PRISCILLA GOMES CARNEIRO FERREIRA DE MELO

CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES

PRISCILLA GOMES CARNEIRO FERREIRA DE MELO

INFLUÊNCIA DO SELÊNIO ORGÂNICO NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL ANTI-RÁBICA DE OVELHAS

ARAPONGAS 2014



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina – UEL e Universidade Norte do Paraná – UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Coelho da Cunha Filho

ARAPONGAS 2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central Setor de Tratamento da Informação

Melo, Priscilla Gomes Carneiro Ferreira de M485i Influência do selênio orgânico na resposta imune humoral anti-rábica de ovelhas /

Priscilla Gomes Carneiro Ferreira de Melo. Arapongas: [s.n], 2014. xvii; 69f. Dissertação (Mestrado em Saúde e Produção de Ruminantes) - Saúde de

Ruminantes. Universidade Norte do Paraná e Universidade Estadual de Londrina. Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Coelho da Cunha Filho 1- Medicina veterinária – dissertação de mestrado – UNOPAR/UEL 2- Produção de

ruminantes 3- Raiva 4- Persistência de anticorpos 5- Vacinação 6- Ovelhas 7- Suplemento mineral I- Cunha Filho, Luiz Fernando Coelho; orient. II- Universidade Norte do Paraná. III- Universidade Estadual de Londrina

CDU 619:636.2



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina – UEL e Universidade Norte do Paraná – UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.

BANCA EXAMINADORA

Orientador Prof. Dr. Luiz Fernando Coelho da Cunha Filho

Departamento de Medicina Veterinária Universidade Norte do Paraná

Prof.ª Dra. Fabíola Cristine de Almeida Rego Grecco

Departamento de Medicina Veterinária Universidade Norte do Paraná

Prof.ª Dra. Thaís Helena Constantino Patelli

Departamento de Medicina Veterinária Universidade Estadual do Norte do

Paraná

Arapongas, 13 de março de 2014.

Dedico

Ao meu esposo com muito amor, companheiro de todas as horas, que muito me ajudou e permaneceu ao meu lado.

Com amor e respeito aos meus pais, que são fonte de incentivo, e compreensão pelas infinitas vezes que me ausentei para concluir esse objetivo.

Aos meus avós (in memoriam) com saudades e amor, pois sei que mesmo longe os sinto perto, me apoiando e incentivando.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pois tem me dado condição,

paciência e sabedoria para realizar mais um sonho, vendo verdadeiramente que nos

momentos de maior dificuldade Ele tem me carregado no colo e me abençoado

durante todo o percurso.

Ao meu pai Gilmar Ravagnani Carneiro e a minha mãe Mariney

Gomes Carneiro, por toda a dedicação, incentivo, compreensão, amor, carinho e

pela oportunidade que me deram para iniciar e concluir mais essa etapa da minha

formação, me apoiando nos momentos difíceis onde eu pensava em desistir e por

proporcionarem a realização desse sonho desde pequena. Sem eles esse sonho

não seria completo.

Ao meu esposo Hugo Luiz Ferreira de Melo por todo o apoio,

dedicação, esforço, orações, amor e muita paciência durante esses dois anos de

curso, não deixando com que as dificuldades me abalassem, mas me encorajando

em todos os momentos e pela compreensão de um período complicado, cheio de

responsabilidades, metas e prazos, onde eu não conseguiria sem a sua ajuda e

amor.

A minha avó Olinda Vicente Gomes (in memoriam) e ao meu avô

José Gomes (in memoriam), por toda a vida acreditarem, orando e confiando em

mim, dando apoio, amor, educação e não duvidando do meu potencial. Pela

preocupação e incentivo, desde os primeiros anos escolares até a finalização da

graduação, para que eu concluísse o curso e fosse o orgulho deles, e por ter me

ensinado a ser uma pessoa honesta, humilde e de caráter, respeitando a todos.

Com a tristeza de hoje não estarem mais presentes entre nós, sabendo que o

término de mais uma etapa seria para eles a maior alegria, mas continuarão

eternamente vivos em meu coração com seus exemplos de vida. O meu amor e

muito obrigada!

Ao meu sogro Walter Luiz Ferreira de Melo e a minha sogra Maria

Aparecida Ferreira de Melo, pela colaboração com alguns animais, pelo incentivo e

orações durante todo esse curso.

Aos meus cunhados Gabriel Ferreira de Melo e Walter Henrique

Ferreira de Melo, e a minha concunhada Lilian Talita Canelossi de Melo pelas

orações, apoio e incentivo.

Ao meu professor Orientador Luiz Fernando Coelho da Cunha Filho,

pelo crescimento profissional que me proporcionou, por mais dois anos de

dedicação, pela atenção, compreensão, confiança durante todo o percurso, e por

todo o tempo disponibilizado para que fosse possível a conclusão de mais uma

etapa. Para mim foi muito mais do que um professor, foi um Mestre que não duvidou

da minha capacidade e abriu muitas portas para o meu aprendizado, foi um amigo

em todos os momentos difíceis, de desabafo, de choro e de alegria, professor esse

que é um orgulho poder falar que fui sua aluna. Agradeço também a sua esposa e

seus filhos que abriram as portas da sua casa, muitas vezes para que pudesse ser

realizado esse trabalho, termino o mestrado com a certeza de que levarei comigo

por toda a minha vida o exemplo de profissional e amigo. O meu muito Obrigada!

Ao coordenador Werner Okano, que foi mais do que um professor,

foi um amigo que confiou na minha capacidade de concluir mais um processo da

minha formação, auxiliando sempre que necessário.

A Dra. Neuza Maria Frazatti Gallina Coordenadora de Projetos de

Desenvolvimento e Produção de Vacinas Virais do Instituto Butantan, pela

realização dos testes, para obtenção de títulos de anticorpos neutralizantes, por ter

me dado à oportunidade de estagiar dentro do laboratório de raiva acompanhando a

realização dos testes e pela paciência e carinho com que me recebeu e a Médica

Veterinária Daniela Pinheiro Rinaldi pela paciência, dedicação, compreensão e

auxílio para realização dos testes.

A prof. Dra. Maria Cláudia Araripe Sucupira da USP, pelo apoio,

carinho, disponibilidade e confiança, além da realização das análises de glutationa

peroxidase, e ainda a Clara pela dedicação e colaboração na realização dos testes.

Ao prof. Flávio Antônio Barca Junior pela colaboração estatística do

trabalho, pelo auxilio de materiais, pela paciência e conselhos durante a realização

deste.

As minhas professoras, Fabíola e Lisiane, e aos demais professores

do Mestrado em Saúde e Produção de Ruminantes, que participaram da minha

formação acadêmica e estavam sempre prontos a ajudar.

A querida Flavinha do laboratório da Unopar de Londrina, pela

paciência, dedicação, disposição, simpatia e ajuda na realização do processamento

das hemácias.

Ao funcionário do sítio Marcos pela ajuda, dedicação e esforço

durante a realização prática do projeto, por sempre me incentivar a fazer melhor.

Aos amigos (graduandos) que colaboraram nas atividades de

execução do projeto João Sartori, Dyonatan Vila Martineli, Guilherme Muschau,

Thiago Rocha, Calinca, Thayla Venancio e Bruna Bertolini.

Aos amigos (mestrandos) que com sua amizade, simpatia e alegria,

ajudaram durante as aulas, as apresentações de seminários, nos churrascos em

comemoração a nossa turma, e as nossas conquistas a cada dia. Em especial ao

amigo de turma, professor e mestre Juarez (in memoriam), pois ele sim ganhou o

título de mestre pela sua disposição, empenho e dedicação, não deixando que as

barreiras atrapalhassem sua conquista. Deixa como exemplo, que não existe idade

para realizarmos nossos sonhos e também sua alegria de menino que nos fez

sempre mais jovens, com a tristeza de não vê-lo concluir essa etapa conosco, mas

sendo eternamente lembrado por nós. O meu muito Obrigada!!!

Àqueles que oraram: Elias, Angélica, Ricardo, Cris, Rafael, Gabriel,

Rafaeli, Raquel, Duevan, Kenya, Elaides, Paulo, Ir. Carlos, Sandra, Izaltina, Neuza,

e muitos outros que eu não fiquei sabendo.

As minhas amigas, Mariana Nogueira, Natalia Vicente, Amanda,

Mayara Araújo, Julia, Glória e Francine, pela amizade, paciência e por

proporcionarem muitos momentos de descontração durante os dois anos de curso.

A minha amiga Márcia Muniz por sua amizade sincera e por toda

ajuda.

A minha amiga Ambrozina por cuidar de mim desde a minha

infância, pela amizade e sempre torcer pela minha felicidade.

Ao Laborsolo® laboratórios pela realização da análise de selênio na

pastagem.

A UNOPAR pelo conhecimento adquirido e pelo apoio referente a

essa pesquisa.

Aos meus animais que fazem com que meu amor pela profissão

aumente a cada dia.

E a todos que direta ou indiretamente me encorajaram, incentivaram,

e oraram para que eu não desistisse, mas que eu finalizasse o mestrado.

A vocês o meu muito obrigada! Com a certeza de mais um sonho

realizado.

“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os fracos de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde

não conhecem nem vitória, nem derrota.” (Theodore Roosevelt)

CARNEIRO, Priscilla Gomes. Influência do selênio orgânico na resposta imune humoral anti-rábica de ovelhas. 2014. 69p. Dissertação de Mestrado Acadêmico Saúde de Produção de Ruminantes (Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2014.

RESUMO

A imunoprofilaxia é uma importante ferramenta no controle da raiva, e muitos microminerais têm sido utilizados para obter melhores respostas imunológicas, sendo o selênio um dos mais utilizados. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a eficácia da suplementação mineral com selênio orgânico na resposta imune humoral anti-rábica em ovinos na região de Londrina no estado do Paraná. Foram selecionadas, aleatoriamente, 18 ovelhas da raça Texel sem vacinação anti-rábica nos últimos 12 meses, com idade média de 20 meses e com peso médio de 35,9 kg., divididas em 2 grupos: grupo tratado (GT) suplementado com mistura mineral e adição de selênio orgânico e imunizado contra raiva com vacina comercial inativada e grupo controle (GC) suplementado com a mistura mineral, e adição de selênio inorgânico (Selenito de sódio), também imunizados. Os animais foram submetidos a um período de adaptação de 90 dias seguido de um período experimental de 120 dias. A determinação de Se sérico foi obtida através da atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px)em dois momentos, e a persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos em cinco momentos com intervalo de 30 dias pelo Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). O consumo da mistura mineral foi de 22 g/animal./dia, nos dois grupos. A ingestão média final de Se em ambos os grupos foi de 0,66 mg /kg MS ao dia. Os valores médios encontrados no D120 de GSH-Px foram superiores no grupo GT com 981,8±105,2 U/g Hb e de 628,2±188,2 U/g Hb no GC (valor de p< 0,001). Os valores médios encontrados de títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos 30 dias após a primovacinação, demonstraram títulos similares estatisticamente no GT e GC, 1.020 UI/ml no GT e de 1.885 UI/ml no GC. A suplementação mineral oral de selênio orgânico não incrementou a resposta imune humoral e a persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos, entretanto, promoveu aumento da retenção sérica de selênio em ovelhas.

Palavras-chave: raiva, persistência de anticorpos, vacinação, ovelhas, suplemento

mineral.

CARNEIRO, Priscilla Gomes. Influence of organic selenium on rabies humoral immune response of ewes. 2014. 69p. Dissertation of Academic Master Health Ruminant Production (Academic Master in Health and Production of Ruminants) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2014.

ABSTRACT

The immunoprophylaxis is an important in control of rabies, and many trace minerals have been used for better immune responses, selenium being the most used. The objective of this research was to evaluate the effectiveness of mineral supplementation with organic selenium on rabies humoral immune response in ewes in the region of Londrina in Parana state. We randomly selected 18 of the Texel ewes without anti-rabies vaccination in the past 12 months, with a mean age of 20 months and a mean weight of 35.9 kg divided into 2 groups: treated group (TG) supplemented with mixture addition of mineral and organic selenium and immunized against rabies with inactivated commercial vaccine and control group (CG) supplemented with mineral mixture, and addition of inorganic selenium (sodium selenite), also immunized. The animals were subjected to an adaptation period of 90 days followed by an experimental period of 120 days. Determining if serum was obtained by the enzyme glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in two moments, the title and the persistence of anti-rabies neutralizing antibodies in five times at intervals of 30 days for the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). The consumption of mineral mixture was 22 g/ hd/day in both group. The final if the average intake for both groups was 0.66 mg/kg DM per day. The mean values found in D120 GSH-Px were higher in TG with 981.8 ± 105.2 U/g Hb and 628.2 ± 188.2 U/g Hb in the CG (p-value < 0.001). The mean values of titers of neutralizing anti-rabies antibodies 30 days after primary vaccination, demonstrated statistically similar titles in the GT and GC, 1,020 IU/ ml in GT and 1,885 IU/ ml CG. Oral mineral supplementation of organic selenium did not enhance the humoral immune response and persistence of evidence of rabies neutralizing antibodies, however caused increased serum retention of selenium in ewes.

Key words:rabies, persistence antibodies, vaccination, sheep, mineral supplement.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Representação esquemática evidenciando a organização estrutural do vírus rábico.................................................................................................................30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Média dos valores séricos da selenoproteina Glutationa Peroxidase (GSH-Px) em ovelhas vacinadas com duas doses de vacina comercial contra raiva e suplementadas com selênio orgânico por 210 dias............................................................................................................................50

Tabela 2: Média dos títulos de anticorpos anti-rábicos em ovelhas vacinadas com

duas doses de vacina contra raiva e suplementadas com selênio orgânico por 210

dias.............................................................................................................................50

LISTA DE ABREVIATURAS

Cab. Cabeça

cm Centímetro

Cu Cobre

D0 Dia 0, dia da primeira dose

D30 Dia 30, 30 dias após a primovacinação




Fe Ferro

g Grama

GC Grupo Controle

GSH-Px Glutationa Peroxidase

GT Grupo Tratado

Hb Hemoglobina

IGG Imunoglobulina G

IGM Imunoglobulina M

Kg Kilograma

L Litro

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

mg Miligrama

ml Mililitro

MS Matéria Seca

NRC

NK

National Research Council

Natural Killer

ºC Graus Celcius

OIE Organização Mundial para Saúde Animal

OMS Organização Mundial de Saúde

OPAS Organização Panamericana de Saúde

PCR Reação da polimerase em cadeia

ppm Partes por milhão

PV Peso vivo

RABV Rabies vírus

RFFIT Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test

RNA Ácido ribonucleico

Se Selênio

Se-Met Seleniometionina

SNC Sistema Nervoso Central

U Unidade

UI Unidades Internacionais

Vit. E Vitamina E

WHO World Health Organization

Zn Zinco

SUMÁRIO

ABSTRACT .............................................................................................................. XV

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 18

2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 19

2.1. SELÊNIO ......................................................................................................... 19

2.1.2. SELÊNIO ORGÂNICO E INORGÂNICO ...................................................... 21

2.1.3. SELENOPROTEÍNAS .................................................................................. 23

2.1.4. DEFICIÊNCIA DE SELÊNIO E TOXICIDADE .............................................. 24

2.1.5. SELÊNIO E IMUNIDADE ............................................................................. 25

2.2. RAIVA .............................................................................................................. 28

2.2.1. HISTÓRICO ................................................................................................. 28

2.2.2. ETIOLOGIA .................................................................................................. 28

2.2.3. EPIDEMIOLOGIA ......................................................................................... 30

2.2.4. PATOGENIA ................................................................................................ 32

2.2.5. SINAIS CLÍNICOS........................................................................................ 33

2.2.6. PREJUÍZOS ................................................................................................. 34

2.2.7. MEDIDAS DE CONTROLE .......................................................................... 34

2.2.8. VACINA ........................................................................................................ 35

3. ARTIGO .............................................................................................................. 38

CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 51

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 52

ANEXO ..................................................................................................................... 66

18

1. INTRODUÇÃO

O selênio (Se) é um micronutriente presente nos tecidos do corpo,

sendo essencial para o funcionamento eficaz do sistema imune de animais e seres

humanos [1,2,3], também atua em diversas funções corporais, como, o crescimento,

a reprodução, a prevenção de enfermidades e a integridade dos tecidos [4,5].

Estudos mostram que o Se participa da produção de anticorpos

[6,7,8] e como consequência eleva a resposta imune [9,10], além de proteger

leucócitos e macrófagos dos radicais livres formados durante a fagocitose de

agentes patogênicos [11,12].

Várias pesquisas têm buscado estratégias que aumentam os

mecanismos de defesa do organismo, em destaque os efeitos da nutrição sobre a

resposta imune e, dentre os nutrientes mais estudados estão os minerais e

vitaminas [13]. Um fator importante é que os solos brasileiros são extremamente

carentes em macro e microminerais, incluindo o elemento Se [11] e as forrageiras

cultivadas nestes solos apresentam baixa concentração em microminerais

essenciais para a produção animal [14].

Em decorrência da vacinação não conferir 100% de proteção, e

devido à importância da vacinação na profilaxia anti-rábica, vários autores têm

pesquisado este tema, buscando alternativas que aumentem a eficácia da resposta

imune frente à vacinação, como a utilização de imunominerais, dentre os quais

selênio, zinco, cobre e os probióticos, na suplementação mineral dos rebanhos.

A raiva animal é uma enfermidade 100% letal, após o aparecimento

dos sinais clínicos [15]. É causada por um RNA vírus neurotrópico, caracterizada por

uma encefalite aguda, que afeta o SNC do homem e mamíferos domésticos e

selvagens [16,17].

Anualmente, são registrados mais de 1000 casos de raiva em

animais de produção, sobretudo bovinos, o que, considerando-se a taxa de

subnotificação calculada para o Brasil, acarreta prejuízos anuais de milhões de

dólares [18,19]. O controle só é possível com a vacinação contínua e maciça dos

animais e com a redução sistemática da população de morcegos hematófagos

[20,21].

19

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. SELÊNIO

O selênio foi descoberto pelo químico orgânico Berzelius em 1818, e

só foi relacionado com a função biológica a partir do século 20, quando constatou

que um tipo de manqueira em equinos era causada por alteração do metabolismo do

Se. Em 1957, Scharz descreveu pela primeira vez a necrose hepática em ratos com

deficiência de Se. Posteriormente, foi descrito em ovinos, quadro de miopatia

provocado por grave deficiência em Se [22].

Durante muitos anos o selênio foi considerado como sendo tóxico

para os animais. Porém, na última década a compreensão de sua importância na

nutrição de bovinos aumentou significativamente. Provavelmente, nenhum dos

minerais envolvidos em nutrição animal sofreu tantas mudanças de conceito, quanto

a sua real importância na nutrição dos animais quanto o selênio [11].

Micronutriente presente nos tecidos do corpo, essencial para o

funcionamento eficaz do sistema imune de animais e seres humanos [1,2,3],

também atua em diversas funções corporais, como, o crescimento, a reprodução, a

prevenção de enfermidades e a integridade dos tecidos [4,5]. Outra função do

selênio é sua participação na produção de hormônios da tireóide, pois este é

componente da enzima iodotironina deiodinase tipo I, responsável pela conversão

de T4 em T3, que é a forma fisiologicamente ativa [23].

O selênio tem papel importante no sistema antioxidante das células

[2,12,24,25,26,27], e caracteriza-se por uma versátil capacidade de oxiredução,

sendo tal característica fundamental para sua atuação no centro ativo da enzima

glutationa-peroxidase, responsável pela eliminação de peróxidos (radicais livres)

[22]. Além da glutationa peroxidase (GSH-Px), o Se é integrante de várias outras

selenoproteínas, sendo que até o momento foram identificadas aproximadamente 25

selenoproteínas, mas nem todas as suas funções foram completamente

caracterizadas [28].

20

2.1.1. Disponibilidade e Suplementação

O Se é encontrado em diversos alimentos, como cereais,

leguminosas e forragens [29]. Com exceção de algumas plantas que são capazes de

acumular Se [29], geralmente, o conteúdo de Se nas plantas tende a refletir a

quantidade e a biodisponibilidade de Se no solo [30]. Geograficamente de acordo

com o tipo de solo, a concentração de Se no solo e sua biodisponibilidade são

diferentes, solos alcalinos tendem a ter maior biodisponibilidade de Se, enquanto os

solos ácidos, especialmente quando combinados com precipitação pluviométrica

elevada, tendem a ter baixa biodisponibilidade de Se e geralmente estão associados

às pastagens deficientes em Se [31].

Alguns autores [11] demonstraram que os solos brasileiros são

extremamente carentes em macro e microminerais e forrageiras cultivadas nestes

solos apresentam baixa concentração em microminerais essenciais para a produção

animal [14]. No solo brasileiro, o Se não se encontra facilmente disponível para

animais criados em regime de pastejo, pois como a maioria dos nossos solos é

altamente lixiviado e com baixo teor de matéria quelatada, o Se se perde facilmente

[11].

A concentração de selênio em volumosos e concentrados é baixa, e

sua ingestão através do conteúdo natural das plantas e componentes da dieta é

insuficiente para atender a exigência nutricional deste elemento em qualquer fase da

produção animal, existindo a necessidade de elaboração de suplementos

adequados a cada situação. Uma suplementação com misturas minerais contendo

selênio é, portanto, indispensável [32,33]. De acordo com o NRC [34], o

requerimento de selênio para pequenos ruminantes é de 0,3 mg Se/kg MS, sendo

que em mistura mineral não deve exceder a 0,7 mg/animal/dia.

Desta forma, o fornecimento de suplementos minerais, com o

objetivo de complementar a dieta dos animais domésticos e as deficiências, os

excessos e os desequilíbrios minerais vêm sendo cada vez mais estudados, não

somente para prevenir e curar enfermidades de origem nutricional, mas também

para aumentar o desempenho zootécnico dos rebanhos [35]. No entanto, a

suplementação com Se nem sempre resulta em aumento da produção animal

[36,37].

21

2.1.2. Selênio Orgânico e Inorgânico

A fonte de suplementação de Se na dieta pode ser inorgânica ou

orgânica. O Se na forma inorgânica mais comum em misturas minerais, é o selenito

de sódio (Na2SeO3) ou selenato de sódio (Na2SeO4), e na forma orgânica é a

Seleniometionina (Se-Met) [38]. Geralmente, a Se-Met é a principal forma de Se

encontrada em grãos enriquecidos [39], mas produtos de levedura têm sido usados

atualmente na fabricação de suplementos de selênio orgânico [38,40], leveduras

enriquecidas, que crescem sobre substrato pobre em enxofre e rico em Se [38].

A fonte de Se a ser suplementada apresenta diferenças se esta for

orgânica ou inorgânica. Foram observadas diferenças no metabolismo inicial das

duas formas desse elemento [33], em ruminantes o Se é absorvido no duodeno e

ceco e é transportado pelas proteínas plasmáticas para os tecidos [6], sendo que

uma vez absorvido, o Se é transportado para o fígado [41,42]. No metabolismo pós-

absortivo das formas inorgânicas, o selenito é captado pelos eritrócitos, reduzido

imediatamente a seleneto (HSe-), acoplado à albumina e transferido ao plasma, para

então ser transportado ao fígado [33].

O rim é o órgão que concentra a maior parte deste mineral, seguido

pelo fígado, baço e pâncreas. A lã e o pelo também possui elevada concentração de

Se, enquanto que o sistema nervoso possui baixa concentração deste micromineral

[6]. Como o metabolismo dos microminerais nos animais possui controle

homeostático, o organismo regula situações de deficiência, através da mobilização

de reservas, e de excesso, através da excreção dos excedentes ou da redução da

absorção intestinal [43,44,45]. No entanto, diferente do que ocorre com outros

microelementos, parece não existir regulação da absorção intestinal das diferentes

formas de Se [46].

Alguns autores [47] realizaram um estudo com ratos, investigando a

absorção intestinal de diferentes formas de Se (Se-Met, selenito e selenato) e

descobriram que, apesar de todas as formas de Se terem sido absorvidas no

intestino delgado, algumas formas deste micromineral foram mais facilmente

absorvidas em seções específicas do intestino delgado em comparação com outras.

Em geral, a Se-Met foi mais rapidamente absorvida, quando comparada com as

formas inorgânicas, já o selenato foi mais eficientemente absorvido nas partes

22

distais do intestino delgado, enquanto que a absorção do selenito no duodeno foi

superior ao selenato [47].

Uma possível razão para estas diferenças pode estar no transporte

de Se através do intestino, onde o selenato é transportado ativamente por

transportadores dependentes de sódio localizados na porção distal do intestino

delgado [47], enquanto que o selenito é passivamente absorvido por difusão simples

ao longo do intestino delgado [28], já a absorção da Se-Met ocorre através de

aminoácidos transportadores dependente de sódio [42].

De forma geral, os microminerais possuem baixa taxa de absorção

pelos animais, principalmente quando são fornecidos na forma inorgânica. A

utilização dos chamados minerais orgânicos é uma alternativa interessante para

maximizar a produção animal, já que tais minerais possuem maior

biodisponibilidade, e atuam com maior eficiência no organismo [48]. Estudos

realizados em espécies como suínos [49], frangos [50] e bovinos [51] relataram

níveis mais elevados de Se no tecido quando foram utilizadas fontes orgânicas de

Se.

Usualmente as formulações minerais contêm fontes inorgânicas de

minerais, pois os minerais orgânicos geralmente são mais caros do que as fontes

inorgânicas. Entretanto, há indicações de que em algumas situações, os minerais

quelatados podem atingir fins biológicos que os convencionais não podem [52].

Os minerais orgânicos ou quelatados referem-se a minerais que

estão complexados com substâncias orgânicas como aminoácidos ou peptídeos e

que por isso apresentam-se mais biodisponíveis, sendo mais facilmente absorvidos

e retidos pelo organismo animal, ao contrário dos inorgânicos [53; 54].

A forma orgânica de suplementação de Se é produzida a partir de

uma cultura de levedura (Saccharomyces cerevisae) enriquecida com Se inorgânico.

Este processo leva à incorporação de Se, ao invés do enxofre, na metionina ou

cisteína formando selenocisteína ou selenometionina [55]. O produto final de extrato

de levedura deste processo de fermentação é pasteurizado e seco, e pelo menos,

90 % do Se deve ser ligado à levedura ou na forma complexada orgânica [40].

Como o Se está na mesma coluna da tabela periódica que o

enxofre, os dois elementos têm muitas características em comum. Isso torna o Se

um elemento químico único em seu metabolismo, se comparado a outros elementos

23

como o zinco, cobre e cobalto [56]. Assim, como análogo dos aminoácidos

sulfurados, a forma orgânica de Se está presente como um produto direto da

incorporação de Se em proteínas em substituição ao enxofre, o que difere das

metaloproteínas ou quelatos, nos quais ocorre simplesmente uma complexação com

grupos funcionais das proteínas [57].

2.1.3. Selenoproteínas

Aproximadamente metades das selenoproteínas conhecidas

desempenham papel importante no mecanismo antioxidante [30]. Uma das mais

bem caracterizadas até o momento é a glutationa peroxidase (GSH-Px) [58].

Constituída por Se a GSH-Px é uma enzima que age protegendo as células contra o

ataque de radicais livres em nível de citoplasma [12,26,28,59].

A determinação dos teores de Se em suas diferentes formas, na

dieta, no sangue ou leite, fornece informações complementares, porém incompletas,

do metabolismo deste micromineral em ruminantes [33]. Assim, a GSH-Px tem sido

muito utilizada para estudar a resposta à suplementação de Se na dieta dos animais

[60,61], a qual parece ser o melhor indicador do status metabólico e o melhor critério

para definir estratégias de suplementação com Se [33,62].Autores observaram uma

correlação positiva entre a concentração de Se plasmático e a atividade da GSH-Px

em cavalos suplementados com Se-levedura [63].

A GSH-Px atua destruindo o peróxido de hidrogênio e os

lipoperóxidos que são formados durante o metabolismo celular normal [2,12,24,64],

protegendo a integridade das membranas da células [2,11], contra a oxidação

tecidual [11] que provoca a degeneração e necrose celular [2,12,24].

A diminuição da atividade da GSH - Px, causada por uma deficiência

nutricional, deixa as células expostas aos efeitos nocivos dos radicais livres,

conduzindo alterações na estrutura de lípidos, proteínas, polissacarídeos, DNA e

outras macromoléculas celulares [65]. O estresse oxidativo em ovelhas tem sido

associado à doença do músculo branco [66,67], anemia hemolítica [68], atraso do

desenvolvimento, imunossupressão [69] e indícios de deficiência subclínica [70,71].

24

Com baixos níveis de Se, a atividade da GSH-Px fica diminuída,

tornando a célula mais vulnerável a oxidação [72]. O período de reposição da

enzima GSH-Px na maioria das células é em torno de 105 dias. Parte do Se,

presente na enzima desativada, pode ser reciclada dentro do organismo [73].

Estudos relataram que a concentração da GSH-Px pode ser

mensurada no sangue de equinos a partir de três semanas de suplementação com

Se [74], porém para se observar um aumento significativo da concentração da

enzima é necessária uma suplementação por 5 a 7 semanas [75,76].

Autores [74] confirmaram a forte relação entre ingestão de Se e a

ação da GSH-Px e notaram que a resposta da GSH-Px por uso de Se oral foi mais

baixa do que por uso parenteral. Pequena diferença na atividade da GSH-Px foi

observada em ovelhas, quando comparadas fontes de Se orgânico e inorgânico [77].

Os valores de referência de GSH-Px seguem a utilização do

seguinte critério: níveis deficitários menores que 60 Ug/Hb, baixos de 60 a 100

Ug/Hb, marginais de 101 a 130 Ug/Hb e adequados maiores que 130 Ug/Hb

[78,79,80].

2.1.4. Deficiência de Selênio e Toxicidade

Ao contrário da maioria dos outros minerais essenciais à

suplementação, o selênio se caracteriza por um limite estreito, entre a deficiência e a

toxicidade [81,82].

A diminuição da resposta imunológica pode ocorrer antes do

aparecimento dos sinais clínicos da deficiência de Se e desta forma, a

suplementação com esses nutrientes pode melhorar a performance produtiva e

reprodutiva de animais que não mostram sinais clínicos de sua deficiência [83]. As

deficiências subclínicas ou marginais de minerais como Se, Zn, Cu, entre outros não

afetam somente o desempenho reprodutivo, mas também a imunidade [14].

De acordo com o conceito de nutrição contido no NRC [34], a

principal manifestação da deficiência de selênio é a doença do músculo branco, que

pode ser congênita ou adquirida, sendo os ovinos mais susceptíveis que os bovinos.

25

A mortalidade de cordeiros pode chegar a 65% em condições extremas. No entanto,

as cabras são mais susceptíveis que os cordeiros ou bezerros.

A deficiência de Selênio causa acúmulo de peróxidos nas

membranas celulares causando necrose, com posterior fibrose e calcificação,

principalmente nos músculos esquelético e cardíaco [84]. A falta de selênio no

organismo animal torna as células mais susceptíveis ao processo oxidativo, além de

aumentar a necessidade de vitamina E [85].

Nos ovinos a deficiência de Se e ou Vit. E pode causar doenças

como distrofia muscular nutricional, definhamento, ineficiência reprodutiva e

anomalias da medula óssea, sendo essas três últimas consideradas responsivas ao

selênio [24].

O selênio é importante mineral na dieta quando ingerido em doses

convenientes, quando então complementa a ação antioxidante [86]. Os principais

problemas com excesso de selênio são devidos a erros de mistura ou

superdosagens com preparações injetáveis. Nestes casos, a toxicidade aguda se

manifesta como um crescimento deficiente, elevado teor de selênio nos tecidos,

marcha anormal, regurgitação, dispneia, espasmos tetânico, e morte. A selenose

crônica ou doença alcalina provoca perdas de lã e morte de ovelhas [34].

As formas crônicas ocorrem através de ingestões diárias de Se na

ordem de 5 – 15 ppm. Os efeitos tóxicos em casos como esses, são muito claros em

ruminantes mantidos em pastagens seleníferas, mas existem referências de sinais

de intoxicação mesmo quando não se constata presença de selênio [86].

2.1.5. Selênio e Imunidade

Nos estudos sobre estratégias que aumentam os mecanismos de

defesa do organismo, tem-se destacado os efeitos da nutrição sobre a resposta

imune e, dentre os nutrientes mais estudados estão os minerais e vitaminas [13].

A nutrição e a imunologia em conjunto podem identificar os possíveis

mecanismos de ação dos nutrientes específicos sobre o sistema imune, permitindo

uma formulação mais adequada do manejo nutricional, para preservar o estado de

26

saúde dos animais, através do melhor funcionamento do sistema de defesa do

organismo [87].

Particularmente, elementos traços estão relacionados a células

mediadoras da imunidade humoral e da resposta imune não específica, como na

função das células T-B, atividade das células natural killer (NK) e na liberação de

citocinas [88]. Dessa forma, durante a reação imunológica, o nível de minerais como

selênio (Se), zinco (Zn) e cobre (Cu) no sangue decresce drasticamente e, em

contrapartida, a absorção é aumentada e, consequentemente, nessas situações, a

exigência dietética desses minerais pode ser maior [89].

O Selênio é importante para o funcionamento do sistema imune,

embora o mecanismo exato através do qual o Se interage com o sistema imunitário

permanece desconhecido [90]. Em estudos com ratos, o estatus de Se afetou a

expressão de RNAm de algumas citocinas moduladoras do sistema imunológico [91]

e receptores de interleucina 2 [92]. A alteração na proliferação de linfócitos, também

tem sido associada com a concentração de Se [92].

Estudos mostram, que o Se participa da produção de anticorpos

[6,7,8] e como consequência eleva a resposta imune [9,10], além de proteger

leucócitos e macrófagos dos radicais livres formados durante a fagocitose de

agentes patogênicos [11,12]. A atividade dos macrófagos e neutrófilos está

intimamente relacionada com o selênio, pois as selenoproteínas estimulam a

atividade de encontrar e destruir os invasores microbianos no organismo de

mamíferos [11].

A primeira evidência de que o Se pudesse afetar a resposta imune,

veio de estudos em que o Se provocou aumento da resposta imune humoral em

camundongos, com dieta suplementada em 1 a 3 ppm de Se, houve aumento da

resposta em títulos de anticorpos IgM e IgG e aumentou as células formadoras de

anticorpos IgM [83]. Alguns autores têm demonstrado que tanto a resposta imune

celular como a humoral, são incrementadas em animais que recebem suplementos

de Selênio [93,94].

As selenoproteínas atuam no sistema imunológico dos mamíferos de

três maneiras: como selenoproteínas estruturais, que fornecem aminoácidos e Se

para a síntese de glóbulos brancos, pela medula óssea; selenoproteínas

antioxidantes, as quais auxiliam no processo inflamatório permitindo que haja a

27

saída dos glóbulos brancos da corrente sanguínea para os tecidos (leucopedese),

através das paredes íntegras dos vasos. Isso só ocorre quando o tecido é atacado e

sofre um processo inflamatório e as selenoproteínas que ―removem os resíduos‖,

que ficam após ataque dos glóbulos brancos a um patógeno microbiano [11].

Os glóbulos brancos fagocitam os microrganismos patogênicos e

tentam destruí-los liberando uma grande quantidade de oxigênio livre, potente

radical oxidante, que é extremamente danoso às células na forma de radical livre. As

enzimas que vão remover os resíduos de tecido e o sangue desses radicais livres

são as selenoproteínas antioxidantes, que rapidamente neutralizam os radicais livres

evitando que os tecidos e as células sejam danificadas. Essa limpeza é fundamental

para que a competência imunológica seja mantida [11].

Se houver acúmulo de radicais no tecido sob ataque há uma

diminuição na leucopedese pelos vasos que o irrigam, assim o glóbulo branco

diminui sua capacidade de destruir os patógenos, ou mesmo cessa para não

aumentar a quantidade de radicais livres. Se o selênio se esgota e não há

selenoproteínas suficientes, a capacidade de defesa do animal fica bem abaixo da

resposta normal esperada [11].

Muitos estudos têm sido realizados em modelos de doenças

humanas para ilustrar a importância das selenoproteínas individuais na regulação

redox de vias de sinalização inflamatórias e na regulação das funções de outras

células do sistema imunológico através de um controle do estresse oxidativo [95].

Estudos com modelo in vitro, concluíram que o mecanismo de ação

do Se situava-se na capacidade de eliminação de radicais livres de células. O

estudo demonstrou a inibição da proliferação de linfócitos por H2O2 em uma maneira

dependente da dose, demonstrando a importância do estado Se adequado para

neutralizar o H2O2 e permitir a proliferação ótima [96].

Independentemente da sua função precisa, foi demonstrada a

importância da selenoproteinas na função imune celular em um estudo com ratos

[97]. A proliferação dos linfócitos T foi diminuída sensivelmente pela queda na

concentração das selenoproteínas. Concluiu-se que selenoproteínas potencialmente

podem desempenhar um papel na ativação do receptor de células T [97].

Essa proposta do mecanismo de ação do Se, pode ser explicada

através do aumento da intensidade do sinal receptor de células T, melhorando a

28

proliferação e diferenciação celular, resultando em maior efetividade da resposta

imune celular [98].

Atualmente foi relatada, que a selenoproteína K é uma proteína da

membrana localizada no retículo endoplasmático, enzima potencialmente envolvida

no fluxo de cálcio nas células [99]. O mecanismo de ação proposto ocorre através do

aumento da intensidade do sinal do receptor para células T, assim, o aumento da

ingestão de Se em ratos resultou em um aumento precoce na sinalização celular

através do elevado fluxo de Ca2+ e fator nuclear de células T ativadas,

potencializando assim a resposta imune celular [98].

2.2. RAIVA

2.2.1. Histórico

A palavra raiva deriva do latim rabere, que significa ―fúria‖, ―delírio‖ e

do sânscrito rhabas, que significa ―tornar-se violento‖ [100]. Os primeiros relatos da

raiva ocorreram há mais de 2700 anos, mas a doença já era conhecida há pelo

menos 4000 anos [101]. Desde 1880, Pasteur vinha realizando pesquisas com o

agente da raiva, e foi influenciado por Galtier [102], em estudos sobre a indução de

proteção em animais de laboratório. Pasteur e seus colaboradores, em 1881,

conseguiram isolar e adaptar o vírus da raiva em animais de laboratório de forma a

torná-lo estável, dando origem ao chamado vírus fixo, de virulência constante, com

características bem definidas e reprodutíveis em laboratório [103]. A partir de então

vários pesquisadores tem demonstrado interesse nesse tema, tanto nos humanos

como nos animais, visando, a melhoria nos tratamentos pré e pós-exposição.

2.2.2. Etiologia

A raiva é uma doença infecciosa, de etiologia viral e caráter

zoonótico, caracterizada por uma encefalite aguda, que afeta o SNC do homem e

mamíferos domésticos e selvagens [16,17]. Considerada uma doença com letalidade

de aproximadamente 100% nos humanos, se não for tratada, é quase sempre fatal

29

após o aparecimento dos sinais clínicos [15,104]. Uma vez que os sintomas

aparecem, a raiva é inevitavelmente fatal, apenas dois sobreviventes humanos com

bom estado neurológico têm sido relatados em 40 anos [105], contudo a raiva animal

é uma enfermidade 100% letal, após o aparecimento dos sinais clínicos [15].

É causada por um RNA vírus neurotrópico, envelopado, da ordem

Mononegavirales, família Rhabdoviridae (do grego, rhabdus = bastão), gênero

Lyssavirus (do grego, lyssa = loucura) e espécie Rabies vírus (RABV), que acomete

o homem e várias espécies de mamíferos domésticos e silvestres [106,107]. Há sete

genótipos conhecidos dentro do gênero Lyssavirus, o vírus da raiva é do genótipo

tipo 1 [108], que infecta mamíferos terrestres, morcegos hematófagos e morcegos

não hematófagos das Américas [109,110]. Todos os Lyssavirus possuem RNA de

fita simples linear e polaridade negativa [109].

O vírus da raiva apresenta a forma de um projétil de arma de fogo,

com uma das extremidades planas e outra arredondada, apresentando diâmetro

médio de 75 nm e 100-300 nm de comprimento [21,109,111], e é composto por

cinco proteínas [101,110].

O nucleocapsídeo, que apresenta simetria helicoidal, é formado pelo

genoma envolto pela nucleoproteína (N), junto com moléculas de outras três

proteínas estruturais, a fosfoproteína (P), a polimerase viral (L) e a proteína da

Matrix (M). O nucleocapsídeo é envolto por um envelope lipídico, o qual é formado

pela membrana lipídica da célula hospedeira e possui moléculas da glicoproteína G

[101,110].

A glicoproteína G é responsável pela indução de anticorpos

neutralizantes, pela estimulação das células T e pela adsorção entre vírus e célula.

A resposta imune específica ao vírus da raiva possui dois componentes: a mediada

por anticorpos e a mediada por células. Além da glicoproteína (G), a nucleoproteína

(N) tem importante papel na resposta imune, visto que, mediante uma interação, age

na resposta imune celular [109].

30

Figura 1: Representação esquemática evidenciando a organização estrutural do vírus rábico. Fonte: [112 adaptado de 110].

O envelope o faz sensível a detergentes e solventes lipídicos

(sabão, éter clorofórmio e acetona), possuindo pouca resistência fora do hospedeiro.

O vírus é sensível ao dessecamento, luz solar, radiação ultravioleta, hipoclorito de

sódio, soda cáustica a 2%, solventes de gorduras e formalina. É inativado em

temperaturas mais elevadas, como a 50º por 15 minutos ou 60º por 35 segundos.

Porém, mantem-se estável por longos períodos a 4º C, por vários anos se colocado

em glicerina tamponada a -20º C e por tempo indefinido em -70º C ou temperaturas

mais baixas [21,101,109].

2.2.3. Epidemiologia

A transmissão do vírus ocorre pelo de contato com saliva de animais

infectados, através de mordidas ou arranhões [103,113]. Outras vias de transmissão,

como contato de mucosas com saliva ou secreções contaminadas, inalação de

aerossóis, transplante de órgãos (em humanos) ou por via oral, são mais raras

[19,114,115,116].

Dentre os mamíferos silvestres, os morcegos pertencentes à ordem

Chiroptera apresentam elevada ocorrência da doença [115]. Amplamente

distribuídos na América Latina, os morcegos hematófagos Desmodus rotundus, são

conhecidos como importante fonte de infecção do vírus rábico para herbívoros

[20,117,118], vivendo em pequenas colônias de 10 a 200 animais e com área de

ação de 10 a 20 km2 [119]. A doença pode ocorrer em outros morcegos

hematófagos como Diphyllae caudata e Diaemus youngii [115].

Os surtos da doença em herbívoros são cíclicos, variando em um

período de dois a cinco anos, devido ao seu principal transmissor, pois, ao ocorrer à

31

morte dos morcegos infectados, leva algum tempo até o repovoamento e a

reinfecção da colônia [114,115].

No ano de 2010 foi confirmado um caso de raiva em ovino na região

de Londrina, um total de 88 casos notificados confirmados de raiva no estado do

Paraná, e sete casos de raiva em ovinos no Brasil [120].

Autores [121] relataram que a raiva humana mata mais pessoas que

doenças como febre amarela e dengue. Uma pessoa morre de raiva a cada 15

minutos e, no mesmo intervalo de tempo, outras 300 são expostas ao vírus [122].

Apesar do progresso que se tem obtido no desenvolvimento de vacinas e no

controle da doença, a raiva continua sendo um problema de saúde pública,

principalmente nos países em desenvolvimento [110,123].

Alguns avanços foram obtidos no controle da doença, a exemplo da

redução dos casos humanos e caninos, devido principalmente, às atividades

direcionadas ao controle da raiva em cães. No Brasil, entretanto, existem áreas

endêmicas para o ciclo silvestre, o qual envolve reservatórios domésticos - como

cães e gatos. Por sua vez, tem se observado a emergência do ciclo silvestre e seus

reservatórios selvagens, como morcegos, cachorros do mato, raposas e primatas

não humanos [19,124,125,126]. Evidenciando a importância da zoonose, na

América do Sul, em 2003, pela primeira vez foi observado maior número de casos

de raiva humana transmitida por animais silvestres, particularmente por morcegos,

do que por cães [127].

As espécies transmissoras dos casos humanos entre os anos 2000

a 2009 foram: cães, com 47,0%; morcegos com 45,0% e herbívoros com 2,0%. No

mesmo período a média dos casos de raiva humana transmitidos por morcegos foi

de sete casos ao ano, no entanto observaram-se dois picos nos anos de 2004 e

2005, com um total de 62 casos notificados nos estados do Pará (38) e Maranhão

(24), decorrentes de surtos ocasionados por morcegos hematófagos. Com isso, o

número de casos humanos transmitidos por morcegos ultrapassou os transmitidos

por cães [128,129]. Ressalta-se, ainda, que no período avaliado, foram confirmados

três casos de raiva humana transmitida por herbívoros; nas três situações, a

transmissão ocorreu pela manipulação direta da saliva, sem agressão por essas

espécies [129].

Foi relatado um caso de raiva em um agricultor do município de Rio

Casca, Minas Gerais, que foi mordido por um morcego depois de tentar removê-lo

32

de um bezerro, o paciente e o bezerro foram a óbito. Houve confirmação laboratorial

antes da morte, de infecção pelo vírus rábico através da reação em cadeia da

polimerase (PCR) no líquido cefalorraquidiano e amostra de saliva, onde o

sequenciamento genético indicou que era compatível com a variante genética

Desmodus rotundus [130].

Esses dados evidenciam a importância da vacinação pré-exposição

tanto de animais quanto de humanos para um controle eficaz da doença em nosso

país, a OMS recomenda a vacinação anti-rábica pré-exposição para pessoas com

alto risco de exposição ao vírus, como profissionais que trabalham no diagnóstico da

raiva ou laboratórios de pesquisa, médicos veterinários, tratadores de animais,

reabilitadores de animais e agentes de animais selvagens [15,131].

2.2.4. Patogenia

Após a mordida de um animal raivoso, a saliva contendo vírus rábico

infeccioso é depositada em músculos e tecidos subcutâneos [116]. O vírus penetra

no organismo, multiplica-se no ponto de inoculação, atinge o sistema nervoso

periférico e, posteriormente, o sistema nervoso central. A partir daí, dissemina-se

para vários órgãos e glândulas salivares, onde também se replica e é eliminado pela

saliva de pessoas ou animais enfermos [19].

Durante o período de incubação, o vírus pode se replicar localmente

nas células musculares ou se ligar diretamente às terminações nervosas. Uma vez

nos nervos periféricos, o vírus se propaga pelos axônios em um transporte axonal

retrógrado, até chegar ao sistema nervoso central (SNC), onde há massiva

replicação viral nas células neuronais [132]. O vírus infecta neurônios em

praticamente todas as regiões cerebrais [133], causando disfunção neuronal, mas

com alterações neurodegenerativas bastante moderadas [116].

Uma vez instalado no SNC, a multiplicação viral ocorre,

preferencialmente, nas regiões do hipocampo, tálamo, hipotálamo, tronco cerebral,

medula e cerebelo. Após replicação no cérebro, o vírus se propaga do SNC através

dos neurônios somáticos e autônomos para múltiplos órgãos e tecidos, incluindo

nervos nas proximidades dos folículos pilosos, córnea, rins, pâncreas, pulmões,

33

fígado, músculos esqueléticos e cardíacos, entre outros. As glândulas salivares

passam a ser um local com predominante replicação viral, por possuir por grama de

tecido, maior quantidade de vírus que o SNC, havendo assim, excreção de vírus

infeccioso na saliva [122,132,134].

2.2.5. Sinais Clínicos

O período de incubação varia em média, 3-8 semanas [135], assim,

o vírus permanece próximo do local de exposição durante a maior parte do período

de incubação [132] que pode durar até seis anos [131].

A probabilidade de desenvolver a doença após a exposição ao vírus

e o período de incubação, dependem de uma série de fatores, tais como a

capacidade invasiva, a patogenicidade, a quantidade de vírus inoculado, o local e a

profundidade da lesão, sendo maior em lesões mais profundas e próximas a regiões

enervadas, como cabeça, mãos e pés (quanto mais próximo do SNC, menor será o

período de incubação), idade, imunocompetência do animal, entre outros

[19,135,136].

Em bovinos, a doença apresenta-se tanto na forma paralítica, como

na furiosa, sendo a primeira, a mais frequente no Brasil [115,120,137]. Portanto, os

sinais clínicos que mais ocorrem são incoordenação dos membros pélvicos, seguida

de paresia e paralisia flácida, depressão, prostração, decúbito lateral, sialorréia,

ausência do reflexo anal, paralisia da cauda, tremores da cabeça, diminuição da

visão, opistótono e bruxismo. Sinais clínicos da forma furiosa, como agressividade e

mugidos frequentes, são discretos, assim como prurido intenso com irritação

cutânea [120,137].

Em ovinos e caprinos os principais sinais clínicos mais comuns são:

apatia, cegueira, flacidez da língua, dificuldade de locomoção dos membros

posteriores, movimentos de pedalagem, tremores musculares, convulsões, pressão

da cabeça contra objetos, opistótono, decúbito lateral paresia e paralisia dos

membros. O curso clínico dos ovinos foi de 3-5 dias nos casos transmitidos por

morcegos [138,139].

34

2.2.6. Prejuízos

Desde 1998 a raiva dos herbívoros é responsável por prejuízos

econômicos na América Latina estimados em 30 milhões de dólares/ano, com a

morte aproximada de 40.000 bovinos/ano [140]. Na América do Sul a raiva é

considerada como um dos maiores problemas econômicos para a pecuária e saúde

pública [114].

Quando se consideram os prejuízos econômicos causados pela

raiva, devem ser computados, além das mortes dos animais de interesse econômico,

os prejuízos indiretos, como a quebra da produção leiteira e da carne, a depreciação

do couro dos animais pelos frequentes ataques dos morcegos hematófagos, e o

dano econômico pelas horas perdidas por homem nos tratamentos anti-rábicos, bem

como o próprio custo dos tratamentos [109].

Anualmente, são registrados mais de 1000 casos de raiva em

animais de produção, sobretudo bovinos, o que, considerando-se a taxa de

subnotificação calculada para o Brasil, acarreta prejuízos anuais de milhões de

dólares [18,19]. O município de Londrina é caracterizado como área de alto risco de

ocorrência de raiva em herbívoros, de acordo com o mapa de área de risco de

ocorrência de raiva de 2011, provavelmente devido ao relevo da região [139].

No Brasil, foram em média vacinados anualmente 46,8 milhões de

bovinos com notificação oficial nos últimos três anos, utilizando aproximadamente

2,5 milhões de frascos de vacina, os prejuízos somente com o custo da vacinação

no controle da doença, ao preço médio unitário atual de R$ 6,00, perfez um total de

R$ 14 milhões/ano em produto biológico, sem contar ainda com a morte de animais

de produção e a redução da produtividade em animais espoliados por transmissores

[141].

2.2.7. Medidas de controle

No caso dos herbívoros, deve-se seguir a orientação do programa

nacional de controle de raiva em herbívoros, considerando o controle populacional

do Desmodus rotundus e a vacinação dos animais susceptíveis. O controle só é

35

possível com a redução sistemática da população de morcegos hematófagos e com

a vacinação contínua e maciça dos animais [20,21].

Em uma área epidêmica, a vacinação obrigatoriamente deverá ser

realizada de 6 em 6 meses, com vacina inativada, e os primovacinados deverão ser

revacinados em um intervalo de 30 dias, já em áreas endêmicas a vacinação deverá

ser anual. Os animais recém-nascidos deverão receber primeira dose de vacina no

3º mês e a revacinação deverá ser realizada no 4º mês, tendo em vista a

persistência de anticorpos colostrais até o 3º mês [142,143].

Em áreas com focos e atendimento de casos, a vacinação focal e

perifocal deverão ser adotadas abrangendo todos os herbívoros existentes nas

propriedades em um raio de até 12 km [143].

2.2.8. Vacina

A vacinação foi comprovada nos últimos 120 anos ser de longe o

método mais eficiente, efetivo e de menor custo no controle de doenças infecciosas

[20,144,145,146,147].

Quando as vacinas são utilizadas para controlar doenças em uma

população de animais ao invés de em indivíduos, deve-se considerar o conceito de

imunidade do rebanho. Esta imunidade do rebanho é a resistência de um grupo

inteiro de animais para controlar as doenças por meio da presença, nesse grupo, de

uma proporção de animais imunes. A imunidade do rebanho reduz a probabilidade

de um animal susceptível ter contato com um infectado, de maneira que retarda ou

impede o alastramento da doença [144]. O aparecimento de anticorpos é um sinal

evidente para se reconhecer uma resposta imunológica após vacinação [148].

A vacinação de bovinos, principalmente, em áreas de alta

concentração de morcegos hematófagos, não tem oferecido resultados plenamente

satisfatórios, inclusive com registro de casos de raiva em animais vacinados

[149,150]. Existem muitas razões pelas quais uma vacina pode não conferir

imunidade a um animal, mesmo os animais que recebem uma dose adequada de

uma vacina efetiva podem não ser protegidos [144].

36

A resposta imune, por ser um processo biológico, nunca confere

uma proteção absoluta e nunca é equivalente em todos os membros de uma

população vacinada. Como a resposta imune é influenciada por um grande número

de fatores genéticos e ambientais, a variação de resposta imune em uma grande

população de animais aleatória tende a seguir uma distribuição normal. Isso significa

que a maioria dos animais responde aos antígenos por meio da montagem de uma

resposta imunomediada e em alguns uma resposta excelente, mas uma pequena

proporção montará uma resposta imune muito fraca [144]. O grupo de animais com

respostas imunes ruins pode não ser protegido contra uma infecção apesar de ter

recebido uma vacina efetiva. Portanto, não é possível garantir 100% de proteção em

uma população de animais aleatória por meio de uma vacinação [144].

Em decorrência da vacinação não conferir 100% de proteção, e

devido à importância da vacinação na profilaxia anti-rábica vários autores têm

pesquisado este tema, buscando alternativas que aumentem a eficácia da resposta

imune frente à vacinação anti-rábica, como os imunominerais e os probióticos. O uso

de adjuvantes tem revelado bons resultados na restauração da resposta imunitária e

na potencialização de vacinas em relação a diversos agentes patógenos [12,146].

Alguns autores [151,152] demonstraram a ineficiência de certos tipos

de vacinas 30 dias após o uso, e alguns [145] sugeriram a aplicação de três doses,

com reforço nos dias 30 e 180 após a primeira dose. Alguns estudos observaram

aumento significativo nos títulos de anticorpos anti-rábicos, um trabalhando com

bovinos suplementados com probiótico [153], e outro com ovelhas suplementadas

com mineral orgânico, zinco, onde obteve uma melhor cobertura vacinal na

primovacinação [154].

Ribeiro Neto e colaboradores (1973) realizaram estudo comparativo

com vacinas anti-rábicas para bovinos, e constataram que no Brasil, para alguns

tipos de vacinas, a imunidade não persiste mais que 45 dias [155]. Outros autores

continuam demonstrando a ineficiência de certos tipos de vacinas 30 dias após o

uso [151,152]. Experimentalmente, tem sido comprovado que doses de reforços

conseguem níveis de anticorpos mais elevados [156,157,158,159,160].

Uma pesquisa trabalhando com imunidade contra raiva em ovinos

suplementados ou não com zinco orgânico relatou que, na primeira dose da vacina

somente 87,5% dos animais do grupo controle (Gc) estavam com títulos

considerados protetores, comparado com os animais do grupo suplementado (Gt)

37

com zinco orgânico onde 100% dos animais já apresentavam títulos protetores,

apenas com a primeira dose da vacina. Após a segunda dose da vacina, tanto os

animais do Gt quanto do Gc, apresentavam títulos protetores [154]. Alguns autores

alertam que o uso de apenas uma dose de vacina não é suficiente para proteger os

animais contra raiva, havendo, portanto, a necessidade de doses de reforço [161].

O objetivo geral foi avaliar a eficácia da suplementação da dieta com

selênio orgânico na resposta imune humoral contra raiva em ovinos.

38

3. ARTIGO

INFLUÊNCIA DO SELÊNIO ORGÂNICO NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL ANTI-RÁBICA DE OVELHAS1

Priscilla G. Carneiro2, Luiz F.C. Cunha Filho3*, Flavio A. Barca Junior4, Agostinho Ludovico5, Fabíola C.A.R. Grecco5, Daniela P. Rinaldi6, Neuza M. Frazatti-Gallina7 and Thaís H.C. Patelli8

RESUMO.-Carneiro P.G., Cunha Filho L.F.C., Barca Junior F.A., Ludovico A., Rinaldi D.P. & Frazatti-Gallina

N.M. 2014. Influência do selênio orgânico na resposta imune humoralanti-rábica de ovelhas.

Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Departamento de Clínica Veterinária, Universidade Norte do

Paraná, Rodovia PR-218 Km 1, Jardim Universitário, Arapongas, PR 86702-670, Brasil. E-mail:

[email protected]

A imunoprofilaxia é uma importante ferramenta no controle da raiva, e muitos microminerais têm

sido utilizados para obter melhores respostas imunológicas, sendo o selênio um dos mais utilizados. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a eficácia da suplementação mineral com selênio orgânico na resposta imune humoral anti-rábica em ovinos na região de Londrina no estado do Paraná. Foram selecionadas, aleatoriamente, 18 ovelhas da raça Texel sem vacinação anti-rábica nos últimos 12 meses, com idade média de 20 meses e com peso médio de 35,9 kg., divididas em 2 grupos: grupo tratado (GT) suplementado com mistura mineral e adição de selênio orgânico e imunizado contra raiva com vacina comercial inativada e grupo controle (GC) suplementado com a mistura mineral, e adição de selênio inorgânico (Selenito de sódio), também imunizados. Os animais foram submetidos a um período de adaptação de 90 dias seguido de um período experimental de 120 dias. A determinação de Se sérico foi obtida através da atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px)em dois momentos, e a persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos em cinco momentos com intervalo de 30 dias pelo Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). O consumo da mistura mineral foi de 22 g/cab./dia, nos dois grupos. A ingestão média final de Se em ambos os grupos foi de 0,66 mg /kg MS ao dia. Os valores médios encontrados no D120 de GSH-Px foram superiores no grupo GT com 981,8±105,2 U/g Hb e de 628,2±188,2 U/g Hb no GC (valor de p<0,001). Os valores médios encontrados de títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos 30 dias após a primovacinação, demonstraram títulos similares estatisticamente no GT e GC, 1.020 UI/ml no GT e de 1.885 UI/ml no GC. A suplementação mineral oral de selênio orgânico não incrementou a resposta imune humoral e a persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos, entretanto promoveu aumento da retenção sérica de selênio em ovelhas. TERMOS DE INDEXAÇÃO: raiva, persistência de anticorpos, vacinação, ovelhas, suplemento mineral.

1Received on…………………………. Accepted for publication on ........................................... 2Mestranda de Saúde e Produção de Ruminantes, Universidade Norte do Paraná, Rodovia PR-218 Km 1,

Jardim Universitário, Arapongas, PR 86702-670, Brazil. E-mail: [email protected] 3 Departamento de Clínica Veterinária, Universidade Norte do Paraná, Rodovia PR-218 Km 1, Jd.

Universitário, Arapongas, PR. *Corresponding author: [email protected] 4 Departamento de Estatística, Universidade Norte do Paraná, Rodovia PR-218 Km 1, Jd. Universitário,

Arapongas, PR. E-mail: [email protected] 5 Departamento de Nutrição Animal, Universidade Norte do Paraná, Rodovia PR-218 Km 1, Jd.

Universitário, Arapongas, PR. E-mail: [email protected], [email protected] 6 Departamento de Raiva, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil 1500, Butantã, São Paulo, SP 05503-900,

Brasil. E-mail: [email protected] 7 Gerente de Projetos, Vacinas Virais, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil 1500, Butantã, São Paulo, SP

05503-900. E-mail: [email protected] 8Departamento de Clínica Veterinária, Universidade Estadual do Norte do Paraná, Campus Luiz Meneghel,

Rodovia BR-369 Km 54, Vila Maria, 86360-000, Bandeirantes, PR. E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]








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ABSTRACT.-[Influence of organic selenium on rabies humoral immune response of ewes] The

immunoprophylaxis is an important in control of rabies, and many trace minerals have been used for

better immune responses, selenium being the most used. The objective of this research was to evaluate

the effectiveness of mineral supplementation with organic selenium on rabies humoral immune response

in ewes in the region of Londrina in Parana state. We randomly selected 18 of the Texel ewes without anti-

rabies vaccination in the past 12 months, with a mean age of 20 months and a mean weight of 35.9 kg

divided into 2 groups: treated group (TG) supplemented with mixture addition of mineral and organic

selenium and immunized against rabies with inactivated commercial vaccine and control group (CG)

supplemented with mineral mixture, and addition of inorganic selenium (sodium selenite), also

immunized. The animals were subjected to an adaptation period of 90 days followed by an experimental

period of 120 days. Determining if serum was obtained by the enzyme glutathione peroxidase (GSH-Px)

activity in two moments, the title and the persistence of anti-rabies neutralizing antibodies in five times at

intervals of 30 days for the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). The consumption of mineral

mixture was 22 g/ hd/day in both group. The final if the average intake for both groups was 0.66 mg/kg

DM per day. The mean values found in D120 GSH-Px were higher in TG with 981.8 ± 105.2 U/g Hb and

628.2 ± 188.2 U/g Hb in the CG (p-value < 0.001). The mean values of titers of neutralizing anti-rabies

antibodies 30 days after primary vaccination, demonstrated statistically similar titles in the GT and GC,

1,020 IU/ ml in GT and 1,885 IU/ ml CG. Oral mineral supplementation of organic selenium did not

enhance the humoral immune response and persistence of evidence of rabies neutralizing antibodies,

however caused increased serum retention of selenium in ewes.

INDEX TERMS: rabies, persistence antibodies, vaccination, sheep, mineral supplement.

INTRODUÇÃO

Nos estudos sobre estratégias que aumentam os mecanismos de defesa do organismo, tem-se

destacado os efeitos da nutrição sobre a resposta imune e, dentre os nutrientes mais estudados estão os

minerais e vitaminas (Santos & Fonseca 2006).

O selênio (Se) é um micronutriente presente nos tecidos do corpo, sendo essencial para o

funcionamento eficaz do sistema imune de animais e seres humanos (Arthur et al. 2003, Paschoal et al.

2006, Goldson et al. 2011), também atua em diversas funções corporais, como, crescimento, reprodução,

prevenção de enfermidades e integridade dos tecidos (Ricciardino 1993, Medeiros et al. 2012).

Este mineral participa da produção de anticorpos (McDowell 1992, Murphy et al. 2006, Carrol &

Fosberg 2007) e como consequência eleva a resposta imune (Hintze et al. 2002, Paschoal et al. 2003), além

de proteger leucócitos e macrófagos dos radicais livres formados durante a fagocitose de agentes

patogênicos (Carvalho et al. 2003, Reis 2008). De acordo com Finch e Turner (1996) as deficiências de

selênio e vitamina E podem comprometer o sistema imunológico e resultar em um declínio na produção e

desempenho dos animais antes dos efeitos mais graves se tornarem aparentes.

Constituída por Se, a glutationa peroxidase (GSH-Px) é uma enzima que age protegendo as células

contra o ataque de radicais livres em nível de citoplasma (Surai 2002, Surai 2006, Funari Jr 2008, Reis

2008). Aproximadamente 75 a 85% do Se nos eritrócitos de ovinos está associado com esta enzima (Oh,

Ganther & Hoekstra 1974), mostrando alta correlação entre o selênio sérico e a atividade da GSH-Px em

ovinos (Oh, Pope & Hoekstra 1976, Whanger et al. 1977). Assim a GSH-Px tem sido utilizada como melhor

40

indicador do estatus metabólico e o melhor critério para definir estratégias de suplementação com Se

(Gierus 2007, Gromadzinska etal.2008).

Os solos brasileiros são extremamente carentes em macro e microminerais (Carvalho et al. 2003)

e forrageiras cultivadas nestes solos apresentam baixa concentração em microminerais essenciais para a

produção animal (Barbosa 2009).A concentração de selênio em volumosos e concentrados é baixa, e sua

ingestão através do conteúdo natural das plantas e componentes da dieta é insuficiente para atender a

exigência nutricional deste elemento em qualquer fase da produção animal, existindo a necessidade de

elaboração de suplementos adequados a cada situação. Uma suplementação com misturas minerais

contendo selênio é, portanto, indispensável (Berchielli et al. 2006, Gierus 2007).

Em decorrência da vacinação não conferir 100% de proteção, e devido à importância da vacinação

na profilaxia anti-rábica, vários autores têm pesquisado a eficácia das vacinas e esquemas de profilaxia,

buscando alternativas que aumentem a eficácia da resposta imune frente à vacinação, como a utilização de

imunominerais, dentre os quais selênio, zinco, cobre e os probióticos, na suplementação mineral dos

rebanhos(Pastoret et al. 1995, Albas et al. 1995, Albas 2003, Queiroz et al. 2003, Albas et al. 2005, Arenas

et al. 2009, Carneiro 2010).

Anualmente, são registrados mais de 1000 casos de raiva em animais de produção, sobretudo

bovinos, o que, considerando-se a taxa de subnotificação calculada para o Brasil, acarreta prejuízos anuais

de milhões de dólares (Marques 2000, Brasil 2009).

A raiva animal é considerada endêmica em muitas regiões do mundo e se destaca pelas perdas

econômicas produzidas na pecuária, por sua importância em saúde pública, por ter 100% de letalidade

após o aparecimento de sinais clínicos, e principalmente por ser uma zoonose (Daher 2005, Queiroz et al.

2009, WHO 2010). É uma enfermidade infecciosa que acomete o sistema nervoso central do homem e de

várias espécies de mamíferos domésticos e silvestres, causada por um RNA vírus neurotrópico,

envelopado, da ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae e do gênero Lyssavirus (Albas et al. 2005,

Kuzmin et al. 2009, Braga et al. 2013).

A principal via de transmissão do vírus da raiva ocorre por via percutânea, através da mordedura

de um animal infectado (Albas et al. 2005, Batista et al. 2007).O controle da doença em herbívoros só é

possível com a redução sistemática da população de morcegos hematófagos e com a vacinação contínua e

maciça dos animais em áreas endêmicas, sendo este último, o método mais efetivo, de menor custo e que

reduz as perdas econômicas (Albas et al. 2006, Batista et al. 2007).

Albas et al. (1995) e Queiroz et al. (2003) demonstraram a ineficiência de certos tipos de vacinas

30 dias após o uso, e Albas et al. (2005) sugeriram a aplicação de três doses, com reforço nos dias 30 e 180

após a primeira dose. Arenas e colaboradores (2009) observaram aumento significativo nos títulos de

anticorpos anti-rábicos nos bovinos suplementados com probiótico. Carneiro (2010) observou que

ovelhas suplementadas com mineral orgânico, zinco, obtiveram melhor cobertura vacinal na

primovacinação.

O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito da suplementação mineral com selênio orgânico na

resposta imune humoral e na persistência de anticorpos neutralizantes anti-rábicos em ovelhas hígidas, e

determinar a concentração sérica de Se pela atividade da selenoproteina GSH-Px.

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MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento foi realizado em uma propriedade na região de Londrina, Paraná. Foram

separadas, aleatoriamente, 18 ovelhas da raça Texel sem vacinação anti-rábica nos últimos 12 meses, com

idade média de 20 meses e com peso médio de 35,9(±10,1) kg. Os animais foram divididos em 2 grupos:

10 animais no grupo tratado (GT) suplementado com mistura mineral comercial, e adição de Se orgânico e

imunizado contra raiva e 8 animais no grupo controle (GC) suplementado com a mistura mineral

comercial, e adição de Se inorgânico (Selenito de sódio), também imunizados. Os grupos permaneceram

em 2 piquetes de 4 ha cada de Brachiaria brizantha, manejados com pastejo contínuo, alternando os lotes

nos piquetes a cada 30 dias, oferecendo as mesmas condições aos 2 grupos.

Os animais dos dois grupos passaram por um período de adaptação de 90 dias, ambos os grupos

receberam a mineralização com sal comercial (Nutristar®) com formulação idêntica, exceto quanto a fonte

de selênio, onde o GT recebeu suplementação mineral com Se orgânico na forma de levedura (Sel-Plex®-

Alltech do Brasil) e o GC com Se inorgânico (Selenito de sódio), ambos na dose de 0,66 ppm/ Kg MS por via

oral, seguido de um período experimental de 120 dias. A suplementação mineral era fornecida

diariamente no final da tarde, em cocho coletivo para cada grupo no aprisco, e adicionado um

palatabilizante, polpa cítrica, estimulando o consumo dos animais. No início do período de adaptação

todos os animais foram identificados, pesados, vermifugados com nitroxinil (Dovenix 34%®), e

monitorados quinzenalmente pelo método Famacha® até o término do período experimental para

controle da verminose.

No primeiro dia de adaptação, todos os animais foram submetidos à venopunção jugular para

colheita de sangue em tubo heparinizado para determinação indireta da concentração de Se através da

enzima glutationa peroxidase (GSH-Px), sendo realizada nova colheita no término do período

experimental (D120). O sangue heparinizado foi centrifugado por 10 minutos em 450 g, em centrífuga

refrigerada marca HETTICH®(4oC), modelo Mikro 22R, para coleta de plasma. As hemácias foram lavadas

com PBS por três ciclos para a obtenção da papa de hemácias, que foram armazenadas em eppendorfs cor

âmbar, e mantidos congelados por um prazo máximo de 30 dias a -80º C, para posterior determinação da

atividade da GSH-Px, realizada através do método de determinação colorimétrica, de acordo como Kit

comercial da marca Randox® (Ransel, código RS 505), sendo utilizada a papa de hemácias na diluição de

200µl.

Após os 90 dias de adaptação, teve início o período experimental considerado (D0), onde os

grupos continuaram recebendo a suplementação mineral com e sem adição de selênio orgânico, até o

término do período experimental considerado (D120). No D0 os animais foram submetidos à vacinação

contra raiva, vacina comercial inativada Alurabiffa® (Laboratório Merial®), na dose de 2 ml via subcutânea

conforme a indicação do fabricante, e 30 dias depois receberam a dose de reforço conforme preconiza o

MAPA (Brasil 2009). Após a primeira dose da vacina foram realizadas colheitas de sangue com intervalos

de 30 dias até o término do período experimental (D0, D30, D60, D90, D120) para obtenção de soro

sanguíneo e determinação da curva de persistência de títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos,

através da técnica de soro-neutralização em células BHK21 (RFFIT), metodologia validada no Instituto

42

Butantan (RFFIT) (Moura et al. 2008). Essas amostras foram obtidas em tubos secos e as alíquotas de

hemosoros, obtidas após centrifugação em 160 g durante 10 minutos, acondicionadas em frascos tipo

eppendorf e mantidos congelados a -20º C até posterior envio para o Instituto Butantan.

No início do período de adaptação e no final do experimento (D120), foram coletadas amostras

das forrageiras dos pastos, utilizando o método o pastejo simulado - hand plucked (De Vries 1995)

(aproximadamente a 40 cm de altura), e encaminhadas à análise bromatológica para a determinação da

quantidade de Se total recebida pelos grupos, com limite de detecção de 0,050 mg/L.

O experimento foi realizado respeitando-se as normas do Comitê de Ética na utilização de animais

em pesquisa (aprovado pelo Comitê de Ética para uso de animais: CEA/UNOPAR n° 017/12). Para análise

estatística dos dados foi utilizado pacote estatístico Minitab 13.0 e os dados quantitativos por meio da

análise de variância com nível mínimo de significância de 5%, as médias foram comparadas através do

teste de Tukey, a comparação de diferentes momentos foram avaliados pelo teste de T pareado.

RESULTADOS

As amostras da pastagem de Brachiaria brizantha submetidas à análise bromatológica para a

determinação da quantidade de Se total recebida pelos grupos, indicaram a ausência do elemento,

portanto a quantidade de Se consumida foi de 0,00 mg/kg MS na forragem. O consumo da mistura mineral

foi de 22 g/animal/dia, nos dois grupos (Gt/Gc). A ingestão média final de Se (pastagem+ mistura mineral)

em ambos os grupos foi de 0,66 mg /kg MS ao dia, sendo que no grupo controle o consumo foi de selênio

inorgânico e no grupo tratado o selênio orgânico.

A determinação indireta da concentração de selênio sérico foi realizada através da selenoproteina

Glutationa Peroxidase (GSH-Px). Os resultados referentes às médias dos valores séricos de GSH-Px

encontrados no 1° dia da adaptação e no D120 do experimento estão demonstrados na tabela 1. Os valores

médios encontrados no D120 de GSH-Px foram superiores no grupo GT com 981,8±105,2 U/g Hb em

relação ao GC, com 628,2±188,2 U/g Hb (valor de p<0,001).

Os resultados dos títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos estão demonstrados na tabela

2. As médias de títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos obtidas no D0 foram, de 0.048 UI/ml no

GT e 0.039 UI/ml no GC (tabela 2), evidenciando que os animais não tinham anticorpos anti-rábicos antes

da vacinação, demonstrando que não houve estímulo antigênico anterior ao do experimento. A

Organização Mundial da Saúde considera como indicador para avaliar a eficácia da vacina anti-rábica e

resposta imune, título igual ou acima de 0,5 UI/mL (WHO 1992).

Os valores médios encontrados de títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos 30 dias após a

primovacinação, demonstraram títulos similares estatisticamente no GT e GC, 1,020 UI/ml no GT e de

1,885 UI/ml no GC, onde os dois grupos permanecem inicialmente protegidos contra raiva na primeira

dose de vacina, com títulos superiores aos recomendados pela OMS. Contudo, o reforço aplicado 30 dias

após a primovacinação potencializou a resposta imune humoral, elevando significativamente os níveis de

anticorpos 60 dias após a primovacinação, em ambos os grupos.

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DISCUSSÃO

Pesquisas demonstram que os solos brasileiros são extremamente carentes em macro e

microminerais (Carvalho et al. 2003) e forrageiras cultivadas nestes solos apresentam baixa concentração

em microminerais essenciais para a produção animal (Barbosa 2009). No Brasil, o selênio não se encontra

facilmente disponível para animais criados em regime de pastejo, pois como a maioria dos nossos solos é

altamente lixiviado e com baixo teor de matéria quelatada, o Se perde-se facilmente (Carvalho et al. 2003).

Sendo assim, a ausência do elemento Se encontrada na análise bromatológica é compatível com as

observações da literatura nacional.

Os resultados encontrados referentes à quantidade de Se na dieta, considerando o consumo

estimado de MS 3% do peso vivo (PV) e uma absorção de somente 60% (NRC 2007) na pastagem de

Brachiaria brizantha, resultaram em uma quantidade final de Se consumida na forragem inferior a

recomendação (NRC 2007) para ovinos, que é de 0,3 mg/kg MS ao dia. Esses dados evidenciam a

necessidade da suplementação mineral do componente Se neste estudo. Gierus (2007) em uma ampla

revisão da literatura ressaltou que a concentração de selênio em volumosos e concentrados é baixa, e que

sua ingestão através do conteúdo natural das plantas e componentes da dieta é insuficiente para atender a

exigência nutricional deste elemento em qualquer fase, e é categórico ao afirmar que uma suplementação

com misturas minerais contendo selênio é indispensável.

Conforme descrito por Pugh (2005) o consumo de mistura mineral estimado para ovinos está

entre 10 a 28g/animal/dia, portanto, o consumo final nos dois grupos permaneceu dentro do esperado.

Considerando a suplementação fornecida na mistura mineral, a ingestão média final de Se (pastagem+

mistura mineral) no grupo controle e no grupo tratado foram superiores a recomendação do NRC (2007),

não excedendo ao limite máximo de 0,7 mg/animal/dia.

Embora a necessidade de Se na dieta de ovinos seja conhecida há décadas, a fonte química e a

dosagem para uma excelente saúde produtiva permanecem obscuras (Hall et al. 2011). A

biodisponibilidade de Se não é linear, porque existem grandes variações no teor de Se nos alimentos,

determinado por uma combinação de condições geográficas e fatores ambientais, e formas químicas em

que pode ser absorvido e metabolizado (Fairweather-Tait et al. 2010). Usualmente o Se está presente na

forma orgânica, como selenometionina (SeMet) ou selenocisteína (SeCys), e na forma inorgânica como

selenato de sódio (NaSe) (Uden et al. 2004).

A GSH-Px tem sido muito utilizada para estudar a resposta à suplementação de Se nos animais

(Zachara 1992, Arthur & Becket 1994), sendo o melhor indicador do estatus metabólico e o melhor

critério para definir estratégias de suplementação com este mineral (Gierus 2007, Gromadzinska et al.

2008). Portanto, no presente estudo utilizou-se a determinação da atividade da selenoproteina GSH-Px

como critério de avaliação da dosagem sérica de Se.

Os resultados encontrados da concentração de GSH-Px, tanto no GT quanto no GC, estão dentro

dos valores de referência (Randox 1990,Ceballos et al. 1998,Jaramillo et al. 2005), considerados desejáveis

acima de 130 U/g Hb. Sendo assim, o GT apresentou um aumento significativo, maior que 50%,na

concentração de GSH-Px em relação ao GC (tab. 1), evidenciando o incremento da absorção de Se,

fornecida através da suplementação orgânica ao GT nos 120 dias do experimento.

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Steen e colaboradores (2008) trabalhando com suplementação de selênio orgânico e inorgânico

em ovelhas e cordeiros recém-nascidos, encontraram concentrações de selênio sérico, significativamente

elevadas nos animais que receberam selênio orgânico. Calamari e colaboradores (2009) observaram uma

correlação positiva entre a concentração de Se plasmático e a atividade da GSH-Px em cavalos

suplementados com Se-levedura. Em geral, as formas orgânicas são absorvidas e retidas pelos ruminantes

mais prontamente do que as formas inorgânicas (Qin et al. 2007).

Knowles e colaboradores (1999) também encontraram aumento das concentrações séricas de

GSH-Px em vacas leiteiras suplementadas com Se quando comparadas aos animais sem suplementação,

contudo, não verificaram efeito da fonte de Se sobre as glutationas. Pequena diferença na atividade da

GSH-Px foi observada em ovelhas, quando comparadas fontes de Se orgânico e inorgânico (Van Ryssen et

al. 1989). Paiva (2006) afirma que as respostas de concentração de Se no soro e GSH-Px no fígado de

cordeiros foram semelhantes na suplementação com Se orgânico e inorgânico, diferentemente dos

resultados dessa pesquisa onde a Se-levedura foi efetiva no aumento da atividade da GSH-Px.

A maioria dos estudos aponta um incremento da atividade da glutationa peroxidase em animais

suplementados com fontes de selênio, principalmente com fontes de selênio orgânico (Qin et al. 2007,

Steen et al. 2008, Calamari et al. 2009, Hall et al. 2011). Entretanto, é preciso considerar o tempo de

suplementação do Se, pois pesquisas relataram que a atividade da GSH-Px pode ser mensurada no sangue

de equinos a partir de três semanas de suplementação com este mineral (Roneus & Lindholm 1983),

porém, para se observar uma atividade aumentada significativamente é necessária uma suplementação

por 5 a 7 semanas (Maylin et al. 1980, Knight & Tyznik 1990). O período de reposição da enzima GSH-Px

na maioria das células é em torno de 105 dias. Parte do Se, presente na enzima desativada, pode ser

reciclada dentro do organismo (Figueira 2009).

Neste estudo a suplementação de Se orgânico foi realizada por um período de 210 dias,

considerando o período de adaptação, exatamente para garantir quantidade suficiente de Se sanguíneo.

Provavelmente este fato explique as altas concentrações GSH-Px no grupo GT com 981,8±105,2 U/g Hb e

de 628,2±188,2 U/g Hb no GC (valor de p <0,001) demonstrando a efetiva incorporação do mineral Se.

Jaramillo e colaboradores (2005) trabalhando com novilhas obtiveram concentrações médias de GSH-Px

de 389±184 U/g Hb, e em alguns animais valores de 936 U/g Hb. Paiva (2006) encontrou uma média de

350 U/g Hb no fígado de cordeiros suplementados com Se.

Particularmente, elementos traços estão relacionados a células mediadoras da imunidade

humoral e da resposta imune não específica, como na função das células T-B, atividade das células NK e na

liberação de citocinas (Marcos et al. 2003). Dessa forma, durante a resposta imunológica, o nível de

minerais como selênio (Se), zinco (Zn) e cobre (Cu) no sangue decresce drasticamente e, em

contrapartida, a absorção é aumentada e, consequentemente, nessas situações, a exigência dietética

desses minerais pode ser maior (Ribeiro et al. 2008). Esperava –se que o maior incremento da atividade

da GSH-Px, e, o maior aporte de Se sérico evidenciados nos resultados desse estudo, promovessem uma

resposta imune humoral anti-rábica mais efetiva.

O selênio exerce papel importante para o funcionamento ótimo do sistema imune, embora o

mecanismo exato através do qual este mineral interage com o sistema imunitário permanece

desconhecido (Brummer 2012). Em estudos com ratos, o estatus de Se afetou a expressão de RNAm de

45

algumas citocinas moduladoras do sistema imunológico (Li e Beck 2007) e receptores de interleucina 2

(Roy et al. 1994). A alteração na proliferação de linfócitos, também tem sido associada com o estado de Se

(Roy et al. 1994). Alguns autores têm demonstrado que tanto a resposta imune celular como a humoral,

são incrementadas em animais que recebem suplementos de Selênio (Nemec et al. 1990, Bires et al. 1993,

Morgante et al. 1996). Outros estudos mostram que o Se participa da produção de anticorpos (McDowell

1992, Murphy et al. 2006, Carrol & Fosberg 2007) e como consequência eleva a resposta imune (Hintze et

al. 2002, Paschoal et al. 2003), além de proteger leucócitos e macrófagos dos radicais livres formados

durante a fagocitose de agentes patogênicos (Carvalho et al. 2003, Reis 2008).

Nenhum dos animais utilizados neste estudo apresentou títulos de anticorpos no soro antes do

início das vacinações, demonstrando que não houve estímulo antigênico anterior ao do experimento, e os

resultados de titulação do Gc demonstraram que durante o experimento não houve a circulação do vírus

no rebanho. Ao analisar os resultados dos títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos na tabela 2,

observamos que não houve diferença significativa estatisticamente entre o Gt e o Gc, mostrando que a

suplementação com diferentes fontes de selênio não influenciou a resposta imune humoral frente à

vacinação anti-rábica.

Diferentemente, Carneiro (2010) trabalhando com imunidade contra raiva em ovinos

suplementados ou não com zinco orgânico relatou que, na primeira dose da vacina somente 87,5% dos

animais do grupo controle estavam com títulos considerados protetores, comparado com os animais do

grupo suplementado com zinco orgânico onde 100% dos animais já apresentavam títulos protetores

apenas com a primeira dose da vacina, demonstrando assim um incremento na resposta imune humoral

nas ovelhas suplementadas. A resposta imune humoral requer proliferação de linfócitos durante vários

dias antes de contribuir significativamente na proteção do hospedeiro (Fernandes et al. 2013), assim, o

micromineral Se parece não ter a mesma efetividade na proliferação de linfócitos que o Zn .

Os resultados da tabela 2 demonstram que no D60, D90 e D120 a curva de persistência de

anticorpos neutralizantes anti-rábicos, apresenta um declínio acentuado a partir da dose de reforço (D60),

e observando os valores individuais de cada animal do experimento no D120, 40% do grupo tratado

apresentavam títulos inferiores a 0,5 UI/mL e 50% do grupo controle, deixando os animais expostos a

infecções. A falta de persistência da resposta imune configurada na tabela 2 fragiliza as medidas de

controle, pois a recomendação do MAPA (Brasil 2009) é revacinar os animais anualmente em áreas

endêmicas e em áreas epidêmicas a vacinação obrigatoriamente deverá ser realizada de 6 em 6 meses.

Portanto, ao continuar o declínio fisiológico da persistência observado na tabela 2, a partir dos 150 dias

provavelmente a maioria das ovelhas vacinadas estaria desprotegida com títulos inferiores a 0,5 UI/mL,

indicando a necessidade de revacinação.

O sistema humoral também é afetado pela deficiência de Se (Arthur et al. 2003), tanto a

imunidade inata como a adaptativa estão comprometidas em indivíduos deficientes deste mineral, e

alterações na ingestão de Se afetam a resposta imune a diferentes agente etiológicos, incluindo imunidade

antiviral e resposta à vacinas (Verma et al. 2011). Vários estudos em animais de produção demonstram os

efeitos da deficiência de Se sobre a resposta imune (Spalholz et al. 1990). Na maioria dos casos, estes

estudos encontraram um aumento de ambas as respostas imunes mediadas por células e humoral, quando

46

se aumentou os níveis de ingestão de Se. No entanto, os resultados são pouco elucidativos sobre o

benefício da suplementação de Se acima dos níveis adequados, em conferir proteção imunológica

adicional (Verma et al. 2011). Os títulos de anticorpos anti-rábicos heterogênicos observados nessa

pesquisa podem ter ocorrido pelo nível de suplementação estar próximo do limite máximo adequado nos

dois grupos.

Funari Jr. (2008) trabalhando com frangos de corte concluiu que a suplementação de selênio não

demonstrou efeito sobre a imunidade humoral nas duas fontes orgânico e inorgânico. A resposta imune é

influenciada por diversos fatores como o estresse, a suplementação de colicalciferol e de outros

nutrientes. A suplementação com Se orgânico e inorgânico proposta neste estudo pode não ter sido

suficiente para incrementar uma resposta humoral, e fatores estressantes como os sucessivos ataques de

predadores (cães) durante o período experimental, podem ter ocasionado a liberação de cortisol e

justificar a ausência de uma resposta imune humoral mais efetiva e persistente no GT.

Vários autores têm pesquisado a resposta imune em bovinos e constataram que a resposta se

apresentou heterogênea, havendo animais não responsivos, intercalados com animais que apresentaram

valores baixos, médios e altos (Ciuchini et al. 1981, Albas et al. 1998, Tizard 2002). Ao que parece, em

relação ao Se e as ovelhas, o mesmo fenômeno pode ter se apresentado, onde animais após a dose de

reforço responderam com títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos muito altos, na ordem de 16

UI/mL, outros com resposta mediana com valores de 5 a 6 UI/mL e alguns com respostas mínimas com

valores de 1 UI/mL.

Outro fator de destaque é que a imunoprofilaxia anti-rábica se mostrou um eficiente modelo

experimental imunológico, pois sua característica de altíssima mortalidade da raiva, diminui a

possibilidade de novos estímulos antigênicos, facilitando assim as pesquisas que utilizam um tempo maior

de período experimental, como as de minerais traços, que requerem vários meses de suplementação para

que ocorra o efeito desejado.

CONCLUSÕES

A suplementação oral de selênio orgânico não incrementou a resposta imune humoral e a

persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos, entretanto, promoveu aumento da

retenção sérica de selênio em ovelhas.

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50

Tabela 1: Média dos valores séricos da selenoproteina Glutationa Peroxidase (GSH-Px) em ovinos vacinados contra raiva com duas doses e suplementados com selênio orgânico

GSH-Px (U/g Hb) 1° dia da

adaptação D120

Controle 616,3±215,7aA 628,2±188.2aA

Tratado 655,9±172,4aA 981,8±105.2bB

p-valor 0,243 0,000 Letras minúsculas iguais na mesma coluna indicam não haver diferença estatística significativa (p<0,05) Letras maiúsculas iguais na mesma linha indicam não haver diferença estatística significativa (p<0,05)

Tabela 2: Média dos títulos (UI/ml) de anticorpos anti-rábicos em ovinos vacinados contra raiva com duas doses e suplementados com selênio orgânico

Grupo D0 D30 D60 D90 D120

Controle 0,039aA 1,885aB 7,763aC 1,350aB 0,775aB

Tratado 0,048aA 1,020aB 5,070aC 1,440aB 0,720aB

p-valor 0,203 0,269 0,289 0,839 0,846 Letras minúsculas iguais na mesma coluna indicam não haver diferença estatística significativa (p<0,05) Letras maiúsculas iguais na mesma linha indicam não haver diferença estatística significativa (p<0,05)

51

CONCLUSÃO GERAL

A suplementação oral de selênio orgânico não incrementou a resposta imune

humoral e a persistência do título de anticorpos neutralizantes anti-rábicos,

entretanto, promoveu aumento da retenção sérica de selênio em ovelhas.

52

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145. Albas A, Pardo PE, Bremer Neto H, Frazatti-Gallina NM, Mourão Fuches RM, Sartori A. Vacinação anti-rábica em bovinos: comparação de cinco esquemas vacinais. Arquivos Instituto Biológico, v.72, n.2, p. 153-159, 2005.

146. Cazella LN, Pardo PE, Frazatti-Gallina NM, Reis LSLS. Effect of levamisole on the humoral immune response against rabies in cattle. Veterinary Record, n.165, p.722-723, 2009.

147. Maria EK, Pardo PE, Frazatti-Gallina NM, Paoli RL, Mourão Fuches RM, Reis LSLS. 2009. Suplementação com zinco não influencia a resposta imune humoral antirrábica em bovinos. Archivos de Zootecnia, v. 58, supl. 1, p. 605-608, 2009.

148. Atanasiu P, Fuenzalida E, Acha P, Szyfres B. Inmunidad antirrábica en bovinos vacunados. Boletín de la Oficina Sanitaria Panamericana, v.64, p.431-440, 1968.

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149. Montaño JÁ, Polack GW, Mora EF. Raiva bovina em animais vacinados. II – Situação epidemiológica no Estado do Paraná, Brasil – 1984. Arquivo de Biologia e Tecnologia, v.30, n.2, p.367-380, 1987.

150. Rondon ES, Bastos PV, Silva DA, Piccini RS. Estudo comparativo da sintomatologia clínica de bovinos suspeitos de raiva. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.17, p.253-259, 1995.

151. Albas A, Alberti ALL, Pardo PE, Giometti J. Ausência de resposta imune em bovinos vacinados contra a raiva na região de Presidente Prudente, SP. Hora Veterinária v. 86, p. 64-66, 1995.

152. Queiroz LH, Cardoso TC, Perri SHV, Pinheiro DM, Carvalho C. Pesquisa de anticorpos anti-rábicos em bovinos vacinados da região de Araçatuba, SP. Arquivos Instituto Biológico, v. 70, n.4, p. 407-413, 2003.

153. Arenas SE, Reis LSLS, Frazatti-Gallina NM, Fujimura SH, Bremer-Neto H & Pardo PE. Probiotic increase the anti rabies humoral immune Response in bovine. Arch. Zootec. 58 (224): 733-736, 2009.

154. Carneiro PG. avaliação da resposta imune humoral anti-rábica em ovinos suplementados com zinco orgânico. Trabalho de conclusão de Curso. Universidade Norte do Paraná. Arapongas: p.73, 2010.

155. Ribeiro Neto A, Nilsson MR, De Angelis Cortes J, Mizuno M, Miguel O. Comparative study of cattle antirabies vaccine. Zentralblatt fur Veterinaer medizin, v.20, p.398- 404, 1973.

156. Ito FH, Côrtes JA, Rweyemamu MM, Umehara O, Medeiros Neto RR, De Lucca Neto D, et al. Course of humoral immune response shortly after revaccination with BHK-21 cell culture inactivated rabies vaccine adjuvanted with aluminium hydroxide .Brazilian Journal Veterinary Research and Animal Science, n.28, p.51-57, 1991.

157. Côrtes JA, Rweyemamu MM, Ito FH, Umehara O, Medeiros Neto RR, De Lucca Neto D, et al. Immune response in cattle induced by inactivated rabies vaccine adjuvanted with aluminium hydroxide either alone or in combination with avridine. Revue Scientifique et Technique Office International des Epizooties, v.12, p.941- 955, 1993.

158. Rodrigues Da Silva AC, Caporale GMM, Gonçalves CA, Tagueta MC, Comin F, Zanetti CR, Kotait I. Antibody response in cattle after vaccination with inactivated and attenuated rabies vaccines. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.42, n.2, p.95- 98, 2000.

159. Oliveira AN, Andrade MCR, Silva MV, Moura WC, Contreiras EC. Immune response in cattle vaccinated agaist rabies. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.95, n.1, p.83-88, 2000.

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160. Albas A. Vacina anti-rábica em bovinos: efeito de doses de reforço. 68p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Univ. Estadual Paulista, Botucatu: 2003.

161. Pastoret PP, Thomas I, Brochier B, Schwers A. Les prolèmes associés à la vaccination antirabique des animaux domestiques. Annales de Médicine Véterinarre, n.129, p.339-349, 1995.

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ANEXO

Normas para preparação dos artigos científicos pra submissão a publicação na Revista Pesquisa Veterinária Brasileira.

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Os trabalhos para submissão devem ser enviados por via eletrônica, através do e-mail <[email protected]>, com os arquivos de texto na versão mais recente do Word e formatados de acordo com o modelo de apresentação disponível no site da revista (www.pvb.com.br. Devem constituir-se de resultados de pesquisa ainda não publicados e não considerados para publicação em outra revista.

Para abreviar sua tramitação e aceitação, os trabalhos sempre devem ser submetidos conforme as normas de apresentação da revista (www.pvb.com.br) e o modelo em Word (PDF no site). Os originais submetidos fora das normas de apresentação, serão devolvidos aos autores para a devida adequação.

Apesar de não serem aceitas comunicações (Short communications) sob forma de ―Notas Científicas‖, não há limite mínimo do número de páginas do trabalho enviado, que deve, porém, conter pormenores suficientes sobre os experimentos ou a metodologia empregada no estudo. Trabalhos sobre Anestesiologia e Cirurgia serão recebidos para submissão somente os da área de Animais Selvagens.

Embora sejam de responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos trabalhos, o Conselho Editorial, com a assistência da Assessoria Científica, reserva-se o direito de sugerir ou solicitar modificações aconselháveis ou necessárias. Os trabalhos submetidos são aceitos através da aprovação pelos pares (peer review).

NOTE: Em complementação aos recursos para edição da revista (impressa e online) e distribuição via correio é cobrada taxa de publicação (page charge) no valor de R$ 250,00 por página editorada e impressa, na ocasião do envio da prova final, ao autor para correspondência.

1. Os trabalhos devem ser organizados, sempre que possível, em Título, ABSTRACT, RESUMO, INTRODUÇÃO, MATERIAL E MÉTODOS, RESULTADOS, DISCUSSÃO, CONCLUSÕES (ou combinação destes dois últimos), Agradecimentos e REFERÊNCIAS:

a) o Título do artigo deve ser conciso e indicar o conteúdo do trabalho; pormenores de identificação científica devem ser colocados em MATERIAL E MÉTODOS.

b) O(s) Autor(es) deve(m) sistematicamente encurtar os nomes, tanto para facilitar sua identificação científica, como para as citações bibliográficas. Em muitos casos isto significa manter o primeiro nome e o último sobrenome e abreviar os demais sobrenomes:

Paulo Fernando de Vargas Peixoto escreve Paulo V. Peixoto ou Peixoto P.V.; Franklin Riet-Correa Amaral escreve Franklin Riet-Correa ou Riet-Correa F.; Silvana Maria Medeiros de Sousa Silva poderia usar Silvana M.M.S. Silva, inverso Silva S.M.M.S., ou Silvana M.M. Sousa-Silva, inverso, Sousa-Silva S.M.M., ou mais curto, Silvana M. Medeiros-Silva, e inverso, Medeiros-Silva S.M.; para

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facilitar, inclusive, a moderna indexação, recomenda-se que os trabalhos tenham o máximo de 8 autores; c) o ABSTRACT deverá ser apresentado com os elementos constituintes do

RESUMO em português, podendo ser mais explicativos para estrangeiros. Ambos devem ser seguidos de ―INDEX TERMS‖ ou ―TERMOS DE INDEXAÇÃO‖, respectivamente;

d) o RESUMO deve apresentar, de forma direta e no passado, o que foi feito e estudado, indicando a metodologia e dando os mais importantes resultados e conclusões. Nos trabalhos em inglês, o título em português deve constar em negrito e entre colchetes, logo após a palavra RESUMO;

e) a INTRODUÇÃO deve ser breve, com citação bibliográfica específica sem que a mesma assuma importância principal, e finalizar com a indicação do objetivo do trabalho;

f) em MATERIAL E MÉTODOS devem ser reunidos os dados que permitam a repetição do trabalho por outros pesquisadores. Na experimentação com animais, deve constar a aprovação do projeto pela Comissão de Ética local;

g) em RESULTADOS deve ser feita a apresentação concisa dos dados obtidos. Quadros devem ser preparados sem dados supérfluos, apresentando, sempre que indicado, médias de várias repetições. É conveniente, às vezes, expressar dados complexos por gráficos (Figuras), ao invés de apresentá-los em Quadros extensos;

h) na DISCUSSÃO devem ser discutidos os resultados diante da literatura. Não convém mencionar trabalhos em desenvolvimento ou planos futuros, de modo a evitar uma obrigação do autor e da revista de publicá-los;

i) as CONCLUSÕES devem basear-se somente nos resultados apresentados no trabalho;

j) Agradecimentos devem ser sucintos e não devem aparecer no texto ou em notas de rodapé;

k) a Lista de REFERÊNCIAS, que só incluirá a bibliografia citada no trabalho e a que tenha servido como fonte para consulta indireta, deverá ser ordenada alfabeticamente pelo sobrenome do primeiro autor, registrando-se os nomes de todos os autores, em caixa alta e baixa (colocando as referências em ordem cronológica quando houver mais de dois autores), o título de cada publicação e, abreviado ou por extenso (se tiver dúvida), o nome da revista ou obra, usando as instruções do ―Style Manual for Biological Journals‖ (American Institute for Biological Sciences), o ―Bibliographic Guide for Editors and Authors‖ (American Chemical Society, Washington, DC) e exemplos de fascículos já publicados (www. pvb.com.br). 2. Na elaboração do texto deverão ser atendidas as seguintes normas: a) os trabalhos devem ser submetidos seguindo o exemplo de apresentação de fascículos recentes da revista e do modelo constante do site sob “Instruções aos Autores” (www.pvb.com.br). A digitalização deve ser na fonte Cambria, corpo 10, entrelinha simples; a página deve ser no formato A4, com 2cm de margens (superior, inferior, esquerda e direita), o texto deve ser corrido e não deve ser formatado em duas colunas, com as legendas das figuras e os Quadros no final (logo após as REFERÊNCIAS). As Figuras (inclusive gráficos) devem ter seus arquivos fornecidos separados do texto. Quando incluídos no texto do trabalho, devem ser introduzidos através da ferramenta ―Inserir‖ do Word; pois imagens copiadas e coladas perdem as informações do programa onde foram geradas, resultando, sempre, em má qualidade;

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b) a redação dos trabalhos deve ser concisa, com a linguagem, tanto quanto possível, no passado e impessoal; no texto, os sinais de chamada para notas de rodapé serão números arábicos colocados em sobrescrito após a palavra ou frase que motivou a nota. Essa numeração será contínua por todo o trabalho; as notas serão lançadas ao pé da página em que estiver o respectivo sinal de chamada. Todos os Quadros e todas as Figuras serão mencionados no texto. Estas remissões serão feitas pelos respectivos números e, sempre que possível, na ordem crescente destes. ABSTRACT e RESUMO serão escritos corridamente em um só parágrafo e não deverão conter citações bibliográficas.

c) no rodapé da primeira página deverá constar endereço profissional completo de todos os autores e o e-mail do autor para correspondência, bem como e-mails dos demais autores (para eventualidades e confirmação de endereço para envio do fascículo impresso);

d) siglas e abreviações dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira vez no trabalho, serão colocadas entre parênteses e precedidas do nome por extenso;

e) citações bibliográficas serão feitas pelo sistema ―autor e ano‖; trabalhos de até três autores serão citados pelos nomes dos três, e com mais de três, pelo nome do primeiro, seguido de ―et al.‖, mais o ano; se dois trabalhos não se distinguirem por esses elementos, a diferenciação será feita através do acréscimo de letras minúsculas ao ano, em ambos. Trabalhos não consultados na íntegra pelo(s) autor(es), devem ser diferenciados, colocando-se no final da respectiva referência, “(Resumo)” ou “(Apud Fulano e o ano.)”; a referência do trabalho que serviu de fonte, será incluída na lista uma só vez. A menção de comunicação pessoal e de dados não publicados é feita no texto somente com citação de Nome e Ano, colocando-se na lista das Referências dados adicionais, como a Instituição de origem do(s) autor(es). Nas citações de trabalhos colocados entre parênteses, não se usará vírgula entre o nome do autor e o ano, nem ponto-e-vírgula após cada ano; a separação entre trabalhos, nesse caso, se fará apenas por vírgulas, exememplo: (Christian & Tryphonas 1971, Priester & Haves 1974, Lemos et al. 2004, Krametter-Froetcher et. al. 2007);

f) a Lista das REFERÊNCIAS deverá ser apresentada isenta do uso de caixa alta, com os nomes científicos em itálico (grifo), e sempre em conformidade com o padrão adotado nos últimos fascículos da revista, inclusive quanto à ordenação de seus vários elementos.

3. As Figuras (gráficos, desenhos, mapas ou fotografias) originais devem ser preferencialmente enviadas por via eletrônica. Quando as fotos forem obtidas através de câmeras digitais (com extensão ―jpg‖), os arquivos deverão ser enviados como obtidos (sem tratamento ou alterações). Quando obtidas em papel ou outro suporte, deverão ser anexadas ao trabalho, mesmo se escaneadas pelo autor. Nesse caso, cada Figura será identificada na margem ou no verso, a traço leve de lápis, pelo respectivo número e o nome do autor; havendo possibilidade de dúvida, deve ser indicada a parte inferior da figura pela palavra ―pé‖. Os gráficos devem ser produzidos em 2D, com colunas em branco, cinza e preto, sem fundo e sem linhas. A chave das convenções adotadas será incluída preferentemente, na área da Figura; evitar-se-á o uso de título ao alto da figura. Fotografias deverão ser apresentadas preferentemente em preto e branco, em papel brilhante, ou em diapositivos (―slides‖). Para evitar danos por grampos, desenhos e fotografias deverão ser colocados em envelope.

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Na versão online, fotos e gráficos poderão ser publicados em cores; na versão impressa, somente quando a cor for elemento primordial a impressão das figuras poderá ser em cores.

4. As legendas explicativas das Figuras conterão informações suficientes para que estas sejam compreensíveis, (até certo ponto autoexplicatívas , com independência do texto) e serão apresentadas no final do trabalho.

5. Os Quadros deverão serexplicativos por si mesmos e colocados no final do texto. Cada um terá seu título completo e será caracterizado por dois traços longos, um acima e outro abaixo do cabeçalho das colunas; entre esses dois traços poderá haver outros mais curtos, para grupamento de colunas. Não há traços verticais. Os sinais de chamada serão alfabéticos, recomeçando, se possível, com “a” em cada Quadro; as notas serão lançadas logo abaixo do Quadro respectivo, do qual serão separadas por um traço curto à esquerda. Pesq. Vet. Bras. 33(7), julho 2013.

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PRISCILLA GOMES CARNEIRO FERREIRA DE MELO