993 apud SAKAI, 1999).

A exemplo dos -glucanos de leveduras ou a quitosana do exoesqueleto de artrpodes,

os imunoestimulantes podem ser frequentemente obtidos de fontes naturais em grandes

quantidades, podendo assim ser considerados suplementos dietticos de relao custo-

benefcio muito vantajosas em funo do baixo custo das suas fontes (BRICKNELL;

DALMO, 2005).Os benefcios dos imunoestimulantes aos animais so muitos e variados. Os

efeitos mais relevantes j relatados em peixes tratados com estes imunoestimulantes podem

ser: aumento de sobrevivncia aps desafios bacterianos; efeitos antiparasitrios, como a

reduzida infestao de piolho marinho; aumento da resistncia infeco viral e aumento dos

nveis de interferon; melhora no crescimento; aumento dos nveis de lisozima; aumento da

produo de anticorpos aps vacinao; aumento da atividade dos macrfagos (fagocitose,

produo de radicais livres, atividade enzimtica, produo de citocinas, produo de xido

ntrico e destruio de bactrias) e aumento da proliferao celular (BRICKNELL; DALMO,

2005).

Componente de parede celular de bactrias Gram-negativas, o lipopolissacardeo

[LPS] capaz estimular genes relacionados ao sistema imunolgico (DARAWIROJ et al.,

23

2008). O LPS pode estimular a fagocitose in vitro e a produo de nions superxido em

macrfagos de salmo do Atlntico (Salmo salar) (SOLEM; JORGENSEN; ROBERTSEN,

1995); aumentar a atividade de lisozima, os nveis de globulinas totais e atividade respiratria

de leuccitos em Labeo rohita (NAYAK et al., 2008); aumentar o ndice de fagocitose de

macrfagos e do nvel de Ig em Cyprinus carpio (KOZINSKA; GUZ, 2004); e aumentar a

contagem de neutrfilos e moncitos em Cyprinus carpio (SELVARAJ; SAMAPATH;

SEKAR, 2006).

Dinucleotdeos citosina-guanina no-metilados [CpG] so pequenas sequncias de

DNA (motifs), prevalentes em DNAs bacterianos e virais, mas fortemente suprimidos e

metilados em genomas de vertebrados (DEMPSEY et al, 1996; KRIEG et al, 1995). Dessa

forma, motifs de CpG no-metilados possuem atividade imunoestimulante (WEINER et al.,

1997). O sistema imunolgico responde a motifs de CpG ativando as respostas Toll-like-1

que podem ser aproveitadas para imunoterapia do cncer, alergias e processos infecciosos

(KRIEG, 2002). Receptores Toll-like esto localizados na membrana celular dos

componentes do sistema imunolgico e possuem a capacidade de identificar os Pathogen-

associated molecular patterns [PAMPs], molculas existentes em bactrias e vrus que

estimulam a resposta inflamatria aps serem identificadas como estranha pelos receptores

Toll-like. O CpG capaz de ativar leuccitos de peixes (JORGENSEN et al., 2003) e, em

particular, estimular a produo de interleucina-1 em truta arco-ris (Oncorhyncus mykiss)

(JORGENSEN et al., 2001). O oligodesoxidinucletdeo sinttico contendo CpG no-metilado

foi avaliado em relao a sua habilidade em melhorar as respostas inatas em carpa comum;

injees dirias peritoneais de CpG por trs dias resultaram em aumento da atividade

fagocitria e aumento da atividade respiratria das clulas fagocitrias do rim; a atividade de

lisozima srica tambm foi maior em peixes que receberam o tratamento (TASSAKKA;

SAKAI, 2002).

O uso de substncias naturais na criao de peixes tem sido amplamente descrito na

literatura e recebido mais ateno, o contrrio acontecendo em relao s substncias ou

drogas sintticas, menos utilizadas, mas de igual importncia (CUESTA; ESTEBAN;

MESENGUER, 2002). Nesse contexto, o levamisol, um derivado sinttico do imidazotiazol,

um anti-helmntico usado para tratamento de infestaes por nematoides em animais e seres

humanos, conhecido tambm por apresentar atividade imunomodulatria, nas formas

injetveis, banho ou oral. A administrao oral de levamisol aumenta o nmero de leuccitos,

atividade de lisozima, atividade respiratria de leuccitos e ndice de fagocitose, e banhos

com levamisol aumentam a resistncia contra Aeromonas hydrophila, a habilidade

24

quimiotxica de fagcitos e a atividade fagocitria em carpas comum (BABA et al., 1993;

SIWICK, 1989). O levamisol apresenta atividades tanto em estudos realizados in vivo como

ensaios in vitro. Em um estudo com a dourada (Sparus aurata), o levamisol foi capaz de

melhorar a atividade citotxica das clulas em ensaios in vivo e in vitro, alm de demonstrar

uma ao elevada e duradoura quando administrado pela dieta (CUESTA; ESTEBAN;

MESENGUER, 2002).

2.1.1 Prebiticos

Prebiticos so substncias no digerveis por enzimas do trato gastrintestinal, mas

capazes de serem seletivamente hidrolisadas por micro-organismos especficos que compem

a microbiota intestinal, promovendo benefcios ao hospedeiro. Para ser considerado

prebitico, um aditivo alimentar precisa atender aos seguintes critrios (FOOKS et al., 1999):

(i) no deve ser hidrolisado, nem absorvido na parte anterior do trato gastrintestinal; (ii) deve

ocorrer fermentao seletiva por bactrias potencialmente benficas no clon; (iii) deve

provocar alteraes na composio da microbiota do clon a fim de uma composio mais

saudvel e, (iv) preferencialmente, deve induzir efeitos que so benficos sade do

hospedeiro.

Os prebiticos utilizados como imunoestimulantes na aquicultura podem ser:

derivados de bactrias e leveduras, entre eles o muramil-dipeptdeo (MDP), os

lipopolissacardeos de membrana [LPS], o adjuvante completo de Freund, as bacterinas de

diversas espcies, os oligossacardeos, os glucanos (origem vegetal, fngica e leveduras), a

quitina e a quitosana (SADO, 2008). Os oligossacardeos, polmeros de dois a dez monmeros

de monossacardeos, tem sido empregados com frequncia como prebiticos na aquicultura.

Dentre eles podem-se citar os frutoligossacardeos [FOS], encontrado em fontes vegetais; o

mananoligossacardeo [MOS], extrado da parede celular de Saccharomyces cerevisiae; o

galactoligossacardeo [GOS], que consiste de uma cadeia pequena de molculas de galactose;

o xiloligossacardeo [XOS], constitudo por unidades de xilose e extrado industrialmente de

materiais lignocelulsicos, e a inulina, um polmero de frutose obtida de fontes vegetais,

sendo que o MOS o mais importante e largamente utilizado na nutrio animal. A

suplementao diettica de MOS ao salmo do Atlntico (S. salar), resultou em aumento da

digestibilidade aparente da energia das dietas e reduo na produo de radicais oxidativos

pelos neutrfilos e na atividade de lisozima srica (GRISDALE-HELLAND; HELLAND;

GATLIN III, 2008). Por outro lado, trutas arco-ris apresentaram melhores indicadores de

25

status imunolgico, desempenho e sobrevivncia quando alimentadas com dietas

suplementadas com MOS (STAYKOV et al., 2007). Alevinos de trutas arco-ris alimentados

com dietas contendo MOS apresentaram aumento da superfcie absortiva do intestino,

aumento do comprimento e da densidade das microvilosidades, mas o mesmo no foi relatado

para juvenis da espcie; por outro lado, o MOS foi capaz de modular a microbiota intestinal

de ambos os grupos (DIMITROGLOU et al., 2009).

As quitosanas so polissacardeos obtidos comercialmente a partir da deacetilao da

quitina, o elemento estrutural do exoesqueleto de crustceos e insetos, e da parede celular de

alguns fungos e leveduras. Quitosanas apresentam uma grande variedade de aplicaes na

medicina, agricultura e aquicultura (CHAA et al., 2008), sendo que atividade

imunomodulatria desses polissacardeos tem sido reportada na criao de organismos

aquticos (SAKAI, 1999). Por exemplo, o olive flounder Paralichthys olivaceus alimentado

com dieta suplementada por quitosana apresentou melhor atividade respiratria de neutrfilos

e de lisozima do muco em comparao dieta basal (CHAA et al., 2008). A suplementao

diettica de quitina e quitosana tambm estimulou os parmetros imunolgicos e

hematolgicos de Epinephelus bruneus, alm de ter melhorado resistncia ao desafio por

Vibrio alginolyticus (HARIKRISHNAN et al., 2012).

Os -glucanos so um grupo de polissacardeos de vrios monmeros de D-glicose

unidos por ligaes -glicosdicas, de massa molecular, solubilidade, viscosidade e

configurao tridimensional variveis. Ocorrem nas plantas na forma de celulose, no farelo de

gros cereais (CARR et al., 1990), na parede celular de leveduras, em alguns fungos e

cogumelos (ENGSTAD; ROBERTSEN; FRIVOLD, 1992). As formas mais ativas dos -

glucanos so aquelas que constituem monmeros de D-glicose com ligaes (1,3) e as

ligaes com cadeias laterais de D-glicose ligados na posio (1,6) (Figura 2).

Figura 2 - Diagrama mostrando as diferentes ligaes dos -glucanos. (A) glucanos encontrados em cereais; (B)

glucanos encontrados em micro-organismos. Adaptado de Park et al. (2003)1

1 PARK, Y.K.; IKEGAKI, M.; ALENCAR, S.M.; AGUIAR, C.L. Determinao da concentrao de -glucano em cogumelo Agaricus blazei Murill por mtodo enzimtico. Cincia e Tecnologia de Alimentos, v. 23, 2003.

26

A localizao, frequncia e comprimento das cadeias laterais, ao invs da cadeia

principal dos -glucanos, determinam a sua atividade sobre o sistema imunolgico (OOI;

LIU, 2000). As diferenas entre as ligaes e tipos de estrutura qumica dos diferentes tipos

de -glucanos so significantes em relao solubilidade, ao modo de ao e atividade

biolgica em geral. Nesse aspecto, a forma insolvel de -glucano (1,3/1,6) possui atividade

biolgica maior que seus homlogos solveis -glucano (1,3/1,4) (OOI; LIU, 2000).

Quando os receptores presentes nos macrfagos e nos leuccitos granulcitos se ligam

molcula de -glucano, ocorre produo de radicais livres e enzimas antioxidantes, de forma

que a atividade antimicrobiana e anti-estresse aumentada (SANTAREM et al., 1997).

Apesar de estudos j terem mostrado que existem receptores de glucanos em macrfagos dos

peixes (ENGSTAT; ROBERTSEN; FRIVOLD, 1992; AINSWORTH, 1994), o mecanismo

pelo qual os -glucanos modulam a imunidade em peixes ainda no est completamente

elucidado (AI et al., 2007). J foi tambm demonstrado em estudos com mamferos que os -

glucanos so capazes de modular a atividade da enzima antioxidante superxido dismutase,

inibir a peroxidao de lipdios (BOBEK; NOSALOVA; CERNA, 2001), ativar a produo

de citocinas como IL-6, IL-8 (WOUTERS et al., 2002), estimular a proliferao de moncitos

e macrfagos (YOUNG et al., 2001) e aumentar a resposta imunolgica inata contra o

desenvolvimento de tumores (HONG et al., 2004) e diversos agentes patognicos como

bactrias, vrus e fungos (TZIANABOS, 2000).

Em suma, os -glucanos so reconhecidos como imunoestimulantes eficazes em

mamferos e tambm em peixes (ROBERTSEN et al., 1990; ROBERTSEN, 1999; COUSO et

al., 2003). Os glucanos provenientes de leveduras e.g. -glucano, -1-3-peptideoglicano,

VitaStim-Taito [VST] so as formas mais utilizadas nos estudos sobre os efeitos destas

substncias em peixes (SAKAI, 1999), comprovadamente a ativao de macrfagos, i.e.

aumento da capacidade de eliminao de patgenos (JORGENSEN et al., 1993;

JORGENSEN; ROBERTSEN, 1995; COOK et al., 2003), e estimulao de respostas

imunolgicas no especficas, como atividade de lisozima e do complemento (ENGSTAD;

ROBERTSEN; FRIVOLD, 1992; PAULSEN; ENGSTAD; ROBERTSEN, 2001). Os efeitos

protetores dos -glucanos foram demonstrados em vrias espcies de peixes contra uma

grande variedade de patgenos bacterianos, incluindo Aeromonas hydrophila (KWAK et al.,

2003; SELVARAJ; SAMAPATH; SEKAR, 2005), Edwardsiella tarda (SAHOO;

MUKHERJEE, 2002) e Vibrio salmonicida (RAA et al., 1992).

Embora estudos in vitro avaliando efeitos de glucanos sobre a cultura de macrfagos

sejam bastante comuns, as avaliaes in vivo so a forma mais utilizada para o estudo dos

27

efeitos destas substncias em peixes. Embora os -glucanos possam ser administrados aos

animais atravs de banhos, injeo peritoneal e suplementao na dieta, a maioria dos estudos

tem focado na administrao atravs da dieta, pois a aplicao via banhos ou injees so

consideradas impraticveis do ponto de vista agroindustrial (COOK et al., 2001).

2.1.2 Probiticos

Aditivos dietticos constitudos por micro-organismos vivos ou bactrias teis so

denominados probiticos. Segundo Fuller (1991), o uso do termo probitico para descrever

aditivos dietticos especificamente designados para melhorar a estado de sade animal ocorre

desde 1974, quando Parker2 o usou para descrever suplementos dietticos promotores de

crescimento, e definiu o termo como organismos e substncias que contribuem para o

balano microbiano intestinal. De acordo com os relatos de Crawford (1979), probitico

pode ser definido como uma cultura de micro-organismos vivos especficos, implantados no

trato digestivo do animal atravs do alimento, garantindo o efetivo estabelecimento da

populao intestinal de micro-organismos. Posteriormente, Vanbelle et al. (1990) definiram

probiticos como bactrias naturais do intestino, as quais, aps uma ingesto em doses

efetivas, so capazes de se estabelecer ou mesmo colonizar o trato digestrio e manter ou

aumentar a microbiota natural, prevenindo a colonizao de organismos patognicos,

assegurando a melhor utilizao dos alimentos. Isso corrobora as posteriores revises de

Fuller (1991), quando este autor definiu probiticos como um suplemento diettico feito com

micro-organismos vivos que beneficamente afeta o animal hospedeiro por melhorar o balano

da flora microbiana, reforando a importncia de se evitar o uso do termo substncia na

definio deste suplemento diettico, que pode designar, por exemplo, antibiticos.

Entretanto, o conceito de probitico j foi ampliado (IRIANTO; AUSTIN, 2002). De

acordo com Gram et al. (1999), um probitico pode ser qualquer suplemento microbiano vivo

que beneficamente afeta o animal hospedeiro por melhorar seu balano microbiano; nesta

conceituao no se observa qualquer associao dos organismos vivos com a dieta. Em

adio, Salminen et al. (1999) consideram como probitico qualquer preparao microbiana

(mas no necessariamente de organismos vivos) ou componentes de clulas microbianas que

possuem efeito benfico na sade do hospedeiro. Novamente, esses autores no associam

clulas vivas a dietas e tornam o conceito de probitico ainda mais generalizado. Nesse

contexto, Irianto e Austin (2002) consideram que quando o conceito de probitico se torna to 2 PARKER, R.B. Probiotics, the other half of the antibiotic story. Animal Nutrition and Health, v. 29, p. 4-8, 1974.

28

generalizado, pode abranger outras grandes reas de controle de doenas, como, por exemplo,

o conceito de vacina.

Desta forma, uma definio mais aceitvel em referncia aquicultura dada por

Verschuere et al. (2000), que definiram probitico como qualquer adjunto microbiano vivo

que tem efeito benfico no hospedeiro, seja modificando o prprio organismo animal ou a

comunidade microbiana do ambiente aqutico, atravs de uma melhora no uso na dieta ou seu

valor nutricional, na resposta do hospedeiro a doenas, ou ainda na qualidade do ambiente em

que se encontra. Neste contexto, Vendrell et al. (2008) definem de forma ainda mais completa

as funes desenvolvidas pelos probiticos quando afirmam que estes micro-organismos

benficos influenciam favoravelmente tanto o desenvolvimento como a estabilidade da

microbiota normal do hospedeiro, alm de inibir a colonizao por patgenos, influenciar na

barreira mucosa por seus efeitos trficos no epitlio intestinal e estimular componentes

especficos e no-especficos do sistema imunolgico. Assim, deve-se agir com muito critrio

e cautela na escolha dos probiticos a serem trabalhados, assegurando-se de que eles possuam

algum tipo de efeito benfico e so inofensivos ao hospedeiro, pois cada vez mais cepas

bacterianas so avaliadas na aquicultura, e os conceitos so muitas vezes divergentes entre si.

Dessa forma, no Brasil, o Compndio Brasileiro de Alimentao Animal (1998), j

determinava que fossem registrados como probiticos apenas os produtos que contivessem

micro-organismos das espcies Bacillus toyoi, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus,

Streptococcus faecium e Saccharomyces cerevisiae.

O uso de probiticos na nutrio de seres humanos e animais j bem difundido e

documentado (RINKINEN et al., 2003) e, mais recentemente, tem sido aplicado aquicultura

(IRIANTO; AUSTIN, 2002; BACHERE, 2003). Dentre eles, pode-se destacar o Bacillus

subtilis; estudos demonstraram que este micro-organismo e seus esporos atuam como

probiticos promovendo o crescimento e a viabilidade das bactrias lcticas benficas no trato

intestinal de humanos e alguns animais (COHEN et al., 2003; HOA et al., 2000). Outro

micro-organismo, o Lactobacillus acidophilus, considerado o micro-organismo predominante

no trato intestinal de seres humanos saudveis (RAY, 1996), tem sido utilizado em larga

escala como a cultura inicial para o desenvolvimento de derivados lcteos na nutrio

humana, a fim de que suas atividades teraputicas promovam um balano da microbiota

intestinal. De acordo com Aly et al. (2008), tilpias-do-Nilo que recebem uma mistura de B.

subtilis e L. acidophilus na dieta apresentam maior taxa de sobrevivncia, aumento no ganho

de peso, aumento da atividade de lisozima e da exploso respiratria e aumento da proteo

frente a desafio bacteriano. Outros resultados positivos foram relatados ainda para o bagre do

29

canal (Ictalurus punctatus) e o camaro Penaeus monodon, que apresentaram maior

sobrevivncia quando receberam dietas contendo Bacillus sp. e Bacillus S11 (QUEIROZ;

BOYD, 1998; RENGPIPAT et al., 2000). Alm disso, a suplementao diettica de

probiticos (Lactobacillus fructivorans e Lactobacillus plantarum) aumentou o nvel de

imunoglobulinas e granulcitos acidoflicos no intestino da dourada, estimulando o sistema

imunolgico do intestino, que resultou em melhor taxa de sobrevivncia da espcie

(PICCHIETTI et al., 2007). O aumento no ganho de peso em peixes que recebem probiticos

na dieta pode ser atribudo melhora na atividade digestria, atravs do aumento da sntese de

vitaminas, co-fatores e atividade enzimtica (GATESOUPE, 1999; ZIEMER; GIBSON,

1998). Carnevali et al. (2006) relataram que robalos europeus (Dicentrarchus labrax)

alimentados com dieta contendo Lactobacillus delbrueckii durante 59 dias, apresentaram

maior ganho de peso quando comparados a um tratamento controle.

O nmero de cepas probiticas sendo testadas quanto aos seus possveis efeitos

imunomodulatrios nos peixes cada vez maior. Em juvenis de leopard grouper,

Mycteroperca rosacea, dietas contendo levedura viva de Debaryomyces hansenii

promoveram alta taxa de sobrevivncia e aumento significativo de imunoglobulina M [IgM],

bem como aumento de enzimas antioxidantes como superxido dismutase e catalase (REYES-

BECERRIL et al., 2008). Brow-spotted grouper Epinephelus coioides alimentados por

quatro semanas com uma dieta contendo Lactobacillus plantarum, apresentaram mortandade

de 20,0% e 36,7%, quando desafiados por Streptococcus sp. e iridovirus, respectivamente,

taxas consideradas bastante reduzidas; o grupo desafiado tambm apresentou elevada

atividade de complemento, lisozima e glutationa (CHEN et al., 2008).

Os produtos comerciais base de Bacillus subtilis so aditivos alimentares probiticos

utilizados na suplementao de dietas para animais de produo, baseados em esporos viveis

da cepa C-3102 de Bacillus subtilis. Pesquisas e testes de campo tm demonstrado os efeitos

positivos destes produtos no desempenho dos animais, com uma melhoria consistente no

crescimento e na converso alimentar, assim como na reduo da diarreia e da mortandade.

Dados publicados tambm sugerem que o Bacillus subtilis C-3102 reduz o nmero de

bactrias patognicas no intestino e enseja o crescimento de bactrias benficas, como os

Lactobacillus sp. O mecanismo de ao proposto que os esporos de B. subtilis C-3102

chegam ao intestino do animal e passam para forma vegetativa, utilizando o oxignio

disponvel, criando um maior ambiente de anaerobiose que promove a proliferao de

bactrias cido-lcticas, e.g. Lactobacillus sp., alm de inibir certos tipos de patgenos

(HOOGE; ISHIMARU; SIMS, 2004). O desempenho e o status microbiolgico de frangos de

30

corte que receberam dietas suplementadas com 0,003% de Bacillus subtilis C-3102, por

exemplo, significativamente melhor (MARUTA et al., 1995; FRITTS et al., 2000). Hooge;

Ishimaru; Sims (2004) relataram tambm maior ganho de peso e converso alimentar, sem

efeitos sobre a mortandade, para frangos de corte que receberam dietas contendo 0,003% de

incluso de Bacillus subtilis C-3102.

2.1.3 Simbiticos

O termo simbitico refere-se a um aditivo alimentar que combina um prebitico e um

probitico, e cujos benefcios so maiores se comparados administrao do prebitico e do

probitico em separado (HOLZAPFEL; SCHILLINGER, 2002). Em outras palavras, se o

carboidrato prebitico utilizado por uma cepa probitica, seu crescimento e proliferao no

intestino sero seletivamente promovidos. Esta combinao pode melhorar a sobrevivncia do

micro-organismo probitico, pois o seu substrato especfico estaria prontamente disponvel

para fermentao, resultando em vantagens para o hospedeiro (COLLINS; GIBSON, 1999). O

uso de probiticos na nutrio de peixes visa aumentar a concentrao de bactrias, e.g.

Bacillus sp. e Lactobacillus sp., no trato gastrointestinal dos animais. Entretanto, as cepas

desses micro-organismos podem no se manter dominantes no intestino dos animais aps o

trmino do tratamento (ROBERTSON et al., 2000; PANIGRAHI et al., 2005). Uma estratgia

inovadora para prolongar a permanncia desses micro-organismos benficos no intestino dos

peixes envolve a suplementao concomitante de substncias no digerveis, mas

fermentveis [NDFs], que fermentadas pelas cepas bacterianas administradas como

probitico, prolongam a vida til dos probiticos no trato gastrintestinal dos animais

(RURANGWA et al., 2009). Os -glucanos so importantes candidatos categorizao como

suplementos NDFs, tenso sido demonstrado que aumentam o crescimento in vitro de trs

cepas de probiticos utilizados em peixes: Bacillus subtilis LMG 7135T, Carnobacterium.

piscicola LMG 9839 e Lactobacillus plantarum LMG 9211 (RURANGWA et al., 2009).

A maioria dos estudos conduzidos para avaliar o efeito de simbiticos sobre o sistema

imunolgico em peixes tem focado na avaliao das respostas inatas, como atividade de

lisozima, atividade do complemento, ndice de fagocitose, exploso respiratria, atividade de

superxido dismutase e outros. Nem sempre os estudos envolvendo simbiticos se preocupam

em avaliar as respostas relativas aos parmetros de desempenho, que muitas vezes no so

sequer mensurados. Esta uma falha razoavelmente grave no desenho dos experimentos que

avaliam os efeitos dos simbiticos em peixes, uma vez que alimentao e manejo alimentar

31

correspondem a mais de 50% dos custos de produo em aquicultura e o desenvolvimento e

aplicao de estratgias de alimentao mais eficientes podem ter impacto significativo na

otimizao do lucro, a principal meta da aquicultura comercial (CEREZUELA et al., 2011).

Resultados de diversos estudos comprovam o efeito sinergtico da combinao de

prebiticos e probiticos em dietas de peixes, como melhora no desempenho (MEHRABI;

FIROUZBAKHSH; JAFARPOUR, 2011; AI et al., 2011, GENG et al., 2011), na atividade de

lisozima (YE et al., 2011), na exploso respiratria de leuccitos (GENG et al., 2011) e na

morfologia intestinal (DE RODRIGANEZ et al., 2009; MERRIFIELD et al., 2010).

Entretanto, deve-se lembrar de que as respostas em relao utilizao de prebiticos e/ou

probiticos na dieta de peixes dependem da espcie, da durao do perodo de alimentao e

da dose do suplemento, bem como do tipo de prebiticos e probiticos testados. Alm disso,

aspectos como efeito na microbiota intestinal, barreiras mucosas, morfologia/danos celulares

e mecanismos que atuam nos benefcios ao hospedeiro ainda no so muito claros

(CEREZUELA et al., 2011). Desta forma, estudos sobre a aplicao de simbiticos em

animais aquticos, especialmente nveis de incluso espcie-especficos e em condies

especficas de criao, so cada vez mais necessrios (CEREZUELA et al., 2011).

2.1.4 Imunoestimulantes e suas respostas imunolgicas

Os estudos sobre imunoestimulantes tm focado a avaliao dos componentes

humorais e celulares da resposta inata ps-absoro. O sistema imunolgico inato de vital

importncia para os mecanismos de resistncia a doenas em peixes, especialmente porque a

resposta imunolgica adquirida geralmente lenta e a expresso ontognica da imunidade em

muitas espcies de peixes tardia (MAGNADTTIR, 2006). A anlise dos fatores

imunolgicos no soro mostra que mudanas humorais ocorrem quando imunoestimulantes so

administrados, incluindo aumento na lisozima e aumento no complemento, como

demonstrado para o salmo do Atlntico por Engstad; Robertsen; Frivold (1992). Incrementos

na lisozima tambm foram detectados em truta (JORGENSEN et al., 1993), salmo do

Atlntico (ENGSTAD; ROBERTSEN; FRIVOLD, 1992), e yellowtail Seriola

quinqueradiata (MATSUYAMA; MANGINDAAN; YANO, 1992), depois de injeo

intraperitoneal e administrao oral de glucanos (GANNAN; SCHROCK, 2001).

A lisozima uma enzima comumente encontrada em clulas e em secrees dos

vertebrados (SILVA, 2003) que destri a parede celular de bactrias. Seu substrato a ligao

glicosdica (1-4) entre o cido N-acetilmurmico e a N-acetilglicosamina. Dessa forma, as

32

propriedades bactericidas da lisozima so principalmente atribudas s suas atividades

enzimticas, resultando em hidrlise da ligao -- entre o cido N-acetilmurmico e a N-

acetilglicosamina do peptideoglicano bacteriano, causando lise da clula (LOPERA, 2008).

Alm disso, existem muitas evidncias sobre a existncia de modos de ao no-enzimticos e

no-lticos da lisozima que ainda no foram bem caracterizados (GINSBURG, 2004;

MASSCHALCK; MICHIELS, 2003). A ao antimicrobiana da lisozima contribui com a

defesa inata e os mecanismos de fagocitose do hospedeiro, podendo interagir tambm com

outras protenas catinicas (COLE; LIAO; STUCHLIK, 2002). A lisozima est presente nos

grnulos fagocticos de neutrfilos, bem como nos moncitos, macrfagos e clulas epiteliais

(LOPERA, 2008).

Assim, os leuccitos neutrfilos, eosinfilos, moncitos e macrfagos exercem

importante funo na modulao das respostas imunolgicas inatas atravs da fagocitose e

consequente extermnio do patgeno (VERLHAC; GABAUDAN, 1997). Durante o processo

da fagocitose ocorre grande aumento do consumo do oxignio molecular, mecanismo

conhecido como exploso respiratria, que decorre da reduo do oxignio em nion

superxido o qual, atravs da ao da enzima superxido dismutase [SOD], forma perxido

de hidrognio (H2O2). O perxido de hidrognio sofre ao da enzima mieloperoxidase

[MPO] liberada pelos leuccitos granulares, se transformando em hipoclorito levando

produo de cloraminas. Todas estas espcies reativas de oxignio [EROs] contribuem

ativamente para sua destruio, pois so substncias oxidantes que atuam sobre membranas de

micro-organismos (VERLHAC et al., 1998). A determinao das EROs produzidas pela

exploso respiratria pode ser detectada por ensaio colorimtrico baseado na reduo do

corante nitroblue tetrazolium [NBT], que forma precipitados de material insolvel com

colorao azul escuro no interior do fagcito, denominados grnulos de formazan (KLEIN,

1990).

O aumento nos nveis de protena srica associado a uma forte reposta inata em

peixes (ANDREWS et al., 2011). As protenas do soro so divididas em dois grandes grupos

albuminas e globulinas. A frao globulina consiste de diversos componentes em que trs

grupos so facilmente identificados como alfa, beta e gama globulinas, sendo este ltimo a

fonte de quase toda a protena imunologicamente ativa do sangue (CHOUDHURY et al.,

2005). Globulinas como as gamaglobulinas so absolutamente essenciais para a manuteno

de um sistema imunolgico saudvel (JHA et al., 2007). Os valores de albumina e globulina

sricas em peixes tratados com diferentes imunoestimulantes so sempre mais altos do que o

controle (CHOUDHURY et al., 2005). O aumento dos nveis de protenas totais e globulinas

33

sricas uma indicao de que o peixe est imunologicamente resistente (NAYAK et al.,

2004). Por exemplo, juvenis de rohu Labeo rohita alimentados durante 60 dias com dietas

contendo B. subtilis, apresentam aumento na protena total e globulinas sricas (NAYAK,

2007). Por outro lado, juvenis de tilpia-do-Nilo alimentados durante 40 dias com uma dieta

basal e mantidos em gua adicionada do probitico Enterococcus faecium no apresentaram

diferenas estatsticas nos parmetros protenas totais, albumina e globulina sricas em

relao a um grupo controle (WANG et al., 2008). Em contrapartida, alevinos de rohu

recebendo mltiplas injees intraperitoneais de diferentes doses de -glucano apresentaram

maiores nveis de protena total srica e globulinas comparadas ao controle ao longo do

tempo, mas o nmero de injees no foi capaz de influenciar esses parmetros (MISRA et

al., 2006).

Assim, em anlises envolvendo a determinao da atividade de lisozima e a atividade

respiratria de leuccitos, devem-se retirar amostras sanguneas dos animais que recebem os

tratamentos. O sangue pode ser amostrado por puno cardaca, puno caudal na extenso da

aorta dorsal e outros. Finalmente, deve-se lembrar de que estudos envolvendo o sangue so

realizados normalmente apenas em peixes adultos e juvenis, simplesmente porque a tcnica

invivel para amostragens em larvas (SCHRECK; MOYLE, 1990).

2.1.5 Imunoestimulantes e a morfologia intestinal

Thompson, 1910 apud Wilson e Castro (2011) relatou que de Aristteles (345 A.C.)

a primeira descrio do fato que as propriedades do intestino e do estmago dos peixes so

similares s de outros vertebrados, sendo que toda a extenso do intestino uma estrutura

simples, e se ocorrer uma reduplicao ou dobra, estas novamente se alargam em uma

estrutura simples. A partir dessa primeira descrio despretensiosa de Aristteles h cerca de

2300 anos em seu trabalho intitulado Historium Animalia, teve incio a histria da

investigao da morfologia intestinal. Entretanto, s depois do Sc. XIX, com o advento da

anatomia comparativa, que um esforo significante foi empregado a fim de determinar a

diversidade anatmica e entender a sua significncia em peixes e vertebrados em geral

(WILSON; CASTRO, 2011). Com avanos em tecnologia nos ltimos 200 anos,

especialmente da microscopia ptica para a microscopia eletrnica, das tcnicas de coloraes

para a imunohistoqumica e a hibridizao in situ do RNA, o nvel de detalhes evoluiu do

rgo para o tecido, do tecido para clula e, finalmente, para o nvel molecular (WILSON;

CASTRO, 2011).

34

A maioria dos epitlios apresenta um ciclo de vida limitado, resultado da renovao

constante de suas clulas pela atividade mittica contnua, tambm conhecida como

turnover celular. A taxa de renovao celular pode ser influenciada pelas caractersticas da

dieta do animal, presena de agentes patognicos, e tambm pelos prprios hormnios do

organismo, como a tiroxina [T4], a triiodotironina [T3], a insulina e o glucagon. Por isso,

diversos estudos desenvolvidos com imunoestimulantes prebiticos e probiticos para animais

aquticos tm avaliado os possveis efeitos sobre a morfologia intestinal dos animais, dado

que melhora na estrutura de microvilosidades e superfcie absortiva j foi relatada para vrias

espcies de peixes alimentados com dietas suplementadas com prebiticos e/ou probiticos

(DE RODRIGANEZ et al., 2009; MERRIFIELD et al., 2010), com destaque para a dourada

(DIMITROGLOU et al., 2010), a corvina-de-pintas Sciaenops ocellatus (ZHOU;

BUENTELLO; GATLIN III, 2010), a tilpia-do-Nilo Oreochromis niloticus (PIRARAT et

al., 2011) e a lagosta europeia, Homarus gammarus L. (DANIELS et al., 2010).

O aumento do comprimento das vilosidades implica em um aumento da rea de

superfcie para maior absoro dos nutrientes disponveis (CASPARY, 1992). Um mecanismo

possvel para explicar esse fenmeno poderia ser que, aps transitarem pelo estmago, as

bactrias probiticas germinam no intestino e utilizam carboidratos para seu crescimento,

produzindo uma substncia que contribui para formar cidos graxos de cadeia curta, podendo

desempenhar um importante papel em aumentar a altura das vilosidades (PELICANO et al.,

2005). cidos graxos de cadeia curta, particularmente o cido butrico, so a fonte energtica

principal para as clulas do epitlio intestinal e podem estimular a liberao de peptdeos

gastrointestinais ou fatores de crescimento que podem afetar a proliferao celular

(BLOTTIERE et al., 2007).

2.2 Modelo biolgico utilizado

O pacu-caranha ou simplesmente pacu, Piaractus mesopotamicus Holmberg 1887

(Characiformes, Characidae), amplamente distribudo na Amrica do Sul, inclusive no

territrio brasileiro, sendo um habitante natural das Bacias do Prata e do Pantanal (PAI et al.,

2000). No estado de So Paulo, o pacu encontrado dificilmente no rio Paranapanema, mas

est presente nos rios Paran, Mogi-Guau, Paraba e baixo Tiet (SOUZA et al., 2003;

JOMORI et al., 2005). Devido boa aceitabilidade do sabor de sua carne, pela alta adaptao

criao em tanques e viveiros, relativa rusticidade, alm de ser uma espcie muito apreciada

35

na pesca esportiva (JOMORI et al., 2008), o pacu tornou-se a principal espcie nativa para

piscicultura.

Para destacar a importncia do pacu, possvel citar diversos estudos recentes

relacionados espcie envolvendo assuntos como a relao energia:protena (BICUDO,

2008), imunoestimulantes (SADO, 2008), sanidade (BELM-COSTA; CYRINO, 2006),

identificao e prevalncia de nematdeos (PARRA et al., 1997), bioqumica (BASTOS et al.,

2007), fisiologia (SAMPAIO et al., 2008), gentica (PINHEIRO et al., 2008), larvicultura

(STREIT JUNIOR et al., 2007), caractersticas limnolgicas do ambiente de criao

(SIPABA-TAVARES et al., 1999), tecnologia do pescado (SZENTTAMASY et al., 1993),

etc. Por outro lado, pesquisas ligadas utilizao de aditivos prebiticos e probiticos para a

espcie ainda so recentes e se restringem a poucos trabalhos.

Em adio, apesar de haver diversos estudos sobre a utilizao de aditivos

imunoestimulantes conhecidos como prebiticos e probiticos para organismos aquticos,

ainda so necessrios mais estudos com relao as suas interaes (simbitico) e a sua

verdadeira eficcia in vivo. Desse modo, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos de

nveis de -glucano e B. subtilis, e sua combinao simbitica sobre os parmetros de

desempenho, bem como os efeitos sobre algumas respostas imunolgicas no especficas e

morfologia intestinal do pacu.

36

37

3 MATERIAL E MTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratrio de Nutrio de Peixes,

Departamento de Zootecnia da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Os animais

foram acondicionados em aqurios de vidro (70 L) com entradas de gua independentes e

aerao forada atravs de soprador radial e pedras porosas difusoras. A fonte de gua era

proveniente de poo artesiano, com renovao constante em um sistema aberto de circulao

e o fotoperodo controlado (12/12 horas) por lmpadas frias ligadas a temporizador e

temperatura mantida em 28,6C 1,3 com o uso de resistncia eltrica colocada no

reservatrio do laboratrio e ligada a termostato. Os parmetros de qualidade da gua

mantiveram-se adequados para a manuteno da espcie durante o todo o perodo

experimental: oxignio dissolvido 5,32 0,94 mg L-1; condutividade 61,02 3,3mS cm-2; pH

8,030,07; amnia txica 0 mg L-1.

3.1 Dietas e delineamento experimental Experimento 1

Considerando-se que objetivo precpuo do estudo foi avaliar o efeito da suplementao

conjunta de -glucano e B. subtilis na rao de alevinos de pacu, foi necessrio dividir o

estudo em duas etapas, visto que no existem dados substanciados na literatura a respeito dos

melhores nveis de incluso desses aditivos para a espcie em questo, especialmente em

relao aos tipos de -glucano e B. subtilis utilizados. Dessa forma, em um primeiro ensaio

foram testados nveis de incluso de cada um desses imunoestimulantes para o pacu. Com

base nos resultados obtidos, os melhores nveis isolados de -glucano e B. subtilis seriam

cruzados para serem avaliados comparativamente a sua administrao isolada. Entretanto,

como no houve diferenas significativas que permitissem eleger os melhores nveis do

prebitico e do probitico para suplementao simbitica das dietas, recorreu-se literatura e

s recomendaes do fabricante para estabelecer os nveis de suplementao conjunta de -

glucano e B. subtilis e avaliar o desempenho e respostas imunolgicas de juvenis de pacu.

Foi ento formulada uma nica dieta basal contendo 32% de protena bruta e 3200

kcal kg-1 de energia digestvel em planilha de macros do aplicativo Microsoft Excel (Tabela

1). A dieta foi extrudada sem adio de lipdios. Aps o processo de extruso, as dietas foram

secas em estufa temperatura de 50 C e receberam os imunoestimulantes atravs de asperso

de suspenso oleosa. As raes contendo B. subtilis foram submetidas anlise

microbiolgica para determinar a recuperao do micro-organismo aps o processo de adio

s dietas (Tabela 2).

38

Tabela 1 - Composio da dieta basal experimental, ensaio 1

Ingrediente Incluso % Farelo de soja 48,30 Farinha de vsceras de aves 12,75 Milho modo 32,00 leo de soja 1,60 Fosfato biclcico 0,30 DL-Metionina 0,35 Calcrio calctico 1,00 Premix mineral1 0,50 Premix vitamnico2 0,50 Celulose microfina 2,68 BHT 0,02 Total 100,00

1 Premix mineral (Agroceres); quantidade por kg de produto: Fe 100.000 mg; Cu 15.000 mg; Zn 150.000 mg; I 4.500 mg; Mn 60.000 mg; Se 400 mg e Co 2.000 mg;

2 Premix vitamnico (Agroceres); quantidade por kg de produto: vit. A 6.000.000 UI; vit. D3 2.250.000 UI; vit. E 75.000 mg; vit. K 3.000 mg; tiamina (B1) 5.000 mg; riboflavina (B2) 10.000 mg; niacina 30.000 mg; piridoxina 8.000 mg; cido pantotnico 30.000 mg; biotina 2.000 mg; cido flico 3.000 mg; cobalamina 20.000 mg e cido ascrbico (vit. C) 192.500 mg.

Tabela 2 - Recuperao de B. subtilis nas dietas experimentais aps suplementao por asperso oleosa

Incluso Resultado Log10 Referncia Relao % UFC g-1 UFC g-1 UFC g-1 %

0,025 2,7E+05 5,43 2,5E+05 106,71 0,050 6,7E+05 5,83 5,0E+05 134,18 0,075 8,6E+05 5,94 7,5E+05 115,09 0,100 1,5E+06 6,18 1,0E+06 151,35 0,125 1,6E+06 6,20 1,25E+06 125,59

Grupos de oito juvenis de pacu (8,91 0,30 g) foram alojados nos aqurios e

alimentados at a saciedade aparente por 75 dias em duas refeies dirias (07:00; 16:00) com

raes suplementadas com concentraes crescentes dos aditivos selecionados, mais um

grupo controle, como segue: -glucano de levedura 60; 120; 180; 240 e 300 mg de -

glucano kg-1 de rao; B. subtilis comercial (109 UFC g-1 de B. subtilis) 0,025%, 0,050%,

0,075%, 0,100%, 0,125% de incluso. Os ensaios relativos foram conduzidos e analisados

separadamente em dois delineamentos inteiramente aleatorizados (5+5+1 tratamentos, n=3).

39

3.2 Dietas e delineamento experimental Experimento 2

Com base nos resultados obtidos no estudo preliminar e principalmente atravs de

comparao com dados obtidos na literatura, uma nica dieta basal foi formulada (Tabela 3) e

processada como anteriormente descrito, e suplementada com (i) -glucano de levedura 240

mg kg-1 de rao; (ii) B. subtilis comercial (109 UFC g-1 de B. subtilis) 0,100% de incluso;

(iii) combinao simbitica 240 mg de -glucano kg-1 + 0,100% de B. subtilis. Uma vez

mais as raes contendo B. subtilis foram submetidas anlise microbiolgica para

determinar a recuperao do micro-organismo aps o processo de adio s dietas (Tabela 4).

Tabela 3 - Composio da dieta basal experimental, ensaio 2

Ingrediente Incluso % Farelo de soja 57,20 Farinha de peixe 10,90 Milho modo 27,04 leo de soja 2,24 Fosfato biclcico 0,52 DL-Metionina 0,36 Calcrio Calctico 0,32 Premix mineral1 0,52 Premix vitamnico2 0,52 Celulose microfina 0,34 BHT 0,02 Total 100,00

1 Premix mineral (Agroceres); quantidade por kg de produto: Fe 100.000 mg; Cu 15.000 mg; Zn 150.000 mg; I 4.500 mg; Mn 60.000 mg; Se 400 mg e Co 2.000 mg;

2 Premix vitamnico (Agroceres); quantidade por kg de produto: vit. A 6.000.000 UI; vit. D3 2.250.000 UI; vit. E 75.000 mg; vit. K 3.000 mg; tiamina (B1) 5.000 mg; riboflavina (B2) 10.000 mg; niacina 30.000 mg; piridoxina 8.000 mg; cido pantotnico 30.000 mg; biotina 2.000 mg; cido flico 3.000 mg; cobalamina 20.000 mg e cido ascrbico (vit. C) 192.500 mg.

Tabela 4 - Recuperao de B. subtilis nas dietas experimentais

Tratamento Resultado Log10 Referncia Relao UFC g-1 UFC g-1 UFC g-1 %

B. subtilis 9,7E+05 5,9866 1,0E+06 97,0

Simbitico 9,8E+05 5,9923 1,0E+06 98,8

Grupos de 15 alevinos de pacu (2,0 0,1 g) foram alojados nos aqurios e alimentados

at a saciedade aparente por 59 dias em duas refeies dirias (07:00; 16:00) com as raes

40

suplementadas como descrito. Os ensaios foram conduzidos e analisados em um delineamento

inteiramente aleatorizado, com quatro tratamentos (n=4).

3.3 Avaliao dos parmetros de desempenho

Ao trmino do perodo de alimentao, os animais foram submetidos a 24 horas de

jejum, anestesiados em soluo alcolica de benzocaina (50 mg L-1) e pesados em balana de

preciso. Os seguintes parmetros de desempenho foram determinados (TACON, 1990):

Ganho de peso GP = [(peso final) (peso inicial)];

Consumo de rao;

ndice de converso alimentar ICA = [(consumo de rao) (ganho de peso)];

Taxa de crescimento especfico TCE = {100 x [(ln peso final ln peso inicial) perodo]}

Sobrevivncia S = [(100 x nmero de animais final) nmero de animais inicial]

3.4 Avaliao das respostas imunolgicas

Para ambos os experimentos, foram medidas as respostas imunolgicas resultantes dos

nveis de suplementao diettica dos imunoestimulantes. Para tanto foi coletado sangue por

puno do vaso caudal, atravs de seringas plsticas e agulhas descartveis, sem

anticoagulante, de trs animais por unidade experimental. Em um tubo tipo Eppendorf foi

separada uma amostra de sangue contendo anticoagulante para utilizao para a anlise de

atividade respiratria dos leuccitos no sangue total, e em outro tubo, uma amostra sem

anticoagulante, destinada obteno do soro para as anlises de protenas totais, albumina e

globulinas sricas, e atividade de lisozima srica.

3.4.1 Protenas totais, albumina, globulina sricas e ndice A:G

A anlise da concentrao de globulinas sricas foi feita por mtodo indireto atravs

da subtrao entre a protena total srica e albumina srica. Para tanto, o soro foi separado por

centrifugao (2096 g, 5 minutos) para a determinao da protena srica atravs de um

refratmetro porttil (WZ-301; Protein 0,0-12,0 g dL-1). Uma alquota do mesmo soro foi

41

utilizada para a determinao da albumina srica atravs de ensaios colorimtricos em

espectrofotmetro utilizando kits comerciais (Bioclin, Quibasa, Belo Horizonte, MG,

Brazil).

3.4.2 Ensaio da atividade de lisozima

A atividade de lisozima foi avaliada atravs do ensaio turbidimtrico proposto por

Ellis (1990), utilizando-se o soro sanguneo. A determinao da atividade de lisozima foi

baseada na lise celular de uma suspenso de clulas de Micrococcus lysodeikticus, medida

atravs da reduo da densidade ptica durante a lise da parede celular das bactrias.

Amostras de soro dos pacus foram submetidas a tratamento trmico (banho-maria a 56o C por

30 minutos) para desnaturao e inativao das protenas do sistema complemento, garantindo

que a lise do M. lysodeikticus fosse provocada exclusivamente por ao da lisozima. Em uma

cubeta de 1,0 mL foi adicionado 150 L de soro, ao qual se adicionou 150 L de tampo

fosfato de sdio (0,05M; pH 6,2). A cubeta foi incubada por dois minutos e em seguida,

foram adicionados 300 L da suspenso de M. lysodeikticus (0,2 mg mL-1; Sigma, St Louis,

MO, USA) totalizando um volume de 600 L. A reduo da densidade ptica (DO) em 450

nm foi avaliada entre 0 e 5,0 minutos. Os resultados da atividade de lisozima foram expressos

em unidades (U) por mL-1 de soro, sendo que 1,0 U de lisozima corresponde quantidade da

enzima necessria para provocar uma reduo de 0,001 min-1 da densidade ptica.

3.4.3 Exploso respiratria de leuccitos

A anlise da atividade respiratria dos leuccitos foi realizada de acordo com a

metodologia proposta por Anderson e Siwicki (1995). O mtodo consiste na determinao das

espcies reativas de oxignio produzidas durante a exploso respiratria dos leuccitos por

ensaio colorimtrico baseado na reduo do corante nitroblue tetrazolium (NBT) que forma

um precipitado de material insolvel com colorao azul escuro no interior dos fagcitos,

denominados grnulos de formazan (KLEIN, 1990). Para dosagem do precipitado, 100 L do

sangue total foram adicionados a 100 L de uma soluo 0,2% de NBT (Sigma, St Louis,

MO, USA) em tampo fosfato-salino (PBS). A soluo foi homogeneizada e incubada por 30

minutos temperatura ambiente. Aps incubao, 50 L da suspenso homogeneizada foram

transferidos para um tubo Eppendorf contendo 1,0 mL de N,N-dimetil-formamida (DMF;

Sigma, St Louis, MO, USA) e centrifugado a 755 g por 5 minutos. O DMF um solvente de

42

sais e de compostos de alto peso molecular que lisa a parede celular dos leuccitos e dos

grnulos de formazan, liberando para a soluo o corante NBT reduzido. A absorbncia da

soluo foi determinada em espectrofotmetro no comprimento de onda de 540 nm.

3.5 Avaliao da morfologia intestinal

Para avaliao da morfologia intestinal foram colhidas amostras do intestino de dois

pacus por unidade experimental, ou seja, seis peixes por tratamento no Experimento 1 e oito

peixes por tratamento no Experimento 2. Em ambos os ensaios, os animais foram sacrificados

em soluo concentrada de anestsico (benzocana, 1 g L-1). O trato intestinal foi inteiramente

dissecado e divido nas pores proximal, mdia e distal, que foram imediatamente lavadas em

soluo fisiolgica (NaCl 0,65%), injetadas com o lquido fixador de Davidson

(gua/formalina/etanol/cido actico, 3/2/3/1, v/v) e mergulhadas no fixador durante 24 horas.

Aps esse perodo, as amostras foram transferidas e armazenadas em tubos contendo etanol

70%. O processamento das amostras seguiu com a desidratao em srie em solues com

concentrao crescente de etanol, com posterior diafanizao em benzol e incluso em

parafina. As pores de cada parte do intestino foram seccionadas em cortes de 5 m de

espessura seguindo o sentido longitudinal do eixo do lmen intestinal. Foram confeccionadas

trs lminas de cada peixe (uma para cada poro intestinal) e os cortes foram corados com

hematoxilina e eosina. As lminas foram examinadas em um microscpio trinocular BEL

Photonics BIO3, equipado com cmera digital (EUREKAM Pro 5.0) e software de

tratamento de imagem BEL Eurisco. Foram avaliadas a altura das dobras intestinais (hD) e a

altura das microvilosidades intestinais (hMV); de cada lmina foram registradas 10 medidas

das dobras mais altas e 10 medidas das microvilosidades de todos os campos fotografados.

3.6 Anlises estatsticas

Todos os dados foram submetidos anlise exploratria para verificao da

normalidade dos resduos atravs do teste de Shapiro-Wilk e homogeneidade das varincias

pelo teste de Levene, sendo posteriormente submetidos anlise de varincia pelo PROC

MIXED do software SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA); as mdias foram analisadas

pelos mtodos dos polinmios ortogonais e teste de comparao de mdias de Tukey.

43

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Parmetros de desempenho

No foi observado efeito significativo dos tratamentos de nveis de -glucano sobre os

parmetros de desempenho (P>0,05) (Tabela 5).

Tabela 5 - Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa

de crescimento especfico (TCE) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com nveis crescentes de -glucano

-glucano GP CR ICA TCE mg kg-1 g g %

0 84,76 5,02 72,94 3,74 0,86 0,01 2,83 0,09 60 91,36 6,03 78,70 3,95 0,86 0,02 2,96 0,08

120 97,94 10,16 82,95 4,82 0,85 0,04 3,03 0,11 180 88,94 11,72 78,65 8,42 0,89 0,04 2,90 0,16 240 96,48 6,48 79,58 1,38 0,83 0,05 2,97 0,11 300 93,21 5,34 80,79 1,94 0,87 0,08 2,96 0,08

C.V (%). 8,56 5,88 5,36 3,70 p-valor 0,39 0,24 0,70 0,38

Os valores correspondem a DP de trs observaes.

A melhora no desempenho dos peixes um dos objetivos de quaisquer estudos sobre

nutrio e produo de peixes. Em relao ao -glucano, existem poucos trabalhos na

literatura que discutem os seus efeitos sobre o desempenho dos peixes; na grande maioria das

vezes, o foco dado s respostas imunolgicas. -glucanos como os derivados de

Saccharomyces cerevisae incorporados dieta de peixes podem aumentar a taxa de

crescimento de algumas espcies em certas condies ambientais (COOK et al., 2003;

MISRA et al., 2006; AI et al., 2007; SEALEY et al., 2008 apud DALMO; BOGWALD,

2008). Entretanto, muitos outros artigos cientficos no relatam quaisquer efeitos

significativos da suplementao diettica com diferentes fontes de -glucano sobre o

crescimento dos peixes (WHITTINGTON et al., 2005 apud DALMO; BOGWALD, 2008).

Aparentemente possveis alteraes na taxa de crescimento dependem da quantidade de -

glucano incorporado dieta, durao do perodo de alimentao, temperatura ambiental e

caractersticas espcie-especficas (DALMO; BOGWALD, 2008). Desse modo, juvenis de

dento Dentex dentex alimentados por dois meses com dietas contendo diferentes fontes de -

glucano no apresentaram diferenas em ganho de peso e converso alimentar (EFTHIMIOU,

1996). Da mesma forma, tilpias-do-Nilo alimentadas por 10 dias com diferentes nveis

dietticos de -glucano no apresentaram diferenas nos parmetros de desempenho (ganho

44

de peso e converso alimentar); embora a tilpia no seja capaz de digerir bem alimentos

altamente fibrosos, elas podem utilizar carboidratos complexos eficientemente como fonte

energtica, ou seja, improvvel que a incluso relativamente baixa de -glucano possa

interferir na digesto e absoro de nutrientes dietticos (WHITTINGTON; LIM; KLESIUS,

2005). Entretanto, alevinos de large yellow croaker Pseudociaene crocea alimentados

durante oito semanas com uma dieta suplementada com um nvel baixo de -glucano (0,09%)

apresentaram maior taxa de crescimento especfico, comparados ao controle, mas o

tratamento de alto nvel de -glucano (0,18%) no apresentou diferena em relao ao

controle (AI et al., 2007). Do mesmo modo, juvenis de snapper Pagrus auratus alimentados

durante 84 dias com dietas suplementadas por EcoActiva, uma preparao comercial de -

glucano, apresentaram melhor taxa de crescimento especfico em relao ao grupo controle

quando mantidos em temperatura de inverno, por outro lado, no foram registradas diferenas

significativas quando os animais foram mantidos em temperaturas de vero.

No h explicao plausvel para tantas diferenas de resultados entre os vrios

experimentos realizados com -glucanos e o presente estudo com pacus no foge regra. A

suplementao diettica com Bacillus subtilis aumentou o consumo de rao em comparao

ao controle (P = 0,01), mas no influenciou os outros parmetros de desempenho (Tabela 6).

Tabela 6 Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa

de crescimento especfico (TCE) de juvenis de pacu alimentados com nveis de B. subtilis

B. subtilis GP CR ICA TCE % g g % 0 84,76 5,02 72,94b 3,74 0,86 0,01 2,83 0,09

0,025 95,49 4,46 81,69a 1,03 0,86 0,03 3,01 0,03 0,050 88,93 6,50 82,74a 5,06 0,94 0,07 2,99 0,09 0,075 86,29 3,45 79,03ab 1,29 0,92 0,03 2,94 0,04 0,100 91,27 3,39 80,38ab 0,69 0,88 0,03 2,97 0,04 0,125 92,19 8,81 81,18a 2,56 0,88 0,05 3,01 0,08

C.V. (%) 6,24 3,60 4,74 2,29 p-valor 0,26 0,01 0,21 0,05

Os valores correspondem a DP de trs observaes.

Da mesma forma que para os -glucanos, poucos trabalhos tm avaliado parmetros

de desempenho em peixes que recebem probiticos dietticos, especialmente o micro-

organismo Bacillus subtilis. Os resultados relatados tm focado a avaliao das respostas

imunolgicas, ou aparentemente no do qualquer importncia aos dados de desempenho. O

aumento no ganho de peso em peixes que recebem probiticos na dieta pode ser atribudo

melhora na atividade digestria atravs do aumento da sntese de vitaminas, cofatores e

45

atividade enzimtica (GATESOUPE, 1999; ZIEMER; GIBSON, 1998; SAULNIER et al.,

2009). Entretanto, os diferentes mecanismos de ao dos probiticos melhora do sistema

imunolgico, preveno de doenas e melhora no desempenho do animal podem ser

dependentes da cepa probitica utilizada, o que torna importante selecionar e comparar

cientificamente probiticos individualmente para seus propsitos pretendidos (SAULNIER et

al., 2009). Desta forma, pode-se inferir ou antecipar que a cepa de B. subtilis utilizada no

presente estudo no possua caractersticas de melhorar o desempenho do animal, mas sim de

melhorar as respostas imunolgicas apenas. Por exemplo, Sun et al. (2010) relataram que

juvenis de grouper Epinephelus coioides alimentados por 60 dias com dietas suplementadas

com Bacillus pumilus e Bacillus clausii, no apresentaram efeito sobre o ganho de peso e taxa

de crescimento especfico, mas uma melhora significativa na converso alimentar foi

observada em ambos os tratamentos. Por outro lado, tilpias-do-Nilo alimentadas com B.

subtilis ou L. acidophilus apresentaram maior ganho de peso comparado ao grupo controle,

entretanto, o mesmo efeito no foi observado quando as duas cepas foram administradas

conjuntamente (ALY et al., 2008).

No foi tambm observado efeito (P > 0,05) da suplementao combinada dos dois

imunoestimulantes sobre os parmetros de desempenho (Tabela 7). Registra-se, entretanto,

que peixes alimentados com a dieta suplementada com a combinao -glucano - B. subtilis

apresentaram maiores valores numricos de ganho de peso e taxa de crescimento especfico,

alm da converso alimentar mais eficiente. Tabela 7 - Ganho de peso individual (GP), ndice de converso alimentar (ICA), consumo de rao (CR) e taxa

de crescimento especfico (TCE) de pacus alimentados com a combinao de -glucano e B. subtilis

Tratamento GP CR ICA TCE g g %

Controle 64,19 3,05 52,24 7,41 0,82 0,13 5,94 0,11 -glucano 64,37 5,34 50,74 5,07 0,79 0,12 5,91 0,10 B. subtilis 65,78 8,90 48,56 3,19 0,75 0,16 5,88 0,31 Simbitico 69,21 8,31 47,03 3,55 0,68 0,06 6,00 0,18 C.V. (%) 10,01 10,50 15,87 3,00 p-valor 0,69 0,53 0,45 0,85

Os valores correspondem a DP de quatro observaes. -glucano = 240mg kg-1; B. subtilis = 0,100% de incluso; simbitico = 240 mg kg-1 + 0,100%.

Se a quantidade de trabalhos avaliando os efeitos de prebiticos e probiticos sobre a

taxa de crescimento em peixes pequena, esse nmero ainda menor em se tratando de

simbiticos, fato que frequentemente leva os autores a discutirem seus resultados comparando

diferentes espcies de peixe e cepas, trabalhos com crustceos e at trabalhos realizados com

46

equinodermos. Ento, se as respostas j apresentam grande variabilidade quando so

comparadas duas espcies de peixes ou at mesmo a mesma espcie trabalhada em lugares e

desenhos experimentais diferentes, a variabilidade ainda maior quando se considera

comparar um peixe a um equinodermo, por exemplo, ou seja, se os mecanismos de ao dos

prebiticos e probiticos em peixes no so considerados ainda bem elucidados, seu

entendimento fica ainda mais difcil nessas condies. De qualquer modo, um trabalho

envolvendo juvenis de large yellow croaker Larimichthys crocea alimentados durante 10

semanas com dietas suplementadas com diferentes combinaes de B. subtilis e

frutoligossacardeo [FOS], apresentou melhor taxa de crescimento especfico e taxa de

converso alimentar para os animais que receberam nveis de FOS e foram suplementados

com 1,35 x 107 UFC g-1 de B. subtilis; por outro lado, os efeitos dos nveis de B. subtilis no

foram influenciados pela suplementao de FOS, bem como no foi observado efeito da

interao entre os nveis de B. subtilis e FOS (AI et al., 2011). Estes mesmos autores discutem

que estes resultados esto em desacordo com outros trabalhos desenvolvidos no mesmo

laboratrio com sea cucumber Apostichopus japonicus alimentados com combinaes de B.

subtilis e FOS, que expressaram efeito da interao entre o probitico e o prebitico (ZHANG

et al, 2010). Ou seja, trabalhos similares de um mesmo laboratrio, utilizando os mesmos

probiticos e prebiticos, levaram a efeitos diferentes apenas alterando a espcie (hospedeiro)

utilizada. Essa observao refora o conceito de que a relao probitico-hospedeiro deve ser

espcie-especfica (RIPAMONTI et al., 2011), ou seja, pode ser que o B. subtilis no seja uma

cepa adequada para ser utilizada como suplemento diettico para pacus. Entretanto, avaliar

uma cepa individualmente pode induzir a uma concluso precipitada. Dentre as caractersticas

probiticas do B. subtilis est a capacidade de promover o crescimento de bactrias

fermentadoras de cido ltico, ou seja, se esses micro-organismos no estiverem presentes no

trato gastrintestinal do hospedeiro, pode ser que a resposta resultante da suplementao de B.

subtilis na dieta seja reduzida ou mesmo nula. Dessa forma, talvez uma estratgia promissora

seja suplementar a dieta dos peixes com dois ou mais micro-organismos probiticos para que

seus efeitos sejam combinados e mais eficientes.

4.2 Protenas totais, albumina, globulina sricas e ndice A:G

No foi registrado efeito (P>0,05) da suplementao de nveis de -glucano nas dietas

dos pacus sobre as variveis protenas totais, albumina, globulina sricas e ndice A:G

(albumina:globulina) (Tabela 8).

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Tabela 8 - Protenas totais sricas (PT), albumina srica (ALB), globulinas sricas (GLO) e relao albumina:globulina (A:G) de juvenis de pacu que receberam dietas suplementadas com nveis de incluso de -glucano

-glucano PT ALB GLO A:G

mg kg-1 mg dL-1 mg dL-1 mg dL-1 0 4,34 0,29 0,84 0,09 3,50 0,21 0,24 0,01

60 4,30 0,28 0,80 0,13 3,50 0,25 0,23 0,04 120 4,49 0,21 0,89 0,22 3,60 0,26 0,25 0,08 180 4,30 0,15 0,83 0,08 3,47 0,10 0,24 0,02 240 4,11 0,35 0,81 0,07 3,31 0,31 0,24 0,02 300 4,36 0,17 0,85 0,13 3,51 0,25 0,24 0,05

C.V. (%) 5,85 15,51 6,84 18,19 p-valor 0,08 0,76 0,21 0,94

Os valores correspondem a DP de nove observaes (trs animais por repetio).

Um incremento nos nveis de protena srica, albumina e globulina associado a fortes

repostas inatas em peixes (ANDREWS et al., 2011). As protenas do soro so divididas em

dois grandes grupos albumina e globulinas. A frao globulina consiste de diversos

componentes em que trs grupos so facilmente identificados como alfa, beta e gama

globulinas, sendo este ltimo a fonte de quase toda a protena imunologicamente ativa do

sangu