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8/16/2019 Produção de etanol a partir de xilose por fermentação contínua
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Seminário em Biotecnologia I
Victor Teixeira Noronha
Docente: Benildo Cavada
Junho - 2015
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Introdução
Aumento da viabilidadeeconômica: fermentaçãode hexoses e pentoses
Microrganismos
Problemas de aplicaçãoà escala industrial
Desvantagens damodificação genética
Composição dabiomassa de materiais
lignocelulósicos
celulose hemicelulose
lignina outros
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Fermentaçãoindustrial:•pH – 4-5•T – 30-35°C
GI:•pH – 7-8•T – 70°C
Introdução
Glicose
Isomerase(EC.5.3.1.5)
Aplicações
Características
Deslocamento do
equilíbrio
Estrutura de raios-X em temperatura ambiente de D-xiloseisomerase em complexo com iõns 2Mg2 + xilitol e a pH 7,7.Kovalevsky, et al., 2012,
D-xilose D-xilulose
5:1
Xylose SIF : pH~temperatura~taxa enzima/levedura
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Introdução
Imobilização
Recuperação e
reutilização Quitosana
Glutaraldeído
Aumento da estabilidade
térmica Imobilização estável:
altas taxas de enzima no
reator
Sistema imobilização-estabilização: ligação covalente amino (enzima)-aldeído (suporte). Vieira, 2009.
Estrutura química de quitosana reticulada comglutaraldeído. Vieira, 2009.
Estrutura da quitosana. Disponivel em: http://quitosana.zip.net/images/Chitosan-chemie.jpg
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Objetivo
Imobilizar GI em quitosana, utilizando glutaraldeído
como ativador, caraterizando este derivado no que diz
respeito às suas propriedades catalíticas e potencial
para ser utilizados no processo de SIF da xilose, bem
como co-imobilizar o derivado com S. cerevisiae em gel
de alginato de cálcio, a fim de avaliar a produção de
etanol a partir de xilose em uma isomerização
simultânea com um processo de fermentação.
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Métodos
Preparação de grânulos de quitosana-glutaraldeído
1) Quitosana em pó (2%) + sol. Ác. Acético 2% (v/v)
Δ a 50ºC Solução
+ KOH0,5M
(3:2) emagitação
por 30min
Solução
+Glutaraldeído
0,8% (v/v);
Agitação a50ºC por30min
Sol. +Quitosanacoagulada
Filtração sobvácuo elavagem
Suporte
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Imobilização de glicose-isomerase
Extrato de enzima +tampão
Retirada de amostrapara controle
Adição de suporte naproporção m/v 1:10,sob agitação a 150
rpm
Testes: Tempo deimobilização→ 3, 24
e 43h; Carga deenzimas → 30, 50 e70 mgenzima·g-1
suporte
Determinação daatividade enzimática
e concentraçãoproteica
Adição de hidroboratode sódio (1 mg·mL-1)
por 30min
Filtração à vácuo elavagem dos derivados
Armazenagem dosderivados em tampãoTRIS-maleato 50mM,
pH 7
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Eletroforese
O extrato enzimático de glicose isomerase (GENSWEET® SGI) foi analisada por SDS-PAGE
Isomerização de xilose
• Xilose (60 g × L-1)• Níveis de xilose e xilulose
determinados
Catalisada por GI solúvel eimobilizada a 30 ◦ C e pH 5.0
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Co-imobilização de derivado IGI-Ch e leveduraem gel de alginato
Levedura comercial +sol. 20 gglicose·L-1 +
nutrientes =LEVEDURA DE
INÓCULO
Centrifugação;filtração;
determinação do teorde umidade
Levedura +quitosana-
glutaraldeídocontendo glicose
isomeraseimobilizada (IGI-Ch)
Sol. 1% Alginatode sódio
Sol. 5% Alginatode sódio
Sol. 13%Alginato de
sódio
Suspensão + 0.25 MCaCl2/0.25 M MgCl2
Partículas esféricas
(φ=1-1,5mm)
Partículas curadas emrefrigerador por 18-20h
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Isomerização e fermentaçãosimultânea da xilose
1 g catalisador × ml-1 meio, a 35 ◦ C, o pH inicial
de 5,3 e 150 rpm.
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Atividade da glicose isomerase:
Medição da Vo da isomerização da frutose em glicose; Concentração de proteína:
Abumina de soro bovino (BSA) como padrão;
Análise do substrato e dos produtos do ensaio SIF:
Xilose, xilulose, xilitol, glicerol, etanol e ácido acético;
Refratometria e HPLC;
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Imobilização da glicose isomerase
Cinética da GI imobilizada em quitosana ativada comglutaraldeído
30 mg proteína/g suporte
50 mg proteína/g suporte
70 mg proteína/g suporte
• Extrato apresenta outras enzimas.
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Imobilização da glicose isomerase
SDS - PAGE
Proteínas de menorpeso molecular
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Imobilização da glicose isomerase
• Concentração máxima de proteína após 20h: 47 mg prot/gder.
• Concentração máxima de proteína após 43h: 68 mg prot/gder.
• Atividade recuperada > 90%
• Atividade da enzima imobilizada da melhor variação doexperimento: 1700 IU/gder.
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Influência do pH e da temperatura sobre a atividade de GI:
SGI e IGI-Ch; Para pH fixo de 7,0 – T de 30 a 90 ºC;
Para T fixo de 60 ºC – pH de 5 a 9;
% de atividade máxima obtida.
Estabilidade da GI:
SGI e IGI-Ch a 80 ºC;
Determinação da atividade enzimática residual.
Influência da concentração de etanol na atividade GI:
SGI e IGI-Ch em diferentes concentrações de etanol;
0 a 70 g/L.
pH 5, 35 ºC, 150 rpm
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Determinação da atividade: ensaios de reciclagem de IGI-Ch:
IGI-Gh avaliada em 3 bateladas;
Estabilidade de GI em condições de operação da SIF de xilose:
GI solúvel e imobilizada;
pH 5, composição do ensaio da isomerização da xilose;
Condições padrões a diferentes tempos de incubação;
% de atividade inicial.
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Influencia do pH e da temperatura na actividade daglicose isomerase
Temperatura pH
• pH 5, temperatura ~ 30ºC• Alta carga de enzimas.•
Suporte extremamente ativado.
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Inativação térmica
• Imobilização confere estabilidade.• Imobilização branda.
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Influência da concentração de etanol sobre aactividade da glicose isomerase (GI), nas condições
de operação da SIF da xilose
• Etanol: deslocamento do equilíbrio.• Baixa atividade em pH 5 a 30ºC.
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Estabilidade da GI nas condições de operação doprocesso de SIF da xilose
• Dessociação das subunidades.• Etanol e outros nutrientes não interferem na atividade enzimática.
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• Confirmar a existência de ligações covalentes entreenzima e suporte – baixa perda de atividade.
• Avaliação da atividade residual depois de cada batelada
de isomerização de frutose.
Ensaio de reciclagem utilizando GI imobilizada
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Isomerização de xilose a xilulose em pH 5 a 30ºC
GI solúvel
GI imobilizadacom levedura
GI imobilizada
Processo conduzido nas condições de fermentação.4 h: equilíbrio químico
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Isomerização e fermentação simultânea da xilose
xilitol
etanol
xilulose
Produtividade = 0,25 getanol /L x hConversão de xilose = 75,4 %Seletividade etanol/xilitol = 1,26
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• Processo SIF – controlado pela isomerização.
• Inibição da isomerização por xilitol, glicerol e ácido acético.
• Baixo pH: desativação da GI.
• pH <= 5: dissocição de subunidades de GI e agregação
irreversível de enzimas
Isomerização e fermentação simultânea da
xilose
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Optimização do processo
• Aumento da concentração de enzimas no biocatalisadorfinal.
• Controle de pH.
• Utilização de tetraborato de sódio (deslocamento doequilíbrio).
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Conclusões
Derivado de IGI-Ch catalisa a isomerizaçãoxilose/xilulose (pH=5, T= 30-35ºC) ao contrário da GIsolúvel.
Sucesso no processo simultâneo de isomerização efermentação alcoólica de xilose.(pH=5,3 , T=35ºC)
Alta atividade enzimática = “beads” (pequenas) dequitosana.
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Conclusões
Viabilidade industrial:
Elevado potencial para produção continua de etanol apartir de xilose por S. cerevisiae.
Necessita de estudos para otimizar o processo da SIF
xilose.