PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE

ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2003

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE

ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.

Orientador: Prof. José Frederico Straggiotti Silva

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO – 2003

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE

ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.

Aprovada em 27 de março de 2003. Comissão Examinadora: _______________________________________________________ Prof. Claudio Andrés Retamal Martínez(DS. Biociência e Biotecnologia) - UENF _______________________________________________________ Prof. Clóvis José Pascarelli Souza (DS. Reprodução Animal) - FIOCRUZ _______________________________________________________ Prof. Marcos Fernando de Resende Matta (DS. Imunologia Veterinária) - UENF _______________________________________________________ Prof. José Frederico Straggiotti Silva (DS. Reprodução Animal) – UENF

(Orientador)

ii

“Wo ein Willen ist, gibt’s immer einen Weg”

“Onde existe um querer, sempre há um caminho”

Autor desconhecido

iii

Aos meus pais, pela educação desde meu primeiro dia de vida até hoje e,

também, pelo amor, carinho, dedicação e companheirismo.

Aos meus irmãos, William e Marden, pela força em todos os momentos de

nosso dia-a-dia.

À minha namorada, Rachel, pela sua imensa dedicação, compreensão, amor

e carinho em todos os momentos e a seus familiares, pela total atenção e carinho.

DEDICO

iv

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) pelo oferecimento deste curso.

À CAPES pela concessão de bolsa de estudo, pois sem ela seria impossível

permanecer nesta cidade.

A todos os meus familiares e amigos pelos incentivos e pelos momentos

compartilhados.

Ao meu super-amigo Bruno Fagundes, pela sua amizade fraterna, desde o

início de nossa difícil caminhada pela graduação e mestrado, mostrando-se presente

em todos os momentos, sem medir esforços para ajudar e pela sua grandiosa

colaboração na execução do presente estudo.

Ao Maurício Fraga van Tilburg, por sua amizade, incentivos e idéias para

serem empregadas na realização deste trabalho.

À Cláudia Gomes Fernandes Matta, por sua dedicação e amizade e aos

demais amigos da Pós-Graduação e do laboratório que colaboraram com idéias e

sugestões.

Aos técnicos do LMGA, Thiago, Bruna, Juliana, Vânia e Diogo pelos auxílios

nos trabalhos desenvolvidos, pela organização e manutenção de equipamentos do

laboratório.

Ao Setor de Reprodução do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual

(LBCT), ao Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA) Setor de Microbiologia e

v

ao Laboratório de Bioquímica e Funções de Proteínas e Peptídeos (LQFPP), por

disponibilizar equipamentos e espaço físico para execução de parte deste trabalho.

Ao professor Claudio Andrés Retamal Martínez, pela orientação na parte de

proteínas de membrana, mostrando-se incansável em ajudar.

Ao professor Marcos Fernando de Resende Matta, pela confiança depositada

em mim para desenvolver este trabalho de tão grandiosa magnitude científica.

Ao orientador e professor José Frederico Straggiotti Silva, principalmente pela

amizade e confiança, pela orientação neste trabalho de forma integral e incansável,

por me fazer um pesquisador dando estímulos, sugestões e apresentando algumas

dificuldades para desenvolver a capacidade de pensar.

Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

A Deus, por ter me dado forças para finalizar este trabalho e por sempre estar

presente para que eu superasse os obstáculos encontrados nessa minha

caminhada.

vi

BIOGRAFIA

GUILHERME VALENTE DE SOUZA, filho de Telmo Marden de Souza e Anna

Maria Valente de Souza, nasceu em 21 de junho de 1977, na cidade de Rio Bonito –

RJ.

Em março de 1996, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, onde se

formou em março de 2001.

Em março de 2001, deu início ao Curso de Pós-Graduação em Produção

Animal, ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, da Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ,

submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em março de 2003.

vii

RESUMO

Souza, Guilherme Valente; Msc; Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro; março/2003; Produção de anticorpos monoclonais contra proteínas sexo-específicas de membrana de espermatozóides de eqüino; Professor orientador: José Frederico Straggiotti Silva. Professor conselheiro: Marcos Fernando de Resende Matta.

A produção de anticorpos monoclonais contra proteínas sexo-específicas de

membrana de espermatozóides de eqüino foi realizada utilizando-se proteínas

purificadas de géis de eletroforese, cujas proteínas apresentam peso molecular em

torno de 19 e 21 quilodaltons (kDa). Foram produzidos 25 clones, dos quais apenas

17 cresceram e somente 3 apresentaram-se positivos contra as proteínas utilizadas

na confecção dos anticorpos monoclonais, sendo 2 clones para a proteína de 19

kDa e 1 para a proteína de 21 kDa. Neste trabalho, verificou-se a baixa

antigenicidade das proteínas sexo-específicas de membrana de espermatozóides de

eqüino e também verificou-se a grande dificuldade da produção de monoclonais a

partir de proteínas de membrana de leucócitos contra as proteínas sexo-específicas

de membrana de espermatozóides de eqüino.

Palavras-chave: Eqüino, espermatozóides, proteína sexo-específica,

monoclonal, antígeno HY

viii

ABSTRACT

The production of monoclonal antibody against sex-specific protein of equine

sperm membrane was developed using purified proteins of one-dimensional

poliacrylamide gel electrophoresis, which proteins has a molecular weight around 19

and 21 kDa. Twenty-five clones were produced, from them only 17 had developed

and just 3 had shown positive against the proteins used to make the monoclonal

antibodies, from the 3 clones 2 were against the protein 19 kDa and 1 was against

the protein 21 kDa. In this work, it was observed low antigenicity of sex-specific

proteins of equine sperm membrane and it was also observed great difficulty to

develop monoclonal antibodies from leucocyte membrane against sex-specific

proteins of equine sperm membrane.

Keywords: Equine, sperm, sex-specific protein, monoclonal, HY antigen

ix

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 01

2 REVISÃO DE LITERATURA 05

2.1 Sêmen 05

2.2 Plasma Seminal 08

2.3 Aspectos gerais sobre a determinação do sexo e o antígeno HY 09

2.4 Produção de anticorpos monoclonais 12

3 MATERIAL E METODO 15

3.1 Obtenção do material biológico 15

3.1.1 Leucócitos 15

3.1.2 Sêmen 16

3.2 Preparação do material biológico para inoculação 16

3.2.1 Extração de proteínas dos leucócitos 16

3.2.2 Espermatozóides íntegros 16

3.2.3 Extração de proteínas dos espermatozóides 17

3.3 Determinação da concentração das proteínas 17

3.4 Eletroforese monodimensional das proteínas de membranas celulares 17

3.5 Análise do gel de eletroforese 18

3.6 Extração das proteínas dos géis de poliacrilamida 18

3.7 Imunização dos animais 19

3.8 Western Blotting 20

3.9 Produção de anticorpos policlonais 20

x

3.10 Teste de ELISA 21

3.11 Obtenção dos macrófagos peritoniais 22

3.12 Fusão 22

3.13 Testes dos clones 24

4 RESULTADOS 25

4.1 Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do gel 25

4.2 Extração, purificação e quantificação das proteínas sexo-específica 28

4.3 Produção dos anticorpos monoclonais contra as proteínas sexo-

específicas de leucócitos

28

4.4 Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do

western-blotting

29

4.5 Imunização dos camundongos 31

4.6 Fusão (Produção dos anticorpos monoclonais) 32

4.7 Teste dos anticorpos monoclonais 32

5 DISCUSSÃO 34

6 CONCLUSÕES 37

7 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 38

APÊNDICES 44

1

1. INTRODUÇÃO

Historicamente, a pré-determinação do sexo sempre despertou interesse. A

antigüidade desse tema é demonstrada no Talmudic ao se referir aos métodos de

coito na pré-seleção do sexo, embora a interpretação permaneça obscura

(ROSNER, 1979). A possibilidade da escolha do sexo também foi considerada pelos

gregos no século V. Apesar deles acreditarem que forças sobrenaturais

determinavam o sexo fetal, infanticídio seletivo foi usado em crianças a fim de

eliminar características indesejáveis, incluindo sexo inapropriado [Cyrus the Great

(Heredotus, Book I) and Oedipus apud WINDSOR et. al., 1993]. Como alternativa, os

pais tinham acesso a um número de seleção do sexo no pré-natal (revisado por

LEVIN, 1987).

Hipócrates, por exemplo, propôs que machos desenvolviam-se mais no lado

direito do útero e fêmeas no lado esquerdo. Acreditava-se que práticas sexuais

apropriadas asseguravam a deposição do sêmen na porção correta do trato genital

feminino, seguindo-se o desenvolvimento do feto do sexo desejado.

Alternativamente, ligação ou, em casos extremos, remoção do testículo direito

(crendo nascer macho) ou do testículo esquerdo (crendo nascer fêmea) resultaria na

ejaculação do espermatozóide desejado. Outras técnicas baseadas em fatores como

o alinhamento geográfico da cama nupcial, remoção ou retenção de calçados antes

da atividade sexual. Mesmo Aristóteles acreditava que o sêmen era o fator

controlador do próprio desenvolvimento fetal, atribuindo a determinação do sexo à

relativa atividade dos pais durante o coito. Os métodos folclóricos foram mantidos no

2

século XX, e são encontradas na literatura, como exemplo, variedade na ingestão de

dietas, técnicas sexuais e cirúrgicas.

Os métodos sexuais para a determinação do sexo tornaram-se menos

empíricos devido à suposição de evidências de que o sexo era determinado não

pela herança, porém por efeitos combinados de condições externas (WILSON, 1896

citado por FARLEY, 1982). Esta suposição foi contraposta pela observação da

genética mendeliana, a qual mostrou a presença de um possível mecanismo de

herança do sexo no momento da fertilização, sendo a eventual determinação do

sexo realizada pelo complemento cromossomal do espermatozóide fertilizante

(revisado por FARLEY, 1982). O reconhecimento do fato de que, em mamíferos, a

fertilização por espermatozóide contendo o cromossomo “X” produzirá fêmea e

espermatozóide contendo o cromossomo “Y” produzirá macho foi resultado da

maioria dos ensaios científicos do século XX, onde a seleção do sexo pré-fertilização

envolve alterações na taxa da população de espermatozóides X/Y, in vitro, antes da

inseminação artificial ou no trato reprodutivo da fêmea.

O progresso para a sexagem de espermatozóides humanos foi alavancado

como método para reduzir a incidência de alterações genéticas ligadas ao sexo. Os

métodos empregados em tecnologias de criação artificial e a demanda por um

sistema de produção agropecuária mais eficiente têm, entretanto, evidenciado um

aumento de interesse para a determinação do sexo da prole dos animais

domésticos. A separação dos espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y”,

no homem e nos animais, foi o principal assunto das revisões (CORSON et al., 1984;

GARNER, 1984; LEVIN, 1987; GLEDHILL, 1988; AMANN, 1989; JOHNSON, 1992) e

um levantamento bibliográfico paralelamente aos periódicos 1981-86 (MCKENZIE,

1987).

O estudo da sexagem dos espermatozóides para a pré-seleção do sexo está

gerando, cada vez mais, um grande interesse tanto na comunidade científica quanto

nos criadores. Este interesse continua devido ao impacto econômico que pode

apresentar sobre a produção de animais (GARNER, 1984; SHAMBACHER, 1975).

Um método imunológico para a separação dos espermatozóides está

baseado na expressão dos genes dos cromossomos “X” e “Y”, de tal forma que o

produto de um desses genes está presente sobre a membrana plasmática dos

espermatozóides (OHNO, 1982).

3

O antígeno HY é controlado pelo gene do cromossomo “Y”, que está expresso

sobre todas as células de machos normais de mamíferos, exceto em eritrócitos e

células germinativas pré-meióticas (MÜLLER, 1981; WACHTEL, 1983).

Diferentes métodos têm sido aplicados para a separação dos

espermatozóides portadores do cromossomo “X” e “Y”. Entre os métodos de

separação são citados a centrifugação, diferença de carga elétrica da superfície

celular, uso de anticorpos, quantificação do DNA por marcação fluorescente e

característica da motilidade (ALI et al., 1990).

De acordo com JOHNSON et al. (1987), o aumento de uma das duas

populações de espermatozóides portadores do cromossomo “X” ou “Y” deverá elevar

o ganho genético e aumentar a eficiência da produção animal. MOREL et al. (1988)

mostraram que produtores de gado estarão sob pressão para otimizar suas criações

e uma técnica para pré-selecionar o sexo poderia ajudar na redução do número de

macho ou fêmea, aumentando a progênie do sexo desejado.

A identificação de proteína sexo-específica na membrana plasmática para

ambos os espermatozóides “X” e “Y” pode gerar grandes oportunidades para a

escolha do sexo (HENDRIKSEN, 1999). Ela pode permitir o desenvolvimento de um

ou mais anticorpos antiproteína “X” ou antiproteína “Y”, viabilizando a separação

através de técnicas imunológicas. A citometria de fluxo consegue separar os

espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y” com alta fidelidade, entretanto,

esse método requer equipamentos caros e, tanto o tempo, quanto o número de

espermatozóides separados por dia é limitado. Métodos imunológicos simples e com

equipamentos de baixo custo podem ser aplicados, possibilitando uma separação

dos espermatozóides em larga escala, evitando o uso de corantes de DNA e

excitação por raio lazer, com possível efeito negativo no espermatozóide e na

viabilidade do embrião precoce (MCNUTT et al., 1996).

MATTA (2001) desenvolveu uma tecnologia capaz de separar as duas

populações de espermatozóides utilizando anticorpos monoclonais, onde a base

científica está na diferença da expressão de proteínas na superfície de

espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y”. Esta metodologia consiste na

utilização de anticorpos monoclonais contra proteína sexo-específica (HY) associada

à via clássica do sistema complemento, onde o anticorpo utilizado destrói somente

os espermatozóides do sexo indesejado, tornando-se esta metodologia rápida, não

4

invasiva e de baixo custo. Essa tecnologia promoveu a sexagem de 81% de 367

embriões analisados por PCR na INFIGEM - EUA. (Matta, 2001).

O objetivo geral deste trabalho é o de gerar condições para o

desenvolvimento de uma metodologia eficiente e simples, pela utilização de

anticorpo monoclonal, para separação de espermatozóides eqüinos com

funcionalidade para fecundação.

Os objetivos específicos deste trabalho são: 1) determinar a proteína sexo-

específica; 2) produzir anticorpos monoclonais contra a proteína sexo-específica.

5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Sêmen

A fertilidade poderá estar reduzida se o espermatozóide ou outro constituinte

essencial para a sobrevivência das células espermáticas ou fertilização promover

uma resposta imunológica efetiva. O trato genital da fêmea é completamente capaz

de produzir uma resposta imune e destruir antigenicamente corpos estranhos.

Sêmen e, em particular, espermatozóides podem, por alguma razão, falhar de serem

antigênicos ou, pelo menos, serem fortes o suficiente para iniciarem uma resposta

antigênica. Entretanto, isto parece ser improvável, já que existem precedentes, isto

é, alguns tecidos no organismo não apresentam antígenos de histocompatibilidade

e, portanto, não são rejeitados após a halotransplantação. Exemplo disso são os

eritrócitos humanos. Na transfusão sanguínea, as células sanguíneas vermelhas são

aceitas pelo receptor mesmo quando outros tecidos do mesmo doador venham a ser

rejeitados. O espermatozóide, uma célula especial também noutros aspectos, pode

de maneira não convencional, falhar em expressar qualquer antígeno de

histocompatibilidade de superfície. De fato, tem sido demonstrado repetidamente

não ser o caso (HOGARTH, 1982).

Inoculações de células espermáticas de várias espécies no coelho provocam

a produção de anticorpos que podem ser verificados a partir da aglutinação de

espermatozóides in vitro ou outros efeitos que indicam a presença de

6

imunoglobulinas específicas antiespermatozóides (EDIDIN e JOHNSON, 1977;

COHEN e HENDRY, 1978).

Os antígenos que provocam estas respostas devem ser xenoantígenos

característicos das espécies das quais os espermatozóides foram obtidos. Antígenos

de espermatozóides que produzem resposta imune apenas em outras espécies,

como os xenoantígenos, são bastante irrelevantes ao sistema imunológico

reprodutivo normal. Apenas substâncias comuns dentro da espécie, mas diferentes

entre os diferentes indivíduos da mesma espécie podem provocar uma resposta

imune como resultado da cobertura, que, conseqüentemente, afetará de forma

adversa a fertilidade. A questão não é, portanto, se os espermatozóides contêm

substâncias que provam ser antigênicas, mas se eles possuem haloantígenos ou

autoantígenos.

Pesquisas adicionais revelam que a situação é consideravelmente complexa.

Os espermatozóides humanos possuem uma carga mista que inclui antígenos do

principal grupo sanguíneo e do sistema de histocompatibilidade.

A pele de camundongos machos deve ser rejeitada por fêmeas de mesma

linhagem genética, onde o transplante entre machos, entre fêmeas, ou de fêmeas

para machos são reconhecidos e aceitos. Isto é devido ao transplante de antígeno

associado com o domínio do cromossomo “Y”, conhecido com antígeno HY. O

antígeno HY tem uma função crucial na determinação primária do sexo. Somente

quando exposto dentro de uma uniformidade genética de uma linhagem altamente

congênita verificou-se a ocorrência de uma discrepância somente no lócus HY, que

vem a ser responsável pela rejeição de transplante (AUSTIN e SHORT, 1972;

HOGARTH, 1978).

O antígeno HY em camundongo é quase totalmente restrito na capa

acrossomal. Este está presente em quantidades variáveis sobre o espermatozóide

do ejaculado, e cerca de 20 a 40 % dos espermatozóides não possuem

praticamente este antígeno. Como somente metade dos espermatozóides do

ejaculado possuem o cromossomo “Y”, isso sugere a expressão pós-meiótica do

genoma, assim como também um método potencial de pré-determinação do sexo da

prole, utilizando antígenos HY do espermatozóide como a base de separação

espermática na produção de machos e fêmeas (HOGARTH, 1982).

Os antígenos do grupo sanguíneo e antígenos do sistema de

histocompatibilidade, os quais os espermatozóides têm em comum com as células

7

somáticas, são também uma classe de antígenos espermatozóide-específicos,

próprios do espermatozóide ou de seus precursores imediatos, isto é, das células

germinativas. Estes auto-antígenos são potencialmente capazes de induzir uma

resposta imune no corpo do macho nos quais são produzidos, por outro lado,

componentes do testículo são estranhos para o resto do corpo. Uma resposta auto-

imune contra antígenos de espermatozóides é, normalmente, prevenida pelo

seqüestro destas células atrás da barreira hemato-testicular, representada pela zona

tight junction das células da Sertoli. Muito raramente esta barreira é quebrada,

porém pode ocorrer a transposição de forma artificial através de injeções de

espermatozóides fora da região confinada do testículo e, conseqüentemente,

provocar uma resposta imune, sendo este um dos principais critérios para

estabelecer a existência de auto-antígenos nos espermatozóides.

Fazendo um experimento com cobaios, os quais são muito susceptíveis à

indução de reação auto-imune antiespermatozóide VOISIN et al.,1974; JOHNSON,

1975 identificaram quatro auto-antígenos de espermatozóides. Eles designaram

estes antígenos como: P, S, T e Z. Dos quatro, Z foi particularmente o mais evasivo,

e tendem a desaparecer durante o processamento de extração utilizado, embora a

existência tenha sido estabelecida, pouco se sabe deste, com exceção, de poder ser

uma glicoproteína. Dos outro três antígenos, P é uma proteína de peso molecular,

provavelmente menor que 60 kDa, S uma glicoproteína rica em açúcar de alto peso

molecular e T é, possivelmente, uma lipoproteína. Os anticorpos contra T são

espermoaglutinantes, os quais indicam que T está localizado do lado externo do

espermatozóide: de outro modo, seria impossível a aglutinação de espermatozóides

vivos e intactos. Essa suposição é confirmada por imunofluorescência. O auto-

anticorpo anti-T é também capaz de fixar complemento e, assim, causar lesões na

superfície da membrana de espermatozóides, principalmente na região do

acrossoma da cabeça do espermatozóide. Esta reação é letal, progredindo muito

rápido: cerca de 20 % dos espermatozóides desenvolvem lesões dentro de 30

segundos, 40 % dentro de 1 minuto e 80 % dentro de 5 minutos da adição do

anticorpo mais complemento. Auto-anticorpos contra o antígeno P são também

fixadores de complemento, como também uma pequena proporção do auto-

anticorpo contra o antígeno S. Entretanto, ambos os antígenos (P e S) estão abaixo

da superfície do espermatozóide, dentro do acrossoma, não podendo nenhum dos

dois anticorpos aglutinar espermatozóides intactos ou iniciar um ataque sobre eles.

8

Porém, estes anticorpos podem contribuir no estágio tardio da destruição, quando o

anticorpo T já abriu a membrana externa do espermatozóide e expôs os antígenos

internos para o ataque (RUSSO e METZ, 1974; LE BOUTEILLIER et al., 1975).

2.2. Plasma Seminal

Além dos espermatozóides, o plasma seminal em que eles estão suspensos

pode também ser antigênico. O plasma seminal é uma mistura complexa, originada

de diferentes secreções dentro do trato genital do macho. O fluido inicial secretado

dentro dos túbulos seminíferos, nos quais os espermatozóides são transportados, é

uma mistura de diferentes contribuições na rete testis. Além do mais, o plasma

seminal modifica sua composição com a passagem pelo epidídimo por adição e

remoção de várias substâncias. Além dessas glândulas acessórias adicionarem

constituintes, formam, também, a maior parte do ejaculado, à medida que os

espermatozóides são lançados para fora durante o coito. Muitas das substâncias

secretadas são enzimas ou grandes moléculas, podendo ser antigênicas.

TROEDSSON et al. (1995) mostraram que os espermatozóides de garanhões

são capazes de ativar o complemento, os quais causam a quimiotaxia e migração

das células polimorfonucleares. Eles também mostraram que o plasma seminal inibiu

a ativação do complemento e suprimiu a quimiotaxia dos polimorfonucleares e a

fagocitose dos espermatozóides. Frações do plasma seminal causaram uma maior

supressão da quimiotaxia dos polimorfonucleares quando comparado com a ação do

plasma sanguíneo inativado pelo calor, sugerindo que outros mecanismos, além da

inativação do complemento, estão envolvidos no efeito supressivo do plasma

seminal (TROEDSSON et al., 1999).

Os espermatozóides alogênicos, logicamente, podem penetrar com sucesso e

repetidamente no trato reprodutivo feminino sem provocar uma resposta imune

significativa. A razão para isso é que o plasma seminal é imunossupressivo. Os

espermatozóides expostos a esse fluido não são imunogênicos, mesmo após uma

lavagem. O fluido prostático, um de seus componentes imunossupressivos do

plasma seminal, também inibe a hemólise mediada por complemento. Nos bovinos,

os componentes imunossupressivos do plasma seminal são proteínas de peso

molecular entre 50 e 150 kDa. Entretanto, ocorrem casos esporádicos de

infertilidade resultante da produção de anticorpo antiespermatozóide no útero

9

(TIZARD 1998). TROEDSSON et al. (2001) caracterizaram que o componente

imunossupressor do plasma seminal de eqüino poderia ser uma ou mais proteínas

com peso molecular entre 50 e 100 kDa, e que estas poderiam ser inativadas

parcialmente pelo uso de carvão e/ou pelo calor (95ºC/45min).

Vários métodos têm sido empregados para estudar a quantidade e a natureza

dos antígenos do plasma seminal oriundos das glândulas acessórias. Se o plasma

seminal humano é inoculado em coelhos, o anti-soro resultante é utilizado para

separar os constituintes do plasma seminal através de imunoeletroforese; com a

separação de componentes protéicos, de acordo com a sua mobilidade

eletroforética, poderão ser distinguidos doze componentes xenoantigênicos. Para

eliminar a possibilidade de inclusão de antígenos de espermatozóides, experimentos

similares foram feitos utilizando-se soro anti-coelho contra o plasma seminal de

homens, cujo sêmen estava completamente livre de espermatozóides. Nesse

plasma seminal azoospérmico foram distinguidos de 13 a 15 componentes. Alguns

desses componentes ocorrem também em outros lugares do organismo. Quando o

soro anti-plasma seminal de humano em coelho foi absorvido com soro humano e

extrato de fígado, o número de componentes do plasma seminal que permaneceram

reagindo caiu para 6. A absorção removeu da mistura de anti-soro aqueles

anticorpos contra elementos do plasma seminal os quais reagiram também contra

antígenos presentes no soro sanguíneo ou fígado. Os seis componentes restantes

do plasma seminal representam antígenos que não ocorrem em outra parte do

organismo, os quais podem, conseqüentemente, atuar como auto-antígenos

específicos do plasma seminal (ISOJIMA et al., 1974).

2.3. Aspectos gerais sobre a determinação do sexo e o antígeno HY

Segundo HAFEZ (1995), as fêmeas dos animais possuem dois cromossomos

sexuais similares (X e X), enquanto que os machos apresentam dois cromossomos

sexuais diferentes (um cromossomo “X” e outro menor, o cromossomo “Y”). Os

gametas (óvulo e espermatozóide) são células haplóides que contêm o cromossomo

“X” ou o cromossomo “Y”. Células somáticas diplóides de fêmeas (sexo

homogamético) contêm um par de cromossomos “X”, porém as células somáticas

dos machos (sexo heterogamético) possuem cromossomos sexuais XY.

10

O sexo genético é estabelecido durante a ocasião da fertilização na trompa, e

o sexo dos descendentes é determinado por complemento cromossômico sexual

dentro do espermatozóide (MOORE, 1978; HAFEZ, 1995). O cromossomo “Y” tem

forte efeito determinante de testículo na gônada não diferenciada. Sob sua

influência, o cordão sexual primário diferencia-se em túbulos seminíferos. A falta do

cromossomo “Y” resulta em formação de um ovário. Portanto, o tipo do cromossomo

sexual estabelecido na fertilização determina o tipo de gônada que se desenvolve a

partir de uma gônada indiferenciada. As gônadas, então, determinam o tipo de

diferenciação que ocorre nos ductos genitais e na genitália externa (MOORE, 1978).

Vários trabalhos relatam que a proporção de espermatozóides “X” e “Y” que

chegam até a porção superior do trato genital feminino poderia ser alterada e,

conseqüentemente, poderia alterar o sexo do feto, alteração essa que poderia ser

conseqüência de vários fatores. Segundo BETTERIDGE (1984), têm sido reportadas

várias abordagens práticas com o intuito de promover a sexagem dos

espermatozóides, tanto utilizando meios científicos quanto métodos empíricos.

Como meios científicos temos, por exemplo, o tempo de inseminação (WHELAN,

1974, FRANCE et al., 1984), utilização de diferentes métodos de inseminação, como

na utilização de duchas alcalinas ou ácidas para alterar o pH vaginal (DANIELL,

1983) e o emprego de dietas específicas (PAPA et al., 1983; STOLOWSKI, 1983).

Nenhum destes métodos supracitados apresentam efeitos sobre a alteração da taxa

do sexo do feto.

Até a data de 1998, HOSSAIN et al. (1998) afirmaram que não se dispõe de

uma metodologia de rotina e segura para a separação das duas populações

espermáticas (X e Y). As metodologias utilizadas no processamento do sêmen para

a separação destas populações ainda não forneceram um resultado seguro, rápido e

economicamente viável. Como exemplo destas metodologias, podemos citar: a

motilidade, a exploração da diferença de massa de cada população, o conteúdo de

DNA e a carga elétrica da superfície celular.

O antígeno HY é um epitopo antigênico macho-específico, o qual foi

observado pela primeira vez em 1955 por EICHWALD e SILMSER (citado por

HENDRIKSEN, 1999). Esse antígeno foi denominado “antígeno HY”, inicialmente por

BILLINGHAN e SILVERS (1960), onde o “H” se refere à histocompatibilidade, o “Y”

ao cromossomo “Y”. GOLDBERG et al. (1971) verificaram a presença do antígeno

HY por meio do teste de citotoxidade ou pela detecção de anticorpos macho-

11

específicos. EICHWALD e SILMSER (1955) descobriram que camundongos fêmeas

rejeitaram transplante de pele de camundongo macho isogênico, enquanto

transplante entre machos e entre fêmeas não resultou numa rejeição. De 1971 em

diante, muitos trabalhos sobre anticorpos direcionados contra antígeno HY têm sido

publicados ( WIBERG, 1987).

MÜLLER (1996) definiu também o antígeno HY como um antígeno de

histocompatibilidade de macho, o qual causa rejeição no transplante de pele de

macho para fêmea da mesma linhagem de roedores, onde o antígeno HY mostra ser

uma parte essencial da membrana da maior parte das células dos machos.

KOPPE e KOO (1984) mostraram que a porcentagem de espermatozóides

HY positivos difere das regiões do trato reprodutivo do macho, isto é, parece diminuir

durante seu transporte a partir do testículo para o epidídimo e vasos deferentes. Eles

sugerem que o antígeno HY aparece sobre a superfície dos espermatozóides

durante a associação com os constituintes testiculares e são removidos durante o

transporte epididimário e capacitação. Neste trabalho, eles também afirmam que o

uso do anticorpo monoclonal HY não influencia na taxa de fertilidade, obtendo

sucesso na fertilização de ovócitos de ratos com subseqüente nascimento da prole.

BRADLEY (1989) mostrou, em estudos imunohistoquímicos com alto título

sorológico detectado, que o antígeno macho-específico está aproximadamente em

50 % dos espermatozóides e está localizado sobre a região pós-acrossomal da

cabeça e na peça intermediária do flagelo. Relata, também, que o antígeno macho-

específico sobre os espermatozóides é um resultado da expressão do gene do

cromossomo haplóide Y. IYER et al. (1989) mostraram, também por testes

imunohistoquímicos, a localização do antígeno nas secções testiculares, onde este

estando presente no citoplasma das células de Leydig, sobre a membrana das

células de Sertoli e na cabeça do espermatozóide.

Inicialmente, acreditava-se que o antígeno HY era responsável pela

determinação do sexo, representando o fator determinante testicular (TDF) em

mamíferos, porém esta hipótese não tem sido aceita pelo fato da diferenciação

gonadal em camundongo poder ocorrer também na ausência do antígeno HY

(WOLF, 1998). Esta hipótese de Ohno’s também foi negada por SIMPSON (2001).

12

2.4. Produção de anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais vem-se tornando uma valiosa ferramenta

para as pesquisas científicas, pois através dos conhecimentos dos mecanismos de

ação das células responsáveis pela defesa do organismo é que os imunologistas,

médicos veterinários, químicos, biólogos e médicos vêm desenvolvendo vários

produtos, como: imunoterápicos, kits de diagnóstico e kits de imunossexagem.

Os anticorpos monoclonais apresentam duas características muito próprias. A

primeira é que estes anticorpos são extremamente específicos, e cada anticorpo liga

e ataca um antígeno em particular. A segunda, alguns anticorpos, uma vez ativados

pela ocorrência de doença, continuam conferindo resistência a esta doença (Access

Excellence).

Várias metodologias vêm sendo testadas com a finalidade de intensificar a

produção de hibridomas. Estas metodologias propõem modificações nos protocolos

de imunização e fusão, utilização de meios para cultivos de mieloma e hibridomas e

aproveitamento de diferentes linhagens de mieloma.

A tecnologia da produção de anticorpos monoclonais foi revolucionada em

1975, quando KOHLER e MILSTEIN descreveram a fusão de células esplênicas com

células de mieloma para a produção de linhagem de células imortais, hibridomas,

produzindo anticorpo para um epitopo em particular. Desde então, essa tecnologia tem

sido padronizada em muitos laboratórios para a geração de anticorpos monclonais

(HARRIS et al., 2002).

Anticorpos ou imunoglobulinas são um grupo de glicoproteínas presentes no

soro sangüíneo e no fluido tecidual de mamíferos. As glicoproteínas séricas podem ser

separadas de acordo com as suas cargas através do uso de eletroforese, HPLC e

anticorpos policlonais. Para eliminar substâncias estranhas, o reconhecimento e a

ligação entre o anticorpo e a superfície do antígeno são muito importantes. O local de

ligação no antígeno é conhecido como epitopo. STRYER (1992) define anticorpos

monoclonais como proteínas homogêneas específicas que são formadas em resposta

a um antígeno e que reagem especificamente contra esse antígeno.

Antes de 1975, só era possível produzir anticorpos policlonais. KOHLER e

MILSTEIN (1975) desenvolveram um método para produzir anticorpos monoclonais de

células hibridomas. Células hibridomas são formadas pela fusão do linfócito B, a partir

do baço do animal imunizado, com a célula mieloma, que tem a capacidade para

13

proliferação ilimitada. Este método permitiu que cientistas produzissem um clone de

células a partir de uma única fusão celular. Esta única célula fusionada pode ser

mantida em cultura celular para sempre, e irá continuar a secretar um único tipo de

anticorpo. Este anticorpo monoclonal pode ser usado para testar a presença de

antígenos específicos, para estudar reação cruzada entre antígeno, e a purificar

antígenos. O anticorpo monoclonal é específico para um determinado epitopo,

ocorrendo somente em determinadas proteínas. Logo, o anticorpo monoclonal permite

que cientistas isolem ou purifiquem proteínas específicas contendo um epitopo

específico.

Para produzir o hibridoma, como descoberto por KOHLER e MILSTEIN (1975),

uma célula tumoral maligna (mieloma) e um linfócito B são colocados juntos e

submetidos a tratamento químico com polietilenoglicol (PEG). Esta substância

desestrutura parcialmente as membranas celulares destas células e permite que estes

dois tipos celulares se fusionem. A célula híbrida retém a capacidade de crescimento

num meio específico no qual nenhuma célula esplênica e/ou células tumorais puras

não podem crescer. A célula híbrida vai possuir a imortalidade característica da célula

tumoral e a produção específica do anticorpo.

Em estudos feitos por OI e HERZENBERG (1980), foi verificado que as células

fusionadas linfócito-linfócito morriam após duas semanas da fusão quando cultivadas

em meio de cultura apropriado. Estes pesquisadores relatam que a especificidade dos

clones pode ser verificada através do teste de reatividade ao antígeno utilizado para a

produção dos anticorpos monoclonais e que estes hibridomas e os seus clones podem

ser injetados em animais isogênicos para induzir a produção em grande quantidade de

anticorpos específicos.

Foi observado que, após a fusão dos linfócitos e das células de mieloma, o

resultado apresentava três tipos celulares, sendo estes híbridos linfócito-linfócito,

mieloma-mieloma e linfócito-mieloma. Com o intuito de obter somente células híbridas

formadas por linfócito-mieloma, foi verificado que era necessário um meio seletivo

onde os híbridos celulares linfócito-linfócito e mieloma-mieloma não pudessem crescer

e, assim, foi verificado que após a fusão das células, estas deveriam ser transferidas

para o meio seletivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), onde

vai ocorrer o bloqueio da via normal da síntese de nucleotídeos através da

aminopterina (antimetabólico), fazendo com que a célula utilize uma via alternativa e,

14

para isso, é necessária a utilização da hipoxantina e da timidina, para que as células

híbridas linfócito-mieloma não morram (KELLEY e LEWIN, 1986).

KOO (1981) relata que, antes da descoberta da metodologia da produção de

anticorpos monoclonais, os anticorpos anti-HY eram produzidos fazendo-se

hiperimunizações em fêmeas de camundongos ou de ratos utilizando-se como

antígeno células de baço de camundongos machos e verificou que das fêmeas

hiperimunizadas, somente 30 % apresentaram um boa resposta imunológica para o

antígeno HY, ou seja, somente 30 % apresentaram um alto título de anticorpos para o

antígeno.

15

3. MATERIAL E MÉTODO

3.1. Obtenção do material biológico

3.1.1. Leucócitos

Os leucócitos foram obtidos de eqüinos sem raça definida (SRD), machos e

fêmeas em bom estado de saúde, da instituição (UENF) e de produtores rurais. Para

a obtenção dos leucócitos utilizou-se um Ehrlenmeyer de 250 mL contendo 0,4 mL

de heparina sódica (5000 U.I./mL) e uma agulha 40x12. Foi feita punção na veia

jugular e o sangue retido no frasco. À medida que o sangue ia descendo, era

realizada sua homogeneização no frasco com suaves movimentos circulares. O

sangue foi vertido em tubos de 50 mL e colocado na geladeira para a sedimentação

das hemácias e dos leucócitos durante 1 hora. Após este tempo, os leucócitos foram

retirados com auxílio de uma pipeta Pasteur e depositados em tubos de 50 mL. Para

a purificação dos leucócitos foi realizada uma centrifugação em gradiente de

percoll®, onde se utilizaram duas concentrações, 90% e 50%, sendo vertida,

inicialmente, a solução de 50% e, depois, com o auxílio de uma seringa com agulha

longa, a solução de 90% foi depositada lentamente no fundo do tubo e, em seguida,

os leucócitos mais plasma foram depositados lentamente sobre a solução de 50%. A

centrifugação utilizada foi de 750 g por 10 minutos numa velocidade de aceleração e

de desaceleração lenta, a fim de não homogeneizar o gradiente de percoll® com

uma aceleração e parada brusca. Feita a centrifugação, os leucócitos ficaram retidos

16

entre o gradiente de 50 e 90% e as poucas hemácias que se apresentavam no

plasma passaram do gradiente de 90% e depositaram-se no fundo do tubo. Com o

auxílio da pipeta Pasteur, os leucócitos foram aspirados e depositados em tubos de

15 mL e, em seguida, foram lavados com o auxílio de uma centrífuga numa

velocidade de 1600 g por 10 minutos em tampão PBS por duas vezes para retirar o

percoll®.

3.1.2. Sêmen

O sêmen foi obtido de animais em idade reprodutiva, em perfeito estado

sanitário, de propriedade de produtores rurais do município de Campos dos

Goytacazes/RJ e da instituição (UENF). As coletas foram efetuadas por meio de

vagina artificial modelo “Hannover”, utilizando-se como parceira para o salto um

manequim artificial ou uma égua contida. Imediatamente após a coleta, o sêmen era

mantido a ± 37ºC em banho-maria e transportado para o laboratório para os exames

de concentração, motilidade e subseqüentes tratamentos.

3.2. Preparação do material biológico para inoculação

3.2.1. Extração de proteínas dos leucócitos

Após a obtenção (purificação) dos leucócitos, foi adicionado detergente

(NONIDET-NP 40® – 0,1% V/V) em tampão PBS para extrair as proteínas de

membrana, deixando as amostras a uma temperatura de 5ºC ± 0,5º por 12 horas;

transcorrido este tempo, foi realizada uma ultracentrifugação (18000 g / 30 minutos),

onde se coletou o sobrenadante e fez-se o descarte do sedimento.

3.2.2. Espermatozóides íntegros

Após a coleta do ejaculado, como descrito na obtenção do sêmen, este foi

filtrado em gaze estéril onde as impurezas e fração gelatinosa ficaram retidas na

gaze. O conteúdo remanescente foi vertido em tubos de 15 mL até o volume de 10

mL. O ejaculado foi centrifugado numa velocidade de 1600 g por 10 minutos. Após

transcorrido este tempo, o sobrenadante foi descartado e o sedimento

17

ressuspendido em tampão PBS, sendo esta etapa de lavagem repetida por várias

vezes.

3.2.3. Extração de proteínas dos espermatozóides

Seguindo a técnica de obtenção de espermatozóides íntegros conforme o

item 3.2.2, descartou-se o sobrenadante da última lavagem e adicionou-se às

células, contidas no sedimento, detergente (NONIDET-NP 40® – 0,1% V/V) em

tampão PBS para extrair as proteínas de membrana, sempre deixando as amostras

a uma temperatura de 5ºC ± 0,5º por 12 horas. Transcorrido este tempo, realizou-se

a ultracentrifugação (18000 g / 30 minutos), onde se coletou o sobrenadante que

continha as proteínas e fez-se o descarte do sedimento.

3.3. Determinação da concentração das proteínas

A concentração protéica foi determinada pelo método de Bradford

(BRADFORD, 1976).

3.4. Eletroforese monodimensional das proteínas de membranas celulares

As separações das proteínas foram efetuadas em géis de poliacrilamida SDS-

PAGE a 12% (tabela 1A e 2A) confeccionados em placas de 20 X 20 cm (BIO-RAD

System). Após a polimerização do gel, as proteínas de membrana já processadas e

diluídas no tampão de amostra (tabela 3A) foram depositadas nos poços (gel

concentrador) dos géis entre as placas de eletroforese. A eletroforese se efetuou a

uma corrente de 60 Volts no início da migração (gel de concentração), após o qual,

quando as proteínas penetraram no gel de separação, a corrente foi elevada para 80

Volts. Para a migração eletroforética foi utilizado uma tampão com SDS pH 8,3

(tabela 3A).

18

3.5. Análise do gel de eletroforese

Após a migração eletroforética das proteínas, o gel foi corado e descorado de acordo com RETAMAL et al. (1999) e depois foi digitalizado, com o auxílio de um scanner comercial de 400 dpi

transformando a imagem adquirida em tons de cinza e salvando como imagem tif. As análises das proteínas foram realizadas

utilizando-se o programa densitográfico GEL-PERFECT (BOZZO E RETAMAL 1991,).

Através deste programa, foi determinada a massa molecular das proteínas,

comparando-as com a migração proteica de uma amostra padrão, no mesmo gel.

3.6. Extração das proteínas dos géis de poliacrilamida

A extração das proteínas dos géis, ou seja, a purificação dos antígenos foi

realizada de acordo com a teoria de RETAMAL et al. (1999) e modificado de acordo

com o descrito abaixo, onde as proteínas de espermatozóides foram depositadas em

um poço único sobre toda a extensão do gel e, após a eletroforese, as fitas laterais

dos géis contendo as bandas proteicas foram cortadas, que consistem em uma fita

contendo as bandas dos padrões e uma pequena parte da migração do material em

questão e outra fita do lado oposto contendo somente a migração do material. Estas

fitas foram, então, colocadas por cerca de 1 a 2 horas em cubas contendo a solução

de coloração (tabela 4A). Transcorrido este tempo, fez-se a descoloração das fitas,

que foi efetuada por meio de um microondas a uma potência máxima por 5 minutos,

utilizando-se água como solução, e repetindo este processo até que as bandas

estivessem bem contrastadas em relação ao fundo incolor do gel. As fitas, uma vez

descoradas, foram recolocadas nos seus devidos lugares em relação ao padrão e,

assim, observando-se a banda de interesse. Elas foram, então, cortadas em tiras

utilizando-se uma régua e um papel com uma reta traçada, a qual serve de

alinhamento para o corte preciso das bandas das proteínas de interesse. Após o

corte destas, as tiras foram trituradas com o auxílio de um bastão e, depois,

sonicadas, utilizando-se 20 ciclos de 30 segundos. A extração foi feita por meio de

um sonicador (20 ciclos de 30 segundos), onde as amostras eram mantidas em um

tubo envolto por gelo picado para não deixar aquecer as proteínas. Após este

processo, as amostras foram centrifugadas a ± 18000 g por 20 minutos, de onde o

sobrenadante foi retirado e armazenado no freezer a uma temperatura de ± – 70ºC.

19

3.7. Imunização dos animais

Na primeira parte deste projeto, foram utilizadas as proteínas purificadas de

membrana de leucócitos, extraídas do gel de eletroforese monodimensional (Gel

poliacrilamida SDS-PAGE 12%), que se apresentaram diferentes nas concentrações

perante a análise do gel para as proteínas de leucócitos de macho e fêmea. Para a

imunização dos animais (camundongas da linhagem Balb/c) seguiu-se um protocolo

conforme a tabela 5A.

Na segunda parte que se divide em primeira e segunda etapa, as

imunizações se deram da seguinte maneira: para a determinação da proteína sexo-

específica utilizando-se células espermáticas na primeira etapa, os animais

(camundongos e coelhos - macho e fêmea e égua) foram imunizados com

espermatozóides íntegros. Os camundongos (macho e fêmea) foram imunizados

com espermatozóides de eqüino íntegros numa concentração de 200 x 106

espermatozóides/mL, sendo o volume total da dose imunizante de 0,5 mL, composta

de 250µL da solução de espermatozóides mais 250µL de adjuvante. Os coelhos

(macho e fêmea) foram imunizados com 1mL de um composto de 750µL da solução

de espermatozóides mais 250µL de adjuvante. A égua foi imunizada com 2mL,

composto de 1500µL da solução de espermatozóides de eqüino íntegros mais 500µL

de adjuvante. A primeira inoculação foi feita com adjuvante completo de Freund’s e

as posteriores inoculações foram feitas com adjuvante incompleto (hidróxido de

alumínio).

Após a identificação das proteínas sexo-específicas pelo teste Western-

blotting (item 3.8), seguiu-se para a segunda etapa da pesquisa, quando os animais

(camundongas da linhagem Balb/c com idade em torno de três meses) foram

inoculados com as proteínas sexo-específicas purificadas da membrana de

espermatozóides numa quantidade em torno de 150 µg de antígeno, seguindo-se o

protocolo de imunização para camundongos na tabela 5A, cujas proteínas foram

extraídas do gel de eletroforese monodimensional (Gel poliacrilamida SDS-PAGE

12%).

20

3.8. Western Blotting

Depois da corrida eletroforética, os géis, contendo as proteínas de membrana

de espermatozóides de eqüino macho e fêmea, foram colocados em contato com

papel de nitrocelulose e este conjunto, protegido com papel-filtro Whatman®, foi

mantido na cuba com tampão de transferência (tabela 6A) durante duas horas a

10Volts.

Terminada a transferência, o papel de nitrocelulose (0,45µ de porosidade) foi

submetido ao corante Ponseau® para verificar se houve a transferência e para

auxiliar no corte das tiras. As tiras foram bloqueadas com leite a 2% por 12 horas,

sendo secas com papel-filtro e armazenadas no freezer –70ºC para posterior

revelação imunoenzimática.

Na revelação imunoenzimática, cada fita de papel de nitrocelulose contendo o

perfil das proteínas seguiu um protocolo abaixo descrito de incubação com soros no

objetivo de se evidenciarem as proteínas sexo-específicas.

Protocolo de incubação para revelação imunoenzimática:

1- Bloqueio das fitas com leite-em-pó a 2%, durante 120 minutos;

2- Incubação com soro de macho ou fêmea hiperimunizado com espermatozóides,

durante 60 minutos;

3- Incubação com imunoglobulina conjugada com peroxidase, especifica contra IgG

da espécie em estudo, diluído na proporção de 1:2000 em tampão PBST, durante 90

minutos;

4- Lavagem abundante com tampão PBST, contendo 0,05% de Tween 20;

5- Revelação imunoenzimática (substrato - DAB)

A coloração foi realizada por 10 minutos, após a qual ela foi parada pela

lavagem com tampão PBST.

3.9. Produção de anticorpos policlonais

Os camundongos utilizados na produção de anticorpos policlonais foram os

da linhagem BALB/c, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF.

21

Para a produção destes anticorpos foram utilizados como antígenos, na

primeira parte, no que se refere aos leucócitos, proteína de membrana de leucócito

de eqüino macho e fêmea; já na segunda parte, no que se refere aos

espermatozóides, foram utilizados para a primeira etapa os espermatozóides

íntegros eqüinos e para a segunda etapa as proteínas purificadas de

espermatozóides eqüinos.

3.10. Teste de ELISA

O teste de ELISA foi usado para verificar se os animais imunizados estavam

produzindo resposta contra os antígenos inoculados.

Para testar os animais imunizados com as proteínas dos leucócitos e

espermatozóides íntegros, a sensibilização da placa se deu utilizando-se um

conjunto protéico o qual foi diluído para uma concentração final de 5 µg/mL em

tampão carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6 (0,80 g 0,015 M Na2CO3, 1,47 g 0,035

M NaHCO3 e 500 mL H2O destilada), sendo colocados 100 µL em cada um dos 96

poços. A placa foi, então, colocada na geladeira a ± 8ºC por 12 horas. Após

sensibilização, a placa foi lavada quatro vezes com PBS pH 7.4 com um volume de

250 µL e bloqueada com 100 µL de gelatina 2% durante duas horas na estufa a ±

37°C. Lavou-se, novamente, a placa e o primeiro anticorpo utilizado foi o soro de

cada animal inoculado (screening), adicionando-se 100 µL em cada poço, sendo

este soro diluído na proporção de 1:100. A placa foi, então, levada à estufa por uma

hora a ± 37°C. Foi utilizado como controle negativo o soro de um camundongo não

imunizado.

A placa foi então novamente lavada quatro vezes com PBS pH 7.4 e, logo

após, foi adicionado anticorpos anti-IgG, das espécies utilizadas como primeiro

anticorpo, conjugado com peroxidase (Sigma Co.,USA) na diluição de 1:2000 em

todos os poços. A placa foi, então, posta na estufa por uma hora a ± 37°C. Em

seguida, a placa foi lavada novamente e foi adicionado 50 µL do substrato para

peroxidase (6,5 mL 0,1N de Ácido Cítrico, 7,0 mL 0,2N de Fosfato de Sódio, 11,5 mL

de água destilada, 10 µL de água oxigenada volume 30 e 10 mg de

Ortofenildiamina). A placa foi protegida da luz e deixada reagir durante 15 minutos.

Transcorrido este tempo, a reação foi interrompida com 50 µL de Ácido Sulfúrico 3N.

22

3.11. Obtenção dos macrófagos peritoniais

Para a obtenção dos macrófagos peritoniais foi, primeiramente, realizado o

sacrifício dos camundongos por deslocamento cervical e, em seguida, os

camundongos foram lavados com álcool 70%, secos com papel-toalha e fixados

numa plataforma. Os camundongos já fixados eram levados ao fluxo laminar (para

realizar-se a retirada asséptica dos macrófagos), sendo feito um pequeno corte na

pele, na porção ventral e, a seguir, a pele foi divulsionada e rebatida em todo a

extensão do abdômen, em seguida eram injetados 5 mL de meio DEMEN-F12 sem

soro fetal a uma temperatura de 4 a 8ºC, o qual era mantido na cavidade abdominal

por 2 minutos. Após esse tempo, foi feita a aspiração do meio da cavidade e, após

colocado em tubos tipo Falcon® de 15 mL, foram adicionandos mais 5 mL de meio à

temperatura de 4 a 8ºC. Finalmente, esta solução contendo os macrófagos foi

centrifugada a ± 720 g/10 minutos/5ºC.

3.12. Fusão

Os camundongos utilizados na produção de anticorpos monoclonais foram os

da linhagem BALB/c utilizados na produção dos anticorpos policlonais, provenientes

do Biotério Central da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro –

UENF, empregados na primeira parte (utilizando-se como material biológico

proteínas sexo-específicas de membrana de leucócitos) e, na segunda etapa da

segunda parte os que utilizou-se como material biológico proteínas sexo-específicas

de membrana de espermatozóides.

Para a realização da técnica de fusão, foram utilizadas as células de mieloma

(NS0) da linhagem BALB/c, as quais eram mantidas armazenadas em nitrogênio

líquido e descongeladas cerca de uma semana antes da fusão, e esplenócitos de

camundongos, isogênicos da linhagem BALB/c, hiperimunizados. Os camundongos

foram sacrificados por deslocamento cervical e os baços retirados de maneira estéril,

sendo colocados em duas placas de Petri contendo meio de cultivo DMEM-F12 sem

soro fetal bovino. Os baços foram tratados separadamente e todas as manipulações

foram feitas em ambiente estéril.

Com o auxílio de duas seringas agulhadas, e estas agulhas previamente

dobradas, as células do baço foram dissociadas manualmente em meio DMEM-F12

sem soro fetal bovino. O sobrenadante, contendo células dissociadas do baço foi

23

recuperado e submetido à centrifugação de oito minutos a 400 G, em temperatura

ambiente. Estas células foram lavadas três vezes com meio DMEM-F12 com soro

fetal bovino, suspendidas novamente e contadas na câmara hematimétrica de

Newbauer. As grandes células brilhantes representam os blastos em fase de

diferenciação.

As células de mieloma foram lavadas em meio DMEM-F12 com soro fetal

bovino, e as células vivas contadas. As células de mieloma foram misturadas com

esplenócitos numa proporção de 1:4 e o conjunto foi centrifugado a 155 G durante

10 minutos à temperatura ambiente. Para induzir a fusão, 1 mL de Polietilenoglicol

(PEG-1000) foi depositado no tubo contendo as células de mieloma e esplenócitos,

delicadamente durante ± 1 minuto e, imediatamente após este procedimento, 2 mL

do meio DMEM-F12 com 10% de soro fetal foram adicionados lentamente durante 2

minutos, em seguida, mais 10 mL do meio DMEM-F12 com 10% de soro fetal foram

adicionados. As células foram homogeneizadas e distribuídas em placas de cultura

de 96 poços, sendo estas preparadas com 2 dias de antecedência, isto é, foram

depositados nos poços macrófagos peritoniais de camundongos para que os fatores

de crescimento pudessem ser concentrados no meio de cultura. Feita a distribuição,

as placas foram levadas à estufa sob uma condição de temperatura de ± 37ºC e

uma concentração de 5% de CO2.

As culturas de células foram colocadas na estufa durante 10 dias, sem que

houvesse nenhuma intervenção, a fim de deixar os híbridos se multiplicarem e

começarem a formação dos clones celulares. Após este período, o crescimento dos

clones foi observado diariamente ao microscópio e quando estes clones ocuparam

1/4 do orifício ou mais, foram coletadas pequenas alíquotas de sobrenadante das

culturas e testadas pelo teste de ELISA para verificação da produção de anticorpos

específicos para o antígeno em estudo. Os clones positivos foram ampliados e

posteriormente sub-clonados com o objetivo de se obter um anticorpo que fosse

realmente monoclonal.

24

3.13. Testes dos clones

Para identificar quais clones estavam produzindo anticorpos para as proteínas

sexo-específicas purificadas, utilizou-se também o teste de ELISA como descrito no

item 3.9. As proteínas extraídas dos géis foram diluídas também numa concentração

de 5 µg/mL em tampão carbonato/bicarbonato e o primeiro anticorpo utilizado foi

sobrenadante da cultura de células, onde se adicionaram 100 µL em cada poço.

Para identificar os clones que estavam produzindo anticorpos utilizou-se como

controle positivo o soro do camundongo imunizado com as proteínas extraídas dos

géis e como controle negativo foi utilizado o soro de um camundongo não

imunizado.

25

4. RESULTADOS

4.1. Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do gel

Na figura 1, pode-se observar a migração proteica contendo o material de

macho à direita e de fêmea à esquerda e ao centro a amostra padrão e as áreas

selecionadas para posterior análise.

Figura 1: Migração eletroforética no gel de poliacrilamida 12 % SDS-PAGE das proteínas dos leucócitos de macho e fêmea. O retângulo amarelo representa o perfil protéico dos leucócitos de fêmea; o retângulo laranja representa o perfil protéico dos leucócitos de macho e o retângulo azul representa as amostras padrão de massa molecular 66 kDa, 45 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 20,1 kDa e 14,2 kDa.

26

Após a análise densitográfica do gel contendo as proteínas de leucócitos de

macho e de fêmea, obtivemos como resultado a diferença de concentração de três

proteínas, sendo de duas para macho de peso molecular 68 e 46 kDa e uma para

fêmea de 35 kDa. Observando a tabela 7A, podemos verificar essas diferenças

encontradas na análise.

Tabela 7A: Resultado da análise do gel onde se verifica a diferença na concentração

das proteínas de leucócitos de macho e fêmea.

Para obtermos os dados da tabela acima foi feita a determinação de cada fita

densitométrica a ser analisada e de cada uma das fitas foi feito um gráfico. Tendo

assim os seguintes gráficos obtidos através da análise conforme a figura 2.

27

Figura 2: Resultado da análise do gel onde se verificam as diferenças na concentração das proteínas de leucócitos de macho e fêmea observando as curvas dos gráficos.

O resultado da análise do gel se resume na figura 3, onde se evidenciam as

proteínas de peso molecular 68 e 46 kDa para o macho e 35 kDa para fêmea, cujas

diferenças nas concentrações são expressadas pelos picos das curvas.

Figura 3: Resultado da análise do gel onde se verifica a diferença na concentração das proteínas de leucócitos de macho (68 e 46 kDa) e fêmea (35 kDa). Estas diferenças significativas entre machos e fêmeas são observadas através de um traço.

28

4.2. Extração, purificação e quantificação das proteínas sexo-específica

Para a extração das proteínas sexo-específicas foram utilizadas membranas

citoplasmáticas de leucócitos macho e fêmea conforme o item 3.2.1. A purificação e

a quantificação dessas proteínas foram realizadas conforme os itens 3.6 e 3.3,

respectivamente, onde as proteínas extraídas dos géis apresentam o peso molecular

de 68, 46 e 35 kDa.

4.3. Produção dos anticorpos monoclonais contra as proteínas sexo-

específicas de leucócitos

As proteínas oriundas da extração e purificação foram inoculadas em

camundongos para a produção dos monoclonais. As inoculações seguiram o

esquema descrito no item 3.7. Feita a fusão e transcorridos dez dias, foi observado o

crescimento de 44 clones apresentados a seguir:

Placa 1: B3, B4, B7, C2, C5, C7, C10, D5, D6, D8, G9 e G10

Placa 2: C10, D2, D4, G6, G8, G9 e G10

Placa 3: C6, D3, D6, D7, E2, E3, E10 e F10

Placa 4: C2, C8, B9, D4, D10, F2, F5, F6 e F10

Placa 5: C6, F3 e G6

Placa 6: D8, D6, E4, E7 e G10

Os clones produzidos foram testados pela técnica de ELISA, onde não se

obtiveram resultados satisfatórios (não houve a produção de clones positivos contra

as proteínas de membrana de leucócitos), o que nos fez seguir para a segunda parte

do projeto.

29

4.4. Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do

western-blotting

Para se chegar às proteínas macho-específicas foram feitas inoculações em

camundongos machos e fêmeas, coelhos machos e fêmeas e égua, daí pôde-se

observar a presença de três proteínas (conforme a figura 4) pelo teste Western-

Blotting. O material utilizado como antígeno para este teste foi um conjunto de

proteína de espermatozóides de diferentes garanhões e foram utilizados dois soros,

que têm a finalidade de bloquear as proteínas com o primeiro anticorpo e depois o

segundo anticorpo para se ligar somente à proteína sexo-específica, já que estas

proteínas não foram reconhecidas pelo primeiro anticorpo.

Figura 4: Western-Blotting para a localização das proteínas sexo-específicas utilizando soro de camundongos machos e fêmeas, coelhos machos e fêmeas e égua e como antígeno foi utilizado um pool de proteínas de espermatozóides de diferentes garanhões.

Nesta figura 4, podemos observar 3 proteínas de interesse, que são,

aproximadamente: 19, 21 e 35 kDa. Com este resultado, foi dado início à segunda

etapa do projeto de pesquisa, que foi a purificação das proteínas (figura 5) e a

inoculação em camundongos fêmeas com as proteínas de interesse.

0- Padrão

1º Anticorpo 2º Anticorpo

1- Soro coelho ♂; soro camund. ♂

2- Soro coelho ♀; soro camund. ♀

3- Soro coelho ♂; soro camund. ♀

4- Soro coelho ♀; soro camund. ♂

5- Soro camund. ♂; soro coelho ♂

6- Soro camund. ♀; soro coelho ♀

1º Anticorpo 2º Anticorpo

7- Soro camund. ♂; soro coelho ♀

8- Soro camund. ♀; soro coelho ♂

9- Soro égua

10- Soro coelho ♀; soro égua

11- Soro coelho ♂; soro égua

Diluição do conjugado → 1:1000

Diluição do anticorpo → 1:50

0

66 kDa 45 kDa 29 kDa 24 kDa 20 kDa 14 kDa

30

A purificação das proteínas foi feita através da técnica descrita anteriormente

no item 3.6.

Figura 5: Eletroforese mostrando o resultado da extração e purificação das proteínas sexo-específicas de peso molecular de 19, 21 e 35 kDa de espermatozóides de eqüinos.

Para confirmar que as proteínas purificadas estavam com

peso de 19, 21 e 35 kDa, o gel de eletroforese foi digitalizado (figura 5) e submetido à análise no programa GEL-PERFECT (BOZZO E

RETAMAL 1991), e o resultado da extração pode ser verificado na figura 6.

Figura 6: Resultado da análise do gel onde se verificam as diferenças na

concentração das proteínas extraídas do gel, observando os picos das proteínas com seus respectivos pesos moleculares na diferença entre as curvas.

31

4.5. Imunização dos camundongos

Feitas as inoculações em comundongos fêmeas da linhagem Balb/c,

realizamos o teste de ELISA em soro destes animais para verificar se o soro estava

apresentando resposta para as proteínas de interesse e um bom título de anticorpos

a fim de se fazer a fusão. Na tabela 8A, podemos observar os resultados do último

teste de ELISA antes da fusão. A leitura do teste de ELISA foi feita com um

comprimento de onda de 493 nanômetros no aparelho AWARENESS® –

(THECHNOLOGY INC) STAT FAX - 2100.

Tabela 8A: Resultado do último teste de ELISA para as proteínas de 19, 21 e 35 kDa

antes da fusão.

1 2 3 4 5 6 A 1,739 0,700 0,710 1,120 0,366 2,936 B 1,336 0,729 0,557 1,064 0,365 2,936 C 1,070 0,563 0,400 1,771 0,360 2,933 D 0,831 0,458 0,346 1,805 0,365 2,933 E 0,595 0,375 0,333 0,496 0,414 F 0,486 0,350 0,329 0,430 0,367 G 0,389 0,299 0,323 0,273 0,339 H 0,360 0,292 0,338 0,280 0,330

Colunas 1, 2 e 3 – proteína de espermatozóides + Bloqueio + Soro (1:50) + Conjugado + Substrato => soro diluído em log 2 Colunas 4 – proteína de espermatozóides + Soro + Bloqueio + Conjugado + Substrato Colunas 5 – Bloqueio + Soro + Conjugado + Substrato Colunas 6, linhas A-D – Conjugado + Substrato Coluna: 1- Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa 2- Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa 3- Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa 4- linhas A e B - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:200) 4- linhas C e D - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:200) 4- linhas E e F - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:200) 4- linhas G e H - proteína de espermatozóide + Bloqueio + Conjugado +

Substrato 5- linhas A - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:100) 5- linhas B - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:100)

5- linhas C - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:100) 5- linhas D - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:200) 5- linhas E - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:200)

5- linhas F - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:200) 5- linhas G e H - Bloqueio + Conjugado + Substrato

Obs: Conjugado (Biotina/Estreptavidina) => 1:4000

Proteínas => [10µg/ml]

32

4.6. Fusão (Produção dos anticorpos monoclonais)

Partindo da idéia de que a proteína de 35 kDa poderia ser um dímero da

proteína de 19 kDa, foi decidido, então, trabalhar com as proteínas de 19 e 21 kDa,

mas não descartando totalmente a proteína de 35 kDa. Sendo assim, os

camundongos que foram inoculados com as proteínas de 19 e 21 kDa foram

sacrificados e seu baço retirado, conforme descrito no material e método no item

3.12. Foram feitas várias fusões que apresentaram somente o crescimento de 11

clones para a proteína de 19 kDa e 14 para a de 21 kDa.

4.7. Teste dos anticorpos monoclonais

As proteínas originárias da extração e purificação foram inoculadas em

camundongos para a produção dos monoclonais. As inoculações seguiram o

esquema descrito no item 3.7. Feita a fusão e transcorridos dez dias, foi observado o

crescimento de 25 clones e somente 17 continuaram crescendo. Estes são

apresentados a seguir:

Placa dos clones contra a proteína de 19 kDa

C3, D4, F4, E5, F5 e E5

Placa dos clones contra a proteína de 21 kDa

B7, B2, F2, C3, D4, D7, E9, E10, D11, E11 e G11

Feitas 10 repetições do teste de ELISA, obteveram-se somente 3 clones que

se apresentaram fracamente positivos que, são: C3 e E5 de 19 kDa e E10 de 21

kDa. Logo, este resultado pode ser observado na tabela 9A, onde foi utilizado

sobrenadante de cultura de células, onde cada clone foi testado separadamente, e o

controle positivo utilizado era o próprio soro, diluído numa proporção de 1:200, dos

animais inoculados com a proteína sexo-específica de 19 e 21 kDa. O conjugado foi

utilizado numa diluição de 1:2000 e o controle negativo numa diluição de 1:200,

onde se utilizou soro de animais não inoculados.

33

Tabela 9A: Resultado do teste de ELISA para a determinação dos clones positivos.

Clones Resultado do teste de ELISA 19 kDa 21 kDa

E5 B7 D11 0,155 0,111 0,126 C3 B2 E11 0,162 0,136 0,110 D4 F2 G11 0,103 0,076 0,102 F4 C3 + 0,093 0,117 0,257 F5 D4 - 0,085 0,108 0,072 C6 D7 branco 0,122 0,101 0,071 + E9 branco 0,648 0,113 0,073 - E10 conjugado 0,071 0,162 3,588

34

5. DISCUSSÃO

A sexagem como um todo sempre despertou o interesse na comunidade

científica desde a antiguidade até os dias de hoje e, dentro da Medicina Veterinária,

há um grande interesse voltado para os animais de produção (bovino, ovinos e

caprinos), esporte e lazer, como os eqüinos, e também quanto ao aspecto

conservacionista de animais em extinção.

Neste trabalho, objetivando-se identificar antígenos sexo-específicos,

purificaram-se membranas de leucócitos de animais de ambos os sexos. A escolha

de leucócitos foi devido ao fato de ter sido anteriormente detectada a presença de

antígenos sexo-específicos em leucócitos, visto que estas células foram

responsáveis pela rejeição de enxertos de camundongos isogênicos, que se

diferenciavam apenas pelo sexo (MÜLLER,1996).

A primeira parte do trabalho teve como base científica a pesquisa do antígeno

H-Y presente nas células de machos e ausente nas de fêmeas, o que foi descrito por

BRADLEY (1989), que mostrou em estudos imunohistoquímicos, utilizando soro com

alto título de anticorpos, que o antígeno macho-específico estava presente em

aproximadamente 50% dos espermatozóides, demonstrando que, num ejaculado,

50% dos espermatozóides são possuidores do cromossomo Y portando o antígeno

HY, enquanto que os outros 50% são possuidores do cromossomo X e, portanto,

não possuem o antígeno HY.

Foi feita uma migração eletroforética (gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%),

onde, ao final, este gel foi corado e descorado de acordo com o descrito em material

35

e método no item 3.6 e, após esta etapa, o gel foi digitalizado, sendo depois a figura

submetida ao programa GEL-PERFECT (BOZZO E RETAMAL 1991) de acordo com

o descrito em material e método no item 3.5, onde o resultado desta análise teve

como diferença 3 proteínas, sendo estas de 68 e 46 kDa para o material de macho e

35 kDa para fêmea. Este achado corrobora o que foi descrito por BRADLEY (1989);

que existe diferença na constituição protéica do tecido de macho para fêmea, o que

também vem corroborar com o que disse MÜLLER (1996); que o antígeno H-Y,

como um antígeno de histocompatibilidade de macho, causa rejeição no transplante

de pele de macho para fêmea da mesma linhagem de roedores, e o antígeno H-Y

estar presente na membrana da maior parte das células dos machos.

Para a primeira parte do trabalho, não obtivemos resultados satisfatórios, pois

os monoclonais produzidos a partir das proteínas de membrana de leucócitos não

apresentaram resposta contra as proteínas de membrana de células espermáticas.

Provavelmente, os antígenos sexo-específicos encontrados nas células leucocitárias

apresentavam-se de forma ou composição diferentes daqueles encontrados nos

espermatozóides. A composição das proteínas de membrana espermática variam

entre células de acordo com o grau de maturidade, como demonstrado por

RETAMAL et al. (2000).

Estes fatos talvez sejam os responsáveis pelo insucesso da produção do

monoclonal a partir de proteínas de membrana de leucócitos. Partimos, então, para

a segunda parte do trabalho, que foi a pesquisa do antígeno HY na membrana de

espermatozóides. Embora sabendo da pouca antigenicidade do antígeno HY, e que

muitos pesquisadores não obtiveram resultados satisfatórios na busca da sexagem

dos espermatozóides, como já descrito por KOO (1981), que somente 30% das

fêmeas de camundongos imunizadas produziam um soro com alto título de anticorpos

anti HY, mesmo assim, achamos válida a pesquisa do antígeno HY em membrana de

espermatozóides de eqüino.

Partindo do fato, relatado por EDIDIN e JOHNSON (1977), e COHEN e

HENDRY (1978), de que inoculações de células espermáticas de várias espécies no

coelho provocam a produção de anticorpos que puderam ser verificados in vitro a

partir da aglutinação de espermatozóides, foi dado início, então, à segunda parte do

trabalho.

36

Esta etapa foi a de determinar as proteínas sexo-específicas utilizando-se

soro de camundongos e coelhos (macho e fêmea) e soro de égua através do teste

de Western-blotting, verificando-se as bandas marcadas no papel de nitrocelulose.

Após as inoculações com as células espermáticas íntegras, soros de

camundongos e coelhos (machos e fêmeas) e soro de égua foram testados por

western-blotting, quando foi verificada a presença de 3 proteínas, 19, 21 e 35 kDa,

sendo que esta apresentação variava de acordo com o segundo anticorpo utilizado.

Quando o imunobloqueio era realizado utilizando-se anticorpos de macho ou de

fêmea, os resultados não variavam. Entretanto, quando o segundo anticorpo

utilizado era proveniente de macho ou de fêmea, houve diferenças acentuadas. Se o

segundo anticorpo utilizado era proveniente de animais de sexo masculino,

observavam-se as três proteínas supracitadas, e quando o segundo anticorpo era

proveniente de animais do sexo feminino, apenas a proteína de 21 kDa era

evidenciada.

O fato da proteína de 21 kDa estar evidente de forma exclusiva quando o

segundo anticorpo era proveniente de fêmeas, nos faz imaginar que esta proteína

seja o antígeno HY ou macho específico. Em relação às proteínas de 35 kDa e de

19 kDa, estas provavelmente são evidenciadas pelo mau bloqueio produzido pelo

anticorpo primário ou pelo não-reconhecimento do segundo anticorpo quando este

era proveniente de fêmea, por se tratar de um antígeno fêmea específico.

Comparando-se os resultados obtidos neste trabalho com proteínas de

membrana de leucócitos e de membrana de espermatozóides, podemos supor que a

proteína de 35 kDa encontrada no material de membrana de leucócito de fêmea foi

semelhante à proteína de 19 e 35 kDa encontrada na membrana de

espermatozóides. Podemos, também, supor que a proteína de 19 kDa encontrada

seria um monômero, enquanto que as proteínas de 35 kDa seriam um dímero desta.

Já a proteína de 21 kDa, encontrada na membrana de espermatozóides,

apresentava-se como monômero das proteínas de 46 e 68 kDa encontradas na

membrana de leucócitos de machos.

Estas proteínas que foram determinadas como sexo-específicas para eqüino,

são de fundamental importância para posteriores estudos da sexagem de

espermatozóides, sendo necessário fazer subclonagens destes clones para uma

melhor especificidade do anticorpo para com o antígeno.

37

6. CONCLUSÕES

1- Verificou-se a grande dificuldade da produção de monoclonais a partir de

proteínas de membrana de leucócitos contra as proteínas sexo-específicas de

membrana de espermatozóides de eqüino.

2- Verificou-se a baixa antigenicidade das proteínas sexo-específicas de eqüino.

3- Obteve-se a produção de três monoclonais contra a proteína de membrana de

células espermáticas de eqüinos, sendo estes dois monoclonais para a proteína de

19 kDa e um monoclonal para a proteína de 21 kDa.

38

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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APÊNDICES

Tabela 1A: Preparação dos géis utilizados na separação das proteínas purificadas de membrana de leucócitos e espermatozóides eqüinos.

Gel �

Soluções ↓↓↓↓

Migração (12%) Concentrador (4%)

Água destilada 16,4 ml 6,8 ml

Tris base/Hcl → pH 8,8

12,5 ml ----

Acrilamida/Bis. 30% 20,0 ml 1,7 ml

PSA 10% 400 µl 50 µl

TEMED 200 µl 40 µl

Tris base/Hcl → pH 6,3

---- 1,25 ml

Tabela 2A: Reagentes (soluções estoque) utilizados para a preparação dos géis em gradiente para a separação das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.

Solução 1,5 M Tris base/HCl, pH 8,8

1,5 M Tris base/HCl, pH 8,8 181,65 g / L

SDS a 0,4 % p / v 4 g / L

Solução 0,5 M Tris base/HCl, pH 6,3

0,5 M Tris base/HCl, pH 6,3 60,55 g / L

SDS a 0,4 % p / v 4 g / L

Solução PSA – Estoque

Persulfato de amônio a 10 % 100 g / L

Acrilamida/Bis. estoque (30%)

Acrilamida 29,2 g

Bis-acrilamida 0,8 g

Água destilada q.s.p. 100 mL

Tabela 3A: Tampões utilizados para a preparação dos géis em gradiente para a separação das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.

Tampão c/ SDS, pH 8,3

Tris base 30,28 g

Glicina 142,0 g

SDS 10,0 g

Água destilada q.s.p. 1000 mL

Tampão de amostra

Água destilada 3,0 mL

Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 1,0 mL

Glicerol 1,6 mL

SDS a 10 % (p / v) 1,6 mL

Beta-mercaptoetanol 0,4 mL

Azul de bromofenol 0,4 mL

Tabela 4A: Coloração do gel com azul brilhante de Coomassie, (REISNER et. al.,

1984), contendo o perfil eletroforético das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.

Solução de coloração

Azul brilhante de coomassie R-250 0,5 g

Metanol 250,0 mL

Ácido acético 50,0 mL

Água destilada q.s.p. 500,0 mL

Tabela 5A: Protocolo de imunização para a produção de anticorpos monoclonais.

Imunização Dias antes da fusão Via de Inoculação Inoculo

1 -15 IP* 50µg de Ag/0,1 mL

de PBS + 0,1 ml de Adj.

Compl. de Freund

2 -8 IP* 50µg de Ag/0,1 mL

de PBS + 0,1 ml de Adj.

Compl. de Freund

3 -5 IP* 50µg de Ag/0,1 mL

de PBS + 0,1 ml de Adj.

Compl. de Freund

4 -2 IP*

IV**

2,5µg de Ag/0,1 mL

de PBS, 2,5µg de Ag/0,1

ml soro fisiológico

IP* Intraperitoneal

IV** Intravenosa

Tabela 6A: Tampão de eletro-transferência utilizado na técnica de Western-blotting para se evidenciar as proteínas sexo-específicas.

Tampão de transferência

Tris 3,03 g

Glicina 15,50 g

Metanol 100,0 mL

Água destilada q.s.p 1000 mL