Preparo de curvas analíticas

Universidade Federal de São João del Rei – Campus Alto Paraopeba

Prática 1

Preparo de Curvas Analíticas

Mayara Sousa – 0845057-9

Nádia Alves Nery Balbino – 0845062-5

Relatório apresentado à professora

Ana Maria de Oliveira como uma das

exigências da disciplina Análise Instrumental.

Ouro Branco

Março de 2011

Preparo de curvas analíticas

1. Resumo

A prática consistiu no preparo de curvas analíticas para a determinação da

concentração de amostras de permanganato de potássio. Para isso, realizou-se a

padronização externa, a padronização interna e o método da adição de padrão. Com a

equação da reta gerada pelo gráfico, C versus A, pode-se então calcular a concentração

da amostra desconhecida. Erros de cálculo no início da marcha analítica

comprometeram a realização dos métodos, limitando sua exatidão. Os resultados não

foram satisfatório, pois os métodos apresentaram limitações que ficaram ainda mais

agravadas devido aos erros.

2. Introdução

Os três tipos mais comuns de calibração de métodos analíticos incluem a

padronização externa, o método da adição de padrão e a padronização interna [1].

Para tanto se utilizam curvas de calibração, que representam a relação entre a

concentração dos padrões utilizados e/ou a absorbância ou a transmitância medidas. O

sucesso de uma curva de calibração depende da exatidão com que são conhecidas as

concentrações dos padrões e quão próxima a matriz dos padrões está da matriz das

amostras a serem analisadas [1,2].

O método de padronização externa utiliza soluções de concentrações conhecidas

preparadas a partir de um padrão, que são introduzidos no instrumento e assim registra-

se a resposta instrumental. Os dados resultantes são colocados em um gráfico com a

resposta do instrumento versus a concentração do analito. Utilizando este gráfico ou a

equação da curva resultante, pode-se calcular a concentração da substância na amostra

[1,3].

A padronização interna consiste na preparação das soluções padrão de

concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se adiciona a mesma

quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno. A amostra também é

analisada após a adição da mesma quantidade conhecida do padrão interno. A

substância usada como padrão interno deve ser similar à substância a ser quantificada,

não reagir com a substância ou outro componente da matriz e não fazer parte da

amostra. A calibração envolve colocar em um gráfico a razão entre o sinal do analito e o

sinal do padrão interno em função da concentração do analito nos padrões. Essa razão

para as amostras é então usada para obter as concentrações de analito a partir da curva

de calibração [1,3].

O método da adição padrão consiste na adição de quantidades conhecidas de uma

solução-padrão a alíquotas da amostra de mesmo volume. Cada solução é então diluída

a um volume fixo antes da medida. As medidas são realizadas com a amostra original e

depois com a amostra mais o padrão, após cada adição. Constrói-se uma curva analítica

relacionando as quantidades da substância adicionada às amostras com as respectivas

medidas obtidas [1,2].

3. Objetivos

Preparar curvas analíticas por diferentes métodos e comparar o resultado obtido

entre eles.

4. Materiais, Métodos e Instrumentos

4.1. Materiais e Reagentes

Permanganato de potássio Reagentes Analíticos Dinâmica;

Dicromato de potássio VETEC;

Permanganato de potássio para uso adulto e pediátrico FARMAX;

Balão volumétrico de 100 mL;

Balão volumétrico de 1L;

Espátula;

Béquer de 100 mL;

Bastão de vidro;

Pipetas volumétricas de 5 mL;

Pipeta graduada de 10 mL;

Pipeta automática de 200 µL Digipet;

4.2. Instrumentos:

Balança Analítica Bioprecisa FA-2104N;

Espectofotômetro Biospectro SP 220.

4.3. Metodologia

Inicialmente foram dissolvidos 0,1057 g de permanganato de potássio em 100 mL

de água destilada e em seguida foram transferidos para um balão volumétrico de 1L e

completou-se o volume com água destilada.

Padronização externa

Preparou-se 50 mL de uma solução estoque de permanganato de potássio 0,0006

mol L-1 calculou-se os volumes necessários desta solução para a preparação das

soluções padrões com concentrações de 1,2 × 10-5 mol L-1; 2,4 × 10-5; 4,8 × 10-5 mol L-1;

7,2 × 10-5 mol L-1 e 1,2 × 10-4 mol L-1 em balões volumétricos de 100 mL. Esses

volumes de solução estoque foram adicionados a cinco balões volumétricos de 100 mL

e aferidos com água. Em seguida, pipetou-se 4 mL da solução de permanganato de

potássio preparada inicialmente, que foram transferidas para um balão volumétrico de

100 mL completando-o com água para a diluição. Então a amostra foi comparada

visualmente para a identificação da concentração aproximada pela tonalidade. As

soluções padrões foram colocadas no fotômetro e então foi realizada a leitura das suas

transmitâncias e absorbâncias, a partir desses valores construiu-se uma curva analítica

A× Conc. Em seguida, a solução diluída de permanganato de potássio foi colocada no

fotômetro para a leitura da transmitância, e então, foi calculada a concentração da

amostra.

Padronização interna

Foram preparadas as mesmas soluções padrões da padronização externa, mas antes

da aferição das soluções adicionou-se a cada balão volumétrico 4 mL de solução de

dicromato de potássio 0,0005 mol L-1. As soluções estoque de permanganato e de

cromato foram colocadas separadamente no fotômetro e a leitura das absorbâncias e

transmitâncias foi feitas. Então se construiu a curva analítica com padronização interna.

Em seguida, pipetou-se 4 mL da solução de permanganato de potássio preparada

inicialmente, que foram transferidas para um balão volumétrico de 100 mL e adicionou-

se 8 mL de solução de dicromato de potássio 0,0005 mol L-1 e completou o volume com

água. A leitura foi realizada e determinou-se a concentração da amostra.

Adição de padrão

Transferiu-se 5 mL da solução de permanganato de potássio diluída para um

béquer e agitou. A absorbância foi medida no fotômetro no pico máximo de absorção do

permanganato de potássio. Transferiu-se novamente 5 mL da solução de permanganato

diluída para um béquer, adicionou-se 100 μL de solução estoque de permanganato de

potássio 0,0006 mol L-1. Agitou-se e leu-se no fotômetro a absorbância e transmitância a

525 nm. Repetiu-se esse mesmo procedimento com a adição de 150 μL e depois 200 μL

e fez-se as leituras. A concentração de permanganato na amostra foi determinada por

extrapolação da curva de adição de padrão.

5. Resultados e discussão

Com a metodologia utilizada os resultados podem ser descritos através de um

gráfico, ao qual temos uma curva analítica, representada por uma equação. Apresentam-

se os valores obtidos no espectrofotômetro em uma tabela e posteriormente será gerado

o gráfico conforme os dados experimentais.

Inicialmente foi preparada uma solução com uma amostra de permanganato de

potássio para uso adulto e pediátrico. A amostra foi pesada, e a massa medida foi:

Através de uma regra de três simples calculou-se o valor da massa em mols:

O volume da solução preparada foi:

A concentração da amostra foi obtida através da fórmula apresentada abaixo:

(1)

A partir dessa solução, prepararam-se as amostras em que os métodos analíticos

foram aplicados para a determinação da concentração.

5.1. Padronização externa

A padronização externa foi realizada para a determinação da concentração de

uma amostra de permanganato de potássio utilizando-se uma curva analítica. Para a

construção desta foram preparadas cinco soluções padrão. As absorbâncias e

transmitâncias dessas soluções foram medidas a 525 nm, que é o comprimento de onda

em que o pico de absorbância do permanganato de potássio é máximo.

Para a preparação das soluções padrão foi feita uma solução estoque de

permanganato de potássio 0,0006 mol L-1. Devido a erros de cálculo durante a

realização da prática a massa pesada, g, foi aproximadamente dez

vezes superior a necessária, o que levou a erros na concentração encontrada

justificando, assim, a diferença do valor esperado. Para minimizar os erros nos

resultados, os volumes dos padrões foram multiplicados por 9,89.

Cada amostra foi colocada no fotômetro e foi feita a leitura das absorbâncias e

das transmitâncias. As transmitâncias também foram calculadas pela lei de Beer a fim

de uma comparação com a leitura realizada no equipamento.

A Transmitância pode ser calculada através da lei de Beer:

(2)

Onde:

A = Absorbância.

T = Transmitância.

Para a primeira solução:

As medidas da absorbância e transmitância de cada padrão, assim como os volumes

necessários para sua preparação, suas respectivas concentrações e os valores das

transmitâncias calculadas a partir da lei de Beer (equação 2) são apresentadas na Tabela

1. As transmitâncias foram calculadas com os valores de absorbância obtidos pelo

fotômetro.

Tabela 1: Concentração das soluções padrão, volume da solução estoque gasto,

Absorbância e transmitâncias medida e calculada.

Solução padrão de KMnO4

Concentração das soluções

padrão

Volume de solução

estoque(L)

Absorbância a 525 nm

Transmitância (%)

Medida Calculada

1 0,217 60,3 60,7

2 0,448 35,7 35,6

3 0,922 12,0 12,0

4 1,363 4,30 4,33

5 1.931 1,20 1,17

Os volumes necessários para a preparação de cada alíquota foram calculados da

seguinte forma:

(3)

Onde:

= Concentração da solução estoque de permanganato de potássio

= Volume a ser determinado (alíquota)

= Concentração da alíquota

= Volume da solução padrão

Para a primeira alíquota tem-se:

Os demais valores foram apresentados na Tabela 1.

A transmitância e a absorbância da amostra de concentração desconhecida foi

medido no fotômetro, tendo os seguintes valores:

De acordo com a Lei de Beer:

Com os dados de Absorbâncias (A) e com as concentrações (C) das soluções

padrão foi construída a curva analítica, apresentada na Figura 1:

Figura 1: Curva analítica obtida a partir da padronização externa.

A concentração da amostra foi calculada a partir da equação da reta obtida na curva

analítica (1):

Onde:

Substituindo o valor da absorbância da amostra, temos:

Pelo método de mínimos quadrados obteve-se a equação da reta

com o quadrado do coeficiente de correlação [2].

A concentração encontrada, , é a concentração de 4 mL

da amostra diluída em 100 mL de água. Pela equação (3) calculou-se a concentração da

amostra original, , multiplicou-se a concentração pela

massa molar do permanganato de potássio obtendo assim a concentração em ,

, como a solução foi preparada em 1L temos que a massa de

permanganato de potássio presente na amostra é igual a:

Pode-se perceber que o cálculo da concentração da amostra na padronização

externa, a partir da equação linear da reta de tendência em relação á curva de

absorbância em função da concentração, mostrou-se negativo. Tal resultado pode ser

explicado pela ampla margem de erro existente quando se utiliza a equação da reta de

tendência. Como ela é uma equação generalizada do gráfico, essa não satisfaz todos os

pontos do gráfico, gerando-se assim algumas discrepâncias nos resultados obtidos.

A padronização externa se mostra eficiente para matrizes não complexas, isto é,

que não apresente efeitos de matriz. Sendo assim, devido à presença de interferentes no

analito o método não foi satisfatório.

5.2. Padronização Interna

Na padronização interna a calibração envolve colocar em um gráfico a razão entre

o sinal do analito e o sinal do padrão interno em função da concentração do analito nos

padrões. Essa razão para as amostra é então usada para obter as concentrações de analito

a partir da curva de calibração [1].

Um padrão interno é uma quantidade conhecida de um composto, diferente do

analito, que é adicionada à amostra desconhecida. Padrões internos são úteis quando a

quantidade de amostra analisada não é reprodutível, quando a resposta do instrumento

varia de análise para análise ou quando perdas de amostras ocorrem durante o preparo

da amostra [4].

O padrão interno utilizado foi o dicromato de potássio, K2Cr2O7, por ser física e

quimicamente similar ao analito, assim ele interage com os interferentes da matriz e

minimiza seus efeitos na resposta [5].

Para a construção da curva analítica foram preparadas soluções padrões iguais as

preparadas na padronização externa, porém antes das leituras adicionou-se um volume

conhecido, , de dicromato de potássio , que é o padrão

interno. As leituras foram realizadas a 370 nm para o dicromato de potássio e a 525 nm

para o permanganato de potássio. Os valores das medidas dos padrões, assim como os

da amostra são apresentados na Tabela 2.

Solução

padrão

Concentração

da solução Absorbância Razões das

de

KMnO4

padrão ( (K2Cr2O7) Absorbância

(KMnO4)

absorbâncias

KMnO4/K2Cr2O7

Transmitância

(K2Cr2O7) (%)

Transmitância

(KMnO4) (%)

1 0,212 0,283 1,335 61,6 52,1

2 0,283 0,530 1,873 52,3 29,5

3 0,444 1,037 2,336 36,0 9,20

4 0,598 1,398 2,334 25,3 4,00

5 0,906 1,979 2,184 12,5 1,00

Amostr

a

0,206 0,059 0,286 62,3 87,1

Tabela 2: Determinação das absorbâncias e transmitâncias dos padrões a

370 nm e 525 nm.

As transmitâncias foram novamente calculadas a partir da lei de Beer, pela equação

(2). Os valores encontrados estão mostrados na Tabela 3.

Tabela 3: Transmitâncias calculadas a partir da lei de Beer.

Concentração da solução

padrão (

Transmitância (K2Cr2O7)

(%)

Transmitância (KMnO4)

(%)

61,4 52,1

52,1 29,5

36,0 9,2

25,2 4,0

12,4 1,0

Amostra 62,2 87,3

Com as razões das Absorbâncias (A) e com as concentrações (C) das soluções

padrão foi construída a curva analítica , C versus A, apresentada na Figura 2:

Figura 2: Curva analítica obtida a partir para padronização interna.

A concentração da amostra foi calculada a partir da equação da reta obtida na curva

analítica (1):

(4)

Onde:

Substituindo o valor da absorbância da amostra, temos:

A concentração encontrada, , é a concentração de 4 mL da

amostra diluída em 100 mL de água. Pela equação (3) calculou-se a concentração da

amostra original, , multiplicou-se a concentração pela

massa molar do permanganato de potássio obtendo assim a concentração em ,



Pelo método de mínimos quadrados obteve-se a equação da reta

com o quadrado do coeficiente de correlação , que é

um valor muito baixo para esse parâmetro, pois por ser uma reta deveria ser próximo a

1. Quando o quadrado do coeficiente de correlação é igual a 1, a correlação é dita

perfeita. Quanto mais próxima de zero for o valor do coeficiente de correlação menor

será a indicação de que as variáveis estejam correlacionadas linearmente [4].

Comparando os resultados obtidos pelos dois métodos já descritos, observou-se que

eles apresentam grande diferença, o que não era esperado pois foram realizados a partir

da mesma amostra. Esse método é limitado, pois existe uma grande dificuldade de

encontrar uma substância adequada para servir com padrão interno. Porém, quando bem

empregado esse método pode compensar efeitos de matriz, desvios decorrentes da

preparação da amostra, além de erros aleatórios e sistemáticos [1,5].

5.3. Adição de padrão

Na adição de padrão, quantidades conhecidas de analito são adicionadas à

amostra desconhecida. A partir do aumento do sinal, deduzimos quanto de analito

estava presente na amostra original. Este método requer uma resposta linear para o

analito. [4]

Na adição de padrão a curva analítica foi construída relacionando o volume de

solução estoque de permanganato de potássio 0,0006 adicionada a amostra e as

respectivas absorbâncias medidas. A leitura no fotômetro foi novamente realizada a 525

nm, por ser o pico máximo de absorção do permanganato de potássio. As transmitâncias

foram calculadas de acordo com a lei de Beer, pela equação (2). A Tabela 4 mostra a

quantidade de solução estoque adicionada, suas medidas (transmitância e absorbância) e

as transmitâncias calculadas.

Tabela 4. Volumes das soluções estoque e da amostra, medidas das absorbâncias e

das transmitâncias lidas e calculadas para o método adição de padrão.

Volume de solução estoque

adicionada (µL)

Concentração da solução estoque adicionada

( )

Transmitância medida (%)

Trasmitância calculada (%)

Absorbância

Amostra 1 0,00 0,00 87,1 87,1 0,060

Amostra 2 100 1,18 x 10-5 80,3 80,2 0,096

Amostra 3 150 1,75 x 10-5 78,8 78,7 0,104

Amostra 4 200 2,31 x 10-5 75,2 75,2 0,124

A curva analítica, Concentração de padrão adicionado (V) versus Absorbância (A), foi construída com valores apresentados na Tabela 4.

A concentração desconhecida da amostra foi então calculada a partir da

extrapolação da curva analítica da adição de padrão. A equação obtida foi

, com coeficiente de correlação . Fazendo na

equação da reta, obteve-se a concentração de permanganato na amostra, cujo valor é

.

A concentração encontrada, , é a concentração de 4 mL

da amostra diluída em 100 mL de água. Pela equação (3) calculou-se a concentração da

amostra original, , multiplicou-se a concentração pela massa molar do permanganato de

potássio obtendo assim a concentração em ,



O método da adição de padrão tem por vantagem a compensação de efeitos de

matriz, que causam interferências nos resultados, pois a matriz da amostra permanece

quase inalterada após cada adição, a única diferença é a concentração do analito, sendo

assim, esse método é útil para análises de amostras nas quais a probabilidade de efeitos

de matriz é alta [1].

A análise quantitativa em espectrofotometria é realizada através da medida da

absorbância, a qual se relaciona linearmente com a concentração dentro de uma faixa de

concentração, seguindo a lei de Beer. Esta mesma lei diz que deve haver uma relação

linear entre a concentração e a absorbância. Esta linearidade vale dentro de certos

limites, pois a partir de certa concentração deixa de haver proporcionalidade entre

concentração e absorbância [7].

A presença de possíveis erros deve ser considerada, pois estes erros podem

contribuir significativamente na alteração dos resultados obtidos. O erro cometido

durante a realização da prática foi de origem sistemática pessoal. Os erros sistemáticos

são erros que nas mesmas circunstâncias distorcem todas as medições sempre num dado

sentido (ou para mais ou para menos) em relação ao seu verdadeiro valor. As suas

causas residem em deficiências [6]:

– de instrumentos de medição e reagentes – erros instrumentais;

– do método usado – erros de método;

– da atuação do próprio operador – erros pessoais.

6. Conclusão

Através dos dados coletados, plotagem de gráficos e de cálculos, foi definida a

concentração da amostra desconhecida pelos métodos de padronização externa e interna

e por adição de padrão.

O método da adição de padrão se mostrou mais eficaz no cálculo da concentração,

por as medidas serem feitas na mesma amostra, e por ter os efeitos de matriz

minimizados.

Os erros existentes, mas consideráveis nos resultados, devem-se a erros

sistemáticos pessoais gerando resultados diferentes dos esperados.

7. Referências Bibliográficas

[1] SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental.5a Ed. Bookman, 2002.

[2] http://www.ebah.com.br/metodo-de-adicao-de-padrao-doc-a56622.html. Acesso em

24/03/2011.

[3] http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-0422004000500017&script=sci_arttext.

Acesso em 24/03/2011.

[4] HARRIS, C.D. Análise Química Quantitativa. 6ª edição, Rio de Janeiro: Editora

LTC, 2005. 876 p.

[5] SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de

Química Analítica. 8ª edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.

[6] http://pointer.esalq.usp.br/departamentos/leb/aulas/lce5702/PE_erros.pdf. Acesso

em 27/03/2011.

[7] http://www.ebah.com.br/curva-de-calibracao-doc-a87176.html. Acesso em

29/03/2011.

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