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i
Universidade Federal do Rio de Janeiro
PREPARAÇÃO DE DERIVADOS FUNCIONALIZADOS DO NOVO PROTÓTIPO
DE FÁRMACO NEUROATIVO LASSBIO 581 POR BIOCONVERSÃO
Francine Pazini
2006
ii
PREPARAÇÃO DE DERIVADOS FUNCIONALIZADOS DO NOVO PROTÓTIPO
DE FÁRMACO NEUROATIVO LASSBIO 581 POR BIOCONVERSÃO
Francine Pazini
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro Profa. Dra. Valéria de Oliveira
Rio de Janeiro Abril de 2006
iii
PREPARAÇÃO DE DERIVADOS FUNCIONALIZADOS DO NOVO PROTÓTIPO
DE FÁRMACO NEUROATIVO LASSBIO 581 POR BIOCONVERSÃO
Francine Pazini
Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro Profa. Dra. Valéria de Oliveira
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Aprovada por: ______________________________________________ Presidente, Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro
_______________________________________________ Profa. Dra. Ana Luisa Palhares de Miranda
_______________________________________________ Profa. Dra. Teresa Cristina Tavares Dalla Costa
_______________________________________________ Profa. Dra. Lidia Moreira Lima
Rio de Janeiro Abril de 2006
iv
Pazini, Francine Preparação de derivados funcionalizados do novo protótipo de fármaco neuroativo LASSBio 581 por bioconversão/ Francine Pazini. Rio de Janeiro: UFRJ, Faculdade de Farmácia, 2006. cvi, 164 f..;il. Orientadores: Eliezer J. Barreiro e Valéria de Oliveira Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, 2006. Referências bibliográficas: f.136-142 1. Bioconversão. 2. Fungos filamentosos. 3. Fármacos neuroativos
v
Resumo
Pazini, Francine. Preparação de derivados funcionalizados do novo protótipo de fármaco neuroativo LASSBio 581 por bioconversão. Orientadores: Eliezer J. Barreiro e Valéria de Oliveira. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A utilização de microrganismos como biocatalisadores eficientes é descrita desde civilizações antigas não apenas para produção de hormônios e antibióticos, mas na síntese régio e estéreoseletiva de fármacos, nos estudos do metabolismo (modelo microbiano do metabolismo animal) e na geração de moléculas com atividade melhorada, diferente ou menos tóxica do que à do composto de partida originadas da biodiversidade enzimática fúngica. Diante da atividade catalítica documentada para diferentes microrganismos, descrevemos neste trabalho a aplicação da bioconversão com fungos filamentosos para preparação de uma série de derivados funcionalizados a partir do novo protótipo de fármaco neuroativo LASSBio 581. Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757 foram os fungos filamentosos escolhidos para realização dos ensaios em escala semi-preparativa devido à respectiva capacidade de produzirem um dos derivados em maior quantidade ou um maior número de derivados em relação às demais cepas testadas. As análises dos dados obtidos por ressonância magnética nuclear de prótons e a espectrometria de massas sugerem a formação de compostos hidroxilados e glicosilados nas posições 4’ e 4’’, metilados e hidroxilados com abertura do anel c, dihidroxilados em 4’ e 4’’ e diglicosilados em 4’’.
vi
Abstract
Pazini, Francine. Preparation of functionalizated derivatives of the new neuroactive lead compound LASSBio 581 by bioconversion. Orientadores: Eliezer J. Barreiro e Valéria de Oliveira. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
The utilization of microorganisms as efficient biocatalysts goes back in time since old civilizations not only for the production of antibiotics and hormones, but also for regio and stereoselective synthesis of drugs or metabolism studies (microbial models of mammalian metabolism) and production of molecules with improved, different or less toxic activity originated by the fungal enzymatic biodiversity. Besides catalytic properties documented for different microorganisms, this work describes the application of bioconversions with filamentous fungi for preparation of a series of functionalizated derivatives by the new neuroactive lead compound LASSBio 581. Cunninghamella echinulata ATCC 9244 and Mortierella isabelina NRRL 1757 were the filamentous fungi choose for carrying out the assays in laboratorial scale due to respective capacity of production one those derivatives in high yields or variety compared to others assayed strains. The analysis of NMR 1H and MS spectra suggest the formation of hydroxylated and glicosylated derivatives in the 4’ and 4’’ position, methylated and hydroxylated with opening the ring c, dihydroxylated in 4’ and 4’’ and glicosylated in 4’’.
vii
Agradecimentos
Aos professores Eliezer J. Barreiro e Valéria de Oliveira pela oportunidade de me
orientar nesta dissertação, pela confiança depositada na realização deste
trabalho, pelos esclarecimentos, compreensão, presteza e paciência.
Às professoras Ana Luisa Palhares de Miranda, Teresa Cristina Tavares Dalla
Costa e Lidia Moreira Lima por terem aceitado o convite de avaliar meu trabalho
e pelos esclarecimentos e correções feitas.
Aos professores Carlos Alberto M. Fraga e Ana Luisa Palhares de Miranda pela
contribuição dada e pela presteza demonstrada.
Aos meus familiares pelo amor incondicional, por entender os momentos de
ausência, pela confiança, amizade, orgulho e companheirismo.
As amigas Tatiana Caixeta, Érica Núbia Cirilo, Andreza, Elaine e ao Emmanuel
Carneiro pelo incentivo, pelos momentos de descontração, pelas conversas, pelo
companheirismo, pelos conselhos e pelo carinho.
Ao Johnathan Santana de Freitas pela amizade, pela credibilidade sempre
impulsionada, pelo incentivo, pela colaboração familiar e pelo amor depositado
nos momentos necessários.
Aos colegas do LASSBio por terem me recebido com muita simpatia, pela ajuda
prestada e pela boa convivência quando estive no Rio de Janeiro.
Ao amigo Ricardo Menegatti pelos conhecimentos compartilhados, pela
solicitude oferecida e pelas agradáveis conversas.
A Dona Clélia pela disponibilidade prestada sempre que necessário.
viii
Aos amigos e professores da Universidade Federal de Goiás pela confiança e
pelo carinho.
Aos alunos com os quais tive oportunidade de compartilhar meus conhecimentos
até então adquiridos e com os quais pude aprender muito mais.
A Deus pela força, sabedoria e presença que me motivaram em todos os
momentos.
ix
Sumário
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Bioconversão e síntese de fármacos 1
1.2 Bioconversão e metabolismo de fármacos 5
1.2.1 Reações metabólicas de fase I 8
1.2.1.1 Sistema enzimático citocromo P-450 8
1.2.1.1.1 Natureza do citocromo P450 11
1.2.1.1.2 Localização do citocromo P450 14
1.2.1.1.3 Ciclo catalítico do citocromo P450 15
1.2.1.1.4 Monoxigenases de origem microbiana 17
1.2.1.1.5 Oxidação de heteroátomos 19
1.2.1.2 Redução 30
1.2.1.3 Hidrólise 31
1.2.2 Reações metabólicas de fase II 32
1.2.2.1 Metilação 32
1.2.2.2 Acetilação 32
1.2.2.3 Sulfatação 34
1.2.2.4 Glicosilação 37
1.2.2.5 Glicorunidação 38
1.2.3 Outros modelos para o estudo do metabolismo 40
1.2.3.1 Culturas de células 40
1.2.3.2 Uso de computadores 41
x
2 OBJETIVOS 42
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 43
3.1 Fatores que influenciam o processo de bioconversão 43
3.2 Composição dos meios de cultura 43
3.2.1 Morfologia do crescimento em meio líquido 45
3.2.2 Intensidade de agitação e aeração 49
3.2.3 pH 51
3.2.4 Temperatura 54
3.2.5 Solventes 55
3.2.6 Utilização das bioconversões para biotransformação de agentes
psicoativos
56
3.3 Síntese do LASSBio 581 60
3.4 Métodos cromatográficos 63
3.4.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) 64
3.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 65
3.5 Estudo do metabolismo microbiano do novo derivado
heterocíclico n-fenilpiperazínico LASSBio 581
67
3.5.1 Bioconversão do LASSBio 581 67
3.5.2 Monitoramento da bioconversão do LASSBio 581 69
3.5.2.1 Absídia blakeslceana ATCC 10148b 70
3.5.2.2 Absídia blakeslceana ATCC 22617 71
3.5.2.3 Aspergillus ochraceus ATCC 1009 73
3.5.2.4 Beauveria bassiana ATCC 7159 74
xi
3.5.2.5 Cunninghamella echinulata ATCC 9245 76
3.5.2.6 Cunninghamella echinulata ATCC 9244 77
3.5.2.7 Cunninghamella elegans ATCC 36112 80
3.5.2.8 Mortierella isabelina NRRL 1757 81
3.5.2.9 Mucor griosyanus ATCC 1207a 84
3.5.2.10 Rhizopus arrhizus ATCC 11145 85
3.5.3 Isolamento e purificação por cromatografia líquida em coluna
(Flash cromatografia)
87
3.5.4 Determinação das estruturas dos metabólitos formados 87
3.5.4.1 LaBioCon 1 91
3.5.4.2 LaBioCon 9 94
3.5.4.3 LaBioCon 10 97
3.5.4.4 LaBioCon 11 99
3.5.4.5 LaBioCon 12 103
3.5.4.6 LaBioCon 13 104
3.5.4.7 LaBioCon 18 107
3.5.4.8 LaBioCon 19 110
3.5.4.9 LaBioCon 22 112
4 CONCLUSÕES 119
5 MATERIAIS E MÉTODOS 121
5.1 Generalidades 121
5.1.1 Técnicas cromatográficas 121
5.1.2 Técnicas espectroscópicas 123
xii
5.1.3 Técnicas microbiológicas 123
5.2 Resultados experimentais 124
5.2.1 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilhexaidro
piperazina
124
5.2.2 Adaptação das cepas ao meio de cultura 127
5.2.3 Triagem 128
5.2.4 Desenvolvimento e validação de metodologias para o
monitoramento de bioconversões
129
5.2.4.1 Incubação 129
5.2.4.2 Separação e purificação dos produtos formados 130
5.2.5 Extração dos produtos formados 131
5.2.6 Isolamento e purificação 131
5.2.7 Ensaios em escala semi-preparativa 132
5.2.7.1 1º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 72h)
133
5.2.7.2 2º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida, tempo de reação: 96h)
134
5.2.7.3 3º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 190h)
134
5.2.7.4 4º Ensaio (Cepa: Mortierella isabelina NRRL 1757, solvente:
dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 168h)
135
5.2.7.5 5º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 96h)
136
xiii
5.2.8 Isolamento dos metabólitos 138
5.2.8.1 LaBioCon 1 138
5.2.8.2 LaBioCon 9 139
5.2.8.3 LaBioCon 10 141
5.2.8.4 LaBioCon 11 142
5.2.8.5 LaBioCon 12 143
5.2.8.6 LaBioCon 13 144
5.2.8.7 LaBioCon 18 145
5.2.8.8 LaBioCon 19 146
5.2.8.9 LaBioCon 22 147
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 149
xiv
Índice de Figuras
1. Esquema proposto para biotransformação do derivado A da tebaína
por Cunninghamella echinulata NRRL 1384, com formação de
intermediários para síntese da buprenorfina
3
2. Estruturas químicas dos derivados formados a partir da incubação do
fenantreno com Cunninghamella elegans
4
3. Transformação metabólica de fármacos
6
4. Participação de diferentes enzimas de fase I envolvidas no
metabolismo de xenobióticos
7
5. Estrutura do citocromo P450 1AKD de Pseudomonas putida com
cânfora 5-monoxigenada. A – sítio ativo do grupo heme; Fe – amarelo
; N – azul. O substrato (círculo rosa) se situa cercado pelo grupo
heme
9
6. Estrutura cristalina do citocromo P-450BM-3-FMN. O domínio heme
se representa em azul e o domínio de flavina em verde, o FMN em
amarelo e o grupo heme em rosa
12
7. Estrutura cristalina do citocromo P450 1AKD reductas
13
8. Estrutura molecular do sítio ativo do CYP450 de Pseudomonas putida
13
9. Localização do sistema enzimático citocromo P450 na membrana do
retículo endoplasmático
15
xv
10. Ciclo catalítico do citocromo P450
17
11. Estruturas químicas do propanolol e de seus metabólitos fase I,
humanos e fúngicos
21
12. Estruturas químicas da ebastina e seu principal metabólito fase I,
carebastina
22
13. Rota metabólica proposta por Zhang et al. para ciclobenzaprina
usando Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de
incubação 72 horas
23
14. Estruturas químicas dos derivados hidroxilados e glicosilados do
lesopitron formados pela incubação com Beauveria bassiana ATCC
7159
24
15. Rota metabólica proposta por Moody et al. para doxepina usando
Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de incubação 48
horas
26
16. Rota metabólica proposta por Moody et al. para mirtazapina usando
Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de incubação 72
horas.
27
17. Estruturas químicas dos produtos hidroxilados e dihidroxilados
formados a partir da incubação do irbesartan com diferentes cepas no
período de 7 dias
29
18. Estruturas químicas dos metabólitos humanos e fúngicos do
Rhazilinama
30
xvi
19. Estruturas químicas da warfarina e de seus metabólitos reduzidos
31
20. Hidrólise de 7,4’-diacetoxidaidzeina em daidzeina por Aspergillus
niger
32
21. Estruturas químicas dos produtos acetilados, formados pela
incubação da tranilcipromina com Cunninghamella echinulata
33
22. Produtos formados pela acetilação da difenidramina por
Cunninghamella elegans
34
23. Estruturas químicas dos derivados sulfatados formados pela
incubação do benzopireno com Cunninghamella elegans ATCC 36112
36
24. Biotransformação do flavonóide naringenina por Cunninghamella
elegans
36
25. Transformação da desacetiltimoxamina por Mucor hiemalis, Mucor
janssenii NRRL 3628 e Actinomucor elegans MMP 2092 com
formação de derivado glicosilado
37
26. Estruturas químicas dos produtos formados pela incubação da
sampangina com Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella
elegans ATCC 9245 e Rhizopus arrhizus ATCC 11145
38
27. Síntese da uridina-5’-difosfato-α-D-ácido glicurônico (UDPGA) e
glicuronidação de um fenol catalizada por uma glicuroniltransferase
39
28. Aspectos morfológicos dos fungos filamentosos Cunninghamella
echinulata ATCC 9244 (superior) e Mortierella isabelina NRRL 1757
(inferior) em ágar batata e nos meios líquidos caldo Sabouraud e
PDSM.
49
xvii
29. Rota síntética para formação do primeiro intermediário de síntese 4-
cloro-azidobenzeno
57
30. Esquema de síntese da formação do intermediário 1-[1-(4-clorofenil)-
1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilhexaidropiperazina
58
31. Etapa final da síntese do derivado N-fenilpiperazínico LASSBio 581
59
32. Espectro de massa do substrato LASSBio 581 obtido num
espectrômetro de massas Quattro LC-Micromass
60
33. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Absídia blakeslceana ATCC 10148b no tempo de 72 horas e
comprimento de onda 248nm
68
34. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Absídia
blakeslceana ATCC 10148b
68
35. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Absídia blakeslceana ATCC 22617 no tempo de 72 horas e
comprimento de onda 248nm
69
36. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Absídia
blakeslceana ATCC 22617
70
37. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Aspergillus ochraceus ATCC 1009 no tempo de 72 horas e
comprimento de onda 248nm
71
38. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Aspergillus
ochraceus ATCC 1009
71
xviii
39. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Beauveria bassiana ATCC 7159 no tempo de 96 horas e
comprimento de onda 248nm
72
40 Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Beauveria
bassiana ATCC 7159
73
41. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Cunninghamella echinulata ATCC 9245 no tempo de 48 horas e
comprimento de onda 248nm
74
42. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella
echinulata ATCC 9245
74
43. Perfis cromatográficos do sobrenadante de incubação do LASSBio
581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 nos tempos de 24 e
48 em sistema isocrático e 24horas em sistema gradiente, e
comprimento de onda 248nm
76
44. Cinéticas de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella
echinulata ATCC 9244
77
45. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Cunninghamella elegans ATCC 36112 no tempo de 48 horas e
comprimento de onda 248nm
78
46. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella
elegans ATCC 36112
79
47. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Mortierella isabelina NRRL 1757 no tempo de 96 horas e
comprimento de onda 248nm
80
xix
48. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Mortierella
isabelina NRRL 1757
81
49. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Mucor griosyanus ATCC 1207a no tempo de 48 horas e
comprimento de onda 248nm
82
50. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Mucor
griseocyanus ATCC 1207ª
83
51. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581
com Rhizopus arrhizus ATCC 11145 no tempo de 48 horas e
comprimento de onda 248nm
84
52. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Rhizopus arrhizus
ATCC 11145
85
53. Substrato LASSBio 581
86
54. Estruturas químicas dos cinco derivados funcionalizados formados a
partir da incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata
ATCC 9244
87
55. Estruturas químicas dos dois derivados funcionalizados formados a
partir da incubação do LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL
1757
88
56. Expansão da região relativa aos picos dos hidrogênios presentes nas
glicoses adicionadas à molécula do substrato LASSBio 581
90
xx
57. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 1 90
58. Estrutura química proposta para o produto diglicosilado LaBioCon 1
91
59. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 9
92
60. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 9
93
61. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 10
94
62. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 10
95
63. Estrutura química proposta para o produto dihidroxilado LaBioCon 12
96
64. Expansão da região relativa aos picos dos hidrogênios presente na
glicose adicionada à molécula do substrato LASSBio 581
97
65. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 13
98
66. Estrutura química proposta para o produto glicosilado LaBioCon 13
98
67. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 19
99
68. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 19
100
69. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 22
101
70. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 22
102
71. Estruturas químicas dos derivados funcionalizados do LASSBio 581 a
partir da aplicação de bioconversões com Cunninghamella echinulata
ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757, destacando suas
103
xxi
respectivas percentagens de rendimento.
72. Estruturas químicas dos derivados funcionalizados do LASSBio 581 a
partir da aplicação de bioconversões com Cunninghamella echinulata
ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757, representadas em 3D
com minimização de energia
108
73. Representação esquemática da primeira etapa da síntese do
LASSBio 581
115
74. Representação esquemática da segunda etapa da síntese do
LASSBio 581
116
75. Representação esquemática da terceira etapa da síntese do LASSBio
581
116
76. Representação esquemática da última etapa da síntese do LASSBio
581
117
xxii
Índice de Tabelas
1. Caracterização morfológica macroscópica em meio líquido PDSM e
Caldo Sabouraud por 72horas a 27ºC ± 2ºC a 200rpm. Tamanho
dos pellets: Ausência (-), Grandes (0,5cm), Médios (0,3cm),
Pequenos (0,1), Pequeníssimos (0,05cm); Produção de massa
amorfa: Positivo (+), Negativo (-); Formação de halo: Ausência (-),
Em toda parede (++); Em parte da parede (+)
45
2. Percentual de crescimento fúngico em meio líquido PDSM e Caldo
Sabouraud.
46
3.1. Exemplos de diferentes valores de pH empregados na literatura em
bioconversões
52
3.2. Exemplos de diferentes valores de pH empregados na literatura em
bioconversões
53
4. Bioconversão do LASSBio 581 por várias cepas de fungos
filamentosos (triagem), tempo de 24-96horas
65
5.1. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do
LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e
Mortierella isabelina NRRL 1757
104
5.2. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do
LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e
Mortierella isabelina NRRL 1757
105
5.3. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do
LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e
Mortierella isabelina NRRL 1757
106
xxiii
6. Diferentes parâmetros avaliados entre os cinco ensaios em escala
semi preparativa
127
xxiv
Anexos
1. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 10148b no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
142
2. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 22617 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
143
3. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Aspergillus ochraceus ATCC 1009 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
144
4. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Beauveria bassiana ATCC 7159 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm.
145
5. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9245 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
146
6. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 no tempo de 24 em sistema isocrático, e comprimento de onda 248nm.
147
7. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 no tempo de 24 em sistema gradiente, e comprimento de onda 248nm.
148
8. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella elegans ATCC 36112 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
149
9. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm.
150
10. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mucor griosyanus ATCC 1207a no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
151
xxv
11. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Rhizopus arrhizus ATCC 11145 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
152
12. Espectro de RMN 1H (500MHz) do derivado LaBioCon 1 153
13. Espectro de massa do derivado LaBioCon 1
154
14. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 9
155
15. Espectro de massa do derivado LaBioCon 9
156
16. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 10
157
17. Espectro de massa do derivado LaBioCon 10
158
18. Espectro de massa do derivado LaBioCon 12
159
19. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 13
160
20. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 19
161
21. Espectro de massa do derivado LaBioCon 19
162
22. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 22
163
23. Espectro de massa do derivado LaBioCon 22
164
xxvi
Lista de Abreviaturas
IPG - 1,2-O-isopropilideno glicerol
CYP450 - Sistema enzimático citocromo P-450
FMN - Flavina mononucleotídio (forma oxidada)
FMNH2 - Flavina mononucleotídeo (forma reduzida)
FAD - Flavina adenina dinucleotídio (forma oxidada)
FADH - Flavina adenina dinucleotídio (forma reduzida)
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
PAHs - Hidrocarbonetos poli aromáticos
CBP - Ciclobenzaprina
UDPGA - Uridina-5’-difosfato-α-D-ácido glicurônico
UDPGT - Glicuroniltransferases
QSAR - Relação estrutura atividade quantitativa
CoMFA - Análise de campo molecular comparativo
PDSM - Popato Dextrose Sucrose Médium
PHM - Metabólitos parahidroxilados
HMM - Metabólitos hidroximetilados
CCD - Cromatografia em camada delgada
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
ATCC - American Type Culture Collection
NRRL - Northern Regional Research Laboratories
xxvii
RMN 1H - Ressonância magnética nuclear de prótons
RMN C13 - Ressonância magnética nuclear de carbono 13
MS - Espectrometria de massas
DMF - Dimetilformamida
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 BIOCONVERSÃO E SÍNTESE DE FÁRMACOS
A utilização de microrganismos como biocatalisadores altamente eficientes, é
descrita desde civilizações antigas com o aprendizado de fazer o vinho e o queijo. Esta
prática não se restringe apenas à utilização de microrganismos para produção de
antibióticos e hormônios, mas também a síntese enzimática regio e estereosseletiva de
produtos químicos e farmacêuticos (AZERAD, 1995; ABOURASHED et al., 1999). A
síntese exclusiva ou preferencial de um estereoisômero, em casos onde a pureza ótica
é fundamental, mostra-se essencial para determinação da qualidade dos compostos
formados, já que dois enantiomêros podem apresentar ações diferentes nos
organismos vivos em relação a ações biológicas e toxicidade (FABER, 1997;
OLIVEIRA, 2000).
Inúmeras são as vantagens da utilização de enzimas à catálise química
usualmente empregada, principalmente com relação à velocidade das reações
catalizadas, às condições de realização dos ensaios, à versatilidade que apresentam
como reagentes e a seletividade para reações catalisadas por elas (AZERAD, 1995). A
proporção de ocorrência das reações promovidas por enzimas podem ser mais rápidas
do que as observadas em catálise química, atuando em condições brandas de análise,
como pH entre 5 e 8, temperatura entre 20 e 40ºC e solvente aquoso. Além disso, as
enzimas apresentam a capacidade de minimizar reações indesejáveis como
decomposição, isomerização, racemização ou rearranjos inoportunos que
freqüentemente interferem nas metodologias químicas (AZERAD, 1995).
2
A ação das enzimas em seus substratos naturais é geralmente muito seletiva,
especialmente considerando todos os tipos de seletividades químicas possíveis:
quimiosseletividade (ação em grupamentos químicos específicos); regio e
diastereosseletividade (discriminação entre grupos funcionais idênticos localizados em
posições estruturalmente diferentes da molécula do substrato); enantiosseletividade
(discriminação entre substratos enantioméricos ou grupos enantiotópicos de um
substrato pró-quiral). A enantiosseletividade de biocatalisadores que podem ser
utilizados para discriminação enantiotópica de moléculas pró-quirais podem levar a
criação de novos centros quirais, representados por um enantiômero simples, em um
rendimento teórico de 100% (ABOURASHED et al., 1999).
A síntese da buprenorfina, um potente agonista parcial de receptores morfínicos
subtipo µ, pode ser efetuada a partir de intermediários demetilados, formados a partir
do derivado A da tebaína, por reações microbianas regiosseletivas de N e O-
demetilação com Cunninghamella echinulata NRRL 1384 (Figura 1) (ABEL et al., 2003).
Carboxiesterases microbianas que incluem lipases e esterases catalisam a
hidrólise de diversos ésteres naturais e não naturais, freqüentemente apresentando alta
enantiosseletividade e regiosseletividade. 1,2-O-isopropilideno glicerol (IPG) é um
importante ligante quiral de bloqueio da síntese de muitos componentes opticamente
ativos, tais como glicerofosfolipídeos, β-bloqueadores, prostaglandinas e leucotrienos.
Devido ao valor comercial associado às substâncias IPG enantioméricas puras R e S, e
ao alto custo associado à síntese química destes compostos, Molinari et al. (2005)
demonstraram em seus estudos a importância da descoberta de enzimas microbianas
que promovessem a hidrólise enantioseletiva de diferentes ésteres IPG racêmicos
usando cepas de Streptomices que comprovaram tal atividade, por ensaios de
3
biotransformação, antes observados em outros microrganismos (Rhodococcus
erythropolis, espécies de Bacillus).
HO
O
H3CO
HOC(CH3)3
CH3
HN
H3CO
O
H3CO
HOC(CH3)3
CH3
H NCH3
H3CO
O
H3CO
HOC(CH3)3
CH3
HNH
HO
O
H3CO
HOC(CH3)3
CH3
H NH
HO
O
H3CO
HOC(CH3)3
CH3
HNCH3
Buprenorfina
Derivado A da tebaína
N-demetilação
O-demetilação N-demetilação
Transferência de N para O-metil
Figura 1. Esquema proposto para biotransformação do derivado A da tebaína por Cunninghamella echinulata NRRL 1384, com formação de intermediários para síntese da buprenorfina (ABEL et al., 2003).
Além da aplicação das bioconversões para síntese regio e estereosseletiva de
fármacos, os microrganismos são capazes de gerar uma biodiversidade de compostos
4
que podem conduzir a novos protótipos de fármacos. Os produtos formados pela ação
de fungos filamentosos podem, entre outras vantagens, gerar produtos com ação
melhorada, diferente ou menos tóxica que à do composto de partida (CERNIGLIA et al.,
1989; HEZARI, DAVIS, 1992; AZERAD, 1995).
O fenantreno, um hidrocarboneto aromático policíclico, apresenta como
principais sítios de metabolização em mamíferos a dihidroxidação nas posições 9 e 10
do anel aromático. Bioconversão deste composto por Cunninghamella elegans,
segundo trabalho de Cerniglia et al. (1989), propiciou a formação de produtos
diidroxilados nas posições 1,2, 3,4 e 9,10 (metabólito observado em mamíferos) e
glicosilado na posição 1 representando a biodiversidade fúngica na geração de novos
compostos (Figura 2).
Fenantreno
OH
OH
OHOH
HO
OH
OO
HOH2C
HO
HO
OH
Figura 2. Estruturas químicas dos derivados formados a partir da incubação do fenantreno com Cunninghamella elegans (CERNIGLIA et al., 1989).
5
1.2 BIOCONVERSÃO E METABOLISMO DE FÁRMACOS
A aprovação de um fármaco para uso na terapêutica compreende extensivos
estudos que determinem sua eficácia e segurança, sendo a elucidação do metabolismo
uma etapa muito importante para esta avaliação (AZERAD, 1999).
O conhecimento sobre a rota metabólica é útil não só no desenho de novos
fármacos, mas no aperfeiçoamento daqueles já existentes. Geralmente, o metabolismo
de fármacos ocorre através de várias vias, cada uma consistindo numa série de
reações que resultam na formação de novos compostos (metabólitos) que também
podem ser farmacologicamente ativos. Em vista disso, no desenvolvimento de um
fármaco novo é importante documentar o comportamento de seus produtos de
metabolismo, assim como o fármaco precursor no organismo (AZERAD, 1999).
O estudo do metabolismo dos fármacos é essencial para o completo conhecimento
de fatores farmacocinéticos relevantes ao seu uso adequado e seguro, já que um
fármaco têm sua utilidade terapêutica medida em função da ação benéfica que ele
exerce sobre um dado sistema biológico (DONATO, O'CONNOR, 2004). A
biotransformação de fármacos é geralmente considerada como uma reação de
detoxificação, responsável pela conversão de fármacos em outros produtos no
organismo antes e depois que eles atinjam seus sítios de ação (AZERAD, 1999).
Os fármacos são metabolizados por processos enzimaticamente catalizados.
Várias enzimas encontradas no organismo, específicas ou não, catalisam o
metabolismo de xenobióticos e fármacos de forma estereoespecíficas, com o objetivo
de converter o fármaco lipofílico em metabólitos mais polares e, portanto mais
facilmente eliminados (AZERAD, 1999). Muitos fármacos e outros xenobióticos são
metabolizados por enzimas normalmente associadas com o biossíntese e metabolismo
6
de constituintes endógenos, como esteróides, eicosanóides, vitamina D3, retinóides e
aminas biogênicas (OMURA, 1999; DÍAZ, 2001; WILLIANS, LEMKE, FOYE , 2002).
O fígado é o principal sítio de metabolização de fármacos, embora outras enzimas
metabolizadoras de xenobióticos são encontradas no tecido nervoso, rins, pulmão,
plasma e trato gastrintestinal (secreções digestivas, flora bacteriana e parede intestinal)
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002). As reações envolvidas nestes processos são, por
conveniência, classificadas em reações de Fase I e Fase II (AZERAD, 1999; WILLIANS,
LEMKE, FOYE, 2002; BARREIRO, SILVA, FRAGA, 1996).
Figura 3. Transformação metabólica de fármacos.
As enzimas de Fase I, em geral, são capazes de transformar inúmeros substratos
e catalisar reações diferentes. Trata-se de proteínas catalíticas de natureza diversa,
incluindo enzimas com atividade de monoxigenases como o citocromo P-450 ou a
flavina monoxigenase, diversas oxidases (álcool desidrogenase, aldeído
desidrogenase, amino oxidases, aromatases), epóxido hidrolases ou esterases e,
amidases hepáticas e plasmáticas. Destas o citocromo P-450 é a mais importante e
amplamente estudado (Figura 4) (DONATO, 2004; WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
Fármaco (Hidrofóbico) Reações de Fase I
Metabólitos funcionalizados (Hidrofílicos)
Reações de Fase II Metabólitos conjugados (Excreção)
Biopolímeros (Toxicidade)
Metabólitos conjugados (Excreção)
7
Figura 4. Participação de diferentes enzimas de Fase I envolvidas no metabolismo de xenobióticos (adaptado de DONATO, 2004).
O estudo do metabolismo de fármacos tradicionalmente é realizado em modelos
animais, perfusão em órgãos e culturas de células normais ou malignas. Modelos
microbianos podem consistir em uma alternativa ou pelo menos um complemento aos
estudos em sistemas animais, haja visto que podem imitar o metabolismo de mamíferos
e fornecer algumas informações pertinentes sobre o destino metabólico de um fármaco
(ROSAZZA et al., 1979; SMITH, ROSAZZA, 1983; SARIASLANI, 1991; ABOURASHED
et al., 1999; AZERAD, 1999). As transformações enzimaticamente promovidas na
estrutura química dos fármacos podem acarretar profundas alterações na resposta
biológica, uma vez que modificações moleculares, ainda que singelas, podem alterar
significativamente o farmacóforo, dificultando sua interação com o biorreceptor original,
ou ainda, favorecendo novas interações com outras biomacromoléculas,
correspondendo a novos e distintos efeitos biológicos, algumas vezes responsáveis
pelos efeitos deletérios de um fármaco (BARREIRO, SILVA, FRAGA, 1996).
hidrolases redutases peroxidases
Flavina monoxigenases
Citocromo P450
8
A utilização de microrganismos como modelo para estudo do metabolismo de
fármacos tem sido bem estabelecido desde o conceito primeiramente introduzido por
Smith e Rosazza em 1974. O conceito de modelo microbiano segundo estes autores
está fundamentado no fato de que tanto os fungos como os mamíferos são organismos
eucariotos que apresentam sistema enzimático similar para a maioria das funções
fisiológicas e para o metabolismo de xenobióticos (ABOURASHED et al., 1999).
Dentre as vantagens da utilização de sistemas microbianos, pode-se destacar: a
fácil preparação e o baixo custo dos meios de cultura; apresentam-se como um método
reprodutivo já que os processos envolvidos são de simples repetição e a quantidade
dos produtos formados é maior em relação aos modelos animais (maior concentração
inicial do substrato é suportada) favorecendo a detecção, identificação e elucidação
estrutural; a manutenção das culturas estoques de microrganismos é relativamente
simples e barata em relação à manutenção de culturas de células e tecidos ou mesmo
animais de laboratório; probabilidade de ocorrer transformações regio e
estereosseletivas usando diferentes cepas selecionadas pelo screening; possibilidade
da descoberta de novos metabólitos com maior atividade e menos toxicidade em
relação ao composto original. (ABOURASHED et al., 1999; AZERAD, 1999).
1.2.1 REAÇÕES METABÓLICAS DE FASE I
1.2.1.1 SISTEMA ENZIMÁTICO CITOCROMO P-450 (CYP450)
O citocromo P-450, ao longo de sua história, foi inicialmente identificado como
um pigmento ligado ao monóxido de carbono microssomal, que quando reduzido
apresentava um pico de absorção único no comprimento de onda de 450nm. Poucos
anos depois, contudo, sua natureza hemoprotéica foi elucidada por Omura e Sato e a
9
partir daí, sua importância como monoxigenase de função mista (BOSSCHE, 1998;
OMURA, 1999). O sistema enzimático citocromo P-450 constitui uma superfamília de
heme-proteínas, presente em numerosas espécies, desde bactérias onde o citocromo
P-450 cam foi o primeiro identificado (Figura 5) a mamíferos, sendo o principal
responsável pelo metabolismo oxidativo dos xenobióticos. Estas enzimas catalizam o
ataque oxidativo a compostos de natureza orgânica, de maneira regio e estéreo
específicas e em temperatura fisiológica (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002; DONATO,
2004). A proporção com que os vários xenobióticos são metabolizados pelo sistema
enzimático CYP-450 depende de vários fatores tais como espécie, raça, estado
nutricional, tecidos e idade (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
Figura 5. Estrutura do citocromo P450 1AKD de Pseudomonas putida com cânfora 5-monoxigenada. A – sítio ativo do grupo heme; Fe – amarelo ; N – azul. O substrato (círculo rosa) se situa cercado pelo grupo heme (VILLAREJO, 2004)
Várias são as reações catalizadas pelo citocromo P-450, sendo elas: a oxidação
de alcanos e aromáticos; a epoxidação de alcenos, hidrocarbonetos policíclicos e
benzenos halogenados; a dealquilação de aminas secundárias, aminas terciárias e
10
éteres; a conversão de aminas para N-oxidos, hidroxilaminas e derivados nitrosos; e a
dealogenação de hidrocarbonetos halogenados (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002;
DONATO, 2004).
Devido a grande diversidade de isoenzimas pertencentes ao sistema enzimático
citocromo P-450, estas enzimas foram classificadas em famílias e subfamílias segundo
critérios filogenéticos e seqüência de aminoácidos das cadeias polipeptídicas. Para
pertencer a uma mesma família as monoxigenases CYP450 devem apresentar uma
homologia na seqüência de aminoácidos > 40% e, homologia > 55% para pertencer a
uma mesma subfamília. CYP450s foram nomeadas usando como raiz o símbolo CYP
seguida por um número arábico que determina a família (CYP1, CYP2, CYP3, etc.), a
letra denominando a subfamília (CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP2E) e outro numeral
arábico representando o gene individual (WILLIANS et al., 2002; DONATO, 2004). No
metabolismo de xenobióticos, as famílias de CYP450 1, 2 e 3 são as que participam em
maior proporção (DÍAZ, 2001).
As enzimas citocrômicas 1A1 e 1A2, pertencentes à família 1 do citocromo P-450
(CYP1), são as que tem participação nos processos de biotransformação, diferindo
entre si na capacidade de oxidar compostos aromáticos. Enquanto as enzimas CYP1A1
catalisam o metabolismo de poluentes ambientais, as enzimas CYP1A2 participam da
oxidação de fármacos tais como tacrina, clozapina, imipramina, antidepressivos,
teofilina, cafeína e naproxeno (DÍAZ, 2001). Aproximadamente 35% do metabolismo de
fármacos comumente utilizados, é decorrente da ação da família 2 do CYP450,
destacando as enzimas 2A6 (oxidação da nicotina), 2C9 (metabolismo da varfarina,
tolbutamida, tamoxifeno e fenitoína), 2C19 (metabolismo da amitriptilina, omeprazol e
fenitoína; metabolização de proguanila a cicloguanila), 2D6 (responsável pelo
11
metabolismo de 20% dos fármacos que sofrem biotransformação pelo CYP450, entre
eles imipramina, desipramina, fluoxetina, paroxetina, propanolol,haloperidol, tioridazina,
lidocaína e codeína) e 2E1 (metabolismo do acetaminofeno ao produto tóxico N-acetil-
p-iminobenzoquinona e biotransformação de procarcinógenos). Dentre as enzimas
citocrômicas, a subfamília 3A (em destaque isoenzimas 3A4 e 3A5) é a que ocupa o
lugar de maior importância, sendo responsável pela biotransformação de mais de 50%
dos fármacos (eritomicina, claritromicina, indinavir, ritonavir, diazepam, alprazolam,
astemizol, terfenadina, sinvastatina, lovastatina e ciclosporina, entre outros) (DÍAZ,
2001).
1.2.1.1.1 NATUREZA DO CYP450
O CYP450 apresenta no mínimo dois componentes protéicos: uma
proteína heme chamada citocromo P-450 e uma flavoproteína chamada NADPH-CYP-
450 redutase contendo tanto flavina mononucleotídio (FMN) como flavina dinucleotídio
(FAD) (Figura 6). Destes dois componentes do sistema enzimático, o CYP450 funciona
como o sítio de ligação do substrato e do oxigênio, ao passo que CYP450 NADPH
redutase atua como transportadora de elétrons do NADPH. No processo de
transferência de elétrons do NADPH para o CYP450, a fosfatidilcolina mostra-se
essencial, demonstrando grande influência sobre o sistema de monoxigenase CYP450
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
12
Figura 6. Estrutura cristalina do citocromo P-450BM-3-FMN. O domínio heme se representa em azul e o domínio de flavina em verde, o FMN em amarelo e o grupo heme em rosa (VILLAREJO, 2004).
De forma geral, a molécula da enzima CYP450 é constituída por uma
combinação de regiões de α-hélice e de grupos rodeando o grupo heme da proteína,
onde as regiões mais variáveis são as de ligação à membrana ou as de união e
reconhecimento do substrato (Figura 7). O sítio ativo da CYP450 consiste de um
domínio de ligação ao substrato hidrofóbico no qual se encontra o grupo prostético ferro
protoporfirinina (grupo heme). O ferro no grupo prostético está ligado a quatro
nitrogênios no anel porfirínico. O grupo tiol do aminoácido cisteína, funciona como
quinto ligante ao átomo de ferro do grupo heme e uma molécula de água como o sexto
ligante (Figura 8) ( WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002; DONATO, 2004).
13
Figura 7. Estrutura cristalina do citocromo P-450 1AKD redutase (VILLAREJO, 2004)
Figura 8. Estrutura molecular do sítio ativo do CYP450 de Pseudomonas putida (VILLAREJO, 2004)
Os CYP450s podem ser classificados em quatro classes em função de como os
elétrons são transportados do NADPH para o centro catalítico da enzima. Os de classe I
utilizam uma redutase que contenha FAD e uma ferro-sulfoproteína (ferridoxina). Os de
classe II usam uma cadeia transportadora de elétrons e necessitam de uma redutase
do citocromo P-450 que contenha FAD/FMN para transferência de elétrons, são as mais
abundantes nos eucariotos. Os de classe III são auto-suficientes e não requerem um
14
doador de elétrons, e os de classe IV recebem os elétrons diretamente do NADPH
(DONATO, 2004).
1.2.1.1.2 LOCALIZAÇÃO DOS CYP450
O citocromo P-450 é uma proteína integral da membrana, onde seus
componentes eletrônicos estão localizados no sítio citoplasmático e o sítio ativo
hidrofóbico no lúmen do retículo endoplasmático (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
Nos organismos eucariotos, os CYP450 de classe I estão localizados na
membrana interna da mitocôndria. Nos mamíferos estes CYP450 catalizam diversas
etapas da biossíntese de hormônios esteroidais e vitamina D3 (DONATO, 2004).
As enzimas de classe II e as CYP450 NADPH redutases não estão associadas,
mas ambas estão ancoradas de forma independente na porção externa da membrana
do retículo endoplasmático (Figura 9). A atividade de alguns CYP450 são favorecidas
pela presença do citocromo b5 que facilita a transferência de elétrons do NADPH. Nos
animais, entre as funções fisiológicas desempenhadas estão a biossíntese e o
catabolismo de moléculas sinalizadoras, hormônios esteroidais e ácido retinóico
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002; DONATO, 2004).
Os CYP450 de classe III participam da síntese de prostaglandinas em
mamíferos. Além das funções biossintéticas, os CYP450 de classe I e de classe II
participam da metabolização de xenobióticos tanto de plantas como de animais. São
responsáveis pelos processos de metabolização de fármacos e dos processos de
detoxificação (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002; DONATO, 2004).
15
Figura 9. Localização do sistema enzimático citocromo P450 na membrana do retículo endoplasmático (DONATO, 2004).
As enzimas do CYP1A1 encontram-se em maior proporção em tecidos
extrahepáticos tais como pulmão, placenta e linfócitos, ao passo que as enzimas CYP
1A2 estão predominantemente no fígado. Dentre as enzimas, com maior participação
no metabolismo, pertencentes à família 2 do citocromo P-450, CYP2A6 e CYP2E1 são
expressas no fígado. As isoenzimas 3A4 e 3A5, da família 3 do CYP450, estão
presentes em tecidos como fígado, trato gastrintestinal, placenta e pulmão (DÍAZ,
2001).
1.2.1.1.3 CICLO CATALÍTICO DOS CYP450
O mecanismo catalítico para as muitas isoformas de CYP450 isoladas mostra-se
uniforme, ocorrendo em uma série de etapas e interagindo com moléculas do substrato,
doadores de elétrons e oxigênio (Figura 10) (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
Na etapa A, a ligação reversível do grupo heme da enzima CYP450 com a
molécula do substrato resulta na formação de um complexo análogo ao complexo
enzima-substrato (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
16
Na etapa B, o complexo férrico formado entre o substrato e o CYP450 sofre
redução para formação de um complexo ferroso entre substrato e CYP450 (Fe3+ do
grupo heme passa para Fe2+). A redução ocorre por um elétron originado do NADPH e
transferido pela flavoproteína, NADPH-CYP450 redutase, do complexo FMNH2/FADH e
pelo aumento no potencial redox originado na etapa anterior (WILLIANS, LEMKE,
FOYE, 2002; DONATO, 2004).
O complexo CYP450 reduzido, na etapa C, rapidamente se liga ao oxigênio
molecular (O2) como um sexto ligante ferroso para formar o complexo oxiCYP450
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
OxiCYP450 sofre auto-oxidação a ânion superóxido, na etapa D do ciclo. Na
etapa E, o ânion superóxido férrico sofre adicional redução por um segundo elétron da
flavoproteína (ou possivelmente do citocromo b5) para formar o complexo reduzido em
dois elétrons, peroxiCYP450. O ciclo pode ser interrompido, a partir da subseqüente
hidroxilação do substrato nesta etapa. Ocorre desequilíbrio no ânion superóxido
causado por xenobióticos, formando peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular (O2)
regenerando o ponto inicial do ciclo, o complexo substrato-proteína heme férrica
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
O complexo peroxiCYP450 férrico, na etapa F, sofre clivagem heterolítica do
ânion peróxido a água e a um intermediário altamente eletrofílico perferril oxenóide (Fe
5+=O) ou a um complexo perferril oxigênio-cisteína-porfirina estabilizado por
ressonância. Esta espécie perferril oxigênio representa a espécie cataliticamente ativa
da oxigenação (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
Na etapa G, a retirada de um hidrogênio do substrato pela espécie perferril
oxigênio transfere o radical hidroxila (OH) periférico para o carbono central, a adição do
17
radical em ligação π ou a retirada de um elétron de um heteroátomo para formação de
um radical cátion centralizado no heteroátomo do intermediário perferril (WILLIANS,
LEMKE, FOYE, 2002).
A subseqüente recombinação do radical (religação do oxigênio), na etapa H, ou
transferência de elétrons (deprotonação) permite produtos hidroxilados e regeneração
do complexo enzimático citocromo P-450 férrico (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
N N
NNFe
SCys
OH H
R-H3+
N N
NNFe
SCys
3+RH
A.
N N
NNFe
SCys
2+RH
é B.
N N
NNFe
SCys
2+RH
O2 C.
OO.. ....
N N
NNFe
SCys
3+RH
OO.. D........
éE.
-.
N N
NNFe
SCys
3+RH
OOH
H+
H2OF.
N N
NNFe
SCys
5+RH
O
N N
NNFe
SCys
4+ R
OH
.. ..G.
H.
R-OH
Figura 10. Ciclo catalítico do citocromo P450.
18
1.2.1.1.4 MONOXIGENASES DE ORIGEM FÚNGICA
A presença de CYP450 em fungos foi descrita desde 1964, em cepas de
Sacharomyces cerevisae. Através de estudos em uma grande variedade de espécies,
pode-se definir sete diferentes reações enzimáticas associadas com os citocromos P-
450 de fungos, incluindo a biossíntese do colesterol, fitosterol e ergosterol, a
hidroxilação de cadeias longas de alcanos, a hidroxilação de ácidos graxos, a
hidroxilação do ácido oléico e a hidroxilação da progesterona. Na biossíntese do
colesterol, fitosterol ou ergosterol, uma etapa fundamental é a 14α-demetilação do
lanosterol em mamíferos, S. cerevisae, Candida glabrata e C. albicans, catalizada pelo
P-450 14DM (P-450 51) (BOSSCHE, KOYMANS, 1998).
A hidroxilação de hidrocarbonetos poli aromáticos (PAHs) por fungos
filamentosos como Cunninghamella elegans, C. echinulata, Mortierella isabelina e
Beauveria bassiana, assim como o envolvimento das enzimas do CYP450 destas cepas
têm sido estudada deste 1982 por Cerniglia et al. O envolvimento destas enzimas em
muitos destes estudos é concluído de maneira indireta como pelo uso de inibidores
específicos do complexo enzimático citocromo P-450, devido a dificuldade de
purificação destas enzimas (BRINK et al., 1998).
Outra classe bem estudada de bioconversões catalizadas pelo sistema
enzimático citocromo P-450 são as hidroxilações estereo-específicas de esteróides.
Frações microssômicas capazes de hidroxilar esteróides in vitro tem sido preparadas a
partir de vários fungos filamentosos incluindo Aspergillus ochraceus (11α-hidroxilação
da progesterona), Botryospaeria obtusa (7β-hidroxilação), Cochliobolus lunatus (11β-
hidroxilação), Mucor piriformis (14α-hidroxilação) e Phycomyces blakesleeanus (7α-
hidroxilação). Um envolvimento das enzimas do citoctromo P-450 em hidroxilações
19
sítio-específicas da progesterona foi observado em vários fungos como Cunninghamella
elegans, Aspergillus fumigatus, Paecilomyces lilacinus e Rhizopus nigricans, de modo
que o envolvimento deste sistema enzimático nas bioconversões pode ser claramente
provado em 1995 pela purificação da proteína do sistema enzimático promotor da
hidroxilação da progesterona por P. blakesleeanus (BRINK et al., 1998).
A para-hidroxilação de benzoatos por Aspergillus niger e a redução do óxido
nítrico por Fusarium oxysporum são conversões fúngicas que também envolvem o
sistema enzimático citocromo P-450. Na para-hidroxilação de benzoatos, o gene do
CYP450 envolvido é o cyp53, que apresenta genes homólogos em cepas de
Rhodotorula minuta e Beauveria bassiana. Para redução do óxido nítrico, ao contrário,
o gene envolvido é o cyp55, com sistema comparável no fungo Cylindrocarpon
tonkinense. O P-450foxy, uma enzima do CYP450, foi isolada do fungo Fusarium
oxysporum e está envolvida na ω-1-ω-3 hidroxilação de ácidos graxos, assim como a
proteína P-450BM3 do Bacillus megaterium (BRINK et al., 1998).
1.2.1.1.5 OXIDAÇÃO DE HETEROÁTOMOS
A oxidação metabólica de carbonos aromáticos pelo CYP450 depende da
isoforma da enzima que catalisa a oxidação e do potencial do componente aromático,
de modo que estas hidroxilações ocorrem em posições preditas pelos conceitos de
substituição eletrofílica. Componentes aromáticos são comumente convertidos a fenóis
por mamíferos, sendo também produzidos como principal metabólito microbiano. Anéis
aromáticos ricos em elétrons são facilmente hidroxilados, enquanto sistemas deficientes
em elétrons o são escassamente ou nem sofrem oxidação. Em sistemas di- ou tri-
substituídos, as hidroxilações são direcionadas a posições preditas pela sumarização
20
dos efeitos dos substituintes (SMITH, ROSAZZA, 1983; WILLIANS , LEMKE, FOYE,
2002).
A habilidade de fungos filamentosos de promover hidroxilações aromáticas em
acetanilida, anilina, benzeno, ácido benzóico, bifenila, clorobenzeno, cumarina,
naftaleno, nitobenzeno, tolueno e três isômeros de xilenos foi testada em trabalho
realizado por Smith e Rosazza em 1983. Para tal, foram testadas as capacidades
metabolizadoras de Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Aspergillus niger
ATCC 9241, Aspergillus ochraceous ATCC 1158w, Rhizopus stolonifer NRRL 1477 e
Cunninghamella echinulata ATCC 9244. A seleção dos substratos em estudo se baseou
no fato de cada um destes componentes selecionados já terem sido estudados em
mamíferos, permitindo comparação com resultados encontrados pelos modelos
microbianos impostos. Com relação aos dados encontrados por Smith e Rosazza
(1983), foi detectado um alto grau de paralelismo entre produtos gerados por mamíferos
e aqueles formados por fungos filamentosos, demonstrando que o padrão de
hidroxilação para os substratos estudados mimetizava a hidroxilação em mamíferos.
Foster et al. em 1989 estudou a biotransformação do bloqueador β-adrenérgico
propranolol por Cunninghamella echinulata, onde os derivados formados foram
comparados aos metabólitos humanos. Dois caminhos principais conduzem aos
metabólitos humanos de Fase I (4-hidroxipropranolol, desisopropilpropranolol, ácido-1-
naftoxiláctico, propranolol glicol e ácido-1-naftilacético) envolvendo a oxidação da
cadeia lateral e a hidroxilação aromática. Todos os cinco metabólitos Fase I
encontrados pela biotransformação do propranolol em humanos também foram
formados em incubações com Cunninghamella echinulata, indicando a importância
deste fungo filamentoso em estudos do metabolismo (Figura 11) (FOSTER et al., 1989).
21
OH2C CHCH2NHCH(CH3)2
OH
OH2C CHCH2NHCH(CH3)2
OH
OH
OH2C CHCH2NH2
OH
OH2C CHCOOH
OH
OH2C CHCH2
HO OH
OH2C COOH Propranolol
4-hidroxipropranolol
desisopropilpropranolol
1-ácido nafitoxilático
propranolol glicol
1-ácido nafitoxiacético
Figura 11. Estruturas químicas do propranolol e de seus metabólitos fase I, humanos e fúngicos (FOSTER et al., 1989). A biotransformação de ebastina, um anti-histamínico, por Cunninghamella
blakesleeana levou a formação de carebastina como metabólito principal, e dos
intermediários álcool e aldeído. Estudos metabólicos Fase I em humanos, ratos, porcos
da Índia, cachorros e macacos também demonstraram a formação de carebastina como
principal metabólito estando em concordância com os estudos realizados com o fungo
filamentoso Cunninghamella blakesleeana. A conversão de ebastina demonstrou desta
forma, ser outro exemplo bem sucedido da utilização de microrganismos para estudos
do metabolismo de fármacos (Figura 12) (SCHWARTZ et al., 1996).
22
NO
O
NO
O
HOO
ebastina
carebastina
Figura 12. Estruturas químicas da ebastina e seu principal metabólito fase I, carebastina (SCHWARTZ et al., 1996). Hidroxilação microbiológica do antidepressivo tricíclico ciclobenzaprina (CBP) foi
observada por Zhang Donglu et al. (1996) com Cunninghamella elegans, e os
metabólitos fúngicos gerados foram usados como padrão para investigar o metabolismo
deste fármaco pelo uso de microssomas de fígado de rato (Figura 13).
Tem sido reportado que a hidroxilação de sistemas aromáticos e não aromáticos
com Beauveria bassiana ATCC 7159 é fortemente dependente da existência de um
substrato com centro rico em elétrons (amida, sulfonamida, carbamato e outros) que
atua como um grupo de ancoragem para o sítio ativo da enzima. Em vista disso, a
incubação do lesopitron, um ansiolítico não benzodiazepínico, com Beauveria bassiana
ATCC 7159 segundo trabalho de Gotor e Liz (1997)., propiciou a formação de um
produto hidroxilado na posição 5 da pirimidina (apresentando-se como provável
metabólito humano) e um derivado metil glicosilado na mesma posição (Figura 14).
23
NMe
Me
NMe
Me
O
NMe
Me
NMe
Me
HO OHCBP-10,11-Oxido
CBP-Diol
CBP
NNMe
MeO-
+
CBP-NO
NMeN
H
Me
Nor-CBP
NMeN
H
Me
OH
Nor-2-OH-CBP
NMe
MeN
Me
Me
O
CBP-2,3-Oxido
NMe
MeN
Me
Me
OH
NMe
MeN
Me
Me
OH
Figura 13. Rota metabólica proposta por Zhang Donglu et al. (1996) para ciclobenzaprina (CBP) usando Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de incubação 72 horas.
24
N
N N
NN
N
Cl
N
N N
NN
N
Cl
N
N N
NN
N
Cl
O
OHO
OMeOH
OH
Lesopitron
5
HO
Figura 14. Estruturas químicas dos derivados hidroxilados e glicosilados do lesopitron formados pela incubação com Beauveria bassiana ATCC 7159 (GOTOR, LIZ, 1997).
Cunninghamella elegans demonstrou capacidade em metabolizar uma grande
variedade de xenobióticos de maneira regio e estereosseletiva similar ao sistema
enzimático dos mamíferos (MOODY et al., 1999, 2000). O antidepressivo tricíclico
doxepina, após metabolização in vivo (humanos), forma os seguintes metabólitos
urinários: (E)-2-hidroxidoxepina, (E)-2-hidroxi-N-desmetildoxepina, (Z) e (E)-N-
desmetildoxepina, (Z) e (E)-doxepina-N-óxido, (E)-2-O-glucuronildoxepina e um amônio
quaternário ligado a um glicuronídeo. Os principais metabólitos obtidos pela incubação
da doxepina com Cunninghamella elegans e que correspondem aos metabólitos
encontrados em humanos foram a (E)-2-hidroxidoxepina, (E)-2-hidroxi-N-
desmetildoxepina, (Z) e (E)-N-desmetildoxepina, (Z) e (E)-doxepina-N-óxido,
demonstrando a alta eficiência desta cepa na produção de metabólitos de
antidepressivos tricíclicos e substâncias correlacionadas (Figura 15) (MOODY et al.,
1999).
25
Além da capacidade de promover a hidroxilação da ciclobenzaprina e doxepina,
Cunninghamella elegans também mostrou-se eficiente em biotransformar o
antidepressivo tricíclico mirtazapina. Os metabólitos humanos Fase I e II descritos para
este fármaco foram: mirtazapina N-óxido, 8-hidroximirtazapina, N-desmetilmirtazapina,
mirtazapina N-glucuronídeo, mirtazapina N-sulfato, 8-hidroximirtazapina glucuronídeo,
8-hidroxi-N-desmetilmirtazapina, 8-hidroxi-N-desmetilmirtazapina glucuronídeo, 8-
hidroximirtazapina sulfato e 8-hidroxi-N-desmetilmirtazapina sulfato. 13-
hidroximirtazapina foi encontrada em estudos de metabolismo realizados em ratos. Pela
incubação da mirtazapina com Cunninghamella elegans sete metabólitos foram
encontrados, sendo: 8-hidroximirtazapina, N-desmetil-8-hidroximirtazapina, N-
desmetilmirtazapina, 13-hidroximirtazapina, mirtazapina N-óxido, 12-hidroximirtazapina
e N-desmetil-13-hidroximirtazapina. Como descrito por Moody et al. (2000),
Cunninghamella elegans metabolizou a mirtazapina pelas mesmas rotas reportadas em
humanos e animais (sendo: 8-hidroxilação, N-oxidação, demetilação e 13-hidroxilação)
demonstrando apresentar habilidade de mimetizar o metabolismo de mamíferos, assim
como de gerar novos produtos e produzir quantidades úteis para propor o metabolismo
humano e síntese química (Figura 16).
26
O
NH3C CH3
O
NH3C CH3
O
NH3C CH3
O
NH3C CH3
O
O
O
O
NH3C CH3
O
NH3C CH3
O
NH3C CH3
R1
R2
OHHO
O
NH3C CH3O
O
NH3C C OH
O
NHCH3
O
NCCH3H3C
OO
NH CCH3
O
O
NHCH3
R1
R2
O
NHCH3
OHO
NHCH3
HO
Doxepina
Doxepina N-óxido
N-formil-N-desmetildoxepina
N-acetil-N-desmetildoxepina
N-acetil didesmetildoxepina
R1=OH: 3-hidroxidoxepinaR2=OH: 2-hidroxidoxepina
N-desmetildoxepina
8-hidroxidoxepina
R1=OH: 3-hidroxi-N-desmetildoxepinaR2=OH: 2-hidroxi-N-desmetildoxepina
4-hidroxi-N-desmetildoxepina
8-hidroxi-N-desmetil-doxepina
Figura 15. Rota metabólica proposta por Moody et al. (1999) para doxepina usando Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de incubação 48 horas.
27
NN
NCH3
mirtazapina
NN
NCH3
mirtazapina-N-óxido
O
NN
NCH3
12-hidroximirtazapina OH
NN
NCH3
13-hidroximirtazapina
OH
NN
NH
N-desmetilmirtazapina
NN
NCH3
HO
8-hidroximirtazapina
NN
NH
N-desmetil-13-hidroximirtazapina
OH
NN
NH
N-desmetil-8-hidroximirtazapina
HO
Figura 16. Rota metabólica proposta por Moody et al. (2000) para mirtazapina usando Cunninghamella elegans, caldo Sabouraud e tempo de incubação 72 horas.
A preparação de metabólitos hidroxilados humanos através do uso de
microrganismos, mostrou-se satisfatória no estudo do metabolismo do anti-hipertensivo
irbesartan com diferentes cepas de fungos filamentosos e bactérias. Em humanos e
28
animais, o metabolismo deste fármaco leva a formação de pelo menos oito metabólitos
urinários: conjugado tetrazol N-β-glicuronídeo; metabólito monohidroxilado na posição
ω-1 da cadeia lateral n-butila e seu derivado correspondente ceto oxidado; o ácido
carboxílico resultante da oxidação do grupo metil terminal da cadeia lateral; dois
diferentes metabólitos monohidroxilados resultantes da oxidação do anel
espirociclopentano; e dois metabólitos adicionais com oxidações em duas posições.
Incubação do ibersantan com cepas de Absidia, Beauveria, Mortierella, Mucor e
Streptomices propiciou a formação dos metabólitos hidroxilados A, C, e E, e dos
metabólitos dihidroxilados D e F representados na Figura 17, destacando o potencial
metabólico destes fungos em estudos do metabolismo humano (ALEXANDRE, MAURS,
AZERAD, 2004).
Rhazinilama é um componente natural com propriedades antimitóticas. Devido a
inativação in vivo deste composto, Décor et al. (2005) realizou estudos de
metabolização da rhazinilama para detectar os prováveis motivos desta inativação,
assim como sugestões para resolução deste inconveniente. Os metabólitos
encontrados tanto em microssomas de fígado humano quanto pela incubação com
Beauveria bassiana foram formados por oxidação das posições 3 e 5 da rhazinilama
(Figura 18). Os dois derivados hidroxilados mostraram em estudos realizados pelo
mesmo trabalho, serem muito menos ativos que seu composto de origem e inativos in
vitro, de modo que a inativação da rhazinilama no organismo pode ser devido a sua
rápida metabolizaçao com formação de metabólitos inativos (DÉCOR et al., 2005).
29
NN
N NH
N
N
OH3C
NN
N NH
N
N
OH3C
OH
NN
N NH
HN
HN
O
OH
H3C O
NN
N NH
HN
HN
O
H3C O
Irbesartan
A
C e E
D e F
Figura 17. Estruturas químicas dos produtos hidroxilados e diidroxilados formados a partir da incubação do irbesartan com diferentes cepas no período de 7 dias (ALEXANDRE et al. 2004).
30
NHN
O
Rhazinilama
NHN
O
(3S)-hidroxirhazinilama
N NO
HO
OH
3
5
Diazaspiroleuconolam
Figura 18. Estruturas químicas dos metabólitos humanos e fúngicos do Rhazilinama (DÉCOR et al., 2005).
1.2.1.2. REDUÇÃO
As principais reações de redução nos átomos de carbono estão relacionadas à
redução de aldeídos a álcoois primários, redução de cetonas a álcoois secundários e à
redução de duplas ligações. N-óxidos, compostos nitro aromáticos, hidroxilaminas e
hidrazinas, por sua vez, podem com freqüência ser reduzidas a aminas (WERMUTH,
1996).
A biotransformação estereosseletiva da varfarina (anticoagulante oral) foi
estudado por Wong e Davis (1989) com Cunninghamella elegans ATCC 36112 como
um modelo do metabolismo animal. Em adição ao metabolismo oxidativo mediado pelo
citocromo P-450 em humanos, a varfarina também é reduzida na cetona da cadeia
lateral formando produtos alcoólicos (9R-varfarina-11R-álcool, 9S-varfarina-11S-álcool,
9R-varfarina-11S-álcool e 9S-varfarina-11R-ácool). Todos os metabólitos encontrados
em humanos, também foram formados pela incubação da varfarina com
31
Cunninghamella elegans ATCC 36112, demonstrando que a biotransformação por este
fungo filamentoso é altamente seletiva como a observada em humanos (Figura 19)
(WONG, DAVIS, 1989).
O
CH3OH
O
OO
CH3OH
OH
H OH
O
CH3OH
OH
H OH
O
CH3OH
OH
H OH
O
CH3OH
OH
H OH
Varfarina
9R-varfarina-11R-álcool
9R-varfarina-11S-álcool
9S-varfarina-11S-álcool 9S-varfarina-11R-álcool
Figura 19. Estruturas químicas da varfarina e dos produtos alcoólicos formadas pela redução da cetona da cadeia lateral deste anticoagulante (WONG, DAVIS, 1989).
1.2.1.3. HIDRÓLISE
As amidas e os ésteres são hidrolizados em humanos por amidases e
estearases presentes no sangue, fígado, rins e outros tecidos. Ésteres e certas amidas
são hidrolizadas rapidamente por um grupo de enzimas chamadas carboxiesterases.
(LACROIX, 1997; WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
A transformação microbiana de 7,4’-diacetoxidaidzeina, uma isoflavona, foi
estudada por Miyazawa et al. em 2004 com Aspergillus niger, embora não haja relatos
do metabolismo humano deste flavonóide. Segundo trabalho produzido por estes
32
autores, 7,4’-diacetoxidaidzeina foi eficientemente hidrolizada nos carbonos 7 e 4’
levando a produção do composto daidzeina (Figura 20) (MIYAZAWA et al., 2004).
OAcO
OAcO
Aspergillus niger
7,4'-diacetoxidaidzeina
OHO
OHO
7
4'
7
4'daidzeina
Figura 20. Hidrólise de 7,4’-diacetoxidaidzeina em daidzeina por Aspergillus niger (MIYAZAWA et al., 2004).
1.2.2. REAÇÕES METABÓLICAS DE FASE II
1.2.2.1. METILAÇÃO
As reações de metilação resultam principalmente na formação de produtos O, N
e S metilados, diferindo dos outros processos de conjugação já que os derivados O-
metil formados podem em alguns casos apresentar lipofilicidade e atividade
farmacológica tão grande ou maior que o substrato de origem. A transferência do grupo
metil ocorre a partir do intermediário de metionina, a S-adenosilmetionina (SAM), pela
ação de metil transferases (exemplos de compostos metil glicosilados - Figuras 14, 26)
(WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
1.2.2.2. ACETILAÇÃO
Acetilação é principalmente uma reação de grupos amino envolvendo a
transferência de acetil CoA para aminas alifáticas primárias e aromáticas, aminoácidos,
hidrazinas ou grupos sulfonamidas (WILLIANS, LEMKE, FOYE, 2002).
33
A metabolização da tranilcipromina, um inibidor da monoamino oxidase usado no
tratamento da depressão, ocorre em mamíferos por N-acetilação e hidroxilação do anel.
Transformação microbiana com Cunninghamella echinulata demonstrou ser um modelo
microbiano satisfatório em estudos de Foster et al. (1991), onde os compostos
formados similares aos humanos foram os produtos acetilados, N-acetiltranilcipromina e
N,O-diacetiltranilcipromina (Figura 21).
H CH
CH
CH2
NH H
TranilciprominaH C
HCH
CH2
NH COCH3
Acetiltranilcipromina
H3CCOO CH
CH
CH2
NH COCH3
N,O-diacetiltranilcipromina
Figura 21. Estruturas químicas dos produtos acetilados, formados pela incubação da tranilcipromina com Cunninghamella echinulata (FOSTER et al., 1991).
A difenidramina é um anti-histamínico tipo etanolamina amplamente usado para
o tratamento de alergias e náuseas, metabolizado em humanos por N-demetilação, N-
glucuronidação e acetilaçãome . Estudos realizados por Moody et al. (2000), usando
difenidramina como substrato, Cunninghamella elegans e incubação em caldo
Sabouraud por 48 horas propiciou a identificação de quatro metabólitos (difenidramina
N-óxido, N-desmetil difenidramina, N-acetildidesmetil-difenidramina e N-acetil-N-
desmetil-difenidramina), alguns dos quais já propostos por estudos in vivo e in vitro em
humanos e microssomas de fígados humanos (Figura 22).
34
Difenidramina
CHOH2CH2CNH3CC
N-acetildidesmetil-difenidramina N-acetil-N-desmetil-difenidramina
OCH3
CHOH2CH2CNHC OCH3
CHOH2CH2CNH3C
CH3
Figura 22. Produtos formados pela acetilação da difenidramina por Cunninghamella elegans (MOODY et al., 2000).
1.2.2.3. SULFATAÇÃO
A sulfatação é uma reação importante na biotransformação de hormônios
esteróides, catecolaminas neurotransmissoras, tiroxina, ácidos biliares, compostos
fenólicos e outros xenobióticos. As sulfotransferases citosólicas estão geralmente
associadas com a conjugação de esteróides fenólicos, neurotransmissores e
xenobióticos. As sulfotransferases ligadas a membrana estão localizadas no complexo
de Golgi de muitas células e são responsáveis pela sulfatação de glicosaminoglicanas,
glicoproteínas e grupo tirosinil de peptídeos e proteínas (WILLIANS, LEMKE, FOYE,
2002).
Devido às ações citotóxicas, carcinogênicas e mutagênicas dos hidrocarbonetos
aromáticos em animais de laboratório, tem-se dedicado bastante interesse no estudo do
metabolismo destes componentes. Os fungos metabolizam hidrocarbonetos aromáticos
35
pelo CYP450 e sistemas enzimáticos epóxido hidrolases através de uma seqüência de
reações similares às descritas em mamíferos, tornando-se um modelo alternativo para
estudo do metabolismo destes compostos. Trabalhos realizados por Cerniglia, Freeman
e Mitchum (1982) com fungos, demonstraram ser a sulfatação e glucuronidação as
principais rotas metabólitas destes hidrocarbonetos aromáticos hidroxilados. Uma
grande variedade de fungos é conhecida por metabolizar hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (PAHs): Phanerochaete chrysosporium por peroxidases extracelulares,
Aspergillus niger via citocromo P-450, Crinipellis stipitaria e Cunninghamella elegans.
Para Cunninghamella elegans que metaboliza diversos PAHs via CYP450 em
diversos derivados menos mutagênicos que o composto original, o caminho metabólico
é usualmente direcionado a detoxificação em comparação aos caminhos de bioativação
comumente encontrados em mamíferos. A biotransformação do benzopireno por
Cunninghamella elegans ATCC 36112, caldo Sabouraud e tempo de incubação 96
horas, levou a formação de derivados sulfatados, hidroxilados e glicosilados segundo
trabalho realizado em 1996 por Pothuluri et al. (Figura 23).
Flavonóides são produtos naturais de plantas, que são ingeridos em quantidades
apreciáveis na dieta humana normal. A conjugação destes componentes com sulfato
representa uns dos principais mecanismos de detoxificação fenólica em tecidos
animais, e embora a sulfatação com microrganismos seja extremamente rara,
Cunninghamella elegans mostrou-se eficaz em promover tal modificação, segundo
trabalho de Ibrahim (2000) (Figura 24) (IBRAHIM, 2000).
36
Benzopireno
10-hidroxi-3-benzopirenilsulfato
OSO3-
HO
3-benzopirenilsulfato
OSO3-
10
3
3
Derivado 10-hidroxi, 3 fenólico substituído
Derivado 3-hidroxifenólico substituído
Derivado 3-glicosilado
Derivado acetilado
Figura 23. Estruturas químicas dos derivados sulfatados formados pela incubação do benzopireno com Cunninghamella elegans ATCC 36112 (POTHULURI et al., 1996).
OHO3SO
OH O
OH
OHO
OH O
OHNaringenina Derivado sulfatado
Figura 24. Biotransformação do flavonóide naringenina por Cunninghamella elegans (IBRAHIM, 2000).
37
1.2.2.4. GLICOSILAÇÃO
As reações de glicosilação são efetuadas pela ação de glicosil transferases,
utilizando a UDP-glicose como fonte de açúcar.
Glicose-1-fosfatoUTP PPi
UDP-glicose
Aglicona
UDP
Glicosil transferase
Aglicona glicosilada
Mucor hiemalis, Mucor janssenii NRRL 3628 e Actinomucor elegans MMP 2092,
em estudo realizado por Moussa et al. (1997), demonstraram sua capacidade em
metabolizar a desacetiltimoxamina com formação de produtos glicosilados.
Desacetiltimoxamina é o fármaco ativo, formado a partir do pró-farmaco timoxamina que
é um agente bloqueador α-adrenérgico, onde a formação do composto glicosilado pelas
cepas citadas acima pode mostrar a versatilidade enzimática dos caminhos metabólitos
de detoxificação encontrados nos microrganismos (Figura 25).
AcO
O NCH3
CH3
HO
O NCH3
CH3
O
O NCH3
CH3
OHOH2CHO
HO OH
DerivadoglicosiladoTimoxamina
Desacetiltimoxamina
Figura 25. Transformação da desacetiltimoxamina por Mucor hiemalis, Mucor janssenii NRRL 3628 e Actinomucor elegans MMP 2092 com formação de derivado glicosilado (MOUSSA et al., 1997).
38
O alcalóide antifúngico sampangina quando biotransformado por Beauveria
bassiana ATCC 7159, Cunninghamella elegans ATCC 9245 e Rhizopus arrhizus ATCC
11145 produz dois compostos glicosilados. A concentração inibitória mínima do
composto metil glicosilado (formado pela incubação com Beauveria bassiana ATCC
7159 é 0,2µg/mL similar à da sampangina contra Cryptococcus neoformans,
diferentemente do metabólito glicosilado formado pela incubação com Cunninghamella
elegans ATCC 9245 e Rhizopus arrhizus ATCC 11145 que se mostrou inativo contra
criptococcosis em ensaios com ratos (Figura 26) (ORABI et al., 1999).
NN
H
O
NN
O
H
OOH
H3COHO OH
NN
O
H
OOH
HOHO OH
Beauveria bassiana ATCC 7159
Cunninghamella echinulata ATCC 9245
Rhizopus arrhizus ATCC 11145
Sampangina
Figura 26. Estruturas químicas dos produtos formados pela incubação da sampangina com Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella elegans ATCC 9245 e Rhizopus arrhizus ATCC 11145 (ORABI et al., 1999).
1.2.2.5. GLICURONIDAÇÃO
Na glicuronidação, uma molécula de ácido glicurônico é transferido para o
substrato a partir da uridina-5’-difosfato-α-D-ácido glicurônico (UDPGA), um cofator que
é sintetizado da glicose 1-fosfato via uridina trifosfato. Estas reações são catalizadas
pelas glicuroniltransferases (UDPGT), enzimas que consistem em um número de
39
produtos da superfamília de genes UGT (Figura 27) (WERMUTH, 1996; WILLIANS ,
LEMKE, FOYE, 2002).
ON
NH
O
O
HO OH
OPOO
O-PO
O-
O
OHO
HOHO HO
UDPG-desidrogenase
2 NAD+ 2 NADHUDPG+ PO4H-
ON
NH
O
O
HO OH
OPOO
O-PO
O-
O
OCHO
HOHO HO
O alfa
HO
R
UDP
UDP-glicuronil-transferase
O
R
OCHO
HOHO HO
O beta
UTP+
OHO
HOHO HO
PO3H
fosforilase
Figura 27. Síntese da uridina-5’-difosfato-α-D-ácido glicurônico (UDPGA) e glicuronidação de um fenol catalizada por uma glicuroniltransferase (WERMUTH, 1996). A formação de glicuronídeos ocorre em uma grande variedade de substratos
(alquilaminas, arilaminas, hidroxilaminas, carbamatos, uréias, tiouréias e sulfonamidas)
e com diferentes grupamentos químicos funcionais (átomos de O, S, N e C).
Glicuronidação de alquilaminas e arilaminas podem ocorrer em aminas primárias,
secundárias e terciárias, levando a formação de N-glicuronídeos (Hawes, 1998).
40
1.2.3. OUTROS MODELOS PARA O ESTUDO DO METABOLISMO
1.2.3.1. CULTURA DE CÉLULAS
Devido as diferenças no sistema enzimático citocromo P-450 entre as espécies,
faz-se necessário a busca por modelos hepáticos in vitro que representem
fidedignamente o metabolismo humano de xenobióticos. Diante disto, hepatócitos
humanos e de animais, em suspensão ou culturas de células em monocamada, tem
sido utilizado para predizer rotas metabólicas in vivo de novos candidatos a fármacos
(O´BRIEN, CHAN, SILBER, 2004; LECLUYSE, 2001; GAD, 2002). Culturas de
hepatócitos em monocamada apresentam vantagens em relação as mesmas células
em suspensão já que consistem de células viáveis e podem ser mantidas por longo
período de tempo (GAD, 2002) .
Há relatos de que a atividade das enzimas Fase I e II diminuem
significantemente com o decorrer do tempo de incubação e que estas culturas não são
afetadas por algumas das variáveis que influenciam estudos in vivo como a absorção e
distribuição. Além disso, estas células apresentam potencial para gerar e examinar a
toxicidade de metabólitos Fase I e II às células do fígado e outros órgãos alvos, e
mostram-se como um mecanismo para examinar o potencial de diferentes espécies no
metabolismo de candidatos a fármacos para estudos in vivo (GAD, 2002).
A escolha da espécie animal apropriada para estudos do metabolismo in vivo
pode se basear em dados obtidos a partir de culturas de hepatócitos primários das
diversas espécies. O isolamento destas células dos fígados de pequenos animais como
camundongos, hamsters, porcos da Índia e ratos é geralmente realizado in situ. Para
animais maiores como coelhos, cachorros e macacos e em tecidos humanos, ao
contrário, o isolamento ocorre por perfusão de amostras do fígado (Gad, 2002).
41
1.2.3.2. USO DE COMPUTADORES
Há muitos fatores que são importantes na predição do destino metabólico
de fármacos, como a medida da capacidade do fármaco de alcançar o sistema
enzimático responsável por sua biotransformação. O entendimento das interações
enzima-substrato são de extrema importância para o conhecimento da
biotransformação de xenobióticos, contudo, fatores como a indução e inibição
enzimática e mecanismos de interação entre fármacos também devem ser
considerados. Modelos de homologia dos citocromos de mamíferos tem sido
construídos incorporando as estruturas de citocromos de procariotos, e tem auxiliado na
expansão de conhecimentos a cerca de estudos de relação estrutura atividade
quantitativa (QSAR) clássica, na pesquisa do metabolismo de xenobióticos pelos
conhecimentos adquiridos em experimentos de docking com o substrato. Técnicas
como análise de campo molecular comparativo (CoMFA) e modelização farmacofórica
do substrato são úteis na interpretação e entendimento dos sítios ativos das enzimas,
complementando os métodos tradicionais de screening in vitro (SOFFERS et al., 2001;
LANGOWSKI, 2002).
A vantagem das tecnologias in silico é que as propriedades das moléculas
podem ser medidas a partir do conhecimento de suas estruturas químicas em duas ou
três dimensões (SOFFERS et al., 2001; LANGOWSKI, 2002).
42
2. OBJETIVOS
A busca de novos compostos que tenham atividade farmacológica desejada,
melhoradas em relação a seus protótipos, atividade farmacológica diferente do
composto original ou aprimoramento das propriedades físico químicas facilitando
processos de absorção e distribuição dos fármacos, é uma prática bastante discutida e
de grande interesse em determinadas linhas de pesquisa.
Diante desta incessante tarefa e a partir do conhecimento da capacidade
catalítica dos microrganismos, o objetivo deste trabalho é aplicar a bioconversão com
fungos filamentosos para preparar uma série de derivados funcionalizados a
partir do novo protótipo de fármaco neuroativo LASSBio 581.
A utilização de fungos filamentosos para síntese regio e estereosseletiva de
fármacos, assim como para preparação de prováveis metabólitos humanos e, sobretudo
para produção de uma gama de produtos diferentes ilustrando a biodiversidade
enzimática destes microrganismos, é bem documentada na literatura desde tempos
antigos até a atualidade.
A escolha da bioconversão em relação à síntese química nestes estudos, além
de ser justificada pela capacidade catalítica específica e diversidade das reações,
também está fundamentada nas grandes quantidades formadas facilitando ensaios
posteriores da atividade farmacológica e da toxicidade, na rapidez e reprodutibilidade
do método e no fato de que as enzimas são catalisadores que não agridem o ambiente.
43
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Fatores que influenciam o processo de bioconversão
Os processos de bioconversão em escala analítica desde que conduzidos de
modo a garantir a sua reprodutibilidade, estão menos sujeitos à influência de vários
fatores, como a forma morfológica dos fungos e a natureza da viscosidade dos meios
líquidos. A lise das células (morte por rompimento devido a fatores intrínsecos ou
extrínsecos) pode ser ocasionada pela intensidade de agitação (estresse mecânico),
aeração, pH durante o processo, temperatura, tempo de incubação e déficit de
nutrientes.
Embora os resultados de um estudo detalhado dos parâmetros envolvidos no
processo de bioconversão não tenham sido apresentados por se tratar de um estudo
em escala analítica, estes parâmetros foram monitorados ao longo do tempo no
laboratório de forma a possibilitar a transposição das reações desenvolvidas para
escala preparativa (bioreator).
3.1.1 Composição dos meios de cultura
Para a seleção do meio de cultura que proporcionasse um melhor crescimento
das cepas durante as incubações, foram testados dois meios líquidos diferentes, Caldo
Sabouraud e PDSM (Potato Dextrose Sucrose Medium). A seleção dos meios de
cultura adequados a melhor adaptação das cepas foi baseada nas seguintes
características: menor custo; maior facilidade de preparo e conservação; menor
probabilidade de contaminação por culturas secundárias; facilidade de extração dos
44
produtos formados; cinética de formação dos derivados em períodos de tempos
compatíveis com a rotina laboratorial e com a possibilidade de transposição para escala
industrial; melhor expressão das enzimas bioconversoras; ausência de lise e
conseqüentemente de morte celular; conservação das características do substrato, não
causando degradação; capacidade de promover crescimento uniforme.
Os aspectos morfológicos observados durante o processo de escolha foram: a
formação de pellets ou massa amorfa, o tamanho dos pellets quando formados e a
presença de halo de crescimento na parede do Erlenmeyer. O meio líquido PDSM, por
ser um meio mais nutritivo que o caldo Sabouraud mostrou-se mais adequado aos
processos de bioconversão para as cepas selecionadas, conforme demonstrado nas
Tabelas 1 e 2 (MIRANDA, 2003; SIQUEIRA, 2004).
A utilização de caldo Sabouraud nos ensaios de screening e escala semi
preparativa foi observada em estudos desenvolvidos por Cerniglia, Freeman e Mitchum
em 1982, justificando sua escolha para seleção de um meio que proporcionasse melhor
crescimento dos fungos selecionados (CERNIGLIA, FREEMAN, MITCHUM, 1982). Na
biotransformação do agente imunomodulador HR325 (LACROIX, BITON, AZERAD,
1997) e do irbesartan (ALEXANDRE et al., 2004) foi observado a utilização de meios
líquidos enriquecidos contendo trigo, glicose, fosfato de potássio monobásico e
dibásico, sulfato de magnésio heptaidratado, cloreto de potássio, nitrito de sódio e
sulfato (FeSO4) heptaidratado. Diferentemente, nos ensaios com LASSBio 581 utilizou-
se como meio líquido enriquecido o PDSM que varia em composição em relação ao
anteriormente descrito, contendo peptona bacteriológica, dextrose, lecitina de soja,
fosfato de potássio monobásico, cloreto de sódio e extrato de levedura.
45
As cepas selecionadas para produção de derivados funcionalizados a partir do
substrato LASSBio 581 foram conservadas em ágar batata inclinado na temperatura
entre 2-4ºC. Este meio sólido mostrou-se eficaz para manutenção e sobrevivência dos
microrganismos através de repiques, com periodicidade de 3 meses, e formação de
esporos em quantidades suficientes para inoculação em meio líquido e crescimento
satisfatório.
3.1.2 Morfologia do crescimento em meio líquido
Sabendo que a morfologia dos microrganismos em meio líquido pode interferir no
desempenho dos processos biotecnológicos, a formação de pellets e/ou massa amorfa
e o percentual de crescimento geral foi observado para algumas das cepas testadas
nos diferentes meios selecionados.
Tabela 1. Caracterização morfológica macroscópica em meio líquido PDSM e Caldo Sabouraud por 72horas a 27ºC ± 2ºC a 200rpm. Tamanho dos pellets: Ausência (-), Grandes (0,5cm), Médios (0,3cm), Pequenos (0,1), Pequeníssimos (0,05cm); Produção de massa amorfa: Positivo (+), Negativo (-); Formação de halo: Ausência (-), Em toda parede (++); Em parte da parede (+).
Meio líquido PDSM Caldo Sabouraud
Microrganismos Tamanho
pellets
Massa
amorfa
Halo Tamanho
pellets
Massa
amorfa
Halo
Cunninghamella echinulata
ATCC 9244 - + ++ - + +
Cunninghamella elegans
ATCC 36112 - + - ++++ - -
Mortierella isabelina
NRRL 1757 + - ++ + - ++
Mucor griosyanus
ATCC 1207a - + - - + -
Rhizopus arrhizus
ATCC 11145 - + ++ - + +
46
Tabela 2. Percentual de crescimento fúngico em meio líquido PDSM e Caldo Sabouraud.
Microrganismos
Meio líquido
PDSM (%)
Caldo
Sabouraud (%)
Cunninghamella echinulata ATCC 9245 95 85 Cunninghamella echinulata ATCC 9244 90 85 Cunninghamella elegans ATCC 36112 45 15
Mortierella isabelina NRRL 1757 45 55 Mucor griosyanus ATCC 1207a 85 75 Rhizopus arrhizus ATCC 11145 95 40
Podemos observar, que em meio líquido PDSM a maioria das cepas testadas
apresentou formação de massa amorfa com halo em toda parede do recipiente. Além
disso, o percentual de crescimento em meio líquido PDSM mostrou-se superior ao caldo
Sabouraud na grande maioria dos fungos filamentosos. Mortierella isabelina NRRL
1757 ao contrário das demais cepas, não formou massa amorfa, apresentou formação
de pellets pequeníssimos e percentual de crescimento pouco inferior ao caldo
Sabouraud. O aspecto morfológico para os diferentes microrganismos em caldo
Sabouraud mostrou-se bastante variado e diversificado, observando-se desde a
formação de pellets pequeníssimos a grandes, assim como a formação de massa
amorfa e ausência ou presença de halo de crescimento na parede do recipiente (em
parte ou em toda parede).
A forma morfológica dominante dos fungos é relevante devido a sua grande
influência nas propriedades físicas dos meios de incubação. Suspensões de micélios
dispersos (massa amorfa) são geralmente viscosas e comportam-se de maneira não
47
Newtoniana (i.e.: a proporção entre a lise por estresse e a taxa de lise não é constante).
Este comportamento não Newtoniano é causado por interações entre os filamentos em
suspensão, como entrelaçamento e ligações de hidrogênio aumentando a estrutura do
micélio e conseqüentemente a viscosidade do meio. Pellets em suspensão são menos
viscosos que micélios, já que geralmente comportam-se como esferas discretas e
exercem pouca influência nas propriedades de fluxo (GIBBS, SEVIOUR, SCHMID,
2000).
Dependendo do objetivo das biotransformações, a formação de pellets ou massa
amorfa pode apresentar vantagens ou desvantagens para os processos de síntese
enzimática. Como mencionado por Gibbs, Seviour e Schmid (2000), a produção de
metabólitos por alguns fungos é reduzida com o crescimento na forma de pellets. Uma
possível razão para redução da produção de metabólitos, quando houver formação de
pellets, é o estabelecimento de um gradiente de nutrientes, pois enquanto o fluido de
fermentação está bem aerado e rico em nutrientes, as células do interior dos pellets
poderão estar estressadas devido à limitação de transporte nutricional. Esta deficiência
nutricional é especialmente detectada em pellets compactos, onde a difusão molecular
não ocorre livremente e seus centros são ocos devido à autólise hifal. Informações
sobre a morfologia dos pellets produzidos é importante para se ter uma estimativa dos
rendimentos. Maiores rendimentos são esperados com a formação de pellets
pequenos, já que oferecem uma menor barreira para difusão de O2 e outros nutrientes
em relação a pellets compactos (GIBBS, SEVIOUR, SCHMID, 2000).
A vantagem de se obter pellets é a de possuir uma maior superfície de contato
externa facilitando reações de hidroxilação. No caso da produção de massa amorfa,
48
melhor rendimento é encontrado em modificações de compostos por reação de redução
ou outras mais demoradas (SIQUEIRA, 2004).
O trabalho realizado por Freitag et al. demonstrou a importância da
composição do meio de cultura para biossíntese de metabólitos para-hidroxilados
(PHM) e hidroximetilados (HMM) do substrato RAC-mexiletina. Os meios testados por
estes autores foram: caldo extrato de levedura (extrato de levedura, cloreto de sódio,
sucrose, fosfato de potássio monobásico e fosfato de sódio dibásico); caldo ácido
casamino (ácido casamino, cloreto de sódio, fosfato de potássio monobásico e fosfato
de sódio dibásico); caldo peptona (peptona, cloreto de sódio, sucrose, fosfato de
potássio monobásico e fosfato de sódio dibásico); caldo de soja tripticase (hidrolisado
de caseína, hidrolisado de soja, cloreto de sódio, fosfato de potássio monobásico e
dextrose); caldo Sabouraud dextrose (neopeptona e dextrose); caldo extrato de malte
(extrato de malte, fosfato de potássio monobásico e fosfato de sódio dibásico); caldo
Czapek dox (sucrose, nitrato de sódio, fosfato de potássio dibásico, sulfato de
magnésio, cloreto de potássio e cloreto de ferro). Foi demonstrado por este estudo que
a composição do meio utilizado tinha um efeito dramático no metabolismo, de modo
que o caldo extrato de levedura foi o que mostrou a biossíntese máxima dos
metabólitos para-hidroxilados e hidroximetilados, com formação 21% maior para HMM e
25% maior para PHM quando comparado com caldo Czapek dox. Caldo de soja
tripticase, demonstrou produção estereosseletiva de PHM e HMM quando comparada à
tampão fosfato, demonstrando que o suporte nutricional é essencial para o aumento da
biossíntese de metabólitos (FREITAG et al., 1997).
49
Figura 28. Aspectos morfológicos dos fungos filamentosos Cunninghamella echinulata ATCC 9244 (superior) e Mortierella isabelina NRRL 1757 (inferior) em ágar batata e nos meios líquidos caldo Sabouraud e PDSM.
3.1.3 Intensidade de agitação e aeração
A agitação empregada nos ensaios de screening e escala semi-preparativa foi de
200 rpm.
Embora nem todos os microrganismos se comportem de uma mesma maneira,
estudos relatam que o aumento da intensidade de agitação pode ocasionar diminuição
do comprimento hifal e aumento da freqüência de ramificações. O aumento da
50
freqüência de ramificações poderia tornar o meio mais viscoso, assim como as
interações entre as hifas poderiam aumentar. Diferentemente, a redução no
comprimento hifal, como fato isolado, resultaria em diminuição da viscosidade aparente
(GIBBS, SEVIOUR, SCHMID, 2000).
Com relação à concentração de O2 dissolvida no meio reacional durante os
processos de bioconversão, pouca influência é observada na morfologia das hifas.
Contudo, alterações nas taxas de O2 podem influenciar drasticamente nos rendimentos
dos metabólitos produzidos. Com relação aos pellets, análises inovadoras com micro
eletrodos de oxigênio mostraram que a estratificação dos pellets grandes (camada
externa com crescimento hifal ativo, duas camadas de células progressivamente menos
ativas e um centro oco) foi causada pela queda na concentração de O2 abaixo dos
níveis críticos (GIBBS, SEVIOUR, SCHMID, 2000).
A produção de CO2 em grandes quantidades é comum em algumas
fermentações aeróbias como conseqüência da atividade respiratória das células
fúngicas, de modo que a presença de CO2 influencia na morfologia de diversos fungos
filamentosos aumentando a freqüência das ramificações. Estudos descritos por Gibbs,
Seviour e Schmid (2000), mostraram que CO2 dissolvido no meio reacional estimula a
síntese de quitina da parede da célula subapical, sendo este um fator associado ao
aumento das ramificações e a maleabilidade das paredes das células fúngicas. Foi
sugerido (embora sem nenhum suporte experimental), que o efeito morfológico da
presença de CO2 está associado com outros fatores tais como a limitação de nutrientes.
51
3.1.4 pH
Nos ensaios realizados em escala laboratorial ou semi-analítica, este parâmetro
permanece constante com eventualmente pequenas variações, mas sua observação
torna-se importante no momento de transpor para o bioreator, pois em maior volume a
quantidade de metabólitos fúngicos secundários pode diminuir ou aumentar o pH.
Diferentes valores de pH de crescimento podem ser observados durante a
incubação e estar relacionados ao transporte de nutrientes, a solubilização dos
nutrientes, às reações enzimáticas e/ou a fenômenos de superfície. A composição do
meio pode afetar o pH inicial e a velocidade de variação deste valor durante o
crescimento dos fungos. Meios fracamente tamponados contendo sais de amônio
provavelmente se tornarão mais ácidos durante o crescimento, enquanto meios
contendo nitratos se tornarão mais alcalinos. Altas concentrações de íons, tais como
fosfatos são requeridos para se alcançar pH estáveis, sobretudo quando se deseja
medir a atividade biológica como crescimento e atividade enzimática (PAPAGIANNI,
2004).
52
Tabela 3.1. Exemplos de diferentes valores de pH empregados na literatura em bioconversões
Substrato Microrganismo pH Meio de cultura
O
O
CH3H
H3C OO
H
O
CH3
H
Artemisinina
Cunninghamella
elegans
ATCC 9245
6,5
Sabouraud dextrose, sucrose, peptona, água
deionizada
(PARSHIKOV et al., 2004)
O CH2CH3
H
H
O
O
H
O
O
H
OHHH
OH Milbemicina A4
Cunninghamella
echinulata
ATCC 9244
6,3≈ 6,5
Glicose, polipetona, extrato de levedura,
extrato de malte
(NAKAGAWA, MIYAKOSHI, TORIKATA,
1991)
NO
O
Ebastina
Cunninghamella
blakesleeana
5,0
Peptona, soja, extrato de levedura, cloreto de
sódio, fosfato de potássio dibásico, glicose
(SCHWARTZ et al., 1996)
53
Tabela 3.2. Exemplos de diferentes valores de pH empregados na literatura em bioconversões
Substrato Microrganismo pH Meio de cultura
NMe
Ciproeptadina
Cunninghamella
elegans
ATCC 9245 e
ATCC 36112
5,6
Caldo Sabouraud dextrose
(ZHANG DONGLU et al., 1997)
OHO
OHO
Daidzeina
Aspergillus niger
7,2
Sacarose, glicose, polipetona, sulfato de
magnésio heptahidratado, cloreto de potássio,
fosfato de potássio dibásico, FeSO4
heptahidratado
(MAATOOQ, ROSAZZA, 2005)
O
OH
O
O
Varfarina
Cunninghamella
elegans
7,0
Dextrose, farinha de soja, cloreto de sódio,
fosfato de potássio dibásico, extrato de
levedura, água destilada
(WONG, DAVIS, 1989)
54
Estudos realizados por Freitag et al. (1997) com RAC-mexiletina (agente
antiarrítmico) demonstraram a importância do pH para biossíntese dos metabólitos
para-hidroxilados e hidroximetilados. A variação do pH em caldo extrato de levedura
demonstrou um aumento na biossíntese com o aumento do pH até 7,6, e decréscimo
na quantidade formada de 7,6 até 8,0 onde não se encontrava mais nenhum metabólito.
Embora houvesse variação na quantidade de derivado encontrado de acordo com a
mudança do pH, este trabalho nada constatou com relação a variação da preferência
de síntese pelo composto para-hidroxilado (FREITAG et al. 1997).
Embora a importância da influência do pH seja pouco discutida na literatura,
existem estudos que demonstrem ser este um parâmetro importante para o processo de
bioconversão, pois afeta a morfologia fúngica. Segundo Gibbs, Seviour, Schmid (2000),
trabalhos de Read e Seviour (1984) com Acremonium diospyri mostrou sensibilidade
desta cepa à mudanças de pH, variando sua morfologia de fragmentos esporulados
miceliais pequenos e grossos em pH 3,0 para grupos miceliais ramificados em pH 6,0.
Neste mesmo estudo, ainda observou-se modificação adicional na morfologia, para
filamentos não ramificados longos e finos em pH 9,0 (GIBBS, SEVIOUR, SCHMID,
2000). Mudanças na morfologia fúngica, também foram observada no trabalho de
Freitag et al. (1997) com RAC-mexiletina, onde o aumento do pH de 5,5 para 8,0
mudava a morfologia hifal de pellets pequenos, densos e individuais em pH 5,5 para
micélios difusos em pH 8,0.
55
3.1.5 Temperatura
As temperaturas empregadas durante a execução dos ensaios realizados
variaram de 27 a 30ºC.
Variações na temperatura de incubação podem provocar mudanças simultâneas
em variáveis como: taxa de crescimento, pH e oxigênio dissolvido. Um aumento na
temperatura de incubação dentro da faixa fisiológica aumenta a taxa de crescimento,
diferentemente da tensão do oxigênio dissolvido que varia de maneira inversa ao
aumento da temperatura. Segundo Braun et al. (1991) e Schügerl et al. (1998), estudos
realizados em incubadoras com velocidade de rotação constante revelaram variação no
volume celular e nas formas morfológicas fúngicas quando a temperatura foi variada
entre 25 e 35ºC. Células maiores foram obtidas em 25ºC, onde somente pellets foram
observados. Com variação da temperatura para 30ºC, os pellets inicialmente formados
foram decompostos com formação de massa amorfa (depois de 50 horas de incubação)
e em 35ºC observou-se principalmente massa amorfa com poucos pellets e agregados.
Estes autores sugerem que em altas temperaturas o suplemento de oxigênio às células
torna-se inadequado, com formação de massa amorfa em 30ºC e de agregados em
35ºC devido ao alto estresse (PAPAGIANNI, 2004).
3.1.6 Solventes
Para adição do substrato LASSBio 581 foi utilizado mistura de
etanol/dimetilformamida 1:1 ou somente dimetilformamida.
Etanol foi inicialmente o solvente de escolha na tentativa do solubilizar os
substrato LASSBio 581, tendo sua utilização já demonstrada em diversos trabalhos
56
como na biotransformação de flavonas (IBRAHIM et al., 1997) e do irbesartan
(ALEXANDRE et al., 2004). Como LASSBio 581 não foi totalmente solúvel em etanol
(temperatura ambiente), testes de solubilidade foram realizados. Dimetilformamida
mostrou-se solvente adequado para solubilização do substrato. A utilização de
dimetilformamida como solvente em biotransformação já havia sido descrita por Smith
et al. (1974) para solubilização de acetanilida, anilina, benzeno, clorobenzeno entre
outros; para solubilização do agente antiprotozoário CGP-291 por Jürgens e Clark
(1990); por Ibrahim (2000) para naringenina; e para solubilização de mirtazapina por
Moody et al. (2002). Ensaios em escala semi preparativa com Cunninghamella
echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757 foram realizados
solubilizando o LASSBio 581 em dimetilformamida, onde o substrato foi incorporado em
meio líquido PDSM e vários produtos foram formados. Mesmo diante da total
solubilização em dimetilformamida, optou-se em ensaios iniciais e em um último ensaio
em escala semi preparativa (meio líquido PDSM), solubilizar o LASSBio 581 em mistura
de dimetilformamida e etanol 1:1. Tanto com a solubilização em dimetilformamida ou na
mistura de dimetilfomamida/etanol 1:1 as cepas selecionadas mostraram-se eficazes na
biotransformação do substrato ensaiado com a formação de diversos produtos
funcionalizados.
57
3.2 Síntese do LASSBio 581
Para obtenção do substrato a ser ensaiado, foi realizado a síntese do composto
LASSBio 581. O método escolhido foi determinado segundo o trabalho desenvolvido
por Menegatti (2001).
Na primeira etapa da síntese, procederam-se reações de diazotação e
substituição nucleofílica aromática. A reação entre 4-cloro-anilina e nitrito de sódio em
meio ácido permitiu a formação do intermediário de síntese 4-cloro-azidobenzeno (óleo
castanho escuro) conforme esquematizado na Figura 29.
Figura 29. Rota síntética para formação do primeiro intermediário de síntese 4-cloro-azidobenzeno
N
O
ONa+-
+ H O H N
O
OH
+ NaOH N
O
OH
+ HCl NO O+
H
H
N+
O
+ H2O+
NH2
Cl
¨N+
Cl
N
H
H ON
Cl
N OHN
Cl
N
+H2O
N+
Cl
N
+ NaN3
N+
Cl
H
NN3 N3
Cl
+ N2
58
A formação do segundo intermediário sintético, 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-
triazol-4-ilmetil]-4-fenilexaidropiperazina (cristais amarelos) procedeu-se pela reação
inicial entre 4-cloro-anilina, álcool propargílico e tolueno com formação de mistura
isomérica de 1-benzil-4-fenilexaidropiperazina (óleo escuro), e reação secundária da
mistura obtida com dióxido de manganês e diclorometano (Figura 30).
Figura 30. Esquema de síntese da formação do intermediário 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilexaidropiperazina
O produto 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilexaidropiperazina foi
finalmente reagido com N-fenilpiperazina em metanol e Pd/C 10% para obtenção do
derivado 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilexaidropiperazina (Figura 31)
na forma de cristais brancos.
N
Cl
N+
N
+
CH2
HC
CH2
OH
CH3
Cl
NN
N CH2OH
MnO2
Cl
NN
N C
O
H
59
Figura 31. Etapa final da síntese do derivado N-fenilpiperazínico LASSBio 581
O substrato assim obtido foi submetido a metabolização por vários
microrganismos.
Cl
NN
N C
O
H
+ N
NH¨
Cl
NN
N N
O N-
+MeOH
Cl
NN
N N
O NH
Cl
NN
N N
O NHH +
Cl
NN
N N+
H N
Pd/C 10%
Cl
NN
N N
N
LASSBio 581
60
Na análise por espectrometria de massas do LASSBio 581, pode-se observar
pico em 354,3 referente a massa do substrato e pico em 320,4 (M – 35,5) indicando a
perda do átomo de Cl presente no anel a do substrato LASSBio 581 (Figura 32).
23-Jul-2003 11:32:45V 06 fr 09
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z0
100
%
AMOSTRA - 02 1 (1.035) Scan ES+ 3.62e8354.3
320.4
211.371.461.4
102.474.4321.4
356.3
357.3
Figura 32. Espectro de massa do substrato LASSBio 581 obtido num espectrômetro de massas Quattro LC-Micromass
3.3 Métodos cromatográficos
Os métodos de cromatografia em camada delgada, flash cromatografia e
cromatografia líquida de alta eficiência foram aplicados para acompanhamento das
reações de bioconversão, separação e purificação dos derivados formados. Seu
desenvolvimento e padronização auxiliaram a otimização destes métodos analíticos e
do processo de biotransformação.
61
3.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)
Para obtenção das melhores condições de separação e acompanhamento dos
processos de purificação, quatro fases móveis foram ensaiadas: acetato de etila;
acetato de etila/metanol 70:30; acetato de etila/metanol 90:10; e acetato de
etila/metanol 95:05.
Acetato de etila, como fase móvel, proporcionou boa separação dos diferentes
produtos formados, contudo aqueles com Rfs inferiores ao do LASSBio 581 quando
separados nestas condições apresentaram valores muito próximos da linha de base.
Esta fase móvel apresentava como vantagem em relação às outras, a boa separação
entre os compostos eluídos antes e após o substrato LASSBio 581. Para aumentar os
valores de Rfs dos derivados eluídos após LASSBio 581, adicionou-se metanol ao
acetato de etila em três diferentes proporções.
Apesar da fase móvel acetato de etila/metanol 70:30 promover um aumento nos
valores de Rfs dos compostos formados, não foi capaz de executar boa separação,
sendo necessário diminuição da quantidade de metanol para preparação de nova fase
móvel. Ao diminuir a quantidade de metanol de 30 para 10 (acetato de etila/metanol
90:10) observou-se boa separação e aumento nos valores de Rfs dos produtos eluídos
após LASSBio 581. Na tentativa de aprimorar o processo de separação, diminuição
adicional da quantidade de metanol de 10 para 5 foi realizada. A fase móvel acetato de
etila/metanol 95:05 por proporcionar melhor separação em relação ao acetato de
etila/metanol 90:10 e maiores valores de Rfs para os produtos localizados inferiormente
ao substrato LASSBio 581, em relação ao acetato de etila, foi a fase móvel de escolha.
62
3.3.2. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Inicialmente, para as análises de cromatografia líquida de alta eficiência, utilizou-
se como fase móvel metanol/tampão 65:35 em sistema isocrático, comprimento de
onda de 248nm, detector luz UV e coluna cromatográfica fase reversa segundo descrito
por Tasso et al., 2003. A fase estacionária utilizada foi uma coluna Lichrospher 100 RP
18, variando-se a fase móvel para que os produtos formados, mais polares que o
LASSBio 581, fossem eluídos mais rapidamente com menor tempo de retenção em
relação ao substrato ensaiado. Tempo de corrida de trinta minutos, mostrou-se
adequado para detecção e identificação dos derivados produzidos.
Embora a análise cromatográfica em fase reversa em sistema isocrático
(condições descritas acima) tenha se mostrado um bom método para identificação e
caracterização dos diferentes produtos formados, compostos iniciais com tempos de
retenção de até 3,0 minutos apresentaram dificuldades de separação, como observado
pela análise cuidadosa dos cromatogramas das alíquotas retiradas do meio reacional
em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas, ou ainda 120, 144, 168 e 190 horas). Na
busca de um método cromatográfico que proporcionasse boa separação dos derivados
com tempo de retenção até 3,0 minutos, assim como dos demais compostos e do
substrato LASSBio 581, seis novos métodos com manutenção da fase estacionária,
comprimento de onda e detector foram criados, variando as quantidades das fases
móveis metanol e metanol/tampão 65:35 durante o tempo de corrida (25 ou 35 minutos)
e o fluxo (mL/min).
Inicialmente testou-se metanol e metanol/tampão 65:35 em sistema gradiente,
máximo de metanol em 4 minutos com diminuição para zero em 6 minutos e
63
manutenção de metanol/tampão 65:35 100% de 6 minutos até final da corrida, com
fluxo de 0,8 mL/min até 10 minutos e 1 mL/min de 10 minutos em diante. Como esta
fase móvel não foi eficiente para separar os produtos iniciais (tempo de retenção até
3,0), alterou-se o fluxo a partir dos 10 minutos para 1,5 mL/min. A alteração do fluxo
para 1,5 mL/min ainda não foi uma modificação eficiente, sendo necessário modificação
adicional do método. Novo sistema foi construído, alterando o fluxo inicial de 0,8
mL/min para 0,5 mL/min até os três primeiros minutos da corrida e a partir daí
mantendo em 1,5 mL/min. Como a modificação do fluxo não foi um fator suficiente para
promover separação eficaz dos compostos iniciais (tempo de retenção até 3,0), novos
métodos foram criados alterando as quantidades das diferentes fases móveis durante o
tempo de corrida. As condições de corrida passaram então para máximo de metanol em
2 minutos com diminuição para zero em 4 minutos e manutenção de metanol/tampão
65:35 de 4 minutos até o final da corrida, e fluxo fixo de 1 mL/min. Com fluxo de
1mL/min detectou-se boa separação dos produtos iniciais (tempo de retenção até 3,0
minutos), contudo, ao final de 25 minutos não foram observados todos os compostos
formados devido à alta velocidade de eluição e pouco tempo de corrida. O tempo de
corrida foi então aumentado para 35 minutos. Para otimização destes dois últimos
métodos e diminuição do tempo de corrida, o fluxo foi alterado para 0,8 mL/min
resultando em diminuição do tempo de corrida para 25 minutos e boa separação de
todos os derivados formados. Este foi o método de escolha para análise das várias
amostras coletadas a partir da incubação do LASSBio 581 com dez diferentes cepas de
fungos filamentosos em ensaio de screening, ou das duas cepas selecionadas para
ensaio em escala semi preparativa, nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas ou ainda em
120, 144, 168 e 190 horas.
64
3.4 Estudo do metabolismo microbiano do novo derivado
heterocíclico N-fenilpiperazínico LASSBio 581
3.4.1 Bioconversão do LASSBio 581
Uma triagem com uma dezena de microrganismos (fungos filamentosos),
aplicando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para detectar e quantificar a
formação de derivados, foi realizada. Cerca de trinta diferentes produtos foram
formados, segundo a cepa utilizada, de modo que uma das atividades metabólicas
encontradas para a maioria das cepas levou a formação de produtos hidroxilados e
glicosilados.
Os diversos compostos formados pelas diferentes cepas foram nomeados e
estão representados na Tabela 5.
Dentre as cepas testadas, Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella
isabelina NRRL 1757 foram selecionadas para ensaio em escala semi-preparava,
visando obtenção de maior quantidade de alguns dos derivados formados.
65
Tabela 4. Bioconversão do LASSBio 581 por várias cepas de fungos filamentosos (triagem), tempo de 24-96horas
Derivados
Microrganismos I II III
IV
V VI
VII
VIII IX
X XA
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
XXI
XXII
XXIII
XXIV
XXV
XXVI
XXVI
XXVI
XXIX
XXX
Absídia blakeslceana
ATCC 10148b
- + - ++++
- - ++
+ + - - - + + + - - ++
- - - - - - - - - - - - -
Absídia blakeslceana
ATCC 22617
- - - ++++
- - - - + - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - +
Aspergillus ochraceus
ATCC 1009
- + + ++++
- - - - - + - - + - + + + + + + - - - - - - - - - - -
Beauveria bassiana
ATCC 7159
- - - +++
+ ++
- - - ++
- - - - ++
+ - + - - - - - - - - - - - - -
Cunninghamella echinulata
ATCC 9245
+ - - +++
- - + - - + ++
- + - - + - - - - - - + - - + - - - - -
Cunninghamella echinulata
ATCC 9244
- + - +++
- ++
- - - - - - - - - - + + - - - - + + - - - ++
+ - -
Cunninghamella elegans
ATCC 36112
- + - +++
- ++
- + - - - + - - + - - - + + + - + + - - - - - - -
Mortierella isabelina
NRRL 1757
- - - +++
- - - - - + - - + + - + ++
- - - - - +++
++
++
- - ++
++
++
-
Mucor griosyanus
ATCC 1207a
- + - ++++
- + - - - - - - - + + + - + - + + - - - - - - - - - +
Rhizopus arrhizus
ATCC 11145
+ - - +++
- - - + + - - - - - - - - + - - ++
++
++
- - + + - - - -
Bioconversão do LASSBio 581 por dez cepas de fungos filamentosos (screening), 24-96 horas, análise HPLC: Lichrospher 100- RP-18 e detecção 248nm, Metanol/Tampão 65:35). – ausência; + até 15%; ++ 15 a 30%; +++ 30 a 45%; ++++ > 50%
66
Cunninghamella echinulata ATCC 9244 foi selecionada devido a sua capacidade
já descrita na literatura de promover hidroxilação e por produzir quase que
exclusivamente o metabólito XXVII (nos ensaios prévios de screening) comparado aos
demais produtos, em determinado tempo reacional (exceção do metabólito IV que está
presente na grande maioria das cepas e em grande quantidade, e do metabólito VI que
tem tempo de retenção 2,17 minutos).
Mesmo não observando descrição na literatura da capacidade do fungo
filamentoso Mortierella isabelina NRRL 1757 de formar derivados glicosilados, este
microrganismo foi escolhido devido a grande variedade de produtos formados em
relação às demais cepas nas condições de análise determinadas.
3.4.2 Monitoramento da bioconversão do LASSBio 581
No processo de triagem para seleção dos microrganismos capazes de produzir
maiores quantidades de determinados derivados e para determinação do tempo final de
incubação para cada uma das cepas, foram retiradas alíquotas do meio reacional a
cada 24 horas após adição do substrato LASSBio 581. A diminuição de LASSBio 581 e
o aumento da quantidade dos diferentes produtos gerados foi acompanhada por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa (solventes metanol e
metanol/tampão 95:05 em sistema isocrático ou gradiente, 248 nm, segundo descrito
em 5.1.1.). Os gráficos das cinéticas de biotransformação determinados por CLAE
foram construídos considerando a quantidade inicial (quantidade de LASSBio
581adicionada ao meio de cultura inoculado com esporos das cepas características) do
substrato como ponto de partida (tempo 0). Assim, os derivados, pelas análises de suas
67
diferentes percentagens de área do pico foram quantificados. Embora as cinéticas de
biotransformação sejam semi-quantitativas (dependentes do valor teórico inicial de
50mg/mL do LASSBio 581), mostraram-se eficazes para o acompanhamento das
reações de bioconversão, assim como para determinação do tempo final de incubação
e do número de derivados formados.
O derivado IV, formado por todas as cepas (tempo de retenção de
aproximadamente 2,15) apresenta-se sempre em maior quantidade (quantidade
aproximada) aos demais por estar em sobreposição ao pico de determinado
componente do meio de cultura, apresentando dificuldade de separação e purificação.
3.4.2.1 Absídia blakeslceana ATCC 10148b
Nove produtos foram formados pela incubação do LASSBio 581 com Absídia
blakeslceana ATCC 10148b (meio líquido PDSM, agitação de 200 rpm, temperatura
de 27ºC). Nas primeiras 24 horas após a adição do substrato, observou-se total
consumo de LASSBio 581 com predominância do derivado IV em 24, 48 e 72 horas.
Em 96 horas, o produto formado em maior quantidade foi o composto VII,
demonstrando ser o de maior interesse, já que das dez cepas ensaiadas a Absídia
blakeslceana ATCC 10148b é a principal envolvida na produção deste derivado. No
tempo de 72 horas destaca-se ainda o aparecimento do composto XVII, produzido em
maior quantidade por este fungo filamentoso em relação aos demais produtores (Tabela
8).
68
Cromatograma
0
50
100
0
5
10
mV
olts
0 10Minutos
*II
IV
DM
F
XIII
X
IV
XVI
I
Esc
ala
grad
ient
e
Figura 33. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 10148b no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Absídia blakeslceana ATCC 10148b
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
0
0,5
1
1,5
2
2,5
LASSBio581Der. II
Der. IV
Der. VII
Der. VIII
Der. IX
Der. XII
Der. XIII
Der. XIV
Der. XVII
Figura 34. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Absídia blakeslceana ATCC 10148b correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados II, VII, VIII, IX, XII, XIII, XIV e XVII) com o tempo de incubação em horas.
69
3.4.2.2 Absídia blakeslceana ATCC 22617
Foram detectados cinco produtos pela biotransformação do LASSBio 581 com
Absídia blakeslceana ATCC 22617 (meio líquido PDSM, agitação de 200rpm,
temperatura de 27ºC). O derivado formado em maior quantidade foi o IV, e o substrato
foi totalmente consumido no tempo de 72 horas. O composto XXX que apresenta tempo
de retenção superior ao do substrato ensaiado foi formado exclusivamente em 48
horas.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mVo
lts
0 10Minutos
IV
DM
F X
V
LA
SSB
io 5
81
Esc
ala
grad
ient
e
Figura 35. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 22617 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
70
Absídia blakeslceana ATCC 22617
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
00,10,20,30,40,50,6
LASSBio 581Der. IVDer. IXDer. XIIIDer. XVDer. XXX
Figura 36. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Absídia blakeslceana ATCC 22617 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados IX, XIII, XV e XXX) com o tempo de incubação em horas.
3.4.2.3 Aspergillus ochraceus ATCC 1009
A incubação do LASSBio 581 com Aspergillus ochraceus ATCC 1009, levou a
obtenção de onze derivados (meio líquido PDSM, agitação de 200rpm, temperatura de
27ºC). O substrato foi totalmente consumido nas primeiras 24 horas de reação, e o
composto formado em maior quantidade foi o IV. O produto III formado no tempo de 48
horas foi o de maior interesse, já que é produzido exclusivamente por esta cepa.
71
Cromatograma
0
50
100
0
5
mVo
lts
0 10Minutos
*II
IV
DM
F X
II X
IV
XVI
I
Esc
ala
grad
ient
e
Figura 37. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Aspergillus ochraceus ATCC 1009 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Aspergillus ochraceus ATCC1009
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1LASSBio 581Der. IIDer. IIIDer. IVDer. XDer. XIIDer. XIVDer. XVDer. XVIDer. XVIIDer. XVIIIDer. XIX
Figura 38. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Aspergillus ochraceus ATCC 1009 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados II, III, X, XII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII e XIX) com o tempo de incubação em horas.
72
3.4.2.4 Beauveria bassiana ATCC 7159
O fungo filamentoso Beauveria bassiana ATCC 7159 em incubação com
LASSBio 581 determinou a formação de sete derivados (meio líquido PDSM, agitação
de 200rpm, temperatura de 27ºC). O composto IV, ao contrário das demais cepas
estudadas, só apresentou quantidade significativamente maior no tempo de 96 horas,
tendo nos tempos anteriores formação praticamente constante. O produto V formado
nos tempos de 48 e 72 horas, foi produzido exclusivamente por este microrganismo,
sendo o de principal interesse para estudo deste fungo filamentoso.
Cromatograma
0
50
100
0
5
10
mVo
lts
0 10Minutos
IV
DM
F X
IV
XV Esc
ala
grad
ient
e
Figura 39. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Beauveria bassiana ATCC 7159 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
73
Beauveria bassiana ATCC 7159
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
024681012
LASSBio 581Der. IVDer. VDer. VIDer. XDer. XIVDer. XVDer. XVII
Figura 40. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Beauveria bassiana ATCC 7159 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e dos derivados IV e VI; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados V, X, XIV, XV, XVII) com o tempo de incubação em horas. 3.4.2.5 Cunninghamella echinulata ATCC 9245
A incubação de Cunninghamella echinulata ATCC 9245 com LASSBio 581 (meio
líquido PDSM, agitação de 200rpm, temperatura de 27ºC) levou a formação de nove
derivados e consumo total do substrato no período de 96 horas. O produto formado em
maior quantidade foi o IV, durante todo o tempo de incubação, contudo não é o de
maior interesse já que é formado em grande quantidade por todas as cepas ensaiadas,
sendo de difícil separação e purificação. O composto XA é formado exclusivamente por
esta cepa e em grande quantidade, no tempo de 48 horas, em relação aos demais
produtos formados por este fungo filamentoso.
74
Figura 41. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9245 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Cunninghamella echinulata ATCC 9245
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
-1
1
3
5
7
9 LASSBio 581Der. IDer. IVDer. VIIDer. XDer. XADer. XIIDer. XVDer. XXIIDer. XXV
Figura 42. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella echinulata ATCC 9245 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados I, VII, X, XA, XII, XV, XXII, XXV) com o tempo de incubação em horas.
Cromatograma
0
50
100
0
2
mV
olts
0 10 Minutos I
IV
DM
F X
V
X
XA XXI
I
Esc
ala
grad
ient
e
75
3.4.2.6 Cunninghamella echinulata ATCC 9244
A biotransformação do substrato LASSBio 581 por Cunninghamella echinulata
ATCC 9244 (meio líquido PDSM, agitação de 200rpm, temperatura de 27ºC), levou a
formação de nove derivados. No tempo de 96 horas pode-se observar metabolização
total do substrato ensaiado, assim como nos tempos de 168 e 190 horas. O composto
formado em maior quantidade foi o IV, durante todo tempo da reação, contudo não foi o
de maior interesse por ser formado por todas as cepas em grande quantidade
(sobreposição com pico de algum componente do meio de cultura). Altas quantidades,
também foram observados para o composto VI nos tempos de 24 e 48 horas. O produto
XXVII, embora também tenha sido produzido por Mortierella isabelina NRRL 1757,
mostrou-se o de maior interesse já que no tempo de 48 horas apresenta-se em maior
quantidade em relação aos demais (com exceção do derivado IV e VI).
76
Figura 43. Perfis cromatográficos do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 nos tempos de 24 e 48 em sistema isocrático (cromatogramas superiores) e 24horas em sistema gradiente (cromatograma inferior), e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Cromatograma
0
50
100
0
2
mV
olts
0 10 20Minutos
II
IV
DM
F X
VI
XV
II XX
II X
XIII
XX
VIII
*LA
SS
Bio
581
0
50
100
0
2
mV
olts
0 10 20
Minutos
II
IV
DM
F
XV
I X
VII
XX
II
XX
III
XX
VII
LA
SS
Bio
581
Cromatograma
Cromatograma
0
50
100
0
1
2
mV
olts
0 Minutos
IV
VI
DM
F
XV
I
XV
II
XX
II
Esc
ala
grad
ient
e
Esc
ala
grad
ient
e
Esc
ala
grad
ient
e
77
Cunninghamella echinulata ATCC 9244
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
012345678910
LASSBio 581
Der. IIDer. IV
Der. VIDer. XVI
Der. XVIIDer. XXII
Der. XXIIIDer. XXVII
Der. XXVIII
Cunninghamella echinulata ATCC 9244
0
4
8
12
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
012345678910 Der. XVI -
LaBioCon 10Der. XVII -LaBioCon 11Der. XXII -LaBioCon 12Der. XXIII -LaBioCon 22Der. XXVII -LaBioCon 19Der. XXVIII -LaBioCon 13
Figura 44. Cinéticas de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella echinulata ATCC 9244 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e dos derivados IV e VI; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados II, XVI, XVII, XXII, XXIII, XXVII, XXVIII) com o tempo de incubação em horas (gráfico superior). Gráfico inferior: cinética destacando os derivados formados pela incubação com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 que tiverem suas estruturas químicas sugeridas pelas análises de RMN 1H e MS.
78
3.4.2.7 Cunninghamella elegans ATCC 36112
A incubação de Cunninghamella elegans ATCC 36112 com LASSBio 581 (meio
líquido PDSM, agitação de 200 rpm, temperatura de 27ºC) ocasionou a formação de
onze derivados e consumo total do substrato no tempo de 96 horas. O composto
formado em maior quantidade foi o IV. Se considerarmos a pequena quantidade com
que os demais produtos foram formados em relação ao IV, Cunninghamella elegans
ATCC 36112 seria uma boa escolha para isolamento do composto IV em 48 horas,
mesmo sendo este um derivado de difícil separação dos componentes do meio de
cultura. O derivado XI foi produzido exclusivamente por esta cepa no tempo de 24
horas, tendo isolamento rápido devido ao seu tempo de formação, contudo pouca
quantidade é obtida.
Figura 45. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella elegans ATCC 36112 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol). .
0
100
0
5
10
mV
olts
0 10 Minutos
IV
DM
F
XIV
XXI
I XXI
II 50
Esc
ala
grad
ient
e
79
Cunninghamella elegans ATCC 36112
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
0
0,5
1
1,5
2LASSBio 581Der. IIDer. IVDer. VIDer. VIIIDer. XIDer. XIVDer. XVIIIDer. XIXDer. XXDer. XXIIDer. XXIII
Figura 46. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Cunninghamella elegans ATCC 36112 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e dos derivados II, IV e VI; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados VIII, XI, XIV, XVIII, XIX, XX, XXII, XXIII) com o tempo de incubação em horas.
3.4.2.8 Mortierella isabelina NRRL 1757
Doze derivados são formados pela metabolização do LASSBio 581 com
Mortierella isabelina NRRL 1757 (meio líquido PDSM, agitação de 200 rpm, temperatura
de 27ºC). No tempo de 96 horas o substrato foi consumido totalmente e maiores
quantidades são observadas dos produtos XVI, XXII, XXIV e XXIX. Nos tempos de 24,
48 e 72 horas, o composto formado em maior quantidade é o IV. Diferentemente, no
tempo de 96 horas, o produto que se forma em maior quantidade é o XXII.
O composto X é encontrado somente no tempo de 24 horas, enquanto que os
produtos XV e XXVIII são formados somente em 48 horas. O derivado XII é formado
nos tempos de 72 e 96 horas, e o XIII nos tempos de 24, 72 e 96 horas em quantidades
80
equivalentes. Maior quantidade do composto XVII é encontrada em 24 horas do que em
72 horas. O derivado XXIII é formado em maior quantidade em 96 horas, e em menor
quantidade em 72horas. Para obtenção do produto XXIX, deve-se manter incubação
até 96 horas, tempo em que é formado.
Figura 47. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mV
olts
0 10Minutos
IV
DM
F XI
I XI
II
XVI
XXI
I X
XIII
XXIV
*XXI
X
Esc
ala
grad
ient
e
81
Mortierella isabelina NRRL1757
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
024681012
LASSBio 581Der. IVDer. XDer. XIIDer. XIIIDer. XVDer. XVIDer. XXIIDer. XXIIIDer. XXIVDer. XXVIDer. XXVIIIDer. XXIX
Mortierella isabelina NRRL1757
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
0
1
2
3
4 Der. XV -LaBioCon 18
Der. XXIV -LaBioCon 9
Der. XXVI -LaBioCon 1
Figura 48. Cinéticas de biotransformação do LASSBio 581 por Mortierella isabelina NRRL 1757 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados X, XII, XIII, XV, XVI, XXII, XXIII, XXIV, XXVI, XXVIII, XXIX) com o tempo de incubação em horas (gráfico superior). Gráfico inferior: cinética destacando os derivados formados pela incubação com Mortierella isabelina NRRL 1757 que tiverem suas estruturas químicas sugeridas pelas análises de RMN 1H e MS
82
3.4.2.9 Mucor griosyanus ATCC 1207a
Dez produtos foram encontrados na incubação do LASSBio 581 com Mucor
griosyanus ATCC 1207a (meio líquido PDSM, agitação de 200 rpm, temperatura de
27ºC). O derivado IV teve sua maior formação no tempo de 48 horas com diminuição
nos tempos de 72 e 96 horas. O substrato foi consumido inteiramente nas 24 horas
iniciais, e no tempo de 72 horas pode-se observar a formação do composto II em
quantidades razoáveis.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mVo
lts
0 10
Minutos
IV
DM
F X
V X
VII
*XXX
Esc
ala
grad
ient
e
Figura 49. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mucor griosyanus ATCC 1207a no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
83
Mucor griseocyanus ATCC 1207a
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
0
0,5
1
1,5
2LASSBio 581Der. IIDer. IVDer. VIDer. XIIIDer. XIVDer. XVDer. XVIIDer. XIXDer. XXDer. XXX
Figura 50. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Mucor griseocyanus ATCC 1207a correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados II, VI, XIII, XIV, XV, XVII, XIX, XX, XXX) com o tempo de incubação em horas.
3.4.2.10. Rhizopus arrhizus ATCC 11145
Dez produtos foram formados pela incubação do LASSBio 581 com Rhizopus
arrhizus ATCC 11145 (meio líquido PDSM, agitação de 200 rpm, temperatura de 27ºC).
O composto aparentemente formado em maior quantidade foi o IV, em todos os tempos
de análise da reação estudada, contudo não foi o de maior interesse, pois não se pode
interferir na formação relativa deste composto visto que nas condições cromatográfica
empregadas tem-se sobreposição com o tempo de retenção de alguns componentes do
meio nutricional. Os derivados XXI e XXVI são produzidos exclusivamente por esta
cepa nos tempos de 48 e 72 horas respectivamente. O composto I foi encontrado nos
84
tempos de 24 horas em maior quantidade e 48 horas. O produto IX é formado somente
no tempo de 48 horas, diferente de XVII que se forma somente em 24 horas.
Figura 51. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Rhizopus arrhizus ATCC 11145 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm (--------------- metanol/tampão 65:35; --------------- metanol).
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mV
olts
0 10 Minutos
*I IV
DM
F
XX
IX
XXI
X
XII
Esc
ala
grad
ient
e
85
Rhizopus arrhizus ATCC 11145
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72 96
Tempo (h)
% d
a ár
ea d
o pi
co
02468101214
LASSBio 581Der. IDer. IVDer. VIIIDer. IXDer. XVIIDer. XXDer. XXIDer. XXIIDer. XXVDer. XXVI
Figura 52. Cinética de biotransformação do LASSBio 581 por Rhizopus arrhizus ATCC 11145 correlacionando a percentagem da área do pico dos diferentes compostos em relação a todos os outros picos observados no cromatograma em comprimento de onda de 248nm (eixo da esquerda relacionado as áreas do substrato LASSBio 581 e do derivado IV; e eixo da direita relacionado as áreas dos picos dos derivados I, VIII, IX, XVII, XX, XXI, XXII, XXV, XXVI) com o tempo de incubação em horas.
3.4.3. Isolamento e purificação por cromatografia líquida em coluna
(Flash cromatografia)
Para separação e purificação dos compostos formados, flash cromatografia
usando fase estacionária Sílicagel 60 (70 – 230 mesh) e comprimento da coluna 30 cm
foi realizada. Para fase móvel, acetato de etila/metanol 95:05, acetato de etila/metanol
70:30, acetato de etila/metanol 50:50 e/ou metanol puro foram ensaiados. A fase móvel
acetato de etila/metanol 95:05 foi a de escolha para a maioria dos ensaios realizados já
que proporcionou boa separação dos diferentes derivados observados inicialmente nos
processos cromatográficos em camada delgada. Na 4ª incubação em escala semi-
86
preparativa utilizou-se como fase móvel acetato de etila/metanol 95:05 em um estágio
inicial, aumento da quantidade de metanol para 30 (acetato de etila/metanol 70:30) a
partir de tubo coletado de número 25, alteração para 50 mL de metanol do tubo 32 ao
36 e metanol puro de 36 até o final. Nenhum benefício foi observado nas condições
analíticas obtidas pela variação das quantidades de acetato de etila e metanol durante
o processo de cromatografia de adsorção.
3.4.4. Determinação das estruturas dos metabólitos formados
As quantidades dos metabólitos obtidos nos cinco ensaios de bioconversão
permitiram a realização das análises de espectrometria de massas e ressonância
magnética nuclear de 1H.
N
N
N
N
N
Cl4'
5' 3'
6' 2'1'
12
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"2" 3"
4"
5"6"
a
b
cd
Figura 53. Substrato LASSBio 581
Pela incubação do LASSBio 581 (Figura 53) com Cunninghamella echinulata
ATCC 9244, cinco derivados (hidroxilados, dihidroxilados, e glicosilados em diferentes
87
posições) tiveram suas estruturas sugeridas pelas análises dos espectros de massa e
ressonância magnética nuclear de hidrogênios (Figura 54).
Cl
N
NN
NN
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
OHO
HO
HOHO
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
HO
O
OH
OH
OH
HO OH
Figura 54. Estruturas químicas dos cinco derivados funcionalizados formados a partir da incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244.
LASSBio 581
LaBioCon 13
LaBioCon 10
LaBioCon 12
LaBioCon 19
LabioCon 22
88
Dois derivados (hidroxilado e diglicosilado no anel d) obtidos pela incubação do
LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757 tiveram suas estruturas químicas
sugeridas segundo análises de massas e ressonância magnética nuclear de
hidrogênios (Figura 55).
Cl
N
NN
NN
Cl
N
NN
NN OH
Cl
N
NN
NN
OO
OH
HOHO
a
b
cd
a
b
cd
a
b
cd
OO
OH
HO HO
OH
Figura 55. Estruturas químicas dos dois derivados funcionalizados formados a partir da incubação do LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757.
LASSBio 581
LaBioCon 9
LaBioCon 1
89
3.4.4.1 LaBiocon 1
O espectro de RMN 1H indica glicosilação (Espectro 12, página 153), com sinais
entre as regiões 3,48 e 5,35ppm. O aparecimento de um multipleto entre 1,28-1,32ppm
indica a presença de quatro hidrogênios referentes aos carbonos 8 e 12 presentes no
anel c. Os quatro hidrogênios referentes aos carbonos 11 e 9 do anel c estão
distribuídos no multipleto entre 3,21 e 3,25 ppm. Os dois hidrogênios da ponte
metilênica, que liga anel b ao anel c, foram identificados no singleto em 3,29 ppm. Dois
hidrogênios foram identificados nos multipletos em 3,49 e 3,65 ppm referentes aos
carbonos 21 e 25 da glicose. Cinco singletos identificados nas regiões 3,78, 3,80, 3,99,
4,20 e 4,23 ppm correspondem a 7 hidrogênios referentes aos carbonos 34, 32, 22, 15
e 14 das glicoses. Dois multipletos em 4,27 e 4,28 ppm correspondem a dois
hidrogênios referentes aos carbonos 26 e 18 das glicoses, respectivamente. Oito
hidrogênios, referentes às hidroxilas e ao carbono 19 da glicose, estão presentes no
singleto em 4,35 ppm. O singleto em 5,34 ppm indica um hidrogênio referente ao
carbono 24, e o singleto em 5,11 ppm ao hidrogênio do carbono 17 ambos presentes
nas glicoses. Um dubleto entre 6,71-6,73 ppm (J=7,2) indica a presença dos dois
hidrogênios dos carbonos 6” e 2”, enquanto um dubleto entre 6,89-6,91 ppm (J=7,2)
indica os dois hidrogênios dos carbonos 5” e 3”, presentes no anel d. Os quatro
hidrogênios referentes aos carbonos 3’ e 5’ e carbonos 2’ e 6’ do anel a foram
identificados no dubleto em 7,63 ppm (J=7,0) e no dubleto 7,89 ppm (J=7,0)
respectivamente. O aparecimento de um singleto em 8,71ppm indica a presença de um
hidrogênio referente ao carbono 5 presente no anel b (Figuras 56 e 57).
90
LaBioCon 1
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5
0.00
0.01
0.02
0.03
8.00 1.721.30 1.151.01 1.00 0.900.82
Água Methanol-d4
5.34
5.11
4.89
4.35
4.28
4.27
4.23
4.20
3.99 3.80 3.78 3.65
3.49
3.30
Figura 56. Expansão da região relativa aos picos dos hidrogênios presentes nas glicoses adicionadas à molécula do substrato LASSBio 581
LaBioCon 1
8 7 6 5 4 3 2 1 0 -10.00
0.05
0.10
Água Methanol-d4 TMS
8.71 7.89 7.63
6.91
6.89 6.73
6.71 5.
34 5.11
4.89
4.35
4.28
4.27 3.49
3.30
3.29
3.22
3.21
1.32
1.28
-0.0
1
Figura 57. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 1
91
O espectro de massa do produto LaBioCon 1 apresenta pico do íon molecular
em m/z 680,6 e pico do íon base em m/z 352, 58 (M-328). Em 354,58 (M+) tem-se o
pico de massa referente ao peso molecular do substrato LASSBio 581 e em 680,6 tem-
se a massa do composto intacto, portanto M+ + 326 (C12H21O10), indicando
diglicosilação sem a saída do átomo de cloro do anel a do composto de partida
(Espectro 13, página 154).
A estrutura proposta para o LaBioCon 1 foi o produto diglicosilado no anel d.
N
N
N
N
N
Cl
O
O
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
4'5' 3'
6' 2'1'
12
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4"
13
1415
3233
16
171819
27 2820
21 22 23
24
2526
29 30
34
35
31
Figura 58. Estrutura química proposta para o produto diglicosilado LaBioCon 1
3.4.4.2 LaBiocon 9
O aparecimento de um singleto em 4,29 ppm indica a presença de hidroxilação
(Espectro 14, página 155). Um multipleto entre 1,27-1,29 ppm indica a presença de
quatro hidrogênios referentes aos carbonos 8 e 12 presentes no anel c. O aparecimento
de um multipleto entre 3,21 e 3,25 ppm indica a presença de quatro hidrogênios
referentes aos carbonos 11 e 9 do anel c. Os dois hidrogênios da ponte metilênica, que
liga anel b ao anel c, foram identificados no singleto em 3,29ppm. Os dois dubletos
entre 6,71-6,72 ppm (J=7,0) e 6,88-6,90 (J=7,0) indicam a presença de quatro
92
hidrogênios, dois referentes aos carbonos 6” e 2” e dois aos carbonos 5” e 3”
respectivamente. Dois hidrogênios referentes aos carbonos 5’ e 3’ estão distribuídos no
dubleto entre 7,60-7,62 ppm (J=7,0). Dois hidrogênios referentes aos carbonos 2’ e 6’
do anel a foram identificados no dubleto entre 7,89-7,90 ppm (J=7,0). O aparecimento
de um singleto em 8,70ppm indica a presença de um hidrogênio referente ao carbono 5
presente no anel b.
LaBioCon 9
5 0
0.0
0.5
1.0
4.213.04 1.260.98
Água
Methanol-d4
TMS
8.70 7.90
7.89
7.62
7.60
6.90
6.88
6.72
6.71
4.87
3.30
3.29
3.22 3.21
1.29
1.27
-0.0
1
Figura 59. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 9
LaBioCon 9 apresenta, em seu espectro de massa , pico do íon molecular em
m/z 370,41 e pico do íon base em m/z 352, 58 (M-17,83). Em 354,58 (M+) tem-se o
pico de massa referente ao peso molecular do substrato LASSBio 581 e em 370,41
93
tem-se a massa do composto intacto, portanto M+ + 17, indica hidroxilação sem a saída
do átomo de cloro do anel a do composto de partida (Espectro 15, página 156).
A estrutura proposta para o LaBioCon 9 foi o produto hidroxilado no anel d.
N
N
N
N
N
Cl
OH
4'5' 3'
6' 2'
1
1'
2
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4" 13
Figura 60. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 9
3.4.4.3 LaBiocon 10
O aparecimento de um singleto em 3,74 indica a presença de hidroxilação
(espectro 16, página 157). Um multipleto entre 2,67-2,70 ppm indica a presença de
quatro hidrogênios referentes aos carbonos 8 e 12 presentes no anel c. Um multipleto
entre 3,12 e 3,15 ppm indica a presença de quatro hidrogênios dos carbonos 11 e 9 do
anel c. O hidrogênio da hidroxila ligada a ponte metilênica está distribuído no singleto
em 3,74 ppm. O dubleto em 6,78-6,76ppm (J=8,0) indica a presença de um próton
referente ao carbono 4”. O dubleto entre 6,90-6,88 ppm (J=8,0) indica a presença de
dois hidrogênios referentes aos carbonos 5’ e 3’. Os dois hidrogênios referentes aos
carbonos 2” e 6” estão distribuídos no dubleto entre 7,51-7,49 ppm (J=8,0). O dubleto
94
entre 7,15 e 7,17ppm (J=8,0) correspondem aos dois hidrogênios dos carbonos 5” e 3”.
O dubleto em 7-80-7,78 (J=8,0), indica a presença dos dois hidrogênios dos carbonos 2’
e 6’. O aparecimento de um singleto em 8,44ppm indica a presença de um hidrogênio
referente ao carbono 5 presente no anel b.
LaBioCon 10
8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
2.10 2.091.971.25
Água Methanol-d4
TMS8.44 7.
807.
547.
17 7.15
6.90
6.88
6.78 6.
76
4.79
3.24
3.23
3.15 3.
122.
702.
67
0.00
Figura 61. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 10
O espectro de massa para o derivado LaBioCon 10, apresenta pico do íon
molecular em m/z 370,4. Em 354,3 (M+) tem-se o pico de massa referente ao peso
molecular do substrato LASSBio 581 e em 370,4 tem-se a massa do composto intacto,
portanto M+ + 17 (espectro 17, página 158).
A estrutura proposta para o LaBioCon 10 foi o produto hidroxilado na ponte
metilênica.
95
N
N
N
N
NOH
Cl4'
5' 3'
6' 2'
1
1'
2
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4"
Figura 62. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 10
3.4.4.4 LaBiocon 12
No espectro de massa do derivado LaBioCon 12, observou-se pico do íon
molecular em m/z 386,3. Em 352,4 (M+) tem-se o pico de massa referente ao peso
molecular do substrato LASSBio 581 e em 386,3 tem-se a massa do composto intacto,
portanto M+ + 34, indicando dihidroxilação (espectro 18, página 159) .
A estrutura proposta para o LaBioCon 12 foi o produto dihidroxilado no anel d e
b.
96
N
N
N
N
N
Cl
OH
OH
4'5' 3'
6' 2'
1
1'
2
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4" 13
Figura 63. Estrutura química proposta para o produto dihidroxilado LaBioCon 12
3.4.5.5 LaBiocon 13
O espectro de RMN 1H indica glicosilação, com sinais entre as regiões 3,62 e
5,39ppm (espectro 19, página 160). O aparecimento de um multipleto entre 2,74-2,77
ppm indica quatro hidrogênios referentes aos carbonos 8 e 12 presentes no anel c. Os
quatro hidrogênios dos carbonos 11 e 9 do anel c estão distribuídos no multipleto entre
3,22 e 3,19ppm. Dois hidrogênios relacionados aos carbonos 9’ e 11’ da glicose estão
presentes no multipleto em 3,62ppm. O multipleto em 3,75ppm está relacionado a um
hidrogênio presente no carbono 10’ da glicose. O hidrogênio do carbono 12’ da glicose
está representado no multipleto em 4,02ppm. Dois singletos em 4,08 e 4,38ppm,
indicam a presença dos dois hidrogênios do carbono 14’ da glicose. Os quatro
hidrogênios das hidroxilas ligadas à molécula de glicose estão distribuídos no multipleto
em 4,58ppm. O hidrogênio do carbono 8’ da glicose está presente no tripleto em
5,39ppm. O hidrogênio do carbono 4” está localizado no dubleto em 6,83 ppm (J=8,0).
O dubleto em 6,95-6,97 ppm (J=8,0) indica a presença dos dois hidrogênios dos
97
carbonos 3’ e 5’. Os dois hidrogênios dos carbonos 6” e 2” do anel d foram identificados
no dubleto em 7,22-7,20 ppm (J=8,0). O dubleto em 7,59-7,61 ppm (J=8,0) indica os
dois hidrogênios dos carbonos 5” e 3”, presentes no anel d. O aparecimento de um
dubleto em 7,89 e 7,87 ppm (J=8,0) indica a presença de dois hidrogênios referentes
carbonos 2’ e 6’ do anel a. No singleto presente em 8,51 ppm está distribuído um
hidrogênio do carbono 5 presente no anel b.
LaBioCon 13
5.0 4.5 4.0 3.5
0.00
0.01
4.09 1.951.461.01 0.910.81
Água
5.39
4.86
4.58
4.38
4.08
4.02
3.75
3.62
Figura 64. Expansão da região relativa aos picos dos hidrogênios presente na glicose adicionada à molécula do substrato LASSBio 581.
98
LaBioCon 13
8 7 6 5 4 3 2 1 0 -10.00
0.01
0.02
Água Methanol-d4
TMS
8.51 7.89 7.87 7.61
7.59
7.22
6.97
6.95
6.83 5.
39
4.86
4.58
4.38
4.08 3.
753.
313.
20 3.19
2.77 2.
752.
74
0.00
Figura 65. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 13
A estrutura proposta para o LaBioCon 13 foi o produto glicosilado na ponte
metilênica.
N
N
N
N
N
Cl
O
O
OH
OH
OHOH
4'5' 3'
6' 2'1'
12
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4"
7'
8'
9'10'11'
12'
13'14'
15'
16'
17'18'
Figura 66. Estrutura química proposta para o produto glicosilado LaBioCon 13
99
3.4.5.6 LaBiocon 19
O aparecimento de um singleto em 4,12 ppm indica a presença de hidroxilação
(espectro 20, página 161). Um multipleto entre 1,28-1,32ppm indica a presença de
quatro hidrogênios referentes aos carbonos 8 e 12 presentes no anel c. O aparecimento
de um multipleto entre 3,21 e 3,00 ppm indica a presença de quatro hidrogênios
referentes aos carbonos 11 e 9 do anel c. Os dois hidrogênios da ponte metilênica, que
liga anel b ao anel c, foram identificados no singleto em 3,29 ppm. Os dois dubletos
entre 6,70-6,72 ppm (J=8,0) e 6,87-6,89 ppm (J=8,0) indicam a presença de quatro
hidrogênios, dois referentes aos carbonos 6” e 2” e dois aos carbonos 5” e 3”
respectivamente. Dois hidrogênios referentes aos carbonos 5’ e 3’ estão distribuídos no
dubleto entre 7,60-7,62 ppm (J=8,0). Dois hidrogênios referentes aos carbonos 2’ e 6’
do anel a foram identificados no dubleto entre 7,87-7,89 ppm (J=8,0). O aparecimento
de um singleto em 8,58ppm indica um hidrogênio do carbono 5 do anel b.
LaBioCon 19
8 7 6 5 4 3 2 1 0 -10.00
0.05
0.10
Água Methanol-d4
8.58 7.
89 7.87
7.62
7.60
6.89 6.87
6.72
6.70
4.84
3.30
3.29
3.21 3.14
3.00
1.32 1.
28
Figura 67. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 19
100
LaBioCon 19 apresenta, em seu espectro de massa, pico do íon molecular e pico
do íon base em m/z 370,2. Em 354,2 (M+) tem-se o pico de massa referente ao peso
molecular do substrato LASSBio 581 e em 370,2 tem-se a massa do composto intacto,
portanto M+ + 17, indicando hidroxilação sem a saída do átomo de cloro do anel a do
composto de partida (espectro 21, página 162).
A estrutura proposta para o LaBioCon 9 foi o produto hidroxilado no anel d.
N
N
N
N
N
Cl
OH
4'5' 3'
6' 2'
1
1'
2
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4" 13
Figura 68. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 19
3.4.5.7 LaBiocon 22
O aparecimento de um singleto em 2,26 indica a presença de dihidroxilação
(espectro 22, página 163). O aparecimento de um singleto em 2,26ppm indica a
presença de dois hidrogênios referentes às hidroxilas introduzidas no anel d e na ponte
metilênica. Um multipleto entre 3,11 e 3,20 ppm indica a presença de quatro
hidrogênios referentes aos carbonos 9 e 11 presentes no anel c. O aparecimento de um
multipleto em 2,77-2,93ppm indica a presença de quatro hidrogênios referentes aos
carbonos 8 e 12 do anel c. O hidrogênio da ponte metilênica, que liga anel b ao anel c,
101
foi identificado no singleto em 4,04 ppm O dubleto em 6,70-6,72 ppm (J=8,0) indica a
presença dos dois hidrogênios dos carbonos 5” e 3” do anel d. O dubleto entre 6,86-
6,88 ppm (J=8,0) indica a presença de dois hidrogênios referentes aos carbonos 6” e 2”
respectivamente. Dois hidrogênios referentes aos carbonos 5’ e 3’ estão distribuídos no
dubleto entre 7,60-7,62 ppm (J=8,0). Dois hidrogênios referentes aos carbonos 2’ e 6’
do anel a foram identificados no dubleto entre 7,87-7,89 ppm (J=8,0). O aparecimento
de um singleto em 8,55ppm indica um hidrogênio do carbono 5 do anel b.
LaBioCon 22
8 7 6 5 4 3 2 1 0 -10.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Methanol-d4Água
2.25
2.26
2.77
3.11
3.20
3.30
3.64
4.84
5.34
6.72
6.86
6.88
7.597.62
7.86
7.89
8.55
Figura 69. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 22
No espectro de massa do derivado LaBioCon 22, observou-se pico do íon
molecular em m/z 386,3 e pico do íon base em m/z 370,2. Em 354,2 (M+) tem-se o pico
de massa referente ao peso molecular do substrato LASSBio 581 e em 386,2 tem-se a
102
massa do composto intacto, portanto M+ + 34, indicando dihidroxilação (espectro 23,
página 164).
A estrutura proposta para o LaBioCon 22 foi o produto dihidroxilado no anel d e
na ponte metilênica.
N
N
N
N
N
Cl
OHOH
4'5' 3'
6' 2'
1
1'
2
3 4
5
6
7
8 910
1112
1"
2" 3"
6" 5"
4"
Figura 70. Estrutura química proposta para o produto hidroxilado LaBioCon 22.
103
Cl
N
NN
NN
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
OHO
HO
HOHO
Cl
N
NN
NN
a
b
cd OH
Cl
N
NN
NN
a
b
cd OH
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
a
b
cd
Cl
N
NN
NN
OO
OH
HOHO
a
b
cd
OO
OH
HO HO
OH
OHHO
OH
O
HO
Figura 71. Estruturas químicas dos derivados funcionalizados do LASSBio 581 a partir da aplicação de bioconversões com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757, destacando suas respectivas percentagens de rendimento.
LASSBio 581
LaBioCon 19 62,5%
LaBioCon 12 2,03%
LabioCon 22 7,56%
LaBioCon 10 7,88%
LaBioCon 13 14,63% LaBioCon 1
32,35%
LaBioCon 9 28,97%
104
Tabela 5.1. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757.
N º (Posição)
LASSBio 581 (ppm)
1 (ppm)
9 (ppm)
10 (ppm)
13 (ppm)
19 (ppm)
22 (ppm)
3 - - - - - - -
5 δ=7,95 (1H,s)
δ=8,71 (1H,s)
δ=8,70 (1H, s)
δ=8,44 (1H,s)
δ=8,51 (1H,s)
δ=8,58 (1H, s)
δ=8,55 (1H, s)
6 δ=3,83 (2H,s)
δ=3,29 (2H,s)
δ=3,29 (2H,s)
δ=3,74 (1H, s, OH)
δ=3,30 (1H,s)
δ=3,29 (2H,s)
δ=4,04 (1H,s) δ=2,26 (1H, s,
OH) 8 e 12 δ=2,72-2,77
(4H,m) δ=1,28-1,32
(4H,m) δ=1,27-1,29
(4H,m) δ=2,67-2,70
(4H,m) δ=2,74-2,77
(4H,m) δ=1,28-1,32
(4H,m) 8-δ=4,84
(1H,s) 12-δ=2,77-
3,11 (2H,2s) 9 e 11 δ=3,20-3,25
(4H,m) δ=3,21-3,25
(4H,m) δ=3,21-3,25
(4H,m) δ=3,12-3,15
(4H,m) δ=3,19 - 3,22
(4H,m) δ=3,00-3,21
(4H,m) 9-δ=5,34 (1H,m)
11-δ=2,93-3,20 (2H,2s)
2’ e 6’ δ=7,71 (2H,d, J=
8,7Hz)
δ=7,89 (2H,d, J=
7,0Hz)
δ=7,89-7,90 (2H,d, J=
7,0Hz)
δ=7,78-7,80 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,87-7,89 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,87-7,89 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,87-7,89 (2H,d, J=
8,0Hz) 3’ e 5’ δ=7,50
(2H,d, J= 8,7Hz)
δ=7,63 (2H,d, J=
7,0Hz)
δ=7,60-7,62 (2H,d, J=
7,0Hz)
δ=6,88-6,90 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=6,95 – 6,97 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,60-7,62 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,60-7,62 (2H,d, J=
8,0Hz) 4’ - - - - - - -
2” e 6” δ=6,82-6,95 (2H,m)
δ=6,71-6,73 (2H,d, J=
7,2Hz)
δ= 6,71-6,72 (2H, d, J=
7,0Hz)
δ=7,49-7,51 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,20-7,22 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ= 6,70-6,72 (2H, d, J=
8,0Hz)
δ= 6,86-6,88 (2H, d, J=
8,0Hz) 3” e 5” δ=7,22-7,30
(2H,m) δ=6,89-6,91
(2H,d, J= 7,2Hz)
δ=6,88-6,90 (2H,d, J=
7,0Hz)
δ=7,15-7,17 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=7,59-7,61 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=6,87-6,89 (2H,d, J=
8,0Hz)
δ=6,70-6,72 (2H,d, J=
8,0Hz) 4” δ=6,82-6,95
(1H,m) - - δ=6,76-6,78
(1H,d, J= 8,0Hz)
δ=6,83 (1H,d, J=
8,0Hz)
- -
105
Tabela 5.2. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757.
N º LASSBio 581
(ppm)
1 (ppm)
9 (ppm)
10 (ppm)
13 (ppm)
19 (ppm)
22 (ppm)
8’ - - - - δ=5,39 (1H,t)
- -
9’ - - - - δ=3,62 (1H,m)
- -
10’ - - - - δ=3,75 (1H,m)
- -
11’ - - - - δ=3,62 (1H,m)
- -
12’ - - - - δ=4,02 (1H,m)
- -
14’ - - - - δ=4,08 ;4,38 (2H,2s)
- -
15’, 16’, 17’e 18’ - - - - δ=4,58 (4H,m,4 OH)
- -
13
- - δ=4,29 (1H,s, OH)
- - δ=4,12 (1H,s, OH)
δ=2,26 (1H,s)
106
Tabela 5.3. RMN 1H dos metabólitos identificados a partir da incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757.
N º LASSBio 581
(ppm)
1 (ppm)
9 (ppm)
10 (ppm)
13 (ppm)
19 (ppm)
22 (ppm)
14 - δ=4,23 (1H,s)
- - - - -
15 - δ=4,20 (1H,s)
- - - - -
17 - δ=5,11 (1H,s)
- - - - -
18 - δ=4,27 (1H,m)
- - - - -
19 - δ=4,35 (1H,s)
- - - - -
21 - δ=3,49-3,65 (1H,m)
- - - - -
22 - δ=3,99 (1H,s)
- - - - -
24 - δ=5,34 (1H,s)
- - - - -
25 - δ=3,49-3,65 (1H,m)
- - - - -
26 - δ=4,28 (1H,m)
- - - - -
32 - δ=3,80 (2H,s)
- - - - -
34 - δ=3,78 (2H,s)
- - - - -
27, 28, 33
- δ=4,35 (3H,s)
- - - - -
29, 30, 31, 35
- δ=4,35 (4H,s)
- - - - -
As novas moléculas formadas pela bioconversão do LASSBio 581 quando
comparadas ao seu substrato original apresentarão diferentes propriedades físico-
químicas e farmacocinética com possibilidades promissoras de aplicação. Os
derivados formados, devido à introdução de grupamentos polares, terão uma maior
solubilidade em água, o que propiciará administração intravenosa antes dificultada
devido a baixa solubilidade em água do substrato de partida LASSBio 581. Devido à
natureza das reações ocorridas, alguns dos compostos formados podem estar
relacionados aos prováveis metabólitos humanos, justificando a possibilidade de
utilização destes produtos como padrões de referencia para estudos do
metabolismo.
As diferentes minimizações de energia observadas para os derivados, quando
comparados ao substrato original, pode supor diferentes interações com receptor e
possibilidade de descoberta de diferentes atividades. .
As posições modificadas nos compostos formados indicam que as
funcionalizações (hidroxilação, dihidroxilações e glicosilações) não estejam
ocorrendo seqüencialmente, já que não há relação entre o desaparecimento e a
formação subseqüente de determinado composto, acreditando-se assim que
provavelmente estas reações estejam sendo realizadas por enzimas distintas.
Figura 72: Estruturas químicas dos derivados funcionalizados do LASSBio 581 a partir da aplicação de bioconversões com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757, representadas em 3D com minimização de energia.
4. Conclusões
A bioconversão com fungos filamentosos, mostrou-se promissora para a
produção de uma série de compostos funcionalizados a partir do LASSBio 581.
A análise dos resultados obtidos levando em consideração os parâmetros
empregados para seleção, manutenção, repique e morfologia de crescimento
fúngico, no meio líquido proposto, contribuiram para as reações de funcionalização
obtidas.
Cunninghamella echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757
propiciaram a formação de seis compostos funcionalizados por grupamentos
químicos em diferentes posições. A partir dos ensaios realizados, a reação química
mais freqüente foi a de hidroxilação similar àquelas observadas no metabolismo fase
I para a maioria dos fármacos, sendo evidenciado pela formação dos derivados
hidroxilados nas posições 4” e 6, dihidroxilados nas posições 5 e 4”; 6 e 4”.
Provavelmente estas reações tenham sido produzidas pelo sistema enzimático
citocromo P-450. Devido à natureza das reações obtidas, alguns dos compostos
formados podem estar relacionados aos prováveis metabólitos humanos.
Por sua vez, a obtenção do derivado glicosilado na posição 6, e diglicosilado
na posição 4”, raramente obtidas no metabolismo animal fase II, são observadas
como produto do metabolismo fúngico, reforçando o caráter da biodiversidade dos
metabólitos formados. Além disso, as glicosilações efetuadas por fungos
filamentosos, podem sugerir posições de prováveis glicuronidações observadas em
mamíferos, e portanto os possíveis locais de biotransformação fase II em humanos.
Os resultados das diferentes posições de funcionalização, leva-nos a crer que
as reações são realizadas por enzimas distintas, visto que, embora sejam
observadas dihidroxilação e glicosilação estas não ocorrem seqüencialmente.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Generalidades
5.1.1 Técnicas cromatográficas
Na determinação dos produtos funcionalizados a partir do novo protótipo de
fármaco neuroativo LASSBio 581 foram utilizados técnicas de cromatografia em
camada delgada, flash cromatografia e cromatografia líquida de alta eficiência.
Para cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatofolhas
de alumínio TCL 20x20cm sílica gel 60 F254, espessura da camada de sílica de
0,25cm (placa analítica) MERCK e as fases móveis: acetato de etila/metanol 70:30,
acetato de etila/metanol 90:10, acetato de etila/metanol 95:05 e/ou metanol puro. As
placas cromatográficas foram reveladas com iodo ressublimado e os diferentes
valores de Rfs foram determinados.
Cromatografia em camada delgada preparativa usando placas analíticas e
fase móvel acetato de etila/metanol 95:05 foram realizadas quando necessária
purificação adicional de determinados produtos formados. Após a corrida, as placas
foram visualizadas em luz UV e o composto de interesse foi extraído da sílica com
acetato de etila.
Os prováveis metabólitos formados foram separados por flash cromatografia,
usando para fase estacionária Sílicagel 60 (VETEC) 0,063 - 0,200mm (70 – 230
mesh) e fase móvel acetato de etila/metanol 95:05, acetato de etila/metanol 70:30,
acetato de etila/metanol 50:50 e/ou acetato de etila. A eluição dos diferentes
produtos encontrados foi acompanhada por cromatografia em camada delgada
usando cromatofolhas de alumínio TCL 20x20cm sílica gel 60 F254 MERCK (placa
analítica), mesma fase móvel: acetato de etila/metanol 95:05 e revelação com iodo
ressublimado.
Os cromatogramas, revelando os tempos de retenção dos prováveis
metabólitos formados e de seu precursor, foram obtidos por análise em fase reversa
usando cromatógrafo Gilson. As condições para execução da análise foram: coluna
Lichrospher 100 RP-18 MERCK (250x4,6mm x 0,5 µ), bombas Gilson H1M, válvula
dosadora manual Rheodyne com capacidade de 20µL e detector UV em
comprimento de onda de 248nm. As análises foram realizadas em sistema isocrático
usando como solvente mistura de metanol/tampão (fosfato de potássio monobásico
0,02M) 65:35 e 30 minutos de corrida, ou em sistema gradiente com as fases móveis
metanol (solvente A) e mistura de metanol/tampão (fosfato de potássio monobásico
0,02M) 65:35 (solvente B), como especificado abaixo:
Tempo (min) Solvente A (%) Solvente B (%) 0 0 100
0 a 2 0 a 100 100 a 0 2 a 4 100 a 0 0 a 100 4 a 25 0 100
As fases móveis para cromatografia líquida de alta eficiência foram
preparadas com solventes grau HPLC e água ultrapura (aparelho Millipore
Simplicity). Antes do uso, foram filtradas em membranas Millipore de 0,45µm e
47mm de diâmetro e degaseificadas em banho de ultrassom Thornton T7 por 15
minutos.
5.1.2 Técnicas espectroscópicas
As análises espectrométricas de massas foram realizadas em
espectrofotômetro de massas acoplado a cromatógrafo líquido Shimadzu AD Vp
com analizador espectrofotométrico de massas quadrupolo Micromass (UK)
Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H (500 MHz) foram
obtidos em aparelho Bruker DRX 400 Advance NMR, tendo as amostras dissolvidas
em metanol deuterado. Os valores de deslocamento químico foram referidos em
ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hz.
5.1.3 Técnicas microbiológicas
Procedência dos microrganismos:
ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; NRRL: Northern
Regional Research Laboratories, Peoria, IL, USA.
Meios de cultura:
Ágar batata (I):
- 39g de ágar batata (MERCK)
- 1 litro de água destilada
Meio líquido PDSM (II):
- 5g peptona bacteriológica (Synth)
- 20g dextrose (Synth)
- 5g lecitina de soja (Inlab)
- 5g fosfato de potássio monobásico (Synth)
- 5g de cloreto de sódio (Vetec)
- 3g extrato de levedura (Vetec)
- 1 litro de água destilada
Ambos os meios foram esterilizados antes do uso em autoclave, na
temperatura de 121°C por 15 minutos.
Os fungos filamentosos utilizados na bioconversão do substrato LASSBio 581,
foram mantidos em ágar batata inclinado na temperatura de 2-4°C e repicados
periodicamente com solução de glicerol a 25%. Sub-culturas das cepas
selecionadas, foram preparadas antes de cada experimento, através do repique de
culturas estocadas (com solução de glicerol 25% e ágar batata) e manutenção a
27°C por 7 dias.
5.2 Procedimentos experimentais
5.2.1 1-[1-(4-clorofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil]-4-fenilhexaidro
piperazina
Em um erlenmeyer de 500mL foram colocados 10g de 4-cloro-anilina e
150mL de ácido clorídrico 37% (densidade 1,19g/mL), ajustando a temperatura para
5ºC em banho de gelo. Com o auxílio de um balão de adição, 6g de nitrito de sódio
dissolvido em 75mL de água destilada foi adicionado lentamente, mantendo
temperatura de 5ºC e sob agitação mecânica, à solução contida no erlenmeyer. Em
seguida, a solução formada pelas etapas anteriores foi adicionada lentamente e em
temperatura ambiente, também com o auxílio de um balão de adição, à um
erlenmeyer contendo 75g de acetato de sódio, 75mL de água e 5,24g de azida de
sódio (agitação mecânica por 15 minutos).
Figura 73. Representação esquemática da primeira etapa da síntese do LASSBio 581.
O composto formado pelas reações descritas anteriormente foi separado em
funil de separação, pela extração com diclorometano e recolhimento da porção
inferior de coloração amarelada. Após separação, o produto recolhido foi filtrado
(filtração simples em funil de vidro e algodão), rotaevaporado e seco sob ar
comprimido por aproximadamente 4 horas. O balão contendo o produto seco foi
então, conectado a um condensador (sistema livre de trocas de ar tanto dentro do
balão como entre o ar externo e interno). Com auxílio de uma seringa foi adicionado
ao balão 10mL de álcool propargílico, destilado sob pressão reduzida e
aproximadamente 90mL de tolueno anidro, mantendo a mistura sob refluxo por 18
horas. Terminado o tempo de refluxo, o produto formado foi rotaevaporado para sua
concentração.
NH2
Cl
NaNO2, HCl, H2O
NaN3, H2O, NaOAc
N3
Cl
Figura 74. Representação esquemática da segunda etapa da síntese do LASSBio 581.
Em um funil de separação, foram colocados 40mL de ácido clorídrico 10%,
pequena quantidade de água destilada e o produto formado anteriormente após
refluxo de 18 horas. O processo de extração procedeu-se com 4 porções de 30mL
de diclorometano e recolhimento das frações em recipiente contendo sulfato de
sódio anidro. O produto extraído foi posteriormente filtrado, seco em rotavapor e
agitado por quatro horas em capela com 56,68g de dióxido de manganês e 60mL de
diclorometano. O composto formado foi filtrado e o álcool propargílico que não
reagiu na etapa anterior foi separado por cromatografia em coluna usando
diclorometano como fase móvel.
Figura 75. Representação esquemática da terceira etapa da síntese do LASSBio 581.
N3
Cl
+
CH
OHTolueno
refluxo 18 horas
Cl
NN
NOH
Cl
NN
N
OH
+
Cl
NN
NOH
Cl
NN
N
OH
+CH2Cl2, MnO2
Cl
NN
NCHO
Em recipiente apropriado para câmara de hidrogenação foram colocados
3,850g do produto obtido por reação com dióxido de manganês, 6,9g de N-
fenilpiperazina, aproximadamente 10mL de metanol anidro (quantidade suficiente
para solubilização) e 350mg de Pd/C 10%. Reação foi realizada em câmara de
hidrogenação na pressão de 60 psi e com supervisão a cada 2 horas durante 12
horas para o controle da pressão. O produto obtido foi purificado por cromatografia
de adsorção em coluna de sílica gel como fase estacionária e n-hexano-
diclorometano (em proporções crescentes de diclorometano) como fase móvel.
Figura 76. Representação esquemática da última etapa da síntese do LASSBio 581
5.2.2 Adaptação das cepas ao meio de cultura
As condições de crescimento, manutenção e manuseio das culturas dos
fungos filamentosos ensaiados, foram estudadas visando a padronização do
processo biotecnológico.
Para manutenção e repique dos microrganismos, ágar batata demonstrou-se
adequado para crescimento homogêneo e formação de esporos viáveis. Com
relação à formação de esporos, o período de sete dias mostrou-se eficaz na
produção em quantidade suficiente para crescimento em meio líquido.
Cl
NN
NCHO
+
NH
N
H2, Pd/C 10%, MeOH
60psi, 12 horas
Cl
NN
N N
N
A escolha do meio líquido de inoculação foi realizada por comparação entre
os diferentes meios líquidos Sabouraud (Difco) e PDSM, assim como pela formação
de pellets e halo ao redor da parede do recipiente.
5.2.3. Triagem
Foram realizados experimentos de triagem (screening) para escolha das
cepas que fossem capazes de biotransformar o substrato LASSBio 581 com
produção de uma maior variedade de derivados ou formação de alguns deles em
maior quantidade. Absídia blakesleeana ATCC 10148b, Absídia blakesleeana ATCC
22617, Aspergillus ochraceus ATCC 1009, Beauveria bassiana ATCC 7159,
Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunninghamella echinulata ATCC 9245,
Cunninghamella elegans ATCC 36112, Mortierella isabelina NRRL 1757, Mucor
griseocyanus ATCC 1207a e Rhizopus arrhizus ATCC 11145 foram ensaiados.
Inicialmente, foram feitas sub-culturas destes dez fungos filamentosos em
ágar batata inclinado, através de repique de culturas estocadas com solução de
glicerol a 25% e manutenção por sete dias a 27ºC (câmara climática BOD Fanem
345 Micronal). Subseqüente ao período de sete dias, erlenmeyers com capacidade
de 250mL e gargalo largo, contendo 100mL de meio líquido PDSM (II), foram
inoculados com uma gota da suspensão de esporos (preparados com solução de
glicerol a 25%) destes crescimentos de sete dias, e mantidos em agitação de
200rpm e 27ºC (shaker Tecnal modelo TE-420).
Sessenta e cinco horas após a inoculação do meio PDSM, foram adicionados
50mg do substrato LASSbio 581, e manteve-se a agitação de 200rpm e 27ºC por 96
horas. Alíquotas em 24, 48, 72 e 96 horas foram retiradas do meio reacional em
duplicata e assepticamente em fluxo laminar, usando pipetas de Paster lavadas com
solução de hipoclorito de sódio 2,5%. Os erpendorfs contendo as amostras
coletadas foram centrifugados em micro centrífuga Fanem modelo 243, e o
sobrenadadante de incubação foi analisado por cromatografia líquida de alta
eficiência em sistema isocrático e gradiente (descrições da análise seção 5.1.1).
Para elaboração das cinéticas de biotransformação, as áreas dos picos dos
diferentes derivados foram relacionadas ao tempo de incubação assim como a
diminuição do substrato foi acompanhada para estabelecer o fim do processo de
bioconversão.
5.2.4 Desenvolvimento e validação de metodologias para o
monitoramento de bioconversões
5.2.4.1 Incubação
A formação dos produtos funcionalizados e o desaparecimento do substrato
biotransformado, foi acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas (ou ainda em 120, 144, 168 e 190
horas) alíquotas foram retiradas do meio reacional em duplicata e assepticamente
em fluxo laminar, com auxílio de pipetas de Paster lavadas em solução de hipoclorito
de sódio 2,5%. Os erpendorfs contendo as amostras coletadas, foram centrifugados
em micro centrífuga Fanem modelo 243, e o sobrenadadante de incubação foi
transferido para outro erpendorf para posterior análise.
O sobrenadante obtido por micro centrifugação foi agitado com acetato de
etila e a fração orgânica foi coletada para análise por CCD. Várias fases móveis
foram testadas segundo especificado na seção 5.1.1.
Para CLAE, o sobrenadante coletado foi injetado diretamente no cromatógrafo
e analisado em sistema gradiente ou isocrático (seção 5.1.1.).
5.2.4.2 Separação e purificação dos produtos formados
A separação e purificação dos produtos formados, foi realizada por
cromatografia de adsorção em coluna segundo determinado na seção 5.1.1. Para
acompanhamento da separação dos compostos encontrados, as frações coletadas
foram analisadas por cromatografia em camada delgada (cromatofolhas de alumínio
TCL 20x20cm Sílica gel 60 F254 MERCK) usando como fase móvel acetato de
etila/metanol 95:05 e iodo ressublimado como revelador.
Cromatografia em camada delgada preparativa (placas analíticas) foi
realizada para purificação adicional de determinados produtos. A fase móvel
utilizada foi acetato de etila/metanol 95:05. Utilização da luz UV e a extração dos
compostos de interesse, foi procedida conforme seção 5.1.1.
Recristalização também foi empregada para separação e purificação dos
compostos formados, como método único ou adicional à cromatografia de adsorção.
Solventes de diferentes polaridades como ciclohexano, diclorometano, acetato de
etila, metanol e água foram utilizados na separação destes diversos produtos. Os
compostos solúveis nestes diferentes solventes (ou na mistura de alguns deles
quando necessário) forma retirados com auxílio de pipeta de paster e analisados por
cromatografia camada delgada (cromatofolhas de alumínio TCL 20x20cm Sílica gel
60 F254 MERCK, fase móvel acetato de etila/metanol 95:05 e revelador iodo
ressublimado) e cromatografia líquida de alta eficiência (método isocrático ou
gradiente conforme seção 5.1.1).
5.2.5 Extração dos produtos formados
A fração aquosa obtida a partir da filtração do micélio fúngico foi extraída três
vezes com 250mL de acetato de etila P.A. ou grau HPLC (total de 750mL) em funil
de separação de 2000mL. A cada porção de 250mL de acetato de etila adicionada,
agitava-se vigorosamente e coletava-se a fração orgânica em recipiente contendo
sulfato de magnésio anidro. A fração orgânica coletada foi filtrada a vácuo em funil
de vidro sinterizado e seca em rotavapor para posterior separação e purificação dos
produtos formados.
5.2.6 Isolamento e Purificação
Em uma haste de metal foi colocado um suporte para preparação da coluna
cromatográfica. Ao suporte, inicialmente colocou-se uma pequena camada de lã de
vidro e sobre esta uma camada de areia. Em um béquer, sílica gel para
cromatografia em coluna, foi dissolvida na fase móvel (acetato de etila/metanol
95:05, acetato de etila/metanol 70:30 e/ou acetato de etila/metanol 50:50) e
transferida para o suporte com auxílio de um funil de vidro. A sílica transferida foi
compactada com vácuo até a formação de uma coluna com 27cm de comprimento
(diâmetro foi de 2cm).
Como o extrato bruto não foi solúvel na fase móvel, adicionou-se pequena
quantidade de Sílica para transformá-lo em um pó fino. O pó fino formado foi então
colocado sobre a coluna de sílica formando uma camada reta, e sobre esta uma
pequena camada de areia. A fase móvel foi adicionada devagar para evitar a
formação de reentrâncias, e de maneira contínua com auxílio de um funil de
separação.
As frações foram coletadas em tubos de ensaio e o processo de separação e
extração foi acompanhado por CCD (condições especificadas na seção 5.1.1.). Pela
análise das placas cromatográficas, os tubos de ensaio contendo as frações de
mesmo Rfs foram misturados e secas em rotavapor.
Recristalização também mostrou-se eficaz para isolamento e purificação dos
diferentes produtos formados (em substituição ao processo de cromatografia de
adsorção) tendo sido realizado conforme descrito em 5.2.4.2.
5.2.7 Ensaios em escala semi-preparativa
Para os ensaios em escala semi-preparativa, erlenmeyers de 250mL
contendo 100mL de meio líquido PDSM (II) foram inoculados com uma gota da
suspensão de esporos (formada a partir de crescimento recente de sete dias à
temperatuta de 27ºC) e mantidos em agitação de 200rpm e 27ºC. Para solubilização
do substrato LASSBio 581 etanol P.A. e dimetilformamida P.A. foram testados.
LASSBio 581 mostrou-se parcialmente solúvel em etanol e totalmente solúvel em
dimetilformamida. Diante da solubilidade exposta, o substrato LASSBio 581
solubilizado em dimetilformamida ou na mistura de dimetilformamida/etanol 1:1 foi
adicionada aos erlenmyers inoculados, após sessenta e cinco horas, mantendo o
tempo de inoculação por até 168 horas (tempo final da incubação dependia da
escolha dos produtos a serem obtidos).
Terminado o tempo de incubação, a mistura reacional foi filtrada em funil de
buchner usando gaze. A fração aquosa obtida foi supersaturada com cloreto de
sódio, filtrada a vácuo em camada de celite para retirada do excesso de cloreto de
sódio e extraída três vezes com acetato de etila. Sulfato de magnésio anidro, usado
para eliminar possível água que estivesse misturada à porção orgânica, foi separado
por filtração em funil de vidro sinterizado. O solvente da fração orgânica foi
evaporado em rotavapor e os produtos sintetizados foram separados por flash
cromatografia, cromatografia em camada delgada preparativa e/ou por
recristalização, acompanhada por cromatografia em camada delgada.
Para extração de prováveis metabólitos que tenham ficado retidos na massa
fúngica, esta massa amorfa foi agitada com acetona por aproximadamente duas
horas. Os produtos detectados após este processo de extração foram então
separados e purificados por recristalização.
5.2.7.1 1º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 72h)
Para um primeiro ensaio em escala semi-preparativa, nove erlenmeyers foram
inoculados com uma suspensão de esporos de Cunninghamella echinulata ATCC
9244. Após sessenta e cinco horas, foram adicionados 50 mg do substrato LASSBio
581 solubilizado em mistura de dimetilformamida (DMF) e etanol na proporção de
1:1, à cada um dos nove erlenmeyers. O tempo de incubação, após a adição do
substrato foi de 72 horas com retirada de alíquotas para monitoramento da reação a
cada 24 horas. Após as 72 horas, a mistura reacional foi filtrada, e o filtrado obtido
foi supersaturado com cloreto de sódio. O peso do extrato bruto obtido foi de 334mg.
Após extração do filtrado, com acetato de etila, os produtos formados foram
separados e purificados por cromatografia de adsorção em coluna, usando como
fase estacionária Sílica gel e acetato de etila/metanol 95:05 como fase móvel
(conforme descrito na seção 5.1.1). Foram observados 14 manchas com valores de
Rfs diferentes. Para purificação adicional, foi realizada cromatografia em camada
delgada preparativa (placas analíticas) conforme especificado na seção 5.1.1. O
peso da soma das frações separadas da fração aquosa foi de 144,7mg, obtendo um
rendimento de 32%.
5.2.7.2 2º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida, tempo de reação: 96h)
Em um segundo ensaio semi-preparativo, dez erlenmeyers foram inoculados
com esporos de Cunninghamella echinulata ATCC 9244. Após sessenta e cinco
horas, foram adicionados 30mg do substrato LASSBio 581 solubilizado em
dimetilformamida, a cada um dos nove erlenmeyers. O tempo de incubação, após a
adição do substrato foi de 96 horas com retirada de alíquotas para monitoramento
da reação a cada 24 horas. Ao final do tempo de incubação, a mistura reacional foi
filtrada e o filtrado obtido foi supersaturado com cloreto de sódio. O peso do extrato
bruto obtido foi 185 mg.
Seguida à extração do filtrado, com acetato de etila, os produtos sintetizados
foram separados e purificados por cromatografia de adsorção em coluna, usando
Sílica gel como fase estacionária e acetato de etila/metanol 95:05 como fase móvel.
Foram observados 15 manchas com valores de Rfs diferentes. O peso da soma das
frações separadas da fração aquosa foi de 62,1mg, obtendo um rendimento de
20,7%.
5.2.7.3 3º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 190h)
Um terceiro ensaio em escala semi-preparativa, foi realizado usando dez
erlenmeyers e inoculação com suspensão de esporos de Cunninghamella echinulata
ATCC 9244. Após sessenta e cinco horas, foram adicionados a cada um dos dez
erlenmeyers aproximadamente 42mg do substrato LASSBio 581 solubilizado em
mistura de dimetilformamida e etanol na proporção de 1:1. O tempo de incubação,
após a adição do substrato foi de 190 horas com retirada de alíquotas para
monitoramento da reação a cada 24 horas. Após 190 horas, a mistura reacional foi
filtrada e o filtrado obtido foi supersaturado com cloreto de sódio. O peso do extrato
bruto obtido foi 601,6mg.
Após extração do filtrado, com acetato de etila, os produtos sintetizados foram
separados e purificados por cromatografia de adsorção em coluna, usando como
fase estacionária Sílica gel e acetato de etila/metanol 95:05 como fase móvel.
Observou-se 17 manchas com valores de Rfs diferentes. Quando necessário
purificação adicional, realizou-se processo de recristalização. O peso da soma das
frações separadas da fração aquosa foi de 49,9mg, obtendo um rendimento de
11,8%.
A extração da biomassa com acetona e agitação mecânica por
aproximadamente duas horas também foi realizada na busca de prováveis
metabólitos presentes no meio intracelular fúngico. Após extração, os produtos
encontrados foram separados e purificados por recristalização.
5.2.7.4 4º Ensaio (Cepa: Mortierella isabelina NRRL 1757, solvente:
dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 168h)
Em um quarto ensaio semi-preparativo, nove erlenmeyers foram inoculados
com suspensão de esporos de Mortierella isabelina NRRL 1757. Após sessenta e
cinco horas, foram adicionados 50mg do substrato LASSBio 581 solubilizado em
mistura de dimetilformamida e etanol na proporção de 1:1 a cada um dos
erlenmeyers. O tempo de incubação, após a adição do substrato foi de 168 horas
com retirada de alíquotas para monitoramento da reação a cada 24 horas. Após 168
horas, a mistura reacional foi filtrada e o filtrado obtido foi supersaturado com cloreto
de sódio. O peso do extrato bruto obtido foi 319,1mg.
Após extração do filtrado, com acetato de etila, os produtos sintetizados foram
separados e purificados por cromatografia de adsorção em coluna, usando como
fase estacionária Sílica gel e acetato de etila/metanol em diferentes proporções
(acetato de etila/metanol 95:05, acetato de etila/metanol 70:30, acetato de
etila/metanol 50:50, metanol puro) como fase móvel. Observou-se 9 manchas com
valores de Rfs diferentes. Quando necessário, para purificação adicional, foi
realizado processo de recristalização. O peso da soma das frações separadas da
fração aquosa foi de 240,42mg, obtendo um rendimento de 48,084%.
A micélio fúngico separado da fração aquosa foi tratado com acetona
(agitação mecânica por aproximadamente duas horas), na busca de prováveis
produtos funcionalizados que estivessem no meio intracelular fúngico. Após extração
com acetona, os produtos encontrados foram separados e purificados por
recristalização.
5.2.7.5 5º Ensaio (Cepa: Cunninghamella echinulata ATCC 9244,
solvente: dimetilformamida/etanol 1:1, tempo de reação: 96h)
Quinto ensaio em escala semi-preparativa foi relizado, utilizando dez
erlenmeyers inoculados com suspensão de esporos de Cunninghamella echinulata
ATCC 9244. Após sessenta e cinco horas, foram adicionados a cada erlenmeyer
50mg do substrato LASSBio 581 solubilizado em mistura de dimetilformamida e
etanol na proporção de 1:1. O tempo de incubação, após a adição do substrato foi
de 96 horas com retirada de alíquotas para monitoramento da reação a cada 24
horas. Após 96 horas, a mistura reacional foi filtrada e o filtrado obtido foi
supersaturado com cloreto de sódio.
Após extração do filtrado, com acetato de etila, os produtos sintetizados foram
separados e purificados por recristalização. Observou-se 12 manchas com valores
de rfs diferentes.
A biomassa separada da fração aquosa foi tratada com acetona (agitação
mecânica por aproximadamente duas horas) e após extração, os produtos
encontrados foram separados e purificados também por recristalização.
Tabela 6. Diferentes parâmetros avaliados entre quatro dos ensaios realizados em escala semi preparativa Incubação
(horas) Número
de manchas
(Rfs)
Peso das
frações (mg)
Substrato (mg)
/Rendimento (%)
Solventes Peso extrato bruto (mg)
Cepa
1º Ensaio
72 14 144,7 450 (32) DMF + etanol (1:1)
334 C. echinulata ATCC 9244
2º Ensaio
96 15 62,1 300 (20,7) DMF 185 C. echinulata ATCC 9244
3º Ensaio
190 17 49,9 ≈ 420 (11,8) DMF + etanol (1:1)
601,6 C. echinulata ATCC 9244
4º Ensaio
168 9 240,42 450 (48,084) DMF + etanol (1:1)
319,1 M. isabellina NRRL 1757
5.2.8 Isolamento dos metabólitos
5.2.8.1 LaBioCon 1
N
N
N
N
N
Cl
Mortierella isabelina NRRL 1757 N
N
N
N
N
Cl
O
O
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
DMF/Et 1:1, 168h
Após incubação do substrato LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL
1757, conforme descrito na seção 5.2.7.4, a massa fúngica separada do meio
reacional foi colocada em agitação magnético com 200mL de acetona por
aproximadamente duas horas. A fração cetônica obtida foi evaporada em rotavapor
e o LaBiocon 1 foi separado dos demais produtos formados por recristalização. No
processo de recristalização, inicialmente a fração cetônica foi dividida em duas
partes, uma solúvel em metanol e outra insolúvel. A porção solúvel em metanol foi
ainda dividida em duas outras porções, uma solúvel em ciclohexano e outra
insolúvel em ciclohexano. Da porção insolúvel em ciclohexano parte foi solúvel em
acetato de etila e parte não. A partir da fração cetônica solúvel em metanol, insolúvel
em ciclohexano e solúvel em acetato de etila obteve-se o produto diglicosilado
LaBiocon 1 que apresentou tempo de retenção de 5,24 (análise por cromatografia
líquida de alta eficiência usando como fase móvel: metanol e metanol/tampão 65:35
em sistema gradiente, condições da análise conforme descrito em 5.1.1) e
quantidade de 4,3mg na forma de cristais amarelados. O percentual de formação do
derivado LaBiocon 1 em relação aos demais compostos de estruturas preditas foi de
aproximadamente 32,35%.
RMN 1H (500MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 1,28-1,32 (4H, m, H8 e H12); 3,21-3,25 (4H, m,
H9 e H11); 3,29(2H, s, H6); 3,49-3,65 (2H, m, H21 e H25); 3,78 (2H, s, H34); 3,80 (2H, s,
H32); 3,99 (1H, s, H22); 4,20 (1H, s, H15); 4,23 (1H, s, H14); 4,27 (1H, m, H18); 4,28
(1H, m, H26); 4,35 (8H, s, 7H-OH e 1H-H19); 5,11(1H, s, H17); 5,34(1H, s, H24); 6,71-
6,73 (2H, d, J=7,2 Hz, H2" e H6”); 6,89- 6,91 (2H, d, J=7,2 Hz, H3” e H5”); 7,63 (2H, d,
J=7,0 Hz, H3’ e H5’); 7,89 (2H, d, J=7,2 Hz, H2’ e H6’); 8,71 (1H, s, H5).
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 352,58 [M+]; 680,6 [M+ + C12H21O10]
5.2.8.2 LaBioCon 9
N
N
N
N
N
Cl
Mortierella isabelina NRRL 1757 N
N
N
N
N
Cl
OH
DMF/Et 1:1, 168h
Para obtenção do produto LaBiocon 9, procedeu-se incubação do substrato
LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757, conforme descrito na seção
5.2.7.4. O tratamento da massa fúngica com acetona, desenvolveu-se conforme
descrito para LaBiocon 1 na seção 5.2.8.1. No processo de recristalização,
inicialmente a fração cetônica obtida foi dividida em duas partes, uma solúvel em
metanol e outra insolúvel. A porção solúvel em metanol foi ainda dividida em duas
outras porções, uma solúvel em ciclohexano e outra insolúvel em ciclohexano. A
porção insolúvel em ciclohexano foi parte insolúvel em acetato de etila e parte
solúvel. A partir da fração cetônica solúvel em metanol, insolúvel em ciclohexano e
insolúvel em acetato de etila obteve-se o produto hidroxilado LaBiocon 9 que
apresentou tempo de retenção de 5,21 (análise por cromatografia líquida de alta
eficiência usando como fase móvel: metanol e metanol/tampão 65:35 em sistema
gradiente, condições da análise conforme descrito em 5.1.1) e forma de cristais
brancos. O percentual de formação do derivado LaBiocon 9 em relação aos demais
compostos de estruturas preditas foi de aproximadamente 28,97%.
RMN 1H (500 MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 1,27-1,29 (4H, m, H8 e H12); 3,21-3,25 (4H, m,
H9 e H11); 3,29 (2H, s, H6); 4,29 (1H, s, OH); 6,71-6,72 (2H, d, J=7,0 Hz, H2” e H6”);
6,88-6,90 (2H, d, J=7,0 Hz, H3” e H5”); 7,60-7,62 (2H, d, J=7,0 Hz, H3’ e H5’); 7,89-
7,90 (2H, d, J=7,0 Hz, H2’ e H6’); 8,70 (1H, s, H5).
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 352,58 [M+]; 370,41 [M+ + OH]
5.2.8.3 LaBioCon 10
N
N
N
N
N
Cl
Cuninghamella echinulata ATCC 9244 N
N
N
N
N
Cl
OH
DMF/Et 1:1, 72h
A incubação do substrato LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata
ATCC 9244, filtração, extração da fração aquosa (meio reacional), separação e
purificação dos produtos formados, conforme descrito na seção 5.2.7.1, foi realizada
para obtenção do LaBiocon 10. Após separação dos produtos formados, os
diferentes compostos foram secos em rotavapor e solubilizados em solvente
adequado. O produto hidroxilado LaBiocon 10 foi insolúvel em metanol e solúvel em
acetato de etila. Foram obtidas 18mg deste composto na forma de pó branco e
observou-se tempo de retenção de 3,03 (análise por cromatografia líquida de alta
eficiência usando como fase móvel: metanol/tampão 65:35 em sistema isocrático,
condições da análise conforme descrito em 5.1.1). O percentual de formação do
derivado LaBiocon 10 em relação aos demais compostos de estruturas preditas foi
de aproximadamente 7,88%.
RMN 1H (500 MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 2,67-2,70 (4H, m, H8 e H12); 3,12-3,15 (4H, m,
H9 e H11); 3,74 (1H, s, OH); 6,76-6,78 (1H, d, J=8,0 Hz, H4”); 6,88-6,90 (2H, d, J=8,0
Hz, H3’ e H5’); 7,15-7,17 (2H, d, J=8,0 Hz, H3” e H5”); 7,49-7,51 (2H, d, J=8,0 Hz, H2”
e H6”); 7,78-7,80 (2H, d, J=8,0 Hz, H2’ e H6’); 8,44 (1H, s, H5).
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 354,3 [M+]; 370,4 [M+ + 17]
5.2.8.4 LaBioCon 12
N
N
N
N
N
Cl
Cunninghamella echinulata ATCC 9244 N
N
N
N
N
OH
OH
OH
DMF, 72h
O produto dihidroxilado LaBiocon 12, foi obtido pela incubação do substrato
LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244, filtração, extração da
fração aquosa, separação e purificação dos produtos formados, conforme seção
5.2.7.1. Após separação dos produtos formados, o composto LaBiocon 12 em
mistura com outro produto foi seco em rotavapor e solubilizado em metanol. Para
separação dos dois compostos, purificação adicional foi realizada por cromatografia
em camada delgada preparativa segundo seção 5.1.1. Foram obtidas 18mg na
forma de cristais brancos e o percentual de formação deste derivado em relação aos
demais compostos de estruturas preditas foi de aproximadamente 2,03%.
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 352,4 [M+]; 386,3 [M+ + 34]
5.2.8.5 LaBioCon 13
N
N
N
N
N
Cl
Cunninghamella echinulata ATCC 9244
DMF/Et 1:1, 72h
O
OH
OH
OH
OH
O
N
N
N
N
N
Cl
O produto LaBiocon 13 foi obtido pela incubação do substrato LASSBio 581
com Cunninghamella echinulata ATCC 9244, filtração, extração da fração aquosa
(meio reacional), separação e purificação dos produtos formados, conforme descrito
na seção 5.2.7.1. Após separação dos produtos formados, LaBiocon 13 foi seco em
rotavapor e solubilizado em acetato de etila. Este composto glicosilado foi insolúvel
em metanol e apresentou tempo de retenção de 7,21 (análise por cromatografia
líquida de alta eficiência usando como fase móvel: metanol/tampão 65:35 em
sistema isocrático, condições da análise conforme descrito em 5.1.1). Foram obtidas
12mg deste composto na forma de pó branco e percentual de formação de
aproximadamente 14,63%.
RMN 1H (500 MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 2,74-2,77 (4H, m, H8 e H12); 3,19-3,22 (4H, m,
H9 e H11); 3,30 (1H, s, H6); 3,62 (2H, m, H9’ e H11’); 3,75 (1H, m, H10’); 4,02 (1H, m,
H12’); 4,08 e 4,38 (2H, 2s, H14’); 4,58 (4H, m, 4OH); 5,39 (1H, t, H8’); 6,83 (1H, d,
J=8,0 Hz, H4”); 6,95 e 6,97 (2H, d, J=8,0 Hz, H3’ e H5’); 7,20-7,22 (2H, d, J=8,0 Hz,
H2” e H6”); 7,59-7,61 (2H, d, J=8,0 Hz, H3” e H5” ); 7,87 e 7,89 (2H, d, J=8,0 Hz, H2’ e
H6’); 8,51 (1H, s, H5).
5.2.8.6 LaBioCon 19
N
N
N
N
N
Cl
Cunninghamella echinulata ATCC 9244N
N
N
N
N
Cl
OH
DMF/Et 1:1, 96h
O produto LaBiocon 19 foi obtido pela incubação do substrato LASSBio 581
com Cunninghamella echinulata ATCC 9244, filtração, extração da fração aquosa,
separação e purificação dos produtos formados, conforme descrito na seção
5.2.7.5. No processo de recristalização, a fração orgânica seco em rotavapor foi
parte solubilizada em metanol e parte solubilizada em ciclohexano. A porção solúvel
em metanol e insolúvel em acetato de etila corresponde ao LaBiocon 19. Este
composto foi obtida na forma de um óleo marrom, com percentual de formação em
relação aos demais compostos de estruturas preditas de aproximadamente 62,5%.
RMN 1H (500 MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 1,28-1,32 (4H, m, H8 e H12); 3,00-3,21 (4H, m,
H9 e H11); 3,29 (2H, s, H6); 4,12 (1H, s, OH); 6,70-6,72 (2H, d, J=8,0 Hz, H2” e H6”);
6,87-6,89 (2H, d, J=8,0 Hz, H3” e H5”); 7,60-7,62 (2H, d, J=8,0 Hz, H3’ e H5’); 7,87-
7,89 (2H, d, J=8,0 Hz, H2’ e H6’); 8,58 (1H, s, H5);
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 354,2 [M+]; 370,2 [M+ + 17].
5.2.8.7 LaBioCon 22
N
N
N
N
N
Cl
Cunninghamella echinulata ATCC 9244N
N
N
N
N
Cl
OHOH
DMF/Et 1:1, 96h
O produto LaBiocon 22 foi obtido pela incubação do substrato LASSBio 581
com Cunninghamella echinulata ATCC 9244, filtração e extração da biomassa com
acetona conforme descrito em 5.2.7.5. No processo de recristalização, a fração
cetônica seca em rotavapor foi parte solubilizada em metanol e parte solubilizada em
acetato de etila. A porção solúvel em acetato de etila corresponde ao LaBiocon 22
que se apresentou amorfo com tempo de retenção de 5,07 (análise por
cromatografia líquida de alta eficiência usando como fase móvel: metanol e
metanol/tampão 65:35 em sistema gradiente, condições da análise conforme
descrito em 5.1.1). O percentual de formação do LaBioCon 22 em relação aos
demais derivados de estruturas preditas foi de aproximadamente 7,56%.
RMN 1H (500 MHz) MeOH-d4 (δ-ppm): 2,26 (2H, s, 2OH); 2,93-3,20 (2H, 2s, H11);
2,77-3,11 (2H, 2s, H12); 4,04 (1H, s , H6); 4,84 (1H, s, H8); 5,34 (1H, m, H9); 6,70-6,72
(2H, d, J=8,0 Hz, H3” e H5”); 6,86-6,88 (2H, d, J=8,0 Hz, H2” e H6”); 7,60-7,62 (2H, d,
J=8,0 Hz, H3’ e H5’); 7,87-7,89(2H, d, J=8,0 Hz, H2’ e H6’); 8,55 (1H, s, H5);
MS (100 a 700 Daltons, MeOH):
m/z= 354,2 [M+]; 370,2 [M+ + 17]; 386,2 [M+ + 34]
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABEL, Anthony M.; C. A. J.; DAVIS, J. Alf; PAYLOR, Michael. The synthesis of buprenorphine intermediates by regioselective microbial N- and O-demethylation reactions using Cunninghamella echinulata NRRL 1384. Enzyme and Microbial Technology, v.33, p.743-748, 2003. ABOURASHED, E. A.; CLARK, A. M.; HUFFORD, C. D. Microbial models of mammalian metabolism of xenobiotics: An Updated Review. Current Medicinal Chemistry, v.6, p.359-374, 1999. ALEXANDRE, Vanessa; LADRIL, S.; MAURS, Michèle; AZERAD, Robert. Microbial models of animal drug metabolism Part 5: Microbial preparation of human hydroxylated metabolites of irbesartan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.29, p.173-179, 2004. AZERAD, R. Application of biocatalysts in organic synthesis. Bull. Soc. Chim., v.132, p.71-51. 1995. AZERAD, R. Microbial Models for Drug Metabolism. Advances in Biochemical Engineering/Biotecnnology, v.63, p.169-218. 1999. BARREIRO, E. J.; SILVA, J. F. M. da; FRAGA, C. A. M. Noções básicas do metabolismo de fármacos. Química Nova, v.19, p.641-650, 1996. BORCHERT, H. H. Microbial models of mammal-bioconversion. Archiv der Pharmazie, v.324, p.401, 1991. BOSSCHE, H. V.; KOYMANS, L. Review Article Cytochromes P450 in fungi. Mycoses, v.41, p.32-38, 1998. BRINK, Hans. J. M. V. D.; GORCOM, Robert F. M. V.; HONDEL, Cees A. M. J. J. V. D.; PUNT, Peter J. Cytochrome P-450 Enzyme Systems in Fungi. Fungal Genetics and Biology, v.23, p.1-17, 1998. CARVALHO, C. C. C. R. de; FONSECA, M. M. R. da. Biotransformation of terpenes. Biotechnology Advances, p.1-9. 2005. CERNIGLIA, C. E.; CAMPBELL, W. L.; FREEMAN, J. P.; EVANS, F. E. Identification of a novel metabolite in phenanthrene metabolism by the fungus Cunninghamella elegans. Applied and Environmental Microbiology, v.55, p.2275-2279, 1989. CERNIGLIA, C. E.; FREEMAN, J. P.; MITCHUM, R. K. Glucuronide and sulfate conjugation in the fungal metabolism of aromatic hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology, v.43, p.1070-1075, 1982. DÉCOR, Anne; BELLOCQ, Delphine; THOISON, Odile; LEKIEFFRE, Nicolas; CHIARONI, Angèle; OUAZZANI, Jamal; CRESTEIL, Thierry; GUÉRITTE, Françoise;
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1. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 10148b no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
5
10m
Volts
0 10 Minutos
*II
IV
DM
F
XIII
X
IV
XVI
I
c:\gilson\farma\farma.101\vo121fr.gdt : Detetor UV/VIS : VOM 2 72h: Inj. Number: 4
Metanol Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
grad
ient
e
2. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Absídia blakeslceana ATCC 22617 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mVo
lts
0 10Minutos
IV
DM
F X
V
LA
SSB
io 5
81
c:\gilson\farma\farma.088\vo112fr.gdt : Detetor UV/VIS : LASSBio 581 VOM8-72h: Inj. Number: 5
Metanol Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
grad
ient
e
3. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Aspergillus ochraceus ATCC 1009 no tempo de 72 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
5
mV
olts
0 10 Minutos
*II
IV
DM
F X
II X
IV
XVI
I
c:\gilson\farma\farma.097\vo120fr.gdt : Detetor UV/VIS : VOM 3 72h: Inj. Number: 4
Metanol Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
grad
ient
e
4. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Beauveria bassiana ATCC 7159 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
5
10
mV
olts
0 10 Minutos
IV
DM
F X
IV
XV
c:\gilson\farma\farma.102\vo122fr.gdt : Detetor UV/VIS : VOM 11 96h: Inj. Number: 6
Metanol
Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
grad
ient
e
5. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9245 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
Chromatogram
0
50
100%
Mob
ile P
hase
0
2
mV
olts
0 10Minutes
I IV
D
MF
XV
X
XA
X
XII
Metanol Metanol/Tampão 65:35
6. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 no tempo de 24 em sistema isocrático, e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
2
mV
olts
0 10 20
Minutos
II
IV
DM
F X
VI
XVI
I X
XII
XXI
II
XXV
II
LA
SS
Bio
581
c:\gilson\farma\farma.057\vo61cin.gdt : Detetor UV/VIS : VO6-3-48h: Inj. Number: 3
Metanol Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
Gra
dien
te
7. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella echinulata ATCC 9244 no tempo de 24 em sistema gradiente, e comprimento de onda 248nm.
Chromatogram
0
50
100%
Mob
ile P
hase
0
2m
Vol
ts
0Minutes
Zero
II
IV
DM
F
*XV
I X
VII
XX
II
Metanol Metanol/Tampão 65:35
8. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Cunninghamella elegans ATCC 36112 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
Chromatogram
0
50
100%
Mob
ile P
hase
0
2
mV
olts
0 10 20Minutes
Zero IV
D
MF
XV
X
VI
*XX
II
XX
VIII
*LA
SS
Bio
581
Metanol Metanol/Tampão 65:35
9. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mortierella isabelina NRRL 1757 no tempo de 96 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mV
olts
0 10Minutos
IV
DM
F
XII
XIII
X
VI
XXI
I X
XIII
XXI
V
*XXI
X
Esc
ala
Gra
dien
te
Metanol Metanol/Tampão 65:35
10. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Mucor griosyanus ATCC 1207a no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4
mVo
lts
0 10
M inutos
IV
DM
F X
V X
VII
*XXX
c:\gilson\farma\farma.088\vo112fr.gdt : Detetor UV/VIS : LASSBio 581 VOM5-48h: Inj. Number: 8
Metanol Metanol/Tampão 65:35
Esc
ala
grad
ient
e
11. Perfil cromatográfico do sobrenadante de incubação do LASSBio 581 com Rhizopus arrhizus ATCC 11145 no tempo de 48 horas e comprimento de onda 248nm.
Cromatograma
0
50
100
0
2
4 m
Vol
ts
0 10 Minutos
*I IV
DM
F
XX
IX
XXI
XX
II
Metanol Metanol/Tampão 65:35
153
12. Espectro de RMN 1H (500MHz) do derivado LaBioCon 1
154
13. Espectro de massa do derivado LaBioCon 1
155
14. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 9
156
15. Espectro de massa do derivado LaBioCon 9
157
16. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 10
158
17. Espectro de massa do derivado LaBioCon 10
23-Jul-2003 11:43:28V 06 fr 10 -12
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z0
100
%
AMOSTRA - 03 1 (1.035) Scan ES+ 2.03e8354.3
320.4
211.3158.256.5 73.4
321.4
356.3
357.3370.4
159
18. Espectro de massa do derivado LaBioCon 12
23-Jul-2003 12:17:10V 06 fr 13-14
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z0
100
%
AMOSTRA - 04 1 (1.035) Scan ES+ 2.15e8336.4
267.3
219.2
211.3197.3
241.3233.3
251.3
309.4
301.3
295.4268.3
279.4
311.4
325.4
370.4
352.4
337.4
351.4
372.3
386.3427.5413.5
388.4
160
19. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 13
161
20. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 19
LaBioCon 19
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2
8.61
7.92
7.90
7.65
6.92
6.90
6.75
4.87
3.33
3.32
3.17
3.02
1.31
162
21. Espectro de massa do derivado LaBioCon 19
163
22. Espectro de RMN 1H do composto LaBioCon 22
LaBioCon 22
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2
7.92
7.90
7.65
7.62
6.89
6.75 5.
385.
364.
87
4.04
3.34
3.33
2.80 2.
32 2.30
2.28
2.08 1.
621.
310.
93 0.92
0.90
164
23. Espectro de massa do derivado LaBioCon 22