PRODUÇÃO DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE A …sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2004/BID04001OCR.pdf · 2.3.3 - fontes de obtenÇÃo e mÉtodos para liberaÇÃo da enzima_

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

PRODUÇÃO DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE

PALHA DE ARROZ POR Candida guilliermondii

Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca

Universitária em Junho/2004 Proc. nº 202/04

Lorena - SP - Brasil 2004

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

PRODUÇÃO DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE PALHA DE

ARROZ POR Candida guil/iermondii

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Ora. Inês Conceição Roberto Dr. Roberto da Silva Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres

Estudante:

Daniela de Borba Gurpilhares

Lorena - SP - Brasil 2004

ii

1 ;

. -. - -~

iii

Agradeço a Deus, a meus pais e todas as pessoas que me apoiaram e incentivaram; tornando-se importantes para mim durante esse período.

iv

AGRADECIMENTOS

À Profa. Ora Inês Conceição Roberto, não somente pela orientação neste

trabalho, mas também pelos constantes incentivos, pela dedicação, apoio e

confiança durante a realização do trabalho;

Aos Professores Doutores João Batista, Maria das Graças Felipe e

Adriane Milagres, pelo valioso conhecimento transmitido e pela amizade;

A todos os funcionários do DEBIQ que, de um modo ou de outro, foram

responsáveis por parte deste trabalho, principalmente à Rita, ao Paulinho e

Nicamor, pelos auxílios prestados dentro e fora do laboratório como também

pelo carinho;

Aos alunos, por compartilharem o conhecimento adquirido e os bons

momentos;

À FAPESP e CAPES, pela bolsa concedida;

A todos aqueles que aqui não foram citados, mas de uma forma ou de

outra, colaboraram para a realização do meu trabalho.

V

ÍNDICE

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE FIGURAS viii

LISTA DE NOMENCLATURAS --------------------- X

1 - INTRODUÇÃO 1 ------------------------- 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4

2.1 - MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 4 ------------------- 2. 1. 1 - COMPOSIÇÃO E CARACTERÍSTICAS DO MATERIAL LIGNOCELULÓSICO_ 4 2.1.2- POTENCIAIS Usos DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 7 2.1.3 - OBTENÇÃO DO HIDROLISADO HEM/CELULÓSICO 9

2.2 - METABOLISMO DE XILOSE EM LEVEDURAS 11 --------------- 2.3 - GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PDH) 13

2.3.1 - IMPORTÂNCIA FISIOLÓGICA 13 2.3.2- PRINCIPAIS APLICAÇÕES 14 2.3.3 - FONTES DE OBTENÇÃO E MÉTODOS PARA LIBERAÇÃO DA ENZIMA_ 15 2.3.4 - INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO 18

3 - OBJETIVOS 20

4- MATERIAIS E MÉTODOS 22

4.1 - PREPARO DA MATÉRIA PRIMA 22

4.2 - OBTENÇÃO E TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO 22

4.3 - MICRORGANISMO 23

4.4 - PREPARO DO INÓCULO 23

4.5 - ESTUDO DAS CONDIÇÕES DE ROMPIMENTO CELULAR 24

4.6- PROCESSO FERMENTATIVO 24 4.6.1 - MEIO DE FERMENTAÇÃO 24 4.6.2 - CONDIÇÕES DE CULTIVO 25 4.6.3-METODOLOGIA ESTATÍSTICA 25

4.7 - MÉTODOSANAlÍTICOS 27 4. 7.1 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR 27 4.7.2 • DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE, XILOSE, ARABINOSE XILITOL E ÁCIDO ACÉTICO 28 4. 7.3 • DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 28 4.7.4 • DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS TOTAIS 29

4.8 - METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS 29

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 32

5.1 - OBTENÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE PALHA DE ARROZ 32

5.2 - ESTUDO DO ROMPIMENTO DAS CÉLULAS DE CANO/DA GUILLIERMOND/1 34

5.3 - ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE VARIÁVEIS DO PROCESSO FERMENTATIVO NA PRODUÇÃO DE GUCOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE 46

vi

5.4 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DO EFEITO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE XILOSE, PH E NÍVEL DE INÓCULO NA PRODUÇÃO DA ENZIMA G6PDH E DE XILITOL 53

5.5 - MODELAGEM MATEMÁTICA PARA ESTIMAR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DE GLICOSE-6- FOSFATO DESIDROGENASE EM FUNÇÃO DAS VARIÁVEIS SIGNIFICATIVAS AO PROCESSO FERMENTATIVO 57

6 - CONCLUSÕES 62 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~- 7 - PREVISÕES FUTURAS 64 8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 65

vu

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Alguns exemplos de produtos obtidos a partir da

fermentação de xilose a Tabela 2.2. Eficiência dos métodos de rompimento celular em diferentes

tipos de células (BECKER et ai., 1996) 16

Tabela 4.1. Matriz de planejamento experimental 23, com pontos

intermediários, para investigar o efeito do pH inicial,

concentração de xilose e do nível de inóculo nos parâmetros fermentativos de produção da enzima _ 26

Tabela 4.2. Nível de probabilidade e notação a ser utilizada para cada

nível de significância, no planejamento efetuado _ 27

Tabela 5.1. Composição do hidrolisado hemicelulósico obtido por hidrólise ácida da palha de arroz _

Tabela 5.2. Valores de atividade específica de glicose-6-fosfato

desidrogenase (G6PDH) para diferentes microrganismos em

diferentes métodos de rompimento 45

Tabela 5.3. Consumo percentual dos açúcares, fator de conversão de

33

xilose em xilitol (Yp1s), e atividade específica da glicose-6-

fosfato desidrogenase (U/mgprotetna) obtidos no tempo final de

fermentação 52

Tabela 5.4. Produção máxima de xilitol cPxmto1) e atividade específica de

G6PDH (U/mgproteina) obtidas no planejamento fatorial 23 para

avaliação da influência do pH inicial, concentração de xilose e

nível de inóculo na produção da enzima glicose-6-fosfato

desidrogenase por Candida guil/iermondii cultivada em

hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz

55 Tabela 5.5. Análise da variância para o modelo representativo da atividade

específica de G6PDH de células de Candida guil/iermondii

58

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura simplificada da fibra de materiais lignocelulósicos

(SHLESER, 1999) 5

Figura 2.2. Estrutura química parcial da hemicelulose (FENGEL &

WEGENER, 1989) 6

Figura 2.3. Representação esquemática do metabolismo de xilose em

leveduras (adaptado de GÍRIO et ai., 1994) 11

Figura 2.4. Diferentes estruturas de paredes celulares de microrganismos (SCHMIDELL et ai., 2001) _

Figura 4.1. Representação esquemática da atuação da enzima G6PDH

na reação para determinação de atividade enzimática _

Figura 5.1. Porcentagem de células rompidas em função da concentração

das suspensões celulares empregando tempos de agitação em

vórtice de 1, 3 e 5 minutos. Número de células intactas(-•-) e

00600 <-•-> 37

17

28

Figura 5.2. Porcentagem de células rompidas em função do tempo de

rompimento empregando diferentes concentrações celulares _ 38

Figura 5.3. Proteínas totais (-Ã-), atividade volumétrica (-•-) e atividade

específica (-0-) de glicose-6-fosfato desidrogenase, obtidas

após o rompimento de diferentes concentrações celulares de

Candida guillierrnondii empregando o tempo de agitação em

vórtice de 1 minuto ~~~~~~~~~~~~~~~~ 41




Candida guillierrnondii empregando o tempo de agitação em

vórtice de 3 minutos 42

Figura 5.5. Proteínas totais (-Ã-), atividade volumétrica {-•-) e atividade



Candida gui/lierrnondii empregando o tempo de agitação em

vórtice de 5 minutos ~~~~~~~~~~~~~~~- 43

Figura 5.6. Consumo de D-xilose (A) e produção de células (8), xilitol {C),

glicose-6-fosfato desidrogenase (D) por Candida guil/iermondii

empregando hidrolisado hemicelulósico com concentração

ix

inicial de D-xilose de 30 g/L sob diferentes condições de

cultivo. Ensaio 1: inóculo de 1 g/L e pH inicial de 4,5 (- •-),

ensaio 2: inóculo 1 g/L e pH 7,5 (-•-). ensaio 5: inóculo 3 g/L e

pH 4,5 (- ... -), ensaio 6: inóculo 3 g/L e pH 7,5 (-T-)

47

Figura 5.7. Consumo de D-xilose (A) e produção de células (B), xilitol (C),



inicial de D-xilose de 70 gil sob diferentes condições de

cultivo. Ensaio 3: inóculo de 1 g/L e pH inicial de 4,5 (-•-).

ensaio 4: inóculo 1 g/L e pH 7,5 (-•-), ensaio 7: inóculo 3 g/L e

pH 4,5 (- ... -), ensaio 8: inóculo 3 g/L e pH 7,5 (-T-) 49




inicial de D-xilose de 50 g/L sob diferentes condições de

cultivo. Ensaios 9, 10 e 11: inóculo de 2 g/L e pH inicial de 6,0, ensaios do ponto central(-•-).(-•-),(- ... -) _

Figura 5.9. Gráfico de Pareto para os efeitos das variáveis pH inicial,

concentração de xilose e nível de inócuto nas respostas

atividade específica da enzima G6PDH (A) e produção máxima

de xilitol (B) 56

50

Figura 5.10. Gráfico dos valores previstos pelo modelo linear em função dos

valores observados para a resposta atividade específica de

G6PDH 60 Figura 5.11. Atividade específica de glicose-6-fosfato desidrogenase em

função da concentração de xilose e do pH, usando 1 g/L de

61

Abreviaturas

Yp1s

Yxts

Ox

Qp

Pxmtol

X

G6PDH

t

rpm

ANOVA

LISTA DE NOMENCLATURAS

Fator de conversão de xilose em xilitol (g/g)

Fator de conversão de substrato em células (g/g)

Produtividade em células (g/L.h)

Produtividade em xilitol (g/L.h)

Produção máxima em xilitol (g/L)

Atividade volumétrica (U/L)

Atividade específica (U/mgproteina)

Densidade ótica a 600 nm

Concentração celular (g/L)

Glicose-6-fosfato desidrogenase

tempo

Rotações por minuto

Análise de variância

XI

RESUMO Produção de glicose-6-fosfato desidrogenase a partir de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz por Candida guil/iermondii. Daniela de Borba Gurpilhares. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dra. Inês Conceição Roberto (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dr. Adalberto Pessoa Jr. (Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP). Banca examinadora: Dr. Roberto da Silva e Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres. Janeiro de 2004.

Este projeto teve como objetivo avaliar a produção da enzima glicose-6- fosfato desidrogenase (G6PDH), por processo fermentativo, empregando a levedura éandida guil/iermondii FTl20037, em meio constituído de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz.

Inicialmente, foram realizados ensaios de rompimento celular empregando esferas de vidro sob agitação em vórtice, variando o tempo de rompimento e a concentração celular da suspensão de forma a se obter uma eficiente liberação da enzima. Este estudo preliminar revelou que as melhores condições de rompimento foram o tempo de 5 minutos de agitação em vórtice e concentração celular de 11,6 g/L, alcançando uma atividade específica de 0,96 U/mgproteína- Em etapa posterior, os ensaios fermentativos foram realizados com o objetivo de se avaliar o efeito do pH inicial do meio (X,) em combinação com outras variáveis do processo na produção da enzima, nomeadamente a concentração inicial de xilose (X2) e o nível de inóculo (~). Para atingir os objetivos deste projeto, foi utilizada a metodologia do planejamento experimental. Com esta metodologia foi possível estabelecer um modelo matemático para descrever a produção de G6PDH, em atividade específica, por Candida guilliermondii. O modelo previsto para esta resposta, em função das variáveis estudadas e do efeito interativo entre elas, é dado pela equação:

sendo previsto pelo modelo uma atividade específica máxima de 0,64 U/mgproteína, podendo ocorrer uma variação de 0,55 a 0, 72 U/mgprcxeína, dentro do intervalo de confiança de 95%.

Para o ensaio de validação do modelo, realizado nas condições de 70 gil de xilose, pH 7,5 e nível de inóculo de 1 g/L, obteve-se Ae=0,60 U/mgproteína, revelando que o modelo proposto é adequado para descrever essa resposta na região em estudo.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam o potencial da levedura Candida guilliermondii na produção da enzima G6PDH, em substratos de baixo custo.

xii

ABSTRACT

This work was focused on the evaluation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) production, by fermentation process, employing yeast cells of Candida guilliermondii FTI 20037, in growth medium of hemicellulosic hydrolysates from rice straw.

lnitially, cell disruption assays were performed employing glass beads under vortexing agitation, varying the disruption time and the concentration of cell suspension in the way of obtaining an efficient releasing of the enzyme. This preliminary study revealed that the best disruption conditions employed were time of vortexing agitation of 5 minutes and cell concentration of 11,6 g/L, reaching a specifc activity of 0,96 U/mgprotein· At the next study, the fermentation assays were performed in shaking flasks with the aim of evaluate the effect of the initial pH of the media (X1) in combination with other process variables that could interfere in the enzyme production, namely initial xylose concentration (X2) and the levei of inoculum (X:3). To reach the aim of this project, it was used the methodology of the experimental design. This methodology enabled to find a mathematical model to describe the G6PDH production, in specific activity, by Candida guilliermondii. The model obtained for this response, as a function of the studied variables and the interactive effect between them, was as follows:

being adjusted by the model, the highest specific activity of 0,64 U/mgprotein, that could vary from 0,55 to 0,72 U/mgprotein, at the confidence levei of 95%.

To the validation of the model, an assay was performed at xylose concentration of 70 g/L, pH 7,5 and levei of inoculum of 1 g/L, reaching a specific activity of 0,60 U/mgprotein wich revealed that the proposed model is suitable to describe this response at the tested range.

The results obtained in this work confirm the potential of the yeast Candida guilliermondii in the enzyme (G6PDH) production, in low cost substrate.

1 - INTRODUÇÃO

Devido à necessidade da diminuição do impacto ambiental e ao

aproveitamento racional de fontes renováveis, como resíduos agrícolas e

florestais, estes materiais têm sido amplamente utilizados como matéria-prima

para geração de energia, ração animal e principalmente como fonte de

carboidratos para processos de bioconversão. O emprego de processos

biotecnológicos de modificação destas matérias-primas ( conversão

microbiológica ou enzimática) constituem o objetivo de estudos de vários

grupos de pesquisa no Brasil e em outros países. Entretanto, a utilização de

materiais lignocelulósicos somente terá interesse comercial se todas as suas

frações forem devidamente aproveitadas, principalmente a fração

hemicelulósica, haja vista que apenas o componente celulósico tem sido

tradicionalmente utilizado em processos industriais. A fração hemicelulósica, ao

contrário da fração celulósica, apresenta variações quanto a sua estrutura e

composição sendo composta basicamente de hexases (D-glicose, D-manose,

D-galactose), pentases (D-xilose e L-arabinose), ácidos D-glicurônicos e

grupos acetilas. A xilose, principal componente desta fração, tem sido

amplamente utilizada em processos de bioconversão visando à obtenção de

produtos como combustíveis, aditivos, ácidos orgânicos, proteína microbiana,

pigmentos e várias enzimas de interesse comercial.

Em decorrência da expansão do uso industrial de enzimas, tem surgido

grande interesse, nos últimos anos, na produção das mesmas. Recentemente,

'-.

2

tem surgido um mercado lucrativo para enzimas microbianas intracelulares,

principalmente na área da saúde como reativos em diagnóstico clínico e em

biotransformação de produtos químicos e farmacêuticos. A glicose-6-fosfato

desidrogenase é um importante exemplo de enzima microbiana utilizada em

diagnóstico clínico.

A glicose-6-fosfato desidrogenase - G6PDH (EC 1.1.1.49) desempenha

um papel fundamental na via das pentases fosfato, a qual catalisa a oxidação

da glicose 6-fosfato (G6P) em 6-fosfogliconato, gerando cofatores reduzidos

(NADPH). Esta enzima tem se mostrado importante em estudos bioquímicos e

médicos, apresentando grande interesse como reagente analítico, pois pode

ser usada em diversas análises quantitativas. Embora a G6PDH possa ser

encontrada em diversos tecidos animais e vegetais, o uso de microrganismos

como fonte de enzimas tem se tornado bastante atraente, principalmente

devido à possibilidade da utilização de matérias-primas renováveis para os

cultivos celulares.

A obtenção de produtos intracelulares, principalmente de enzimas

microbianas, tem representado um problema prático em relação aos processos

de purificação destas biomoléculas. Os processos para a separação de tais

produtos geralmente envolvem rompimento, mecânico ou químico, das células,

seguido da remoção dos fragmentos celulares e de alguns contaminantes por

centrifugação ou filtração em membrana. Além disso, a obtenção dos produtos

intracelulares pode ser influenciada de modo significativo através de variáveis

do processo fermentativo como, concentração de substrato, pH do meio, nível

de inóculo, concentração de oxigênio dissolvido, dentre outras.

Dentro deste contexto, o presente projeto visa estudar o processo de

produção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) por processo

fermentativo, empregando a levedura Candida guilliermondii cultivadas em

hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz.

O presente trabalho se insere no programa de pesquisa do Grupo de

Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da

Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL), em cooperação

com a Universidade de São Paulo (Departamento de Tecnologia Bioquímico-

Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas) que tem como objetivo

o desenvolvimento de tecnologia para o aproveitamento da fração

' - . --

3

hemicelulósica de resíduos agroindustriais visando a produção de insumos por

via biotecnológica, dando ênfase aos estudos de produção e purificação de

enzimas intracelulares, em particular, a enzima G6PDH.

4

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 - MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

2.1.1 - Composição e Características do Material Lignoce/u/ósico

Os principais componentes orgânicos dos materiais lignocelulósicos são

a celulose, a hemicelulose e a lignina, em proporções que dependem da

espécie vegetal e outras variações biológicas, como diferenças genéticas

dentro da própria espécie, e condições de crescimento (FENGEL &

WEGENER, 1989; GOLDSTEIN, 1981 ).

O termo estrutura lignocelulósica refere-se a parte do vegetal que forma

a parede celular, composta basicamente por carboidratos ( celulose e

hemicelulose) os quais estão ligados a uma estrutura contendo substâncias

aromáticas, denominada lignina. A Figura 2.1 apresenta a estrutura simplificada

da fibra de materiais lignocelulósicos.

5

Lignina

Parede celular do vegetal

Fibras de celulose

Figura 2.1. Estrutura simplificada da parede celular vegetal de materiais

lignocelulósicos (SHLESER, 1999)

A celulose é um homopolímero linear de unidades repetidas de 0-

glicose com ligações f3(1 ~4) de elevado peso molecular e alta cristalinidade.

Sua função na natureza é estrutural, sendo o principal componente da parede

do vegetal onde atua como suporte para a membrana celular (GOLDSTEIN,

1981; KUHAD & SINGH, 1993). A estrutura cristalina do material celulósico

constitui um dos principais obstáculos para a sua hidrólise, independente do

método de extração empregado (PARIS!, 1989).

A lignina constitui um polímero complexo de estrutura polifenólica e não

convertida em açúcares fermentáveis (LADISCH, 1979). Este complexo atua

como um "cimento" entre as fibras oferecendo barreira à degradação

enzimática do material celulósico (GOLDSTEIN, 1981 ).

A hemicelulose é, depois da celulose, o complexo orgânico natural de

maior ocorrência na biosfera. Este complexo está presente em todas as

camadas da parede celular do vegetal, porém concentrado nas camadas

primárias e secundárias, onde ocorre em associação com a celulose e a lignina

6

(BISARIA & GHOSE, 1981). A Figura 2.2 mostra a estrutura simplificada da

hemicelulose.

a-Arabinofuranose

Figura 2.2. Estrutura química parcial da hemicelulose (MUSSATTO, 2002)

Ao contrário da celulose, as hemiceluloses apresentam variações quanto

a sua estrutura e composição sendo constituída de polímeros heterogêneos

com cadeias lineares apresentando ramificações laterais. Estes polímeros são

compostos basicamente de hexases (D-glicose, D-manose e D-galactose),

pentases (D-xilose e L-arabinose), ácidos D-glicurônicos e grupos acetilas

(KUHAD & SINGH, 1993). As cadeias das hemiceluloses são de menores

dimensões que as da celulose apresentando grau de polimerização

normalmente menor que 200 (GONG et ai., 1981a). Além dos três

componentes majoritários, a parede celular da biomassa vegetal apresenta

outros constituintes, em menor proporção, que são classificados como

extrativos (ácidos graxos, resinas, taninos, etc.) e não-extrativos (sílica,

oxalatos, carbonatos, etc.) que variam suas composições de acordo com cada

espécie de material (KUHAD & SINGH, 1993).

7

2. 1.2 - Potenciais Usos dos Materiais Lignocelulósicos

Atualmente existe grande tendência em obter-se uma utilização mais

eficiente de resíduos agroindustriais (PANDEY et ai., 2000). O desenvolvimento

da tecnologia para o uso dessa biomassa renovável e a tentativa de diminuir o

impacto adverso sobre o meio ambiente tem-se mostrado importantes (SUN et

ai., 2000). Os materiais lignocelulósicos sob a forma de resíduos agrícolas e

florestais são acumulados anualmente, no mundo, em grandes quantidades.

Devido a sua natureza renovável e ao seu baixo custo, estes materiais têm sido

amplamente utilizados como matéria prima para geração de energia, ração

animal e principalmente como fonte de carboidratos para processos de

bioconversão (KUHAD & SINGH, 1993). De acordo com PARIS! (1989) a

utilização de materiais lignocelulósicos somente terá interesse comercial se

todas as suas frações forem devidamente aproveitadas, principalmente, a

fração hemicelulósica, haja vista que apenas o componente celulósico tem sido

tradicionalmente utilizado em processos industriais.

Segundo PARAJÓ et ai. (1994) consideráveis esforços têm sido

dispensados para o desenvolvimento de novos processos para a utilização

destes materiais. As novas tecnologias devem satisfazer a várias exigências,

tais como (i) possibilidade econômica, (ii) alta eficiência no processamento da

matéria prima, (iii) alta seletividade na separação das frações, e (iv) baixo

impacto ambiental.

Dentre os materiais lignocelulósicos considerados como potenciais

fontes alternativas para geração de diferentes produtos de interesse econômico

e social podem ser destacados o bagaço de cana de açúcar e a palha de

diversos cereais (dU TOIT et ai. 1984, WILKE et ai. 1981). Segundo GRAJEK

(1988), a conversão destes materiais em produtos de valor econômico constitui

um processo de grande importância para o futuro da humanidade.

A palha de arroz é um dos principais resíduos lignocelulósicos no

contexto brasileiro. Segundo dados da Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária (Embrapa), cerca de 14 milhões de toneladas de palha de arroz

foram produzidos na safra de 1995/96. Este resíduo contém uma fração

hemicelulósica de aproximadamente 25%, rica em xilose a qual vem sendo

utilizada principalmente para a obtenção de xilitol por via biotecnológica

(ROBERTO et ai., 2002). A palha de arroz tem sido utilizada , também, na

produção de combustíveis líquidos, fibras, ou na geração de energia (KADAM

et ai., 2000). No oriente, onde o arroz e o trigo são intensamente cultivados, a

palha é o principal recurso utilizado na alimentação animal, e na produção de

combustíveis domésticos e fibras de celulose (MISRA et ai., 1993).

Nos últimos anos, vários trabalhos vêm sendo conduzidos com o

objetivo de se obter uma separação seletiva dos componentes poliméricos dos

materiais lignocelulósicos (celulose, hemicelulose e lignina), em tratamentos

denominados de "Fracionamento". Este tipo de processo permite uma

utilização separada das frações obtidas e sua transformação em produtos de

interesse comercial por meio de processos biotecnológicos (KUHAD & SINGH,

1993)

A alta proporção de pentases, particularmente xilose, na fração

hemicelulósica, aliada a sua maior facilidade de extração do complexo

lignocelulósico, tem atraído a atenção de pesquisadores para a efetiva

utilização desta fração em processos de bioconversão. A Tabela 2.1 mostra

alguns produtos que podem ser obtidos a partir de xilose por bioconversão.

Tabela 2.1. Alguns exemplos de produtos obtidos a partir da fermentação de

xilose

Classificação Produtos Referências Combustíveis/

Solventes

Etanol, Acetona-butano!, 2,3

butanodiol

Bisaria (1998)

Magee & Kosaric (1985)

Aditivo alimentar Xilitol Roberto et ai. (1991);

Winkelhausen &.

Kusmanova ( 1998)

Acidos Orgânicos Acido lático Garde et ai. (2002)

Acido acético Brownell & Nakas (1991)

Outros Proteína microbiana

Pigmentos

Pessoa et ai. ( 1996)

Parajó et ai. ( 1998)

8

9

2.1.3 - Obtenção do Hidrolisado Hemice/ulósico

A hidrólise ácida utilizada na produção de hidrolisados hemicelulósicos

tem sido descrita como um dos métodos mais eficientes na solubilização de

açúcares provenientes da fração hemicelulósica, bem como no pré-tratamento

da biomassa visando o aumento da degradação celulósica através de enzimas

(McMILLAN, 1994). A hidrólise da fração hemicelulósica envolve solubilização

e parcial degradação dos açúcares produzidos o que demonstra ser um dos

principais problemas encontrado neste processo.

Durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos são formados

diferentes tipos de açúcares (D-glicose, D-galactose, D-manose, D-xilose, L-

arabinose) e produtos de degradação os quais são considerados tóxicos,

podendo afetar intensamente o metabolismo microbiano. Os principais

compostos tóxicos incluem hidróximetilfurfural e furfural (produtos da

degradação de açúcares), ácido acético (substância liberada da estrutura

hemicelulósica), e alguns compostos fenólicos e aromáticos (produtos da

degradação da lignina) sendo estes considerados mais tóxicos que furfural ou

hidróximetilfurfural, mesmo em baixas concentrações (PARAJÓ et ai., 1998).

Tendo em vista a necessidade de diminuição da toxicidade causada por

compostos inibidores presentes no hidrolisado, processos de destoxificação

como neutralização, evaporação, resinas de troca iônica e adsorção por carvão

ativo têm sido utilizados antes da fermentação (McMILLAN, 1994). A adsorção

com carvão ativo vem sendo utilizada como um método de destoxificação para

melhorar a capacidade de microrganismos de fermentar hidrolisados

hemicelulósicos. De acordo com MUSSATTO & ROBERTO (2001), o xilitol

produzido por Candida guilliermondii apresentou um rendimento de 0, 72 g/g e

uma produtividade volumétrica de 0,61 g/L.h após tratamento do hidrolisado de

palha de arroz com carvão ativo na razão hidrolisado: carvão de 40 g/g,

correspondendo à remoção de 27% de compostos fenólicos. Estes estudos

demonstraram ainda que esses parâmetros tiveram um aumento de 22 e 45%,

respectivamente, em relação àqueles obtidos em hidrolisado sem tratamento

com carvão.

O aumento na concentração de xilose presente nos hidrolisados

hemicelulósicos também tem demonstrado ser importante sob o ponto de vista

10

econômico, pois tende a melhorar parâmetros, como rendimento e

produtividade, na bioconversão da D-xilose em xilitol. O aumento na

concentração inicial deste açúcar aumenta a concentração do produto final,

melhorando a produtividade volumétrica e tornando o processo de separação

mais viável (MUSSATIO & ROBERTO, 2004). Em estudos realizados por

PARAJÓ et ai, (1996) a relativa baixa concentração de xilose presente no

hidrolisado hemicelulósico de madeira limitou tanto a produtividade quanto o

rendimento de xilitol por Debaryomyces hansenii. De acordo com MUSSA TIO

& ROBERTO (2004), durante a etapa de concentração do hidrolisado de palha

de arroz, o aumento dos teores de açúcares é acompanhado pelo aumento nas

quantidades de hidróximetilfurfural, ácido acético e produtos da degradação da

lignina, resultando em maiores níveis de toxicidade e inibição do metabolismo

microbiano. Segundo estes autores, a hidrólise ácida da palha de arroz

empregando O, 1 M de H2S04 na proporção líquido:sólido de 1 O: 1 (v/p) durante

27 minutos a 121ºC seguida da concentração do hidrolisado hemicelulósico

obtido produziram níveis de compostos tóxicos, tais como furfural,

hidróximetilfurfural e ácido acético, abaixo do limite de inibição preconizado na

literatura.

Outro fato importante é que a utilização de hidrolisados em processos

fermentativos implica em um efeito, nem sempre positivo, na obtenção do

produto de interesse devido à presença de diferentes tipos de açúcares como

xilose, glicose e arabinose. A capacidade da Candida guil/iermondii em

fermentar xilose, mesmo na presença de outros açúcares, foi estudada pelos

pesquisadores LEE et ai. (1996), e SUGAI & DELGENES (1995). Tais estudos

demonstraram que a glicose reprime parcialmente a indução" de aldose

redutase (xilose redutase) pela xilose e que a intensidade dessa repressão está

correlacionada a concentração de glicose no sistema de indução, ou seja, o

aumento da concentração de glicose adicionada a xilose pode anular o efeito

dessa pentase na indução da atividade da aldose redutase.

11

2.2 - METABOLISMO DE XILOSE EM LEVEDURAS

Uma vez dentro da célula da levedura, a xilose é reduzida a xilitol pela

xilose redutase (aldose redutase EC 1.1.1.21) dependente quer de NADH ou

de NADPH. O xilitol, composto relativamente estável, ou é excretado da célula

ou oxidado a xilulose pela xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) dependente de

NAD ou NADP. As primeiras duas reações são consideradas limitadoras do

metabolismo de xilose. A presença quer de elevadas atividades de xilose

redutase (XR) ou baixas atividades de xilitol desidrogenase (XDH) tem sido

usada como critério para selecionar os microrganismos produtores de xilitol. A

fosforilação da D-xilulose a D-xilulose-5-fosfato é catalisada pela

xilulosequinase (WINKELHAUSEN & KUZMANOVA, 1998). A Figura 2.3

mostra um esquema simplificado do metabolismo de xilose em leveduras.

A conversão de pentoses a xilulose-5-fosfato é um pré-requisito para a

sua utilização pelas vias catabólicas centrais. A D-xilulose-5-fosfato pode

subsequentemente entrar na via das pentoses fosfato, também conhecida

como via das hexoses monofosfato (HMP) a qual possui duas etapas (oxidativa

e não oxidativa).

xy1uiOW

i

8 stnanot 4 {'\

Nf<!Í NAD>i

fn.x:tose-6-P + ·~~p

-pyruvate --+ Biomass

Figura 2.3. Representação esquemática do metabolismo de xilose em leveduras (adaptado de GÍRIO et ai., 1994)

12

A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a enzima responsável

pela primeira etapa do processo oxidativo da via das pentases fosfato. Nesta

etapa, a glicose 6-fosfato é convertida em 6-fosfoglico-õ-lactona, um éster

intramolecular, que é hidrolisado para a forma ácida livre 6-fosfogliconato.

Durante esta etapa são gerados equivalentes redutores, sob a forma de

NADPH, para as reações biossintéticas redutivas dentro das células, enquanto

que na fase não oxidativa as pentases fosfato são convertidas em hexases e

triases fosfato (JEFFRIES, 1983). A via das pentases fosfato também fornece

ribose-5-fosfato usada para a síntese de ácidos nucleicos e histidina e eritrose-

4-fosfato necessária para a síntese de ácidos aromáticos.

O gliceraldeido-3-fosfato e a frutose-6-fosfato são produtos da fase não

oxidativa da via das pentases fosfato. Ambos podem ser convertidos a piruvato

na via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). O piruvato pode ser

descarboxilado e reduzido a etanol ou pode entrar no ciclo dos ácidos

tricarboxílicos. A conversão de xilulose-5-fosfato em gliceraldeido-3-fosfato e

acetil fosfato pela xilulose-5-fosfato fosfocetolase apresenta uma via alternativa

para a utilização da xilulose-5-fosfato denominada desvio da fosfocetolase

(PRIOR et ai., 1989). O metabolismo da xilose em leveduras fornece uma

variedade de produtos contendo carbono que incluem, xilitol, dióxido de

carbono, etanol, ácido acético, entre outros. Os rendimentos em produto são

dependentes da regulação do fluxo de carbono através das vias metabólicas

disponíveis (SLININGER et ai., 1987). Recentemente, o metabolismo de xilose

em leveduras selvagens e recombinantes tem sido revisto (HO et ai., 1999;

JEFFRIES & SHI, 1999). Um estudo detalhado da bioquímica e fisloloqia de

leveduras capazes de metabolizar a xilose foi publicado por HAHN-HÃGERDAL

et ai., 1994.

O catabolismo de xilose está intimamente relacionado às condições

ambientais e aos microrganismos em estudo. A literatura apresenta

principalmente os fatores: suprimento de oxigênio, concentração de substrato,

pH e nível de inóculo, como as variáveis que influenciam a produção de

metabólitos no meio de cultivo (HAHN-HAGERDAL et ai., 1994;

WINKELHAUSEN & KUZMANOVA, 1998).

13

2.3 - GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6POH)

2.3.1 - Importância Fisiológica

A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é uma enzima

citoplasmática de grande importância para a sobrevida das células uma vez

que é responsável pela manutenção de um nível adequado da coenzima

reduzida NADPH.

Em seres humanos, a deficiência da enzima G6PDH configura uma

patologia conhecida como anemia hemolítica. Esta deficiência promove a

diminuição dos eritrócidos devido à incapacidade das células de regenerarem o

NADPH, um cofator importante nos processos biológicos oxidativos (VIEIRA-

NETO et ai. 1999). Tal patologia é resultado de mutações em diferentes pontos

no gene que codifica a enzima e é considerada a enzimopatia mais comum em

humanos pois afeta 400 milhões de pessoas no mundo. As populações de

origem Mediterrânea, Asiática e do Oriente Médio apresentam altas

freqüências de mutações desse gene. Em Hong Kong e no sul da China, 4-6%

da população masculina são deficientes em G6PDH (LUZZATIO & MEHTA,

1995).

As manifestações clínicas associadas à deficiência de G6PDH são: 1)

Anemia hemolítica induzida por drogas: antimaláricos, sulfonamidas, sulfonas e

outras drogas ou produtos químicos que estejam associados à significativa

hemólise em algumas pessoas; 2) Anemia hemolítica induzida por infecção:

numerosas infecções por bactérias ou vírus podem provocar hemólise, sendo

as mais importantes as hepatites, a pneumonia e a febre tifóide; 3) Favismo:

súbito aparecimento de anemia hemolítica aguda após 24 a 48 horas da

ingestão de fava; 4) Icterícia neonatal: surge geralmente entre 1 a 4 dias de

vida; 5) Anemia hemolítica congênita crônica: estas manifestações ocorrem

devido a um aumento de estresse oxidativo.

Em leveduras, as reações iniciais do metabolismo de xilose são

limitadas em diferentes graus em função da especificidade da enzima xilose

redutase para os cofatores reduzidos NADPH ou NADH. De acordo com

ALEXANDER et ai. (1988), em Candida shehatae o metabolismo de xilose sob

condições aeróbias é possivelmente limitado pelos níveis da enzima xilose

14

redutase ou glicose 6-fosfato desidrogenase (fonte de NADPH), enquanto que

sob anaerobiose a xilose redutase dependente de NADH é o fator limitante.

SILVA et ai. (1996) concluíram que a xilose redutase de Candida guilliermondii

requer apenas NADPH como cofator, o que demonstra a importância do fluxo

de xilose pela via das pentases para regeneração do cofator. JEPPSSON et ai.

(2002) demonstraram a importância da parte oxidativa da via das pentases

fosfato em cepas recombinates de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar

o rendimento em etanol a partir da xilose. A cepa TMB3255, a qual teve o gene

ZWF1 rompido com conseqüente redução na produção de NADPH, apresentou

rendimentos em etanol de 0,41 g/g e em xilitol de 0,05 g/g. Porém a taxa de

consumo de xilose foi diminuída em 84% devido à limitação na redução de

xilose por NADPH. Tais resultados indicam a existência de uma estreita

conexão entre a produção de xilitol e a parte oxidativa da via das pentases

fosfato.

JEPPSSON et ai. (2003), avaliaram a influência da enzima G6PDH, em

diferentes níveis de atividade, na fermentação da D-xilose. Os diferentes niveis

na desta enzima foram obtidos através do promotor de cobre, CUP1, utilizado

para facilitar a regulação da expressão do gene ZWF1 com a mudança na

concentração de Cu2+ do meio (cepa TMB3030). A maior atividade de G6PDH,

1,567 U/mgprotetna, nessa cepa resultou em um maior rendimento de xilitol (0,33

g/g) quando comparado à cepa TMB 3001 (0,29 g/g) que continha 1,015

U/mgprotelna· Esses estudos comprovaram a existência da relação entre

atividade de G6PDH e rendimento de xilitol.

2.3.2 - Principais Aplicações

Além da importância em estudos bioquímicos e médicos (LEITE, 1989;

SEVERO, 1979), a enzima G6PDH apresenta grande interesse como reagente

analítico, pois pode ser usada em diversas análises quantitativas, incluindo

medidas de atividade da hexoquinase e creatina-quinase, concentrações de

ATP e de hexases (BERGMEYER, 1984). De acordo com CHATEL et ai.

(1996), a G6PDH pode identificar e quantificar de forma eficiente e precisa

moléculas de glicose liberadas após hidrólise do amido em sucos, mesmo na

presença de pedaços de frutas, compostos coloridos, elevadas concentrações

15

de sacarose e outros tipos de polissacarídeos. SHIROKANE et ai. (2000),

também utilizaram a G6PDH, juntamente com as enzimas maltose-1-

epimerase, maltose fosforilase e J3-fosfoglucomutase, para a determinação de

maltose.

Visando avaliar o metabolismo da fonte de carbono e sua estabilização

pelos microrganismos, presentes no solo, FREY et ai. (1999) propôs um

método simples.rápido e específico para a determinação da concentração de

glicose em solos enriquecidos, utilizando hexoquinase e glicose-6-fosfato

desidrogenase. A enzima G6PDH tem sido também empregada para a

determinação de glicose em sistema de reator em fluxo contínuo, pois o

NADPH formado pela reação enzimática pode ser facilmente detectado

espectrofotometricamente ou fluorometricamente (MORI et ai., 1999; FREY et

ai., 1999). Essa enzima pode, ainda, detectar baixíssimos níveis de

estreptavidina e biotina por ensaios de bioluminescência em reações de

hibridização de DNA, sem perda da atividade enzimática (TEROUANNE et ai.,

1989; BALAGUER et ai., 1989). Outra aplicação recente é a confecção de

biossensores, visando o rápido monitoramento da concentração de G6P no

sangue com menor custo e consumo de tempo do que os métodos tradicionais

como cromatografia e espectroscopia. Esse monitoramento é importante

porque ele pode refletir diretamente a atividade relativa da G6PDH na via

metabólica e tem sido utilizado por possibilitar o controle de G6PDH em

eritrócitos humanos e em células de fígado de ratos (BASSI et ai., 1999).

2.3.3 - Fontes de Obtenção e Métodos para Liberação da Enzima

A enzima G6PDH esta amplamente distribuída na natureza, sendo

encontrada em quase todos os tecidos de origem animal e vegetal e em células

de microrganismos. Dentre as principais fontes de obtenção são destacadas as

leveduras de panificação, Torula, Baci/lus stearothermophillus, Leuconostoc

mesenteroides, adrenais de bovinos e eritrócitos humanos (LEW, 1998).

A maioria das enzimas produzidas por microrganismos são intracelulares

e · algumas delas tem sido produzidas com sucesso em escala industrial

(ÔZBEK & ÜLGEN, 2000). O mercado para produtos microbianos intracelulares

visando aplicação industrial, principalmente na área de alimentos e médica, se

16

encontra em crescimento contínuo devido aos novos desenvolvimentos em

engenharia genética e tecnologia do DNA recombinante.

Para que ocorra a liberação dos produtos microbianos intracelulares, é necessário o uso de métodos que são capazes de romper a parede celular sem

causar inativação dos produtos biológicos. Os métodos de rompimento celular

podem ser divididos em 4 classes, como mecânicos (homogeneizador de alta

pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultra-som), não-mecânicos

(choque osmótico, congelamento e descongelamento, aquecimento, secagem),

químicos (álcalis, solventes, detergentes, ácidos) e enzimáticos (lise enzimática

ou inibição da síntese da parede celular). Segundo LOVITI et ai 2000, os

métodos mecânicos são geralmente os mais apropriados para rompimentos em

larga escala.

Para leveduras, o método de rompimento utilizando esferas de vidro

demonstrou ser mais conveniente e efetivo na obtenção do extrato celular. A

ação de rompimento das esferas de vidro durante agitação causa ruptura da

célula de levedura. A espessura e a rigidez da parede celular das leveduras

fazem de métodos como o ultra-som, lise osmótica e homogeneização

ineficazes no rompimento dessas células (Tabela 2.2)

Tabela 2.2. Eficiência dos métodos de rompimento celular em diferentes tipos

de células (BECKER et ai., 1996)

Métodos Bactéria Levedura Células ... Animais

Ultra-som Eficaz Ineficaz Ineficaz

Prensa Francesa Eficaz Eficaz somente a Ineficaz elevadas pressões

(20000 psi) Lise Osmótica Eficaz para Ineficaz Eficaz

liberação de enzimas

periplasmáticas Homogeneização Ineficaz Ineficaz Muito eficaz

· com pistão de vidrofTeflon Moinho com Eficaz O mais eficaz Ineficaz

esferas de vidro

17

Há diferentes estruturas de paredes celulares. As células animais

possuem membranas frágeis e fáceis de serem rompidas, enquanto que as

bactérias, leveduras e outras formas de fungos possuem paredes rígidas e que

exigem elevadas tensões de cisalhamento para o seu rompimento (Figura 2.4).

Bactérias rn:. Peptidioglicano gram (+) ! 1

l e:=:::::.-- Membrana citoplasmática

1 1 Membrana externa Bactérias '=miaiimm· gram (·) t'.:il Peptidioglicano

c:=::::::::a-- Membrana citoplasmática

Leveduras Manana I proteínas

Figura 2.4. Diferentes estruturas de paredes celulares de microrganismos

(SCHMIDELL et ai., 2001)

Segundo RICCI-SILVA et al.(2000) o procedimento escolhido deve

permitir o acoplamento de uma alta eficiência de desintegração com um curto

tempo de rompimento. A eficiência de uma técnica de rompimento particular é

usualmente avaliada em termos do grau de células rompidas e/ou do valor de

atividade específica da enzima recuperada na suspensão de células rompidas.

Os métodos físicos, destacando os homogeneizadores e os moinhos com

esferas de vidro, são os mais eficientes para o rompimento de células em

pequena e grande escala.

O rompimento envolvendo agitação rápida de uma suspensão de células

microbianas com esferas de vidro é uma excelente técnica. Este procedimento

é particularmente eficiente no rompimento de leveduras e fungos filamentosos,

os quais possuem paredes celulares rígidas constituídas principalmente por

polissacarídeos (80-90%) (KESHAVARZ et ai., 1987).

18

2.3.4 - Influência das Condições de Cultivo

Assim como para qualquer produto metabólico excretado pelos

microrganismos, fatores como pH, concentração do inóculo, concentração e

tipo da fonte de carbono, oxigênio dissolvido dentre outros podem afetar

significativamente a produção de uma enzima intracelular.

Em fermentações empregando a levedura Saccharomyces cerevisiae,

ABRAHÃO-NETO et ai. (1997) constataram que o pH do meio de cultivo

exerceu uma forte influência na atividade da G6PDH. Segundo os autores, a

atividade da enzima foi aumentada em 57% quando o pH do cultivo passou de

5,0 para pH 4,5. Neste mesmo trabalho os autores também estudaram o efeito

da concentração de oxigênio dissolvido sobre a atividade específica da enzima

sendo obtido um valor máximo de Q!~1 O U/mg quando a concentração de

oxigênio dissolvido no meio foi de 4,0 mg 02.L-1. Segundo os autores, a

diminuição da atividade enzimática observada com valores superiores (6,0 mg

02.L-1) e inferiores (0,2 mg 02.L-1) de oxigênio dissolvido foi devido à reduzida

taxa de crescimento sob estas concentrações de oxigênio. Essa observação

deve-se ao fato da G6PDH participar da via das pentoses, caminho pelo qual

as células sintetizam ribose-6-fosfato, um dos constituintes chave dos ácidos

nucleícos e nucleotídeos. Dado que a demanda por ácidos nucleícos durante a

fase de crescimento máximo é acentuada, a atividade específica da G6PDH

também aumenta.

De acordo com GÍRIO et ai (1994), a parte oxidativa da via das pentases

fosfato consiste de duas reações principais catalisadas pela glicose-6-fosfato

desidrogenase e pela 6-fosfogluconato desidrogenase dependentes de NADP,

resultando na formação de NADPH. Parte dos cofatores reduzidos são

empregados na redução da xilose, na primeira reação do metabolismo deste

substrato, e o restante é requerido pela célula em reações biossintéticas. Esses

autores estudaram o efeito da taxa de transferência de oxigênio (OTR) nos

níveis das enzimas do metabolismo de xilose em células de Debaryomyces

hansenni e observaram que a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase foi

estimulada pela quantidade de oxigênio disponível, aumentando em 60%

quando as condições de OTR variaram de 2,72 a 12,93 mmol 02/L.min.

Aumento na atividade de G6PDH similar foi relatado para Candida shehatae

19

cultivadas em xilose quando as condições de aeração do cultivo foram

mudadas de anaeróbio para semiaeróbio e então aeróbio (ALEXANDER et ai.,

1988). O maior valor de atividade específica de G6PDH obtido por GlRIO foi de

0,54 U/mg em meio sintético.

A atividade de várias enzimas incluindo G6PDH durante o cultivo de

Candida guilliermondii em quimiostato empregando xilose como fonte de

carbono foi determinada por GRANSTROM et ai (2001 ). Para uma taxa de

diluição de 0,097 h", a aÚvidade da enzima G6PDH decresceu cerca de 35%

(de 0,74 para 0,26 U/mg) quando a condição de oxigenação do cultivo passou

de aeróbio para oxigênio-limitado, o que demonstra que o efeito da

concentração de oxigênio é significativo na produção da enzima.

A fonte de carbono pode também influênciar a produção de glicose-6-

fosfato-desidrogenase (G6PDH) a partir de leveduras (SILVA, 2000). Em meios

contendo glicose ou glicose/sacarose a atividade da enzima foi superior

quando comparado com meios contendo apenas sacarose. Em cultivos

empregando Candida boidinii, a atividade da G6PDH também variou com a

fonte de carbono empregada (SURYADI et ai 2000). A atividade específica da

enzima decresceu de 0,51 para 0,39 U/mg quando o glicerol foi substituído pela

glicose. KATO et ai (1979), em estudos visando a purificação de glicose-6-

fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase a partir da levedura

Candida boidinii capaz de fermentar metanol, observaram que a atividade

destas enzimas foi duas vezes maior quando o metanol foi substituído pela

glicose como fonte de carbono.

De acordo com CERTIK et ai (1999), a relação carbono/nitrogênio pode

ser considerada fator extremamente importante num cultivo. Estes autores

mostraram que a atividade de G6PDH a partir do fungo Cunninghamella

echinulata aumentou de 100 para 200 nmol/min.mg quando a concentração de

nitrogênio no meio aumentou em 1,2 g/L.

20

3 - OBJETIVOS

GERAL

O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção da enzima

glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) por processo fermentativo, sob

diferentes condições de cultivo, a partir do hidrolisado hemicelulósico de palha

de arroz utilizando a levedura Candida guilliermondii.

ESPECÍFICOS

./ Determinar as condições de rompimento de células de Candida

guilliermondii variando-se o tempo de rompimento e a concentração

celular da suspensão, visando uma eficiente liberação da enzima

G6PDH;

./ Investigar o efeito do pH inicial, concentração de xilose e do nível de

inóculo nos parâmetros fermentativos de produção da enzima, com

auxílio de um planejamento estatístico;

21

./ Determinar as melhores condições de fermentação e estabelecer um

modelo matemático que correlacione as respostas obtidas com as

variáveis significativas do processo, empregando a metodologia da

superfície de resposta.

22

4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 - PREPARO DA MATÉRIA PRIMA

A palha de arroz utilizada nos experimentos foi obtida na região de

Lorena. Após o recebimento, a palha foi seca ao sol e cominuída em moinho

tipo martelo a um tamanho de aproximadamente 1 cm de comprimento e 1 mm

de espessura.

4.2 - OBTENÇÃO E TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

O hidrolisado hemicelulósico foi obtido por catálise ácida em reator

confeccionado em aço-inox AISI 316 com capacidade de 350 litros, munido de

aquecimento indireto por resistência elétrica por camisa de óleo térmico. As

reações foram realizadas a 121 ºC por 27 minutos empregando uma relação

solução ácida:palha seca de 1 Og/g. Foi utilizado o H2S04 como catalisador e a

solução ácida foi preparada para concentração final de 1 % (ROBERTO et ai,

2003). Ao final da reação, o material descarregado do reator foi centrifugado e

a fração líquida recuperada (hidrolisado hemicelulósico) foi retornada ao reator

de hidrólise para destoxificação do hidrolisado com carvão ativo nas seguintes

condições: relação carvão:hidrolisado de 3% (p/v), temperatura de 45 ºC e

tempo de agitação de 30 minutos (MUSSATIO & ROBERTO, 2001). Após o

processo de adsorção com carvão ativo, o hidrolisado foi centrifugado para

remoção de sólidos e então concentrado sob vácuo a uma temperatura de

65 ºC, visando aumentar a concentração de xilose até aproximadamente

108 g/L. O hidrolisado destoxificado e concentrado (HDC) foi estocado sob

refrigeração a 4°C, pH O, 70, para posterior utilização nos ensaios de

fermentação.

4.3 - MICRORGANISMO

Foi utilizada a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, da coleção de

culturas do Grupo de Processos Fermentativos DEBIQ/FAENQUIL,

selecionada para produção de xilitol a partir de materiais lignocelulósicos. A

cultura foi repicada em tubos de ensaio contendo ágar malte inclinado,

incubada em estufa a 30 ºC por 24 h e então conservada em geladeira à 4ºC

para posterior preparo do inóculo.

4.4 - PREPARO DO INÓCULO

Células de Candida guilliermondii, recém repicadas em meio de

manutenção, foram transferidas em condições assépticas, com auxílio de uma

alça de platina, para tubos de ensaio contendo cerca de 5 ml de água

destilada esterilizada. Alíquotas de 1 ml desta suspensão foram transferidas

para frascos Erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml do meio de cultivo

constituído por hidrolisado destoxificado com pH ajustado para 6,2 e

concentração inicial de xilose de 30 g/L. Os frascos foram incubados a 30ºC

em agitador rotativo (Tecnal mod. Te 420) a 200 rpm durante 29 horas. Após

este tempo, as células foram separadas por centrifugação a 2000xg por 20

minutos e ressuspendidas em água destilada esterilizada de forma a se obter

uma suspensão celular densa. A partir desta suspensão foi calculado o volume

necessário para fornecer a concentração celular inicial desejada no meio de

fermentação, para cada ensaio.

2-4

4.5 - ESTUDO DAS CONDIÇÕES DE ROMPIMENTO CELULAR

Foi utilizado o método de rompimento com esferas de vidro ( diâmetro

médio de 0,5 mm) sob agitação em vórtice. O método consiste em adicionar

esferas de vidro a uma suspensão celular em proporções de 1: 1 (v/v) e

promover vários ciclos de agitação em vórtice alternando com períodos de

resfriamento em banho de gelo. Para este estudo, células provenientes do

cultivo do inóculo foram separadas por centrifugação e após lavagem com

água esterilizada foram ressuspendidas em tampão Tris-HCI 50 mM, pH 7,5

(adicionado de P-mercaptoetanol 10 mM, ácido aminocapróico 2 mM e EDTA

0,2 mM) de forma a se obter uma suspensão densa (da ordem de 30 g/L). A

partir desta suspensão foram preparadas várias diluições para o estudo do

rompimento celular. Volumes de 3 mi de suspensão celular e 3 ml de esferas

de vidro foram colocados em tubos de centrifuga e após agitação em vórtice

por intervalos regulares de tempo (1, 3 e 5 minutos; sendo que cada 1 min de

agitação, a suspensão foi resfriada em banho de gelo por 30 s). Os sólidos em

suspensão resultantes (fragmentos celulares e esferas) foram separados do

sobrenadante por centrifugação por 15 minutos a 4ºC e 6725g. O sobrenadante

foi então quantificado quanto ao teor de proteínas totais e atividade de G6PDH

e a eficiência do rompimento foi avaliada através da contagem de células

intactas, em câmara de contagem, e através da leitura de densidade ótica,

DO&XJ, antes e após o rompimento.

- --

4.6 - PROCESSO FERMENTATIVO

4.6.1 - Meio de Fermentação

O meio de fermentação foi preparado com o hidrolisado concentrado

conforme descrito no item 4.2. O hidrolisado foi diluído em água destilada

esterilizada de forma a se obter a concentração inicial de xilose desejada.

Antes da utilização dos hidrolisados diluídos como meio de fermentação, estes

25

tiveram os valores de pH ajustados de acordo com o planejamento fatorial

apresentado na Tabela 4.1.

4.6.2 - Condições de Cultivo

Os experimentos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 500 ml

contendo 200 ml do meio de fermentação, inoculados com células cultivadas

nas condições descritas anteriormente. Os frascos foram incubados a 30ºC, em

agitador rotatório (Tecnal mod. Te 420), sob a agitação de 200 rpm. Durante as

fermentações, amostras foram retiradas, em diferentes tempos, para o

acompanhamento do consumo de xilose, glicose e arabinose, produção de

glicose-6-fosfato desidrogenase e xilitol, crescimento celular e variação do pH.

4.6.3 - Metodologia Estatística

Para avaliação da influência da concentração inicial de xilose, nível de

inóculo e pH inicial do cultivo sobre a produção da enzima G6PDH foi utilizado

um planejamento fatorial completo de dois níveis 23, conforme matriz

apresentada na Tabela 4.1.

As variáveis foram codificadas de acordo com a equação:

(1)

onde Vc -valor codificado da variável independente

VR -valor real da variável independente

V0 - valor real da variável independente no ponto central

l!J..VR - valor do passo, isto é (VRmáx-VRmín)/2

26

Tabela 4.1. Matriz de planejamento experimental com pontos

intermediários, para investigar o efeito do pH inicial,

concentração de xilose e do nível de inóculo nos parâmetros

fermentativos de produção da enzima

Ensaio Níveis originais Níveis codificados

das variáveis das variáveis

pH Xilose lnóculo pH Xilose lnóculo

inicial (g/L) (g/L) inicial (g/L) (g/L)

1 4,5 30 1 -1 -1 -1

2 7,5 30 1 +1 -1 -1

3 4,5 70 1 -1 +1 -1

4 7,5 70 1 +1 +1 -1

5 4,5 30 3 -1 -1 +1

6 7,5 30 3 +1 -1 +1

7 4,5 70 3 -1 +1 +1

8 7,5 70 3 +1 +1 +1

9 6,0 50 2 o o o 10 6,0 50 2 o o o 11 6,0 50 2 o o o

A análise estatística dos dados obtidos foi realizada utilizando-se o

programa STATGRAPHICS (versão 5.0). A significância dos fatores

experimentais foi testada pelo teste t de Student. Este teste, baseado na

hipótese de que o verdadeiro parâmetro é zero, é utilizado para elucidar a

significância dos fatores. Se o valor de t calculado (tcatc) for superior ao t tabelado tc1 _ª·À.) para um nível de significância a. e À. graus de liberdade, então o

termo em causa contribui significativamente para a resposta. Os níveis de

significância e a notação que será utilizada para denotar cada nível,

encontram-se na Tabela 4.2.

27

Tabela 4.2. Nível de probabilidade e notação a ser utilizada para cada nível de

significância, no planejamento efetuado

Nível p Notação

significância

90% p < 0,10 *

95% p < 0,05 **

99% p < 0,01 ***

Para a quantificação dos níveis das variáveis e otimização das

condições de produção da enzima foi utilizada a metodologia de superfície de

resposta.

4. 7 - MÉTODOS ANAlÍTICOS

4.7.1 - Determinação da Concentração Celular

A concentração celular foi obtida mediante uma curva de calibração que

correlaciona densidade ótica (DO) com massa seca de células. Para a

elaboração desta curva, células provenientes do cultivo do inóculo foram

centrifugadas, lavadas e ressuspendidas em água destilada de forma a se

obter uma suspensão homogênea densa (suspensão original). Esta suspensão

foi utilizada para preparar suspensões com diversas diluições (1 :50, 1 :100,

1 :125, 1 :200, 1 :250, 1 :500). Cada uma destas suspensões diluídas foram

submetida a leitura de absorbância em espectrofotômetro (Beckman DU 640) a

600 nm, utilizando-se água destilada como branco. A massa seca foi

determinada a partir da suspensão original após secagem de alíquotas com

volume conhecido, em estufa a 105 ºC por 24 horas.

28

4. 7.2 - Determinação da Concentração de Glicose, Xilose, Arabinose Xilitol e Ácido Acético

As concentrações de glicose, xilose, arabinose, ácido acético e xilitol

foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC),

em equipamento WATERS, nas seguintes condições: coluna 810-RAD Aminex

HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura: 45 ºC; eluente: ácido sulfúrico 0,01 N;

fluxo 0,6 ml/min; volume de amostra: 20 µL; detector: índice de refração.

4. 7.3 - Determinação da Atividade Enzimática

A atividade de G6PDH foi determinada por análise espectrofotométrica

em aparelho Beckman 640 OU, a 340 nm e temperatura de 30 ºC de acordo

com o método descrito por BERGMEYER (1984). A atividade foi determinada

em um sistema enzimático contendo amostra, nicotinamida-adenina-

dinucleotídeo fosfato (NADP+) e glicose-6-fosfato (G6P). Nesta reação, a

glicose-6-fosfato (G6P), na presença da enzima G6PDH e do cofator NADP\ é oxidada a gliconato-6-fosfato gerando o cofator reduzido nicotinamida-adenina

dinucleotídeo fosfato (NADPH), conforme esquematizado na Figura 4.1. A

atividade da enzima G6PDH foi então determinada pela medida da velocidade

de formação de NADPH.

Glicose-6-Fosfato

;~!~::~::aro i 1 ~ Gliconato-6-Fosfato

NADPH

Figura 4.1. Representação esquemática da atuação da enzima G6PDH na

reação para determinação de atividade enzimática

29

Para a determinação da atividade da enzima G6PDH, foi utilizado 500µL

de tampão Tris-HCI (0,071 M, pH?,5), 1 OOµL de cloreto de magnésio (35mM),

5~tl NADP+ (O, 131 M), 1 OµL glicose-6-fosfato (500mM) e 1 OOµL de amostra.

Uma unidade (U) de G6PDH é definida como a quantidade da enzima capaz de

catalisar a redução de 1 µmal de NADP+/min nas condições experimentais. A

atividade volumétrica foi determinada pela seguinte equação:

~a lxl06 A\' =-x-·-x7J5xdiluição

~· 6220 .

onde:

Av = atividade volumétrica (U/L)

.1al.1t = velocidade de formação de NADPH por minuto a 340 nm

6220 = coeficiente de extinção molar ou índice de absorbância (M-1cm-1) para

NADPH

7, 15 = fator de diluição da cubeta

4.7.4 - Determinação do Teor de Proteínas Totais

O teor de proteínas totais foi determinado de acordo com o método

proposto por LOWRY. Foi utilizado como padrão a albumina de soro bovino

(BSA -"bovine serum albumin").

4.8 - METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS

Para avaliação dos resultados obtidos nas diversas etapas do trabalho

foram analisados os seguintes parâmetros:

Eficiência do Rompimento Celular(%)

Nº células I mL = células,x5xl 04 xdiluição

onde:

cétútes, = número total de células contadas em Câmara de Neubauer

30

5x104 = fator de diluição da Câmara de Neubauer

/1° cé/11/asante - 11° células j . (%) = o : epors x100

/1 ce/ulas,111(es onde:

n º célulasantes = número de células antes do rompimento

n º célulasdepois = número de células depois do rompimento

Curva de Peso Seco:

DO -0,0386 [X]g / L = 600 xdiluição

1,527 onde:

[X]= concentração celular (g/L)

00600 = densidade ótica a 600 nm

(%) = [XLntes -[X]depois xlOO [XJanles

onde:

[X]antes = concentração de células antes do rompimento (00600)

[X]depois = concentração de células depois do rompimento (00600)

Fator de Conversão de Substrato em Células YXJs (g/g)

Yxis = _f1;_Y_ = (Xr - X;) ou YXJs = Coeficiente angular da -!).Sr (Sli - slf) + (S2; - S21)

equação de LiX = f(-LiST)

Fator de Conversão de Xilose em Xilitol Yp1s (g/g)

YP/s = ~ = (Pr - J:) ou Yp,s = Coeficiente angular da equação de L\P -!).S2 (S2; - S2f)

onde:

~ e Xr - Concentração inicial e final de células (g/L)

Pi e Pt - Concentração inicial e final de xilitol (g/L)

ti e tt- Tempo inicial e final da fermentação (h)

31

S1i e S1t - Concentração inicial e final de glicose (g/L)

S2i e S2t - Concentração inicial e final de xilose (g/L)

Produtividade em Xilitol Qp (g/L.h): LlP (P1 - P;)

Qp = -;;; = U1 - ti)

Produtividade em Células Qx (g/L.h)

Ox= LlX = (X1 -X;) - M (r1 -t;)

Atividade Específica de G6PDH em relação às proteínas totais (U/mg prot)

A atividade específica da enzima G6PDH foi obtida pela relação entre

atividade enzimática volumétrica (U/L) e a concentração de proteínas totais

(mg/L).

32

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 - OBTENÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE PALHA DE ARROZ

O hidrolisado hemicelulósico foi obtido através da hidrólise ácida da

palha de arroz em condições previamente determinadas por ROBERTO et ai.

(2002) conforme descrito no item 4.2. Segundo esses autores, o hidrolisado da

palha de arroz apresentou na sua composição, como componentes poliméricos

principais, glucana (43,4%), xilana (20,2%), arabinana (2,73%), lignina (17,2%)

e cinzas (11,4%).

No presente trabalho, foram obtidos 86 litros de hidrolisado tratado com

carvão ativo (3%) e 15 litros de hidrolisado concentrado a partir de 16,5 kg de

palha de arroz (peso seco).

A composição química do hidrolisado hemicelulósico da palha de arroz

após hidrólise, tratamento com carvão ativo e concentração a vácuo está

mostrada na Tabela 5.1. Verifica-se que, sob as condições de hidrólise

empregadas, o açúcar predominante no hidrolisado foi a D-xilose (18,97 g/L),

seguido de arabinose (3,29 g/L) e glicose (2,22 g/L). Concentração semelhante

de D-xilose (18,24 g/L) e teores menores de arabinose (1,71 g/L) e glicose

(1,20 g/L), foram obtidos por RODRIGUES et ai. (2001) após a hidrólise ácida

do bagaço da cana-de-açúcar empregando 100 mg de H2S04 diluído/g de

bagaço de cana (peso seco) durante 10 minutos a 121ºC. SUN et ai. (1999),

observaram que a hidrólise alcalina da palha de arroz, diferentemente da

- -~

33

hidrólise ácida, favoreceu a solubilização da O-glicose presente na fração

hemicelulósica.

Tabela 5.1. Composição do hidrolisado hemicelulósico obtido por hidrólise

ácida da palha de arroz

Componentes

(g/L)

Hidrolisado

O-glicose

D-xilose

L-arabinose

Ácido Acético

2,22

18,97

3,29

2,22

Tratado com Concentrado 6

Carvão ativo vezes -

2,17 11,28

18,37 103,1

3,20 15,29

1,69 2,84

ln Natura

Após a obtenção do hidrolisado, realizou-se o tratamento deste com

carvão ativo visando a parcial remoção de compostos tóxicos prejudiciais ao

crescimento e ao metabolismo de microrganismos. Segundo FELIPE et ai.

(1996), tais compostos devem ser removidos ou terem suas concentrações

diminuídas para uma utilização eficiente do hidrolisado hemicelulósico em

processos de bioconversão de xilose. Observa-se, na Tabela 5.1, que não

houve alteração nas concentrações de açúcares, porém ocorreu uma pequena

redução na concentração de ácido acético. De acordo com estudos realizados

por RODRIGUES et ai. (2001 ), o tratamento com carvão ativo antes da

concentração a vácuo (4 vezes) do hidrolisado de bagaço de cana em pH 0,92,

favoreceu a remoção de compostos fenólicos (98%) e apresentou uma redução

nos valores de ácido acético de 62,2%. No presente trabalho, o tratamento com

carvão ativo do hidrolisado de palha de arroz antes da concentração a vácuo

proporcionou uma redução de 24% de ácido acético. Esta diferença pode ser

atribuída aos diferentes tipos de materiais lignocelulósicos, às diferentes

condições de hidrólise empregadas além do tratamento utilizado na remoção

dos compostos tóxicos presentes no hidrolisado.

O processo de concentração a vácuo foi realizado visando o aumento

da concentração de xilose no hidrolisado, embora . tal processo fosse

acompanhado pelo aumento na quantidade de compostos tóxicos. Como pode

ser observado na Tabela 5.1, a concentração do hidrolisado produziu uma

elevação na quantidade de xilose (443%), glicose (408%) e arabinose (365%),

além do ácido acético (28%). Apesar do ácido acético ser um composto tóxico

aos microrganismos, FELIPE et a/.(1995) relataram que somente valores acima

de 3 g/L podem afetar negativamente na fermentação da xilose por Candida

g uilliermondii.

5.2 - ESTUDO DO ROMPIMENTO DAS CÉLULAS DE Candida guil/iermondii

O rompimento celular é uma operação unitária importante na obtenção

de produtos intracelulares de microrganismos, sendo os métodos físicos os

mais comumente utilizados. Em estudos da etapa de rompimento celular, a

influência de fatores como concentração celular, tempo de rompimento,

agitação, volume de esferas de vidro, pressão, potência, são freqüentemente

avaliados de acordo com o método a ser empregado. Além disso, para o

monitoramento da eficiência do rompimento celular, parâmetros como

concentração total de proteínas solúveis ou enzima intracelular liberada,

tamanho das células, número de células viáveis e concentração celular, têm

sido avaliados (CURRIE et ai., 1972; FOLLOWS et ai., 1971; AGERKVIST &

ENFORS, 1990; KULA et ai., 1990; MELENDRES et ai., 1993).

No presente trabalho, experimentos foram conduzidos visando à determinação das condições de rompimento de Candida guilliermondii,

utilizando esferas de vidro sob agitação em vórtice, variando o tempo de

rompimento e a concentração celular da suspensão para que eficiente

liberação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pudesse ser alcançada. A

eficiência do método de rompimento foi estimada através da análise dos

parâmetros concentração celular medida por densidade ótica, DO&X>, e também

pelo número de células intactas, utilizando Câmara de Neubauer; além da

quantidade de proteínas solúveis e da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase.

Tal etapa foi realizada com repetição para que a reprodutibilidade do método

também pudesse ser avaliada.

35

A Figura 5.1 apresenta a porcentagem de células rompidas em função

da concentração das suspensões celulares nos tempos de rompimento 1, 3 e 5

minutos. Nota-se que no tempo de 1 minuto, a porcentagem de células

rompidas estimada pela densidade ótica não mostrou significante variação com

a concentração celular, alcançando um valor médio de 44% de células

rompidas. De modo diferente, a porcentagem de células rompidas estimada

pelo número de células intactas neste mesmo tempo, apresentou aumento

acentuado a partir da concentração celular de 11,6 g/L, alcançando 67% de

rompimento celular com 35,4 g/L de células, o que pode ser explicado por um

possível erro experimental presente na contagem de células em Câmara de

Neubauer, uma vez que suspensão celular mais concentrada implica em maior

diluição para a leitura.

Considerando o tempo de 3 minutos, observa-se que a porcentagem de

células rompidas, estimada tanto pela densidade ótica quanto pelo número de

células intactas, apresentou comportamento parecido ao observado para o

tempo de 1 minuto. Entretanto os valores de células rompidas alcançados

foram maiores.

Para o tempo de 5 minutos de agitação em vórtice, pode-se observar

que a concentração celular não influenciou significativamente na porcentagem

de células rompidas, já que os valores de porcentagem mostraram pouca

variação quando estimados pela densidade ótica bem como pelo número de

células intactas. Vale ressaltar que os erros-padrão mostrados na Figura 5.1

para o tempo de 5 minutos foram menores se comparados aos outros tempos.

TAUBERT et ai. (2000) observaram que o aumento da concentração celular

promoveu um decréscimo na eficiência do rompimento de Ganoderma

applanatum em moinho de esferas, embora o aumento da biomassa não tenha

influenciado no rompimento de Pycnoporus cinnabarinus. No presente trabalho,

as concentrações celulares empregadas promoveram pouca variação na

porcentagem de células rompidas. Esses resultados sugerem que a influência

da concentração celular sobre a eficiência de rompimento, depende do tipo de

microrganismo estudado.

Os resultados das porcentagens de células rompidas em função do

tempo, empregando diferentes concentrações celulares, estão apresentadas na

Figura 5.2. A porcentagem de células rompidas variou com o tempo de

36

rompimento, tanto para as células rompidas estimadas por DOro:i quanto para

as estimadas pela contagem de células intactas em Câmara de Neubauer.

Nota-se, na Figura 5.2, que o aumento do tempo de agitação em vórtice

favoreceu a eficiência de rompimento, apesar da concentração celular de

5,9 g/L ter atingido um valor de porcentagem de células rompidas maior (DOEOJ)

após 3 minutos quando comparado com o tempo de 5 minutos. De um modo

geral, o tempo de 5 minutos demonstrou ser o mais adequado para a obtenção

de um eficiente rompimento celular, haja vista que os maiores valores de

porcentagens de células rompidas foram alcançados nesse tempo.

RICCI-SILVA et ai (2000) analisaram a influência da concentração

celular inicial, agitação e do tempo na porcentagem de células de

Saccharomyces cerevisiae rompidas em moinho de esferas. Segundo estes

autores, o aumento do tempo de rompimento de 3 a 15 minutos,

independentemente da concentração inicial da suspensão celular, mostrou

favorecer no rompimento dessas células até o tempo de 9 minutos, a partir do

qual a porcentagem de células rompidas permaneceu praticamente constante.

Estes autores constataram ainda que, empregando-se uma concentração

celular de 170 g/L e agitação de 2300 rpm, o tempo de 6 minutos foi suficiente

para que 83% das células fossem rompidas. No presente trabalho, a maior

porcentagem de células rompidas, 78% (em número de células intactas) e 69,5

± 8,5% (DOro:i), foi alcançada com uma concentração celular de 35,4 g/L e 5

minutos de agitação em vórtice. De acordo com MARFFY & KULA (1999),

porcentagens de rompimento variando de 60 a 80% são satisfatórias para a

obtenção de enzimas por leveduras.

RICCI-SILVA et ai. (2000), concluíram que observações feitas em

câmara de Neubauer com o auxílio do microscópio não são necessariamente

um bom critério para a contagem de células rompidas, além de não

confirmarem se a membrana citoplasmática foi afetada na mesma proporção.

KUBOI et ai (1995), durante o estudo do rompimento de células de Escherichia

coli em ultrassom visando à obtenção da enzima ~-galactosidase, avaliaram o

parâmetro concentração celular medido pela densidade ótica como uma

estimativa da eficiência do método de rompimento utilizado. Esse parâmetro

37

80 11 minuto\

70

~60 I! ~; UJ -ig 50 "ã. f7'!~i><~ E 40 o ..... ~ 30

~ 20 o .l 10

o o 5 10 15 20 25 30 35 40

80 e minutos I 70 ~- ~a) ~,V i UJ

~ 50 o.. E 40 o l ..... UJ 30 (11

::i :âj 20 o

10

o o 5 10 15 20 25 30 35 40

80 ~ minutos \

~:~~~-=-1 -ig 50 l "ã. E 40 e UJ 30 (11

's =ai 20 o

10

0-1--~~~~~~~~~~~~~~ O 5 10 15 20 25 30 35 40

Concentração celular (gil)

Figura 5.1. Porcentagem de células rompidas em função da concentração das

suspensões celulares empregando tempos de agitação em vórtice

de 1, 3 e 5 minutos. Número de células intactas (- • -) e DOEm (-•-)

38

! D Contagem D 00600rm

100 90 80 70 60 50

40 30

20 10 0+-~'-r-'~-.-~.........-~---.~~........-~

100 90 80

[ 70 :Q 60 u "ã. 50 E e 40 UI

~ 30 =o; (.) 20

10

0+----'-'-r-'-'--.-----'-........,__.__.___,~~ .......... ~

X= 1,2 g/L

3 5

100 90 80

~ 70 UI .jg 60 "ã. 50 E e 40 UI

~ 30

~ 20 10 0+-~'-r-'~-.-~.........-~---.~~........-~

X= 5,9 g/L

3 5

80 70

X - 221 gil

~ 60 ~ :Q 50 u "ã. 40 E e UI 30 1'11

~ 20 ~

-

----, e-- ~

e , ......

.·

10 o

3

Tempo (min) 5

X= 3,2 g/L

3 5

100 90 80 70 60 50

40 30

20 10 0+-~'-r-'~~~.........-~---.~~........-~

X= 11,6 gil

3

X= 35,4 g/L

5

100 90 80 70 60 50

40 30

20 10 o..-~ ........ ~-.-~....,..~~~......,~~

3

Tempo (min) 5

Figura 5.2. Porcentagem de células rompidas em função do tempo de

rompimento empregando diferentes concentrações celulares

39

provou ser eficaz na determinação da extensão do rompimento celular, sendo

uma medida simples e rápida. Entretanto, a medida da concentração celular

pela DOero (% de células rompidas) deve provar a existência de uma relação

entre densidade ótica e produto liberado (FOSTER, 1995). Com base nos

trabalhos citados anteriormente, a eficiência do método empregado foi

avaliada, em etapas posteriores, pelo parâmetro concentração celular medida

através da densidade ótica, o qual, além de ter demonstrado facilidade e

rapidez, foi semelhante à concentração celular medida pela contagem do

número de células intactas. Para que pudesse ser efetuada uma análise mais

criteriosa da porcentagem de células rompidas, medida pelo número de células

intactas, seria necessário o emprego de microscópio de contraste de fases.

Segundo FOSTER (1995), estas observações podem ser verdadeiras, porém o

rompimento das células deveria, também, ser quantificado por critérios mais

objetivos como análise do tamanho das partículas antes e após o rompimento,

atividade extracelular de uma enzima alvo, dentre outros.

Diferentes autores estudaram a eficiência do rompimento celular através

da liberação de compostos intracelulares como proteínas solúveis e enzimas

(KUBOI et ai., 1995; SONG & JACQUES, 1997; LOVITI et ai., 2000; RICCI-

SILVA et ai., 2000; TAUBERT et ai., 2000; BALASUNDARAM & PANDIT,

2001 ). No presente trabalho, o sobrenadante do extrato celular, obtido das

amostras após o rompimento e centrifugação, foi analisado com o objetivo de

se quantificar a enzima intracelular glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH).

As Figuras 5.3 a 5.5 apresentam os resultados das análises relacionados às

proteínas totais e às atividades volumétricas e específicas da G6PDH nos

tempos de rompimento 1, 3 e 5 minutos, respectivamente, empregando-se

diferentes concentrações celulares.

A Figura 5.3 mostra a liberação de proteínas e da enzima G6PDH no

tempo de rompimento de 1 minuto. Observa-se que a liberação de proteínas

totais como também a da enzima G6PDH (atividade volumétrica) aumentou

com o aumento da concentração da suspensão celular proporcionando uma

maior liberação destes compostos intracelulares presentes no extrato livre de

células. Neste tempo os valores de proteínas totais e de atividade volumétrica

alcançados foram 1736 mg/L e 1022 U/L, respectivamente. Entretanto, este

comportamento não foi observado para a atividade específica desta enzima.

40

Nota-se que o aumento acentuado na atividade específica (0,47 U/mgproteína)

ocorreu até a concentração celular de 5,9 g/L, sugerindo que esse tempo de

agitação em vórtice tenha sido insuficiente para adequada liberação da mesma.

Os resultados referentes ao tempo de 3 minutos estão apresentados na

Figura 5.4. Nota-se que tanto a quantidade de proteínas totais quanto a

atividade volumétrica de G6PDH foram aumentadas até a concentração de

22, 1 g/L, atingindo um valor de 2505 mg/L e 1578 U/L, respectivamente, as

quais se mantiveram nestes níveis na concentração celular de 35,4 g/L.

Observa-se, ainda, que a concentração celular influenciou na atividade

específica da enzima somente em suspensões mais diluídas, ou seja, até 5,9

g/L, a partir da qual a atividade específica da enzima permaneceu praticamente

constante, em torno de 0,65 U/mgproteina-

Com relação ao tempo de 5 minutos (Figura 5.5), verifica-se que o

comportamento da liberação de proteínas e da atividade volumétrica foi

semelhante ao observado para o tempo de 1 minuto. Neste tempo os maiores

valores de proteínas totais, 4157 mg/L, e atividade volumétrica, 2757 U/L,

foram obtidos com a concentração celular de 35,4 g/L. Nota-se, ainda na Figura

5.5, que a atividade específica alcançou um valor máximo de 0,96 U/mQproteina

com 11,6 g/L de células, a partir da qual houve um decréscimo em cerca de

31 % quando a maior concentração celular foi empregada, 35,4 g/L. Tal fato

pode ser explicado pelo pronunciado aumento da quantidade de proteínas

totais liberadas no extrato. Estes resultados demonstram que, apesar de

maiores quantidades de proteínas terem sido solubilizadas no tempo de

agitação em vórtice de 5 minutos, esse fator promoveu um decréscimo na

atividade específica de G6PDH, sugerindo uma possível desnaturação dessa

biomolécula ou liberação de outras proteínas para esse tempo, a partir da

suspensão celular de concentração 11,6 g/L. FOLLOWS et ai (1971 ),

observaram que durante o rompimento de células de levedura por um

homogeneizador de alta pressão, o comportamento da liberação de enzimas

apresentou-se dependente de sua localização. A maior parte de glicose-6-

fosfato desidrogenase está localizada no citoplasma e sua liberação durante o

rompimento celular é instantânea. ÕZBEK & ÜLGEN (2000), em estudo da

estabilidade de enzimas após sonificação, observaram que a enzima G6PDH.

., -· ,._

41

1,0 2000 t = 1 min -

~

0,9 Ô> .....1 1800 E - - ::) 0,8 2, ........ 1600 I I ~ ::J' 1400 0,7 O

o, co - / (O (9 ~ 1200 -. / ---Q 0,6 (9

/ (!) ........ (!) -o -~ .... O 5 -o ro co 1000 :!. . B o - 1 ·e .9 04 !E .ã, (/) 800 I . o ~ E ~ (!)

,-

::::1 ,_ 600 1/~ 0,3 g- - Q) (!) o- > e Q) Q) o, 400 0,2 -e "O co ro ?~ "O "O 200 0,1 ·5 ·5 -.p :;:::; -c ~ o º·º o 5 10 15 20 25 30 35


Figura 5.3. Proteínas totais (-~-). atividade volumétrica (-•-) e atividade

específica (-0-) de glicose-6-fosfato desidrogenase, obtidas após

o rompimento de diferentes concentrações celulares de Candida

guilliermondii empregando o tempo de agitação em vórtice de 1

minuto

/ (

I o c-, a. ...J <X) õ, l9 E (l) ........,

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42

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900

600

300

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2700

2400

35

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0,1 ·5 :.::; <(

2100

1800

1500

1200

5 10 15 20 25 30





guillirmondii empregando o tempo de agitação em vórtice de 3

minutos

::J' -- ::::> .......... J: o ......... a.. _J co -- (9 E Q) .......... "O !/)

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E ~ ::J ·- - Q) o ..... > e Q) a..

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3000 2500 2000 1500 1000 500

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4500 t = 5 rnin

35

1.4 ......... O)

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0,8 i s

ti= 0,6 'õ

Q) a. C/)

0.4 Q) Q) "O <ll

0,2 ~ :.:; <(

43

Figura 5.5. Proteínas totais (-À-), atividade volumétrica (-•-) e atividade



guilliermondii empregando o tempo de agitação em vórtice de 5

minutos

4000 3500

5 10 15 20 25 30 Concentração celular (g/L)

44

apresentou menores valores de estabilidade nesse processo quando

comparada as enzimas álcool desidrogenase, maiato desidrogenase, L-lactato

desidrogenase, fosfatase alcalina e a (3-galactosidase (AP > pG > LDH > MDH

> ADH > G6PDH) sugerindo que o perfil e o grau de degradação das mesmas

variam de acordo com a enzima além da sua localização na célula.

Como discutido anteriormente, as proteínas totais liberadas mostraram-

se dependentes da concentração celular inicial da suspensão, em todos os

tempos. LOVITI et ai (2000), em estudo do rompimento de células de

Saccharomyces cerevisiae em compartimento sob pressão, também

investigaram o efeito da concentração celular na liberação de proteínas

utilizando concentrações entre 2 e 90 g/L submetidas a uma pressão de 170

MPa. Estes autores observaram que, inicialmente, até cerca de 30 g/L o

aumento da proteína liberada foi proporcional ao aumento da concentração

celular porém acima desta concentração, a quantidade de proteína não

mostrou ser proporcional, sendo que, com 90 g/L a concentração de proteínas

presentes no extrato foi 15% menor do que em suspensões celulares mais

diluídas. No presente trabalho, comportamento semelhante também foi

observado, ou seja, a relação entre proteínas liberadas foi proporcional até a

concentração celular de 35,4 g/L, em todos os tempos estudados.

Nesta etapa do trabalho, os maiores valores de atividades específicas da

G6PDH foram alcançadas no tempo de 5 minutos sendo a máxima, 0,96

U/mgprotefna, obtida na suspensão celular de concentração 11,6 g/L.

O estudo da etapa de rompimento mostrou-se importante, visto que o

mesmo possibilitou a determinação de condições adequadas a serem

aplicadas, posteriormente, no processo fermentativo visando a produção da

enzima glicose-6-fosfato desidrogenase. Porém, durante o processo

fermentativo, a baixa formação de biomassa e os pequenos volumes de

amostras retiradas com o tempo constitui um fator limitante para utilização de

uma concentração celular de 11,6 gil. Desta forma, optou-se pelo emprego da

concentração de 3,0 g/L para o estudo da influência das variáveis pH do meio,

concentração inicial de xilose e nível de inóculo sobre a produção da enzima.

Nesta concentração celular (3 g/L) obteve-se porcentagem de células rompidas

de 56,5 ± 4,5% e atividade específica de 0,72 U/mgprotelna .. Esse valor de

45

atividade específica é semelhante ao obtido por GRANSTRÔM et ai. (2000),

em células de Candida guil/iermondii VfT-C-71006 rompidas por ultrassom

(Tabela 5.2).

Tabela 5.2. Valores de atividade específica de glicose-6-fosfato desidrogenase

(G6PDH) para diferentes microrganismos em diferentes métodos

de rompimento

Microrganismo Método de Cultivo Concentração Aede Referências GGPDH Rompimento celular (g/L) ( U/mgprotelna)

Candida Ultra-som Xilose nr 0,74 Granstrõm

guilliermondii et ai (2001)

Debaryomyces Esferas de Xilose nr 0,54 Gírio et ai

hansenii vidro 50 g/L (1994)

Candida boidinii Ultra-som Glicose nr 0,39 Suryadi et ai

(selvagem) 20 g/L (2000)

Candida boidinii Ultra-som Glicose nr 0,015 Suryadi et ai

(mutante) 20 g/L (2000)

Saccharomyces Esferas de Glicose nr 0,30 Pessoa et ai

cerevisiae vidro 20 g/L (2001)

(selvagem)

Saccharomyces Esferas de Glicose nr 8,90 Pessoa et ai

cerevisiae vidro 20 g/L (2001) (geneticamente

modificada)

Pycnoporus U ltra-Turrax Glicose nr 0,63 T aubert et ai

cinnabarinus 30 g/L (2000)

Ganoderma Moinho de Glicose nr 0,67 T aubert et ai

applanatum esferas 30 g/L (2000)

nr: não relatado

46

5.3 - ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE VARIÁVEIS DO PROCESSO FERMENTATIVO NA

PRODUÇÃO DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE

O estudo da influência das variáveis do processo fermentativo sobre a

produção da enzima glicose-6 fosfato desidrogenase foi baseado no

planejamento experimental, conforme matriz apresentada na Tabela 4.1

presente no item 4.6.3.

O consumo de D-xilose, a concentração celular e a produção de xilitol e

glicose-6-fosfato desidrogenase, observados em diferentes condições de pH,

concentração inicial de D-xilose e nível de inóculo, nos diversos tempos de

fermentação por Candida guilliermondii estão mostrados nas Figuras 5.6 a 5.8.

A Figura 5.6 representa os ensaios com concentração inicial de D-xilose

de 30 g/L (ensaios 1, 2, 5 e 6 da matriz do planejamento fatorial 23). Como

pode ser visto na Figura 5.6 (A), a D-xilose presente no meio foi

completamente consumida ao final de 48 horas em todas as condições

estudadas. Entretanto, nas condições nível de inóculo de 3 g/L e pH 4,5 ou 7,5,

foram observadas as maiores velocidades de consumo deste açúcar, sendo

consumida cerca de 94% da xilose após 36 horas de fermentação. As

concentrações residuais de xilose nos ensaios com nível de inóculo de 1 g/L e

de 3 g/L foram da ordem de 1,5 g/L e 0,2 g/L, respectivamente, após 48 horas

de cultivo.

O crescimento celular demonstrou ser influenciado principalmente pelo

pH, sendo as maiores concentrações celulares obtidas em pH 7,5. O aumento

no nível de inóculo também favoreceu o crescimento celular quando o pH do

meio variou de 4,5 para 7,5 (Figura 5.6 B). Por outro lado, ao final da

fermentação, a concentração de xilitol presente no meio foi semelhante em

todos os ensaios independentemente das condições avaliadas. Vale ressaltar

que para as fermentações conduzidas no maior nível de inóculo a produção

máxima de xilitol foi alcançada após 36 horas de cultivo (Figura 5.6 C).

Com relação à enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (Figura 5.6 D),

observa-se que quando o pH foi elevado de 4,5 para 7,5, nos ensaios com 1

g/L de inóculo, a atividade volumétrica de G6PDH passou de 167 para 253 U/L

(51%). Um aumento mais acentuado foi observado quando o inóculo passou de

35 A 8 7

30 6

25 5 ::::i' ::::i' § 20 ~4 (!} cn cn l\l o 15 ::i x :V 3 o

10 2

5

o o o 10 20 30 40 50 o 10 20 30 40 50

20 e D ... 300

15 250

:::]' 2' 200 § 10 2.

I o ~ 150 ~ x (O (9

5 100

50 o o o 10 20 30 40 50 o 10 20 30 40 50

Tempo (h) Tempo (h)

47

Figura 5.6. Consumo de D-xilose (A) e produção de células (8), xilitol (C),


empregando hidrolisado hemicelulósico com concentração inicial

de D-xilose de 30 g/L sob diferentes condições de cultivo. Ensaio

1: inóculo de 1 g/L e pH inicial de 4,5 (-•-), ensaio 2: inóculo 1 g/L

e pH 7,5 (-0-), ensaio 5: inóculo 3 g/L e pH 4,5 (-•-), ensaio 6:

inóculo 3 g/L e pH 7,5 (-V-)

48

1 g/L para 3 g/L em pH 4,5, alcançando 90%, enquanto que um aumento de

apenas 26% foi alcançado em pH 7,5.

A Figura 5. 7 apresenta os resultados referentes aos ensaios conduzidos

com concentração inicial de 70 g/L de xilose. Com base nesta Figura (5. 7 A),

verifica-se que nas condições 3 g/L de inóculo e pH 4,5 a xilose presente no

meio de cultivo não foi totalmente consumida, apresentando um residual de

15,30 g/L, no entanto, quando o pH do cultivo passou de 4,5 para 7,5 houve um

aumento na velocidade de consumo desse açúcar além de seu esgotamento

do meio após 96 horas de fermentação. Neste mesmo tempo, os ensaios 3 e 4

apresentaram consumo percentual médio de xilose de 97%.

A produção de células (Figura 5.7 8) também foi fortemente influenciada

pela variação de pH do meio na condição de 3 g/L de inóculo, uma vez que a

elevação no pH de 4,5 para 7,5 favoreceu o aumento na concentração celular

em 54%.

Na Figura 5. 7 C nota-se que, da mesma forma que para o consumo de

xilose e a produção de células, as condições nível de inóculo de 3 g/L e pH 4,5

não foram favoráveis a produção de xilitol. É interessante observar que para o

pH 4,5, o aumento do inóculo afetou negativamente a produção de xilitol a qual

decresceu de 38,50 para 24,99 g/L (ensaios 3 e 7 da matriz do planejamento

fatorial). Tal comportamento não pode ser explicado pela inibição do

hidrolisado em baixo valor de pH conforme constatado em outros trabalhos,

uma vez que no inóculo de 1 g/L e pH 4,5 a produção de xilitol foi semelhante à de 1 g/L e pH 7,5.

Com relação a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (Figura 5.7 D)

verfica-se que os maiores valores de atividade volumétrica foram obtidos

quando as fermentações foram realizadas nos níveis superiores das variáveis

pH e concentração de inóculo (7,5 e 3 g/L, respectivamente). Nestes ensaios, a

variação do pH de 4,5 para 7,5 promoveu um aumento de 207% na atividade

volumétrica de G6PDH.

Na Figura 5.8 A, B, C e D, estão apresentados os ensaios conduzidos

com 50 g/L de D-xilose, 2 g/L de inóculo e pH 6,0. Nota-se que a D-xilose foi

praticamente consumida com 60 horas de fermentação. Nesses ensaios, ao

final da fermentação, obteve-se concentração média de 7 ,2 g/L em células e

80 A 10 B

60 8

,......_ ,......_ 6 ....J ~ 40 -- C) C) - - (1) (/)

(/) <ti o "S 4

>< 20 •(I) o

2 o

o o 20 40 60 80 100 o 20 40 60 80 100

50 e D 500

40 400

30 ,......_ ,......_ ....J ....J -- -- :::, 300 C) - - I - 20 =ª o o, x (O 200 o

10 100

o o

o 20 40 60 80 100 o 20 40 60 80 100

Tempo (h) Tempo (h)

49


glicose-6-fosfato desidrogenase (D) por Candida guilliermondii


de D-xilose de 70 g/L sob diferentes condições de cultivo. Ensaio

3: inóculo de 1 g/L e pH inicial de 4, 5 (- • -), ensaio 4: inóculo 1 g/L

e pH 7,5 (-0-),ensaio 7: inóculo 3 g/L e pH 4,5 (-Ã-), ensaio 8:

inóculo 3 g/L e pH 7,5 (-V-)

60 A B

50 8

40 ,......_ ,......_ 6

_J ....J -- õ, 30 O) .._., - (!) V,

ro V, 3 o 20 x •(!) 4 o 10

2 o

o 10 20 30 40 50 60 o 10 20 30 40 50 60

30 e 400 D

25 350

20 300 ,......_

,......_ _J _J -- Ô> 15 2 250 .._.,

]: o ~ 200 ~ 10 x (O C)

150 5 100

o 50

o 10 20 30 40 50 60 o 10 20 30 40 50 60 Tempo (h) Tempo (h)

50

Figura 5.8. Consumo de 0-xilose (A) e produção de células (B}, xilitol (C),

glicose-6-fosfato desidrogenase (D) por Candida guilliermondii


de D-xilose de 50 g/L sob diferentes condições de cultivo. Ensaios

9, 1 O e 11: inóculo de 2 g/L e pH inicial de 6,0, ensaios do ponto

central(-•-}, (-0-), (-.A.-)

51

29,2 g/L em xilitol. A produção da enzima variou de 263 a 379 U/L o que pode

ser atribuído à variação na concentração inicial de inóculo nestes ensaios.

Os resultados referentes ao consumo percentual dos açúcares bem

como os parâmetros fermentativos fator de conversão de xilose em xilitol e

atividade especícica de G6PDH estão mostrados na Tabela 5.3.

Observou-se que em todos os ensaios a glicose foi totalmente

consumida antes de 12 horas de fermentação e que o consumo da arabinose

foi iniciado somente após esgotamento da xilose (Apêndice A.3)).

Vale ressaltar que o consumo de arabinose foi influenciado pelas

condições de cultivo empregadas (Tabela 5.3). Verifica-se que os maiores

percentuais de consumo deste açúcar ocorreram nos ensaios com maior nível

de inóculo, com exceção do ensaio 7 (maior concentração de xilose e menor

pH inicial), onde não se observou consumo desta pentase o que provavelmente

foi devido à presença de um grande residual de xilose no meio. O maior

consumo de arabinose (81 %) foi obtido nas condições do ensaio 5, ou seja, pH

4,5 e nível de inóculo de 3 g/L.

A Tabela 5.3 também mostra os valores dos parâmetros fator de

conversão de xilose em xilitol e de atividade específica da G6PDH. Os valores

de Y Pts nos ensaios conduzidos com 1 g/L de inóculo ( ensaios 1 a 4) variaram

de 0,59 a 0,66 g/g e de atividade específica variaram de 0,28 a 0,62

U/mgproteína- Nota-se, ainda, que nas condições do ensaio 4 (pH 7 ,5, 70 g/L de

xilose e 1 g/L de inóculo) foram obtidos os valores máximos para ambas

respostas. O mesmo comportamento foi observado para os ensaios realizados

com 3 g/L de inóculo (ensaios 5, 6, 7 e 8). Nestas fermentações os valores de

Yp1s variaram de 0,53 a 0,74 g/g e de atividade específica de 0,31 a 0,40

U/mQproteína sendo observado que o maior Yp1s e atividade específica foram obtidos no ensaio 8.

Com relação aos ensaios do ponto central (ensaios 9, 10 e 11 ), os

valores médios de Yp1s e AE foram de 0,65 g/g e 0,42 U/mQproteína, respectivamente.

52

Tabela 5.3. Consumo percentual dos açúcares, fator de conversão de xilose

em xilitol (Yp1s), e atividade específica da glicose-6-fosfato

desidrogenase (U/mgproteína) obtidos no tempo final de fermentação

Ensaios Tempo Consumo Percentual Yp1s G6PDH

final (h) Xilose Arabinose (g/g) (U/mg) ·-----------------------·--

1 48 96 39 0,59 0,28

2 48 95 29 0,60 0,55

3 96 94 15 0,62 0,53

4 96 97 35 0,66 0,62

5 48 99 81 0,69* 0,31

6 48 99 64 0,60* 0,35

7 96 78 o 0,53 0,37

8 96 99 53 0,74 0,40 ..

9 60 97 42 0,63 0,44 - ~~

10 60 100 39 0,65 0,42

11 60 99 36 0,68 0,40

*valores obtidos com 36 horas de fermentação

Além da produção do xilitol através da bioconversão da D-xilose por

Candida guilliermondii, esse microrganismo demonstrou ser uma importante

fonte de obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, tornando o

processo de aproveitamento de resíduos lignocelulósicos mais viável

economicamente. A partir dos resultados obtidos, visando a posterior

recuperação dessa enzima, uma análise mais profunda utilizando a

metodologia estatística foi realizada com base na resposta atividade específica

(U/mQproteína).

53

5.4 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DO EFEITO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE XILOSE,

PH E NÍVEL DE INÓCULO NA PRODUÇÃO DA ENZIMA G6PDH E DEXILITOL

Na Tabela 5.4 estão apresentados os resultados em atividade específica

da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e produção máxima de xilitol

obtidos nos ensaios realizados com base no planejamento fatorial 23. De

acordo com estes resultados, pode-se observar que a menor atividade

específica, 0,28 U/mgproteína, foi obtida no ensaio 1 onde foram empregados os

menores níveis de pH inicial, concentração de xilose e nível de inóculo.

Observa-se ainda que a elevação simultânea nos níveis das variáveis pH

inicial, concentração de xilose e nível de inóculo ( ensaio 8) promoveu um

aumento de 43% nos valores de atividade específica de G6PDH e que esta se

mostrou fortemente influenciada pelo nível de inóculo, sendo que no menor

nível, 1 g/L (ensaios 2, 3 e 4), foram obtidos os maiores valores para esta

resposta, com exceção do ensaio 1. Nesta condição, a variação do pH de 4,5

para 7 ,5 promoveu um aumento de 96% quando foi empregada uma

concentração de xilose de 30 g/L e de 17% com 70 g/L de xilose. No entanto,

quando o nível de inóculo foi de 3 g/L a elevação do pH promoveu um aumento

em torno de 11 %, para ambas concentrações de xilose avaliadas. Estas

observações indicam que o pH inicial e o nível de inóculo influenciaram

fortemente na produção da glicose-6-fosfato desidrogenase.

Para a resposta produção máxima de xilitol (Tabela 5.4), observa-se que

para os ensaios conduzidos com 30 g/L de xilose (ensaios 1, 2, 5 e 6), a

concentração final do produto apresentou pouca variação (de 16,54 a 18,57

g/L). Estes resultados sugerem que, na região estudada, as variáveis pH e

nível de inóculo não influenciaram na formação do xilitol. Nos ensaios 3, 4, 7 e

8, realizados a 70 g/L de xilose, a concentração de xilitol foi de 38,50, 40, 1 O,

24,99 e 43,95 g/L, respectivamente. Nota-se que com exceção do ensaio 7, a

produção final de xilitol foi similar nas condições de pH e concentração de

inóculo avaliadas. Estes dados sugerem a existência de um efeito positivo da

variável concentração de xilose, na região investigada, sobre esta resposta.

54

A influência das variáveis investigadas, seus efeitos principais bem como

a existência de efeitos de interação entre elas, pode ser melhor avaliada

empregando-se a análise estatística.

A Figura 5.9 A e B mostram o gráfico de Pareto o qual representa os

efeitos estimados, em ordem decrescente de magnitude, das variáveis pH

inicial, concentração de xilose e nível de inóculo e suas interações nas

respostas atividade específica de G6PDH e produção máxima de xilitol. O

tamanho de cada barra é proporcional ao efeito estimado. A linha vertical é

utilizada para avaliar quais dos efeitos são estatisticamente significativos no

intervalo de confiança de 95%.

55

Tabela 5.4. Produção máxima de xilitol (Pxi1tto1) e atividade específica de G6PDH

(U/mgproteína) obtidas no planejamento fatorial 23 para avaliação da

influência do pH inicial, concentração de xilose e nível de inóculo na

produção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase por Candida

guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de palha de

arroz

Ensaio Variáveis Respostas

pH Concentração Nível de U/mgproteína Pxmtol inicial de xilose inóculo (g/L)

(g/L) (g/L)

1 4,5 30 1 0,28 16,54 2 7,5 30 1 0,55 16,73

3 4,5 70 1 0,53 38,50 4 7,5 70 1 0,62 40,10 5 4,5 30 3 0,31 18,57 6 7,5 30 3 0,35 17,07 7 4,5 70 3 0,37 24,99 8 7,5 70 3 0,40 43,95 9 6,0 50 2 0,44 29,06 10 6,0 50 2 0,42 29,04 11 6,0 50 2 0,40 29,45

p= 0,05 A

lnóculo (C) -5,79

Xilose (B)

pH (A)

A*C

B*C

A*B

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Efeito estimado (Valor absoluto)

p= 0,05 B

B (Xilose) 7,60

A*B

A(pH)

A*C

B*C

e (lnóculo)

o 1 2 3 4 5 6 7 Efeito estimado (Valor absoluto)

56

8 9

Figura 5.9. Gráfico de Pareto para os efeitos das variáveis pH inicial,

concentração de xilose e nível de inóculo nas respostas atividade

específica da enzima G6PDH (A) e produção máxima de xilitol (B)

57

Como pode ser visto (Figura 5.9 A), os efeitos principais nível de inóculo,

C, concentração de xilose, 8, pH inicial, A, além da interação AC (pH e nível de

inóculo) foram significativos. O maior efeito principal observado para essa

resposta foi o da variável nível de inóculo a qual apresentou estimativa de

- 5, 79, seguido pela concentração de xilose com estimativa de + 4,53. Observa-

se ainda que o efeito interativo entre as variáveis A e C apresentou uma

estimativa de sinal negativo indicando que os resultados de atividade

específica são melhorados com a condução dos ensaios em menores valores

de concentrações de inóculo e pH mais elevado, nas respectivas regiões

estudadas. Os resultados desta análise (teste t de Student) confirmam os

efeitos sugeridos pela análise direta dos dados e também a existência de

interação entre as variáveis.

Com relação à resposta produção máxima de xilitol (Figura 5.9 8), nota-

se que apenas o efeito principal concentração de xilose, 8, mostrou-se

significativo para o intervalo de confiança de 95% na região estudada.

No entanto, como o objetivo principal deste trabalho é a produção da

enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, seguiu-se o estudo com a resposta

atividade específica de G6PDH, visando obter um modelo matemático que

descreva a influência das variáveis do processo fermentativo sobre esta

resposta.

5.5 - MODELAGEM MATEMÁTICA PARA ESTIMAR A ATMDADE ESPECIFICA DE

GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM FUNÇÃO DAS VARIÁVEIS

SIGNIFICATIVAS AO PROCESSO FERMENTATIVO

O primeiro passo para a determinação de um modelo empírico através

da metodologia de superfície de resposta é aproximar a função (f), na região

das variáveis independentes. Se a resposta for bem modelada por uma função

linear, então a função de aproximação é um modelo de primeira ordem. Se

existir curvatura no sistema ou na região de ótimo, então um polinômio de grau

superior, como um modelo de segunda ordem deverá ser utilizado para

aproximar a resposta.

58

Para a obtenção de um modelo matemático que melhor descrevesse a

relação entre as variáveis independentes (pH, nível de inóculo e concentração

inicial de xilose) e a resposta em estudo (atividade específica de glicose-6-

fosfato desidrogenase) procedeu-se uma análise de regressão múltipla, cujos

resultados estão apresentados na Tabela 5.5.

Tabela 5.5. Análise da variância para o modelo representativo da atividade

específica de G6PDH de células de Candida guilliermondii

Fonte de SQ GL MQ F p

Variação ----------·--------·-----------

Modelo 0,10 6 0,017 11,85 0,03**

Curvatura 8,SE-05 1 8,SE-05 0,06 0,83

Residual 4,4E-03 3 1,5E-03

Falta de ajuste 3,6E-03 1 3,6E-03 9,03 0,09*

Erro puro 8,0E-04 2 4,0E-04

Total 0,11 10

.. nível de confiança de 90%; .... nível de confiança de 95%

R2 = 0,959; C.V. = 9,03%

SQ = soma quadrática; GL = graus de liberdade; MQ = média quadrática

Analisando a referida Tabela, verifica-se que a regressão obtida foi

estatisticamente significativa (p< 0,05) e que o modelo não mostrou diferença

significativa para a curvatura (p>0,83) e para a falta de ajuste (p>0,09) ao nível

de 95% de confiança. Isto significa que a diferença entre os valores obtidos

experimentalmente e os valores previstos pelo modelo pode ser explicada

apenas pelo erro experimental. A validade do modelo de 1ª ordem obtido pôde

ser também comprovada pelo elevado coeficiente de determinação, R2 = 0,96,

ou seja o modelo consegue explicar 96% da variação total em torno da média,

sendo que os restantes 4% representam os resíduos. Desta forma, o modelo

matemático que descreve a produção de glicose-6-fosfato desidrogenase em

59

atividade específica, considerando a região em estudo, pode ser expresso pela

seguinte equação:

Onde: Y representa o valor previsto para a atividade específica de G6PDH

(U/mgproteína) e X1, X2, X3 representam os níveis codificados das variáveis pH

inicial, concentração de xilose e nível de inoculo, respectivamente.

A Figura 5.1 O apresenta os valores de atividade específica de G6PDH

previstos pelo modelo em função dos valores experimentais obtidos nos 11

ensaios. Observa-se que a distribuição dos pontos em torno da reta para a

resposta atividade específica de G6PDH se ajustam ao modelo linear.

A superfície de resposta obtida pela equação do modelo que representa

a atividade específica de G6PDH em função das variáveis pH inicial,

concentração de xilose, na região estudada, está mostrada na Figuras 5.11.

Nota-se uma tendência crescente da resposta avaliada com o aumento do nível

do pH e concentração inicial de xilose, empregando-se uma concentração de

inóculo de 1,0 g/L. Através da equação obtida, o modelo prevê uma atividade

específica máxima de 0,64 U/mgproteína empregando-se o hidrolisado com uma

concentração de xilose de 70 g/L, pH 7,5 e um nível de inóculo de 1 g/L,

podendo ocorrer uma variação de 0,55 a O, 72 U/mgproteína, dentro do intervalo

de confiança de 95%. Para a confirmação do modelo obtido foi realizado um

ensaio nestas condições tendo sido alcançado, neste ensaio, uma atividade

específica de 0,60 U/mgproteína- Este resultado demonstra que o modelo se

adequou aos resultados experimentais, descrevendo bem a região em estudo.

60

0,70

0,65

0,60 ,....... O> E 0,55 -- ::) ......... 0,50 (/) o

;'!:::: 0,45 "O (l> ... o. 0,40 (/) (l>

0,35 ... o (IJ > 0,30

0,25

0,20 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70

Valores observados (U/mg)

Figura 5.1 O. Gráfico dos valores previstos pelo modelo linear em função dos

valores observados para a resposta atividade específica de

G6PDH

61

o,1

o,6

~ :ro o.s ~ A ,Z O,

:;;;-- o,S ~ ~

Figura 5.11. Atividade específica de glicose-6-fosfato desidrogenase em função

da concentração de xilose e do pH, usando 1 g/L de inóculo

62

6 - CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no decorrer do presente trabalho, permitiram tirar

as seguintes conclusões:

../ A porcentagem de rompimento celular de Candida guilliermondii pode

ser estimada de forma simples e rápida através da leitura da densidade

ótica da suspensão, antes e após o rompimento;

../ Na etapa de rompimento, a enzima liberada mostrou ser dependente da

concentração inicial da suspensão celular e do tempo de agitação

empregados;

../ A máxima liberação da enzima G6PDH foi obtida nas condições, tempo

de agitação em vórtice de 5 minutos e concentração celular de 11,6 g/L,

alcançando uma atividade específica de 0,96 U/mgproteina· Suspensões

celulares mais concentradas, ou seja, maiores que 11,6 gil,

promoveram um declínio na atividade específica da glicose-6-fosfato

desidrogenase para este tempo;

../ A produção da glicose-6-fosfato desidrogenase, durante o processo

fermentativo, mostrou ser influenciada por todas as variáveis estudadas,

nomeadamente pH inicial, concentração de xilose e nível de inóculo. A

produção desta enzima foi favorecida com a diminuição do nível de

63

inóculo e com o aumento do pH e concentração inicial de xilose, na

região estudada;

./ Pela metodologia estatística usada foi possível estabelecer um modelo

matemático para descrever a produção de G6PDH, em atividade

específica, por Candida guilliermondii cultivadas em hidrolisado

hemicelulósico de palha de arroz. O modelo previsto para esta reposta,

em função das variáveis estudadas e do efeito interativo entre elas, é

dado pela equação:

y = 0,43 + 0,054XI + 0,054X2 -0,069X3 -0,024XIX2 -0,036XIX3 -0,026X2X3

sendo que, através desta equação, o modelo prevê uma atividade

específica máxima de 0,64 U/mQproterna, podendo ocorrer uma variação de

0,55 a 0, 72 U/mgproteína, dentro do intervalo de confiança de 95%;

./ Para o ensaio de validação do modelo, realizado nas condições de 70

g/L de xilose, pH 7,5 e nível de inóculo de 1 g/L, obteve-se AE=0,60

U/mgproteína, revelando que o modelo proposto é adequado para

descrever essa resposta na região em estudo.

64

7 - PREVISÕES FUTURAS

Para complementar estes estudos, dando continuidade ao processo

biotecnológico de produção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase por

Candida guilliermondii cultivadas em hidrolisado hemicelulósico de palha de

arroz; no trabalho de doutorado pretende-se purificar esta enzima através do

processo de extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas

integrado ao rompimento celular desta levedura.

65

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICES

APÊNDICE A.1 - CURVA DE CALIBRAÇÃO DE BIOMASSA E DE PROTEiNAS TOTAIS (LOWRY)

Encontra-se, a seguir, a curva de obtida para a calibração da concentração

celular, pelo método do peso-seco em função da absorbância a 600 nm. A

calibração foi realizada com as células crescidas em hidrolisado lavando-as duas

vezes com água destilada.

0,8

E o.r e: g 0,6 e.o ro ro 0,5 "ü e:

~ 0,4 .... o C/l ~ 0,3

ro

jº·2 // <1> 0,1 ~

• •

o.o -+--r--r--.--,r--r----.----r----r--r-.,--...---r-....--,r--r---r-r--r--.----,

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50

Concentração Celular (g/L)

Figura A .1. Curva de calibração de biomassa em g/L

Curva de Calibração do lnóculo lavado:

D.O= 0,03857+1,52736 x Biomassa (R2=0,996)

Apresentam-se, a seguir, as curvas obtidas para a calibração das

concentrações de proteínas totais em mg/L.

0,20

0,18

~ 0,16 E e 0,14

~ 0,12

.!.'!! O 10 g ' ~ 0,08 o ~ 0,06

0,04

• 0,02 /.

Y =0,00217+6,38743E-4 X

100 150 200 250

Concentração de BSA (mg/L) 300

Figura A.2. Curva Padrão de proteínas totais utilizada nos ensaios de rompimento celular

0,9

0,8

0,7 E ~ 0,6 .... ~ 0,5

·~ 0.4

~ 0,3

j 0,2

0,1

0,8 B

0,0+-"''-.--,------------ 0 1000 200 400 6Xl 800

Concentração de 8$&. {mg/L)

0,8

0,7

E 0,6 e ~ 0,5

"' : Q.4 'g :l:1l 0,3

.§ 0,2 -c

0,1

0,7

~ 0,6

~ 0,5

.00 600 800 Concentração de BSA {mg/L)

e

0,0+-0 ~-200---400---WJ--800---1~000- Concentração de BSA (mg/L)

Figura A.3. Curva Padrão de proteínas totais utilizada nos ensaios do processo fermentativo

A)Y = -0,02861 + 6,73047E-4X (R2=0,994)

B) Y = 0,01546 + 7,49795E -4X (R2=0,999)

C)Y = 0,0177 + 7,92682E - 4X (R2=0,981)

APÊNDICEA.2 - RESULTADOS DOS ENSAIOS DE ROMPIMENTO CELULAR

Nesta seção encontram-se tabelados os valores obtidos para todos os

ensaios de rompimento celular efetuados. Foram determinados os valores de

porcentagens de células rompidas, tanto por DOaxi quanto por número de células

intactas, proteínas totais, atividades volumétrica e específica de G6PDH bem como

seus respectivos desvios-padrão.

Tabela A.1. Porcentagens de células rompidas (ensaios 1 e 2) determinadas pela contagem do

número de células em câmara de Neubauer, no tempo de 1 minuto, empregando

diferentes concentrações celulares

Concentração celular Ensaio 1

40

43

68

Média Erro-padrão

41 o 38 ±8 48 o

37,5 ±2,5

50,5 ±7,5 67 ±1

(g/L)

1,2

3,2

5,9

11,6

22,1

35,4

(%)

41

46

48

35

58

66

Ensaio 2 (%)

41

30

Tabela A.2. Porcentagens de células rompidas (ensaios 1 e 2) detemninadas pela contagem do

número de células em câmara de Neubauer, no tempo de 3 minutos, empregando


Concentração celular Ensaio 1 Ensaio 2 Média Erro-padrão

(g/L) (%) (%)

1,2 62 58,5 ±3,5

3,2 54 25 39,5 ±14,5

5,9 52 54 53 ±1

11,6 46 57 51,5 ±5,5

22,1 53 67 60 ±7

35,4 79 70 74,5 ±4,5

Tabela A.3. Porcentagens de células rompidas (ensaios 1 e 2) determinadas pela contagem do

número de células em câmara de Neubauer, no tempo de 5 minutos, empregando


--- -·-------···-··--·---·----·------ Concentração celular Ensaio 1 Ensaio 2 Média Erro-padrão

(g/L) (%) (%)

1,2 61 67 64 3,2 58 47 52,5 5,9 56 64 60 11 ,6 58 61 59,5 22,1 70 72 71 35,4 78 78 78

±3 ±5,5

±4 ±1,5 ±1 o

Nº células I mL = cétutas.x+x; 04 xdiluição

nº células j 1 - n" células, . (%) = n es aepois xl 00 nº células antes

Tabela A.4. Porcentagens de células rompidas (ensaios 1 e 2) determinadas pela 00600, no tempo de

1 minuto, empregando diferentes concentrações celulares

Concentração celular Ensaio 1 Ensaio 2 Média Erro-padrão

(g/L) (º/o) (O/o) -------H•,----------·--·--•.WU•---·------ ' ----------•OOO•o••<,O_O _

1,2 42 54 48 ±6 3,2 54 5,9 11,6

22,1 35,4

40 50 11

56

30 42 ±12 48 44 ±4 42 46 ±4 58 34,5 ±23,5 47 51,5 ±4,5


3 minutos, empregando diferentes concentrações celulares

---·--------- ·---------------------------- Concentração celular Ensaio 1 Ensaio 2 Média Erro-padrão

(g/L) (%) (%)

1,2 47 62 54,5 ±7,5 3,2 58 39 48,5 ±9,5 5,9 67 78 72,5 ±5,5 11,6 49 53 51 ±2 22,1 64 72 68 ±4 35,4 66 54 60 ±6


5 minutos, empregando diferentes concentrações celulares

Concentração celular Ensaio 1 · Ensaio 2 (g/L) (%) (%)

1,2 56 77

3,2 61 52

5,9 62 70

11,6 63 67

22,1 72 73

35,4 78 61

Média Erro-padrão

66,5 ±10,5 56,5 ±4,5 66 ±4

65 ±2 72,5 ±0,5

69,5 ±8,5

DO -0,0386 _ [ X]g I L = 600 xdiluiçao

1,527

(%) = [ XLntes - [ X]depois xlOO [Xlantes

Tabela A.7. Atividade volumétrica de glicose-6-fosfato desidrogenase (ensaios 1 e 2) no tempo de 1

minuto, em diferentes concentrações celulares ~-------------------------------------- ---

Concentração celular Av (g/L) ensaio 1

(U/L)

1,2 22

3,2 79

5,9 145

11,6 341

22,1 483

35,4 962

------·--·-·--·--·-· .. ·-·--··-·-·-·---··-····--···--·----··-···--·--··· Av Média Erro-padrão

ensaio 2 (U/L)

26

45

209

370

552

1083

24 ±2 62 ±17 177 ±32

355;5 ±14,5 517,5 ±34,5 1022,5 ±60,5 _________________________________ .. _, ., __ ,, , ,, __ ., _


minutos, em diferentes concentrações celulares

Concentração celular Av Av Média · · Erro-padrão

(g/L) ensaio 1 ensaio 2 .. (U/L) (U/L) --~

1,2 55 63 59 ±4 3,2 161 154 157,5 ±3,5 5,9 349 241 295 ±54

11,6 831 768 799,5 ±31,5 22,1 1614 1543 1578,5 ±35,5

35,4 2045 1404 1724,5 ±320,5. ,.,.._ .. ,.~,.L, ... , ..... o.,.LU,


minutos, em diferentes concentrações celulares·

Concentração celular . Av . · · Av · . Média · · . Erro-padrão . ·

(g/L) ensaio 1

(U/L)

1,2 48

3,2 239

5,9 442

11,6 1544

22,1 1740

35,4 3555

ensaio 2

(U/L)

81 64,5 ±16,5

218 228,5 ±10,5

370 406 ±36

974 1259 ±285

1807 1773,5 ±33,5 1959 2757 ±798

Tabela A.1 O. Proteínas totais (ensaios 1 e 2), no tempo de 1 minuto, em diferentes concentrações

celulares

Concentração celular Proteínas totais Média

(g/L) ensaio 1

Proteínas totais

ensaio 2 Erro-padrão

1,2 3,2 5,9 11,6 22,1 35,4

(mg/L)

188 238 344 819 771 1572

(mg/L)

98 218 403 605 1174 1901

143 ±45 228 ±10

373,5 ±29,5 712 ±107

972,5 ±201,5 1736,5 ±164,5

Tabela A.11. Proteínas totais (ensaios 1 e 2), no tempo de 3 minutos, em diferentes concentrações

celulares

Concentração celular Proteínas totais Proteínas totais Média Erro-padrão

(g/L) ensaio 1 ensaio 2

(mg/L) (mg/L)

1,2 230 103 166,5 ±63,5 3,2 298 355 326,5 ±28,5 5,9 563 373 468 ±95 11,6 1338 1113 1225,5 ±112,5 22,1 2508 2503 2505 ±2,5 35,4 2583 2635 2609 ±26

.............................. ...,~-··· .... ··~· -···~· ,..........,..,,..., ................................ --=-

Tabela A.12. Proteínas totais (ensaios 1 e 2), no tempo de 5 minutos, em diferentes concentrações

celulares

Concentração celular Proteínas totais · Proteínas totais Média · Erro-padrão .

ensaio 2 (g/L) ensaio 1 (mg/L)

1,2 196 3,2 323 5,9 498

11,6 1317 22,1 2671

(mg/L)

35,4 4586

112 315 452 1351 2530 3728

154 ±42 319 ±4 475 ±23 1334. ±17

2600,5 ±70,5 4157 ±429

-··-····--··-·-------·-··---··--·---·--·-----···--·-·--

Tabela A.13. Atividade específica de glicose-6-fosfato desidrogenase (ensaios 1 e 2) no tempo de 1

minuto, em diferentes concentrações celulares

Concentração celular

(g/L)

·--- .. -·--·-··-···--- .. - -- . Média Erro-padrão

1,2

3,2

5,9

11,6

22,1

35,4

ensaio 1 ensaio 2

(U/mgprotelna) (U/mgprotelna)

0,12 0,27 0,195 ±0,075 0,33 0,21 0,27 ±0,06 0,42 0,52 0,47 ±0,05

0,42 0,61 0,515 ±0,095 0,63 0,47 0,55 ±0,08 0,61 0,57 0,59 ±0,02


minutos, em diferentes concentrações celulares ·concentração celular ·"···-A;··-····-·-·-··-··-~~~-·· ··-·····Ã~~··· ··- ····· ··- ·· ·· ·MédTa··· Erro-padrão


(U/mgprotelna) (U/mgprotelna) .. - ~........,.,

1,2 0,24 0,61 0,425 ±0,185 3,2 0,54 0,43 0,485 ±0,055

5,9 0,62 0,65 0,635 ±0,015

11,6 0,62 0,69 0,655 ±0,035

22,1 0,64 0,62 0,63 ±0,01

35,4 0,79 0,53 0,66 ±0,13


minutos, em diferentes concentrações celulares

Concentração celular· · AE · · AE · · . Média . · Erro-padrão .


(U/mgprotefna) (U/mgprotelna)

1,2 0,24 0,72 0,48 ±0,24

3,2 0,74 0,69 0,715 ±0,025

5,9 0,89 0,82 0,855- ±0,035

11,6 1,2 0,72 0,96 ±0,24

22,1 0,65 0,71 0,68 ±0,03

35,4 0,78 0,53 0,655 ±0,125

da 106 . . _ Av(U / L) = -. x--x7,15xdrlwçao

mm 6220

Onde, AE é a atividade específica, Av atividade volumétrica e P1 as proteínas totais

APÊNDICE A. 3 - RESULTADOS DOS ENSAIOS DO PLANEJAMENTO FATORIAL 23

Nesta seção encontram-se representados os valores obtidos para todos os

ensaios do planejamento fatorial 23 efetuado. A concentração celular foi determinada

pelo método do peso-seco, enquanto a concentração de açúcares, xilitol e ácido

acético foi obtida por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC - WATERS).

Foram também avaliados os valores de porcentagem de rompimento por DO&XJ,

proteínas totais através da curva padrão de proteínas, atividades volumétricas e

específicas além do pH do meio, através de pHmetro.

Tabela A.16. Ensaio fermentativo de produção de glicose-6-fosfato desidrogenase por Candida

guil/iermondii, com 30 g/L de xilose, 1 g/L de inóculo e pH 4,5

Tempo (h) [X] antes

(g/L)

[X] depois Rompimento

(g/L) (%)

Av (U/L)

Proteínas si AE

tampão (U/mQprot)

(mg/L) ---------··---- -------------·---·····-------------------- o 3,1 1,4 55 132 353 0,37

12 2,2 1,5 32 93 224 0,42

24 2,3 1,6 30 108 194 0,57

36 2,7 1,7 37 114 291 0,39

48 3,0 2,2 27 147 530 0,28

·--~-·- ... = ........................ ... , ...... ..,......,. ... .,.......,...,...,,.,......., ... ,., ............................................ Tempo Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH

(h) (g/L) (g/L) (g/L) acético (g/L) (U/L) (g/L)

(g/L)

o 33,44 3,703 5,244 0,9078 30 0,7 4,62

12 24,69 5,059 0,5391 2,918 101 2,4 4,70

24 16,13 4,930 8,418 122 2,6 5,02

36 8,467 4,631 13,47 122 2,9 4,99

48 1,489 3,180 16,54 167 3,4 4,80 _..__ ... _... .. .., .. --.. ........ -.,.. ........... "'""-"''"""' .................. - .... - ............................... ,., ....... - ...... ..,_ ..... _ .... _ . ., .......... _ .... _"'_"'"'··'·-···"'·· .. ··.oc···-···· ............ ---·--~·-·"'·· ........... ,.-" ........ ...-0-··:.-·o.-..-· .. .., ..................... _ .. ____ .. _ .. _____


guil/iermondii, com 30 gil de xilose, 1 g/L de inóculo e pH 7,5

--------------·----- -·---·------·---·-·-··--·--·----···--·----- .. --------· Tempo (h) [X) antes [X) depois Rompimento Av Proteínas si AE

(gil) (gil) (%) (UIL) tampão (Ulmgprot)

(mgll)

o 3,1 1,4 55 132 353 0,37

12 2,5 1,5 40 137 305 0,45

24 2,8 1,8 36 134 280 0,49

36 2,5 1,8 28 145 362 0,40

48 2,7 1,8 33 167 304 0,55 __ N __________ ,. ___ .. ______________ ,,_, ______ , ____ __ .. __ ,,_ .. ___________ ,.,, ______ ., _____ ,_,,, ___

, , ,, .. ,,,,, ~.- ,0,0 ..,-,,,,, .. ., , A,•,,,0. 0, 0,,,0,<-'H,0 .. ,0,0 0,0,0,0 ,,,>,.,o,•A,0,0,0,0.0.0 0~0,< •,~ 0,0,0,0_,d,0-,0·<•0•>•••~, - •,••O,,.<•• o,,,O, ,,,,,o.- .. ,<,0 •·•·--'••~~dd .. ,M,,_.., .. ,,,o,o, .. ,,, .. ,, .. ,,,,,,.,,,,, ,, .. _.,,,,,,,0,0••••••••••"·'''•'•••• , ,.,_. ,....,_ .. ,_. ,, .. ,,,.., , ,,,0,0. •_,_..,,,,0,,,0J•

Tempo Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH

(h) (gil) (gil) (gil) acético (gil) (UIL) (gil)

(gil)

o 33,78 3,685 5,315 1,091 30 0,7 7,63

12 25,67 5,197 0,8216 2,526 40 2,7 6,56

24 17,04 5,048 0,7371 7,291 144 3,0 6,59

36 8,710 4,954 0,6939 13,47 220 3,8 6,68

48 1,555 3,786 0,5561 16,73 253 4,1 6,72 .............. ~--·-- .................... , ....... L ......... , ..................... LL-< ..... <..W.1.-· ......... ,., ............................................... -- ~ .... ,J ........ ,J ..... .._. ..... ,_,,..........._.,, ..... ,., ....................... ~,.L,-.>. ................. ,....__~~- ......... ---·~----


guil/iermondii, com 70 gil de xilose, 1 gil de inóculo e pH 4,5

Tempo (h) [X] antes [X] depois Rompimento Av . Proteínas si AE .

(gil) (gil) (%) (UIL) tampão (Ulmgprot)

(mgll)

o 2,8 1,5 46 96 303 0,32

24 2,5 1,1 56 108 238 0,45

48 2,5 1,6 36 103 195 0,53

60 3,5 2,2 37 147 246 0,60

96 2,9 1,9 34 207 393 0,53

------·--··--------------------------···------- .. --------·--···---------- . ------·-····-···-·····---····--·-···-·-····-·-·-· .. -·--··-··-··-···-····--· Tempo Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH


(g/L)

o 66,08 7,309 12,69 1,670 41 1,2 4,64

24 60,37 12,65 1,446 3,951 99 2,3 4,54

48 42,87 12,05 0,5560 12,86 156 3,8 4,72

60 31,91 12,34 0,1660 20,04 160 3,8 4,88

96 3,773 10,73 38,50 350 4,9 4,75 ··--·-·····----··"·-·--·-···---···-·--·---·--------- .. ---·-··- ., __________ ................ -, ........ ·-···-··---···--·--·------- .... ,. ____ ,, _________ ,,, .. ,. __________ , ................ ................................. - ......


guilliermondii, com 70 g/L de xilose, 1 g/L de inóculo e pH 7,5

~·-·~O,M,O,MMMM,O,o,,,0,0,0-M•-•-••••••••••••M•OM,o,,,,_.,_._. __ M ......... MOM•'•••••~- ..... ,, .. M,0,,,,,0,0,0MM,•,O,O•••••••••••••••••••-••·•"·MO,<,<M .. ,O,MOd,,M,M,,••,•M,0•• .. ••• ... , ...... ,- ..... ~>- .. ,d.,,,.,,,.,.,,,.,.,,,,,,, ... ~, ...... , ..... ~~d-·d~ .... , ..... , .. ~.,,,.0_,,, ... ,,,.,,,., ... ,-,, ... ,.,.•.•dd,•,•d,<d•'•'d,Od '•'"• .. , ... ,.,,,,,.,.,_,,,,,O,>,••••O•'••••••d•'"•~' 0 •·'

Tempo (h) [X] antes [X] depois Rompimento Av Proteínas si AE

(g/L) (g/L) (%) (U/mgprot)

o 2,8 1,5 46

24 2,8 1,7 39

48 2,9 1,3 55

60 3,3 1,8 45

96 3,0 1,5 50 -~~----~ --- ....................... ~--

(U/L) tampão

(mg/L)

96 303

136 362

136 400

174 345

208 337

0,32

0,38

0,34

0,50

0,62

- --

•••••••••••••••••••••••••••••••00••·••.,•••••••••••"••••••••••••••••••••••••••.,••••••• ...... ,,.,.,_,,.,. ... ,,.n,,,,, • .,,.,,,.u,•n•-"•"•"'-"'-"''"'·n•••"•••••~••••••••••••••••,.•••••••••••"•••••••·•••-•••--••••••••••••••••,.,.,,,.,,.,,,.,.,,,,.,,,o



(g/L)

o 71,88 4,412 13,05 2,389 51 1,5 7,44

24 51,48 11,72 1,482 6,994 175 3,6 6,27

48 35,07 12,12 1,669 20,14 248 5,3 6,42

60 24,27 11,32 1,030 26,07 253 4,8 6,50

96 1,844 8,531 1,385 40,10 354 5,1 6,67


guil/iermondii, com 30 g/L de xilose, 3 g/L de inóculo e pH 4,5

-------·-··-- ------------- ------------·----------·-----------·-·--···------ Tempo (h) [X] antes [X] depois Rompimento Av Proteínas s/ AE

(g/L) (g/L) (%) (U/L) tampão (U/mgprot)

(mg/L)

o 3,1 1,4 55 132 353 0,37

12 2,5 1,7 32 104 275 0,39

24 2,5 1,6 36 113 306 0,37

36 2,4 1,5 38 127 302 0,42

48 2,5 1,8 28 130 414 0,31 --·--------------, .. __________________ ,, ___ --·--------··-·--·- .. ----·-··-···- .. ··------·--·--- .. ---·--·--

................ ~ ............. , ... - ... , ............ -----·--·-··· ..... , ............................................. , .••.•••.•. , .• ,,.,.,,,.,,,J.•., .•. ~., ................................ , ................ _ ..... ______ ._,_,,,., .......................................... ............ ~-~--------···· .. ················--·-··"'·'·'·'·'·•··················· .. - . ._ .. .......... ,.,.,.,., .•. ,., .. .,.,.,.,,



(g/L)

o 32,70 3,402 5,166 0,8264 149 3,5 4,62

12 19,88 5,056 0,4610 6,314 170 4,1 4,68

24 9,089 4,840 14,15 199 4,4 4,95

36 1,933 3,522 18,57 259 4,9 4,87

48 0,1764 0,9737 17,56 317 6,1 4,86 ~-~._._._. ....................................... ~. .J.~ .................... ,-·=_.- ........................ _. ..... w. ........ , .................................. <.&.h<-'~ ....... . ~., .......... ,w ..... ,._.._ ____ 0.0.0.•-'~•-khh~hh•·-hh~h··•••••••·h--··•-•·h-~.h•••M-h---~-


gui/liermondii, com 30 g/L de xilose, 3 g/L de inóculo e pH 7,5

Tempo (h) [XÍ ãntes "txJêiepÕis"-···-RÕmpimêniõ""""-'"""-· ·x:; . .. Proteínas s/

(g/L) (g/L) (%)

o 3,1 1,4 55 12 3,2 1,9 41

24 2,9 1,6 45

36 2,7 1,4 48

48 2,8 1,6 43

(U/L) tampão

(mg/L)

132 257

166 379

151 421

125 364

121 350

0,51

0,44

0,36

0,34

0,35 ··-·-----······-·--··-······-·-·-··-·---------·---------

---···-------------·-··-·--- -·---·----------··-···-··--·-··· .. ---------· .. ·-- •••••••-•••••••••••••m•••••••••-••••--•••• -·-·"··-- .. ·----·-··-····------······ Tempo Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH


(g/L)

o 31,06 2,984 4,963 1,007 149 3,5 7,63

12 19,90 5, 113 0,8803 6,316 218 4,2 6,45

24 9,982 4,776 0,7370 11,79 250 4,8 6,53

36 2,082 4,157 0,6507 17,07 273 5,9 6,64

48 0,3384 1,791 0,4679 17,01 320 7,4 6,72 ··--··· .. ---····· .. ··-·-·-··-·· ··--···-···--··-·-- .. ---------·-···---· .. ·-·------------------·-··""'" ..... , ____ .. ___ ....................... _, ............................ .......................................... .................... _________



Tempo (h) [X] antes . . [X] de-pois· Rõm'pimênto ······ Av··· P.rÕtê'inâs'"s/ .. . . A~---······ (g/L) (g/L) (%) (U/L)

o 3,1 1,7

24 2,7 1,5

48 2,4 1,4

60 2,4 1,3

96 2,4 1,3 -·=·~· -~-- ........... o>Jw ..

45 129

44 105

41 81

46 71

46 69

tampão (U/mgprot)

(mg/L}

369 0,35

362 0,29

218 0,37

195 0,36

188 0,37

Tempo. Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH


(g/L)

o 70,40 7,712 10,83 1,508 116 2,8 4,58

24 54,68 10,98 1,663 4,397 167 4,3 4,48

48 40,19 10,91 1,820 9,947 162 4,8 4,50

60 34,32 11,13 1,600 13,45 160 5,4 4,52

96 15,30 11,26 0,8087 24,99 161 5,6 4,68 •H•u•.O••••~•-...,o. .. ,.,"'o·o;,,.,~-.-.,.__,.,_.,.,,..., .. , ....... o· .,,...,,,....,=,.--,.,.-....., •-q,.._..., ... ___ ,.,.., ___ .... __ "'"'" .. ""'"""""'-.,...,. .,_.,____ •·-·· ·=-•.u< -H--~··-- .....,.,._....,,-., _ .. .,,. ..,,., -..;,-..,._,.,< .-«,_ .. ,..,..,._...,.,.,n.•••••••4u ..... ,,.....,,.,.,. • .,.,_, ..



---------··-··--·--·--·-·----- -·--··-----··------·---------------- Tempo (h) [X] antes [X] depois Rompimento Av Proteínas s/ AE

(g/L) (g/L) (%) (U/L) tampão (U/mQprot)

(mg/L)

o 3,0 1,6 47 113 328 0,34

24 3,2 1,9 41 128 384 0,33

48 2,7 1,5 44 123 342 0,36

60 2,9 1,6 45 128 398 0,32

96 2,9 1,6 45 167 423 0,40 --·----·- .. -·-·--· .. --·----·------ .... ,.,,_, _______ ···--·-··-·- .. -· ... -- .. ··-·--·----·------ .. -·- .. -·--- ----

~.,,,,,,,,,.,,,,,,, ,.,.,~,,,,,>,o,,.,,O,o,,,,,O,O,O,O,O,h•,••••~'•'•>•0,0 .. ,,.,,,,<,<,>,,,0,0,0,,,0, .. 0,0,0,>•0,00·N•,<,,.,,,,L•J,0-',~·-···-•••,0,0,,,,,o, .. ,, .. ,,ho,,,,,,,,,,.,,,,>,>,,,O,<,,,O,>,O•>,<,•-'•'•' ~,.,,O,,,O,M,,,0,>,<,>,>,0,0,0,,,0,0,0,0,0,0, .. 0,0,0•>•<•>,<,>,,,0,0,<,>,•,>,<,>,0,0,0•0,>,>, .. >,,•••-•,--l,•,,,,,>,•,><<,O,>,O,>,•,••••••'•'•''·'''·'•-•••-·••-•,•.-••,•·•·•,O,•,O·•••·•



(g/L)

o 69,78 6,568 11,17 1,685 113 3,0 7,48

24 41,48 11,38 1,551 14,18 216 5,4 6,54

48 18,92 10,37 1,255 30,15 328 7,2 6,65

60 9,60 9,756 1,323 38,31 327 7,4 6,78

96 0,5946 5,195 0,9987 43,95 495 8,6 6,93 ................................................................... ......,. ...................................... _, ... _. ~.- ........... .,_............._.. ........................ __ ~ ........................ ~~·~-·- .. -·--·--·-"-'·"-""·~'- .... -~----~--- ... -- ...... , ....... _____ , .. _.,_ .. ___ .. __ .~-·---------~


guillierrnondii, com 50 g/L de xilose, 2 g/L de inóculo e pH 6,0

Tempo (h) . [X} antes ·- -ixféfepÔis-·-·--RÕrrÍpimentéi-·--·-····-··· Av Proteínas s/ AE


(mg/L)

o 2,8 1,5 46 96 286 0,34

24 2,9 1,8 38 79 163 0,48

36 2,5 1,5 40 88 234 0,38

48 2,7 1,5 44 93 188 0,49

60 2,6 1,6 38 95 215 0,44

---------·-·---·-··---- ..... _,, ________________________________________________________________________ ,. _____________________________ ,,_ .. _______________________ ,,, ..... - ............... -----···--·-···--··-·····-·-·······--·- ··--···· Tempo Xilose Glicose Arabinose Acido Xilitol Av Células pH


(g/L)

o 54,24 3,831 11,00 1,352 86 2,5 6,13

24 27,03 8,763 0,7655 12,51 117 4,3 5,92

36 17,48 8,582 0,6046 20,08 186 5,3 6,09

48 7,779 7,494 0,4372 24,67 234 6,8 6,13

60 1,749 6,433 0,4007 29,06 281 7,7 6,13 •••-•·---------•-•"•--•·------------•-•••-·------••••••••--••••••u•••,HM•·--H--•-·----------•••-----~·---•·•--•-- m••••••••-•••----•••,O,-HO••••••••••••••••••••••••



-·····Temi>o'''fi,j'-·"-····-txj'·a-ntes·-·· '"''txfcfe.pÕis"''"''j:fo.mpime'i,iêi Av .. Proteínas si ,,.,,,.,Ã;···· '"' ''


(mg/L)

129 369 0,35

115 273 0,42

133 311 0,43

97 232 0,42

95 227 0,42 ____ ......_. ............................ ~~ ..........................

o 3,1 1,7 45

24 2,7 1,6 40

36 3,0 1,7 43

48 2,6 1,5 42

60 2,6 1,4 46



(g/L)

o 24

36

48

60

50,85

26,31

15,50

6,246

O, 1811

5,465 7,602

7,706

7,539

7,002

4,645

1,154

0,6233

12,54

20,54

26,97

29,04

79

204

226

220

263

1,9

4,8

5,1

5,9

7,2

6,10

6,14

6,32

6,37

6,45


guil/ierrnondii, com 50 g/L de xilose, 2 g/L de inóculo e pH 6,0

-----·-----·----------------·-----·----··------ ... -------·-·--·- .. ·-·-··----- Tempo (h) [X] antes [X] depois Rompimento Av

(g/L) (g/L) (%) (U/L)

o 3,1 1,7 45 129

24 2,7 1,6 40 75

36 2,6 1,6 38 92

48 2,6 1,6 38 120

60 2,4 1,4 41 136 -·---- .. ·--- .. --_ .. __ ,_,, ________ , __ ,, ________ ,, ____ ., _______________________ ,,,_, .. _ .

Proteínas s/ AE tampão (U/mQprot)

(mg/L)

369 0,35

248 0,30

221 0,42

244 0,49

341 0,40



(g/L)

o 51,49 5,134 7,733 1,150 79 1,9 6,10

24 26,69 7,510 11,92 130 4,7 6,10

36 16,52 7,563 0,7057 19,99 173 4,9 6,26 - ... ,.., 48 7,339 7,317 26,90 267 5,8 6,31

60 0,4432 4,942 29,45 379 6,7 5,42

APÊNDICE A.4 - CÁLCULO DO FATOR DE RENDIMENTO EM XILITOL, POR REGRESSÃO,

FATOR DE RENDIMENTO EM CÉLULAS, PRODUTIVIDADE EM XILITOL E PRODUTIVIDADE EM

CÉLULAS DO PLANEJAMENTO FATORIAL 23

Encontra-se nesta seção os gráficos da regressão linear dos valores de ~P

em função de (-~S), para o cálculo do fator de rendimento em xilitol em cada um dos

ensaios realizados. O valor para o fator de rendimento em xilitol, Yp1s, é fornecido

pelo coeficiente angular da reta de ~p = A+ Yp1s (-~S). O fator de rendimento em

células, YXJs, foi calculado pontualmente para cada um dos ensaios realizados. A

produtividade em xilitol (O») e a produtividade em células (Ox), também foram

calculadas. Os valores de cada parâmetro estão presentes na Tabela A.17.

18

14

.,.r,..••··•r,·,·,....,•,•o•,-, ... ..,-,,,.,.,,r,·<'•"-,-,•,-,-,•rr.,...,·~-.,.,._...., ............. ._.r•-,.r••r,-,.,,~-·,.,.,~,·rrr.-.•,-,•,•,-,•,-,•••r••••••ro~-.-·~r,•,•••

Parâmetro Valor Erro 16

o 'S 12 -c, o C: 10 o .., 8 o "" -~ 6

~ 4

YP/S 0,5962 0,5962 0,034

17,00461 0,52223

N p

a 17,00461 ---Ff. SD

0,99676 0,58804 4 0,00324

·25 -20 -15 -10 .5 -(Variação do substrato)

18

18

Parâmetro Valor Erro 14

,§ 12 -e,

l 10 o .., 8 s ~ 6

~ "

a

O,OC699 0,0354 ·

18,02981 0,56733

R SD N p

0,99661 0,6391 4 0,00339 2

o+-~~..--..--~~~~~~~~ -30 -25 -20 -15 -10 -5

-(Variação do substrato)

40 ~nsaio 3 \ .. /

35 /

o 30 /

/ :i /

'tl / ,,

e 25 / /

Q. // .g 20 /" o ..

/ /

e.,, 15 -~ /

~ 10 .> ,,,,:·/

/

-60 -50 -40 -30 -20 -10


45

40 ~nsaio 4 !

35

o 30 :i

'tl

~ 25 o 'tl 20 o .. -~ 15

~ 10

.50 o-i-~-,----r--,--,--.--,----r~--,-~-,--~

-60 -40 -30 -20 -10


20

18

16

~ 14

'tl 12

~ o 10 'tl

~ .!!!

~

0-t-....-,r""-r~-,-....,-.--,-~-.-.-,~-,-~-.-~~~ -22 -20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2


• <J ..• ,., ,.,.,.,.,., .•. ~,.,.,-,.,.,.,., ,.•.,.•,,JJo>• .. •,,., ,.>~,,,, ,.,.,,, ..., ,..,.,,,,, .,~ -...,_~ ....- L.,•.,.,~_j~•.•.,.,,.,,.,•,,.<,">.'C.,.,L.L

Parâmetro Valor Erro

YP1s ..... --········-- ·-·---···--·---~----~-~--··--- -

0,61684 0,02658

a 40,20099 1,07275

R SD N p

0,99815 1,00273 0,00185 4 ·-- .. ·---·----------------··---------·-----------------·


a

0,65806

41,86096

0,03484

1,16505

R p SD N

0,99721 4 0,00279 1,25586

Parâmetrô Valor

Yp1s 0,68636 0,02963

a 20,00135 0,37541

R p SD N

0,37859 0,02.747 3 ---------···---·---·------·--··----------·--··-

0-t-..-,r-r-.-~.-..-,r-r-r~.-~~r-r-r~.-~~ -22 -20 -18 -18 -14 -12 -10 -S -6 -4 -2

-(Variaçao do substrato)

25

o 20 '5 "' e O.. 15 o

"' o ~ 10 .!!!

~

0-t-~~--,~r-r~-.-~~~.-~~~~~~--, -eo -50 -40 -30 -20

-(Variaçao do substrato) -10

45

~ 35

"' e o.. 30 o "' i 25

·ê ~ 20

15

-40 -30 -20 -10 -(Variaçao do substrato)

a

Parâmetro

R SD

0,99849 ···-~······-·--04·-~-·--···

0,41714

........ · ... Parãmeiro · · ·

a

R

0,99263

SD

Valor Erro

0,00139

18,13291

0,03304

0,42651

N p

3 0,03494

Valor Erro

0,52967 0,04573

32,32884 1,77345

N p

4 0,00737 1,29148

a


0,73674 0,0224

44,64995 0,52178

R SD N p

4 9,22859E-4 0,99900 0,68123

JO 28 26 2,

o 22 ~ 20 e 1e ~ 16 ,, " .g 12 o-

·l:'i! 10 ~ 8

..JO -25 -20 -15 -10 -5


JO 28 26 2,

o 22

~ 20 e 18

~ 16 ,, " o ca 12 o,

.S! 10

~ 8

JEnsaio 10 1 ./--;;

.> /

o+-~-.-~-...-~~-~-.-~-.--~-,-~ .JO -25 -20 -15 -10 -5


30 :.s 26 2'

o 22

~ 20 e 18

~ 16

,, " _g 12 o-

..!!! 10

~ 8 6

• 2 O+-~-,-~-,.--,---,...-~--,-~-.-~-..~ -30

@nsaio 11 J

•

-25 -20 -15 -10 -5

-(Variaçao do substrato) o

Parâmetro

a

Valor Erro

0,63363

31,13998

0.0462

0,76ro3

·-------···-------------··-·--------------- 0,99473 0,88837 4 O,C!J527

Parâmetro

a

R SD 0,00326 1 ,05472

Valor Erro

0,64737 0,05342

31,07932 0,83254

N p

4 0,00674

Parâmetro Erro

YP/S

a

Valor ................ 0;68400 .

31,78563

0,06185

0,99698

R SD N p

0,99192 1,22031 4 O,ro!OO

Tabela A.27. Parâmetros fermentativos obtidos no planejamento fatorial 23

-- ··········-·-···-- .. ....,.,. .. , ... ,.,,,.,,., .... -= ................. -- ·---------------------------.-- ••••••••;.e.<,......m=......;.:.,.,...::,==-=.,.c,=L'-"-"-'"=.,•"•·J"I. .• ",

Ensaios Parâmetros Fermentativos

U/mQproteina Pxilitol YXJs Yp1s Qx Qp

(g/L) (g/g) (g/g) (g/L.h) (g/L.h)

1 0,28 16,54 0,076 0,59 0,056 0,34

2 0,55 16,73 0,094 0,60 0,071 0,35

3 0,53 38,50 0,050 0,62 0,038 0,40

4 0,62 40,10 0,048 0,66 0,037 0,42

5 0,31 18,57 0,041 0,69 0,039 0,52

6 0,35 17,07 0,075 0,60 0,067 0,47

7 0,37 24,99 0,044 0,53 0,029 0,26

8 0,40 43,95 0,074 0,74 0,058 0,46

9 0,44 29,06 0,092 0,63 0,087 0,48

10 0,42 29,04 0,094 0,65 0,088 0,48

11 0,40 29,45 0,085 0,68 0,080 0,49

.. _ _,/

Documents

PRODUÇÃO DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE A …sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2004/BID04001OCR.pdf · 2.3.3 - fontes de obtenÇÃo e mÉtodos para liberaÇÃo da enzima_