ELIZABETE APARECIDA RUZZA JAKIEMIU

UMA CONTRIBUIO AO ESTUDO DO LEO ESSENCIAL E DO EXTRATO DE TOMILHO (Thymus vulgaris L.)

CURITIBA 2008

2 ELIZABETE APARECIDA RUZZA JAKIEMIU

UMA CONTRIBUIO AO ESTUDO DO LEO ESSENCIAL E DO EXTRATO DE TOMILHO (Thymus vulgaris L.)

Dissertao apresentada ao Programa de Ps Graduao de Tecnologia de Alimentos do Setor de Tecnologia da Universidade Federal do Paran, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Tecnologia de Alimentos. Orientadora: Dr Agnes de Paula Scheer Co-orientador: Dr. Juarez Souza de Oliveira

CURITIBA 2008

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Jakiemiu, Elizabete Aparecida Ruzza Uma contribuio ao estudo do leo essencial e do extrato de tomilho (Thymus vulgaris L.) / Elizabete Aparecida Ruzza Jakiemiu. Curitiba, 2008. 89 f. : il., tabs, grafs.. Orientadora: Profa. Dra. Agnes de Paula Scheer Co-orientadores: Dr. Juarez Souza de Oliveira Dissertao (Mestrado) Universidade Federal do Paran, Setor de Tecnologia, Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de Alimentos. Inclui Bibliografia. 1. Essncias e leos essenciais. 2. Tomilho. 3. Hidrodestilao. 1. Extrao com solvente.I. Scheer, Agnes de Paula. II.Ttulo. III. Universidade Federal do Paran. CDD 633.85

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Dedico este Trabalho:

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Ao meu amado companheiro Airton Jr. que sempre esteve presente com muita pacincia, compreenso e muito amor, sempre me incentivando e colaborando para a realizao deste trabalho.

Ao meu irmo Jos Carlos que nunca deixou de acreditar em mim e me apoiar nas decises mais difceis.

Aos meus pais Jair e Ivanir Jakiemiu que na sua simplicidade nunca deixaram que as dificuldades se sobrepusessem ao amor e ao carinho dedicado aos filhos.

Aos meus sogros Airton e Clarice Vendruscolo que me acolheram como filha dando todo o apoio possvel para que eu conseguisse realizar esse trabalho.

AGRADECIMENTOS

7 A Deus, pelo Seu infinito amor que me fascina cada vez mais. Aos meus irmos Joo, Jos Carlos, Maria Isabel, Genoefa e Gilberto pelo carinho e incentivo e por estarem sempre ao meu lado. A minhas sobrinhas Gabrieli Luiza, Giovanna, Ana Laura, Victria e aos meus afilhados Paulo Alexandre, Vitria e Jos Pedro que sempre souberam me distrair nos momentos em que eu precisava dar um tempo aos livros. Que vocs possam fazer o futuro melhor! A amiga e colega Solange Carpes pelo apoio irrestrito para que eu aceitasse o desafio de fazer uma ps-graduao. minha orientadora, Dr Agnes de Paula Scheer, pela sua disposio e pacincia demonstradas durante sua orientao. Alm de seus ensinamentos, por no medir esforos para me ajudar durante toda a pesquisa. Ao co-orientador, Dr. Juarez de Souza Oliveira, pelo apoio e por estar sempre disposio partilhando seus conhecimentos e suas idias brilhantes. A pesquisadora Llian Cristina Ccco, pela grande amizade, incentivo e acima de tudo pelo conhecimento que me passou. No tenho palavras para agradecer tudo que me ensinou. Ao professor Dr. Ccero Deschamps, pela disponibilidade no apenas do Laboratrio de Ecofisiologia, mas tambm pela disponibilidade em esclarecer dvidas e apoiar esta pesquisa. Ao Laboratrio de Combustveis Automotivos LACAUT- ets, na pessoa do professor Dr. Carlos Itsuo Yamamoto, pela disponibilidade de equipamentos e de servios. A CHAMEL Indstria e Comrcio de Produtos Naturais Ltda, na pessoa do senhor Estefano Dranka, pela gentileza em doar as plantas frescas e ao colega e funcionrio desta empresa Kleber Bert pela sua presteza e disponibilidade. A todos os professores do Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Alimentos, em especial professora Snia Haracemiv, que alm de conhecimento soube transmitir muitos exemplos para a vida.

8 A Coordenao do Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Alimentos pela oportunidade de realizao deste trabalho. A todos os colegas de turma pela amizade construda nesses dois anos. Ao colega Vitor Renan da Silva pela colaborao no desenho das frmulas qumicas. Aos estagirios do Laboratrio de Ecofisiologia, em especial ao Rodrigo Monteiro, que sempre esteve disposto a ajudar nas extraes. Ao CNPQ, pela oportunidade e concesso de bolsa de estudo.

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Chegamos exatamente onde precisamos chegar, porque a Mo de Deus sempre guia aquele que segue seu caminho com f. Autor Desconhecido

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RESUMO O trabalho teve como objetivo identificar e quantificar os constituintes do leo essencial de tomilho (Thymus vulgaris L) extrados por hidrodestilao. Um estudo complementar foi desenvolvido tambm para um extrato obtido por extrao com solvente. Foram utilizadas quatro tipos de amostras entre plantas secas e frescas e comparadas entre si conforme sua composio. No mtodo de hidrodestilao utilizou-se trs tempos de extrao que foram de 1, 2 e 3 horas, no qual se obteve o melhor rendimento 1,86% para plantas frescas com haste no tempo de 3 horas. Para a identificao dos compostos utilizou-se cromatografia a gs acoplada a espectrometria de massas CG/EM e para a quantificao utilizou-se a cromatografia a gs com detector de chama CG/FID. Para o leo essencial obtido por hidrodestilao foram identificados e quantificados trinta e trs compostos que variaram a concentrao de acordo com o tipo de amostra utilizada sendo que os majoritrios foram o borneol, o carvacrol, o timol e o - terpineol. Para o extrato obtido por extrao com solvente foram identificados e quantificados trinta e oito compostos sendo que dezessete deles foram apenas traos, os principais compostos obtidos foram o -pineno, o mirceno, o timol e o carvacrol que tambm variaram suas concentraes conforme o tipo de amostra. Quando comparados os dois mtodos, o de hidrodestilaao se mostrou mais efetivo na extrao de timol enquanto que o mtodo de extrao com solvente se mostrou mais efetivo na extrao de -pineno. Palavras-chave: leo essencial. Tomilho. Hidrodestilao. Extrao com solvente.

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ABSTRACT

This work aimed the identification and quantification of the essential oil of thyme (Thymus vulgaris L.) contents, extracted by hydrodistillation. A complementary study was also developed for an extract obtained from an extraction with solvent. Four types of samples of dried and fresh plants were compared among them according to their composition. In the hydrodistillation method, it had been used three extraction times of 1, 2 and 3 hours, in which the best oil yield of 1.86% for fresh plants with aerial parts in 3 hours time. The components identification was performed by gas chromatography /mass spectrometry (GC/MS) and for the quantification, the equipment used was a gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID). For the essential oil obtained by hydrodistillation, thirty three components had been identified and quantified, and the concentration varied in accordance to the plant type. The majority components founding this study were: borneol, carvacrol, thymol and -terpineol. For the extract obtained by extraction with solvent, thirty eight components were identified and quantified, in which seventeen components had low concentration (traces). The mainly components were -pinene, myrcene, thymol and carvacrol that also had their composition varying in accordance to the plant type. When compared both methods, the hydrodistillation showed effective extraction of thymol whereas the extraction with solvent method showed effective extraction of -pinene.Key-words: Essential oil. Thyme. Hydrodistillation. Extraction with solvent.

12 LISTA DE FIGURAS FIGURA 01 FIGURA 02 FIGURA 03 FIGURA 04 FIGURA 05 FIGURA 06 FIGURA 07 FIGURA 08 FIGURA 09 FIGURA 10 PRINCIPAIS VIAS DO METABOLISMO SECUNDRIO................ BIOSSNTESE DE TERPENOS..................................................... BIOSSTESE DE FENILPROPRANIDES..................................... TOMILHO (Thymus vulgaris L.)...................................................... FRMULA ESTRUTURAL DE ALGUMAS SUBSTNCIAS PRESENTES NO LEO ESSENCIAL DO TOMILHO (Thymus vulgaris L.)....................................................................................... SISTEMA DE HIDRODESTILAO............................................... EXTRATOR A GS......................................................................... EQUIPAMENTO PORTTIL EXTRATOR PARA OPERAES COM GASES LIQEFEITOS.......................................................... CROMATGRAFO A GS VARIAN, MODELO CP 3800 COM DETECTOR FID.............................................................................. CROMATGRAFO A GS ACOPLADO A UM DETECTOR DE MASSAS......................................................................................... 24 27 30 37 39 48 49 50 52 53

13 LISTA DE TABELAS TABELA 01 TABELA 02 TABELA 03 PERCENTUAL DE UMIDADE MDIA POR TIPO DE AMOSTRA................................................................................ 54 RENDIMENTO MDIO POR TIPO DE AMOSTRA EM PORCENTAGEM VOLUME/MASSA...................................... IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO EXTRADOS POR TABELA 04 HIDRODESTILAO PLANTA SECA.................................... IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO EXTRADOS TABELA 05 HIDRODESTILAO DA PLANTA FRESCA......................... IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS DO EXTRATO DE TOMILHO (Thymus vulgaris L.) OBTIDO TABELA 06TABELA 07 POR EXTRAO COM SOLVENTE...................................... COMPOSTOS DO EXTRATO E DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO EXTRADOS DA PLANTA SECA.......................... COMPOSTOS DO EXTRATO E DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO DA PLANTA FRESCA........................................... 63 65 67 59 57 55

LISTA DE QUADROS QUADRO 01QUADRO 02RESUMO DE ARTIGOS DA REVISO BIBLIOGRFICA..... 43 RESUMO DAS CONCENTRAES DOS COMPOSTOS MAJORITRIOS DO TOMILHO COMPARADAS COM A LITERATURA.......................................................................... 62

LISTA DE ABREVIATURAS b.u. CG / FID Base mida Cromatografia a gs com detector de ionizao de chama

14 CG/EM DMAPP FPP GGPP GPP IPP ISO MEP m/z Pir/CG/MS UV Cromatografia a gs acoplada espectrometria de massas Dimetilalil difosfato Farnesil difosfato Geranilgeranil difosfato Geranil difosfato Isopentenil difosfato International Standard Organization Metileritritol fosfato Massa / carga Pirlise / cromatografia a gs / espectrometria de massa Raios ultravioleta

SUMRIO

1 INTRODUO.................................................................................................... 1.1 OBJETIVOS..................................................................................................... 1.1.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................... 1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................................

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15 2 REVISO DE LITERATURA.............................................................................. 2.1 LEOS ESSENCIAIS - BREVE HISTRICO.................................................. 2.2 OS LEOS ESSENCIAIS - DEFINIES....................................................... 19 19 20

2.2.1 Metabolismo Secundrio............................................................................... 23 2.2.2 Os terpenides.......................................................................................................... 24

2.2.3 Biossntese de Terpenos............................................................................... 26 2.2.4 Os Fenilpropanides..................................................................................... 2.2.5 Secagem de Plantas Aromticas.................................................................. 28 30

2.2.6 Mtodos de Extrao e Anlise do leo Essencial....................................... 33 2.2.7 Toxicidade..................................................................................................... 36

2.2.8 Tomilho.......................................................................................................... 37 2.2.9 Utilizao dos Principais Compostos na Indstria ....................................... 3 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................. 44 47

3.1 MATERIAL BOTNICO.................................................................................... 47 3.2 EXTRAO DO LEO ESSENCIAL............................................................... 47

3.2.1 Extrao por hidrodestilao......................................................................... 47 3.2.2 Extrao com solvente orgnico................................................................... 3.3 DETERMINAO DO RENDIMENTO DO LEO ESSENCIAL...................... 48 51

3.4 CROMATOGRAFIA A GS.............................................................................. 51 3.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS.................................................................. 3.6 ANLISE ESTATISTICA.................................................................................. 52 53

4 RESULTADOS E DISCUSSES........................................................................ 54 4.1 UMIDADE......................................................................................................... 4.2 DETERMINAO DO TEOR DE LEO ESSENCIAL..................................... 4.3 IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPONENTES DOS LEOS ESSENCIAIS....................................................................................... 4.3.1 Extrao por Hidrodestilao ....................................................................... 56 56 54 54

4.3.1.1 Planta seca................................................................................................. 56

16 4.3.1.2 Planta Fresca............................................................................................. 58

4.3.1.3 Comparao entre planta seca e planta fresca.......................................... 61 4.3.2 Extrao com Solvente................................................................................. 4.4 OBSERVAES SOBRE OS CONSTITUINTES OBTIDOS ATRAVS DOS DOIS DIFERENTES MTODOS DE EXTRAO................................................. 5 CONCLUSES................................................................................................... 6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS................................................. 64 69 71 62

REFERNCIAS...................................................................................................... 72 APNDICES.......................................................................................................... 79

1 INTRODUO Os leos essenciais so utilizados em diversos setores industriais como, por exemplo, na fabricao de frmacos, perfumes, cosmticos, produtos de higiene e limpeza, alimentos e bebidas. Esses leos podem ser extrados de caules, flores, frutos e razes de diversas espcies de vegetais aromticos e possuem diferentes aplicaes. Na indstria alimentcia podem atuar como antioxidantes e antibacterianos, alm de reproduzir o sabor e odor da planta

17 utilizada. Cerca de 300 diferentes tipos de leos essenciais so comercializados, apesar de serem conhecidos aproximadamente 3.000 tipos de leos essenciais (BUSATTA, 2006). O desempenho do comrcio exterior brasileiro de exportao de leos essenciais decresceu tanto em relao ao volume quanto receita, no perodo de 2003 a 2005, passando de 69.521 t para 59.745 t e de US$ 1.649.640,00 para US$ 1.275.720,00, respectivamente, segundo FERNANDES, 2005. Dentre os principais leos exportados pelo Brasil, em 2007, destacam-se os leos ctricos, pau-rosa, eucalipto e candeia sendo o principal produtor do leo essencial de eucalipto o Estado do Sergipe e do pau rosa o Estado do Amazonas (MATTOSO, 2007). As importaes brasileiras de leos essenciais mostraram uma tendncia de crescimento nesses ltimos anos. O ano de 2007 Brasil o limo siciliano e a menta (MATTOSO, 2007). No Estado do Paran, as espcies mais importantes so a camomila e o gengibre, porm outras espcies como o capim limo e eucalipto vm sendo exploradas. O Estado responsvel por 10% das importaes de leos essenciais de diversas plantas. Estes dados revelam a necessidade de expanso desse mercado, tanto no Paran como no Brasil, nos prximos anos (BARATA et al., 2005). O mercado de leos essenciais prspero para pases que dispem de uma grande biodiversidade, como o Brasil, e possuem condies de agregar valor s suas matrias-primas, transformando-as em produtos beneficiados. Por esse motivo importante pesquisar sobre o leo essencial de plantas condimentares como o tomilho. Este condimento de grande uso na culinria brasileira, e sabese que, na Frana, o leo essencial dessa planta vem sendo utilizado em restaurantes por chefes de cozinha para aromatizar pratos base de aves e peixes. No Brasil, apesar do grande uso dessa planta, poucos estudos sobre a composio do seu leo essencial foram efetuados. JORDN et al. (2003) relatam fechou com aproximadamente US$ 51 milhes, sendo os principais leos importados pelo

18 a existncia de uma demanda elevada para o leo essencial e uma variabilidade muito grande de espcies de tomilho. O valor comercial do leo essencial do Thymus vulgaris L., embora no muito acessvel, pode variar de R$ 500,00 a R$ 1000,00 o litro, dependendo de fatores como a qualidade e a concentrao. O Thymus vulgaris L., conhecido tambm como tomilho comum, uma planta nativa da regio do Mediterrneo (Espanha, Itlia, Frana, Grcia). Alm de uma fonte de leo essencial, tem sido usada tambm como fonte de seus constituintes como, por exemplo, o timol, os flavonides, o cido cafeico e o cido labitico, derivados de diferentes partes da planta (LEUNG e FOSTER, 1996). O programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Alimentos tem trabalhado em conjunto com o Programa de Ps-Graduao em Agronomia, rea de concentrao em Produo Vegetal para estudar tanto as variveis do manejo, desenvolvimento vegetativo, nveis de radiao e adubao quanto o rendimento e qualidade dos leos essenciais de vrias plantas. Dentro do contexto de aplicao dos constituintes foram estudados neste trabalho o rendimento e a qualidade do leo essencial de tomilho obtido por hidrodestilao e do extrato obtido por extrao com solvente. O equipamento para extrao foi projetado pelo co-orientador prof. Dr. Juarez Souza de Oliveira e utiliza como solvente hidrocarboneto liquefeito. Para a investigao da composio destes produtos foram aplicadas as tcnicas de espectrometria de massas e cromatografia a gs. Para a utilizao de leos essenciais pela indstria devem ser avaliados e otimizados mtodos existentes e alternativos de extrao. Cabe ressaltar ainda a necessidade do conhecimento tanto das variveis de produo vegetal quanto de obteno de derivados das plantas condimentares. A difuso destes conhecimentos possibilita a orientao do agricultor para diversificar seus ganhos e agregar valor aos seus produtos. O presente trabalho est dividido em mais cinco captulos. No captulo dois, a seguir, so apresentados um breve histrico do uso de essncias, a formao dos leos essenciais pelo metabolismo secundrio e os mtodos de extrao. Em

19 relao ao tomilho so relatadas suas principais caractersticas, sua toxicidade e os usos na indstria dos seus principais componentes: o timol e o carvacrol. No captulo trs so descritos os materiais, os procedimentos e as metodologias utilizadas para a obteno dos resultados. No captulo quatro so apresentados os resultados e as discusses. Nos captulos cinco e seis so apresentadas as concluses e sugestes para trabalhos futuros.

1.1 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivo Geral Identificar e quantificar os constituintes do leo essencial e do extrato de tomilho (Thymus vulgaris L.).

20 1.1.2 Objetivos Especficos 1. Determinar o teor de leo essencial de tomilho de plantas frescas e plantas secas; 2. Determinar o tempo de extrao adequado para o leo essencial do tomilho, utilizando o mtodo de hidrodestilo; 3. Identificar e quantificar os principais componentes do leo essencial obtido por hidrodestilao; 4. Identificar e quantificar os principais constituintes do extrato obtido por extrao com solvente; 5. Comparar os mtodos utilizados quanto variao da porcentagem dos compostos extrados de plantas frescas; 6. Comparar os mtodos utilizados quanto variao da porcentagem dos compostos extrados de plantas secas.

2 REVISO DE LITERATURA 2.1 LEOS ESSENCIAIS BREVE HISTRICO O emprego de essncias comeou nas antigas civilizaes, quando o homem descobriu o fogo e percebeu que ao queimar determinados arbustos e resinas, estas exalavam um aroma intenso. Na Idade Mdia, a busca pela pedra

21 filosofal levou os alquimistas a realizarem inmeras experincias, que contriburam no desenvolvimento de processos para a extrao dessas essncias. Os alquimistas perceberam que podiam sentir a presena das plantas aromticas mesmo quando estas j haviam sido retiradas do recinto, devido ao aroma liberado. Isso os levou a buscar a quinta essncia da matria. Paracelsus, alquimista do sculo XVI, usou vapor para conseguir isolar o que ele chamou de a alma da planta ou a quinta essncia daquele ser. Portanto, ele conseguiu isolar substncias que continham o aroma. Essas substncias, tal qual o leo, no se misturavam com a gua, de onde surgiu o nome leo essencial. Hoje em dia, mesmo no havendo leo ou lipdeos, nem sendo essencial, o termo leo essencial ou essncia utilizado no mundo todo (BLANCO et al. 2007). As primeiras referncias histricas importantes provm do Oriente, especialmente do Egito, onde os leos essenciais eram usados para embalsamar mmias e para fazer oferendas nas cerimnias religiosas e, muitas vezes, eram colocados em recipientes com detalhes em ouro que seguiam juntos para os tmulos dos grandes faras. Na Tumba de Tutancmon, por exemplo, foram encontrados leos aromticos de cedro, mirra e zimbro. Os gregos adquiriram conhecimentos dos egpcios e o transmitiram aos romanos que, a partir de 45 a.C., adotaram o uso dos leos essenciais para rituais religiosos e funerrios, perfumando no somente o corpo, mas tambm a moblia da casa (BIOMIST, 2006). Na Grcia, as folhas de tomilho eram queimadas como incenso, por ser a planta sinnimo de fora, felicidade, coragem e altivez, de onde surgiu o nome Thymus. Os romanos consideravam o tomilho o remdio dos fracos e desanimados, estmulo dos guerreiros e antidepressivo, sendo utilizado em banhos aromticos. No sculo XVII, fazia-se uma sopa com tomilho e cerveja para "curar a timidez"(OKA e ROPERTO, 2007). A evoluo da utilizao, com base cientfica, dos produtos naturais tem caminhado junto com a prpria evoluo da humanidade. Atualmente as pesquisas indicam um forte crescimento do mercado de produtos naturais, apresentando mdia de crescimento acima de 20% ao ano. Os leos obtidos

22 diretamente das plantas concorrem diretamente com produtos sintticos, tendo como principal diferencial o custo. A indstria alimentcia tem se voltado para a utilizao de produtos cada vez mais naturais e est preferindo utilizar aromatizantes extrados de plantas, porm a falta de pesquisa das composies, princpios ativos e toxicidade dos componentes ainda impede que estes sejam utilizados em escala industrial.

2.2 LEOS ESSENCIAIS - DEFINIES O valor condimentar de uma planta est geralmente ligado ao teor de leos volteis, que so compostos qumicos gerados durante o desenvolvimento da planta (FURLAN, 1998). Segundo a Resoluo - RDC n 2, de 15 de janeiro de 2007, leos essenciais so produtos volteis de origem vegetal obtidos por processo fsico (destilao por arraste com vapor de gua, destilao a presso reduzida ou outro mtodo adequado). Podem se apresentar isoladamente ou misturados entre si, retificados, desterpenados ou concentrados. Entende-se por retificados, os produtos que tenham sido submetidos a um processo de destilao fracionada para concentrar determinados componentes; por concentrados, os que tenham sido parcialmente desterpenados; por desterpenados, aqueles dos quais tenha sido retirada a quase totalidade dos terpenos (BRASIL, 2007). Conforme a International Standard Organization (ISO), descrito por SIMES e SPITZER (2003), os leos essenciais so misturas complexas de substncias volteis, lipoflicas, geralmente odorferas e lquidas. A designao de leo devida a algumas caractersticas fsico-qumicas como a de serem geralmente lquidos de aparncia oleosa temperatura ambiente. Sua principal caracterstica a volatilidade, diferenciando-os dos leos fixos, que so misturas de substncias lipdicas obtidas normalmente de sementes, como, por exemplo, soja, mamona e girassol. Os leos volteis podem estar presentes em certos rgos das plantas, como nas flores, folhas, cascas, tronco, galhos, razes, rizomas, frutos ou

23 sementes. Apesar de todos os rgos de uma planta poderem acumular leos volteis, sua composio pode variar segundo a localizao (SIMES et al., 2000). leos essenciais extrados de diferentes partes de uma mesma planta, apesar de apresentarem cor e aspecto semelhantes, podem apresentar composio qumica, caractersticas fsico-qumicas e odores diferentes (ROBBERS et al., 1997). Embora extrado do mesmo rgo de uma mesma espcie vegetal, a composio qumica de um leo essencial pode variar significativamente, dependendo ainda de fatores como a poca de coleta - as espcies apresentam pocas especficas em que contm maior quantidade de leos volteis no seu tecido, podendo esta variao ocorrer tanto no perodo de um dia como em pocas do ano (REIS et al., 2003) - estgio de desenvolvimento, condies climticas e de solo (SIMES e SPITZER, 2003). O aroma agradvel e intenso presente na maioria dos leos volteis faz com que estes sejam chamados de essncias. Eles tambm so solveis em solventes orgnicos pouco polares, como ter, recebendo, por isso, a denominao de leos etreos ou, em latim, aetheroleum (RADNZ, 2004). Diversas funes biolgicas da planta so atribudas aos leos volteis, tais como a atrao de polinizadores, a defesa contra o ataque de predadores, a proteo contra perda de gua e aumento de temperatura e a inibio de germinao. Os leos essenciais so tambm considerados como desperdcio fisiolgico ou produtos de desintoxicao, desempenhando a adaptao do organismo ao meio (SIMES et al., 2000; FABROWSKI, 2002). A constituio dos leos essenciais varia desde hidrocarbonetos terpnicos, lcoois simples e terpnicos, aldedos, cetonas, fenis, steres, teres, xidos, perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas e compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos esto presentes em diferentes concentraes, normalmente variando de acordo com as caractersticas de cada planta (SIMES; SPITZER, 2003). Segundo SILVA e CASALI (2000), os leos essenciais so provenientes do metabolismo secundrio. So normalmente elaborados nas folhas,

24 armazenados em espaos extracelulares, entre a cutcula e a parede celular. A biossntese de leos essenciais ocorre normalmente em estruturas chamadas tricomas glandulares que esto distribudos em quantidades diferentes por toda a planta, mas que na maioria das plantas ocorrem principalmente nas folhas e clices (LEVIN, 1973) . A formao dos compostos dos leos essenciais se d a partir da derivao qumica de terpenides, originados a partir do cido mevalnico, ou de fenilpropanides, provindos do cido chiqumico (GUENTHER, 1977 e SIMES et al. 2000). Uma grande variedade de substncias vegetais constituda por terpenides, sendo empregado este termo para indicar todas as substncias de origem biossinttica derivadas de unidades do isopreno. Cada unidade isoprnica, por sua vez, origina-se a partir do cido mevalnico (Mann e Breitmaier, citados por SIMES e SPITZER, 2003). Nos leos volteis os compostos terpnicos encontrados com maior freqncia so os monoterpenos (C10) (cerca de 90% dos leos volteis) e os sesquiterpenos (C15). J os diterpenos (C20) so encontrados apenas em leos essenciais extrados com solventes orgnicos devido alta temperatura de volatilizao desses compostos (Steinegger e Hansel, citados por SIMES e SPITZER, 2003). Os constituintes de leos essenciais de plantas so divididos em duas classes qumicas inteiramente distintas, terpenides e fenilpropanides. Embora os terpenos representem a maioria dos componentes e ocorram com muito mais freqncia e abundncia, sempre que os fenilpropanides esto presentes fornecem um sabor e odor indispensveis e significativos ao leo. Biogeneticamente, terpenides e fenilpropanides originam-se de metabolismos precursores diferentes e so gerados por rotas biossintticas completamente distintas (SANGWAN et al. 2001). Para melhor explicar essa formao faz-se necessrio o entendimento do metabolismo secundrio das plantas bem como a formao dos terpenos e dos fenilpropanides.

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2.2.1 Metabolismo Secundrio Por no ser necessrio para todas as plantas, o metabolismo secundrio origina compostos que no possuem uma distribuio universal e, por isso, esses compostos podem ser utilizados em estudos taxonmicos. Apesar de nem sempre ser necessrio para que uma planta complete seu ciclo de vida, o metabolismo secundrio desempenha um papel importante na interao das plantas com o meio ambiente. Uma das principais funes dos compostos gerados so os mecanismos de defesa das plantas. Assim, produtos secundrios agem como defesa contra herbvoros, ataque de patgenos, competio entre plantas e atrao de organismos benficos como polinizadores, dispersores de semente e microorganismos simbiontes. Possuem tambm ao protetora em relao a mudanas de temperatura, contedo de gua, nveis de luz, exposio aos raios ultravioleta (UV) e deficincia de nutrientes minerais. Os metablitos secundrios dividem-se em trs grandes grupos: terpenos, compostos fenlicos e alcalides (FIGURA 01). Os terpenos so formados a partir do cido mevalnico, no citoplasma, ou do piruvato e 3-fosfoglicerato, no cloroplasto (PERES, 2004). Muito do sabor, odor e colorao de diversos vegetais que apreciamos no nosso dia-a-dia, so gerados por compostos fenlicos. Alguns desses compostos, como o aldedo cinmico da canela (Cinnamomum zeyllanicum) e a vanilina da baunilha (Vanilla planifolia), so empregados na indstria de alimentos. Os compostos fenlicos so atrativos no somente para seres humanos, mas tambm para outros animais, os quais so atrados para polinizao ou disperso de sementes. Alm disso, os compostos fenlicos desenvolvem uma funo de proteo nas plantas, como proteo contra os raios UV, insetos, fungos, bactrias e vrus. Algumas espcies vegetais desenvolvem compostos fenlicos para inibir o crescimento de outras plantas competidoras. Em termos qumicos, os compostos fenlicos so substncias que possuem pelo menos um anel aromtico no qual ao menos um hidrognio substitudo por um grupamento hidroxila. J os alcalides so derivados de aminocidos aromticos (triptofano, tirosina), os quais

26 so derivados do cido chiqumico, e tambm de aminocidos alifticos como a ornitina e a lisina (PERES, 2004).

FIGURA 01 - PRINCIPAIS VIAS DO METABOLISMO SECUNDRIO FONTE: PERES, 2004.

2.2.2 Os Terpenides At o presente momento, j foram catalogados aproximadamente 25.000 diferentes compostos terpnicos. Os terpenos so compostos que ocorrem em todas as plantas e compreendem uma classe de metablitos secundrios com uma grande variedade estrutural (RAVEN et al., 2001). Os terpenos so formados pela fuso de unidades isoprnicas de cinco carbonos; quando submetidos a altas temperaturas, podem se decompor em isoprenos, podendo referir-se, ocasionalmente, a todos os terpernos como isoprenides (TAIZ e ZEIGER, 2004). Os terpenos ou terpenides podem ser classificados de acordo com o nmero de isoprenos que constituem: hemiterpenides, monoterpenides, sesquiterpenides, diterpenides, triterpenides, tetraterpenides e politerpenides (OLIVEIRA et al., 2003). Os hemiterpenides (C5) so o menor grupo dos terpenos, sendo que o seu representante mais conhecido e estudado o isopreno, um produto voltil liberado de tecidos fotossinteticamente ativos (CROTEAU et al., 2000). Os monoterpenides (C10) so compostos por duas unidades de isopreno. Devido a

27 sua baixa massa molecular, estes costumam ser volteis, sendo os constituintes das essncias volteis e leos essenciais, atuando na atrao de polinizadores. Os monoterpenos podem ser isolados atravs de destilao ou extrao. O primeiro monoterpenide a ser isolado foi a turpentina (C10H16) na dcada de 1850 na Alemanha. Atualmente so conhecidos mais de 1.000 monoterpenides naturais e alguns tm sido empregados nas indstrias de perfumes e fragrncias, produo de especiarias, culinria, indstria de alimentos e condimentos (OLIVEIRA et al., 2003). Os monoterpenos podem ocorrer em plos glandulares, clulas parenquimticas diferenciadas e em canais oleferos. Eles podem estar estocados em flores, como as de laranjeira, folhas, como no capim-limo, nas cascas dos caules, como na canela, na madeira, como no sndalo ou no pau-rosa, e em frutos como nos de erva-doce (PERES, 2004). Os sesquiterpenides (C15) so encontrados nos leos essenciais e em hormnios vegetais, constituindo a maior classe de terpenides (OLIVEIRA et al., 2003). Os diterpenides (C20) compreendem um grande grupo de compostos no volteis, possuindo uma vasta gama de atividades diferentes que incluem os hormnios, cidos resnicos e agentes anticancergenos (ROBBERS et al., 1997; CROTEAU et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2003). PERES (2004) descreve que talvez o principal papel desempenhado por um diterpeno seja o das giberelinas, as quais so importantes hormnios vegetais responsveis pela germinao de sementes, alongamento caulinar e expanso dos frutos de muitas espcies vegetais. Os triterpenides (C30) formam os componentes das resinas, ltex, ceras e cutcula das plantas. Entre os triterpenos est uma importante classe de substncias, os esterides, os quais so componentes dos lipdios de membrana e precursores de hormnios esterides em mamferos, plantas e insetos. Uma outra classe importante de triterpenos so as saponinas. Como o prprio nome indica, as saponinas so prontamente reconhecidas pela formao de espuma em certos extratos vegetais. Essas substncias so semelhantes ao sabo porque possuem

28 uma parte solvel (glicose) e outra lipossolvel (triterpeno). Nas plantas, as saponinas desempenham um importante papel na defesa contra insetos e microorganismos (PERES, 2004). Os tetraterpenides (C40) so carotenides, pigmentos responsveis pela colorao amarela, laranja, vermelha e prpura dos vegetais, apresentando funo essencial na fotossntese e, especialmente, na pigmentao de flores e frutos. Os politerpenides so aqueles com mais de oito unidades de isopreno, ou seja, com mais de 40 carbonos na sua estrutura, como os longos polmeros encontrados na borracha (ROBBERS et al., 1997; CROTEAU et al., 2000 OLIVEIRA et al., 2003). 2.2.3 Biossntese de terpenos Os terpenos so biossintetizados a partir de metablitos primrios por no mnimo duas rotas diferentes, conforme mostra a FIGURA 02 (TAIZ e ZEIGER, 2004).

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FIGURA 02 - BIOSSNTESE DE TERPENOS FONTE: TAIZ E ZEIGER, 2004

Na rota do cido mevalnico, trs molculas de acetil CoA so ligadas, a partir de uma srie de etapas da rota, para formar o cido mevalnico. Esse importante intermedirio de seis carbonos ento pirofosforilado, descarboxilado

30 e desidratado para produzir o isopentenil difosfato (IPP), que a unidade bsica na formao dos terpenos. O IPP tambm pode ser formado a partir de intermedirio da glicose ou do ciclo de reduo fotossinttica do carbono, atravs de um conjunto de reaes denominado de rota do metileritritol fosfato (MEP), que ocorre nos clorosplastos e outros plastdeos. O gliceraldedo-3-fosfato e dois tomos de carbono derivados do piruvato se combinam para formar um intermedirio que convertido em IPP. O isopentenil difosfato e seu ismero, o dimetilalil difosfato (DMAPP) so as unidades pentacarbonadas ativas na biossntese dos terpenos que se unem para formar molculas maiores. Inicialmente o IPP e o DMAPP reagem e formam o geranil difosfato (GPP), uma molcula de 10 carbonos, a partir da qual so formados os monoterpenos. O GPP pode, ento, ligar-se a outra molcula de IPP, formando um composto de 15 carbonos, farnesil difosfato (FPP), precursor da maioria dos sesquiterpenos. A adio de outra molcula de IPP forma o geranilgeranil difosfato (GGPP), composto de 20 carbonos precursor dos diterpenos. Finalmente, FPP e GGPP podem dimerizar para formar triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40), respectivamente. No geral, os terpenides so os constituintes predominantes dos leos essenciais das plantas, mas muitos dos leos essenciais tambm podem ser compostos de outros produtos qumicos, os fenilpropanides. 2.2.4 Os Fenilpropanides Os mecanismos bioqumicos especficos de leos essenciais e sntese de fenilpropanides, tais como o eugenol e a elemicina, so conhecidos somente a uma extenso limitada. Embora os fenilpropanides no sejam constituintes comuns de leos essenciais de plantas, os leos essenciais de certas espcies contm propores abundantes ou significativas de tais compostos. Quando ocorrem, sua natureza e suas propriedades alteram significativamente as caractersticas sensoriais do leo. Os principais fenilpropanides conhecidos so

31 eugenol, metil eugenol, miristicina, elemicina, chavicol, metil chavicol, dilapiol, anetol, estragol, apiol (SANGWAN et al. 2001). Os fenilpropanides so substncias naturais amplamente distribudas nos vegetais e constitudas por um anel aromtico unido a uma cadeia de trs carbonos e derivadas biossinteticamente do cido chiqumico (FIGURA 03). O cido chiqumico formado por dois metablitos da glicose, o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fostato. Atravs da juno do cido chiqumico e de uma molcula de fosfoenolpiruvato ocorre a formao do cido corsmico (PERES, 2004). O cido corsmico responsvel por gerar aminocidos aromticos, como a fenilalanina, a tirosina e o triptofano, que so precursores de vrios alcalides. Esses aminocidos sofrem ao enzimtica, dando origem ao cido cinmico ou ao cido p-cumrico, tambm chamado de p-hidroxicinmico (LORENZO et al., 2002). A partir do cido cinmico ou do cido p-cumrico so formados compostos fenlicos simples denominados fenilpropanides. Esses compostos costumam ser volteis, sendo considerados, juntamente com os monoterpenos, leos essenciais (PERES, 2004).

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FIGURA 03 - BIOSSTESE DE FENILPROPANIDES FONTE: LORENZO et al. 2002 e PERES, 2004.

2.2.5 Secagem de Plantas Aromticas Aps a colheita, inicia-se um processo de degradao nas plantas, devido ao aumento da atividade enzimtica, levando tambm degradao dos princpios ativos presentes nas mesmas. Para minimizar esses efeitos, as plantas medicinais devem ser consumidas ou secas (REIS et al., 2003). O alto teor de gua presente nas clulas e tecidos das plantas, em torno de 60% a 80%, faz com que a secagem tenha importncia fundamental para evitar

33 a fermentao ou degradao dos princpios ativos. A secagem deve ser realizada corretamente para preservar as caractersticas de cor, aroma e sabor do material colhido e deve ser iniciada o mais rpido possvel (BRASIL, 2006). O excesso de umidade em matrias-primas vegetais permite a ao de enzimas, podendo acarretar a degradao de constituintes qumicos, alm de possibilitar o desenvolvimento de fungos e bactrias (FARIAS, 2003). O maior problema na secagem e no armazenamento de plantas aromticas a alta sensibilidade do princpio biologicamente ativo e sua conservao no produto final (HERTWIG, 1986). A secagem deve ser realizada at que a planta atinja 8% a 12% de gua, conforme a espcie e a parte da planta. Com essa umidade, a maior parte das espcies pode ser armazenada por um bom perodo sem que ocorra deteriorao e o desenvolvimento de microrganismos como fungos, bactrias e leveduras (BRASIL, 2006). A secagem no deve ser um processo muito rpido nem muito lento. Quando o processo rpido ocorre volatilizao dos compostos presentes na planta podendo degradar os princpios ativos da mesma. Se o processo for lento pode propiciar o aparecimento de microorganismos indesejveis, por isso muito importante que seja considerada a velocidade com que a gua retirada da planta medicinal, durante a secagem. (SILVA e CASALI, 2000). O tempo de secagem depende do fluxo de ar, da temperatura e da umidade relativa do ar. Quanto maior a temperatura e maior o fluxo de ar, tanto mais rpida a secagem. A temperatura de secagem determinada pela sensibilidade dos princpios ativos da planta; portanto, para cada espcie, h uma temperatura ideal de secagem (BRASIL, 2006). Com base nisso, alguns pesquisadores vm estudando o efeito de secagem sobre a qualidade e a quantidade de leo essencial extrado de determinadas plantas aromticas. Com o objetivo de avaliar a quantidade e a qualidade do leo essencial, DEANS e SVOBODA (1992) empregaram temperaturas do ar de secagem entre 40 e 100 C, durante 24 horas, para a secagem de manjerona (Origanum majorana L.), manjerico (Ocimum basilicum), artemsia (Artemisia dracunculus),

34 slvia (Salvia officinalis), satureja (Satureja hortensis), tomilho (Thymus vulgaris L.) e alecrim (Rosmarinus officinalis). A quantidade extrada de leo essencial foi inversamente proporcional ao aumento da temperatura do ar de secagem. A composio dos leos essenciais de manjerona e manjerico apresentou mudanas significativas quando a temperatura do ar de secagem atingiu 80 C, e em artemsia, slvia e satureja esta alterao foi percebida quando a temperatura atingiu 50 e 60C, enquanto que no tomilho e no alecrim no foram observadas mudanas significativas na composio do leo essencial. BARITAUX et al. (1992) estudaram a composio qumica do leo essencial de manjerico (Ocimum basilicum L.) seco com ar aquecido a 45 C e da planta fresca. A composio do leo essencial de manjerico seco demonstrou uma concentrao de componentes diferente do obtido da planta fresca. A porcentagem de metilchavicol e eugenol decresceu durante a secagem, porm a porcentagem de trans-bergamoteno, linalol e 1,8-cineol teve um aumento significativo. Os efeitos da secagem em estufa, secagem com congelamento e secagem em microondas, sobre a composio do leo essencial de tomilho (Thymus vulgaris L.) foram estudados por KOLLER e RAGHAVAN (1995). Houve diferena na concentrao de componentes do leo essencial para os trs mtodos utilizados principalmente em relao ao componente majoritrio, o timol. VENSKUTONIS et al. (1996) secaram tomilho (Thymus vulgaris L.), empregando dois mtodos: ar aquecido a 30 C, durante 25 horas, com velocidade mdia de 3,3 ms-1 sob a massa de plantas; e secagem seguida de congelamento por 40 horas. A reduo no contedo total de constituintes volteis aps a secagem foi de aproximadamente 1-3%, no sendo verificadas diferenas entre os dois mtodos de secagem. VENSKUTONIS (1997) estudou o efeito de secagem sobre os constituintes volteis de tomilho (Thymus vulgaris L.) e slvia (Salvia officinalis). Verificou-se uma reduo de 43 e 31% na quantidade total de compostos isolados de tomilho e slvia, respectivamente, quando submetidos secagem em estufa a 60 C, comparados planta fresca. A reduo dos compostos volteis, durante a

35 secagem, depende da volatilidade e estrutura qumica dos constituintes da planta, segundo o autor. Um estudo com temperatura do ar de secagem a 60 C, verificou a reduo de 3,4; 3 e 2 vezes nas quantidades de mirceno, limoleno e -pineno, respectivamente. Por outro lado, a concentrao de xido cariofileno permaneceu praticamente a mesma, e um componente no identificado apresentou um aumento de aproximadamente 38%. BALLADIN e HEADLEY (1999) estudaram folhas frescas de tomilho (Thymus vulgaris L.), com teor de gua inicial de 75% base mida, foram secas em estufa e em secador solar na mesma temperatura (50 C), at atingirem o teor de gua mdio de 12% base mida. Na anlise realizada por cromatografia de camada delgada, a colorao da mancha obtida das plantas submetidas secagem foi menos intensa que a da planta fresca, indicando perda de qualidade. Com o objetivo de avaliar o rendimento de leo essencial, RADNZ et al. (2002a) utilizaram 5 temperaturas (ar ambiente, ar aquecido a 40, 50, 60, 70 C) para a secagem de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham), comparando com a planta fresca. Para a amostra seca com ar ambiente observaram uma reduo de 8% no teor de leo essencial. Os tratamentos de secagem a 40, 50, 60 e 70 C no apresentaram diferenas significativas entre si e a planta fresca. Para os mesmos tratamentos acima descritos, na anlise qumica no foi verificada variao qualitativa significativa no percentual de timol e nem para -cimeno nos tratamentos estudados comparados planta fresca. Entretanto, para os valores de cariofileno verificaram um aumento significativo nos tratamentos de secagem com ar aquecido a 50, 60 e 70 C (RADNZ et al. 2002b). 2.2.6 Mtodos de Extrao e Anlise do leo Essencial Os processos de obteno de leos essenciais variam conforme a localizao do leo na planta. Os mtodos mais comuns so: enflorao; arraste direto por vapor dgua; hidrodestilao; extrao com solventes orgnicos; prensagem e extrao com fluidos supercrticos (GUENTHER, 1977; ROBBERS et al., 1997; SIMES et al., 2000).

36 A composio dos leos essenciais pode sofrer influncia de acordo com o mtodo de extrao utilizado, pois suas propriedades bioativas podem ser comprometidas. As caractersticas fsico-qumicas podem ser alteradas pelas condies operacionais empregadas na extrao, bem como seus efeitos teraputicos (ROBBERS et al., 1997). Graas ao avano da tecnologia, hoje dispe-se de mtodos que permitem extrair leos essenciais com um maior grau de pureza e concentrao, como o caso da extrao com fluidos supercrticos, que na indstria alimentcia utiliza gs carbnico na extrao, fazendo com que no haja resduos txicos. O mtodo de enflorao utilizado para extrao de leos essenciais de matrias-primas delicadas como ptalas de flores. As ptalas so depositadas, a temperatura ambiente, sobre uma camada de gordura, durante um determinado tempo. Em seguida as ptalas esgotadas so substitudas por novas at a saturao total, quando a gordura tratada com lcool. O lcool ento destilado a baixa temperatura, obtendo-se assim o leo essencial (SIMES et al., 2000). A prensagem utilizada para extrao de leo essencial de frutas ctricas, que encontrado nos tecidos perifricos, no caso nas cascas. Estas so prensadas e a camada que contm o leo essencial separada por decantao, centrifugao ou destilao fracionada (SIMES et al., 2000). A extrao com solventes orgnicos usada no mundo todo para obter maior rendimento ou produtos que no podem ser obtidos por nenhum outro processo. Geralmente so utilizados solventes apolares como o diclometano e ter, mas possuem o inconveniente de extrair composto lipoflicos alm dos leos volteis (GUENTHER, 1948). A extrao por fluidos supercrticos uma tcnica que utiliza o poder do solvente em temperatura e presso vizinhas ao ponto crtico. O solvente mais utilizado nesta tcnica o dixido de carbono (CO 2), devido ao seu baixo custo, temperatura crtica considerada baixa (31,1C) e a presso crtica facilmente alcanvel (72,85 atm), alm de ser um solvente inodoro, quimicamente inerte e sem risco ambiental. Esta tcnica vem sendo considerada uma das mais

37 promissoras para a rea da alimentao. A nica desvantagem que o processo demanda custos altos, dificultando a implantao da tcnica (LUQUE, 1994). Na extrao por arraste de vapor o material vegetal colocado em uma placa perfurada, a uma determinada distncia do fundo do extrator, evitando o contato com a gua em ebulio, submetido a uma corrente de vapor onde as misturas dos vapores de leo e de gua se condensam, sendo separadas pela diferena de densidade (GUENTHER, 1977). A hidrodestilao um mtodo antigo e verstil, sendo o mais usado comercialmente no Brasil. O material vegetal permanece em contato com a gua em ebulio, o vapor faz com que as paredes celulares se abram e o leo que est entre as clulas evapore junto com a gua que vai para o condensador, onde resfriado e separado por diferena de densidade. No caso das produes em pequena escala, emprega-se o aparelho de Clevenger. O leo essencial obtido, aps separar-se da gua, deve ser seco com sulfato de sdio (Na2SO4) anidro (SIMES et al., 2000). O mtodo mais utilizado para anlise do leo essencial a cromatografia a gs acoplada a espectrometria de massas, por ser mais preciso e eficiente (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 2002). A cromatografia um mtodo de separao que se baseia na migrao diferencial das substncias entre a fase mvel e a fase estacionria. A fase estacionria pode ser slida ou lquida, e a fase mvel pode ser lquida ou gasosa. A identificao dos compostos possvel atravs da comparao do tempo de reteno relativo da amostra com seus padres. A quantificao realizada atravs do mtodo de normalizao ou mtodo 100%, onde o valor total das reas de cada pico considerado 100%. A cromatografia a gs acoplada espectrometria de massas ir indicar a massa molecular e o padro de fragmentao (CIOLA, 1973). Segundo SIMES e SPITZER (1999) o espectrmetro ioniza as molculas, separa ons de acordo com a razo m/z (massa / carga) e fornece um histograma das abundncias relativas de ons individuais com diferentes razes massas / carga geradas por um composto em condies especificadas, porm os

38 dados de reteno linear devem ser considerados para aumentar a segurana na identificao. O ndice de reteno linear aplicvel para condies com gradiente de eluio e pode ser calculado pela seguinte equao (CIOLA, 1973): RIP = RI1 + (RI2 RI1) X (RTP RT1) / (RT2 RT1), onde: RI1= ndice de reteno do pico de referncia mais prximo eluindo antes de RTP. RT1= tempo de reteno do pico de referncia mais prximo eluindo antes de RTP. RI2 = ndice de reteno do pico de referncia mais prximo eluindo depois de RTP. RT2 = tempo de reteno do pico de referncia mais prximo eluindo depois de RTP. RTP = tempo de reteno do pico do qual se quer calcular o ndice de reteno. 2.2.7 Toxicidade O emprego dos leos essenciais bastante amplo. Contudo no se pode esquecer que algumas substncias podem causar efeito txico, que varia desde uma simples alergia at mesmo convulses, podendo agir como psicotrpicos (SIMES et al., 2000). Os leos essenciais, por serem produtos de extrao de uma espcie vegetal e, portanto, mais concentrados, apresentam toxicidade mais elevada que a da planta de origem. O grau da toxicidade depender da dose utilizada de leo essencial, em alguns casos baixas dosagens acarretam intoxicaes devido sensibilidade individual (SIMES et al., 1999). Segundo NEWALL et al. (2002), para o leo essencial de tomilho, no existem relatos de problemas causados durante a gestao ou lactao, desde que usado em doses moderadas. Tem reputao de afetar o ciclo menstrual, no devendo, portanto, ser ingerido em doses altas.

39 2.2.8 Tomilho O tomilho (Thymus vulgaris L.) uma planta da famlia Lamiaceae que compreende 150 gneros, com cerca de 2800 espcies distribudas em todo o mundo, sendo o maior centro de disperso a regio do Mediterrneo (FIGURA 04). Muitas das espcies introduzidas no Brasil so plantas medicinais e produtoras de leos essenciais, sendo utilizadas como condimentos ou como flores ornamentais. Dentre os gneros cultivados da famlia Lamiaceae destacamse vrias espcies usadas como condimentos, tais como: slvia (Salvia officinalis), manjerico (Ocimum basilicum), organo (Origanum vulgaris L.), manjerona (Origanum majorana L.), entre outras (PORTE e GODOY, 2001).

FIGURA 04 TOMILHO (Thymus vulgaris L.) FONTE: A autora (2007)

O cultivo do tomilho no demanda muitas exigncias, preferindo regies secas, ridas, expostas ao sol e solos arenosos, mas leves e possivelmente

40 calcricos; planta de solos pobres, rstica, evitando umidade e terras compactadas (CASTRO e CHEMALE, 1995). Entretanto, a hibridizao que ocorre facilmente entre as espcies de tomilho que tem proximidade geogrfica e com perodo de florao coincidente, conduz a uma variabilidade grande que pode afetar a homogeneidade e o rendimento do leo essencial, bem como a sua composio qumica. As populaes naturais so geralmente heterogneas, compostas de plantas de fentipos diferentes (ECHEVERRIGARAY et al., 2001). Propriedades farmacolgicas de diferentes extratos e dos leos essenciais do tomilho foram estudadas detalhadamente e trouxeram contribuies significativas para as indstrias (principalmente como aditivo de alimento) e aplicaes medicinais da planta. Alm de seus usos tradicionais numerosos, a planta e seu leo essencial encontraram diversas aplicaes na farmcia e na medicina. O leo essencial de tomilho possui atividades antimicrobianas (bactrias e fungos) carminativa e expectorante, atividades estas atribudas ao timol e ao carvacrol, componentes fenlicos do leo, sendo o timol o mais potente. As atividades antifngicas, pesticidas e antibacterianas do leo essencial de tomilho foram demonstradas por diversos investigadores como HIGES e LLORENTE, (1996), DAFERERA et al. (2000), KALEMBA e KUNICKA (2003) e BAGAMBOULA et al. (2004). Atividades espasmolticas bem como antioxidantes foram relatadas tambm para o extrato alcolico da planta (HUDAIB et al., 2002) Vrios estudos fotoqumicos investigaram a composio do leo essencial do Thymus vulgaris L. (FIGURA 05), de fontes e de gentipos diferentes, bem como a sua variao em estaes diferentes e durante o ciclo vegetativo da planta (ECHEVERRIGARAY et al., 2001 e HUDAIB et al., 2002). Avaliaes da composio do leo extrado de diferentes partes da planta ou ambientes variados, cultivo, e/ou condies de armazenamento tambm tm sido relatadas (VENSKUTONIS et al., 1996).

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FIGURA 05 - FRMULA ESTRUTURAL DE ALGUMAS SUBSTNCIAS PRESENTES NO LEO ESSENCIAL DO TOMILHO (Thymus vulgaris L.). FONTE: JORDN et al, 2003 e HUDAIB et al, 2002.

VENSKUTONIS (1997) estudou o efeito de secagem sobre os constituintes do tomilho (Thymus vulgaris L.) e da slvia (Salvia oficinalis L.). Foram analisadas amostras frescas, secas a 30 C, secas a 60C e congeladas aps a coleta. Dois mtodos foram aplicados, headspace dinmico, que utiliza vcuo para a extrao, e extrao por destilao em aparelho de LikensNickerson, que um processo que utiliza ao mesmo tempo a hidrodestilao e a extrao com solvente. O leo essencial obtido foi analisado por cromatografia e espectrometria de massas. No total, 68 compostos foram identificados no tomilho, sendo os principais constituintes o timol, seguido do p-cimeno, do -terpineno, do linalol e do carvacrol, tanto para as amostras frescas quanto para as demais amostras (secas e congeladas) havendo apenas variao nas concentraes. O rendimento e a composio dos extratos em diclorometano das folhas, das flores e das hastes do Thymus vulgaris L. que crescem no nordeste da Espanha foram estudados por GUILLN e MANZANOS (1998). O rendimento obtido das folhas e das flores muito mais elevado do que aquele obtido das hastes, sendo encontrados 4,0%, 2,6% e 0,5%, respectivamente. Os extratos obtidos das folhas e das flores foram analisados por CG e CG/EM. Os principais componentes encontrados nas folhas foram: 1,8 cineol, linalol, - pineno, canfeno, -pineno. Nas flores, os constituintes principais foram: linalol, elemol, nonacosano, e trans-cariofileno. Nas flores, os constituintes principais foram: linalol, elemol, nonacosano e trans-cariofileno. Nas hastes os componentes majoritrios foram: hexacosanal, nonacosano, -sitoesterol, sendo que nos trs tipos de amostras do timol e do carvacrol foram encontrado apenas traos.

42 HUDAIB et al. (2002), na Itlia, analisaram os leos essenciais das plantas do tomilho (Thymus vulgaris L.) atravs de cromatografia a gs CG/EM, baseada em colunas polares e apolares. A metodologia adotada foi usada para monitorar variaes sazonais na composio do leo obtido das plantas do tomilho colhidas em perodos diferentes do ciclo vegetativo. As plantas cultivadas com dois anos foram consideradas novas e as com cinco anos foram consideradas velhas. Foram avaliados os leos essenciais de quatro e duas coletas, respectivamente, efetuadas durante todo perodo do crescimento de maio/dezembro. O leo encontrado era rico em monoterpenos (timol e carvacrol) e em seus precursores correspondentes, hidrocarbonetos monoterpnicos (0,15% volume/massa de rendimento) foi caracterizado por (pcimeno e -terpineno). O leo da planta velha coletado no perodo de maio/junho nveis significativamente mais baixos de monoterpenos (principalmente -terpineno) e pelos nveis mais elevados dos monoterpenos oxigenados (linalol e borneol), de fenis do monoterpeno (principalmente timol) e de seus derivados (principalmente o metil ter carvacrol), de sesquiterpenos (principalmente - cariofileno) e de seus derivados oxigenados (por exemplo xido de cariofileno) em comparao com todas as amostras restantes. Uma presena caracterstica da cnfora e da timodihidroquinona foi observada tambm nos leos das plantas velhas. Nas plantas novas, coletadas em junho/julho, foi obtido o melhor rendimento de leo (1,2% volume / massa) com o mais elevado ndice de fenis do monoterpeno (timol: 51,2% e carvacrol: 4%). Este ltimo perodo do crescimento pode representar a melhor poca da colheita de plantas novas do tomilho a fim de se obter um leo essencial com qualidade e quantidade melhores. JORDN et al. (2006), estudaram clones de Thymus hyemalis e o Thymus vulgaris, na Espanha, onde foram monitoradas variaes sazonais na composio do leo essencial. Foram colhidas amostras em cinco estgios diferentes durante o ciclo vegetativo das plantas. O perfil temporrio das amostras do leo essencial foi determinado por anlises de CG/EM. Esta tcnica identificou 99 componentes para o Thymus hyemalis e 98 para o Thymus vulgaris. Para o leo essencial do Thymus vulgaris, os principais componentes quantificados foram

43 o 1,8 cineol, seguido pelo acetato de terpenila, borneol, linalol, -pineno, -

terpineol, e cnfora. Com respeito s concentraes dos componentes mais abundantes, o estgio vegetativo mdio parece ser o momento de colheita mais apropriado para esta espcie, pois o cineol, o borneol, os hidrocarbonetos monoterpnicos e a cnfora exibiram suas concentraes relativas mximas neste estgio. No contraste, o acetato de terpenila, o -terpineol e o linalol, provavelmente os componentes que so associados com o aroma fresco no leo, foram concentrados na maior parte no estgio de florao completa. As correlaes foram detectadas entre as concentraes dos componentes mais abundantes neste leo essencial. As concentraes de acetato de terpenila, cineol, sabineno e linalol variaram durante o ciclo vegetativo inteiro. Na Litunia, LOZIENE et al. (2003) estudaram 25 amostras de partes areas de Thymus pulegioides L., coletadas de 11 localidades daquele pas. A extrao do leo essencial foi efetuada por hidrodestilao e a composio do leo essencial foi analisada por cromatografia gasosa capilar e espectrometria de massas. Os principais constituintes encontrados foram: timol (0,2-26%), geraniol (0-31%), carvacrol (1,5-25%), p-cimeno (0,1-16%), -terpineno (traos-21,4%), cariofileno (5-14%). OZCAN e CHALCHAT (2004), na Turquia, extraram por hidrodestilao o leo essencial de partes areas de Thymus vulgaris L. e identificaram os componentes por cromatografia a gs e espectrometria de massas. Os componentes majoritrios encontrados foram: timol (46,2%), -terpineno (14,1%), p-cimeno (9,9%), linalol (4,0%), mirceno (3,5%), -pineno (3,0%) e -tujona(2,8%), com um rendimento de 1,57% (v/m). NICKAVAR et al. (2005), no Ir, estudaram duas espcies de tomilho. Os leos essenciais obtidos das partes areas do Thymus daenensis e do Thymus kotschyanus foram analisados usando o CG e o CG/EM. As duas espcies foram consideradas ricas em fenis e monoterpenos, especialmente timol e carvacrol. Vinte e seis compostos que representam 99,7% do leo essencial do T. daenensis foram identificados. Os principais compostos encontrados foram: timol (74,7%), p-cimeno (6,5%), -cariofoleno (3,8%) e metil

44 carvacrol (3,6%). Trinta componentes num total de 98,7% do leo essencial do Thymus kotschyanus foram identificados, sendo que os constituintes principais foram o timol (38,6%), o carvacrol (33,9%), o -terpineno (8,2%) e o p-cimeno (7,3%). Em Portugal a composio dos leos essenciais isolados de 24 populaes de Thymus caespititius coletados em Corvo, Flores, So Miguel e Terceira (Aores) e em Madeira foram estudados por CG e CG-EM. Os principais constituintes dessas amostras foram: carvacrol (41-65%), timol (35 - 51%) e terpineol (33-37%) (SANTOS et al., 2005). leo essencial de Thymus capitatus foi analisado na Tunsia atravs de quatro tcnicas: tcnica de acoplamento pirlise / cromatografia a gs / espectrometria de massa (Pir/CG/EM), cromatografia a gs com detector de ionizao de chama (CG/FID), cromatografia a gs acoplada espectrometria de massa (CG/EM) com ionizao de impacto de eltrons e cromatografia a gs acoplada espectrometria de massa de captura de eltrons (CG/EM/captura de eltrons). Nesse estudo, os autores concluram que a melhor resposta obtida foi atravs do mtodo de CG/EM, e os principais constituintes do leo essencial de Thymus capitatus foram o carvacrol (53,7%), seguido do -terpineno (11,6%) e do p-cimeno (10%). Neste trabalho no h referncia sobre o timol (HEDHILI et al., 2005). Na Frana, ROUATBI et al. (2007) usaram o vapor superaquecido para extrair compostos volteis das folhas do tomilho e das frutas da pimenta preta. O vapor e os volteis extrados foram coletados em um condensador e os leos essenciais foram separados da mistura coletada por solventes e analisados por CG. A temperatura ideal encontrada para manter a qualidade do leo essencial foi de 175C. Os constituintes majoritrios foram: timol (36,69%), p-cimeno (25,25%) e carvacrol (8,77%). O QUADRO 01 apresenta o resumo dos trabalhos citados, destacando os componentes majoritrios e de maior relevncia presentes nos leos essenciais de tomilho, estudados por diferentes tcnicas e tipos de planta, bem como o rendimento obtido.

45

AUTORES / PAS

RENDIMENTO

ESPCIE DE PLANTA

PARTES DA PLANTA

TCNICAS UTILIZADAS

% DE COMPOSTOS IDENTIFICADOS

JORDN et al. (2006), Espanha

-

T.vulgaris

Partes areas

Hidrodestilao / CG/EM

JORDN et al. (2006), Espanha HUDAIB et al. (2002), Itlia

-

T.hyemalis

Partes areas Partes areas

Hidrodestilao / CG/EM Hidrodestilao / CG/EM

NICKAVAR et al. (2005), Ir NICKAVAR et al. (2005), Ir SANTOS et al. (2005), Portugal

Planta velha 0,15% (v/m) Planta nova 1,2% (v/m) 2,4% (v/m)

T. vulgaris

1,8 cineol (29-36%) acetato de terpenila (1825%) borneol (4,3-4,6%) linalol (1,57-3,7%) -pineno (2,3-3,6%) -terpineol (2,4-3%) cnfora ( 1,7-2,1%) p-cimeno (30-41%) Timol (16-29%) -Terpineno (7-12%) Carvacrol (1-1,3%) Timol (19-54%) Carvacrol (1,4-2,6%) p-cimeno (11,6-21,5%) -terpineno (1,4-16,8%)

T. daenensis

Partes areas

Hidrodestilao / CG e CG/EM

Timol (74,7%) p-cimeno (6,5%) -cariofoleno (3,8%) Metil carvacrol (3,6%). Timol (38,6%) Carvacrol (33,9%) -terpineno (8,2%) p-cimeno (7,3%). Carvacrol (41-65%) Timol (35 - 51%) -terpineol (33-37%) 1,8 cineol Linalol - pineno Canfeno -pineno Linalol Elemol Nonacosano Trans-cariofileno hexacosanal Nonacosano -sisterol

1,2% (v/m)

T. kotschyanus

Partes areas

Hidrodestilao / CG e CG/EM

0,1 -1,2% (v/m) 4,0%

T. caespititius T. vulgaris

Partes areas Folhas

Hidrodestilao / CG e CG/EM Extrao em diclorometano / CG e CG/EM Extrao em diclorometano / CG e CG/EM Extrao em diclorometano / CG e CG/EM

GUILLN e MANZANOS (1998), Espanha

2,6%

T. vulgaris

Flores

0,5%

T. vulgaris

Hastes

Continua

46

ContinuaoAUTORES / PAS RENDIMENTO ESPCIE DE PLANTA PARTES DA PLANTA TCNICAS UTILIZADAS % DE COMPOSTOS IDENTIFICADOS

ROUATBI et al. (2007), Frana LOZIENE et al. (2003), Litunia

1,7%(v/ m)

No consta

Folhas

Vapor superaquecido / CG Hidrodestilao / CG e CG-EM

Timol (36,69%) p-cimeno (25,25%) Carvacrol (8,77%) Timol (0,2-26%) Geraniol (0-31%) Carvacrol (1,5-25%) -cimeno (0,1-16%) -terpineno (traos-21,4%) -cariofileno (5-14%). Timol (46,2%) -terpineno (14,1%) p-cimeno (9,9%) Linalol (4,0%) Mirceno (3,5%) -pineno (3,0%) -tujona (2,8%) Timol p-cimeno -terpineno Linalol Carvacrol

-

T. pulegioides

Partes areas

OZCAN e CHALCHAT (2004), Turquia

1,57% (v/m).

T. vulgaris

Partes areas

Hidrodestilao / CG e CG-EM

VENSKUTO NIS (1997),

-

T. vulgaris

Litunia

Partes areas

HEDHILI et T. Partes Carvacrol (53,7%) al. (2005), capitatus areas -terpineno (11,6%) Tunsia p-cimeno (10%) QUADRO 01 - RESUMO DE ARTIGOS DA REVISO BIBLIOGRFICA

headspace dinmico e destilao em aparelho de LikensNickerson / CG e CG-EM Hidrodestilao / CG e CG-EM

2.2.9 Utilizao dos Principais Compostos na Indstria Os principais compostos presentes no leo essencial de tomilho so o timol e o carvacrol. Os usos dessas substncias geralmente esto associados atividade antimicrobiana. No ano de 1992, o timol foi avaliado pelo Comit de Especialistas em Substncias Aromatizantes do Conselho Europeu. Desde ento permitida sua adio em alimentos at um nvel de 50 mg/kg e de 10 mg/kg em bebidas

47 (CARMONA, 2002). No Brasil no h referncia na legislao quanto ao uso dessa substncia em alimentos. O timol est presente em leos essenciais ctricos (0,03-0,1%) utilizados amplamente na indstria de bebidas refrescantes. Alm disso, possui uma atividade antioxidante comparvel do BHA (2,6-Bis-(1,1-dimetiletil)-4-metilfenol), e do BHT ((1,1-dimetiletil)-4-metoxifenol), antioxidantes de snteses empregados na alimentao e cujo uso cada vez mais discutido (CARMONA, 2002). Na Europa, o timol vem sendo usado como aditivo alimentar de ovinos e bovinos, devido ao fato de ser um componente natural da dieta. Portanto, os possveis resduos que possam ficar em carnes e derivados, aps um tratamento veterinrio, no so considerados txicos para o homem, uma vez que rapidamente metabolizado e eliminado quando ingerido. Por esse motivo o timol aparece classificado no Apndice II da regulamentao europia N 2377/90 e no tem um limite mximo de resduos estabelecido para sua presena em produtos derivados de produes pecurias (CARMONA, 2002). Os antioxidantes fenlicos de origem vegetal, categoria em que pode ser includo o timol, tm sido relacionados recentemente com a baixa mortalidade por problemas cardacos entre as pessoas que praticam dieta mediterrnea. O timol tem sido usado na medicina humana para o tratamento tpico de problemas dermatolgicos, para realizar inalaes em pessoas com problemas respiratrios e para o cuidado dos dentes (CARMONA, 2002). O timol ainda utilizado num produto chamado Apiguard, patenteado pela empresa Vita (Europe) Limited (Reino Unido), que utilizado nas colmias para combater o caro varoa. Esse produto apresenta-se na forma de gel, funciona como uma esponja e o tamanho da sua malha aumenta ou diminui em funo da temperatura ambiente. Quando a temperatura sobe, a volatilidade do timol aumenta e a malha do gel diminui, controlando assim a libertao do timol. O timol tambm est presente na formulao das pastilhas Angino-Rub, do Laboratrio Eurofarma, indicada para processos inflamatrios e dolorosos da boca e garganta. O anti-sptico bucal Listerine, marca da empresa Warner-

48 Lambert, uma mistura de componentes de leos essenciais como timol, mentol, eucaliptol (TORRES, 2000). Em 2003 na Espanha, foi patenteado um produto base de timol para ser diludo em gua potvel, para aliviar, curar ou prevenir doenas causadas pelo Clostridium sp, em particular o Clostridium perfringes, no trato intestinal de animais como aves e mamferos. Esse produto leva ainda em sua formulao guaiacol, eugenol e capsaicina. A Fundao Eroski, tambm espanhola, sugere que o timol e o carvacrol, presentes em leos essenciais de algumas plantas de uso medicinal e aromtico, poderiam ser empregadas na indstria alimentcia como antibacterianos. O carvacrol vem sendo estudado como antimicrobiano para a reduo da contagem de microorganismos viveis em kiwi e extenso da fase de latncia da flora microbiana natural em melo fresco cortado (SERRANO et al., 2005). Uma mistura de carvacrol, timol e eugenol (25L de cada um), foi adicionada em uma gordura estril e aplicada em embalagens termoseladas com dois tipos de filmes de permeabilidade diferentes contendo uva da variedade Aledo. Os resultados mostraram que as uvas com leos essenciais sofrem retardos significativos no processo de maturao e com menores perdas de firmeza, acidez e menor perda de cor. A contagem de aerbios mesfilos foram inferiores nas uvas tratadas, demonstrando que essa mistura de componentes garantiu a segurana do produto sem alterar a qualidade sensorial (VALVERDE et al., 2006).

49 3 MATERIAIS E MTODOS 3.1 MATERIAL BOTNICO Foram adquiridos no comrcio da cidade de Curitiba PR, dois quilos de tomilho (Thymus vulgaris L.) seco, sendo um lote de 1Kg em maro e outro em outubro de 2007 em estabelecimentos diferentes. Estes dois lotes eram constitudos somente de folhas. As amostras de planta fresca foram doadas pela CHAMEL Indstria e Comrcio de Produtos Naturais Ltda, localizada na cidade de Campo Largo - PR. Imediatamente aps a colheita as plantas foram divididas em dois grupos. No primeiro grupo, foram mantidas as hastes, o caule e as folhas, e no segundo trabalhou-se somente com as folhas. Em ambos os grupos as amostras foram homogeneizadas, pesadas e, em seguida, foi efetuada a extrao. A identificao botnica das plantas seca e fresca foi realizada atravs de comparao com exsicata depositada no Museu Botnico Municipal de Curitiba sob registro N 218653, efetuada pelo botnico responsvel Gerdt Gunther Hatschbach. 3.2 MTODOS DE EXTRAO APLICADOS NO TOMILHO Foram utilizados, neste trabalho, dois mtodos de extrao; a hidrodestilao e extrao em solvente orgnico que sero descritos a seguir. 3.2.1 Extrao por hidrodestilao Foram pesados em triplicata aproximadamente 100g de amostra de tomilho (Thymus vulgaris L.) e transferidos para um balo volumtrico ao qual adicionou-se 1 L de gua destilada. Acoplou-se ao balo o aparelho de Clevenger, (FIGURA 06) iniciando-se a hidrodestilao. A extrao foi efetuada nos tempos de uma, duas e trs horas e as amostras de leo essencial obtidas nos diferentes

50 tempos de extrao foram transferidas para tubos ependorf, levadas ao freezer por no mximo uma semana e posteriormente analisadas pela tcnica de cromatografia a gs para a quantificao e cromatografia a gs acoplada a espectrometria de massas, para a identificao dos constituintes.

FIGURA 06 SISTEMA DE HIDRODESTILAO FONTE: Autora (2007)

3.2.2 Extrao com solvente orgnico A extrao foi realizada em equipamento porttil para operaes com gases liquefeitos (FIGURA 07). O solvente utilizado no extrator foi o GLP, composto basicamente por propano, n-butano e isobutano (gs para isqueiro). Amostras de 10,0 gramas de material botnico foram utilizadas para cada extrao.

51

FIGURA 07 - EXTRATOR A GS FONTE: Autora (2008)

O equipamento porttil constitudo de duas partes: corpo A e corpo B (FIGURA 08). O corpo A, construdo em ao inoxidvel, possui em uma das extremidades uma vlvula (1) de alimentao do solvente (gs liqefeito), 2 conjuntos de telas (2 e 3), para evitar o entupimento da vlvula de alimentao do solvente e problemas de bloqueio e/ou entupimento das vlvulas posteriores contidas no corpo B (vlvulas 6 e 9): a vlvula entre os compartimentos de separao (6) e tambm a vlvula (9), que permite a transferncia do extrato para o frasco coletor. O corpo B constitudo de duas cmaras (C e D) com partes tubulares de vidro para visualizao da operao de separao das fases (aquosa e orgnica). O conjunto formado pelas cmaras C e D comunica-se com o exterior pela vlvula 9, possibilitando a transferncia do extrato para um frasco coletor (Fc), por uma agulha, sem contato do mesmo com o meio ambiente. A montagem do conjunto feita momentos antes do processo de extrao (aproximadamente 5

52 min). A estanqueidade do conjunto assegurada pelo uso de anis de elastmero de borracha nitrlica (4, 5, 7 e 8), colocados entre cada componente do extrator (tubos de vidro e vlvulas). As vlvulas, confeccionadas em teflon e ao inoxidvel, que em condio de repouso permanecem normalmente fechadas, so operadas pela compresso de um pequeno pino voltado para a parte externa da referida vlvula (P e P) (OLIVEIRA,1997 e CUNICO, 2003).

FIGURA 08 EQUIPAMENTO PORTTIL EXTRATOR PARA OPERAES COM GASES LIQEFEITOS FONTE: CUNICO et al., 2003

A obteno dos extratos vegetais ocorreu alimentando-se o corpo A do extrator com 10,00g de tomilho (Thymus Vulgaris L.). Em seguida, acoplou-se o corpo A ao corpo B, que j havia sido montado previamente. Colocou-se ento o extrator na posio vertical e atravs da vlvula superior (1) fez-se a alimentao com o Solvente (GLP), deixando o conjunto extrator permanecer na posio vertical agora, com a base que possui a vlvula de alimentao voltada para

53 baixo, por aproximadamente 30 minutos. Aps o tempo de contato entre o solvente e a amostra, deslocou-se o conjunto extrator, deixando-se a parte que contm a vlvula de alimentao (1) novamente voltada para cima, para que o extrato percolasse, passando aos compartimentos de vidro, pela simples compresso da vlvula (P). A transferncia do extrato no compartimento inferior para um frasco coletor deu-se por meio de uma agulha conectada base da vlvula (9) que, por compresso manual, permitiu a abertura e conseqente passagem do extrato. As amostras do extrato obtidas foram posteriormente analisadas para quantificao e identificao dos constituintes. 3.3 DETERMINAO DO RENDIMENTO DO LEO ESSENCIAL O rendimento do leo essencial foi expresso em % volume/massa, ou seja, volume (mL) de leo essencial por massa (g) de material vegetal seco (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1988; FABROWSKI, 2002). A secagem das amostras de 20g de massa verde foi feita em triplicata em estufa com circulao de ar a uma temperatura de 65C at massa constante (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2000). Aps o tempo de extrao pr-estabelecido, as amostras foram retiradas do aparelho de Clevenger, separando o leo essencial da fase aquosa, utilizando-se para tal micropipeta de preciso (100 1000 L) e medindo-se o volume. 3.4 CROMATOGRAFIA A GS O equipamento e as condies operacionais utilizadas para a quantificao dos componentes do leo essencial de tomilho foram as seguintes: Cromatogrfo gasoso Varian, modelo CP 3800 com detector FID (CG-FID) (FIGURA 09). Utilizou-se coluna capilar Chrompack de slica fundida CP-SIL 8 CB, 0,25mm de dimetro interno, 30m de comprimento e 0,25m de filme lquido. A

54 temperatura do injetor foi de 250C, split 1:200. A presso da coluna de 30psi e quantidade de amostra

injetada foi igual a 1,0 L. O gs de arraste utilizado foi o gs Hlio com a gs de make up ar sinttico, nitrognio e hidrognio. A temperatura do detector FID foi de 300C com programao de temperatura do forno a temperatura inicial de 60C e elevao de temperatura a 90C na razo de 3C por minuto, permanecendo por 5 minutos; elevao de temperatura a 140C na razo de 3C por minuto; elevao de temperatura a 240C na razo de 30C por minuto, permanecendo por 5 minutos.

FIGURA 09 CROMATGRAFO A GS VARIAN, MODELO CP 3800 COM DETECTOR FID FONTE: LACAUT- ets (2008)

3.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS As condies operacionais para aquisio do espectro de massas para a identificao dos constituintes do leo essencial de tomilho foram as seguintes: Cromatogrfo a gs acoplado a um detector de massas (CG-EM) Varian com on trap, modelo CP 3.800/Saturn 2000 (FIGURA 10). Utilizou-se coluna capilar Chrompack de slica fundida CP-SIL 8 CB, 0,25 cm de dimetro interno, 30m de comprimento e 0,25m de filme lquido. A temperatura do injetor foi de 250C, split 1:300. A quantidade de amostra injetada foi de 0,2 a 0,5L. O gs de arraste utilizado foi o gs Hlio, 1mL/min constante. A temperatura do transfer

55 line foi de 250C, a temperatura do manifold foi de 80C e a temperatura do on trap de 150C. A modulao axial de 4V. A intensidade da ionizao foi de 70 eV e o modo de ionizao utilizado foi por impacto de eltrons. A programao de temperatura do forno foi com temperatura inicial de 60C, elevao de temperatura a 90C na razo de 3C por minuto permanecendo por 5 minutos; elevao de temperatura a 140C na razo de 3C por minuto; elevao de temperatura a 240C na razo de 30C por minuto permanecendo por 5 minutos. Tempo total de corrida 40 minutos. O espectro de massas de cada um dos componentes do leo essencial de tomilho foi analisado e comparado aos espectros contidos no acervo das bibliotecas Saturn (CG-EM verso 5.51), NIST (98 MS, verso 1.7) e ADAMS, 1995.

FIGURA 10 CROMATGRAFO A GS ACOPLADO A UM DETECTOR DE MASSAS FONTE: LACAUT-ets (2008)

3.6 ANLISE ESTATSTICA A anlise dos dados obtidos foi efetuada atravs do Software R Development Core Team (2007), onde foi efetuada anlise de varincia ANOVA, para a comparao de mdias foi utilizado o probabilidade, sem transformao de dados, Teste de Tukey a 5% de utilizando o delineamento

56 inteiramente casualisado com trs repeties quatro diferentes amostras e com trs variaes de tempo.

4 RESULTADOS E DISCUSSES 4.1 UMIDADE Para facilitar as discusses as plantas sero nomeadas ao decorrer do trabalho da seguinte maneira: a planta fresca com as hastes, o caule e as folhas ser chamada de Fresca Haste e a planta fresca somente as folhas ser chamada de Fresca Folhas. A umidade das plantas secas 01 e 02 teve uma pequena variao, em torno de 1,64%, e a umidade das plantas frescas apresentou uma variao de 3,04%, conforme pode ser visto na TABELA 01.TABELA 01 PERCENTUAL DE UMIDADE MDIA POR TIPO DE AMOSTRA SECA 01 6,99 0,77 0,11 AMOSTRAS SECA FRESCA 02 HASTE 8,63 55,33 0,34 0,46 0,04 0,01 FRESCA FOLHAS 52,29 0,25 0,01

UMIDADE (%) DESVIO PADRO CV (%) FONTE: Autora (2008)

4.2 DETERMINAO DO RENDIMENTO DE LEO ESSENCIAL O rendimento do leo essencial de tomilho apresentado na TABELA 02 variou entre 1,04% (mL/100g, base seca) para 1 hora a 1,86% (mL/100g, base seca) para 3 horas na planta fresca haste. Este rendimento est de acordo com a ISO 6754:1996, que especifica a porcentagem mnima de leos volteis para o Thymus vulgaris L. em 1% (mL/100g, base seca). Usando as partes areas das plantas frescas de Thymus vulgaris L., HUDAIB et al. (2002) obtiveram um rendimento de 0,15% (v/m) para plantas velhas (5 anos), porm para plantas

57 novas (2 anos) foi de 1,2% (v/m). OZCAN e CHALCHAT (2004) obtiveram rendimento de 1,57% (v/m) sem mencionar a idade das plantas e nas mesmas condies de ensaio usadas neste trabalho. Na literatura ainda so citados alguns rendimentos, utilizando vapor superaquecido (ROUATBI et al., 2007), e extrao com diclorometano como solvente (GUILLN e MANZANOS, 1998), em folhas de tomilho, sendo obtidos rendimentos de 1,7% e 4%, respectivamente. Observa-se com esses resultados a importncia da indicao do tipo de extrao, da idade da planta e da quantidade de umidade, na obteno de maior teor de leo essencial do tomilho. Observou-se neste estudo que, no final do perodo de trs horas, a taxa de extrao do leo era muito pequena. Sendo assim, no foram testados tempos superiores, apesar do teste de Tukey revelar que o rendimento por horas difere estatisticamente ao nvel de 95% de significncia para as plantas secas e plantas frescas, conforme apresentado na TABELA 02. Este tempo mximo foi utilizado na literatura (OZCAN e CHALCHAT, 2004) e tambm levou-se em considerao a significativa reduo de custos, pois, ultrapassando este limite de horas, o gasto de gua e energia torna a extrao mais onerosa. Quanto ao rendimento por tipo de amostra, o teste de Tukey revelou que para uma hora de extrao, as planta secas 01 e 02 no diferiram estatisticamente ao nvel de 95% de significncia. Para trs horas, no houve diferena significativa entre a planta fresca haste e planta fresca folhas. Observase, ainda, que h diferena significativa entre as amostras secas 01 e 02 e as amostras fresca haste e fresca folhas, conforme revela o teste de Tukey com 95% de significncia. Avaliando estes dados, pode-se dizer que h indicao da influncia do processo de secagem sobre o rendimento do leo essencial, porm no foi objeto deste estudo conhecer e monitorar as condies de secagem (tempo, temperatura e umidade relativa) empregadas no processamento das amostras.TABELA 02 - RENDIMENTO MDIO POR TIPO DE AMOSTRA EM PORCENTAGEM VOLUME/MASSA TIPO DE AMOSTRA TEMPO 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS Seca 01 1,35cB 1,68bA 1,82aB

58Seca 02 Planta fresca haste Planta fresca folhas 1,38bB 1,04cC 1,52cA 1,42bB 1,32bC 1,68bA 1,58aC 1,86aA 1,78aB

* Letras minsculas iguais na horizontal no diferem significativamente quanto ao rendimento por hora pelo teste de Tukey, com 95% de significncia. * Letras maisculas iguais na vertical no diferem significativamente quanto ao rendimento por planta pelo teste de Tukey, com 95% de significncia. FONTE: Autora (2008)

4.3 IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPONENTES DOS LEOS ESSENCIAIS 4.3.1 Extrao por hidrodestilao Na extrao por hidrodestilao tanto para a planta seca quanto para a planta fresca, foram identificados trinta e trs compostos, sendo em sua maioria terpenos, lcoois e cetonas, como mostrado nas TABELAS 03 e 04 e detalhado no APNDICE 01. Dentre eles, dez compostos apresentaram somente traos: sabineno, ter metil carvacrol, carvotanacetona, eugenol, orto-metoxi-alfa-alfadimetil-benzil-alcool, -cadineno, -cadineno, miristicina, espatulenol, -Muurolol, -cadinol. 4.3.1.1 Planta seca Os compostos majoritrios identificados para a planta seca foram o borneol (32,12 a 35,14%), seguido do carvacrol (15,24 a 20,62%) e do -terpineol (10,51 a 12,33%). Percebe-se que o borneol, apesar de apresentar maior concentrao na planta seca 01 e 02 quando a extrao foi de uma hora (35,14% e 33,74%), no diferiu estatisticamente ao nvel de 95% de significncia com 2 e 3 horas de extrao, conforme revelou o teste de Tukey. A tabela mostra ainda a comparao entre o ndice de reteno calculado e o ndice de reteno encontrado na literatura, o que permite uma maior confiana nos resultados, a diferena entre os ndices de reteno pode ser atribuda a vrios fatores, como a

59 diferena entre equipamentos e a coluna utilizada. Devido a esses fatores, aceitase a proximidade entre os valores obtidos experimentalmente e da literatura.

TABELA 03 - IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO EXTRADOS POR HIDRODESTILAO PLANTA SECA IR IRL COMPOSTO TIPO DE AMOSTRA/ TEMPO DE EXTRAO / % DE COMPOSTOS Planta Seca 01 Planta Seca 021 hora 2 horas 3 horas 1 hora 2 horas 3 horas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

918 928 944 967 973 984 1014 1021 1025 1027 1029 1054 1083 1099 1141 1167 1175 1194

926 939 953 976 980 991 1018 1026 1031 1031 1033 1062 1088 1098 1143 1165 1177 1189 1233 1244 1246 1285 1290 1298 1356 1404 * 1513 1524

19 1227 20 1239 21 1245 22 23 24 25 1283 1293 1301 1354

Tricicleno -pineno Canfeno Sabineno -pineno Mirceno -Terpineno p-Cimeno Limoneno -felandreno Eucaliptol -Terpineno Terpinoleno Linalol Cnfora Borneol Terpin-4-ol -Terpineol Formato de Isobornila Eter Metil Carvacrol Carvotanacetona Acetato de Bornila Timol Carvacrol Eugenol Cariofileno Orto-metoxi-alfaalfa-dimetil-benzilalcool -Cadineno -Cadineno

0,36 1,36 2,69 Tr 0,31 0,14 0,21 0,97 0,28 0,05 0,05 0,89 0,11 1,97 0,52 35,14 1,47 12,33 0,20 Tr Tr 1,59 8,37 20,62 Tr 1,87 Tr Tr Tr

0,12 1,56 3,10 Tr 0,36 0,16 0,25 1,15 0,33 0,05 0,06 1,04 0,13 2,10 0,51 35,01 1,47 12,17 0,19 Tr Tr 1,53 7,81 19,59 Tr 2,14 Tr Tr Tr

0,15 1,98 3,74 Tr 0,42 0,19 0,29 1,28 0,38 0,06 0,07 0,17 0,15 1,98 0,52 33,05 1,39 11,90 0,19 Tr Tr 1,42 7,88 18,99 Tr 2,49 Tr Tr Tr

0,14 3,06 5,49 Tr 0,62 0,25 0,36 2,13 0,47 0,07 0,07 1,42 0,12 2,21 0,58 33,74 1,51 10,51 0,06 Tr Tr 1,46 6,88 15,24 Tr 3,30 Tr Tr Tr

0,15 3,35 5,93 Tr 0,63 0,25 0,34 2,30 0,47 0,08 0,07 1,39 0,17 2,01 0,54 32,62 1,44 11,18 0,01 Tr Tr 0,55 7,35 16,39 Tr 2,45 Tr Tr Tr

0,11 2,27 4,08 Tr 0,45 0,19 0,27 2,08 0,36 0,06 0,08 1,07 0,09 1,88 0,51 32,12 1,32 11,53 0,01 Tr Tr 0,84 8,45 18,62 Tr 2,14 Tr Tr Tr

26 1413 27 1441 28 1512 29 1517

6030 31 32 33 1521 1578 1644 1657 1520 1576 1645 1653 Miristicina Espatulenol -Muurolol -Cadinol Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr

** O teste de Tukey no apresentou diferena significativa ao nvel de 95% de significncia na concentrao dos compostos entre 1, 2 e 3 horas. NOTA: IR ndice de reteno; IRL ndice de Reteno de Literatura Tr Traos, concentrao < 0,001; * - ndice de reteno no encontrado na literatura pesquisada. FONTE: Autora (2008)

A quantidade de borneol nas amostras de plantas seca 01 e 02 variou de 32,0 a 35,0%. Estudo com plantas secas foi realizado por VENKUSTONIS (1997), utilizando para secagem uma temperatura de 60C e foi encontrada porcentagem de borneol de 1,2%. Esta diferena pode ser atribuda ao quimiotipo da plantas, bem como as condies de cultivo utilizadas. A concentrao de carvacrol (15,24 a 20,62%) encontrada neste trabalho foi superior em relao ao estudo do VENSKUTONIS (1997), que encontrou 3% deste composto. A concentrao encontrada de -terpineol (11,18 a 12,33 %) nas plantas seca 01 e seca 02 no foi mencionada em outros trabalhos pesquisados. O timol apresentou uma concentrao de 6,88 a 8,45%, estando abaixo da encontrada por VENSKUTONIS (1997), que foi de 48%. Observou-se que a concentrao de cada constituinte se manteve estvel durante as trs horas de extrao, isso significa que o critrio de composio qumica no influencia na deciso tcnica de escolha da durao da extrao. O mesmo no se pode dizer com relao ao rendimento, pois com o passar do tempo, ocorreu um aumento significativo na quantidade de leo essencial extrado. Variaes de concentrao podem ser consideradas normais devido a condies diferenciadas de cultivo, local de armazenamento e processamento das plantas. No entanto, as amostras de tomilho, apesar de obtidas em diferentes pocas do ano e de diferentes procedncias, tiveram um comportamento similar em relao concentrao dos componentes. 4.3.1.2 Planta fresca

61

Nas plantas frescas (haste e folhas) os compostos majoritrios foram o timol, com 54 a 57,5% de concentrao para fresca haste, e 50 a 55% de concentrao para fresca folhas, seguido pelo p-cimeno com 12 a 15%, para fresca haste e 17 a 21% para fresca folhas. O -terpineno teve uma concentrao de 6 a 7% para a planta fresca haste, e de 5 a 7% para planta fresca folhas, como demonstrado na TABELA 04.TABELA 04 - IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DOS COMPOSTOS DO LEO ESSENCIAL DE TOMILHO EXTRADOS POR HIDRODESTILAO DA PLANTA FRESCA IR IRL COMPOSTO TIPO DE AMOSTRA / TEMPO DE EXTRAO / % DE COMPOSTOS Fresca haste Fresca Folhas1 hora 2 horas 3 horas 1 hora 2 horas 3 horas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

918 928 944 967 973 984 1014 1021 1025 1027 1029 1054 1083 1099 1141 1167 1175 1194 1227 1239 1245 1283 1293 1301 1354 1413 1441 1512 1517 1521 1578

926 939 953 976 980 991 1018 1026 1031 1031 1033 1062 1088 1098 1143 1165 1177 1189 1233 1244 1246 1285 1290 1298 1356 1404 * 1513 1524 1520 1576

Tricicleno -pineno Canfeno Sabineno -pineno Mirceno -Terpineno p-Cimeno Limoneno -felandreno Eucaliptol -Terpineno Terpinoleno Linalol Cnfora Borneol Terpin-4-ol -Terpineol Formato de Isobornila Eter Metil Carvacrol Carvotanacetona Acetato de Bornila Timol Carvacrol Eugenol Cariofileno Orto-metoxi-alfa-alfadimetil-benzil-alcool -Cadineno -Cadineno Miristicina Espatulenol

0,93 0,64 0,63 Tr 0,80 1,23 0,45 15,49 0,31 0,10 0,50 6,90 0,01 1,80 0,66 1,74 0,55 0,27 0,15 Tr Tr 0,37 54,89 3,18 Tr 1,05 Tr Tr Tr Tr Tr

0,85 0,49 0,43 Tr 0,88 1,09 0,51 12,86 0,28 0,13 0,42 7,20 0,02 1,74 0,46 1,59 0,60 0,20 0,58 Tr Tr 0,44 57,58 3,43 Tr 1,46 Tr Tr Tr Tr Tr

0,39 0,25 0,28 Tr 1,00 0,79 0,46 13,92 0,16 0,14 0,34 6,20 0,03 2,06 0,55 1,97 0,64 0,23 1,22 Tr Tr 0,41 55,33 3,41 Tr 1,90 Tr Tr Tr Tr Tr

0,69 0,53 0,65 Tr 1,00 1,00 5,64 18,60 0,29 0,08 0,60 5,64 0,03 2,96 0,57 2,86 0,56 0,32 0,18 Tr Tr 0,47 50,43 3,54 Tr 0,89 Tr Tr Tr Tr Tr

0,83 0,51 0,76 Tr 1,48 1,45 6,78 21,17 0,37 0,36 0,81 7,17 0,09 4,10 0,69 3,40 0,56 0,42 0,35 Tr Tr 0,51 55,25 4,01 Tr 0,88 Tr Tr Tr Tr Tr

0,43 0,27 0,58 Tr 0,92 0,54 5,77 17,92 0,22 0,21 0,49 5,71 0,05 2,42 0,35 2,17 0,32 0,17 0,26 Tr Tr 0,29 52,67 2,35 Tr 0,36 Tr Tr Tr Tr Tr

6232 33 1644 1657 1645 1653 -Muurolol -Cadinol Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr

** O teste de Tukey no apresentou diferena significativa ao nvel de 95% de significncia na concentrao dos compostos entre 1, 2 e 3 horas. NOTA: IR ndice de reteno; IRL ndice de Reteno de Literatura; Tr Traos, concentrao < 0,001; * - ndice de reteno no encontrado na literatura pesquisada. FONTE: Autora (2008)

O teste de Tukey revelou que no h diferena significativa ao nvel de 95% de significncia na concentrao dos componentes do leo essencial de tomilho extrado por hidrodestilao em plantas frescas quando se extraiu somente das folhas ou quando foi extrado da planta toda. A TABELA 04 mostra ainda que a maior concentrao de timol obtida foi de 57,5% para duas horas de extrao para planta fresca haste. Portanto, a melhor qualidade obtida da planta fresca haste, no havendo a necessidade de separao das folhas. O timol considerado o principal componente do tomilho. Para a indstria, quanto maior a concentrao deste composto, maior ser a qualidade e o valor do leo essencial. Na literatura, utilizando as mesmas condies de extrao e anlise, existem relatos de concentraes mximas de timol entre 31,5% a 54% (HUDAIB et al., 2002 e ATTI-SANTOS et al. 2004). A concentrao de timol (57%) encontrada est de acordo com a literatura citada e pode-se dizer que o leo