UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

PREVENÇÃO DE PROBLEMAS COLIBACILARES NO INÍCIO DA FASE DE

TERMINAÇÃO EM SUÍNOS MEDIANTE A VACINAÇÃO COM COLIDEX-C®

Lívia Mendonça Pascoal

Orientador: Prof. Dr. Romão da Cunha Nunes

GOIÂNIA

2012

ii

LIVIA MENDONÇA PASCOAL

PREVENÇÃO DE PROBLEMAS COLIBACILARES NO INÍCIO DA FASE DE

TERMINAÇÃO EM SUÍNOS MEDIANTE A VACINAÇÃO COM COLIDEX-C®

Área de Concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientador:

Prof. Dr. Romão da Cunha Nunes– UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Jurij Sobestiansky – UFG

Profa. Dra. Moema Pacheco Matos Chediak – UFG

GOIÂNIA

2012

Tese apresentada para obtenção do

grau de Doutor em Ciência Animal junto

à Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

iii

Dedico este aos meus pais,

João e Irací, e à minha irmã

Aline, pelo amor, carinho e

incentivo. Essenciais na minha

vida.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre iluminar meu caminho.

Ao meu querido amigo e orientador, Prof. Jurij Sobestiansky, pela amizade, pelos

ensinamentos, pela confiança e apoio durante todos os anos de convívio. Uma

honra tê-lo como orientador.

Aos professores da banca de qualificação, Romão, Moema, Ana Paula e Sabrina.

Obrigada pelas correções que fizeram este trabalho mais claro e objetivo.

À Coordenação de Pós-Graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG, por permitir

o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo, pela preocupação e pelo apoio sempre

recebido.

Ao secretário da pós-graduação, Gerson Luiz Barros, por sempre ter me atendido

com atenção e presteza.

À UFG, especialmente ao Departamento de Medicina Preventiva. Agradeço à

todos os funcionários pelo carinho de sempre.

Ao professor, Marcos Café, pelo apoio e amizade.

À querida amiga Sabrina, por aceitar o convite para ser memória da minha banca

e por realizar este trabalho de maneira tão eficiente. E à querida Marina, por

sempre ter as palavras corretas para cada momento e por aceitar o convite para a

banca de defesa.

À Prof. Drª. Luciana Batalha, pela preocupação, carinho e pelas conversas que

sempre enriqueceram meus dias.

Ao CNPq, pela bolsa de doutorado e à CAPES, pela bolsa de doutorado

sanduíche.

À querida amiga, Sara, por estar sempre por perto, e por todas as soluções que já

encontrou para meus problemas.

À querida amiga Cybelly, pelo carinho e palavras de incentivos.

Aos meus pais, João e Irací, pelo amor, pelo apoio incondicional, por serem

exemplos de vida e força. À minha irmã, Aline, pelo amor, pela torcida, pela

preocupação e auxílio sempre recebido. Agradeço à vocês e à Deus pela família

linda e especial que tenho.

v

À Espanha, por me proporcionar um grande crescimento profissional e pessoal.

À Universidade de Murcia, por me receber para o doutorado sanduíche.

Ao Professor e amigo, Antonio Muñoz, por sempre acreditar em mim e oferecer

soluções aos problemas enfrentados durante da minha estadia na Espanha.

Ao meu querido amigo, Professor Guillermo Ramis, pelo apoio, pela supervisão

durante a realização deste trabalho, pela amizade e ótimos momentos vividos.

Ao Professor Francisco Pallarés, pela supervisão, pelos esclarecimentos e

ensinamentos.

Ao amigo e também supervisor, Juan José Quereda, pela amizade, pelos

ensinamentos desde o primeiro dia que cheguei no departamento, correções e

pelos emails sempre cheio de palavras de incentivo.

Ao querido amigo, Juanma, por fazer das horas passadas no frigorifico, horas de

fácil e divertido trabalho, pela contribuição inestimável para a realização deste

trabalho e pela amizade de todos os dias.

À querida amiga, Juani, pela amizade, companheirismo, por nunca medir esforços

para me ajudar e por alegrar meus dias com seu jeito especial de ser.

Aos queridos amigos, Obdulio, Aida e Lidiane, por toda ajuda e colaboração

durante a execução deste trabalho.

À querida amiga, Laura, pelo carinho e preocupação sempre dispensados.

Ao meu querido, Diego, pelo amor e amizade. Por ser exemplo de paixão e

dedicação ao trabalho. Por estar sempre ao meu lado ensinando-me, apoiando-

me, fazendo os meus dias mais bonitos e alegres, e suportando-me nas horas de

aflição.

A todos vosostros, gracias por tantas horas de alegría y sonrisas compartidas las

cuales siempre sirvieron para animar a mi corazón y suavizar los momentos

difíciles. Estaréis siempre en mi corazón.

Meus sinceros agradecimentos.

vi

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPc - adenosina monofosfato cíclico

C. 10-20 - grupo de animais não vacinados ou controles

C. 10-30 - grupo de animais não vacinados ou controles

C. 20-30 - grupo de animais não vacinados ou controles

CES - complexo entérico suíno

DNA - ácido desoxirribonucléico

DP - diarrea pós-desmame

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay

ETEC - cepas E. coli enterotoxigênicas

ETEEC - cepas E. coli enterotoxêmicas

GMPc - guanosina monofosfato cíclico

Hly - hemolisina

IFN-α - interferon alfa

IFN-γ- interferon gama

IgA - imunoglobulina A

IL - interleucina

LPS - lipopolisacarideos

LREC - Laboratório de Referência de E. coli.

LT - enterotoxina termolábil

PCR - reação em cadeia da polimerase

PCV2 - circovírus suíno tipo 2

SPF - specific pathogen free (libre de patógenos específicos)

ST - enterotoxina termoestável

TGF-β - fator de crescimento transformante beta

TNF-α - fator de necrose tumoral alfa

V. 10-20 - grupo de animais vacinados aos dias 10 e 20 de vida

V. 10-30 - grupo de animais vacinados aos dias 10 e 30 de vida

V. 20-30 - grupo de animais vacinados aos dias 20 e 30 de vida

VT - verotoxina

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ……………………………………….. 1

CAPÍTULO 2 – EFEITO DA VACINAÇÃO CONTRA Escherichia coli EM LEITÕES

SOBRE O DESMPENHO NAS FASES DE CRECHE E

CRESCIMENTO/TERMINAÇÃO ......................................................................... 23

CAPÍTULO 3 – DETECÇÃO DE PATÓGENOS DO COMPLEXO ENTÉRICO

SUÍNO E ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE EM SUÍNOS VACINADOS

CONTRA Escherichia coli .................................................................................... 41

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................ 79

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RESUMO

A diarreia pós-desmame causada por cepas patogênicas de Escherichia coli leva a perdas produtivas e econômicas no mundo inteiro. O controle dessa enfermidade ainda não está bem estabelecido. A importância da colibacilose não se limita às perdas que causa, já que a adesão e produção de toxinas por cepas patogênicas de E. coli podem criar condições favoráveis para que outros agentes patogênicos, como Lawsonia intracellularis, Brachyspyra hyodisenteriae, Salmonella spp e Circovírus suíno tipo 2 exerçam suas ações. Por outro lado, a produção de citocinas é crucial para o recrutamento e ativação de células do sistema imune e desenvolvimento de uma resposta imunitária eficiente. O desenvolvimento de uma vacina, Colidex® (Farcovet, Espanha), registrada para o uso parenteral diretamente nos leitões levou à realização deste trabalho. O objetivo foi determinar o efeito de três diferentes protocolos de vacinação de leitões contra E. coli usando a referida vacina. Foram avaliados parâmetros produtivos nas fases de creche e crescimento/terminação, assim como a interação entre E. coli e outros agentes patogênicos do complexo entérico suíno. Também foram avaliados alguns pontos da resposta imune como, expressão gênica de citocinas e produção de IgA em intestino de leitões vacinados frente E. coli. Foram utilizados 8.299 leitões, divididos em seis grupos dependendo do protocolo de vacinação, a saber: leitões vacinados e revacinados aos 10 e 20 dias de vida (V10–20), vacinados e revacinados aos 10 e 30 dias de vida (V10-30), e vacinados e revacinados aos 20 e 30 dias de vida (V20-30). Para cada grupo vacinado, deixou-se um grupo contemporâneo sem vacinar para servir de controle (C10-20, C10-30 e C20-30). De acordo com os resultados deste estudo, o uso de Colidex® para a prevenção da diarreia pós-desmame em leitões produziu importantes melhorias sanitárias, produtivas e econômicas, sendo o melhor protocolo de vacinação a primeira vacinação aos 10 de idade e a revacinação aos 20 dias de idade. Uma vez que o melhor protocolo vacinal foi o V10-20, realizou-se, deste grupo vacinado e de seu controle, PCR em tempo real para detecção de E. coli, Lawsonia intracellularis, Brachyspyra hyodisenteriae, Salmonella spp e Circovírus suíno tipo 2, estudo histopatológico e diagnóstico imunoistoquímico para IgA e PCV2. Também foi realizado PCR em tempo real para a quantificação da expressão gênica das citocinas IFN-γ, IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-12 p35 e IL-12 p40. Os animais vacinados apresentaram maior infiltrado linfoplasmocitário, maior número de células produtoras de IgA, enquanto os animais do grupo controle apresentaram mais animais positivos para E. coli e L. intracelullaris e maior ocorrência de doenças entéricas. Estes achados sugerem que o infiltrado celular mais exacerbado juntamente com o maior de células produtoras de IgA poderiam ser devido a vacinação, que estaria atuando para a melhoria da defesa intestinal frente a E. coli como foi evidenciado nos resultados encontrados. Esta vacina parenteral mostrou ser uma nova estratégia no controle da doença. Palavras-chaves: citocinas, colibacilose, diarreia pós-desmame, E. coli, índice de conversão, vacina parenteral.

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS

As preocupações a respeito das enfermidades suínas mudaram muito

nos últimos anos. Antes, as doenças respiratórias constituíam o principal

problema de produtores e veterinários, mas atualmente tais enfermidades estão

cada vez melhor controladas. Por outro lado, as doenças gastroentéricas são hoje

a principal fonte de perdas na suinocultura. De fato, atualmente enfrentamos o

Complexo Entérico Suíno (CES) no qual estão envolvidos diversos patógenos

víricos, bacterianos e parasitários que interagem entre si, agravando a

apresentação clínica e patológica das doenças clássicas. Entre os patógenos

bacterianos, ressalta-se Escherichia coli, Lawsonia intracellularis e Brachyspyra

hyodisenteria, e entre os víricos, o circovírus suíno (PCV2) (RAMIS et al., 2011).

As enfermidades produzidas por E. coli sempre representaram um

desafio para a produção suína, especialmente com a intensificação da

suinocultura nas últimas décadas. A apresentação clássica dessa enfermidade se

centrava na fase de lactação e creche (FAIRBROTHER et al., 2005; BLANCO et

al., 2006), devido às transmissões verticais da porca para o leitão e à

contaminação ambiental presente nas instalações (MORÉS & MORENO, 2007).

Entretanto, nos últimos anos, tem-se observado no campo que a expressão

clínica dessas diarreias colibacilares passaram a ocorrer em um período

aproximado de seis semanas após a entrada na fase de terminação,

aproximadamente 12-18 semanas de idade (STEGE et al., 2000; RAMIS et al.,

2011). Essa mudança na expressão clínica da colibacilose, possivelmente deve-

se a fatores como a intensificação na prevenção contra o patógeno na fase de

maternidade e creche, o estresse do transporte à terminação, a mistura de lotes,

a mudança na alimentação, a qualidade da água, entre outros (FAIRBROTHER et

al., 2005) .

Até agora, a via clássica de prevenção das diarreias colibacilares

centrava-se na imunização das porcas, com o objetivo de reduzir a pressão de

infecção à que são submetidos os leitões na maternidade (MOON & BUNN,

1993). Além disso, realiza-se prevenção a base de antibióticos e elementos

adstringentes adicionados a ração, como o óxido de zinco durante a fase de

creche (JENSEN-WAERN et al., 1998; MOLIST et al., 2011). Possivelmente, o

2

êxito desses programas é outro fator que fez com que a patogenia da doença

tenha alterado, passando a ocorrer no início da fase de terminação.

Atualmente, o aparecimento das diarreias colibacilares no início da fase

de terminação requer como solução o uso de antibióticos, administrados via água

de bebida ou ração e a utilização de elementos preventivos como o óxido de zinco

(RAMIS et al., 2011). Entretanto, o uso de antibióticos e de óxido de zinco podem

gerar problemas de caráter ético. O uso massivo de antibióticos gera

preocupação no consumidor que cada vez mais rejeita o uso de antibióticos na

produção animal. Nos últimos anos, constatou-se na União Europeia (UE) a

tendência cada vez maior em reduzir ou eliminar o uso de antibióticos na

produção suína, o que é uma das causas do agravamento atual das enfermidades

nesta espécie (BARTON, 2000; HØJBERG et al., 2005).

O uso de óxido de zinco planteia problemas ambientais já que se

acumula nos dejetos dos animais e pode chegar a se converter em um

contaminante ambiental (CRISTANI et al., 1997). Em 2004, seu uso esteve

proibido de forma transitória, mas posteriormente, criou-se uma moratória por

reconhecimento mútuo com países da UE em que seu uso foi permitido.

Entretanto, a tendência da legislação europeia é eliminar este tipo de elemento da

produção animal, levando à perda de uma das armas para a prevenção e controle

da colibacilose em suínos.

Além disso, como as estratégias de controle atuais contra a E. coli

concentram-se nas primeiras idades do leitão. A presença da bactéria em idades

posteriores pode produzir o agravamento de outros patógenos participantes no

CES, tais como os agentes da Disenteria suína e da Enterite proliferativa suína. O

aparecimento destes agentes produz um incremento nos custos de produção e

requer o uso de antibióticos em altas doses durante um período prolongado de

tempo (RAMIS et al., 2011).

Outras soluções propostas aos suinocultores são o uso de probióticos

e prebióticos e o uso de imunoglobulinas, obtidas em embrião de frango e

administradas via oral. Porém, até o momento, estas soluções são caras e

eficazes somente de forma parcial (VONDRUSKOVA et al., 2010). Então, a

substituição das soluções atuais por uma prevenção vacinal permitiria superar tais

problemas e ao mesmo tempo incidiria em questões como o bem estar animal

3

(melhoria da qualidade sanitária e portanto da qualidade de vida dos animais),

melhoria dos parâmetros produtivos e da rentabilidade do processo do processo

de produção de suínos (RAMIS et al., 2011).

1.1 Complexo Entérico Suíno

Nos últimos dez anos, ocorreu o agravamento e o aumento da

prevalência das enfermidades entéricas, sobretudo nas fases de creche e

crescimento/ terminação (PALLARÉS et al., 2006). Fatores como o aumento da

densidade animal nas granjas de produção ou a falta de vacinas eficazes contra a

maioria dos patógenos entéricos, além da proibição de antibióticos promotores de

crescimento, propiciaram uma mudança na expressão clínica de doenças, como a

disenteria suína, a enterite proliferativa suína e a colibacilose. Atualmente, estas e

outras doenças entéricas suínas são difíceis de serem diagnosticadas de forma

individual, já que são frequentes as infecções conjuntas por vários patógenos

entéricos. Por isso, alguns autores preferem usar o termo CES para referir-se ao

conjunto de patógenos que interagem provocando enfermidades digestivas

(RAMIS et al., 2011) .

1.2 Importância da colibacilose no Complexo Entérico Suíno

A colibacilose é uma importante causa de diarreia em leitões recém-

nascidos e recém-desmamados, sendo considerada como responsável por

perdas significativas em granjas de todo o mundo (FAIRBROTHER et al., 2005;

BLANCO et al., 2006). A colibacilose pós-desmame é de grande importância

econômica, em função das perdas por mortalidade (que podem atingir 10%), pelo

surgimento de muitos refugos e pelos gastos com medicamentos no seu controle

(MORES & MORENO, 2007).

O aparecimento clínico de diarreias colibacilares em suínos alterou sua

patogenia, convertendo-se em um problema cada vez mais frequente no início do

período de terminação (STEGE et al., 2000; RAMIS et al., 2011). Algumas das

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razões que explicam essas mudanças, assim como suas consequências estão

resumidas no Quadro 1.

QUADRO 1: Causas e consequências da mudança da expressão clínica da

colibacilose suína

CAUSAS CONSEQUÊNCIAS

Fatores que influenciam

diretamente no

aparecimento de

problemas colibacilares

Maior esforço na prevenção

de patógenos na fase de

creche

Estresse do transporte a fase

de crescimento/terminação

Mistura de animais de

diferentes leitegadas

Mudança de alimentação

Maior uso de

antibióticos

Piora dos parâmetros

produtivos

Perda do bem estar

animal

Perdas econômicas

Fatores gerais que

influenciam no

aparecimento do

complexo entérico suíno

Aumento generalizado da

densidade animal

Falta de vacinas eficazes

frente a patógenos entéricos

Proibição dos antibióticos

promotores de crescimento

A importância desta doença não se limita às perdas produtivas e

econômicas que por si só ocasiona. Também, a adesão e produção de toxinas

por cepas patogênicas de E. coli podem criar condições favoráveis para que

outros patógenos digestivos, implicados no CES, possam exercer sua ação

(FAIRBROTHER et al., 2005).

O incremento dos processos diarreicos associados a E. coli tem sido

relacionados à fatores como o aparecimento de cepas altamente virulentas,

mudanças no manejo dos suínos e maior resistência bacteriana aos antibióticos

rotineiramente utilizados, fazendo-se necessário o desenvolvimento de novas

formas de prevenção deste patógeno (FAIRBROTHER et al., 2005).

5

1.3 Importância de outros patógenos do Complexo Entérico Suíno

1.3.1 Lawsonia intracellularis

A ileíte ou enteropatia proliferativa é uma importante enfermidade que

afeta a espécie suína, produzida pela Lawsonia intracellularis e que se caracteriza

pelo espessamento da mucosa intestinal causada pela proliferação de enterócitos

infectados pelo agente (MCORIST et al., 1993; LAWSON & GEBHART, 2000;

GUEDES, 2007). Atualmente, é considerada uma enfermidade de caráter

universal, cuja importância tem aumentado muito desde o ano 1999, coincidindo

com a proibição dos antibióticos promotores de crescimento (GUEDES, 2007).

Esta doença provoca grandes perdas econômicas devido a diarreia

que ocasiona a diminuição do consumo e, consequentemente, a redução de

ganho de peso dos animais e/ou mortalidade (até 6%) próximo à idade de abate

(JACOBSON et al., 2010). Os suínos de terminação com aproximadamente 40 kg

de peso vivo são os mais afetados (PALLARÉS et al., 2006). Esta doença já foi

relatada em todos os países de expressiva produção suinícola, reforçando a

importância da enfermidade, pois as lesões intestinais resultam em má absorção

dos nutrientes, influenciando negativamente o ganho de peso diário, a conversão

alimentar e a redução no ganho de carne (GUEDES, 2007).

1.3.2 Brachyspira hyodisenteriae

A Disenteria Suína é uma enfermidade bacteriana cujo agente

etiológico é a Brachyspira hyodisenteriae. Sua capacidade de persistir em fezes e

a existência de vetores biológicos permitem que esta bactéria permaneça nas

granjas por longos períodos de tempo. A bactéria coloniza o intestino grosso do

provocando severa colite mucohemorrágica (HAMPSON et al., 2006; PALLARÉS

et al., 2006). A morbidade pode chegar a 90%, com média de 30-40%. A

mortalidade varia de 5 a 15%, podendo chegar a 30% dependendo da eficácia no

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tratamento. Os animais afetados são suínos de terminação, os quais apresentam

um atraso no crescimento (0,374 kg de perda diária) e aumento do índice de

conversão (0,350k g) e, consequentemente, importantes perdas econômicas,

tanto diretas como indiretas (HANS, 2001; GUEDES & BARCELLOS, 2007). A

presença desta enfermidade na granja exige gastos com controle elevados e que

pesam durante anos no rendimento econômico. Entre os custos diretos e

indiretos, a disenteria suína origina um aumento no custo de produção que pode

chegar a superar 20% (CARVAJAL et al., 2006).

1.3.3 Salmonela sp.

A salmonelose atinge, principalmente, suínos desmamados com até

três a quatro meses de idade (KICH, 2007). Esta enfermidade apresenta duas

formas diferentes segundo a espécie de salmonella infectante. A forma

septicêmica é causadas por Salmonella cholerasuis e a forma entérica é

causadas por Salmonella entérica sorovar Typhimurium e S. entérica sorovar

Enteritidis, principalmente. A forma septicêmica geralmente cursa com a morte do

animal. Já a forma entérica, é mais comum e causa diarreia amarelada e fétida.

O hábitat natural da Salmonellla sp. é o trato intestinal de pessoas e

animais. A salmonelose destaca-se por ser, ao mesmo tempo, um problema

sanitário econômico nas criações de suínos e, também um problema de saúde

pública, sendo considerada uma das principais zoonoses de origem alimentar

(MCEWEN & FEDORKA-CRAY, 2002; TAELE, 2002).

Em registros americanos, os dados de morbidade e mortalidade são

muito variáveis, revelando que a participação da Salmonella nos quadros clínicos

entéricos é menor que em septicêmicos (9% e 58%). No Brasil, embora as

informações não estejam disponíveis, aparentemente o problema clínico é menor

do que em outros países. O número de leitões que adoecem num rebanho é

variável, em geral, abaixo de 15%. A mortalidade, nesses casos, fica entre 4-6%.

Os leitões que sobrevivem tendem a refugar e a mortalidade, nesses casos, Varia

de 20- 40% (KICH, 2007). Em alguns casos, as perdas econômicas podem ser

muito importantes (PALLARÉS et al., 2006). A infecção pelo agente pode

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aumentar o custo de produção, devido, principalmente, a redução no ganho de

peso e conversão alimentar, aumento no uso de antibióticos e aumento na

mortalidade (GORTON et al., 1996).

1.4 Diarreias pós-desmame por Escherichia Coli

1.4.1 Etiologia

As espécies de E. coli são classificadas dentro da família

Enterobacteriaceae. Muitos desses microrganismos são habitantes normais do

trato gastrointestinal, enquanto outros são responsáveis por uma ampla variedade

de enfermidades em suínos, entre estas a diarreia pós-desmame (GOSWAMI et

al., 2008). A E. coli é considerada uma das causas mais importantes desta

enfermidade em leitões (HAMPSON, 1994; VU KHAC et al., 2006). A diarreia

pós-desmame é causada por cepas de E. coli possuidoras de fatores de

virulência que lhe permitem colonizar as vilosidades intestinais e produzir uma ou

várias enterotoxinas (WILSON & FRANCIS, 1986; MOON & BUNN, 1993).

A patogenicidade de uma cepa de E. coli está determinada pelos

fatores de virulência que posui. Com base nesses fatores de virulência, as cepas

de E. coli agrupam-se em patotipos. Os principais patotipos implicados na

colibacilose pós-desmame são as cepas E. coli enterotoxigênicas (ETEC),

associadas à diarreia pós-desmame; e as cepas E. coli enterotoxêmicas

(ETEEC), associadas à doença do edema (GYLES, 1994; FRANCIS, 2002;

FRYDENDAHL, 2002).

As cepas isoladas com mais frequência nos processos de diarreia pós-

desmame pertencem a um reduzido grupo de serogrupos (GARABAL et al., 1996)

que combinam antígenos O (LPS), K (capsular) e/ou F (fimbrial) (HOLLAND,

1990) além de serem normalmente hemolíticos (SMITH & LINGGOOD, 1971).

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1.4.2 Epidemiologia

Os leitões geralmente adquirem a infecção por cepas patogênicas de

E. coli na maternidade, veiculando o patógeno à creche e

crescimento/terminação, onde se produz uma transmissão horizontal. Uma vez

produzida a infecção, o hábitat primário da E. coli é o trato gastrointestinal

(BERTSCHINGER & GYLES, 1994). A proliferação bacteriana ocorre

principalmente no intestino delgado, mas também pode ser isolada no ceco e

cólon (WADA et al., 1996). E. coli é um microrganismo contagioso, demonstrado

pelo fato de que se pode encontrar a mesma cepa em muitos animais enfermos,

inclusive entre animais de lotes distintos. A eliminação fecal é a principal via de

disseminação de E. coli no meio ambiente, promovendo a contaminação do piso,

água e alimento. O contato direto entre os animais de uma mesma baia, também

possibilita a disseminação da enfermidade (MORES & MORENO, 2007).

A morbidade da enfermidade é muito variável entre granjas afetadas

(MORES & MORENO, 2007), podendo aparecer e desaparecer de forma

repentina (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999), sendo frequente o

reaparecimento do processo (KURTZ et al., 1969). A mortalidade da diarreia pós-

desmame tende a ser baixa (MORES & MORENO, 2007). As diarreias pós-

desmame (DP) associadas a E. coli são observadas tipicamente no período

compreendido entre final do desmame e ao longo da creche, porém nos últimos

anos diversos fatores (Quadro 1) fizeram com que fosse possível o aparecimento

desta enfermidade entre as quatro e seis primeiras semanas da fase de

crescimento/terminação (RAMIS et al., 2011). Trabalhos como o de KAUFMANN

et al. (2006), no qual se observou uma grande prevalência de cepas virulentas de

E. coli em amostras fecais obtidas em frigorífico, demonstra que cepas

patogênicas podem persistir ao longo de todo o ciclo produtivo.

As medidas higiênico-sanitárias impostas na lactação e desmame são

pontos-chaves para o controle da enfermidade (MORES & MORENO, 2007).

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1.4.3 Patogenia

A E. coli pode persistir no intestino do animal sem causar doença ou

proliferar e causar sintomatologia e eliminação de bactérias coliformes via fecal.

Para que existam sinais clínicos nas infecções por E. coli é necessário o contato

da E. coli com a mucosa do hospedeiro, a fixação à mucosa e resistência às

forças de arrasto, a aquisição dos nutrientes necessários para a proliferação, taxa

de crescimento suficientemente elevada para manter ou aumentar a população e

resistência aos mecanismos de defesa do hospedeiro (FELDER et al., 2000).

Os principais atributos que conferem às cepas ETEC sua capacidade

patogênica são: a habilidade para colonizar o intestino e a capacidade de produzir

toxinas que estimulam a excreção de eletrólitos e água do intestino delgado. A

efetividade com que a E. coli realiza ambos processos de forma conjunta,

depende dos fatores de virulência que a cepa implicada na infecção possui

(GAASTRA & DE GRAAF, 1982).

a) Fatores de virulência

Os fatores de virulência são caracteres bacterianos implicados na

patogenicidade do microorganismo. Esses fatores interferem nas funções do

hospedeiro e permitem o crescimento do agente patogênico.

As cepas patogênicas de E. coli caracterizam-se pela produção de uma

ampla gama de fatores de virulência (Quadro 2) que podem ser agrupados em

fimbrias e toxinas. Uma cepa patogênica dispõe normalmente de um grupo

completo de uma ou várias toxinas e fimbrias.

As fimbrias ou pili são apêndices extracelulares altamente específicos ao

hospedeiro que permitem a bactéria colonizar a superfície epitelial do intestino

delgado (BLANCO et al., 1997; GARABAL et al., 1997; NAGY et al., 1999). A F4 e

a F18 são as fimbrias mais frequentes na diarreia pós-desmame associadas a E.

coli em todo o mundo (FAIRBROTHER et al., 2005; HUR et al., 2011).

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QUADRO 2 - Fatores de virulência e sorotipos mais frequentes em ETEC suínas.

SEROGRUPOS, FIMBRIAS E ENTEROTOXINAS ISOLADAS COM MAIOR

FREQUÊNCIA EM ETEC

Serogrupos O8, O64, O138, O139, O141, O147, O149,

O157.

BLANCO et al. (1997);

FRYDENDAHL (2002);

NOAMAMI et al. (2003)

Fimbrias F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18, F41 OJENIYI et al. (1994)

Enterotoxinas

LT*

STa STb*

GYLES (1992); OJENIYI

et al (1994)

LT: enterotoxina termolábil; STa STb: enterotoxina termoestável.

As cepas F4+ causam diarreia e morte em neonatos e nos primeiros dias

pós-desmame (VERDONCK et al., 2004). As cepas F18+ estão amplamente

distribuídas e são as principais responsáveis pela ocorrência da doença a partir

dos cinco dias pós-desmame e em animais no início da terminação (SVENDSEN

et al., 1974; BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999; VERDONCK et al.,

2003; CHENG et al., 2005). O aparecimento mais tardio da doença por cepas

F18+ explica-se porque o receptor para F18 não é expresso por leitões neonatos

(NAGY et al., 1999; BROWN et al., 2007b). Os leitões só expressam receptores

para F5 e F6 nos primeiros dias de vida (BROWN et al., 2007a).

As toxinas produzidas por ETEC são enterotoxinas excretadas no

lúmen intestinal. Como observado no Quadro 2 existem dois tipos principais: a

toxina LT, sensível ao calor e a toxina ST, resistente ao calor. A toxina LT ativa a

adenilatociclase dos enterócitos, o que incrementa a produção de AMPc e

portanto, incrementa a secreção de íons Cl-, Na+ e HCO3-. Esses fenômenos

explicam a diarreia por hipersecreção, sinal clínico primário da diarreia pós-

desmame. A capacidade imunogênica desta toxina faz com que seja um

componente importante nas vacinas. Existem dois tipos de toxina ST, a STa e

STb, que dão lugar ao aparecimento de diarreias ao estimular a produção de

GMP cíclico, via guanilatociclase, o que inibe o cotransporte de Na/Cl no intestino

e conduz à menor absorção intestinal de eletrólitos e água. As toxinas ST estão

11

implicadas principalmente nas diarreias neonatais reduzindo seu efeito conforme

aumenta a idade do animal (BROWN et al., 2007b).

A doença do edema é produzida por cepas ETEEC possuidoras de F18

e capazes de produzir outro tipo de toxina, a Shiga Toxina, também chamada

verotoxina, capaz de chegar ao sistema circulatório onde produz um dano

vascular, responsável pelo edema generalizado característico (BERTSCHINGER

& FAIRBROTHER, 1999; BROWN et al., 2007b).

Algumas cepas de E. coli têm a capacidade de produzir tanto

enterotoxinas como verotoxinas dando lugar a um quadro clínico de diarreia e

edemas (BLANCO et al., 1997; NOAMANI et al., 2003) embora não seja frequente

animais afetados pela doença do edema apresentarem diarreia (BROWN et al.,

2007b).

1.4.4 Alterações clinicopatológicas

a) Processos agudos

Os animais que morrem em consequência de diarreia pós-desmame

associada a E. coli apresentam, em geral, boa condição corporal, ainda que com

sinais de desidratação como olhos fundos e cianose. É frequente ver o intestino

delgado dilatado, edematoso e hiperêmico com conteúdo que pode variar entre

aquoso e mucoso. No intestino grosso são encontradas apenas lesões, em raras

ocasiões há conteúdo aquoso-mucoso e ligeira congestão. Às vezes observam-se

as fezes com coloração amarelada. Em muitos casos as veias do estômago estão

congestas (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999; BROWN et al., 2007b).

Quanto às lesões microscópicas, a diarreia por cepas ETEC manisfesta-se

por discretos sinais de inflamação, sendo que a mucosa e o epitélio aparecem

intactos ou com alterações mínimas (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999;

BROWN et al., 2007b; GOSWAMI et al., 2008). É muito característico nos animais

mortos pela enfermidade, observar bactérias aderidas à superfície do íleo (WADA

et al., 1996). Alguns autores descreveram um incremento do número de

neutrófilos na lâmina própria e atrofia das vilosidades (VIJTIUK et al ., 1995).

12

b) Processos crônicos

A atrofia ou encurtamento das vilosidades intestinais é um achado

histopatológico frequente nos animais domésticos, e pode ser o resultado de um

amplo número de causas, entre estas se incluem agentes víricos, bacterianos e

parasitários, causas alimentares e idiopáticas (BROWN et al., 2007a). Na lesão

microscópica ainda pode obsevar-se proliferação das criptas (VIJTIUK et al.,

1995). Essas alterações revelam perda significativa da superfície intestinal,

gerando má absorção e diarreia. Na lâmina própria normalmente aparece um

infiltrado celular que desaparece em poucos dias, quando cessa a infecção. Em

processos mais prolongados observa-se um infiltrado de linfócitos e células

plasmáticas. A infecção por E. coli foi relacionada por diversos autores, tanto com

atrofia das vilosidades intestinais como ao aumento do infiltrado celular (COX et

al., 1988; VIJTIUK et al., 1995; OPAPEJU et al., 2009).

1.4.5 Diagnóstico

O diagnóstico da diarreia pós-desmame em suínos é complexa pelas

múltiplas etiologias capazes de dar uma sintomatologia similar, além de

possibilidade de infecções conjuntas (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999).

O aparecimento de diarreia nos primeiros dias pós-desmame, com marcante

desidratação podem ajudar no diagnóstico, porém a confirmação de diarreia pós-

desmame associada a E. coli requer provas laboratoriais, como técnicas de

cultivo bacteriano, ELISA ou imunofluorescência indireta e PCR (FRANCIS, 1983;

MULLANEY et al., 1991; BLANCO et al., 1992; BLANCO et al., 2004).

1.4.6 Vacinação contra a colibacilose

13

As superfícies mucosas são as vias de entrada mais frequentes para

qualquer antígeno potencialmente patogênico do meio ambiente, dessa forma o

sistema imunológico concentra grande quantidade de anticorpos IgA nas mucosas

do organismo (NEUTRA et al., 1987). A IgA é capaz de se unir aos receptores de

vírus ou bactérias inibindo total ou parcialmente a entrada no organismo. A união

das fímbrias F4 e F18 aos receptores F4 e F18 dos enterócitos é um passo

essencial na patogênese da E. coli, de maneira que os leitões que não expressam

estes receptores são resistentes à cepas F4+ e F18+ (RUTTER et al., 1975;

FRYDENDAHL et al., 2003). Ao contrário, animais com receptores F4/F18 na

superfície dos enterócitos serão susceptíveis, pois uma resposta imune na qual

há produção de anticorpos que impeçam a união das fímbrias ao receptor,

poderia reduzir ou inclusive impossibilitar a colonização bacteriana. Por essa

razão diversos autores dedicaram suas pesquisas à criação de vacinas contra os

antígenos das fímbrias F4 e F18 (BIANCHI et al., 1996; VAN DEN BROECK et al.,

1999; FELDER et al., 2000; VERDONCK et al., 2004; VERDONCK et al., 2007;

MELKEBEEK et al., 2007a; MELKEBEEK et al.; 2007b; TIELS et al., 2008)

(Quadro 3).

A vacinação de porcas contra a E. coli mostra-se como um método

econômico e muito eficaz na prevenção de processos colibacilares nas primeiras

etapas da vida dos leitões. A imunidade adquirida pelo colostro protege os leitões

no início do período neonatal, período em que ocorrem a maioria das mortes por

ETEC, porém a imunidade que a porca concede aos leitões é pouco duradoura,

ficando os animais expostos à enfermidade durante o final da fase de creche e o

início do crescimento/terminação (MOON & BUNN, 1993). Com a finalidade de

proporcionar aos leitões uma imunidade mais duradoura, foram realizadas várias

pesquisas para a produção de vacinas de aplicação direta em leitões, porém os

resultados são pouco satisfatórios (Quadro 3).

Nos trabalhos expostos no Quadro 3 observa-se que: 1. A via de

administração da vacina é principalmente oral para conseguir imunidade ativa nas

mucosas; 2. A imunidade adquirida, nos trabalhos com melhores resultados,

reduz a gravidade do processo, mas não evita a infecção; 3. As vacinas de DNA

podem potenciar a resposta imune sem interferir com anticorpos maternais (BOT

& BONA, 2002).

14

Os objetivos de vacinar os animais contra a E. coli são: reduzir as perdas

ocasionadas pela diarreia pós-desmame e reduzir a necessidade de tratamentos

profiláticos e terapêuticos (BERTSCHINGER & GYLES, 1994; FAIRBROTHER et

al., 2005). Além disso, a vacinação de suínos pode servir como referência em

estudos de vacinação humana, por ser o leitão desmamado, o único modelo

natural para estudos de imunidade contra a infecção por cepas ETEC no homem

(FELDER et al., 2000).

QUADRO 3 - Vacinas testadas em leitões para imunizar leitões contra ETEC.

VACINA UTILIZADA VIA DE

ADMINISTRAÇÃO EFETIVIDADE AUTOR

Cepas E. coli F4+

inativadas con

formaldeído

Intramuscular Não efetiva BIANCHI et al.

(1996)

Fímbria F18

encapsulada em

microesferas de

poly(lactide-co-

glycolide)

Oral Não efetiva FELDER et al.

(2000)

Fímbria F18 purificada

veiculada adyuvante

mucoso

Oral e nasal Não efetiva VERDONCK et

al. (2007)

Conjugação de FedF e

de fimbria F4 Oral

Redução da excreção

de E. Coli F18 em

animais infectados

TIELS et al.

(2008)

Administração de

fímbria F4 purificada Oral

Estimulação do

sistema imune da

mucosa: produção de

IgA e IgG

VAN DEN

BROECK et al.

(1999)

Subunidad FaeG

recombinante de

Fímbria F4

Oral

Produção de Ac

sistémicos e na

mucosa contra F4.

Redução da excreção

de E. Coli F4

VERDONCK et

al. (2004)

Vacina ADN para

subunidade FaeG de Intradérmica

Produção de Ac

sistémicos IgG

MELKEBEEK et

al. (2007a)

15

F4. sistémicos. Ligeira

redução da excreção

de E.Coli F4

MELKEBEEK et

al. (2007b)

Diante do exposto, o lançamento no mercado de uma vacina contra a

E. coli - Clostridium - COLIDEX® registrada para uso direto em leitões leva a

necessidade de uma pesquisa, com o objetivo de determinar a eficácia desta

vacina para a prevenção de problemas colibacilares em leitões nas fases de

creche e crescimento/terminação, avaliar a ocorrência de agentes envolvidos no

complexo entérico suíno e alguns aspectos da resposta imune intestinal.

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23

CAPÍTULO 2 – EFEITO DA VACINAÇÃO CONTRA Escherichia coli EM

LEITÕES SOBRE O DESMPENHO NAS FASES DE CRECHE E

CRESCIMENTO/TERMINAÇÃO

EFFECT OF VACCINATION OF PIGLETS AGAINST Escherichia coli ON

NURSEY AND FINISHING PRODUCTION PERFORMANCE

RESUMO

O controle da diarreia pós-desmame causada pela Escherichia coli ainda não está bem estabelecido. O desenvolvimento da vacina Colidex® (Farcovet, Espanha), registrada para uso parenteral direto em leitões levou a realização deste trabalho, com o objetivo de determinar o efeito de três diferentes protocolos de vacinação de leitões contra a E. coli, avaliando parâmetros clínicos na creche, assim como parâmetros produtivos e econômicos nas fases de crescimento/terminação. Foi utilizado um total de 8.299 leitões, divididos em seis grupos e vacinados aos 10 e 20 dias de idade (V10-20), aos 10 e 30 dias de idade (V10-30) e aos 20 e 30 dias de idade (V20-30), cada grupo tinha um grupo controle contemporâneo. De acordo com os resultados deste estudo, o uso de Colidex® para a prevenção da diarreia pós-desmame em leitões produziu importantes melhorias sanitárias, produtivas e econômicas, sendo o melhor protocolo de vacinação a primeira vacinação aos 10 dias de idade e a revacinação aos 20 dias de idade. Desta forma conclui-se que esta vacina parenteral é uma nova estratégia de controle para as enfermidades entéricas associadas a este patógeno. Palavras-chave: Colibacilose, diarreia pós-desmame, índice de conversão,

ganho médio diário, vacina parenteral. ABSTRACT

The control of post-weaning diarrhea caused by Escherichia coli is not well established. Colidex® (Farcovet, Spain), is a new vaccine registered for parenteral use in piglets. This study aims to determine the effect of three different protocols of vaccination of piglets against E. coli using Colidex®, evaluating clinical parameters in the nursery, as well as economic and productive parameters during growing and finishing. 8,299 pigs were divided into six groups and three of them were vaccinated at 10 and 20 days of age (V10-20), 10 and 30 days of age (V10-30) and at 20 and 30 days of age (V20-30). Each group had a contemporaneous control group (C10-20, C10-30, C20-30). The use of Colidex® for the prevention of post-weaning diarrhea in piglets improves health, productive and economical parameters. The best protocol was vaccination at 10 days of age and revaccination 10 days after. This provides a new parenteral vaccination control strategy for enteric diseases associated with E. coli.

24

Keywords: Average daily gain, colibacillosis, feed conversion, post-weaning

diarrhea, parenteral vaccine.

25

1 INTRODUÇÃO

A Escherichia coli é uma bactéria colonizadora habitual do trato

gastrointestinal dos animais, entretanto algumas cepas podem ser responsáveis

por uma ampla variedade de enfermidades em suínos, como diarreia em fases

distintas da produção e a doença do edema (MARTINS et al., 2000;

FAIRBROTHER, 2006).

Entre essas enfermidades a diarreia pós-desmame é considerada uma

importante causa de diminuição do ganho de peso ou morte de leitões

desmamados em todo o mundo (FAIRBROTHER et al., 2005). Esta enfermidade

é causada por cepas de E. coli que possuem fatores de virulência que

determinam a colonização das vilosidades intestinais e a produção de

enterotoxinas (WILSON & FRANCIS, 1986; MOON & BUNN, 1993). A importância

da colibacilose não se limita às perdas produtivas e econômicas que por si só

ocasiona (FAIRBROTHER et al., 2005), mas também pela adesão e produção de

enterotoxinas por cepas patógenas de E. coli, que podem criar condições

favoráveis para que outros microrganismos entéricos exerçam sua ação

patogênica (WHITNEY et al., 2006).

Nos últimos dez anos, verificou-se um agravamento do quadro clínico e

aumento da prevalência das enfermidades entéricas associadas a E. coli em

suínos, especialmente durante as fases de creche e crescimento/terminação. Fato

que tem gerado importantes perdas no rendimento produtivo e um incremento no

custo de produção final (PALLARÉS et al., 2006). As modificações na forma de

apresentação da colibacilose poderiam estar associadas a fatores como a intensa

prevenção na fase de maternidade, o aparecimento de cepas altamente

virulentas, mudanças no manejo dos suínos e maior resistência bacteriana aos

antibióticos (FAIRBROTHER et al., 2005).

O protocolo clássico de prevenção contra a E. coli baseia-se na

vacinação das reprodutoras. Na literatura científica descreve-se a eficiência da

vacinação parenteral da porca para prevenir a diarreia neonatal produzida por E.

coli. RIISING et al. (2005) concluíram que a vacinação das porcas protegeu de

maneira significativa os leitões, reduzindo a mortalidade e a diarreia grave. Este

protocolo tem sido considerado satisfatório para controlar a colibacilose durante a

26

fase de lactação, entretanto alteraram a patogenia da enfermidade, atrasando-a

até as fases de creche e crescimento/terminação. Durante essas últimas fases, a

imunidade passiva induzida pela vacinação das porcas já não é efetiva e a

vacinação dos leitões poderia ser uma solução para a prevenção desta

enfermidade neste período (BIANCHI et al., 1996).

Alguns autores trabalharam com adjuvantes associados à vacina oral

em leitões desmamados na tentativa de melhorar a resposta imune contra a E.

coli. BOZIC et al. (2003) descreveram que o uso de levamisol como adjuvante

potencializou o efeito de uma vacina composta por cepa não enterotoxigênica de

E. coli, quando comparado com o grupo controle que não recebeu levamisol.

Porém, quanto ao uso de vacinas parenterais em leitões MOON & BUNN (1993) e

BIANCHI et al. (1996) relatam que o uso de fimbrias F4ac purificada ou o conjunto

de células bacterianas que expressem o antígeno F4ac não induziu a imunidade

protetora contra o desafio bacteriano.

Recentemente, foi desenvolvida uma vacina, Colidex® (Farcovet,

Espanha), que está registrada para o uso parenteral diretamente nos leitões. Esta

vacina está indicada para a prevenção da diarreia pós-desmame causada por

diversos sorotipos de E. coli enterotoxigênicos. Esta vacina foi desenvolvida

contra antígenos e toxóides, de maneira que está direcionada a todas as

combinações possíveis de mecanismos de patogênese de E. coli. Assim o

objetivo do presente estudo foi determinar o efeito de três protocolos diferentes de

vacinação de leitões contra a E. coli usando Colidex®, avaliando parâmetros

clínicos na creche, assim como parâmetros produtivos e econômicos nas fases de

crescimento/terminação.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

O comitê de bem-estar animal da Universidade de Murcia examinou e

aprovou todos os protocolos experimentais. Os animais foram criados em

condições que cumpriam em todo momento a legislação espanhola com respeito

à normatização de granjas de suínos (Real decreto - R. D. 324/2000, de 3 de

março, que estabelece normas básicas de ordenação das granjas de suínos) e

27

quanto às normas de bem-estar (R. D. 1135/2002, de 31 de outubro, relativo às

normas mínimas para a proteção de suínos; transposição literal da Diretiva

2001/88/CE, de 23 de outubro de 2001, relativa às normas mínimas para proteção

de suínos).

2.1 Granja e animais

Foi utilizado um total de 8299 leitões de cruzamento comercial de

Duroc x (Landrace x Large White). Os animais procediam de porcas que haviam

sido vacinadas com Colidex® aos 80 dias de gestação nas duas gestações

prévias. Foram formados grupos distintos, de acordo com o protocolo de

vacinação: leitões vacinados e revacinados aos 10 e 20 dias de vida (V10–20),

vacinados e revacinados aos 10 e 30 dias de vida (V10-30) e vacinados e

revacinados aos 20 e 30 dias de vida (V20-30). Para cada grupo vacinado, havia

um grupo contemporâneo sem vacinar para servir de controle em cada protocolo

experimental (C10-20, C10-30 e C20-30). No Quadro 1 encontra-se detalhado os

grupos experimentais e as datas em que se realizaram as provas.

QUADRO 1 - Grupos experimentais da prova COLIDEX-C® em múltiplas fases, Murcia,

2012.

Grupo Protocolo Nº suínos Data de entrada

creche

Data entrada

crescimento/terminação

Vacinado V10-20 1893 Outubro 2008 Dezembro 2008

Controle C10-20 1869 Novembro 2008 Janeiro 2009

Vacinado V10-30 1200 Janeiro 2009 Março 2009

Controle C10-30 1200 Fevereiro 2009 Abril 2009

Vacinado V20-30 851 Março 2009 Maio 2009

Controle C20-30 1286 Abril 2009 Junho 2009

Os animais foram castrados cirurgicamente dentro da primeira semana

de vida, de acordo com o R.D. 1135/2004 que estabelece as medidas de proteção

mínimas para suínos.

Os animais permaneceram durante o período experimental sem

medicação rotineira contra patógenos entéricos.

28

Todos os grupos experimentais foram criados sob as mesmas

condições ambientais e de manejo, usando a mesma ração para cada fase e nas

mesmas granjas. O sistema produtivo onde se desenvolveu o experimento é um

sistema de produção em sítios. A maternidade, a creche e a terminação estão em

três localizações geográficas distintas, situadas todas na província de Toledo

(Espanha).

Na fase de creche, os animais foram criados em três galpões com 1000

animais em cada, estando divididas em três módulos cada uma. O tamanho das

baias era de 2,7 m2, onde se alojavam 12 leitões. Cada baia estava dotada com

bebedouro tipo chupeta com concha metálica com água a disposição, e com um

comedouro tipo funil metálico com três espaços de comedouro. Foi fornecida

ração farelada à vontade.

Na fase de crescimento/terminação, foram utilizadas 11 galpões com

600 animais cada, com uma superfície livre de 8,4 m2 onde foram alojados 12

animais. Cada baia estava dotada com bebedouros tipo chupeta com concha de

concreto com água à disposição e um comedouro tipo funil de concreto com dois

espaços de comedouro. Foi fornecida ração granulada à vontade.

As instalações foram manejadas mediante o sistema todos dentro -

todos fora, por sala na creche e por edifício no crescimento/terminação.

Uma vez alcançado o peso comercial, os suínos foram abatidos no

Frigorífico Incarlopsa (Tarancón, Cuenca, Espanha) segundo os métodos

rotineiros estabelecidos pela legislação.

2.2 Vacina

A vacina utilizada, COLIDEX-C® (Farco Veterinaria, S.A., España), é

composta de uma suspensão de sete cepas de E. coli, inativadas com formol e

com calor, assegurando-se a presença, na mistura final, dos antígenos fimbriais

K88 (F4), K99 (F5), K41 (F41), K18 (F18) e P987 (F6), assim como dos toxóides

da toxina termolábil (LT), termoestável (STa), verotoxina (VT) e hemolisina (Hly),

combinada com toxóide de Clostridium perfringens Tipo C. Cada dose de 2 ml

contém 2x109 microrganismos de cada uma das cepas bacterianas inativadas

29

com calor, 1,5x109 microrganismos de cada uma das cepas inativadas com formol

e 300 UI de toxóide ß de C. perfringens.

Os animais incluídos nos grupos vacinados foram vacinados e

revacinados mediante injeção intramuscular cervical. Sendo a dose de 0,5 ml de

COLIDEX-C® para primeira vacinação e 1 ml para revacinação. Os animais dos

grupos controle receberam uma injeção com o mesmo volume de solução salina

fisiológica como placebo.

2.3 Coleta de dados clínicos e de desempenho

O estudo clínico e produtivo foi realizado tanto durante o período de

creche quanto durante a fase de crescimento/terminação, nos seis grupos

experimentais (V10-20, C10-20, V10-30, C10-30, V20-30, C20-30). Durante a

creche foram registrados para cada grupo experimental, a mortalidade, os surtos

de enfermidades entéricas e respiratórias, a morbidade em cada surto de

enfermidade, as medicações coletivas realizadas, assim como os animais que

não alcançaram o peso necessário para a saída para a terminação ao mesmo

tempo que seus contemporâneos.

Foi considerado como um surto de enfermidade entérica aquele em

que a sintomatologia generalizada foi diarreia, qualquer que fosse a suposta

causa, que afetasse mais de 20% dos leitões e requeresse medicação coletiva.

Foi considerado como um surto de enfermidade respiratória aquele em que a

sintomatologia predominante foi tosse, espirro e dispneia, independentemente da

causa, que afetasse mais de 20% dos animais e requeresse uma medicação

coletiva.

Todos os animais que morreram na creche foram necropsiados para

estabelecer um diagnóstico presuntivo. Sendo classificadas em “causa

respiratória”, nos casos de lesões compatíveis com um processo inflamatório no

pulmão; “causa entérica”, quando as lesões eram compatíveis com um processo

inflamatório gastroentéricos; e “refugos” para os animais com perda de condição

corporal que indicasse um processo patológico prolongado, independente da

causa.

30

Durante a fase de crescimento/terminação foram registrados os dados

de mortalidade, peso dos leitões ao início do crescimento/terminação, quantidade

de ração consumida durante crescimento/terminação, custo de medicações, peso

ao abate, duração da fase de crescimento/terminação e os animais não

comercializados ao final da terminação, assim como os custos diretos e indiretos.

Com estes dados foram calculados o ganho médio diário (GMD), o índice de

conversão alimentar (IC), e o custo por cada Kg ganho durante a terminação por

leitão (CKR).

2.4 Análise estatística

Os resultados foram analisados com o programa estatístico SPSS

versão 15.0 (SPSS Inc., Estados Unidos).

Para as comparações dos dados clínicos e produtivos, foi utilizado

como referência o desvio padrão, pois não foi possível realizar replicados ao se

usar amostras muito numerosas. Para isso, foram recompilados os dados

produtivos obtidos para o mesmo tipo de animal na mesma granja de creche e

crescimento/terminação durante os 12 meses precedentes ao estudo e foram

calculadas as estatísticas básicas. As diferenças maiores que o desvio padrão

obtido foram consideradas significativas.

3 RESULTADOS

3.1 Fase de creche

As fases de creche tiveram uma duração média de 44±2 dias, sem

diferenças significativas entre protocolos vacinais nem entre os grupos vacinados

e controles dentro de cada protocolo. Os dados referentes à mortalidade e causas

de mortalidade estão relacionados na Tabela 1.

31

TABELA 1 - Mortalidade total de leitões nos grupos vacinados e controle na fase de

creche, Murcia, 2012.

Protocolo Grupo Leitões

(nº) Mortes

(nº) Mortalidade

(%) ∆Mortalidade

(%)

V10-20 vacinado 1893 29 1,53 -2,11

C10-20 controle 1869 68 3,64

V10-30 vacinado 1200 35 2,92 -0,08

C10-30 controle 1200 36 3,00

V20-30 vacinado 851 24 2,82 +1,65

C20-30 controle 1286 14 1,17

Nos grupos V10-20 e V10-30 ocorreu menor mortalidade comparada

aos grupos controles. No caso do grupo V20-30, a mortalidade do grupo vacinado

superou a mortalidade do grupo controle.

FIGURA 1 – Mortalidade de leitões classificadas por causas nos grupos vacinados e

controles na fase de creche.

* Porcentagem calculada sobre o total de mortes

Com respeito ao percentual de mortes, foi observado que nenhum dos

grupos vacinados teve mortalidade registrada por causas entéricas no resultado

das necropsias realizadas durante a creche. Entretanto, os grupos controle C10-

20 e C10-30 apresentaram mortalidade por causas entéricas, representando

11,76% e 5,56% sobre o total de mortes, respectivamente. Observaram-se

diferenças no percentual de refugos mortos sobre o total de mortes ao comparar

0

10

20

30

40

50

60

70

80

V10-20 C10-20 V10-30 C10-30 V20-30 C20-30

0

11,76

0 5,56

0 0

10,34

0

8,57

0 0 0

24,14

38,24 42,86

55,56

75

42,86

% d

e m

ort

es

Protocolo vacinal

Entéricas

Respiratórias

Refugos

32

os grupos V10-20 e C10-20 (24,14% e 38,24%) e ao comparar os grupos V20-30

e C20-30 (75% e 42,86%).

Os surtos de enfermidades entéricas e respiratórias com a morbidade

estimada aparecem na Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente.

TABELA 2 – Surtos e morbidade por causa entérica e dias de medicação em cada surto

detectado durante o experimento nos grupos vacinados e controle na fase

de creche, Murcia, 2012.

Protocolo Surtos entéricos

(nº) Morb 1

(%) Morb 2

(%) Dias medicados

V10-20 0 0 0 0

C10-20 2 30 25 10

V10-30 0 0 0 0

C10-30 1 35 0 5

V20-30 0 0 0 0

C20-30 0 0 0 0

Os animais do grupo C10-20 e C10-30 mostraram sinais de

enfermidade entérica que afetava mais de 20% da população, enquanto que nos

demais grupos não se observaram sinais generalizados que requeressem

medicação coletiva.

TABELA 3 – Surtos e morbidade por causa respiratória e dias de medicação em cada

surto detectado durante o experimento nos grupos vacinados e controle na

fase de creche, Murcia, 2012.

Protocolo Surtos

respiratórios (nº)

Morb 1 (%)

Morb 2 (%)

Morb 3 (%)

Morb 4 (%)

Morb 5 (%)

Dias medicados

V10-20 4 50 35 60 60 0 14

C10-20 5 40 60 50 60 40 23

V10-30 3 60 30 40 0 0 14

C10-30 0 0 0 0 0 0 0

V20-30 1 50 0 0 0 0 10

C20-30 0 0 0 0 0 0 15

33

Com respeito aos surtos de enfermidades respiratórias, os grupos V10-

20 e C10-20 foram os que maior número de surtos apresentaram, seguidos do

grupo C10-30.

As principais diferenças na fase de creche foram entre o lote V10-20 e

seu controle, observou-se menor mortalidade (- 2,11%), ausência de surtos de

enfermidades entérica enquanto o grupo controle apresentou dois surtos e menor

número de mortes classificadas como refugos (enfermidades crônicas) (-14,10%).

Todos estes benefícios produziram uma diferença no custo do leitão de R$ 1,15

nas condições de mercado analisadas.

3.2 Fase de crescimento/terminação

Utilizando o desvio padrão dos parâmetros produtivos de 2008-2010,

encontrou-se diferença significativa no índice de conversão alimentar comparando

V10-20 e C10-20 (0,168 Kg corresponde a -5,58%). O ganho médio diário foi

maior nos animais vacinados, porém a diferença não superou o desvio padrão

utilizado para comparação (0,014 kg contra SD = 0,059kg), portanto não foi

significativo. Para os demais parâmetros avaliados não se encontrou diferença

significativa entres os protocolos de vacinação testados.

Analisando o protocolo V10-30, houve diferença estatística significativa

no peso médio ao abate (- 4,82%), mortalidade (-17,62%), dias permanência total

em crescimento /terminação (-15 dias), dias médios de permanência crescimento

/terminação (-17 dias) e em refugos (+2,62%) em comparação ao controle C10-

30. Para os demais parâmetros avaliados não houve diferença estatística

significativa.

O protocolo V20-30 apresentou diferença significativa somente em

peso médio ao abate (- 5,85%) e refugos (-2,27%) em comparação com seu

controle C20-30.

Nos grupos V10-20 e C10-20, a mortalidade (- 18,65%), o índice de

conversão alimentar (- 5,58%) e animais não comercializáveis (-14,6%)

apresentaram grande diferença estatística, o que produziu a redução do custo do

34

quilo ganho (-2,06%). Todas as melhorias apresentadas pelo grupo V10-20 gerou

uma economia de R$ 4,60 por suíno terminado, comparado ao grupo C10-20.

Os resultados obtidos para cada grupo aparecem na Tabela 4.

TABELA 4 – Desempenho dos animais em crescimento/terminação para cada grupo

experimental, Murcia, 2012. PROTOCOLO PME PMA IC KR GMD CMC CKR MORTES DPT DPM REFUGOS

V10-20 21,0 108,1 2,845 87,1 ,740 3,10 2,41 6,67 136 118 5,36

C10-20 20,2 107,55 3,013 87,35 ,726 2,76 2,45 8,2 134 121 6,28

V10-30 22,1 102,55 2,848 80,45 ,660 4,06 2,48 8,51 135 118 4,39

C10-30 23,2 107,78 2,887 84,58 ,630 3,08 2,39 10,33 150 135 1,77

V20-30 20,7 106,56 3,032 85,86 ,630 5,21 2,50 7,92 146 136 1,90

C20-30 24,1 113,18 2,915 89,08 ,650 4,43 2,50 7,08 150 137 4,17

PME: peso médio de entrada a crescimento/terminação (Kg); PMA: peso médio abate (Kg), IC: índice de

conversão alimentar (Kg/Kg), KR: quilos ganhos em crescimento /terminação (Kg), GMD: ganho médio diário

(Kg), CMC: custo com medicações por leitão (R$), CKR: custo quilo ganho crescimento /terminação (R$),

DPT: dias permanência total em crescimento /terminação, DPM: dias médios de permanência crescimento

/terminação, REFUGOS: percentual de animais não comercializados no final crescimento /terminação.

TABELA 5 – Média e desvio padrão dos parâmetros produtivos na fase de

crescimento/terminação nos anos de 2008-2010 na mesma granja,

Murcia, 2012. PME PMA IC KR GMD CMC CKR MORTES DET DEM REFUGOS

Media 21,54 111,35 3,02 89,81 0,69 1,55 7,49 127,42 127,42 2,50

SD 2,29 4,52 0,156 4,43 0,059 0,678 1,71 7,74 7,74 1,53

PME: peso médio de entrada a crescimento/terminação (Kg); PMA: peso médio abate (Kg), IC: índice de

conversão alimentar (Kg/Kg), KR: quilos ganhos em crescimento /terminação (Kg), GMD: ganho médio diário

(Kg), CMC: custo com medicações por leitão (R$), CKR: custo quilo ganho crescimento /terminação (R$),

DPT: dias permanência total em crescimento /terminação, DPM: dias médios de permanência crescimento

/terminação, REFUGOS: percentual de animais não comercializados no final crescimento /terminação.

4 DISCUSSÃO

Em suínos, a E. coli é de grande importância econômica, em função

das perdas por mortalidade, por afetar alguns parâmetros produtivos como o

índice de conversão alimentar e ganho médio diário, pelo surgimento de muitos

refugos e pelos gastos com medicamentos no seu controle (MORÉS & MORENO,

2007; TREVISI et al., 2009). Em outras espécies como as aves, este efeito

negativo da E. coli também foi observado por BORATTO et al. (2004), que

35

relataram que as aves inoculadas com E. coli apresentaram significativamente

menor consumo de ração, menor ganho de peso e pior conversão alimentar que

aves não inoculadas.

Os grupos de animais utilizados neste estudo do tipo caso-controle

foram homogêneos, evitando fatores que pudessem provocar diferenças entre

grupos. Cabe destacar que não houve diferenças significativas no peso de

entrada à fase de crescimento/terminação o que poderia haver influenciado

parâmetros como o índice de conversão, o peso ao sacrifício ou a duração da

fase de crescimento/terminação. O que indicaria que as diferenças nos

parâmetros observados foram devido à vacina.

Este é o primeiro trabalho sobre vacinação parenteral em suínos frente

E. coli realizado em condições de campo. A vacinação direta dos leitões com

Colidex® permitiu avaliar os parâmetros clínicos, produtivos e econômicos dos

animais que participaram do experimento, comparando três protocolos vacinais

diferentes.

Não existe muita literatura disponível sobre o uso de vacinas contra a

E. coli em leitões desmamados. Sendo este o primeiro trabalho científico relatado

com Colidex® depois de seu registro para uso em leitões na Espanha. A maioria

dos trabalhos publicados com vacinas contra a E. coli são estudos experimentais

que utilizam um número reduzido de animais (BIANCHI et al., 1996; FELDER et

al., 2001; VERDONCK et al., 2007), situação diferente das condições encontradas

nas granjas de produção. Além disso, nesses estudos, os animais foram

vacinados, desafiados e abatidos poucos dias ou semanas após o desafio, sem

que houvesse tempo suficiente para avaliar índices produtivos. No presente

estudo foi realizado um estudo caso-controle em condições de campo, o que em

muitos aspectos dificulta a comparação com os resultados obtidos de forma

experimental.

A mortalidade, na fase de creche, observada no presente estudo,

independente do grupo (vacinado ou controle) e do protocolo, não superou 3,64%.

Este dado está de acordo com o citado por MORES & MORENO (2007) que

afirmam que a mortalidade é muito variável em função dos fatores de risco

encontrados na granja, entretanto geralmente, são menores de 10%. Porém, o

fato dos animais vacinados, independente do protocolo de vacinação, não

36

apresentarem mortalidade por causas entéricas e não apresentarem surtos

entéricos quando comparados com os grupos controle, sugere a proteção efetiva

da vacina nos animais vacinados.

Os resultados do presente estudo, diferem do estudo prévio de

BIANCHI et al. (1996) que também trabalharam com vacina intramuscular, no

entanto, utilizaram cepas de E. coli F4+ inativadas com formaldeído, em leitões

criados em condições de isolamento e desafiados com E. coli, 14 dias após a

vacinação, e concluíram que a vacina não foi efetiva ante o desafio com E. coli.

Da mesma maneira, difere de FELDER et al. (2001) e VERDONCK et al. (2007)

que trabalharam com vacinas elaboradas com fimbrias F18 e de aplicação oral e

oral/nasal respectivamente, não obtendo tampouco resultados positivos.

O índice de conversão está diretamente relacionado com a eficiência

do uso da ração consumida, sendo desejável que cada unidade de carne

produzida requeira a mínima quantidade de ração ingerida. Igualmente é

desejável um ganho médio diário elevado, o que diminui os ciclos produtivos. O

índice de conversão alimentar junto com o ganho médio diário são os caracteres

biológicos de maior significado econômico na fase de terminação. No presente

estudo, os animais do grupo V10-20 apresentaram menor índice de conversão

alimentar em comparação ao seu grupo controle. Quanto ao ganho médio diário

encontrado no presente trabalho, este foi maior nos animais V10-20, porém não

houve diferença significativa. Em outras experiências, em que se estudou

procedimentos de prevenção, foi constatado que leitões recém-desmamados e

desafiados com cepas de E. coli K99, mostraram significativamente menor GMD,

menor consumo médio de alimento diário e menor IC que animais tratados com

plasma seco e colistina (TORRALLARDONA et al., 2003).

Outros autores concluíram que depois do desafio com E. coli

enterotoxigênica, em geral, os leitões podem mostrar um crescimento reduzido,

porém também demonstraram que o uso de alguns elementos protetores podem

atuar reduzindo o impacto da infecção sobre os parâmetros produtivos. Este fato

foi observado quando se utilizou triptofano para tentar diminuir o impacto da E.

coli sobre leitões (TREVISI et al., 2009). MORES & MORENO (2007) afirmam que

existe uma redução na taxa de ganho de peso dos leitões ainda que a diarreia

seja transitória. Estas experiências aportam evidências de que a infecção por E.

37

coli potencialmente altera os parâmetros de crescimento e eficiência, e que o uso

de elementos protetores podem evitar ou diminuir o impacto da E. coli sobre os

animais, como observado no presente estudo.

YAN et al. (2009) comparando características de produção entre suínos

com e sem receptor F4 encontraram que os animais com receptor F4ab, F4ac ou

com ambos mostraram maior ganho médio diário, maior peso de carcaça e maior

comprimento de carcaça que suínos que não tinham estes receptores. Os autores

atribuíram estes resultados ao fato de que a microbiota intestinal normal

(lactobacilos e bifidobactérias) poderia reconhecer e unir-se a estes receptores

para exercer uma barreira contra a aderência e colonização de bactérias

patógenas e ao mesmo tempo promoveriam a digestão e absorção dos alimentos

(MENG et al., 1998). De maneira similar, uma redução na carga de E. coli

derivada de um procedimento imunoprofilático como o estudado, deveria deixar

disponíveis maior número de receptores para a flora saprófita, cumprindo o

paradigma anteriormente esboçado.

Os grupos V10-20 apresentou menor número de animais refugos que

seu controle, porém estes e C10-20 apresentaram maior número de refugos na

fase de crescimento/terminação quando comparados com os outros protocolos de

vacinação. Este resultado, provavelmente, deve-se ao fato de as fases de

crescimento/terminação dos grupos V10-20 e C10-20 terem sido realizados no

inverno, o que poderia produzir um incremento no número de refugos por outras

causas como as enfermidades respiratórias ou as multissistêmicas víricas (RAMIS

et al., 2011).

Para analisar adequadamente os dados deve-se considerar que os

experimentos foram realizados em lotes sucessivos durante ano de 2009, o que

poderia gerar variações estacionais entre grupos. Entretanto, cada grupo

vacinado teve um grupo controle contemporâneo, que permitiu realizar as

comparações desejadas. Também, deve-se considerar as diferenças estacionais

que podem ocorrer entre protocolos, por isso as comparações só são possíveis

entre os grupos vacinados e seus controles.

A diferença que há no índice de conversão comparando o lote V10-20

e seu controle é maior em relação os demais protocolos. Porém, estes grupos

foram criados no inverno, o que poderia justificar este índice conversão alimentar

38

maior, já que em algumas partes da Espanha há uma forte correlação entre a

temperatura ambiental e este parâmetro (R2=0,9147, p<0,001), sendo os meses

de inverno os que apresentam um maior índice de conversão da ração pelo

consumo de energia nos mecanismos de termorregulação (NIENABER et al.,

1989).

O lote V10-20 foi o que menor índice de conversão obteve (2,845 Kg)

junto com o lote V10-30 (2,848 kg), porém o primeiro foi realizado em inverno

(dezembro-fevereiro), o segundo foi realizado na primavera. Por outro lado, o

desvio padrão do índice de conversão para a população estudada é de 0,156 kg,

por isso a diferença entre os lotes V10-20 e C10-20 (0,168 kg) é significativa.

Entretanto, esta diferença não foi observada de forma constante nos demais

grupos, o que novamente sugere que o protocolo de vacinação mais adequado é

aos 10 e 20 dias de vida.

Na fase de crescimento/terminação, a redução de 2%, observada no

grupo V10-20 comparado ao C10-20, no custo de produção por quilo ganho

significa uma economia de R$ 4,64 por cada animal produzido. Somando estes

benefícios com os benefícios obtidos durante a creche, há uma economia de R$

5,80 por cada animal terminado, o que cobre o custo da vacina e deixa um

benefício marginal elevado para o produtor.

De acordo com os resultados deste estudo, a vacinação de leitões aos

10 dias e a revacinação aos 20 dias de idade, via intramuscular, demonstrou ser

eficiente para melhorar o desempenho e o custo de produção em um sistema de

produção em sítios com histórico de problemas causados por E. coli.

5 CONCLUSÕES

Nas condições do presente estudo, o uso de Colidex® para a

prevenção da diarreia pós-desmame em leitões produziu importante melhorias

sanitárias, produtivas e econômicas em leitões nas fases de creche e

crescimento/terminação, sendo o melhor protocolo de vacinação, a primeira

vacinação aos 10 dias de idade e a revacinação aos 20 dias de idade.

39

REFERÊNCIAS

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41

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42

CAPÍTULO 3 – DETECÇÃO DE PATÓGENOS DO COMPLEXO ENTÉRICO

SUÍNO E ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE EM SUÍNOS VACINADOS

CONTRA Escherichia coli

DETECTION OF PATHOGENS PORCINE ENTERIC COMPLEX AND

ASPECTS OF THE IMMUNE RESPONSE IN PIGS VACCINATED

AGAINST Escherichia coli

RESUMO

A adesão e produção de toxinas por cepas de E. coli patogênicas pode favorecer a criação de condições para que outros agentes gastrointestinais patogênicos exerção sua ação. Atualmente, a suinocultura enfrenta o Complexo Entérico Suíno (CES) no qual estão envolvidos diversos patógenos víricos, bacterianos e parasitários que interagem entre si, entre os quais, cabe ressaltar alguns como Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Brachyspyra hyodisenteria e circovírus suíno (PCV2). Por outro lado, a produção de citocinas é crucial para o recrutamento e ativação de células do sistema imune e desenvolvimento da resposta imunitária. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a interação entre E. coli e outros agentes patogênicos envolvidos no complexo entérico suíno, e avaliar alguns pontos da resposta imune como, expressão gênica de citocinas e produção de IgA em intestino de leitões vacinados contra E. coli. De um total de 3762 leitões de cruzamento comercial, 1893 foram vacinados e 1869 não vacinados. Os animais foram abatidos, no final da terminação, e foram colhidas amostras de intestino de 40 destes animais que foram conservadas congeladas e em formol 10%. Foi realizado diagnóstico para E. coli, Lawsonia intracellularis, Brachyspyra hyodisenteriae, Salmonella spp e PCV2 mediante PCR em tempo real. As amostras de intestino foram avaliadas microscopicamente, sendo pontuadas de 0 a 3 de acordo com o infiltrado inflamatório e foram realizadas imunoistoquimica para IgA e PCV2. A expressão gênica de IFN-γ, IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-12 p35 e IL-12 p40 foram avaliadas por PCR em tempo real. O grupo não vacinado apresentou mais E. coli LT, E. coli 987p e Lawsonia Intracellularis (p<0.001, p=0.013, and p<0.001 respectivamente). O grupo vacinado apresentou maior expressão gênica de citocinas IFN-α, TNF-α, TGF-β e IL-12 p35 (p=0.001, p=0.005, p<0.001 e p=0.05, respectivamente). O infiltrado inflamatório foi maior no grupo vacinado (p=0.035). Palavras-chave: citocinas, colibacilose, intestino, leitões, vacinação.

ABSTRACT The adhesion and production of toxins by pathogenic strains of Escherichia coli can create conditions for other pathogens such as Lawsonia intracellularis,

43

Brachyspyra hyodisenteriae and Porcine circovirus type 2. Moreover, the production of cytokines is crucial to the recruitment and activation of immune cells and development of the immune response. Our objectives were to evaluate the intereção between E. coli and other pathogenic agent involved in the porcine enteric complex, and to evaluate some aspects of the immune response such as cytokine gene expression and production of IgA in the intestine of piglets vaccinated against E. coli. Were used in total 3762 pigs crosses commercial, 1893 vaccinated and 1869 unvaccinated. Finally the pigs were slaughtered and frozen and formaline fixed intestine samples obtained. Diagnosis of E. coli, Lawsonia intracellularis, Brachyspyra hyodisenteriae, Salmonella spp and PCV2 was also made by quantitative-PCR. The intestinal samples were histopathological evaluated scoring from 0 to 3 the inflammatory infiltrate and were performed immunohistochemistry for IgA y PCV2. mRNA was isolated from frozen samples (n=20 for vaccinated group, n=18 for unvaccinated group). IFN-γ, IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-12 p35 and IL-12 p40 gene expression was assessed by q-PCR. E. coli LT, E. coli 987p and Lawsonia Intracellularis genome copy number were higher in the group unvaccinated group (p<0.001, p=0.013, and p<0.001 respectively). The vaccinated group evidence higher gene expression for IFN-α, TNF-α, TGF-β and IL-12 p35 (p=0.001, p=0.005, p<0.001 and p=0.05, respectively) when comparing with the unvaccinated group. It was recorded a higher infiltrate degree for vaccinated group (p=0.035). Keywords: colibacillosis, cytokines, intestine, piglets, vaccination.

1 INTRODUÇÃO

A Escherichia coli é responsável pela diarreia pós-desmame em

suínos, também chamada de colibacilose pós-desmame. É uma importante causa

de mortes de leitões nesta fase do ciclo produtivo e ocorre em todo o mundo. A

infecção entérica por E. coli manifesta-se normalmente nas primeiras semanas

após o desmame, afetando os resultados da produção e muitas vezes afetando o

ganho de peso do animais (FAIRBROTHER et al., 2005) sendo responsável por

perdas significativas em grande escala em todo o mundo (BLANCO et al., 2006).

A importância da colibacilose não se limita às perdas produtivas e

econômicas. A adesão e produção de toxinas por cepas de E. coli patogênicas

podem favorecer a criação de condições para que outros agentes

gastrointestinais patogênicos exerçam sua ação (FAIRBROTHER et al., 2005). De

fato, hoje na suinocultura, enfrenta-se o Complexo Entérico Suíno no qual estão

envolvidos diversos patógenos víricos, bacterianos e parasitários que interagem

entre si, agravando a apresentação clínica e patológica das enfermidades

44

clássicas (RAMIS et al. 2011). Entre esses patógenos bacterianos cabe destacar

alguns como Escherichia coli, Lawsonia intracellularis ou Brachyspyra

hyodisenteriae e entre os víricos, o circovírus suíno (PCV2).

Até o momento, o controle da colibacilose tem se concentrado na

vacinação das porcas, oferecendo aos leitões imunidade passiva através dos

anticorpos maternos. Porém, durante as fases de creche e

crescimento/terminação a imunidade passiva induzida pela vacinação das mães

não é efetiva e a vacinação dos leitões poderia ser uma forma de prevenção

desta enfermidade neste período (BIANCHI et al., 1996).

Por outro lado, as células epiteliais intestinais (CEI) foram

recentemente, reconhecidas como importantes reguladores do sistema imune

intestinal (DEVRIENDT et al., 2010). Estas células atuam como “vigilantes” do

sistema imune (ECKMANN et al., 1995) sendo fundamentais para a ativação da

imunidade inata e, posteriormente, para a indução da resposta imune adquirida

(SANSONETTI, 2004). As CEI podem sinalizar o início das respostas imunes por

meio da produção de citocinas que são cruciais para o recrutamento e ativação de

neutrófilos, macrófagos, células T e B e células dendríticas (PIÉ et al., 2004;

DEVRIENDT et al., 2010). A maioria das citocinas é derivada de linfócitos e

macrófagos, porém também são produzidas por outras células como as CEI (PIÉ

et al., 2004) e são o principal meio de comunicação intracelular ante uma invasão

microbiana. A resposta imune em mucosas, como no epitélio intestinal,

caracteriza-se pela produção de imunoglobulinas (Ig) A, que representam uma

primeira linha de defesa contra a colonização de patógenos bacterianos e virais. A

IgA tem um papel importante na reposta imune intestinal, já que está mais

presente nas secreções mucosas do que as outras classes de imunoglobulinas. A

maioria dessas IgA´s são produzidas localmente por células plasmáticas IgA+ na

lâmina própria (VAERMAN & HEREMANS, 1970), sendo essa produção de IgA

influenciada pela secreção citocinas (MACPHERSON et al., 2008).

Com os objetivos de avaliar a interação entre E. coli e outros agentes

patogênicos envolvidos no complexo entérico suíno e avaliar alguns aspectos da

resposta imune como, a expressão gênica de citocinas e produção de IgA em

intestino de leitões vacinados contra E. coli desenvolveu-se o presente trabalho.

45

2 MATERIAIS E MÉTODOS

O comitê de bem-estar animal da Universidade de Murcia examinou e

aprovou todos os protocolos experimentais. Os animais foram criados em

condições que cumpriam em todo momento a legislação espanhola com respeito

à normatização de granjas de suínos (Real decreto - R. D. 324/2000, de 3 de

março, que estabelece normas básicas de ordenação das granjas de suínos) e

quanto às normas de bem-estar (R. D. 1135/2002, de 31 de outubro, relativo às

normas mínimas para a proteção de suínos; transposição literal da Diretiva

2001/88/CE, de 23 de outubro de 2001, relativa às normas mínimas para proteção

de suínos).

2.1 Animais

De um total de 3762 leitões de cruzamento comercial, sendo 1893

vacinados e 1869 não vacinados (grupo controle), colheram-se amostras

intestinais de 40 animais escolhidos aleatoriamente. Todos os animais nasceram

de fêmeas vacinadas no mínimo duas vezes com Colidex-C®. A fase de creche foi

de outubro/2008 a janeiro/2009, com duração de três meses. A fase de

crescimento/terminação durou quatro meses e os animais foram abatidos em

maio/2009. O sistema de produção era em sítios, sendo que a maternidade, a

creche e crescimento/terminação estavam na mesma área geográfica, localizados

na província de Toledo - Espanha. Ambos os grupos foram criados nas mesmas

condições de alimentação (à vontade) e manejo. Todas as etapas da produção

foram desenvolvidas seguindo o princípio do sistema todos dentro - todos fora. Os

animais permaneceram durante o período experimental sem medicação rotineira

contra patógenos entéricos.

Após atingirem o peso comercial, os leitões foram abatidos no

frigorífico Incarlopsa (Tarancón, Cuenca, Espanha) de acordo com os métodos de

rotina estabelecidos pela legislação local. As amostras foram colhidas no próprio

frigorífico.

46

2.2 Isolamento de E. coli

Foram colhidas amostras de cinco animais de cada grupo

experimental, escolhidos aleatoriamente. Realizou-se uma pequena incisão com

bisturi no jejuno, pela qual se introduziu um swab, realizando uma ligeira pressão

sobre a mucosa. As amostras foram acondicionadas em meio CARY-BLAIR

AGAR GEL (COPAN Diagnostics, Inc. Itália) e refrigeradas para o transporte ao

Laboratório de Referência em E. coli (LREC), Departamento de Microbiologia e

Parasitologia, Faculdade de Veterinária, Universidade de Santiago de

Compostela, Lugo, Espanha. No LREC as colônias de E. coli foram cultivadas

overnight em caldo Luria-Bertani a 37⁰C com ligeira agitação. Posteriormente,

realizou-se a determinação dos sorogrupos, sendo os antígenos O determinados

pela técnica de microaglutinação (GUINEÉ et al.,1981, adaptado por BLANCO et

al., 1992) usando antisoros O disponíveis. A detecção dos fatores de virulência

(toxinas LT, STa, STb, VT1 e VT2 e das fímbrias F4, F5, F6, F18, F41) foi

realizado mediante PCR utilizando os oligonucleotídeos descritos no Quadro 1.

QUADRO 1 - Oligonucleotídeos utilizados para detecção de fatores de virulência

de E. coli.

Fator de virulência

Sequência de oligonucleótidos (5´→3´) Tamanho do

produto amplificado

Autor

LT-I F: GGCGACAGATTATACCGTGC R: CCGAATTCTGTTATATATGTC

708 BLANCO et al.

(1997)

LT-II F: AGATATAATGATGGATATGTATC

R: TAACCCTCGAAATAAATCTC 300

PENTEADO et al. ( 2002)

STa F: ATTTTTATTTCTGTATTGTCTTT

R: GGATTACAACACAGTTCACAGCAGT 176

PENTEADO et al. ( 2002)

STb F: ATCGCATTTCTTCTTGCATC

R: GGGCGCCAAAGCATGCTCC 175

BLANCO et al. (1997)

VT1 F: CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC R: CGTGGTATAGCTACTGTCACC

302 BLANCO et al.

(2004)

VT2 F: CTTCGGTATCCTATTCCCGG

R: CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC 516

BLANCO et al. (2004)

47

QUADRO 1 - Oligonucleotídeos utilizados para detecção de fatores de virulência

de E. coli (cont.).

Fator de virulência

Sequência de oligonucleótidos (5´→3´) Tamanho do

produto amplificado

Autor

F4 F: GGTGATTTCAATGGTTCGGTC

R: ATTGCTACGTTCAGCGGAGCGC 773

FRANKLIN et al. (1996)

F5 F: CCAGCGCCCGGCAGTAATGACTGC

R: CCACCATTAGACGGAGCGCGG 278

BLANCO et al. (2006)

F6 F: GCGCCCGCTGAAAACAACACCAGC

R: GTACCGGCCGTAACTCCACCG 467

BLANCO et al. (2006)

F18 F: GGTACTGTTGCACCAAGCGG

R: CGACGCCTTAACCTCCTGCCCC 225

BLANCO et al. (2006)

F41 F: GGCTATGGAAGACTGGAGAGGG

R: GGGGTGACTGAGGTCATCCC 551

BLANCO et al. (2006)

Fonte: Adaptado de BLANCO et al. (2006)

2.3 Determinação da presença de fatores de virulência de E. coli

Foram colhidas amostras de íleo e colón de 25 animais de cada grupo

experimental. As amostras foram transportadas em refrigeração ao Laboratório de

Genética da Faculdade de Veterinária da Universidade de Murcia onde foram

armazenadas a -20⁰C para posterior utilização.

2.3.1 Extração de DNA

As amostras de íleo e cólon de cada animal foram submetidas ao

processo de extração de DNA, empregando-se o kit comercial DanaPure Spin Kit®

(Genedan S.L., Espanha). Os procedimentos para a extração foram realizados de

acordo com as instruções do fabricante, adotando-se o protocolo indicado para a

extração a partir de 25 μg de tecido. Os eluatos obtidos no final das extrações

48

foram armazenados a -20ºC para posteriormente serem utilizados nas reações de

PCR.

2.3.2 Determinação da presença de fatores de virulência de E. coli mediante

PCR em tempo real – ensaio plus/minus.

Realizou-se PCR para os fatores de virulência K88, K99, F41, LT, STa,

F18, 987P. As sequências de oligonucleotídeos utilizados aparecem no Quadro 2.

QUADRO 2 - Oligonucleotídeos utilizados para determinação da presença de

fatores de virulência de E. coli.

Fator de

virulência Sequência de oligonucleótidos (5´→3´)

Tamanho

do produto

amplificado

Autor

K88 F: GGTTCAGTGAAAGTCAATGCATCT

R: CCCCGTCCGCAGAAGTAAC 70

WEST et al.

(2007)

K99 F: GCTATTAGTGGTCATGGCACTGTAG

R: TTTGTTTTCGCTAGGCAGTCATTA 80

WEST et al.

(2007)

F41 F: CTGCTGATTGGACGGAAGGT

R: CCAGTCTTCCATAGCCATTTAACAG 88

WEST et al.

(2007)

LT F: CCGGCAGAGGATGGTTACAG

R: GAATCCAGGGTTCTTCTCTCCAA 73

WEST et al.

(2007)

Sta F: GCAAAATCCGTTTAACTAATCTCAAA

R: ACAGAAATAAAAATTGCCAACATTAGC 91

FRYDENDAHL

et al. (2001)

F18 F: TTGTGCTTCCTTGTCCAATAAAAC

R: CTCCCCCTTGATTAGCAAAACC 82

WEST et al.

(2007)

987P F: CCAAAGTATTCCACTGCAAGCA

R: GCCGTAACTCCACCGTTTGT 72

WEST et al.

(2007)

49

As reações de PCR foram realizados em volume final de 25 μL,

contendo Power SYBR® green Mastermix (Applied Biosystems, Estados Unidos);

Primer forward 10mM; Primer Reverse 10mM e 2μl da amostra de DNA,

completando com água livre de nucleases. A amplificação realizou-se em um

termociclador em tempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Estados Unidos)

programado para um ciclo de 95⁰C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos

repetidos de 95⁰C por 15 segundos (desnaturação) e 62⁰C um minuto (hibridação

e polimerização). A leitura da fluorescência realizou-se ao final da fase de

polimerização de cada ciclo. Como controle positivo foi utilizada uma amostra de

DNA genômico de E.coli sabidamente positiva.

Ao se realizar a PCR com química SYBR-Green, realizou-se um passo

de dissociação final para determinar a temperatura de melting (Tm) do produto

amplificado em cada caso. Confirmou-se a presença do produto amplificado de

tamanho esperado mediante eletroforeses em gel de agarose a 2% em um

sistema de migração CONSORT (Consort, Bélgica). A visualização foi feita em

aparelho transiluminador de UV (Electronic UV Transilluminator, Ultra-Lum), em

ambiente escuro e a documentação fotográfica dos resultados das eletroforeses

foi efetivada em equipamento fotodocumentador de géis (Vilber Lourmat).

2.4 Determinação da presença e quantificação de L. intracellularis, B.

hyodisenteriae , Salmonella spp e PCV2

Utilizando os extraídos de DNA obtidos para determinação dos fatores

de virulência de E. coli, determinou-se a presença de três bactérias incluídas no

CEP (L. intracellularis, B. hyodisenteriae e Salmonella spp) e de PCV2. A técnica

de diagnóstico utilizada foi a PCR em tempo real. A eleição destas bactérias foi

devido a sua importância nos sistemas de produção de suínos. As amostras

utilizadas foram provenientes de íleo e cólon, por serem regiões onde tipicamente

se localizam os agentes pesquisados.

O diagnóstico de PCV2 foi realizado devido à importância desse vírus

nos sistemas de produção de suínos, por haver histórico na granja onde se

realizou o estudo e por ser um vírus que pode cursar com um quadro de enterite.

50

2.4.1 Reações de PCR em tempo real

A sequência de oligonucleotídeos (TIB MOLBIOL Syntheselabor

GMBH, Berlim, Alemanha) utilizados estão no Quadro 3.

QUADRO 3 - Oligonucleotídeos utilizados para detecção de L. intracellularis, B.

hyodisenteriae e PCV2 na PCR em tempo real.

Agente

patógeno Sequência de oligonucleótidos (5´→3´)

Tamanho do

produto

amplificado

(pb)

Autor

L. intracellularis

F: GCGCGCGTAGGTGGTTATAT

R: GCCACCCTCTCCGATACTCA 98

LINDECRONA

et al. (2002)

B. hyodisenteriae F: ATGAAGAAGGCAGCAGACGTTTAT

R:GTAGGAAGAAGAAATCTGACAATGCA 142

AKASE et al.

(2009)

Salmonella spp. F: TTGGTGTTTATGGGGTCGTT

R: GGGCATACCATCCAGAGAAA 298

SUH & SONG

(2005)

PCV2 F: GCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGG

R: TCACACAGTCTCAGTAGATCATCCCA 220

FENAUX et al.

(2004)

As reações de PCR foram realizadas em volume final de 25 μl,

contendo 6μl de água; 12,5μl de FastStart Universal SYBR GREEN Master

(Roche, Suiça); 0,75μl de Primer forward 10mM; 0,75μl de Primer Reverse 10mM

e 5μl de amostra de DNA. A amplificação realizou-se em um termociclador em

tempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Estados Unidos), programado para um

ciclo de 95⁰ C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos, consistindo cada ciclo de

duas etapas, primeiro desnaturação a 95⁰ C durante 15 segundos, hibridação e

polimerização a 62⁰ C durante um minuto. A leitura da fluorescência realizou-se

ao final da fase de polimerização de cada ciclo. Ao se utilizar a química SYBR-

51

GREEN®, no final do procedimento realizou-se uma curva de dissociação para

calcular a temperatura de melting (Tm) do produto de PCR obtido.

Para a curva padrão foram utilizadas diluições 107 cópias/μl, 106

cópias/μl, 105 cópias/μl, 104 cópias/μl, 103 cópias/μl, 102 cópias/μl, 101 cópias/μl

obtidas a partir de uma diluição mãe.

2.5 Imunoistoquímica para PCV2

Foram colhidas 20 amostras de tecido intestinal (íleo e cólon) de cada

grupo experimental, de 3-5 cm de comprimento, abertos longitudinalmente e

fixados com formol tamponado a 10% para realização da técnica

imunoistoquímica (IHQ) para diagnóstico de PCV2.

As amostras de tecido foram processadas em um processador de

tecidos automático Leica TP 1050 (Leica, Alemanha). Após a obtenção do bloco

de parafina, realizou-se cortes seriados de 4 μm de espessura com micrótomo

Leica RM 2155 (Leica, Alemanha).

Depois da obtenção dos cortes, as lâminas foram incubadas em estufa

a 56⁰C durante um período mínimo de 24 horas. Em seguida, os cortes foram

desparafinados, desidratados e incubados em peróxido de hidrogênio a 35% em

metanol por 30 minutos para bloqueio da peroxidase endógena. Para a

recuperação antigênica foi realizado tratamento enzimático com Pronasa à

diluição 1:10 durante 12 minutos. Para o bloqueio das reações inespecíficas, os

cortes foram incubados com soro normal de coelho a 1% em PBS a temperatura

ambiente, durante 30 minutos. Em seguida, os tecidos foram incubados com

anticorpo primário contra a PCV2 (anticorpo monoclonal Anti PCV 36A9 -

Ingenesa, Espanha) utilizando-se diluição 1:200 e mantidos a temperatura de 4º C

durante overnight. Para amplificação das reações, os cortes foram lavados e

incubados com anticorpo secundário biotinilado coelho-anticabra (Polyclonal Goat

Anti-Rabbit Immunoglobulins/Biotinylated, Dako, Dinamarca) utilizando-se diluição

1:200 e mantidos em temperatura ambiente durante 30 minutos. Os cortes foram

lavados e incubados com complexo avidina biotina-peroxidase (VECTASTAIN

Elite ABC Kit – Standard, Vector Laboratories, Califórnia, Estados Unidos) - 30 l

52

de avidina + 30 l de biotina + 1000 μl de PBS - a temperatura ambiente durante

uma hora. A reação foi revelada com solução de diaminobenzidina-peroxidase

(Liquid DAB Substrate Chromogen System®, Dako, Estados Unidos) por 5

minutos. Solução tamponada de PBS (pH 7,4) foi utilizada para os lavados entre

as etapas. Os cortes foram contracorados com hematoxilina de Mayer (Sigma-

Aldrich, Steinheim, Alemanha) durante 2 minutos, desidratados e montados com

Eukitt® (O. Kindler GmgH & Co., Alemanha). O controle negativo foi realizado

para identificar coloração inespecífica, instilando apenas PBS no momento

correspondente ao anticorpo primário. A leitura das lâminas foi realizada em um

microscópio óptico Zeiis Axioskop 40 (Carl Zeiss, Alemanha).

2.6 Avaliação microscópica

Utilizando os mesmos blocos de parafina obtidos para

imunohistoquímica, realizaram-se, igualmente, cortes seriados para o estudo

histológico. Os cortes foram desparafinados, reidratados e corados com

hematoxilina e eosina (HE), posteriormente, foram desidratados e montados com

Eukitt® (O. Kindler GmgH & Co., Alemanha). Os cortes foram analisados às

cegas e sempre pelo mesmo observador, em um microscópio óptico Zeiis

Axioskop 40 (Carl Zeiss, Alemanha).

Foi avaliada a presença de lesões microscópicas em íleo e cólon. O

infiltrado inflamatório foi utilizado como parâmetro para graduar as lesões

intestinais. Com a finalidade de realizar um estudo comparativo entre os animais

vacinados e controles, graduou-se o infiltrado inflamatório em 0 = ausente, 1 =

discreto, 2 = moderado), 3 = acentuado (Quadro 4) (VIJTIUK et al., 1995). As

figuras 1, 2 e 3 mostram a graduação do infiltrado inflamatório consideradas para

determinação do escore.

53

FIGURA 1 – Categoria 1 - Discreto infiltrado inflamatório

FIGURA 2 – Categoria 2 - Moderado infiltrado inflamatório

FIGURA 3 – Categoria 3 - Acentuado infiltrado inflamatório

54

2.7 Imunoistoquímica para detecção de células produtoras de IgA

Das amostras processadas e incluídas no estudo histopatológico e no

diagnóstico de PCV2 foi realizado uma técnica imunohistoquímica para a

avaliação do número de linfócitos B sitentizadores de IgA.

O protocolo seguido foi o mesmo utilizado no íten 2.5, sendo utilizado

anticorpo primário contra IgA (Goat anti-Pig IgA Antibody Affinity Purified, Bethyl

Laboratories, Inc., Estados Unidos) com diluição 1:300 mantido em temperatura

de 37º C durante 1 hora e utilizando-se como anticorpo secundário biotinado

coelho-anticabra (Polyclonal Goat Anti-Rabbit Immunoglobulins/Biotinylated,

Dako, Dinamarca) na diluição 1:200.

Com a finalidade de realizar um estudo comparativo entre os animais

vacinados e controles, as células marcadas na imunohistoquímica foram contadas

em 12 campos de 16.000 μ2 em cada amostra. A contagem celular foi realizada

por meio de uma imagem digital em obejetiva de 40X que foi feita em um

microscópio óptico Zeiis Axioskop 40 (Carl Zeiss, Alemanha).

2.8 Determinação do perfil de expressão gênica de citocinas

Foi determinada a expressão gênica de IFN-γ, IFN-α, TNF-α, TGF-β,

IL-10, IL-12p35, IL12-p40 em amostras de íleo de 20 animais do grupo vacinado e

18 animais do grupo controle. As amostras de íleo foram colhidas com 1 cm e

ultracongeladas imediatamente após a coleta, imergindo-se o tecido em 2-

metilbutano refrigerado em nitrogênio líquido. Em seguida, foram transportadas ao

Laboratório de Genética da Faculdade de Veterinária da Universidade de Murcia

onde foram armazenadas a -80⁰C até o processamento.

2.8.1 Extração de RNA

Para avaliar as citocinas, o mRNA foi isolado a partir de amostras

congeladas usando o kit comercial RNeasy Mini Kit® (Qiagen, EUA), de acordo

55

com as instruções do fabricante. Para remover qualquer DNA genômico presente

nas amostras de RNA extraído, foi usado o kit comercial Turbo DNA Free Kit®

(Ambion, EUA). O cDNA foi obtido usando o kit comercial GenExpression Core

Kit® (Applied Biosystems Inc., EUA). O cDNA obtido foi conservado a - 80°C até o

momento das análises.

2.8.2 PCR quantitativa (q-PCR)

As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 25 μl,

contendo 10μM da sequência específica de cada primer, Power SYBR® GREEN

Mastermix (Applied Biosystems), e 2 μL da amostra de DNA, completando com

água livre de nuclease. A amplificação foi realizada em um termociclador a tempo

real ABI Prism® 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, EUA)

utilizando um protocolo padrão de um ciclo a 95ºC durante 10 minutos, seguido de

50 ciclos de 95ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 30 segundos e 72ºC

durante 30 segundos. A leitura da fluorescência foi realizada no final de cada

ciclo. Para a curva padrão, as diluições foram 107 cópias/μl, 106 cópias/μl, 105

cópias/μl, 104 cópias/μl, 103 cópias/μl, 102 cópias/μl, 101 cópias/μl a partir de

uma diluição mãe. A expressão gênica foi calculada em relação a três controles

endógenos (β-actine, cyclophilin and GAPDH) (MARTEN et al., 1994). A eficiência

foi calculada usando dados oferecidos pelo software. O Quadro 5 mostra os

oligonucleotídeos utilizados.

56

QUADRO 5 - Oligonucleotídeos utilizados para detecção de citocinas mediante

PCR em tempo real.

Citocina Sequência de oligonucleótidos

(5´→3´)

Tamanho do

produto

amplificado

(pb)

Autor

IFN-γ F: TGGTAGCTCTGGGAAACTGAATG

R: GGCTTTGCGCTGGATCTG 78

GUYLAINE et

al. (2008)

IFN-α F: CCCCTGTGCCTGGGAGAT

R:AGGTTTCTGGAGGAAGAGAAGGA 108

MOUE et al.

(2008)

TNF-α F: ACTCGGAACCTCATGGACAG

R: AGGGGTGAGTCAGTGTGACC 68

GABLER et al.

(2008)

TGF-β F: CACGTGGAGCTATACCAGAA

R: TCCGGTGACATCAAAGGACA 101

MOUE et

al.(2008).

IL-10 F: TGAGAACAGCTGCATCCACTTC

R: TCTGGTCCTTCGTTTGAAAGAAA 104

ROYAEE et al.,

2004

IL-12p35 F: AGTTCCAGGCCATGAATGCA

R: TGGCACAGTCTCACTGTTGA 84

MOUE et al.

(2008).

IL12-p40 F: TTTCAGACCCGACGAACTCT

R: CATTGGGGTACCAGTCCAAC 160

KIM et al.

(2010).

2.9 Cálculo da expressão gênica

Cada amostra foi analisada em duplicata cuja média foi analisada e

utilizada para o cálculo da expressão gênica normalizada com o controle

endógeno. O cálculo da expressão gênica foi realizado pelo método ∆Ct,

relativizando genes endógenos e genes de interesse ao de maior expressão,

tomando, portanto a amostra com menor Ct o valor de 1, como descrevem

MESTDAGH et al. (2009).

57

2.10. Análise estatística

Os resultados foram analisados com o programa estatístico SPSS

versão 15.0 (SPSS Inc., Estados Unidos). Foi utilizado ao teste de qui-quadrado

(χ2) nas tabelas de contingência para determinar as relações entre os parâmetros

categóricos estudados, sendo a variável independente o grupo experimental, e as

variáveis dependentes a valoração do infiltrado inflamatório e positividade-

negatividade obtida na PCR em tempo real, utilizando os resíduos tipificados para

determinar as diferenças entre grupos.

Para verificar se o número de cópias de DNA apresentava distribuição

normal aplicou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov.

As diferenças entre grupos relativas de infiltrado inflamatório, ao

número de cópias de L. intracellularis, de PCV2 e de expressão gênica das

distintas citocinas foram analisadas, mediante prova não paramétrica de

comparação de mediana de Kruskal-Wallis entre todos os grupos e teste U de

Mann-Withney para discriminar diferenças entre grupos.

As correlações entre os distintos parâmetros numéricos contínuos

foram analisados mediante a correlação de Rho de Spearman.

Em todos os casos considerou-se diferença estatisticamente

significativa para p<0,05.

3 RESULTADOS

3.1 Isolamento de E. coli

Todos os animais vacinados apresentaram resultado negativo aos

fatores de virulência desta bactéria. No grupo controle, todos os animais foram

positivos. Deste, dois foram positivos a enterotoxina termoestável (Stb). Os

resultados positivos a Stb também foram avaliados em relação à presença de

fimbrias, sendo o resultado negativo. Duas amostras foram positivas para eae.

Uma amostra deste grupo foi positiva para o gene de hemolisina.

58

3.2 Determinação da presença de fatores de virulência de E. coli - PCR –

ensaio plus-minus

Foram encontradas 24 amostras positivas, sendo 17 amostras

pertencentes ao grupo não vacinado e sete amostras pertencentes ao grupo

vacinado (p=0,035) (Tabela 1).

TABELA 1 - Amostras positivas para E.coli mediante PCR em tempo real – ensaio

plus-minus.

Fator de virulência Vacinados Não vacinados Significância

LT 1 9 p<0,001

F41 0 2 NS

Sta 6 2 NS

987p 0 4 p = 0,013

Total 7 17 p = 0,035

Dos animais positivos para E. coli, 11 animais foram positivos para um

fator de virulência. Cinco animais foram positivos para dois fatores de virulência e

um animal foi positivo para três fatores de virulência. Dos animais positivos para

mais de um fator de virulência, cinco pertenciam ao grupo não vacinado (controle)

e um animal pertencia ao grupo vacinado.

3.3 Determinação da presença de outros agentes patogênicos

3.3.1 Detecção de L. intracellularis, B. hyodisenteriae e Salmonella spp. por PCR

em tempo real

Todas as reações de PCR em tempo real tiveram eficiência de

amplificação de 97-100%. Nenhuma amostra foi positiva para B. hyodisenteriae

ou Salmonella. Entretanto, 40% e 100% das amostras de íleo analisadas

procedentes de animais vacinados e não vacinados, respectivamente, foram

positivas para L. intracellularis, sendo a diferença significativa (p<0,001).

59

No cólon foi determinada a presença desta bactéria em 20% do grupo

vacinado, enquanto 70% das amostras procedentes de animais não vacinados

foram positivas, sendo a diferença significativa (p=0,001). Em três animais do

grupo vacinado foi detectado simultaneamente a bactéria em íleo e cólon,

enquanto o mesmo achado foi encontrado em 14 animais do grupo controle.

A densidade bacteriana nas amostras de íleo do grupo vacinado foi de

70±43 cópias de DNA/gr de tecido e em cólon 12,4±6,1 cópias/gr. No grupo

controle, foi obtido valores de 1.447.781±1.193.306 e 3.288,3±27.883,3 cópias/gr

de tecido para íleo e cólon respectivamente. As diferenças entre grupo foram

significativas em ambos tecidos (p<0,001). O erro padrão da média elevado deve-

se à amplitude dos valores (0-2 x 107 em íleo e 0-558735 em cólon).

Por outro lado, analisando os resultados com base nos fatores de

virulência obtidos, independentemente do grupo experimental ao qual pertenciam,

foi observado uma carga de L. intracellularis significativamente maior (p=0,028 e

p=0,033 para íleo e cólon, respectivamente) naquelas amostras que resultaram

positivas para algum fator de virulência de E. coli (2,2 x 106± 2x105 e 52404 ±

46326 cópias/gr de tecido em íleo e cólon, respectivamente) contra às amostras

de animais negativos para fatores de virulência (100920±76688 e 695±515

copias/gr de tecido em íleo e cólon, respectivamente).

Observou-se correlação positiva e alta entre a carga bacteriana

detectada em íleo e a detectada em cólon (r2=0,725, p<0,001).

3.3.2 Detecção de PCV2 por PCR em tempo real

Na detecção de PCV2 mediante a técnica de PCR em tempo real, a

eficiência de amplificação foi de 102%.

Todas as amostras de íleon foram positivas para a presença de

genoma de PCV2, enquanto 75% das amostras de cólon do grupo vacinado e

80% no grupo controle foram positivas. A carga vírica foi de 13,6 x 108±5,6 x 108 e

10,2 x 106± 8,7 x 106 cópias/g de tecido para as amostras de íleo e cólon dos

animais do grupo vacinado e 3,9 x 108± 1,8 x 108 e 5,8 x 106± 2,9 x 106 cópias/g de

tecido para as amostras de íleo e cólon dos animais do grupo controle,

60

respectivamente. Não houve diferenças significativas na carga observada em

nenhum dos dois tecidos comparando animais vacinados com animais controles.

Observou-se correlação significativa entre a carga vírica detectada em íleo e em

cólon (r2= 0,570, p<0,001).

FIGURA 1 – Carga de PCV detectada na PCR em tempo real nos grupos vacinados e

não vacinados em íleo (A) e cólon (B). 3.4. Avaliação microscópica

Observou-se depleção linfóide em placas de Peyer e nódulos linfáticos

em seis leitões, três pertencentes ao grupo vacinado e três ao grupo não

vacinado. Edema na lâmina própria de intestino grosso em 80% dos animais.

Infiltrado de eosinófilos no intestino delgado de todos os animais estudados.

Infiltrado de linfócitos e células plasmáticas no intestino delgado de todos os

animais estudados.

Com relação ao infiltrado linfoplasmocitário, no grupo de animais

vacinados, 55% apresentaram infiltrado celular moderado; 40% dos leitões

apresentaram infiltrado celular acentuado e somente 5% foram classificados como

infiltrado celular discreto. Quanto ao grupo controle, 65% apresentaram moderado

infiltrado celular, mas somente 10% tiveram infiltrado celular acentuado, enquanto

25% foram classificados como infiltrado celular discreto.

Para comparar o grupo vacinado e o grupo não vacinado, foi calculada

Vacinado Vacinado Não vacinado Não vacinado

A B

61

a média das pontuações obtidas por cada grupo. A mediana obtida foi maior no

grupo de animais vacinados (2,35) quando comparado aos animais não vacinados

ou controle (1,85).

O estudo estatístico revelou que a diferença entre ambos grupos

experimentais foi significativa (p = 0,040), sendo registrado maior grau de

infiltrado inflamatório nos animais vacinados.

FIGURA 2 - Média das pontuações obtidas em cada grupo experimental.

Nenhum dos fatores de virulência mostrou uma influência sobre o grau

de infiltrado inflamatório, do mesmo modo que não foi observada relação entre a

carga de L. intracellularis nem de PCV2.

3.5. Imunohistoquímica

3.5.1 Detecção de células produtoras de IgA

Foi registrado maior número de células produtoras de IgA no grupo

vacinado, sendo significativa a diferença com o grupo controle (p<0,01). A

Vacinado Não vacinado Grupo

62

mediana de células produtoras de IgA foi 25,78±0,84 e 10,38±0,41 unidades nos

grupos vacinado e controle, respectivamente (Figura 3).

FIGURA 3 - Mediana ± SEM do número de células produtoras de IgA no grupo vacinado e controle.

FIGURA 4 – Fotomicrografias do intestino delgado de leitões. A: grupo vacinado –expressão acentuada de IgA em linfócitos e células plasmátivas. B: grupo não vacinado contra E. coli - expressão discreta de IgA em linfócitos e células plasmáticas.

3.5.2 Detecção de PCV2

A imunoistoquímica revelou que o vírus PCV2 se encontrava nas

placas de Peyer e nos folículos linfóides e em nenhum caso na mucosa do tecido.

Vacinado Não vacinado Grupo

A B

63

3.7 Expresão de citocinas

A expressão gênica de RNAm de IFN-α, TNF-α, TGF-β e IL 12p35 foi

maior no intestino dos animais vacinados que nos controles (6,53 – 2,88; p=0,001;

5,64 – 1,67; p=0,001; 6,81 – 3,66; p>0,001; 3,70 – 2,80; p= 0,030,

respectivamente) (Figuras 4A – 4D).

Não foi encontrada diferença significativa para a expressão gênica de

IFN-γ, IL-10 e IL-12p40 (p=0,350, p=0,121 e p=0,588) entre os grupos vacinados

e controle.

FIGURA 4 - (A) Expressão gênica de IFN-α. Grupo V10-20 expressou 2,3 vezes mais IFN-α que C10-20. (B) Expressão gênica de TNF-α. Grupo V10-20 expressou 3,4 vezes mais TNF-α que C10-20. (C) Expressão gênica de TGF-β. Grupo V10-20 expressou 1,86 vezes mais TGF-β que C10-20. (D) Expressão gênica de IL12p35. Grupo V10-20 expressou 1,32 vezes mais IL12p35 que C10-20.

Vacinado Não vacinado Grupo Vacinado Grupo Não vacinado

Vacinado Grupo Não vacinado Vacinado Grupo Não vacinado

64

3.7.1 Citocinas e células produtoras de IgA

Foi encontrado correlações positivas entre expressão gênica

normalizada de IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-12 p35 e o número de células produtoras

IgA, respectivamente (r2 = 0,390; p=0,01), (r2 = 0,384; p<0,011), (r2 = 0,500;

p=0,01), (r2 = 0,305; p=0,047).

O número de células produtoras de IgA foi equivalente à quantidade de

infiltrado inflamatório. Portanto, ao se observar altos índices de IgA os valores de

infiltrado inflamatório também apresentavam-se altos, ainda que a diferença não

tenha sido significativa (Figura 5).

FIGURA 5 - Células produtoras de IgA em cada categoria de infiltrado celular.

Analisando o número de células produtoras de IgA em função da

positividade para E. coli, foi encontrada diferença significativa para o fator de

virulência LT (p < 0,03) (Figura 6A). Animais negativos para o agente

apresentaram maior número de células produtoras de IgA.

Categorias de infiltrado celular

65

Para os demais fatores de virulência não foram encontradas diferenças

significativas, mas foi observado uma tendência similar ao encontrado para o fator

de virulência LT, (Figura 6B – 6C), exceto para o fator de virulência STa (Figura

6D).

FIGURA 6 - Células produtoras de IgA em função da positividade para E.coli - (A) fator de virulência LT. (B) fator de virulência F41. (C) fator de virulência p987. (D) fator de virulência STa.

3.7.2 Citocinas e infiltrado inflamatório

Não foi verificada encontrada diferença estatisticamente significativa na

expressão gênica das distintas citocinas em relação àa categoria de infiltrado

66

inflamatório, exceto para TGF-β ao comparar a categoria 2 e 3 de infiltrado

(Figura 7).

FIGURA 7 - Expressão gênica de TGF-β em cada categoria de infiltrado

celular (media±SEM).

3.7.3. Citocinas e fatores de virulência

Ao analisar as citocinas e os fatores de virulência de E. coli, foi

observado que os animais positivos para a fímbria 987P apresentaram uma maior

expresão para IL12 p40 (p=0,02) e uma tendência na expressão de TGF- β

(p=0,055). Para a toxina LT foi observado que a expressão gênica de TGF- β e

TNF-α foi maior nos animais negativos.

3.7.8 Citocinas e PCV2

Utilizando a regressão linear como método de análise foi observada

uma relação entre a carga vírica de PCV2 em íleo e a expressão gênica de IFN-α

Categorias de infiltrado celular

67

e IFN-γ (R=0,458, p=0,002 e R=0,613, p<0,001, respectivamente), sendo maior

nos animais positivos para o vírus.

4 DISCUSSÃO

Os animais do grupo vacinado apresentaram significativamente menos

E. coli, L. intracellularis, mortes por causas entéricas e surtos de enfermidades

entéricas em comparação ao grupo controle.

Como foi observado pelo LREC, nenhum animal do grupo vacinado foi

positivo para E. coli e nos resultados da PCR – ensaio plus/minus 29% das

amostras positivas pertenciam a animais do grupo vacinado.

Paralelamente a isso, os animais vacinados também apresentaram

maior infiltrado linfoplasmocitário, maior número de células produtoras de IgA e

maior expressão gênica de citocinas em comparação aos animais não vacinados.

O aumento destes três parâmetros avaliados pode ser devido à presença de

agentes patogênicos no intestino ou a um efeito da vacinação contra E. coli.

Porém, como foi observado no presente estudo, que os animais vacinados

apresentaram melhores resultados quanto à presença de patógenos e a

ocorrência de problemas entéricos, sugere-se que estes achados, sejam devido a

vacina, que contribuiu para uma melhor defesa na mucosa intestinal frente a E.

coli.

Os resultados do estudo histopatológico mostraram que tanto os leitões

vacinados como os leitões do grupo controle apresentaram infiltrado inflamatório

linfoplasmocitário, sendo este classificado como moderado a acentuado na

maioria dos animais. Entretanto, o grupo vacinado apresentou um maior grau de

infiltrado que o grupo não vacinado (p=0,035). A diferença estatisticamente

significativa entre os grupos poderia ser devido a uma mobilização mais intensa

de linfócitos B à mucosa intestinal dos animais que, uma vez imunizados,

receberam contínuos contatos com antígenos de E. coli presentes no ambiente da

granja. Estes resultados concordam com (VALPOTIC et al., 1994; VIJTIUK et al.,

1995; LACKOVIC et al., 1997; JANJATOVIC et al., 2008) que descreveram o

recrutamento de linfócitos para a mucosa intestinal como resposta a uma

68

imunização com cepas não patogênicas de E. coli. No entanto, em todos estes

estudos a imunização foi realizada via oral e as amostras de intestino foram

colhidas poucos dias após a imunização. Já no presente trabalho, a imunização

foi realizada via parenteral e as amostras foram colhidas ao final da fase de

terminação. Achados semelhantes também foram encontrados por BOZIC et al.

(2002) que detectaram a presença de um maior infiltrado linfocitário na mucosa do

íleo e jejuno de animais imunizados em comparação com os controles, porém o

tipo de linfócito não era protetor para E. coli.

Trabalhos prévios demonstram uma rápida proteção de suínos

gnobióticos contra infecção experimental com Salmonella obtida após a infiltração

de leucócitos no intestino, sendo esta infiltração causada pela administração

prévia de uma cepa de Salmonella enterica avirulenta (FOSTER et al., 2003).

Estes autores demonstraram que a infiltração celular no intestino foi compatível

com a proteção frente o desafio com S. enterica. De maneira similar, sugere-se

que o estímulo inicial induzido pela vacina contra E. coli usada no presente

estudo, poderia incrementar o recrutamento de células imunológicas para o

intestino levando a uma melhor saúde intestinal, o que justificaria o infiltrado

acentuado no intestino dos animais vacinados.

Em contraste aos resultados do presente trabalho, BIANCHI et al.

(1996) observaram diminuição na resposta das células B na mucosa intestinal

após administração de uma vacina contra a E. coli, via parenteral. Esta

discordância entre os resultados dos estudos provavelmente deve-se a algumas

diferenças entre metodologias, já que a vacina utilizada por BIANCHI et al. (1996)

foi uma cepa E. coli F4+, enquanto a vacina utilizada no presente estudo está

composta por sete cepas de E. coli. Além disso, BIANCHI et al. (1996)

administraram a vacina aos 29 dias de vida sem revacinação. Os autores que

trabalharam com vacinas orais de E. coli destacaram a importância da realização

da vacinação em animais jovens para maior eficácia da vacina, porque aos 29

dias é muito provável que os leitões já tenham tido contato com a bactéria.

A abundância de linfócitos observada no infiltrado poderia ser um efeito

derivado da vacinação e associa-se ao maior número de células marcadas para

IgA nos animais vacinados.

69

Os resultados obtidos no LREC mostraram uma diferença evidente

entre os animais dos grupos vacinado e controle quanto à presença de fatores de

virulência característicos de cepas patogênicas de E. coli. Os cinco animais

vacinados não apresentaram fatores de virulência de E. coli. Porém os cincos

animais do grupo controle foram positivos para algum fator de virulência. Sendo,

dois animais positivos para a toxina STB, esta toxina é um fator de

patogenicidade importante, porém ao ser negativo para os fatores de adesão sua

capacidade patogênica é pobre. Dois animais foram positivos para o fator eae, ou

seja, possuíam capacidade genética de produzir fatores de virulência, mas ao

serem negativas para os demais fatores de virulência são consideradas

apatogênicas. Um animal apresentava cepa hemolisina positiva, o que a princípio

é um sinal de patogenicidade importante, porém como não possuia outros fatores

de virulência é considerada apatogênica.

Em vários trabalhos encontrou-se a presença de cepas patogênicas de

E. coli em suínos a partir de amostras colhidas em frigorífico (HEUVELINK et al.,

1999; PAIBA, 2000; BONARDI et al., 2003). Apesar das cepas de E. coli

detectadas no LREC serem de patogenicidade pobre, o fato de todos os animais

controles terem sido portadores de algum fator de virulência e nenhum animal

vacinado ter apresentado fatores de virulência deste patógeno, parece indicar que

a vacina frente a E. coli administrada nos leitões, gerou uma proteção imunológica

eficaz.

No presente estudo, detectou-se por PCR em tempo real – ensaio

plus/minus, maior número de amostras positivas para as fímbrias F6 (987P) e

F41, embora para esta última a diferença não tenha sido significativa e todas as

amostras positivas pertenciam a animais do grupo não vacinado. Estas fímbrias

comumente estão relacionadas com diarreias neonatais, porém, podem ser

encontradas em animais de outras idades.

Em nenhuma das amostras foram encontradas cepas com genes para

a produção de fímbrias F4 (K88), F18 e F5 (K99). O que difere do citado por

FAIRBROTHER et al. (2005), que afirmam que cepas de E. coli enterotoxigénica

associada à diarreia pós-desmame geralmente produzem fimbrias F4 (K88) ou

F18. Porém, concorda com BROWN et al. (2007) que relatam que cepas com

fímbria F5 (K99) geralmente são mais comuns em leitões jovens, já que os

70

animais expressam os receptores para esta fimbria nos primeiros dias de vida.

Portanto, a amostragem ao abate, pode não ter permitido a detecção das cepas

produtoras destas fimbrias, devido a idade dos animais.

Detectou-se ainda a presença de cepas com o gene para a síntese de

LT e STa, sendo que para esta última a diferença não foi significativa . No caso da

LT, observou-se diferença importante de frequência ao comparar vacinados e

não vacinados (4% contra 50%, p<0,001). Isto sugere que havia certo grau de

proteção contra a cepas portadoras do gene para LT, mas que este efeito não foi

produzido contra a cepas com o gene para STa. No total, 70% das amostras

positivas detectadas na PCR em tempo real (ensaio plus/minus) pertenciam à

animais do grupo não vacinado, o que também parece indicar uma proteção

imunológica eficaz gerada pela administração da vacina.

Dos animais positivos para L. intracellularis no presente trabalho, foi

detectada esta bactéria em 32% das amostras de íleo, em 56% dos animais em

íleo e cólon simultaneamente e em 12% dos animais somente em cólon. Esses

resultados concordam com os obtidos por JENSEN et al. (2006) que encontraram

31% de animais positivos para L. intracellularis somente em íleo, 66% dos

animais positivos tanto em íleo quanto em cólon e 2% dos animais positivos

somente em cólon. O número de animais positivos, simultaneamente, em íleo e

cólon foi maior no grupo de animais não vacinados e o número de cópias de DNA

por mg de tecido foi estatisticamente superior neste grupo. Estes achados

indicam infecção mais extensa e com maior densidade nos animais controle

comparados com os animais vacinados.

Alguns autores mencionam que não há uma relação direta entre

infecções entéricas com mais de um agente patogênico e maiores prevalências

de L. intracellularis (STEGE et al., 2000). Outros autores descrevem que a

infecção por L. intracellularis não ocorre na ausência de certas bactérias da

microbiota intestinal (MCORIST et al., 1994). Ainda que exista uma discordância

entre os autores sobre a interação de L. intracellularis com a microbiota intestinal,

a maioria deles concorda que mudanças na flora bacteriana intestinal influenciam

na intensidade da infecção de L. intracellularis (MCORIST et al. 1994; MOLBAK et

al., 2008). Portanto, a maior carga de L. intracellularis detectada no grupo

controle, no presente estudo, poderia ser devido a maior proliferação de E. coli

71

neste grupo, o que poderia alterar a flora intestinal, criando condições favoráveis

para a proliferação de L. intracellularis. Deve-se levar em consideração que a

excreção de L. intracellularis é intermitente (RAMIS et al., 2011) porém neste caso

as amostras foram tomadas diretamente de tecido, o que elimina a possibilidade

deste fenômeno. Então a diferença significativa entre os grupos sugere que a

vacina contra E. coli aplicada nos leitões pode ter tido alguma influência na

disseminação ou proliferação de L. intracellularis no grupo vacinado, uma vez que

foi menos detectada neste grupo.

Todas as amostras analisadas foram negativas para Salmonella spp e

B. hyodisenteriae, independentemente do tecido analisado (íleo ou cólon) e do

grupo experimental (V10-20 ou C10-20). Estes resultados estão em concordância

com as prevalências não muito elevadas destes agentes patogênicos na

Espanha. A prevalência descrita de B. hyodisenteriae é de 30-40% em granjas de

produção suína na Espanha (CARVAJAL et al., 2006; HIDALGO et al., 2009).

Igualmente a Salmonella spp. é identificada em 43% das terminações da

península (GARCÍA-FELIZ et al., 2007). De fato, a granja de origem e a

terminação onde se desenvolveu o experimento não tinham histórico de diarreia

hemorrágica nos últimos anos.

Com respeito ao PCV2, 100% das amostras de ambos os grupos foi

positiva mediante PCR, não sendo observadas diferenças entre animais

vacinados e controle quanto à carga vírica detectada. Isto indica que ambos

grupos estiveram submetidos ao mesmo efeito derivado deste vírus. O fato de

que a imunohistoquímica evidenciou que o vírus está nas células do componente

linfóide e não na mucosa do órgão descarta a possibilidade de que este agente

tenha produzido algum efeito patogênico no intestino, já que não há lesões e

infiltrado típicos de PCV2 e o agente não está associado a nenhuma lesão nas

amostras analisadas.

Está bem documentado que os anticorpos IgA atuam como uma

importante primeira linha de defesa contra os patógenos nas mucosas limitando a

aderência ao epitélio com a conseguinte redução das taxas de colonização, como

mencionado por WILLIAMS & GIBBONS (1972) e HUSBAND et al. (1999). Os

dados imunohistoquímicos obtidos de IgA mostram que os animais vacinados

possuíam mais células produtoras de IgA que os controles (p<0,01). Este fato

72

associado ao resultado de que suínos com maior número de células produtoras

de IgA foram negativos para E. coli na técnica de PCR, sugere que a

administração da vacina gerou imunidade contra esta bactéria.

Os animais negativos para E. coli pertencem, na grande maioria, ao

grupo de animais vacinados. Estes dados sugerem que o infiltrado celular

observado, formado basicamente por células plasmáticas, seria um mecanismo

de defesa do intestino desencadeado pela vacinação, o que estaria de acordo

com SLIFKA et al. (1998), que relata que a imunidade humoral intestinal pode ser

dependente de células de defesa.

O aumento de linfócitos e células plasmáticas na mucosa intestinal dos

animais vacinados observado no estudo histopatológico concorda com o aumento

das células produtoras de IgA detectadas por imunoistoquímica.

Paralelamente, foi observado correlações positivas entre os níveis de

RNAm das citocinas (IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-12p35) com a quantidade de

células produtoras de IgA nos animais vacinados. A expressão de IgA nas

mucosas encontra-se sob o controle de citocinas sintetizadas pelos linfócitos TH2

de acordo com HUSBAND et al. (1999).

O TGF-β parece ter um papel destacado favorecendo que os linfócitos

B mudem o isotipo de IgA (LEVAST et al., 2009; TIZARD, 2009; AUSTIN et al.,

2003). No presente estudo, foi encontrado uma correlação positiva entre a

expressão gênica desta citocina e a presença de células produtoras de IgA, sendo

a maior correlação encontrada. Esses achados corroboram o estudo realizado por

EHRHARDT et al. (1992) que observaram que o TGF- β induziu o aumento da

expressão das IgA quando linfócitos de ratos foram estimuladas com

lipopolisacarídeo de E. coli. Achados semelhantes foram encontrados por

RAFFERTY & MONTGOMERY (1995), que observaram aumento significativo dos

níveis de IgA em fragmentos de tecido glandular parotídeo, submandibular ou

sublingual de ratas após serem estimulados com TGF-β, usando para esta

avaliação um sistema de cultivo in vitro.

De maneira semelhante, JACOBSON et al. (2010) investigaram a

expressão de citocinas no intestino de suínos em casos de diarreia a campo

provocados por L. intracellularis e encontraram um aumento de duas vezes ou

mais na expressão de todas as citocinas que investigaram (IL-1b, IL-6, IL-10, IFN-

73

α, IFN-γ, TNF-α, TGF-ß, IL12 p40), tanto nos animais com diarreia como nos

animais usados como controles (sem diarreia). Os autores não consideraram o

aumento consistente e atribuíram este fato, a pobre resposta imune observada na

adenomatosis intestinal suína causada por L. intracellularis em animais jovens.

Por outro lado, atribuíram o aumento de algumas citocinas como o INF-γ a

infecção por Circovírus suíno tipo 2 ou B. hyodysenteriae.

ANDERSON et al. (2011) estudaram a resposta imune no intestino de

suínos infectados experimentalmente com PCV2 e parvovírus suíno, e

constataram que os suínos infectados por PCV2 e PPV mostraram um aumento

significativo na expressão de RNAm de IFN-γ. Do mesmo modo, a expressão

gênica de INF-γ e IFN-α, observada no presente estudo, poderia ser justificada

pela infecção por PCV2.

4 CONCLUSÕES

Os animais positivos para algum fator de virulência de E. coli

apresentaram maior carga de L. intracellularis. A maioria desses animais

pertencia ao grupo não vacinado.

A vacinação e revacinação de leitões contra E. coli pode reduzir a

ocorrência de E. coli. Somado a isso, os animais vacinados apresentaram maior

infiltrado inlfamatório, maior número de células marcadas com IgA e maior

expressão gênica de citocinas indicando uma melhor defesa intestinal contra a E.

coli.

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80

CAPITULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

O crescente aumento da população mundial e a maior demanda de

alimentos para o abastecimento do mercado tem possibilitado o crescimento da

comercialização de animais e de seus produtos. Neste contexto, a suinocultura é

uma atividade de grande importância econômica e social, em diversas regiões do

mundo. A perspectiva atual com que se depara esta atividade no Brasil sinaliza

para um cenário de crescente modernização e profissionalização do segmento

tendo como o objetivo final a produção de uma carne suína de altíssima

qualidade.

Paralelamente à modernização e intensificação da atividade suinícola

houve uma mudança dos problemas sanitários. Dentre estes se destacam as

diarreias em suínos nas fases de recria e terminação que passou a ser um dos

principais problemas a ser enfrentado em função do aumento nas taxas de

mortalidade e morbidade, queda no ganho de peso e do aumento adicional de

despesas relacionadas com doença.

Nos últimos anos a Escherichia coli, um agente comensal do intestino,

tem sido identificada como uma das causas mais frequente de diarreia de origem

bacteriana, nas fases de crescimento e terminação. Também nesta fase, vários

elementos podem interferir na ocorrência e na intensidade da doença dentre os

quais destaca-se o estado imunitário dos leitões.

Atualmente uma das maiores preocupações em relação à diarreia nas

fases de crescimento e terminação é controlar a doença com auxilio da

imunização ativa, uma vez que, existe uma tendência mundial de reduzir ou

proibir o uso de antibióticos na produção animal que nos leva a busca de

alternativas imunoprofiláticas que possam substituir a utilização dos antibióticos.

Dessa forma, testou-se a possibilidade de melhorar a imunidade dos leitões,

através de um programa de vacinação, tendo com base uma vacina comercial

(Colidex®). Foram avaliados comparativamente três protocolos vacinais bem

como a interação da E. coli com outros agentes patogênicos causadores de

problemas entéricos. O experimento foi em uma granja de porte industrial na qual

os animais foram criados em sistema de três sítios e em todas as fases do

experimento não houve alterações no programa de biosseguridade. As variáveis

81

registradas no decorrer da fase experimental permitiram concluir melhorias na

taxa de morbidade, taxa de mortalidade, índice conversão e consequentemente

uma redução no custo de produção, nos animais vacinados.

Considerando os resultados encontrados, pode-se sugerir a

incorporação de um programa de vacinação contra E. coli, utilizando o protocolo

V10-20 no controle da colibacilose pós-desmame. O uso de a vacina permite por

um lado melhorar o rendimento produtivo dos animais e por outro a melhoria da

qualidade do produto final uma vez que influenciou positivamente na área de

bem-estar dos animais, redução do uso de antibióticos utilizados contra

enfermidades entéricas durante as fases de crescimento/terminação, assim como

a redução do uso de outros elementos como o óxido de zinco.

A metodologia aplicada no desenvolvimento deste estudo, que teve

como o objetivo estabelecer à campo os efeitos profiláticos e terapêuticos de uma

vacina para o controle de uma doença específica, pode ser aplicada em outras

regiões.

É importante resaltar que uma vacina representa um recurso para

prevenir a ocorrência de um surto de uma doença. Porém, nem todos os

antígenos são bons imunógenos sendo que tal fato decorre, em especial, de sua

composição. Este fato leva a sugerir que antes de utilizar uma vacina, no controle

de doenças, ela deve ser testada para definir sua capacidade imunogênica. Para

tal, baseado nos resultado obtidos no presente estudo, recomenda-se a utilização

do protocolo utilizado neste experimento em nosso meio.