Upload
thayna-barato
View
15
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Importância da preservação
armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção
– contaminação– perda de viabilidade– mutação (perda das características fisiológicas)
solução → metodologia de preservação de longa duração– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas
crescimento em meio mínimo resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura
Importância da preservação
preservação a longo prazo – evita problemas com o novo isolamento de microrganismos– economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo
importante função da coleção de culturas– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação
por períodos prolongados– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza
Escolha do método de preservação
pontos a serem considerados
– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento
– manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial
– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo
– custos de preservação e manutenção
Escolha do método de preservação
– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento
– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método
– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte
– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros
Métodos de preservação
curto prazo– repique contínuo
médio prazo– preservação em óleo mineral– preservação em água– congelamento a -20°C– secagem em sílica, solo e papel de filtro
longo-termo– liofilização– congelamento a -80°C– criopreservação em nitrogênio líquido
princípio– diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura)
fatores a serem considerados– meio adequado para manter a cultura– temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira
(4 a 7 ºC) de 4-6 meses– freqüência entre as transferências: determinação empírica
minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes examinar a pureza em cada transferência conservar em duplicata
Repique contínuo
Repique contínuo
vantagens– baixo custo– não requer equipamentos especializados– o manuseio é simples
desvantagens– riscos de contaminação e possível perda da linhagem– perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade– seleção de células atípicas (variantes ou mutantes)– supervisão especializada– mão-de-obra– espaço relativamente grande para a armazenamento
Repique contínuo
princípio– diminuição da atividade metabólica
fatores a serem considerado (Castellani)– espessura do ágar– número de blocos na água
Preservação em óleo mineral e em água
Preservação em óleo mineral
Preservação em óleo
armazenamento em geladeira
vantagens- ↓ custo de equipamento
- evita contaminação por ácaros
desvantagens- necessidade de mais transferências
até que a cultura revigore- requer espaço para amazenamento
Preservação em água (Castellani)
Geladeira
Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada
Preservação em água
vantagens- boa taxa de viabilidade
- evita contaminação por ácaros
desvantagens- limitado a organismos que
aderem ao ágar (Castellani)- dificuldade da retirada dos cubos
na reativação (Castellani)- crescimento durante a estocagem- requer espaço p/ amazenamento- riscos de contaminação
Preservação em água
armazenamento em geladeira
Secagem
princípio– diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira
fatores a serem considerados– tipo de célula– idade da cultura– concentração celular– condições de estocagem
Secagem em sílica e em solo
Secagem em papel de filtro
Secagem
vantagens– simples e de baixo custo– não requer equipamento especial– estabilidade elevada– ácaros não sobrevivem
desavantagens– métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados– risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo– papel: poucos dados sobre o sucesso do método
Liofilização
princípio– remoção da água por sublimação
fatores a serem considerados– tipo de células– idade da cultura– concentração celular– agentes crioprotetor– condições de estocagem– método de reidratação
Liofilização
agentes crioprotetores– reduzem danos durante o congelamento e descongelamento– estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem
leite desnatado (skim milk) 10% leite desnatado 10% + inositol 5% sacarose 7% + peptona 7% inositol 5% em soro de sangue de cavalo
Liofilização
3 mL
Skim Milk
Cultura pura 0,2 mL
na ampola
Maçarico Liofilizador
Maçarico
Liofilização - reativação
Liofilização
vantagens– vedação total da amostra– longa viabilidade– estabilidade elevada em muitas espécies– produção em larga escala– não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)– fácil distribuição e transporte
desvantagens– muitas espécies não sobrevivem ao processo– viabilidade ocasionalmente insatisfatória– mão-de-obra especializada– requer equipamentos sofisticado
Congelamento em ultrafreezer
princípio– indução da dormência do microrganismo– armazenamento a - 80˚C
fatores a serem considerados– tipo de microrganismo– idade da cultura– concentração celular– agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração
maior)– condições de estocagem– método de descongelamento
Congelamento
10 mL
Fungos filamentosos não esporulados
Bactérias, arqueas e leveduras
Fungos filamentosos esporulados
7 mL
1 mL
1 mL1 mL
Congelamento em ultrafreezer
Congelamento em nitrogênio líquido
princípio – indução da dormência do microrganismo– armazenamento a - 196˚C
fatores a serem considerados– tipo de microrganismo– idade da cultura– concentração celular– agente crioprotetor– condições de estocagem– método de descongelamento
Congelamento em nitrogênio líquido
Congelamento em nitrogênio líquido
vantagens– condições estáveis por longos períodos– vedação completa, evitando contaminação– utilização para esporulados e não esporulados
desvantagens– viabilidade ocasionalmente insatisfatória– requer equipamento sofisticado– suprimento contínuo de N2
– boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento
Controle de qualidade de preservação
contagem de população viável antes e após preservação– determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no
protocolo utilizado– aplicável a métodos de médio e longo-termo– imprescindível para garantia de preservação de longo-termo
pureza– logo após o processamento do lote
viabilidade– primeira pós: até um mês após o processamento– segunda pós em diante: anualmente
Controle de qualidade de preservação
Suspensão de células em crioprotetor
0,1 mL 0,1 mL0,1 mL0,1 mL
(10-8)(10-6) (10-4)(10-2)9,9 mL água + 0,1% ágar
10-2 10-4
10-8 10-6
no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL