PREPARAÇÃO DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRASAMOSTRAS

AMOSTRAS

Soro Plasma Urina Líquor

Tecidos Cremes

Géis Suspensões

Comprimidos

Coleta: volume, anticoagulante

Estocagem: temperatura, luz, frasco

Processamento preliminar

Pesagem ou diluição

Remoção de partículas

Extração da amostra de interesse

ANÁLISE

OBJETIVOS

-Livre interferentes

- Concentração da amostra

- Erros na quantificação- Necessidade de atingir limites cada vez menores

- Deterioração das colunas e outras partes (compatível com o sistema de análise)

- Perda de tempo com manutenção preventiva (limpeza de detector, corte da coluna, limpeza da fonte de íons)

Máxima recuperação do analito de interesse

Menor número de passos

Rápido

Alta precisão

Fácil automação

PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO IDEAL

ESCOLHA DO TIPO DE EXTRAÇÃO

Características da matriz

Características do analito

Técnica de análise empregada

EXTRAÇÃO EM ULTRASSOM

DESVANTAGENS- Gera grande quantidade de resíduo- Possui um pequeno espectro de aplicações- Compostos podem ser degradados com o ultrassom

VANTAGENS- Baixo custo- Rapidez (um ciclo de extração dura 3 minutos)- Excelente para análise de hidrocarbonetos de petróleo

PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS(amostras biológicas)

DESVANTAGENSBaixa recuperação

Não seletivoBaixa exatidão

Em alguns casos: diluição da amostra

DESPROTEINIZAÇÃO

- solventes orgânicos (solubilidade das proteínas)

- ácidos (formação de sais insolúveis)

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO (LLE)

PARTIÇÃO DA AMOSTRA ENTRE DOIS LÍQUIDOS IMISCÍVEIS: FASE AQUOSA E FASE ORGÂNICA

ANALITO: COEFICIENTE DE PARTIÇÃO ENTRE AS DUAS FASES

solvente extrator pH da fase aquosa volume do solvente extrator

A eficiência da LLE depende:

DESVANTAGENS

• amostras com alta afinidade pela água são parcialmente extraídas pelo solvente orgânico

• impurezas do solvente são concentradas junto com a amostra (solvente ultrapuro)

• pode ocorrer a formação de emulsões

• volumes relativamente grandes de amostra e solventes são requeridos

• toxicidade dos solventes orgânicos

• difícil automação

VANTAGENS

• simples

• grande número de solventes (solubilidade e seletividade)

• proteínas presentes na amostra são desnaturadas

Vantagens- Baixo custo- Boa aplicabilidade a varredura de compostosDesvantagens- Gera grande quantidade de resíduos (disposição do resíduo)Sérios problemas com emulsão- Processo demorado para análise de várias amostras

Extração líquido-líquido (método descontínuo)

VÁRIOS PASSOS

PARÂMETROS

Tipo do solventeanalito solúvel no solventebaixo ponto de ebuliçãobaixa viscosidadeseletivo

pHnão ionizada (partição na fase orgânica)

Quantidade de solvente

Tempo

Temperatura

Baixa recuperação/salting out

Emulsão (RECUPERAÇÃO)- adição sal- resfriar ou aquecer- adição de solvente orgânico- centrifugação

PROBLEMAS

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SOLID PHASE EXTRACTION-SPE)

Vantagens da SPE em relação à LLE

Maior eficiência Elimina maior número de interferentes Reduzido consumo de solvente orgânico Fácil coleta do analito Fácil automação

- Mais utilizados- Disponibilidade comercial- Baixo custo

VANTAGENS- Material extrator semelhante ao cartucho- Área de contato maior- Camada extratora mais delgada - Partículas menores e mais homogêneas

DESVANTAGENS- Eficiência da extração depende do condicionamento (etapa limitante)- Obstrução por macromoléculas- Maior custo

SISTEMA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

MECANISMOMECANISMO

Modo reversoModo normal

Troca iônica

RETENÇÃO: analito e grupos funcionais da sílica

C8, C18 e CN: interações de van der Waals

Modo normal: pontes de hidrogênio, interações - e dipolo-dipolo

Troca iônica: interações eletrostáticas

TIPOS DE FASES UTILIZADAS EM SPE

Condicionamento – expor os sítios de interação Aplicação da amostra - lenta Lavagem – eliminar interferentes Secagem do cartucho Eluição – eluir composto de interesse

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SOLID PHASE MICRO EXTRACTION-SPME)

VANTAGENS

- Tempo reduzido

- Baixo consumo de solvente

APLICAÇÃO

Análises ambientais

Toxicologia

Soro e plasma

Tecidos

Alimentos

medicamentos

cosméticos

Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos

Ribeirão Preto - 2007

FIBRAS – POLÍMEROS

-Polidimetilsiloxano (PDMS)- Poliacrilato (PA)- Carbowax (CW)

COMBINADAS

- Polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PDMS-DVB)

- Carboxen-polidimetilsiloxano- Carbowax-divinilbenzeno

Espessura: 7-100 mComprimento: 1 cm

MECANISMO

Partição do analito entre a matriz e a fibra de extração

OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS DA SPME

Tipo de fibra

Tempo de extração

Agitação da amostra

pH

Força iônica – salting-out

PRINCIPAL LIMITAÇÃO

Limite de quantificação alto

Variações entre os diferentes lotes e marcas de polímeros extratores

CONCENTRAÇÃO DO EXTRATO ORGÂNICO

Objetivo: Concentrar o extrato orgânico de modo a detectar os analitos na menor quantidade possível no extrato, quando for desejável

SECAGEM - ROTOEVAPORADOR

SECAGEM - FLUXO DE NITROGÊNIO

QUAL O TIPO DE EXTRAÇÃO DEVO UTILIZAR?

Analito Matriz Composto específico ou varredura Custo Tempo Número de amostras

Bibliografia

Gil, E S. Controle físico-químico de qualidade de medicamentos. Ateneu Editora, São Paulo, 2000.

Farmacopéia Brasileira, 4a. Ed., Atheneu Editora São Paulo Ltda, São Paulo, 2005.

United States Pharmacopoeia. 29th ed. Rockville: United States Pharmacopoeia Convention, 2006.